CN101474272A - 动物用复方中草药免疫增强剂及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种动物用复方中草药免疫增强剂的配方及其制备方法。该复方免疫增强剂主要由以下重量份的原料组分制备得到：白花蛇舌草5－15份，黄芪30－50份，党参30－50份。制备方法是先将所述原料组分粉碎，过筛，再按所述的重量份混匀，加入8－15重量倍去离子水煎煮，趁热过滤后，合并滤液，真空浓缩后分装，高压灭菌即制得。该增强剂为纯中药制剂，无毒副作用，无有害残留，生产无三废，对环境无污染；不仅配方简单，而且功效高，可明显促进淋巴细胞增殖，显著提高动物的体液免疫功能、促进血液中IL－2与IFN－γ等细胞因子的分泌，全面增强机体的各种免疫功能。

Description

动物用复方中草药免疫增强剂及其制备方法

技术领域

技术领域

本发明涉及免疫增强剂的配方及制备工艺领域，具体涉及一种动物用中草药免疫增强剂及其制备方法。

技术背景

随着我国畜牧业的快速发展，畜禽饲养模式也发生了明显变化，规模化和集约化程度越来越高，全球气候变暖，使动物疾病的发生形式及数量发生了变化，最为严重和显著的特点是各种原因造成的机体免疫机能下降导致疫苗免疫失败时有发生、条件性传染性疾病尤其是细菌性疫病经常暴发和流行，一方面养殖场为此不断增加疫苗的使用剂量和次数，对动物的应激更加频繁，动物的生长性能受到了限制；另一方面，由于饲料中长期添加各种抗生素诱使细菌性病原体普遍产生了严重的耐药性，养殖场为控制细菌病而超剂量使用或滥用，造成动物产品中出现抗生素残留越来越重，不仅对人类的身体健康造成了威胁，而且严重阻碍了我国畜产品的出口贸易的健康发展。

中草药可从整体上全面调理人和动物机体的各种功能，部分中草药具有抗应激、抗病毒、抗菌活性，而且价格低廉，资源丰富，长期使用对机体的毒副作用小，低残留或无残留，因此近年来受到了广大饲养者的青睐。白花蛇舌草、黄芪、党参等多种中草药可不同程度地提高或调节机体的免疫功能，复方中草药免疫增强剂具有更全面或更好的增强效果，但现有的复方制剂组分太多，复杂，产品质量不仅难于控制，而且不稳定，从多种不同配比的组合中筛选出小复方中草药免疫增强剂，尤其适用于南方热带亚热带地区，目前未见相关报道。

发明内容

针对现有技术中存在的不足之处，本发明的首要目的是提供一种能显著提高动物的体液免疫、细胞免疫功能等特异性及非特异性免疫功能的复方中草药免疫增强剂。

本发明的另一目的是提供上述免疫增强剂的制备方法。

本发明通过以下技术方案达到以上目的：一种动物用复方中草药免疫增强剂，由以下重量份的原料制备得到：白花蛇舌草5-15份，黄芪30-50份，党参30-50份。

本发明还提供上述动物用复方中草药免疫增强剂的制备方法：先将所述原料(白花蛇舌草、黄芪和党参)粉碎，过筛，再按所述的重量配比混匀，加入8-15重量倍去离子水煎煮，趁热过滤后，合并滤液，真空浓缩后分装，高压灭菌即制得。

上述制备方法中，优选地，所述筛为40-100目筛。

上述制备方法中，优选地，所述煎煮次数为3-5次。

上述制备方法中，优选地，所述真空浓缩的温度为60-70℃。

上述制备方法中，优选地，所述高压灭菌是在121℃灭菌30分钟。

木发明的技术原理：白花蛇舌草具有清热解毒、增强动物免疫力和抗感染能力、镇静、镇痛和调节胃肠功能等作用，近年来临床上广泛应用于胃炎、肠炎、阑尾炎及上呼吸道感染等多种炎症的治疗和多种癌症的辅助治疗；黄芪具有促进机体免疫功能、增加白细胞和淋巴细胞数、提高淋巴细胞转化率和巨噬细胞活性、诱生干扰素等作用，党参可增强小鼠巨噬细胞的吞噬功能，其水煎液低浓度可促进体外培养淋巴细胞的有丝分裂，并促进COnA活化的小鼠脾脏淋巴细胞DNA合成，明显促进环磷酰胺引起的免疫抑制小鼠的淋巴细胞的转化，增强抗体产生细胞的功能，提高抗体滴度。通过正交试验筛选出白花蛇舌草、黄芪、党参的最佳配方，经禽类(鸡)和哺乳类(小鼠)的动物实验证明，该免疫增强剂可全面增强动物的各种免疫功能，长期使用无任何毒副作用。

