CN103230435B

CN103230435B - 一种促进肝细胞再生的中药的制备方法

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Publication number: CN103230435B
Application number: CN201310178182.7A
Authority: CN
Inventors: 熊富良; 黄志军; 李崇明
Original assignee: WUHAN JIANMIN PHARMACEUTICAL GROUP CO Ltd
Current assignee: JIANMIN PHARMACEUTICAL GROUPS CORP., LTD.
Priority date: 2013-05-15
Filing date: 2013-05-15
Publication date: 2015-05-13
Anticipated expiration: 2033-05-15
Also published as: CN103230435A

Abstract

本发明公开了一种促进肝细胞再生的中药，所述中药由下述重量配比的原料制成：葛根10~50份、丹参5~30份、人参3~15份。本发明还公开了所述中药的制备方法：取葛根、丹参、人参，加入6~12倍65~85%的乙醇，回流提取1~3次，每次1~3小时，合并提取液并浓缩至60℃时相对密度为1.25~1.35的稠膏，再加入辅料制成适合临床使用的剂型。本发明具有疏肝理气、活血化瘀的功效，可用于慢性肝炎、病毒性肝炎、酒精肝等引起的肝细胞损伤和肝纤维化的预防和治疗。疗效确切，副作用少。

Description

一种促进肝细胞再生的中药的制备方法

技术领域

本发明涉及一种中药，具体地是涉及一种促进肝细胞再生的中药及其制备方法。

背景技术

肝脏在人体内的作用十分重要，一旦损伤会影响代谢、解毒、免疫和抗微生物等功能。正常成人肝脏的肝细胞是一种长寿命细胞，平常极少见分裂增殖，但在肝受损害后，特别是肝部分切除术后，残余的肝细胞迅速出现活跃的分裂增殖，动物实验证明将正常肝脏切除70％~80％，仍可维持正常生理功能。但40岁以后，肝的再生能力减弱，这与机体的代谢能力是一致的。肝细胞再生是对病毒性、化学性、缺血性和免疫性损伤及部分肝切除术后的一种高度代偿性反应，肝具有如此大的再生能力，其机制迄今还不完全清楚。目前已知，肝再生受肝内外诸多因子的调控，在肝受损害或部分切除后，有关因子的量发生变化，它们通过肝细胞相应的受体作用于肝细胞，启动和促进或者抑制肝细胞的增殖。

肝损伤发生后，肝细胞再生活跃与否是肝脏功能维持的关键。因此，通过促进肝细胞的再生对病变肝脏进行修复，应是肝炎治疗的重点之一。大量研究报道显示许多中药复方具有保护肝细胞、修复其损伤、促进其再生的作用。中药复方抗肝损伤的治法治则大致有疏肝理气、活血化瘀、补肾健脾益气养血、清热利湿解毒四大类，如疏肝理气类小柴胡汤是治疗慢性肝脏疾病临床用方之一，大量临床实践已证实了它对慢性肝炎的有效性。

发明内容

本发明的目的是提供一种促进肝细胞再生的中药及其制备方法。

一种促进肝细胞再生的中药，所述中药由下述重量配比的原料制成：

葛根10~50份丹参5~30份人参3~15份。

优选地，所述原料的重量配比是：

葛根20~40份丹参15~20份人参5~12份。

最佳地，所述原料的重量配比是：

葛根30份丹参18份人参9份。

所述中药除了上述原料外，还可以包括辅料，所述辅料可以是蔗糖、淀粉、糊精、硬脂酸镁、山梨醇、甘露醇、乳糖、微晶纤维素、微粉硅胶、羧甲基纤维素、水等这些药物制剂中常规辅料的一种或多种的组合，具体选择哪一种或哪几种辅料应根据所需要制成的剂型来确定。

所述中药可以是适合于临床使用的任何一种剂型，例如：汤剂、片剂、颗粒剂、胶囊剂、丸剂、膏剂、合剂、糖浆剂等。所述原料可以粉碎后直接服用，也可以经提取、精制、浓缩后再制成适当的剂型，例如可以将原料熬成汤剂，也可以全部粉碎后加入适当的辅料制成片剂、散剂、颗粒剂、胶囊剂、丸剂，或者将原料全部提取后再加入适当的辅料制成片剂、颗粒剂、胶囊剂、膏剂、合剂、糖浆剂，还可以将原料部分粉碎、部分提取后再加入适当的辅料制成片剂、颗粒剂、胶囊剂等。提取方法可以采用中药制备中常规的水煎提取或乙醇回流提取法。

