CN103610798B

CN103610798B - 一种白花蛇舌草的活性部位及其制备方法、应用

Info

Publication number: CN103610798B
Application number: CN201310615336.4A
Authority: CN
Inventors: 张永勇; 潘家荣
Original assignee: China Jiliang University
Current assignee: China Jiliang University
Priority date: 2013-11-28
Filing date: 2013-11-28
Publication date: 2015-11-04
Anticipated expiration: 2033-11-28
Also published as: CN103610798A

Abstract

一种白花蛇舌草的活性部位及其制备方法、应用，属于中药技术领域。该活性部位由以下步骤制得：取白花蛇舌草，加15～20倍量的95%乙醇，回流提取，过滤，合并提取液，减压回收溶剂，得提取物；提取物用热水溶解，过滤，大孔树脂柱层析，用乙醇溶液进行洗脱，收集洗脱液，减压回收溶剂，得洗脱物；洗脱物再用水溶解，过滤，聚酰胺柱层析，用水洗脱，收集水洗脱液，减压浓缩，干燥，得活性部位。本发明采用的方法简单，适合工业化生产；所采用的分离材料价廉可反复使用，降低了成本；最后所得的活性部位杂质少，纯度高，药效更明显。

Description

一种白花蛇舌草的活性部位及其制备方法、应用

技术领域

本发明属于中药技术领域，具体涉及一种白花蛇舌草的活性部位及其制备方法、应用。

背景技术

白花蛇舌草（Hedyotis diffusa Willd.）为茜草科植物，有清热解毒，利尿消肿，活血止痛等功效。广泛分布于广东、广西、湖南、福建、浙江等南方各省。内服多用于治疗恶性肿瘤、肝炎、阑尾炎、泌尿系统感染、支气管炎、扁桃体炎、喉炎等疾病，外用可治疗毒蛇咬伤、痈肿疔疮等等。白花蛇舌草主要含有黄酮类、蒽醌类、萜类和甾醇类等化学成分，药理作用包括抗肿瘤、抗氧化、抗菌、免疫调节和保肝等作用。在中医临床上，常以白花蛇舌草为主药治疗乙型病毒性肝炎患者。但其治疗乙型肝炎的物质基础一直不够明确，迄今未见白花蛇舌草的活性部位治疗乙型肝炎的报道。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于设计提供一种白花蛇舌草的活性部位及其制备方法、应用的技术方案。

所述的一种白花蛇舌草的活性部位，其特征在于通过以下步骤制得：

1）取白花蛇舌草，加15～20倍量的95%乙醇，回流提取，过滤，合并提取液，减压回收溶剂，得提取物；

2）提取物用热水溶解，过滤，大孔树脂柱层析，用乙醇溶液进行洗脱，收集洗脱液，减压回收溶剂，得洗脱物；

3）洗脱物再用水溶解，过滤，聚酰胺柱层析，用水洗脱，收集水洗脱液，减压浓缩，干燥，得活性部位。

所述的一种白花蛇舌草的活性部位，其特征在于所述的步骤1）中回流提取3次，第一次2小时，第二次1.5小时，第三次1小时。

所述的一种白花蛇舌草的活性部位，其特征在于所述的步骤2）中热水温度为70～80℃，大孔树脂的型号为D101、AB-8、NKA-9、HPD-400中的一种，乙醇浓度为30～60%。

所述的一种白花蛇舌草的活性部位，其特征在于所述的步骤3）中聚酰胺型号为PA6或PA66。

所述的一种白花蛇舌草的活性部位在制备治疗乙型肝炎药物中的应用。

所述的一种白花蛇舌草的活性部位的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

所述的一种白花蛇舌草的活性部位的制备方法，其特征在于所述的步骤1）中回流提取3次，第一次2小时，第二次1.5小时，第三次1小时。

所述的一种白花蛇舌草的活性部位的制备方法，其特征在于所述的步骤2）中热水温度为70～80℃，大孔树脂的型号为D101、AB-8、NKA-9、HPD-400中的一种，乙醇浓度为30～60%。