与现有技术相比，本发明的优点和有益效果如下：

与现有化学免疫增强剂相比，本发明动物用中草药免疫增强剂属天然中草药产品，无毒副作用，无有害残留，生产无三废，对环境无污染；与现有中草药免疫增强剂比较，比单味中药免疫增强剂有更全面、更广泛的免疫调理作用，较现有复方中草药免疫增强剂不仅组方简单，质量更易控制，而且功效高，可明显促进淋巴细胞增殖，显著提高动物的体液免疫功能、促进血液中IL-2与IFN-γ等细胞因子的分泌，全面增强机体的各种免疫功能。

具体实施方式

下面通过实施例进一步说明本发明，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

本实施例中，动物用复方中草药免疫增强剂由以下重量配比的原料组分制备得到：

白花蛇舌草10g，黄芪40g，党参40g。

制备方法为：先将上述原料组分粉碎，过40目筛，再按所述的重量配比混匀，加入15重量倍去离子水煎煮3次，趁热过滤后，合并滤液，65℃真空浓缩至1g/ml后分装，高压灭菌即制得。

实施例2

本实施例中，动物用复方中草药免疫增强剂由以下重量配比的原料组分制备得到：

白花蛇舌草5g，黄芪30g，党参30g。

制备方法为：先将上述原料组分粉碎，过100目筛，再按所述的重量配比混匀，加入8重量倍去离子水煎煮5次，趁热过滤后，合并滤液，60℃真空浓缩至1g/ml后分装，高压灭菌即制得。

实施例3

本实施例中，动物用复方中草药免疫增强剂由以下重量配比的原料组分制备得到：

白花蛇舌草15g，黄芪50g，党参50g。

制备方法为：先将上述原料组分粉碎，过60目筛，再按所述的重量配比混匀，加入10重量倍去离子水煎煮4次，趁热过滤后，合并滤液，70℃真空浓缩至1g/ml后分装，高压灭菌即制得。

现以实施例1得到的免疫增强剂为例，以鸡和小鼠作为动物模型通过以下实验来证明其对动物机体的免疫增强作用，实施例2和实施例3经类似的实验证明具有相近的效果。

一、本发明的免疫增强剂对鸡的免疫增强作用

实验方法：

1日龄雏鸡150羽，8日龄时随机分为高(8g/kg)、中(4g/kg)、低(2g/kg)三个剂量实验组，黄芪对照组(8g/kg)和生理盐水空白对照组，每组30羽，体重为70.0±5.0g，灌胃给药，空白对照组灌服等量的生理盐水，共10d，在9日龄时免疫新城疫疫苗，14日龄时免疫法氏囊中等毒力疫苗，23日龄时再次免疫新城疫疫苗，在二次免疫后7、14、21、28d测以下各项指标：

外周血淋巴细胞增殖：采用MTT法。将抗凝血用D-Hank’s液稀释1倍，小心加在淋巴细胞分离液上层，2000rpm离心20min，能取中间云雾状白细胞层，用无血清RPMI-1640营养液洗2遍，1500rpm离心15min台盼兰染色，细胞计数活细胞大于95％后，用RPMI-1640培养液调整细胞浓度为1×10⁷个/mL(ConA终浓度10μg/mL)，加入到96孔细胞培养板中，100μL/孔，每个样品重复4孔，然后置于39.5℃、5％CO₂条件下培养44h，取出每孔加入MTT 10μL，继续培养4h，然后吸弃上清，加入150μL DMSO，震荡10min后测OD₅₇₀。

