CN103520108A - 一种提高免疫力的马齿苋多糖脂质体的制备及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种提高免疫力的马齿苋多糖脂质体的制备及其应用法。油相与水相体积比为2：1，油相中，马齿苋多糖、卵磷脂、胆固醇和V_C的浓度分别为0.016g/ml、0.04g/ml、0.022g/ml和0.022g/ml；添加甘露醇、Tween20和蒸馏水的含量分别占水相总量的5%、5%和90%。将马齿苋多糖、卵磷脂、胆固醇、V_C溶解于浓度80%的乙醇中，在50～55℃水浴条件下至完全溶解；将制备的油相用注射器快速注入制备的水相中，通过磁力搅拌、混合均匀，经减压蒸发后，经避光冷冻干燥获得马齿苋多糖脂质体。制备方法及获得产品具有生物利用度显著增强，活性高，具有广泛的应用价值。

Description

一种提高免疫力的马齿苋多糖脂质体的制备及其应用

技术领域

本发明涉及脂质体制备方法技术领域,具体的，本发明涉及一种提高免疫力的马齿苋多糖脂质体的制备及其应用的技术领域。

背景技术

马齿苋（Portulaca oleracea L.）属马齿苋科一年生肉质草本植物，在我国大部分地区均有分布。马齿苋含有多种对人体有益的营养成分和药用成分，其性寒、味酸，富合不饱和脂肪酸、维生素C、E和胡萝卜素，是我国卫生部规定的78种药食同源野生植物之一。以及苹果酸、谷氨酸和天门冬氨酸、草酸等，钙、磷、铁、及锌、铜等含量也较高。另外，还含有较多的钾元素，其中有硝酸钾、硫酸钾、草酸氢钾等多种钾盐。有抗菌消炎、降血脂、抗动脉粥样硬化、增强免疫力、抗衰老等作用，具有清热解毒、祛湿止带功效，适用于湿热下注、带下色黄、黏稠味臭、小便短黄、口渴口苦、舌红苔黄、脉滑者，亦可用于湿热泄泻、痢疾等。能驱虫功效，适用于小儿钩虫病。并具有清热解毒、止泻痢、除肠垢、益气补虚功效，适用于治疗久痢。是一种保健价值很高的草本植物。而马齿苋多糖是马齿苋主要活性成分之一，不仅具有增强免疫调节、抗肿瘤、降血糖、抗病毒、抗菌、抗氧化等功能，还具有抗衰老、抗凝血、降血脂、抗突变、抗辐射等作用。随着对马齿苋多糖药理作用的研究，对马齿苋多糖的开发和利用越来越受到人们的广泛关注。

现有技术表明，经分离提纯后的天然马齿苋多糖目前面临着三个方面的问题，一是稳定性差，易受光照、温度、氧、pH等影响，易氧化分解；二是溶解性低；三是生物利用度低，由于其稳定性差和溶解性低，从而降低了其生物活性，使其应用受限。亟需加以解决天然马齿苋多糖目前所面临的问题，如何利用高效载体来包裹马齿苋多糖，使其不受外界因素的影响，提高其稳定性和消化率，防止其生物活性降解，提高生物利用度，具有重要的现实意义。

发明内容

针对国内外报道未有解决有关分离提纯后的天然马齿苋多糖目前面临的问题，未有关于马齿苋多糖有效载体的研究现状。本发明提供一种提高免疫力的马齿苋多糖脂质体的制备及其应用，获得马齿苋多糖脂质体制备的最佳工艺条件，制备的马齿苋多糖脂质体具有很好的缓释效果，表现出更高的消化率、活性稳定性和免疫活性，且对双歧杆菌有显著增殖作用，其生物利用度和稳定性显著提高，对于马齿苋多糖产业化应用具有重要的现实意义。

本发明采用的主要技术方案：

通过提供一种提高免疫力的马齿苋多糖脂质体的最佳制备方法，选用制备的脂质体作为多糖的载体，利用其靶向性和淋巴定向性、缓释性、细胞亲和性与组织相容性、降低药物毒性、保护药物提高稳定性等特点，延缓药物在体内的释放，从而降低药物的毒性，提高生物利用度。本发明以包封率为考察指标，优化制备马齿苋多糖脂质体的工艺，并从稳定性、缓释效果、生物利用度三个方面对马齿苋多糖脂质体进行性能评价，为马齿苋多糖产业化应用提供现实的科学依据。

本发明具体提供了一种提高免疫力的马齿苋多糖脂质体的制备方法，具体制备方法步骤如下。

（1）选用主料为马齿苋多糖，是将马齿苋经分离提纯后的纯度为84.31%的马齿苋多糖，需在4℃下储存备用，辅料为卵磷脂和胆固醇、维生素C，选用卵磷脂和胆固醇作为壁材，脂药比按照卵磷脂与马齿苋多糖重量比计为2.5：1，壁材比按照卵磷脂与胆固醇重量比计为1.8：1，选用浓度为80%的乙醇作为油相的溶剂，马齿苋多糖、卵磷脂与胆固醇作为油相的溶质，其中，纯度为84.31%的马齿苋多糖的浓度为0.016g/ml，卵磷脂的浓度为0.04g/ml，胆固醇的浓度为0.022g/ml，维生素C的浓度为0.022g/ml。

（2）油相的制备：将上述步骤制备的马齿苋多糖、卵磷脂、胆固醇、维生素C溶解于上述步骤选用的浓度80%的乙醇中，在50～55℃水浴条件下至完全溶解。

（3）水相的制备：油相与水相之比按照体积比计比例为2:1；水相由冷冻保护剂、乳化剂、乳化剂和溶剂组成，其中，冷冻保护剂采用甘露醇，乳化剂采用Tween20，溶剂采用蒸馏水，添加甘露醇的含量为水相总量的5%，添加Tween20的含量为水相总量的5%，添加蒸馏水的含量为水相总量的90%，将甘露醇、Tween20加入蒸馏水混匀至溶解。