所述的一种白花蛇舌草的活性部位的制备方法，其特征在于所述的步骤3）中聚酰胺型号为PA6或PA66。

本发明具有以下有益效果：

1、本发明提取纯化所采用的方法简单，适合工业化生产；所采用的分离材料价廉可反复使用，降低了成本；最后所得的活性部位杂质少，纯度高，药效更明显。

2、本发明所得的活性部位主要含有环烯醚萜类成分，以鸡屎藤次苷甲酯为对照品，采用比色法（二硝基苯肼法显色反应）测得总环烯醚萜的含量大于80%。

3、该活性部位对四氯化碳和氨基半乳糖致大鼠急性肝损伤具有保肝作用，对鸭乙肝病毒(DHBV) 具有抗病毒与保护肝细胞的作用。

具体实施方式

以下结合实施例来进一步说明本发明。

实施例1：

取白花蛇舌草1kg，粉碎成粗粉，第一次加入20倍量95%乙醇，回流提取2小时，过滤，得提取液I；第二次加入18倍量95%乙醇，回流提取1.5小时，过滤，得提取液II；第三次加入15倍量95%乙醇，回流提取1小时，过滤，得提取液III；合并三次提取液，减压回收乙醇至无醇味，得提取物流浸膏；用70～80℃的热水1L溶解提取物，过滤，过D101大孔树脂柱，依次用水、10%乙醇、50%乙醇洗脱，收集50%乙醇洗脱液，减压回收乙醇至无醇味，得洗脱物；在洗脱物中加入300ml水溶解，过滤，过PA6聚酰胺柱，用6倍量柱体积的水洗脱，得水洗脱物，减压浓缩，干燥，得活性部位5.8g。

实施例2：

取白花蛇舌草1kg，粉碎成粗粉，第一次加入20倍量95%乙醇，回流提取2小时，过滤，得提取液I；第二次加入18倍量95%乙醇，回流提取1.5小时，过滤，得提取液II；第三次加入15倍量95%乙醇，回流提取1小时，过滤，得提取液III；合并三次提取液，减压回收乙醇至无醇味，得提取物流浸膏；用70～80℃的热水1L溶解提取物，过滤，过AB-8大孔树脂柱，依次用水、10%乙醇、60%乙醇洗脱，收集60%乙醇洗脱液，减压回收乙醇至无醇味，得洗脱物；在洗脱物中加入300ml水溶解，过滤，过PA6聚酰胺柱，用6倍量柱体积的水洗脱，得水洗脱物，减压浓缩，干燥，得活性部位5.2g。

实施例3：

取白花蛇舌草1kg，粉碎成粗粉，第一次加入20倍量95%乙醇，回流提取2小时，过滤，得提取液I；第二次加入18倍量95%乙醇，回流提取1.5小时，过滤，得提取液II；第三次加入15倍量95%乙醇，回流提取1小时，过滤，得提取液III；合并三次提取液，减压回收乙醇至无醇味，得提取物流浸膏；用70～80℃的热水1L溶解提取物，过滤，过NKA-9大孔树脂柱，依次用水、10%乙醇、30%乙醇洗脱，收集30%乙醇洗脱液，减压回收乙醇至无醇味，得洗脱物；在洗脱物中加入300ml水溶解，过滤，过PA66聚酰胺柱，用6倍量柱体积的水洗脱，得水洗脱物，减压浓缩，干燥，得活性部位4.7g。