细胞因子含量：培养外周血淋巴细胞，取上清，用ELISA试剂盒测定白介素2(IL-2)与γ-干扰素(IFN-γ)含量。

鸡新城疫HI抗体滴度：每组分别随机取10只鸡，翅下静脉采血0.5mL，分离血清，用微量血凝抑制法测定鸡新城疫抗体滴度。

血液生化指标：每组取5只，心脏采血(2mL/只)，分离血清，测球蛋白，白蛋白、球蛋白、谷氨酰转移酶，天门冬氨酸转氨酶、尿酸。

免疫器官指数：每组取5只鸡，称重，静脉放血处死，取脾、胸腺、法氏囊，计算免疫器官指数。

实验结果：

1、对鸡外周血T淋巴细胞增殖的影响：

如表1所示，在二次免疫后7d、14d、21d，复方中草药免疫增强剂可极显著促进鸡的外周血淋巴细胞增殖，高剂量组和中剂量组效果与黄芪对照组相比，差异极显著(p<0.01)；28d，高、中剂量组与黄芪对照组及空白对照组相比，仍能极显著促进鸡外周血淋巴细胞增殖(p<0.01)。

表1 本发明动物用复方草药免疫增强剂对鸡外周血T淋巴细胞增殖的影响(OD₅₇₀)

^*：与空白对照组相比，^*表示0.01<p<0.05，差异显著，^**表示p<0.01，差异极显著

Δ：与黄芪对照组相比，Δ表示0.01<p<0.05，差异显著，ΔΔ表示p<0.01，差异极显著

2、对IL-2分泌量的影响：

如表2所示，二次免疫后7d，复方中草药免疫增强剂各剂量组均明显促进IL-2的产生，与黄芪对照组及空白对照组相比，差异极显著(p<0.01)，高、中剂量组促进作用最强(p<0.01)；14d时，高、中剂量组和黄芪对照组促进作用最强，而高剂量极显著的促进IL-2的产生(p<0.01)；21d时，各组都促进IL-2的产生(p<0.01)，高剂量组与黄芪对照组相比，差异显著(p<0.05)；28d时，各组促进IL-2的产生，高、中剂量组仍有显著的促进效果(p<0.05)。

表2 本发明动物用复方草药免疫增强剂对IL-2分泌量的影响(单位：pg/mL)

^*：与空白对照组相比，^*表示0.01<p<0.05，差异显著，^**表示p<0.01，差异极显著

Δ：与黄芪对照组相比，Δ表示0.01<p<0.05，差异显著，ΔΔ表示p<0.01，差异极显著

3、对γ-干扰素分泌量的影响：

如表3所示，二次免疫后7d，各组都极显著促进IFN-γ的产生；并一直持续至免疫后21d。

表3 本发明动物用复方草药免疫增强剂对γ-干扰素分泌量的影响(单位：pg/mL)

^*：与空白对照组相比，^*表示0.01<p<0.05，差异显著，^**表示p<0.01，差异极显著

Δ：与黄芪对照组相比，Δ表示0.01<p<0.05，差异显著，ΔΔ表示p<0.01，差异极显著

4、对鸡新城疫抗体滴度的影响：

如表4所示，二次免疫后7d，高剂量组的抗体效价极显著高于黄芪组(p<0.01)，显著高于空白对照组；二免后14d，高、中剂量组的抗体效价极显著高于对照组(p<0.01)，高剂量组的抗体效价极显著高于黄芪组(p<0.01)；21d时，高、中、低剂量组与黄芪对照组的抗体水平都高于空白对照组，高、中剂量组效果极显著(p<0.01)；28d，除低剂量组提高抗体水平不显著外，其它各组与对照相比差异显著，尤其高剂量组效果极显著。

表4 本发明动物用复方草药免疫增强剂对鸡新城疫抗体滴度的影响

^*：与空白对照组相比，^*表示0.01<p<0.05，差异显著，^**表示p<0.01，差异极显著

Δ：与黄芪对照组相比，Δ表示0.01<p<0.05，差异显著，ΔΔ表示p<0.01，差异极显著

5、对血清总蛋白的影响：

如表5所示，在二次免疫后7d时，血清中总蛋白含量各组没有差异性；14d时，高、中、低剂量组、黄芪对照组与空白对照组相比，差异极显著(p<0.01)，高、中剂量组与黄芪对照组相比，差异极显著(P<0.01)；21d时，各组与空白对照组相比，差异显著，高剂量组与黄芪对照组差异极显著(p<0.01)；28d时，高、中剂量组与对照组差异极显著(p<0.01)，黄芪对照组与空白对照组相比，差异显著(p<0.05)。