（4）将步骤（2）制备的油相用注射器快速注入步骤（3）制备的水相中。

（5）将上述步骤（4）制备的马齿苋多糖脂质体溶液采取磁力搅拌，磁力搅拌速度40 r/min，搅拌5min，使其混合均匀。

（6）旋转蒸发：在55℃温度下经旋转蒸发器减压蒸发，确保乙醇完全蒸完。

（7）冷冻干燥：将上述经旋转蒸发后得到材料经避光冷冻干燥12个小时以上，制备粉末即可获得马齿苋多糖脂质体，包封率不低于95.7%。

同时，本发明提供一种提高免疫力的马齿苋多糖脂质体，通过上述提供的马齿苋多糖脂质体的制备方法获得，制备的马齿苋多糖脂质体主要由油相和水相组成，油相与水相按体积比计比例为2：1，油相由马齿苋多糖、卵磷脂、胆固醇、维生素C和浓度80%的乙醇组成，选用浓度为80%的乙醇作为油相的溶剂，马齿苋多糖、卵磷脂与胆固醇作为油相的溶质，其中，纯度为84.31%的马齿苋多糖的浓度为0.016g/ml，卵磷脂的浓度为0.04g/ml，胆固醇的浓度为0.022g/ml，维生素C的浓度为0.022g/ml；水相由冷冻保护剂、乳化剂、乳化剂和溶剂组成，其中，冷冻保护剂采用甘露醇，乳化剂采用Tween20，溶剂采用蒸馏水，添加甘露醇的含量为水相总量的5%，添加Tween20的含量为水相总量的5%，添加蒸馏水的含量为水相总量的90%。

通过上述工艺技术制备的马齿苋多糖脂质体在光照、pH、温度下同条件同比马齿苋多糖稳定，且具有显著的缓释效果，制备的马齿苋多糖脂质体在小肠中的消化率为63.24%，同比马齿苋多糖更易在小肠中消化，且在胃液中脂质体表现出更高的稳定性，生物利用度显著增强，活性高。

进一步，本发明提供了马齿苋多糖脂质体在双歧杆菌中应用，对双歧杆菌有显著增殖作用。

本发明提供了马齿苋多糖脂质体在乳酸菌中应用，对乳酸菌有显著增殖作用。

本发明提供了马齿苋多糖脂质体在制备酸奶中的应用，对酸奶具有显现凝乳性，能够控制酸奶的酸度。

通过实施本发明具体的发明内容，可以达到以下效果：

本发明选用壁材比按照卵磷脂与胆固醇重量比计为1.8：1，冷冻保护剂为甘露醇的脂质体作为马齿苋多糖的载体，利用其靶向性和淋巴定向性、缓释性、细胞亲和性与组织相容性、降低药物毒性、保护药物提高稳定性等特点，延缓药物在体内的释放，从而降低药物的毒性，提高生物利用度。本发明以包封率为考察指标，优化马齿苋多糖脂质体的制备工艺，并从稳定性、缓释效果、生物利用度三个方面对马齿苋多糖脂质体进行性能评价，制备的马齿苋多糖脂质体在光照、pH、温度不同条件下同比马齿苋多糖稳定，且具有显著的缓释效果，马齿苋多糖脂质体在小肠中的消化率为63.24%，制备的马齿苋多糖脂质体同比马齿苋多糖更易在小肠中消化，且在胃液中脂质体表现出更高的稳定性，生物利用度显著增强，活性高，为提高马齿苋多糖的生物学功效的产业化应用提供科学依据，具有广泛的应用价值。

附图说明：

图1为马齿苋多糖脂质体的制备工艺流程图。

图2为壁材比对脂质体包封率的影响图。

图3为乙醇含量对脂质体包封率的影响图。

图4为甘露醇的含量对脂质体包封率的影响图。

图5为马齿苋多糖脂质体制备工艺优化响应面图一。

图6为马齿苋多糖脂质体制备工艺优化响应面图二。

图7为马齿苋多糖脂质体制备工艺优化响应面图三。

图8为不同pH下多糖脂质体和多糖对羟自由基的清除率曲线图。

图9为不同温度下多糖脂质体和多糖对羟自由基的清除率曲线图。

图10为不同光照天数下多糖脂质体和多糖对羟自由基的清除率曲线图。

图11为多糖脂质体和多糖的消化率曲线图。

图12为多糖浓度随时间变化的曲线图。

图13为多糖脂质体的包封率随时间变化的曲线图。

图14为多糖脂质体对双歧杆菌生长曲线的影响图。

图15为马齿苋多糖及多糖脂质体替代葡萄糖双歧杆菌生长曲线图。

图16为对数期生长曲线R的影响图。

图17为多糖脂质体对双歧杆菌对数生长期世代时间（G）比较图。

图18为多糖脂质体对酸奶发酵过程中酸度变化图。

图19为多糖脂质体对发酵过程中乳酸菌总数变化图。

图20为多糖脂质体对发酵过程中双歧杆菌数量变化图。

具体实施方式

下面，举实施例说明本发明，但是，本发明并不限于下述的实施例。另外，在下述的说明中，如无特别说明，％皆指m/m质量百分比。

采用的主要原辅材料及相关试剂材料：大豆卵磷脂、甘露醇、维生素C（上海蓝季科技发展有限公司）；胆固醇（北京欧博星生物技术责任有限公司）；Tween20（天津市福晨化学试剂厂）；α—淀粉酶（北京奥博星生物技术有限公司）；黄原胶（上海源叶生物技术有限公司）；双歧杆菌（从酸奶制品中分离）；柠檬酸、柠檬酸钠、盐酸萘乙二胺、水杨酸、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、3，5-二硝基水杨酸、吲哚试剂、亚硝酸钠、硫酸亚铁、双氧水、苯酚、浓硫酸等均为A.R.级。