实施例4：

取白花蛇舌草1kg，粉碎成粗粉，第一次加入20倍量95%乙醇，回流提取2小时，过滤，得提取液I；第二次加入18倍量95%乙醇，回流提取1.5小时，过滤，得提取液II；第三次加入15倍量95%乙醇，回流提取1小时，过滤，得提取液III；合并三次提取液，减压回收乙醇至无醇味，得提取物流浸膏；用70～80℃的热水1L溶解提取物，过滤，过HPD-400大孔树脂柱，依次用水、10%乙醇、40%乙醇洗脱，收集40%乙醇洗脱液，减压回收乙醇至无醇味，得洗脱物；在洗脱物中加入300ml水溶解，过滤，过PA66聚酰胺柱，用6倍量柱体积的水洗脱，得水洗脱物，减压浓缩，干燥，得活性部位5.3g。

实施例5：所得活性部位的保肝和抗乙肝病毒实验

1、活性部位（由实施例1制得）对四氯化碳致小鼠急性肝损伤的保护作用

健康雄性昆明种小鼠60只，随机分为正常对照组，模型组，阳性对照（联苯双酯，150mg/kg）组，高（400mg/kg）、中（200mg/kg）、低（100mg/kg）剂量组，每组10只，每天灌胃给药2次，连续7d。末次给药后，每只小鼠按10mL/kg腹腔注射以植物油配制的0.1%CCl₄溶液，24h后，眼内眦静脉丛取血0.8mL，放置30min，3000r/min离心5min，取血清，按试剂盒操作要求测定ALT和AST（见表1）；取肝脏，称总重，求算肝脏指数；取汇管区肝脏组织，以10%甲醛溶液固定，石蜡包埋，HE染色，做病理组织学检查。

表1 活性部位对四氯化碳致肝损伤小鼠血清ALT和AST活力的影响（ ±s，n=10）

注：与模型组比较**P<0.01，*P<0.05。

生化指标显示，白花蛇舌草活性部位高、中剂量组与联苯双酯组血清ALT与模型组比较具有显著性差异（P＜0. 01）；白花蛇舌草活性部位高剂量组与联苯双酯组血清AST与模型组比较具有显著性差异（P＜0. 01）。病理切片结果表明，高中剂量组的肝细胞坏死，变性及炎性细胞浸润程度均有明显减轻，表明高中剂量组均有较强保护肝损伤作用。

2、活性部位对氨基半乳糖致小鼠急性肝损伤的保护作用

健康雄性昆明种小鼠60只，随机分为正常对照组，模型组，阳性对照（联苯双酯，150mg/kg）组，高（400mg/kg）、中（200mg/kg）、低（100mg/kg）剂量组，每组10只，每天灌胃给药2次，连续7d。末次给药后，腹腔注射800mg/kg D-GalN，24h后，眼内眦静脉丛取血0.8mL，放置30min，3000r/min离心5min，取血清，测定ALT和AST，按试剂盒操作要求测定ALT和AST（见表2）；取肝脏，称总重，求算肝脏指数；取汇管区肝脏组织，以10%甲醛溶液固定，石蜡包埋，HE染色，做病理组织学检查。

表2 活性部位对氨基半乳糖致肝损伤小鼠血清ALT和AST活力的影响（±s，n=10）

注：与模型组比较**P<0.01，*P<0.05。

生化指标显示，与模型组比较，白花蛇舌草活性部位各剂量组小鼠血清中ALT，AST活性的显著降低（P＜0.05），并呈较好的量效关系。病理切片结果表明，白花蛇舌草活性部位各剂量组小鼠肝细胞病变程度较轻，其中高剂量组效果最好，肝细胞水肿不明显，可见肝细胞再生现象，偶伴有点状坏死，与模型组比，病变程度明显减轻，表明各剂量组均有较强保护肝损伤作用。