表5 本发明动物用复方草药免疫增强剂对血清总蛋白的影响

^*：与空白对照组相比，^*表示0.01<p<0.05，差异显著，^**表示p<0.01，差异极显著

Δ：与黄芪对照组相比，Δ表示0.01<p<0.05，差异显著，ΔΔ表示p<0.01，差异极显著

6、对血清白蛋白的影响：

结果如表6所示，二次免疫后7d，血清白蛋白含量，中剂量组与空白对照相比，差异显著(p<0.05)，中剂量组与黄芪对照组相比，差异极显著(p<0.01)；14d时，中、低剂量组、黄芪对照组与空白对照组相比，差异显著(p<0.05)；21d和28d时，各组差异不显著。

表6 本发明动物用复方草药免疫增强剂对血清白蛋白的影响

^*：与空白对照组相比，^*表示0.01<p<0.05，差异显著，^**表示p<0.01，差异极显著

Δ：与黄芪对照组相比，Δ表示0.01<p<0.05，差异显著，ΔΔ表示p<0.01，差异极显著

7、对血清球蛋白的影响：

如表7所示，二次免疫后第7d，血清中球蛋白含量各组差异不显著；14d时，高、中、剂量组与空白对照组相比，差异极显著(p<0.01)；21d时，高、中剂量组与空白对照组相比，差异极显著(p<0.01)，黄芪对照组与空白对照组相比，差异显著(p<0.05)；28d时，各剂量组和空白对照组相比差异不显著。

表7 本发明动物用复方草药免疫增强剂对血清球蛋白的影响

^*：与空白对照组相比，^*表示0.01<p<0.05，差异显著，^**表示p<0.01，差异极显著。

Δ：与黄芪对照组相比，Δ表示0.01<p<0.05，差异显著，ΔΔ表示p<0.01，差异极显著。

8、对血清谷草转氨酶和血清谷丙转氨酶的影响：

结果如表8和9所示，各用药组与对照组相比，血清中的谷丙转氨酶、谷草转氨酶均没有明显升高，说明本发明对鸡肝脏无毒副作用。

表8 本发明动物用复方草药免疫增强剂对血清谷草转氨酶的影响

^*：与空白对照组相比，^*表示0.01<p<0.05，差异显著，^**表示p<0.01，差异极显著

Δ：与黄芪对照组相比，Δ表示0.01<p<0.05，差异显著，ΔΔ表示p<0.01，差异极显著

表9 本发明动物用复方草药免疫增强剂对血清谷丙转氨酶的影响

^*：与空白对照组相比，^*表示0.01<p<0.05，差异显著，^**表示p<0.01，差异极显著

Δ：与黄芪对照组相比，Δ表示0.01<p<0.05，差异显著，ΔΔ表示p<0.01，差异极显著

9、对血清中尿酸的影响

结果如表10所示，各用药组血清中尿酸含量与空白对照组比较没有明显差异，说明该中药复方免疫增强剂对动物机体肾脏无毒副作用。

表10 本发明动物用复方草药免疫增强剂对血清中尿酸的影响

^*：与空白对照组相比，^*表示0.01<p<0.05，差异显著，^**表示p<0.01，差异极显著

Δ：与黄芪对照组相比，Δ表示0.01<p<0.05，差异显著，ΔΔ表示p<0.01，差异极显著

二、本发明的免疫增强剂对小鼠的免疫增强作用

实验方法

取小鼠64只，18-22g/只，随机均分为4组(每组20只)。分为高剂量组(6g/kg)、低剂量组(3g/kg)、黄芪对照组(6g/kg)和生理盐水对照组，中药用生理盐水稀释相应浓度后，灌胃给药。给药组每只0.4mL/d，1次/d，对照组生理盐水每只0.4mL/d，1次/d，连续10d。测定以下各项指标：

巨噬细胞吞噬率和吞噬指数：各组小鼠在灌胃第8d，每组取5只，每只小鼠腹腔注射4％蛋白胨溶液0.5mL，连续3d，第11d腹腔注射20％鸡红细胞悬液1mL，间隔6h，经腹腔注射无菌生理盐水2mL，轻揉腹部2min，随即处死小鼠，收集腹腔液，每个载玻片上滴0.2mL(每鼠两片)；放入37℃温箱中孵育1h，用pH6.4的PBS液轻轻冲洗玻片。吹干，姬姆萨-瑞特染液染色。油镜下计数200个巨噬细胞，计算巨噬细胞吞噬率和吞噬指数。

血清中IL-2，IFN-γ及免疫球蛋白IgG、IgM含量测定：给药10d后各组小鼠，眼眶采血，分离血清，-20℃保存。取上述分离到的血清，测血清中IL-2，IFN-γ及免疫球蛋白IgG、IgM含量。