实验动物：昆明种小鼠，新疆实验动物研究中心提供；左旋咪唑片(山东仁和堂药业有限公司)；印度墨汁(Cat.NO.18060)；碳酸钠，天津永晟精细化工有限公司，批号：20111020；培养基：双歧杆菌基础培养基；改良的MRS固体培养基。

采用的主要仪器设备：TDL-5-A系列离心机，海安亭科学仪器厂；79-2磁力搅拌器，江苏省金坛市金城国胜实验仪器厂；RE-52AA旋转蒸发器，上海亚荣生化仪器厂；FZ102-SIM真空冷冻干燥设备，德国西门子公司；512GD紫外-可见光分光光度计，上海分析仪器总厂；THZ-82水浴恒温振荡器，国华企业；F A2104S型精密电子天平，上海天平仪器厂；721分光光度计，上海第三分析仪器厂；DH-360型电热恒温箱，北京市永光明医疗仪器厂；TGL-16G冷冻离心机，上海安亭科学仪器厂；隔水式恒温培养箱，上海一恒科技有限公司；5W-CJ-2FD超净工作台，上海湾迅实业有限公司医疗设备厂；GMSX-280;І类B型蒸汽式压力灭菌锅，北京市永光明医疗仪器厂；E200显微镜，Nikon ECLIPSE等。

本发明中选用的所有试剂和仪器都为本领域熟知选用的，但不限制本发明的实施，其他本领域熟知的一些试剂和设备都可适用于本发明以下实施方式的实施。

实施例一：马齿苋多糖脂质体的制备

参见附图1，制备提高免疫力的马齿苋多糖脂质体具体步骤如下。

（1）选用主料为马齿苋多糖，是将马齿苋经分离提纯后的纯度为84.31%的马齿苋多糖，需在4℃下储存备用，辅料为卵磷脂和胆固醇、维生素C，选用卵磷脂和胆固醇作为壁材，脂药比按照卵磷脂与马齿苋多糖重量比计为2.5：1，壁材比按照卵磷脂与胆固醇重量比计为1.8：1，选用浓度为80%的乙醇作为油相的溶剂，马齿苋多糖、卵磷脂与胆固醇作为油相的溶质，其中，纯度为84.31%的马齿苋多糖的浓度为0.016g/ml，卵磷脂的浓度为0.04g/ml，胆固醇的浓度为0.022g/ml，维生素C的浓度为0.022g/ml。

（2）油相的制备：将上述步骤制备的马齿苋多糖、卵磷脂、胆固醇、维生素C溶解于上述步骤选用的浓度80%的乙醇中，在50～55℃水浴条件下至完全溶解。

（3）水相的制备：油相与水相之比按照体积比计比例为2:1；水相由冷冻保护剂、乳化剂、乳化剂和溶剂组成，其中，冷冻保护剂采用甘露醇，乳化剂采用Tween20，溶剂采用蒸馏水，添加甘露醇的含量为水相总量的5%，添加Tween20的含量为水相总量的5%，添加蒸馏水的含量为水相总量的90%，将冷冻保护剂甘露醇、乳化剂Tween20加入蒸馏水混匀至溶解。

（4）将步骤（2）制备的油相用注射器快速注入步骤（3）制备的水相中。

（5）将上述步骤（4）制备的马齿苋多糖脂质体溶液采取磁力搅拌，磁力搅拌速度40 r/min，搅拌5min，使其混合均匀。

（6）旋转蒸发：在55℃温度下经旋转蒸发器减压蒸发，确保乙醇完全蒸完。

（7）冷冻干燥：将上述经旋转蒸发后得到材料经避光冷冻干燥12个小时以上，制备粉末即可获得马齿苋多糖脂质体，包封率不低于95.7%。

实施例二：马齿苋多糖脂质体的制备

参见附图1，制备提高免疫力的马齿苋多糖脂质体具体步骤如下。

（1）选用主料为马齿苋多糖，是将马齿苋经分离提纯后的纯度为84.31%马齿苋多糖，用量为0.8g，需在4℃下储存备用，辅料为卵磷脂和胆固醇、维生素C，选用卵磷脂和胆固醇作为壁材，选用卵磷脂2.0g，胆固醇1.1g，添加维生素C量为1.1g，浓度为80%的乙醇50ml。

（2）油相的制备：将上述步骤制备的马齿苋多糖、卵磷脂、胆固醇、维生素C溶解于浓度为80%的乙醇中，在50～55℃水浴条件下至完全溶解。

（3）水相的制备：油相与水相之比按照体积比计比例为2:1；水相的制备中，冷冻保护剂采用甘露醇1.25ml，乳化剂采用Tween20为1.25ml，溶剂采用蒸馏水22.5ml，将冷冻保护剂甘露醇、乳化剂Tween20加入蒸馏水混匀至溶解。

