CN103372038A - 积雪草提取物的新应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种从积雪草中获得提取物的方法。选用乙醇作为提取剂将积雪草在室温下浸渍提取或超声提取或加热回流提取，提取次数可为一次或多次，经减压干燥后获得粗提取物，称重。将粗提取物分散到适量的水中，然后利用等量石油醚、氯仿等有机溶剂中的任何一种萃取除去脂溶性杂质，再利用等量正丁醇萃取即可获得积雪草正丁醇提取物。采用体外检测抗脂肪酸合成酶活性的方法，对积雪草提取物的生物活性进行了研究。实验证实积雪草提取物具有很强的抗脂肪酸合成酶的活性，表明积雪草提取物可作为一种脂肪酸合成酶的抑制剂，配以适当的赋形剂，可用于制备治疗肥胖症和预防肥胖的各种药物剂型或膳食补充剂的新用途。
Description
技术领域
本发明涉及医药技术领域，具体是关于一种积雪草提取物或组合物作为脂肪酸合成酶抑制剂及其在制备预防或治疗肥胖症药物及减肥产品等方面的应用。
背景技术
肥胖是一种复杂的、多因素决定的代谢失调症，发病率呈上升趋势，世界卫生组织的报告指出，全球约2.5亿的成年人患肥胖症。据统计，发达国家每年用于治疗肥胖的费用就达到了医疗总费用的2％-7％，肥胖症已成为一种迫切亟待解决的问题。从根本上来说，肥胖源于食物摄入与能量消耗之间的平衡的破坏。目前在临床上疗效确切的减肥药物多为化学合成药物，如去甲肾上腺素摄取抑制剂等，长期服用毒副作用大。因此迫切需要开发疗效确切、毒副作用低的减肥产品。
脂肪酸合酶(FAS)是体内脂肪合成的关键酶，是催化长链脂肪酸形成的关键酶。抑制FAS的活性，既能阻滞生脂通路以减少脂肪的合成，又能够造成丙二酰辅酶A浓度的升高来抑制中枢系统调控食欲的神经肽从而达到降低食欲的目的。因此FAS是体内能量消耗和储存的调节靶位。Loftus等通过给小鼠腹膜内注射FAS抑制剂C75观测到小鼠体重明显减轻。这种体重的减轻呈剂量依赖性，并随剂量的增加作用的时间延长。但是停药后，小鼠随药物作用的消失恢复失去的体重，而不会持续消瘦。
近些年，FAS抑制剂的研究引起极大关注，田维熙教授等人研究表明绿茶中的成分-表没食子酸儿茶素没食子酸酯(EGCG)是有效的FAS抑制剂，它和C75有不同的抑制表现及作用部位，研究表明绿茶和中药何首乌都具有抑制脂肪酸合酶和减肥的作用(李丽春等，中国生物化学与分子生物学学报，2003，19(3)：297-304；张睿等，云南大学学报，2004，26(6A)：42-47)。另有报道，EGCG能减轻小鼠食欲和体重(Kao JH.，Endocrinology，2000，141(3)：980～987)。大量的科学研究已经证实脂肪酸合酶抑制剂在预防和治疗肥胖方面的潜在的应用。本发明描述了积雪草提取物对FAS的抑制作用。
积雪草(Centella asiatica(L.)Urban)异称落得打、崩大碗、马蹄草、半边钱等，为伞形科积雪草属植物，全草入药，广泛分布于我国华南、华北、中南及西南地区，在我国医学上将其外用及内服治病已有两千多年历史。据《神农本草经》记载，积雪草性寒，味苦、辛，具有清热利湿、解毒消肿之功效，临床上常用于治疗湿热黄疸、中暑腹泻、砂淋血淋、痈肿疮毒、跌打损伤等。在我们的研究中，首次发现了积雪草提取物具有很好的抗脂肪酸合酶FAS活性，可以用于制备减肥产品。
发明内容
本发明的目的是提供一种脂肪酸合成酶抑制剂及其制备方法。
本发明提供了一种积雪草提取物或组合物作为脂肪酸合成酶抑制剂及其用于生产预防或治疗肥胖症药物及减肥膳食补充剂中的用途。