脾脏淋巴细胞增殖：给药10d后，每组取4只，处死小鼠，无菌采取脾脏，制成单个脾细胞悬液，调整细胞浓度为5×10⁶/mL，用MTT法测定脾脏淋巴细胞增殖情况。

实验结果

1、对小鼠脾脏淋巴细胞增殖的影响

实验结果表明(表11)，在ConA和LPS诱导的小鼠脾淋巴细胞增殖中，高剂量组与空白对照组和黄芪对照组相比，差异极显著(p<0.01)。

表11 本发明动物用复方草药免疫增强剂对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响

^*：与生理盐水对照组相比，^*表示0.01<p<0.05，差异显著，^**表示p<0.01，差异极显著

Δ：与黄芪对照组相比，Δ表示0.01<p<0.05，差异显著，ΔΔ表示p<0.01，差异极显著

2、对IL-2和IFN-γ的影响

实验结果表明(表12)，本发明高剂量组小鼠血清中IL-2含量极显著高于黄芪对照组和生理盐水对照组(p<0.01)，IFN-γ的含量极显著高于对照组(p<0.01)。

表12 本发明动物用复方草药免疫增强剂对小鼠血清中IL-2和IFN-γ的影响(单位：pg/mL)

^*：与生理盐水对照组相比，^*表示0.01<p<0.05，差异显著，^**表示p<0.01，差异极显著

Δ：与黄芪对照组相比，Δ表示0.01<p<0.05，差异显著，ΔΔ表示p<0.01，差异极显著

3、对血清中免疫球蛋白IgG和IgM的影响

实验结果表明(表13)，小鼠血清中的IgG含量，高、低剂量组和黄芪组与对照组相比，差异极显著(p<0.01)，高剂量组与黄芪对照组相比，差异显著(p<0.05)。血清中IgM含量各个组之间没有显著性差异。

表13 本发明动物用复方草药免疫增强剂对小鼠血清中IgG和IgM的影响(单位：ng/mL)

^*：与生理盐水对照组相比，^*表示0.01<p<0.05，差异显著，^**表示p<0.01，差异极显著

Δ：与黄芪对照组相比，Δ表示0.01<p<0.05，差异显著，ΔΔ表示p<0.01，差异极显著

4、对腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响

实验结果表明(表14)，对于吞噬百分率，高、低剂量组与对照相比差异极显著(p<0.01)，高剂量组与黄芪对照组相比，差异显著(p<0.05)；吞噬指数，高、低剂量组、黄芪对照组与生理盐水对照组相比，差异极显著(p<0.01)，中剂量组与黄芪对照组相比，差异显著(p<0.05)。

表14 本发明动物用复方草药免疫增强剂对小鼠腹腔巨噬细胞功能的影响

^*：与生理盐水对照组相比，^*表示0.01<p<0.05，差异显著，^**表示p<0.01，差异极显著

Δ：与黄芪对照组相比，Δ表示0.01<p<0.05，差异显著，ΔΔ表示p<0.01，差异极显著

以上性能测定实验充分证明，本发明的动物用复方中草药免疫增强剂可明显促进淋巴细胞增殖，显著提高动物的体液免疫功能、促进血液中IL-2与IFN-γ等细胞因子的分泌，全面增强机体的各种免疫功能，并且对动物机体肝、肾脏无毒副作用。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1、一种动物用复方中草药免疫增强剂，其特征在于由以下重量份的原料组分制备得到：白花蛇舌草5-15份，黄芪30-50份，党参30-50份。

2、一种权利要求1所述动物用复方中草药免疫增强剂的制备方法，其特征在于：先将所述原料组分粉碎，过筛，再按所述的重量份混匀，加入8-15重量倍去离子水煎煮，趁热过滤后，合并滤液，真空浓缩后分装，高压灭菌即制得。

3、根据权利要求2所述动物用复方中草药免疫增强剂的制备方法，其特征在于：所述筛为40-100目筛。

4、根据权利要求2所述动物用复方中草药免疫增强剂的制备方法，其特征在于：所述煎煮的次数为3-5次。

5、根据权利要求2所述动物用复方中草药免疫增强剂的制备方法，其特征在于：所述真空浓缩的温度为60-70℃。

6、根据权利要求2所述动物用复方中草药免疫增强剂的制备方法，其特征在于：所述高压灭菌是在121℃灭菌30分钟。