（4）将步骤（2）制备的油相用注射器快速注入步骤（3）制备的水相中。

（5）将上述步骤（4）制备的马齿苋多糖脂质体溶液采取磁力搅拌，磁力搅拌速度40 r/min，搅拌5min，使其混合均匀。

（6）旋转蒸发：在55℃温度下经旋转蒸发器减压蒸发，确保乙醇完全蒸完。

（7）冷冻干燥：将上述经旋转蒸发后得到材料经避光冷冻干燥12个小时以上，制备粉末即可获得马齿苋多糖脂质体，包封率不低于95.7%。

实施例三：马齿苋多糖脂质体制备工艺参数的确定与优化

取0.1g/mL的实施例一制备的马齿苋多糖脂质体溶液2mL，3000r/min下离心5min，取上清液定容至10mL，用0.45μm微孔滤膜过滤，作为游离药物测定液。取0.1g/mL的马齿苋多糖脂质体溶液2mL，稀释至10mL，用0.45μm微孔滤膜过滤，作为总量测定液。分别精密量取上述2种测定液各2mL，于490nm处测定吸光度A_总和A_游。马齿苋多糖脂质体包封率按照以下公式计算：

包封率（%）=1-A_游/A_总×100%

其中，A总为制剂中药物总量，A游为制剂中游离药物量。

壁材比对马齿苋多糖脂质体包封率的影响：在乙醇浓度为75%， 甘露醇含量为2%的条件下，考察不同壁材比[m (卵磷脂)：m(胆固醇)]对脂质体包封率的影响，结果参见附图2。

由附图2可知，多糖脂质体载量一定的情况下，在高浓度范围内，逐渐增大卵磷脂用量可提高脂质体的包封率，当进一步增加卵磷脂比例时，包封率降低，这可能与脂质体双分子层包埋芯材机制有关，胆固醇用量相对较高时能够增加脂质体膜的刚性和致密度，水合过程中能增强脂质体膜的稳定性，提高包封率。所以，选用壁材比卵磷脂与胆固醇为1.8：1较为合适。

乙醇含量对脂质体包封率的影响：选用壁材比卵磷脂与胆固醇为1.8：1，甘露醇含量为2%的条件下，不同乙醇含量对脂质体包封率的影响，结果见附图3。

由附图3可知，提高乙醇浓度包封率逐渐增大，当高于80%时脂质体的包封率呈下降趋势，可能是因为浓度过高的乙醇会对卵磷脂和胆固醇造成破坏。因此，最适乙醇浓度为80%。

甘露醇含量对脂质体包封率的影响：选用壁材比卵磷脂与胆固醇为1.8：1，乙醇浓度为80%的条件下，不同甘露醇含量对脂质体包封率的影响，结果见附图4。

由附图4可知，甘露醇用量在5.0%时马齿苋多糖脂质体的包封率最高。当用量低于5.0%时，不能很好地保护脂质体使多糖在冷冻干燥过程中出现渗漏现象；含量高于5.0%时，使脂质体膜上形成孔洞，多糖渗漏，影响包封效果。综合考虑，甘露醇最适使用量为5.0%。

马齿苋多糖脂质体的制备响应曲面优化试验结果与分析

采用统计软件Minitab 15.0中的响应曲面法，建立三因素三水平的Box-Behnken模型，以卵磷脂与胆固醇的质量比(SPC/CH)、乙醇百分比、甘露醇的使用量比为影响因素，分别以X₁、X₂、X₃表示。根据单因素实验结果，设计本实验自变量因素编码及水平见表1。自变量的编码值1、0、－1分别代表自变量的高、中、低水平。包封率为响应值，由Y表示。

表1 三因素三水平中心组合试验方案及结果

运行序	标准序	(X1)壁材比	(X2)乙醇含量/%	(X3)甘露醇含量/%	包封率/%
						1	15	0	0	0	93.4
2	9	0	-1	-1	69.8
						3	1	-1	-1	0	66.2
4	14	0	0	0	93.2
						5	3	-1	1	0	77.7
6	5	-1	0	-1	59.0
						7	7	-1	0	-1	69.4
8	8	1	0	1	63.4
						9	13	0	0	0	92.1
10	10	0	1	-1	81.2
						11	4	1	1	0	70.1
12	2	1	-1	0	72.4
						13	11	0	-1	1	72.3
14	6	1	0	-1	68.7
						15	12	0	1	1	83.1

表2 三因素三水平中心组合参数估计

项	系数	系数标准误	T	P	显著性
						常量	92.9000	1.3017	71.367	0.000	**
X1	0.2875	0.7971	0.361	0.733
						X2	3.9250	0.7971	4.924	0.004	*
X3	1.1875	0.7971	1.490	0.196
						X1*X1	-16.3875	1.1734	-13.966	0.000	**
X2*X2	-4.9125	1.1734	-4.187	0.009	**
						X3*X3	-11.3875	1.1734	-9.705	0.000	**
X1*X2	-3.4500	1.1273	-3.060	0.028	*
						X1*X3	-3.9250	1.1273	-3.482	0.018	*
X2*X3	-0.1500	1.1273	-0.133	0.899

*为显著（P＜0.05）；**为极显著（P＜0.01）

由表2可知，一次项X₂差异极显著（P＜0.01），说明乙醇百分比对脂质体包封率的影响是非常显著的，二次项X₁ ²，X₂ ²和X₃ ²差异极显著（P＜0.01）；交互项X₁X₂ 、X₁X₃差异显著（P＜0.05），说明响应值的变化相当复杂，试验的各因素对马齿苋多糖脂质体包封率的影响不是简单的线性关系。采用DPS软件处理应值与各因素进行回归拟合后，得到二次回归方程表示为：