葛根的主要成分有异黄酮类（如葛根素）、葛根苷类、三萜皂苷类等，其中异黄酮类是其主要活性成分，文献报道的葛根总黄酮的提取方法有三种：一种以水煎煮进行提取，一种以一定浓度乙醇进行回流提取，还有一种方法以乙醇渗漏法进行提取。丹参的主要成分有丹参酮（如丹参酮ⅡA）、丹酚酸等，提取方法也有水提、醇提两类。人参的主要成分是人参皂甙、人参二醇、人参多糖等，常用渗漏法和乙醇回流法进行提取。我们在大量试验的基础上，发现乙醇回流法提取的效果最好，不仅各指标成分如丹参酮ⅡA、葛根素、人参皂甙Rg的提取转移率（即提取物中的指标成分总量占提取药材中的指标成分总量的比率）最高，说明提取的有效成分最多，而且提取物中的指标成分（丹参酮ⅡA、葛根素、人参皂甙Rg）含量最高，而含量越高说明提取物中的有效成分更加富集，杂质更少。

本发明优选的一种制备方法是：按重量配比取葛根、丹参、人参，按重量加入6~12倍质量浓度为65~85%的乙醇，回流提取1~3次，每次1~3小时，合并提取液并浓缩至60℃时相对密度（相对于水的密度）为1.25~1.35的稠膏，再加入辅料制成适合临床使用的剂型。

最佳的制备方法是：按重量配比取葛根30份、丹参18份、人参9份，按重量加入8倍质量浓度为75%的乙醇，回流提取2次，每次2小时，合并提取液并浓缩至60℃时相对密度为1.3的稠膏，再加入辅料制成适合临床使用的剂型。采用该制备方法得到的稠膏中，丹参酮ⅡA的平均含量达12.2mg/g、葛根素的平均含量达17.8mg/g、人参皂甙Rg的平均含量达5.6mg/g（均采用高效液相法测定），通过测定药材中的含量，计算出丹参酮ⅡA的平均转移率达27.8%、葛根素的平均转移率达21.4%、人参皂甙Rg的平均转移率达30.9%。综合提取效果高于水煎煮法、渗漏法和其它提取方法。

优选地，所述剂型为胶囊剂。

本发明具有疏肝理气、活血化瘀的功效，可用于慢性肝炎、病毒性肝炎、酒精肝等引起的肝细胞损伤和肝纤维化的预防和治疗。疗效确切，副作用少，药效试验表明：

1）对四氯化碳诱导的大鼠肝损伤模型，本发明能降低血清中AST、ALT的含量，提高血清中白蛋白(ALB)的含量，降低血清中的甘油三酯的含量，提高血清中总白蛋白(TP)的含量，能降低血清中胆红素和碱性磷酸酶的含量，提示本发明具有明显的保肝降酶的作用；

2）对Con A致免疫性肝损伤小鼠模型，本发明能降低模型小鼠血清中ALT、AST和肝匀浆中MDA水平，增强肝匀浆中重要的抗氧化酶SOD的活性，减轻肝脏的病理性损伤，表明TPF对Con A诱导的小鼠免疫性肝损伤具有保护作用；

3）本发明含药血清能刺激WB-F344细胞的增殖，对大鼠肝干细胞具有增殖和诱导分化的作用。

具体实施方式

实施例1

一种促进肝细胞再生的中药，由下述重量配比的原料制成：

葛根10份丹参5份人参3份。

制备方法是：将葛根、丹参、人参粉碎成细粉，灭菌后直接服用。

用法用量是：每日三次，每次6g。

功能主治是：疏肝理气、活血化瘀。用于慢性肝炎、病毒性肝炎、酒精肝等引起的肝细胞损伤和肝纤维化的预防和治疗。

实施例2

一种促进肝细胞再生的中药，由下述重量配比的原料制成：

葛根50份丹参5份人参3份。

制备方法是：将葛根、丹参、人参加3倍水煎煮2次，每次30min，过滤，制成汤剂。

用法用量是：每日三次，每次一剂（相当于生药材15g）。

实施例3

一种促进肝细胞再生的中药，由下述重量配比的原料制成：

葛根50份丹参30份人参15份。

制备方法是：取葛根、丹参、人参，按重量加入6倍质量浓度为85%的乙醇，回流提取3次，每次1小时，合并提取液并浓缩至60℃时相对密度为1.25的稠膏，再加入糖粉制成颗粒剂。

用法用量是：每日三次，每次3粒（相当于生药材12g）。

实施例4

葛根40份丹参15份人参5份。

制备方法是：取葛根、丹参、人参，按重量加入12倍质量浓度为65的乙醇，回流提取1次，提取3小时，合并提取液并浓缩至60℃时相对密度为1.35的稠膏，再加入微晶纤维素、淀粉、硬脂酸镁制成片剂。

用法用量是：每日三次，每次3粒（相当于生药材15g）。

实施例5

葛根20份丹参20份人参12份。

制备方法是：取葛根、丹参、人参，按重量加入10倍质量浓度为80%的乙醇，回流提取2次，每次1小时，合并提取液并浓缩至60℃时相对密度为1.3的稠膏，再加入适量微晶纤维素，淀粉，制粒，用胶囊填充，制成胶囊剂。