积雪草提取物可选用乙醇在室温下浸渍提取或超声提取或加热回流提取获得，提取次数可为一次或多次，减压干燥，称重。提取物分散到适量的水中，然后利用等量石油醚、氯仿等有机溶剂中的任何一种萃取除去脂溶性杂质，再利用等量正丁醇萃取获得积雪草正丁醇提取物。
为了提高所述提取物的纯度，所述浸取后还进行了高速逆流的浓缩；所述浓缩的方法为溶剂体系：正己烷-正丁醇-甲醇-水(3∶1∶2∶3-4∶4.5∶6∶5)，将200mg积雪草提取物溶于10mL固定相中上样，转速为800r/min；检测波长为210nm和254nm；流速为2mL/min；25℃恒温，收集1-4小时的流出组分获得活性提取物。
以活性化合物X为标准物质测定积雪草活性提取物含量测定，含量大于30％。利用高效液相色谱的方法表征了提取物的指纹图谱(RP-C18)分析型色谱柱；Symmetry C18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm，美国Waters公司)，流动相为乙腈-10mmol/L乙酸铵水溶液(38∶62，V/V)，流速1.0mL/min，检测波长254nm，柱温25℃，进样量为20μL，可监测到10-16个色谱峰，活性化合物X的保留时间约为5.0min。
采用体外抗脂肪酸合成酶活性检测方法，对积雪草提取物的生物活性进行了研究，证实了积雪草提取物具有很强的抗脂肪酸合成酶活性。
本发明的优点是从中药积雪草中提取抑制脂肪酸合成酶活性的有效成分，提取物活性高且对人体无害。将积雪草提取物配以适当的赋形剂，可用于制备预防肥胖和治疗肥胖症的各种药物剂型或膳食补充剂。
附图说明
图1为积雪草提取物在210nm波长下的HPLC谱图。
图2为积雪草提取物在210nm波长下的HSCCC图谱。
图3为积雪草提取物在254nm波长下的HPLC谱图。
图4为积雪草提取物在254nm波长下的HSCCC图谱。
图5为活性化合物X(A)、槲皮素(B)、山奈酚(C)在254nm下的HPLC谱图；其中，图5-1、5-2、5-3分别为化合物X、槲皮素、山奈酚的HPLC图，图5-4为化合物X、槲皮素、山奈酚混合物的HPLC谱图。
具体实施方式
下述实施例中，所用的脂肪酸合酶均为用常规方法(W.X.Tian et al.，1985.J.Biol.Chem.，260(20)：11375-11387；田维熙等，1996.不同生长期蛋鸡的体脂水平和肝脏脂肪酸合成酶活性的关系.生物化学杂志，12(2)：234-236)自新鲜鸭肝中分离提纯的，并经聚丙烯酰胺凝胶电泳 检测为单一带。
脂肪酸合酶活性采用乙酰辅酶A、丙二酸单酰辅酶A、NADPH为底物的标准测活方法测定(W.X.Tian et al.，1985.J.Biol.Chem.，260(20)：11375-11387；田维熙等，1996.不同生长期蛋鸡的体脂水平和肝脏脂肪酸合成酶活性的关系.生物化学杂志，12(2)：234-236)。
实施例1、脂肪酸合酶抑制剂积雪草有效物质的制备
将积雪草粉碎，用下述方法提取有效物。
用乙醇-水混合溶剂(乙醇的体积百分数为50％)与上述粉碎的积雪草按重量份数比8∶1混合，室温25℃下搅拌浸取12小时，用普通滤纸过滤；在同样条件下再浸取12小时，然后用普通滤纸过滤，将两次滤液合并。在0.09MPa，40℃(减压)低温蒸发除去乙醇，得到含有效物质的水相，用等体积的石油醚脱去其中的脂类物质，再用等体积乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯层，减压低温蒸发除去有机溶剂，得到浸膏，将该浸膏(真空)干燥(50℃)得到固态的积雪草提取物，将该固态积雪草提取物称为积雪草提取物。