Y=12.2900+0.0400X₁+0.3925X₂+0.1300X₃-1.6275X₁ ²-0.5025X₂ ²-1.1275X₃ ²-0.3450X₁X₂-0.3700

X₁X₃-0.0150X₂X₃

表3方差分析

来源	自由度	Seq SS	Adj SS	Adj MS	F	P（F﹥Fα）	显著性
								回归	9	1649.02	1649.02	183.224	36.04	0.001	**
线性	3	135.19	135.19	45.062	8.86	0.019	*
								平方	3	1404.51	1404.51	468.169	92.10	0.000	**
交互作用	3	109.32	109.32	36.441	7.17	0.029	*
								残差误差	5	25.42	25.42	5.084
失拟	3	24.44	24.44	8.146	16.62	0.057
								纯误差	2	0.98	098	0.490
合计	14	1674.43

*为显著（P＜0.05）；**为极显著（P＜0.01）

由方差分析表3可知，回归模型高度显著(P=0.001<0.01)，失拟项不显著(P=0.057>0.05)，可知回归方程拟合度和可信度均很高，能够很好地对马齿苋多糖脂质体包封率进行预测。

结论

参见附图5至附图7，通过Minitab15.0程序分析，包封率最佳条件：壁材比为1.8：1，乙醇浓度为80%，甘露醇添加量为5%，得到包封率为95.7%，而预期的脂质体包封率为93.4%，与理论预测值相比相对误差较小。可见该模型能较好地预测马齿苋多糖脂质体的包埋情况。

实施例四：马齿苋多糖脂质体活性稳定性评价

对羟自由基的清除作用实验：在试管中依次加6mmol/L的FeSO₄溶液2mL，多糖溶液2mL，6mmol/L的H2O2溶液2mL，摇匀，静置10min，再加入6mmol/L的水杨酸溶液2mL，摇匀，静置30min后于510nm处测吸光度[22]。清除率按下式计算： 清除率（%）=1-(Ai-Aj)/A₀

其中，Ai代表样品的吸光值；Aj代表用水代替水杨酸测得的吸光值；A₀代表水代替多糖时测得的空白对照吸光值。

（1）酸碱度对多糖和脂质体溶液活性稳定性的影响：分别取1mg/mL多糖、脂质体溶液5mL，分别置于小烧杯中，利用磷酸缓冲液调其pH至2、6、7、8、10，常温下放置2h，按1.3.2.1的方法分别测定其对羟自由基的清除率。

由附图8可知，多糖脂质体在不同pH溶液中，对羟自由基的清除率一直比较稳定，而多糖在pH为2~7的溶液中对羟自由基的清除率比较稳定，在碱性溶液中对羟自由基的清除率降低，表现出其不稳定性。说明马齿苋多糖脂质体活性稳定性优于多糖。

（2）温度对多糖和脂质体溶液活性稳定性的影响：分别取1mg/mL多糖、脂质体溶液5mL，置于加塞的试管中，分别在25、37、50、60、70、80℃的水浴中加热2h，按1.3.2.1的方法测定每支试管的多糖和脂质体溶液对羟自由基的清除率。

由附图9可知，脂质体对羟自由基的清除率在25~45℃比较稳定，45~80℃呈下降趋势，可能是因为较高的温度破坏了脂质体壁材的活性，从而释放出多糖。而多糖对羟自由基的清除率随温度增加一直呈下降趋势，说明当温度超过45℃，脂质体的活性稳定性高于多糖。

（3）光照对多糖和脂质体活性稳定性的影响：分别取1mg/mL多糖、脂质体溶液30mL，置于50mL的烧杯中，用保鲜膜封住，采用室内自然光对其进行照射，按1.3.2.1的方法每隔2d测定一次多糖和脂质体溶液对羟自由基的清除率。

由附图10可知，随着天数的增加脂质体和多糖对羟自由基的清除率均降低，说明其稳定性都受光照的影响逐渐下降，而多糖对羟自由基的清除率下降的比较快，由此可说明马齿苋多糖脂质体活性稳定性优于多糖。

实施例五：马齿苋多糖脂质体缓释效果评价

模拟肠液条件下马齿苋多糖脂质体的消化实验：

（1）样品前处理：向样品中加入37℃蒸馏水，使脂质体（多糖）含量在10%。1.000g α-淀粉酶加入35.0mL pH 7.2磷酸缓冲液中，慢速磁力搅拌5min，1500r/min离心10min，即为工作酶液。

（2）消化实验：于150 mL锥形瓶内加入10.00 g样品、30mL浓度为1 mg/mL的黄原胶磷酸缓冲液以及10mL酶液，加入玻璃珠，37℃水浴回旋振动；于加入酶液后0、30、60、120、180、240 min取样0.20 mL，加入4.00 mL蒸馏水，2500 r/min离心25 min，取上清液。用3.00 mL水洗涤沉淀，离心，取上清液，合并两次上清液，震荡混匀。取2.00 mL清液，加入1.50 mL 3，5-二硝基水杨酸试剂，沸水浴反应7 min，冷却3 min，用水补至25.0 mL，测定490 nm处吸光值，并按下面公式计算消化率：消化率（%）=1-A_t/A₀× 100%

其中，A₀为0min时溶液的吸光度；A_t分别为60、120、180、240min时溶液的吸光度。

马齿苋多糖和多糖脂质体模拟肠液条件下的消化情况；由附图11可知，在单位时间内多糖脂质体的消化率一直大于多糖的消化率，二者之间的差值呈增大趋势。充分说明了多糖做成脂质体后有利于小肠消化，提高了生物利用度。

模拟胃肠液条件下亚硝酸钠清除实验：

取500µg/mL的马齿苋多糖和脂质体溶液各1.0mL，加入0.2mg/mLNaNO₂标准液0.1mL（同时做不加NaNO₂标准液的本底管），以pH 2.0柠檬酸缓冲溶液补充至5.0mL，混匀后加塞置于37℃恒温震荡，按时取出各管。加入1mL 0.2%盐酸萘乙二胺溶液，混匀，静置15min，同时做对照管，用2cm比色皿于540nm处测定吸光值，并按下面公式计算清除率。