3、活性部位对鸭体内抗乙型肝炎病毒和保护肝细胞作用

用健康成年广西麻鸭所产蛋孵化的1日龄雏鸭，于腹腔注射DHBV－DNA强阳性病毒血清0.2mL 接种7d后，分别从胫静脉采血0.2～0.3mL，装入一次性EP管中，整个过程不应交叉污染。于4000r·min－1离心5min，取血清于－20℃保存备用。经ELISA法检测筛选出感染的阳性鸭，饲养至13日龄作为实验动物进行药物治疗试验。将50只鸭随机均分为模型组（生理盐水）、拉米夫定（0.05g·kg^-1·d^-1）组和高（1g·kg^-1·d^-1）、中（0.5g·kg^-1·d^-1）、低（0.25g·kg^-1·d^-1）剂量活性部位组。各组每天早上灌胃给药1次，连续14d，实验期间麻鸭自由取食和饮水。于用药第0、7、14天及停药第7天时，分别从胫静脉采血约2mL，分离血清，于－20℃保存备用。采用斑点杂交法，用地高辛标记DHBV－DNA探针，将用药前后的血清统一对比检测，以与探针同源的质粒DNA倍比稀释后点样于硝酸纤维薄膜上杂交显示的斑点颜色深浅为标准，用扫描仪进行膜片扫描，对斑点进行定量分析血清中DHBV－DNA滴度（见表3）。用全自动生化分析仪检测血清中的ALT（见表4）和AST（见表5）。

表3 活性部位对血清DHBV－DNA滴度的影响（±s，n=10）

注：与模型组比较**P<0.01，*P<0.05。

表3显示: 模型组用药前后血清中DHBV－DNA滴度无明显降低。拉米夫定组于用药14d后血清中DHBV－DNA滴度明显降低( P＜0.01) ，停药后有反跳现象。白花蛇舌草中高剂量组分别于第7天( T7)、第14天( T14) 开始出现DHBV－DNA滴度降低( P＜0．01或P＜0．05) ；停药后7天( P7)，高剂量组的DHBV－DNA滴度仍维持在较低水平( P＜0．05) ，无反跳现象。

表4 活性部位治疗前后鸭血清中ALT水平的变化情况（±s，n=10）

注：与模型组比较**P<0.01，*P<0.05。

表5 活性部位治疗前后鸭血清中AST水平的变化情况（±s，n=10）

注：与模型组比较**P<0.01，*P<0.05。

表4、表5显示，与模型组比较，白花蛇舌草活性部位中高剂量组、拉米夫定组用药后7～14d，血清ALT、 AST的含量均明显降低( P＜0.05或P＜0.01)；停药后7d，白花蛇舌草活性部位高剂量组ALT、AST仍能维持在较低水平( P＜0.05) ，而拉米夫定组ALT、AST则出现明显反跳现象。

以上结果表明，白花蛇舌草活性部位具有保肝和抗乙肝病毒的作用，各实施例所得活性部位均有类似的实验结论。该活性部位可以开发成具有保肝或抗乙型肝炎病毒的药物。

Claims

1.一种白花蛇舌草的活性部位，其特征在于通过以下步骤制得：

1）取白花蛇舌草，加15～20倍量的95%乙醇，回流提取3次，第一次2小时，第二次1.5小时，第三次1小时，过滤，合并提取液，减压回收溶剂，得提取物；

2）提取物用70～80℃热水溶解，过滤，大孔树脂柱层析，用浓度为30～60%的乙醇溶液进行洗脱，收集洗脱液，减压回收溶剂，得洗脱物；

3）洗脱物再用水溶解，过滤，聚酰胺柱层析，聚酰胺型号为PA6或PA66，用水洗脱，收集水洗脱液，减压浓缩，干燥，得活性部位。

2.如权利要求1所述的一种白花蛇舌草的活性部位，其特征在于所述的步骤2）中大孔树脂的型号为D101、AB-8、NKA-9、HPD-400中的一种。

3.一种白花蛇舌草的活性部位的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

4.如权利要求3所述的一种白花蛇舌草的活性部位的制备方法，其特征在于所述的步骤2）中大孔树脂的型号为D101、AB-8、NKA-9、HPD-400中的一种。