为了提高所述提取物的纯度，所述浸取后还用高速逆流法进行纯化及浓缩；所述纯化的方法为溶剂体系采用正己烷-正丁醇-甲醇-水(3∶1∶2∶3-4∶4.5∶6∶5)，将200mg积雪草提取物溶于10mL固定相中上样，转速为800r/min；检测波长为210nm和254nm；流速为2mL/min；25℃恒温，收集1-4小时的流出组分获得积雪草活性提取物。
实施例2、积雪草活性提取物的含量测定
将积雪草粉碎，用下述方法提取有效物。
精密称取实施例1中积雪草提取物1.0g，置于100毫升容量瓶中，加水溶解，并定容至100毫升作为供试液。精密量取5μL，以乙腈(A)-0.3％乙酸水溶液(B)梯度洗脱：0-4min为(A)20％，(B)80％；4-20min梯度渐变为(A)60％，(B)40％；20-30min梯度渐变为(A)70％，(B)30％；检测波长为254nm；流速为1mL/min；柱温为室温；Waters Symmetry C18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)，结果表明含量在30％。
实施例3、对脂肪酸合酶抑制活性的检测
在37℃下，在2mL石英比色皿中加入该酶底物：加入0.1M pH＝7.0的磷酸盐缓冲液1.85mL，0.2mM乙酰辅酶A溶液25μL，0.4mM丙二酸单酰辅酶A溶液50μL和1.3mM NADPH溶液50μL，然后加入FAS溶液30μL混匀，启动酶促反应。分光光度计监测单位时间内340nm波长处吸光值A的变化，以(ΔA/min)表示FAS的活力。积雪草药材粉碎，过40目筛，加入溶剂(1∶20)，室温搅拌4h后，离心分离上清液，稀释十倍后测定提取液对FAS的抑制率。在一定浓度积雪草提取物存在下，FAS全酶反应的活力下降，当其活力下降一半时所需积雪草提取物的浓度即为IC50值，用该数值表示积雪草提取物对FAS的抑制能力，上述测活体系中FAS的终浓度为7μg/mL。积雪草提取物具有非常强的抗脂肪酸合酶的活性，IC50 为37.5μg/mL。
Claims (8)
1.积雪草提取物在制备减肥药药物中的应用，特别是用于制备抑制脂肪酸合成酶方面的药物。所述积雪草提取物按照如下方法制备：用水和/或有机溶剂作为提取剂，将积雪草用提取剂浸泡后提取获得，提取次数可为一次或多次，减压干燥，称重。提取物分散到适量的水中，然后利用等量石油醚、氯仿等有机溶剂中的任何一种萃取除去脂溶性杂质，再利用等量正丁醇萃取获得积雪草正丁醇提取物。为了提高所述提取物的纯度，所述浸取后还进行了高速逆流的浓缩。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述有机溶剂为甲醇、乙醇、石油醚、正丁醇、丙酮、氯仿或乙酸乙酯。
3.根据权利要求1和2所述的应用，其特征在于：所述有机溶剂为体积分数为20-95％水溶液。
4.根据权利要求1-3所述的应用，其特征在于：所述提取为超声提取或加热搅拌提取或加热回流提取或微波辅助提取。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述提取温度为20-70℃。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述提取中，至少提取1次，每次提取时间为0.5-3小时。
7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述萃取剂为乙醇、甲醇、丙酮、正丁醇、氯仿或乙酸乙酯。
8.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述干燥为减压蒸馏、真空干燥或冷冻干燥。
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