NaNO₂清除率（%）=1-（A₁-A₀₁）/A0

其中，A₀为不加样品的对照值；A₁为加样品后的吸光值；A₀₁为样品本身的本底值。

按照上述方法测pH分别为2.2、3.3、4.0、5.0、5.8、6.8、7.5、8.0八种缓冲液及人工肠液的吸光度，并计算结果。

表4 多糖和多糖脂质体对亚硝酸钠的清除率

试验pH	时间/h	多糖(%)	脂质体(%)
				人工胃液	2	76.37	78.54
2.2	2	74.52	77.83
				3.2	2	65.43	77.49
4.0	2	58.38	76.37
				5.0	2	59.38	74.41
5.8	2	54.56	75.69
				6.8	1	62.16	78.23
7.5	10	23.85	42.54
				8.0	3	45.73	47.30
人工肠液	5	39.19	40.71

由表4可知，在任何时间段马齿苋多糖脂质体对亚硝酸钠的清除率均高于多糖，说明马齿苋多糖脂质体的活性较高，而且马齿苋多糖脂质体对亚硝酸钠的清除率变化不大，证明在胃肠液条件下，脂质体比多糖稳定。

马齿苋多糖脂质体的溶解速度测定：

在0min，2min，4min，6min，8min，10min，12min时分别精密量取1mg/mL脂质体溶液2mL，2500r/min离心5min，上清液定容至10mL，用0.45μm微孔滤膜过滤，作为游离药物测定液。精密量取1mg/mL脂质体溶液2mL，稀释至10mL，用0.45µm微孔滤膜过滤，作为总量测定液。取上述2种测定液各2ml，测定A_总和A_游。按实施例二提供公式计算包封率。

由附图12可知，多糖在水溶液中溶解的平均速度为0.016mg/mL·min，8min后浓度不再变化，说明多糖几乎完全溶解。

马齿苋多糖的溶解速度测定：

分别在0min，2min，4min，6min，8min，10min时量取0.4mg/mL粗多糖溶液10mL，用0.45µm微孔滤纸过滤，吸取样液1.0mL补水至2.0mL，加入6%苯酚1.0mL，置冷水中迅速加入浓硫酸5.0 mL，摇匀，冷水中放置5min，再置沸水浴中加热15min，然后置冷水中放置5min，用0.45μm微孔滤膜过滤并于490nm处测吸光度。根据方程A=0.5487C-0.0135，R²=0.9946计算出相应浓度。

由附图13可知，1～10min脂质体的包封率逐渐下降，10～12min包封率基本呈稳定状态，说明脂质体溶解需要10min的时间。

马齿苋多糖脂质体缓释效果研究结果：通过比较二者在水溶液中的溶解速度可知，马齿苋多糖比多糖脂质体在水溶液中的溶解速度稍快，从而证明马齿苋多糖脂质体具有缓释效果。

实施例六：马齿苋多糖脂质体对双歧杆菌的增殖作用评价

马齿苋多糖对双歧杆菌的增值基础实验：

工艺流程： 培养基的配制→培养液的罐装→灭菌→制备菌悬液（制备菌悬液→稀释→涂布→厌氧培养→计数）→接种→厌氧培养24h→稀释→涂布→厌氧培养→计细胞数量

双歧杆菌基础培养基的配制：大豆蛋白胨0.5g，胰胨0.5g，L-半胱氨酸0.05g，酵母膏1.0g，葡萄糖1.0g，吐温-80 0.1mL，无机盐液4.0mL（每1L含CaCl₂ 0.2g，K₂HPO₄ 1.0g，MgSO₄·7H₂O 0.48g，NaHCO₃ 10.0g，NaCl 2.0g)，H₂O 100mL，pH 7.0。

操作要点：制备双歧杆菌基础培养液100mL，等分两份，倒入两个锥形瓶中。一个锥形瓶中加马齿苋多糖0.3%，另一个瓶中不加马齿苋多糖，标记。上述制备的两种培养液分别取10mL装入Ф18×180mm的试管中，标记。锥形瓶中倒入50mL生理盐水，准备盛有9mL生理盐水的10支试管。准备好的生理盐水和培养液在121℃灭菌15min。盛有50mL生理盐水的锥形瓶中加适当量的双歧杆菌，制备双歧杆菌菌悬液。各试管中接种双歧杆菌菌种1mL，摇荡试管。37℃厌氧培养24h。双歧杆菌菌悬液以10倍稀释法从10^{－ 1}稀释到10^{－ 10}，取4个稀释梯度10^{－ 3}，10^{－ 4}，10^{－ 5}，10^{－ 6}，分别吸取稀释液各0.1mL，用涂棒涂布于改良的MRS培养基平板上，每个梯度做2个平行板。然后放于自制的厌氧罐里，37℃培养48h后计数，计算菌悬液初始浓度。制备16支盛有生理盐水的试管，121℃灭菌15min。经过24h厌氧培养后的样液分别取1mL，以10倍稀释法从10^{－ 1}稀释到10^{－ 10}，取3个稀释梯度10^{－ 6}，10^{－ 7}，10^{－ 8} ，分别吸取稀释液各0.1mL，用涂棒涂布于改良的MRS培养基平板上，每个梯度做2个平行板。然后放于自制的厌氧罐里，37℃培养48h后计数。