用法用量是：每日三次，每次3粒（相当于生药材16g）。

实施例6

葛根30份丹参18份人参9份。

取葛根、丹参、人参，按重量加入8倍质量浓度为75%的乙醇，回流提取2次，每次2小时，合并提取液并浓缩至60℃时相对密度为1.3的稠膏，再加入适量微晶纤维素，淀粉，制粒，用胶囊填充，制成胶囊剂。

用法用量是：每日三次，每次3粒（相当于生药材19g）。

实施例7 本发明药物对大鼠四氯化碳慢性肝损伤的药理研究

1 试验材料

1.1 实验动物 SD大鼠，清洁级，由武汉大学医学院药理研究室提供。

1.2试剂及仪器

1.2.1 实验药物本发明实施例4、5、6药物；小柴胡颗粒，由广州白云山药业有限责任公司生产。

1.2.2主要试剂 ALT(丙氨酸氨基转移酶)试剂盒、AST(天门冬氨酸氨基转移酶)试剂盒、ALB(白蛋白)试剂盒、总胆红素试剂盒、TP(总蛋白)试剂盒，购自南京建成生物有限公司；甘油三酯试剂盒、总胆固醇试剂盒，北京北化康泰临床试剂有限公司；生理盐水。

1.2.3 主要仪器 Rayto RT1904型半自动生化分析仪(深圳雷杜生命科学股份有限公司)；UV-9100分光光度计；电子分析天平(上海精密科学仪器有限公司)；TGL-16C高速台式离心机(上海安亭科学仪器厂)。

2 实验方法

2.1 造模与分组选取SD大鼠72只，体重140-180 g，雄性，按体重随机分为6组，即空白组12只，四氯化碳肝损伤模型组60只，四氯化碳肝损伤模型组大鼠皮下注射40％四氯化碳色拉油溶液，第1次按 0.5mL/100g，以后每次按0.3mL/l00g给予，每周2次，连续8周。造模第4周时眼眶取血，测定血清AST，按体重和AST含量随机分为5组：模型组、小柴胡颗粒组、实施例4、5、6组。

2.2 给药方法造模4周后开始灌胃给药：空白组和模型组均给予蒸馏水；其余各组分别给予小柴胡颗粒颗粒、实施例4、5、6药液；灌胃容积为10ml/kg，每天给药1次，连续给药4周，实验结束前动物称重，禁食12h，测定各项指标。

2.3 统计方法 SPSS 17．0软件进行统计分析，描述指标采用表示，多组样本均数间的比较采用单因素方差分析。

3 结果

我们采用四氯化碳诱导的大鼠肝损伤模型，研究时发现实施例4、5、6组与模型组比较，均能降低血清中AST、ALT的含量，提高血清中白蛋白(ALB)的含量，降低血清中的甘油三酯的含量，提高血清中总白蛋白(TP)的含量，提示本发明具有明显的保肝降酶的作用；表3表明本发明均能降低血清中胆红素和碱性磷酸酶的含量，提示有保肝作用，同时具有提高免疫作用。结果见表1~3。

表1 各组大鼠慢性肝损伤血液生化指标比较

注：与空白组比较，^a P<0.01；与模型组比较，^bP<0.05，^cP<0.01。

表2 各组大鼠慢性肝损伤血液总蛋白和甘油三酯比较

注：与空白组比较，^aP<0.05，^bP<0.01；与模型组比较^cP<0.05。

表3 各组大鼠慢性肝损伤血液胆固醇、胆红素、碱性磷酸酶比较

注：与空白组比较，^aP<0.01；与模型组比较，^bP<0.05。

实施例8 本发明对小鼠免疫性肝损伤的保护作用

1 试验材料

1.1 实验动物同实施例1。

1.2 试剂

联苯双酯(bifendate，BF)：浙江医药股份有限公司新昌制药厂；刀豆蛋白A(美国Sigma公司)；考马斯亮蓝、MDA、SOD、ALT、AST试剂盒均购自南京建成生物工程研究所；IFN-γ、TNF-α试剂盒为eBioscience公司产品；UV1200紫外可见分光光度计，上海美谱达仪器有限公司；酶标仪（NA9602)，北京普朗新技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1 分组60只小鼠按体重随机分为正常组、阳性药组(BF， 200mg·kg^-1)、模型组、本发明实施例4、5、6组，每组10只。

1.2.2 造模按免疫性肝损伤造模方法，模型组尾静脉注射Con A生理盐水液20mg·kg^-1，造成急性免疫性肝损伤模型。

1.2.3 实施例4、5、6组按生药4g/Kg，每日灌胃给药1次，正常组和模型组每日灌胃等体积的生理盐水溶液1次，连续灌胃10d。末次灌胃后，除正常组尾静脉注射生理盐水外，其余各组均尾静脉注射Con A生理盐水液20mg·Kg^-1。禁食8 h后，摘眼球取血离心，留取血清待检。