实验组A：（a）含0.3%马齿苋多糖+1%葡萄糖的双歧杆菌基础培养液；（b）含0.3%多糖脂质体+1%葡萄糖的双歧杆菌基础培养液；

实验组B：（a）含1.3%马齿苋多糖的双歧杆菌基础培养液；（b）含1.3%多糖脂质体的双歧杆菌基础培养液；

对照组：双歧杆菌基础培养液（含1.3%葡萄糖）。

将三组培养液分别装入φ18×180mm试管中，10mL/支装量，121℃灭菌15分钟后接种双歧杆菌菌种1mL，37℃厌氧培养一定时间，分别取1mL菌种培养样液测定双歧杆菌细胞数量。以基础培养液中双歧杆菌细胞数量为参比，分别衡量马齿苋提取多糖与多糖脂质体对双歧杆菌的增殖作用。经试验，获得双歧杆菌生长曲线﹑菌体对数生长期生长速率常数与世代时间的差异。

计算公式：

双歧杆菌对数生长期生长速率常数（R）：3.322 (lgX₂－lgX₁)/(t₂－t₁)

双歧杆菌对数生长期世代时间（G）：t₂－t₁/3.322(lgX₂－lgX₁)

式中t₂，t₁为培养时间，X₁，X₂为培养t₂，t₁时间时的双歧杆菌细胞数量（个/mL）或（n/mL）

每mL样品中的活菌数CFU=每皿菌落数平均值×0.1ml×10×稀释倍数

表5 马齿苋多糖对双歧杆菌增殖试验结果

注：菌体初始浓度1.95×10⁴个/mL，马齿苋多糖的添加量为0.3%。

从表5中可以看出，添加了马齿苋多糖的双歧杆菌培养液中测得的双歧杆菌细胞数量为4.80×10⁷个/mL，明显高于对照组的3.95×10⁷个/mL，说明马齿苋多糖对双歧杆菌具有明显的增殖作用。

马齿苋多糖脂质体对双歧杆菌的影响：

由图14可知，马齿苋多糖和多糖脂质体添加到双歧杆菌的培养液后，双歧杆菌的细胞数量有效增多，衰亡速度大大减缓，且比对照组显著缩短了生长世代时间。在48h时，多糖脂质体组的细胞数量比对照组明显减少，分析原因可能是双歧杆菌首先利用了培养液中葡萄糖和多糖脂质体，使得细胞数量快速增多，大量生产代谢产物，而进入衰亡期后，细胞数量会慢慢减少，然后再利用培养基的其它成分和代谢产物再次繁殖。

由图15所知，将马齿苋多糖和多糖脂质体代替葡萄糖添加至培养液后，在糖浓度近于相同情况下，马齿苋多糖和多糖脂质体比葡萄糖更有利于双歧杆菌增殖。

由图16可知，对照组的R值为0.115，而实验组中，无论是添加了马齿苋多糖或多糖脂质体，还是用马齿苋多糖或多糖脂质体代替葡萄糖，所得的R值均显著高于对照组，且添加了多糖脂质体代替葡萄糖后得到的R值达到最高为0.587，说明多糖脂质体对双歧杆菌的增殖作用最为明显，菌体在对数生长期生长速率常数（R）分别提高了194%～23%、403%～510% 。

由图17所知示，无论是添加了马齿苋多糖或多糖脂质体，还是用马齿苋多糖或多糖脂质体代替葡萄糖，双歧杆菌对数生长期的生长世代时间（G）都显著缩短。菌体在对数生长期生长世代时间（G）分别缩短了24%～52%、20%～25%。该结果表明，试验马齿苋多糖和脂质体含有双歧生长因子，即在这些植物多糖中应含有2～3个单糖单位通过糖苷键连接的小聚合体，糖苷键中α-1,4糖苷键比例小，α-1,6、β-1,6等糖苷键形式较多，成为非消化性糖NDO。NDO能被消化道后部的有益微生物如双歧杆菌利用产生简单的有机酸。

马齿苋多糖脂质体在酸奶体系中的应用研究

酸奶的制作工艺：鲜牛奶（分别添加0.3%的马齿苋多糖和0.3%的多糖脂质体，对照组不加）→杀菌→冷却→发酵（每隔2h观察凝乳状态、测酸度、乳酸菌总数、双歧杆菌数）→后发酵

分析测定指标及方法：酸度测定：采用酸碱滴定法：用0.1mol/ L的标准NaOH标定酸奶样品；乳酸菌总数：采用比浊法；双歧杆菌的测定：采用平板菌落计数法。

对酸奶凝乳状态的影响结果见表6：

表6 在酸奶发酵过程中凝乳状态变化

实验组

0h

1 h

2h

3h

4h

6h

对照组

没凝乳，稀液状态

没凝乳，稀液状态

开始凝乳，有流动性

凝乳增多，有流动性

已凝乳，比较稠

已凝乳，不流动，稠

马齿苋多糖

没凝乳，稀液状态

开始凝乳，乳清析出

开始凝乳，有流动性

完全凝乳

——

——

多糖脂质体

没凝乳，稀液状态

开始凝乳，乳清析出

开始凝乳，有流动性

完全凝乳

——

——

由表6可知，在酸奶的前发酵过程中，试验组和对照组的凝乳状态有明显差异，添加马齿苋多糖及多糖脂质体的酸奶可缩短凝乳时间。

对酸奶酸度的影响结果：由图18可知，马齿苋多糖和多糖脂质体均对酸奶在前发酵过程中有提升酸度作用。马齿苋多糖组的作用比多糖脂质体组的作用更明显，说明脂质体有缓释效果，对酸奶酸度升高起到了一定的控制作用。

对乳酸菌总数变化的影响结果：由图19可知，在酸奶前发酵过程中试验组的乳酸菌总数始终多于对照组。且加入多糖脂质体的酸奶中乳酸菌总数多于马齿苋多糖，说明多糖脂质体对乳酸菌增殖作用更为显著。