1.2.4 指标测定末次给药禁食8h后摘除眼球取血，离心15min(3000r·min )，分离血清，测定血清中ALT、AST值。取10％肝匀浆用同样时间离心得上清液，测定上清液中MDA、SOD、IFN-γ、TNF-α含量，其中IFN-γ、TNF-α采用ELISA法测定，各项检测严格按试剂盒标示方法操作。

1.3 统计学处理数据应用SPSS 11．0软件包处理，实验结果均以表示，组间显著性用t检验及相关分析。

2 结果

2.1 实施例4、5、6组对Con A致免疫性肝损伤小鼠血清中ALT、AST和肝匀浆中MDA、SOD、IFN-γ、TNF-α的影响模型组小鼠与正常组比较差异有显著性(P<0.05)；实施例4、5、6组与模型组比较，其小鼠血清ALT、AST、肝匀浆中MDA、IFN-γ、TNF-α含量降低，差异有显著性(P<0.05)；肝匀浆中SOD升高，差异具有统计学意义(P<0.05)，见表4、5。

表4 各组大鼠免疫性肝损伤血液ALT、AST、MDA比较

注：与模型组比较，^aP<0.01；与空白组比较，^bP<0.05。

表5 各组大鼠免疫性肝损伤血液SOD、IFN-γ、TNF-α比较

注：与模型组比较，^aP<0.01；与空白组比较，^bP<0.05。

本发明能降低免疫性肝损伤模型小鼠血清中ALT、AST和肝匀浆中MDA水平，增强肝匀浆中重要的抗氧化酶SOD的活性，减轻肝脏的病理性损伤，表明TPF对Con A诱导的小鼠免疫性肝损伤具有保护作用。

实施例9 含药血清对大鼠肝干细胞增殖、诱导分化作用

1)含药血清的制备

将大鼠分为空白组、实施例4组、实施例5组、实施例6组，每组各16只。实施例4组、实施例5组、实施例6组采用传统灌胃方法制作含药血清。各组给相应的药物连续灌胃7d(1次/d)，给药量均为生药3.2g/L，大鼠按体重100g灌胃1mL的量给药，空白组灌胃等量的生理盐水，连续1周，末次给药后2h进行大鼠颈动脉取血，将采集的血液在室温中静置4h，3000r/min．离心15 min，将收集的血清在56℃水浴30min进行灭活，而后过滤除菌，分装成小瓶于-20℃保存备用，需要时用培养液配制成不同浓度的含药血清。

2)细胞的培养

用50mL的培养瓶，将WB-F344接种于含10％胎牛血清、2mmol/L谷氨酰胺、100U/mL青霉素及链霉素的高糖DMEM培养基中，细胞浓度为2×10 ⁴ 个/mL，置于5％CO₂、37℃的培养箱中培养。细胞换液时间为2~3d，3~5d传代，0.25％胰蛋白酶消化后1∶2传代。

3) MTT法检测细胞的增殖

取对数生长期WB-F344细胞用胰酶消化，调密度为1×10⁵/mL，按每孔100L接种96孔细胞培养板。于37℃ 、5％C0 条件下，用含10％胎牛血清的高糖DMEM培养基培养24h后，分别加入药物血清，空白对照组加入正常大鼠血清，正常对照组加入等量的培养液，以上每个浓度设6个平行孔，作用24h，每孔再加入5mg/mL MTT25μl，4h后弃上清液，加入DMSO 125μl/孔，振荡5min左右，置于酶标仪上490nm波长处测定吸光度OD值。

4)统计学方法

采用SPSS 13.0软件进行分析，计量资料数据以均数±标准差表示。多组均数问比较行完全随机设计的方差分析。

5)结果

HTT检测含药血清对WB-F344细胞增殖的影响结果表明，实施例4、5、6含药血清均能刺激WB-F344细胞的增殖，与空白、正常对照组比较OD值显著升高(P<0.O1)；各组含药血清对WB-F344细胞作用24h后，未表现出对细胞的毒性作用。见表6。

表6 本发明含药血清对WB-F344增值的影响

注：与正常组比较，^aP<0.01；与空白组比较，^bP<0.01。

Claims

1.一种促进肝细胞再生的中药的制备方法，其特征在于：按重量配比取葛根30份、丹参18份、人参9份，按重量加入8倍质量浓度为75％的乙醇，回流提取2次，每次2小时，合并提取液并浓缩至60℃时相对密度为1.3的稠膏，再加入辅料制成适合临床使用的剂型。

2.根据权利要求1所述促进肝细胞再生中药的制备方法，其特征在于：所述剂型为胶囊剂。