对双歧杆菌总数变化的影响结果：从图20可知，当发酵时间为4h时双歧杆菌总数达到最高值(GB 2746-1999酸牛乳)。在酸奶发酵过程中马齿苋多糖和多糖脂质体均对双歧杆菌有增殖作用，但多糖脂质体作用远大于马齿苋多糖。食品中的酸度越高越会抑制菌落生长，而多糖脂质体加入培养液中后使溶液呈中性，促进了菌落总数的提高。

实施例七：马齿苋多糖脂质体的免疫活性评价

（1）小鼠口服急性毒性试验

预式实验：选择KM小鼠，每组4只，雌雄各半。马齿苋多糖脂质体以2～4个剂量，0.4ml/10g体积一次性灌胃小鼠，连续观察14天。以序贯法找出首若片引起最大不致死量和最小全致死量。

正式试验：选择KM小鼠，每组20只，雌雄各半。根据预式实验结果决定正式试验的剂量。灌胃给药后，连续观察14天。最后计算小鼠口服半数致死剂量（LD50）或最大耐受剂量（MTD）。

（2）对小鼠免疫器官胸腺、脾脏重量的影响

取小鼠80只，雌雄各半，随机分成8组即对照组，阳性对照左旋咪唑片组，POP（低、中、高）和POPS（低、中、高）组。灌胃给药，每日一次，共7天，于末次给药后1小时，摘眼球放血处死，称体重摘出胸腺及脾脏，用滤纸吸干脏器表面血污，称重，计算胸腺/体重比值和脾脏/体重比值，作为胸腺指数和脾脏指数。

（3）采用炭粒廓清法小鼠体内吞噬廓清能力的影响

取小鼠80只，雄性，随机分成8组即对照组，阳性对照左旋咪唑片组，POP（低、中、高）和POPS（低、中、高）组。灌胃给药，每日一次，共7天，于末次给药后1小时，于鼠尾静脉注入稀释的印度墨汁0.1ml/10g。于注入墨汁后2min及10min用特制取血吸管从小鼠眼眶后静脉丛取血20ul，立刻吹入0.1%Na2CO₃液2ml中，吸管于该液中吸入、吸出数次，以充分洗出吸管壁附着之血液，取血完毕，以20ul正常小鼠血溶于2ml 0.1%Na2CO₃液校零，于分光光度计上675nm处比色，按K=LgC₁- LgC₂/T₂-T₁计算吞噬指数（K）。

（4）对小鼠血清溶血素的影响

取小鼠80只，雌雄各半，随机分成8组即对照组，阳性对照左旋咪唑片组，POP（低、中、高）和POPS（低、中、高）组。灌胃给药，每日一次，共7天。给药第3天腹腔注射5%生理盐水鸡红细胞悬液0.2ml免疫小鼠，第7天眼球取血，离心，取血清用生理盐水稀释100倍。取稀释血清1ml，与鸡红细胞悬液0.5ml，10%补体0.5ml混合，37℃恒温箱保温30分钟后置0℃冰箱终止反应，离心取上清液与721分光光度计540nm处比色，测录光密度（OD）。以光密度读数作为判定血清溶血素的指标，比较各组的差异。

（5）统计方法

结果以 X±S表示，采用PEMS 3.1数据处理软件，组问比较采用t检验。

小鼠口服急性毒性试验：小鼠MTD为16g/kg。

对小鼠免疫器官胸腺、脾脏重量的影响：与对照组比较，阳性对照左旋咪唑片组、POP和POPS各剂量组胸腺指数没有统计学差异（P>0.05）。与对照组比较，阳性对照左旋咪唑片组、POP（3g/kg）和POPS（3g/kg）虽能升高脾脏指数，但其差异没有统计学意义（P>0.05），结果见表7。

表7 马齿苋多糖和多糖脂质体对小鼠免疫器官胸腺、脾脏重量的影响（x±s）

组别	动物数	剂量	胸腺指数	脾脏指数
					对照组	10	------	0.044±0.011	0.050±0.007
阳性对照左旋咪唑片组	10	0.01g/kg	0.042±0.010	0.057±0.014
					POP低剂量组	10	1g/kg	0.042±0.006	0.045±0.015
POP中剂量组	10	2g/kg	0.046±0.008	0.050±0.014
					POP高剂量组	10	3g/kg	0.048±0.019	0.057±0.008
POPS低剂量组	10	1g/kg	0.040±0.009	0.045±0.005
					POPS中剂量组	10	2g/kg	0.044±0.007	0.049±0.011
POPS高剂量组	10	3g/kg	0.039±0.009	0.054±0.007

备注：与对照组比较 P>0.05。

胸腺与脾脏是机体主要免疫器官，其增重往往意味着机体淋巴细胞的增殖，直接体现了免疫应答的强弱。从脾脏指数与胸腺指数来看POP、POPS对小鼠体内淋巴细胞增殖无明显作用。

小鼠体内吞噬廓清能力的影响：与对照组比较，阳性对照左旋咪唑片组、POPS（2g/kg）升高廓清指数（P<0.05），其它各给药组虽能升高廓清指数（k），但其差异没有统计学意义（P>0.05），果见表8。

表8 马齿苋多糖和多糖脂质体对小鼠体内吞噬廓清能力的影响（x±s）

组别	动物数	剂量	廓清指数（k）
				对照组	10	------	0.046±0.032
阳性对照左旋咪唑片组	10	0.01g/kg	0.081±0.036*
				POP低剂量组	10	1g/kg	0.061±0.031
POP中剂量组	10	2g/kg	0.061±0.034
				POP高剂量组	10	3g/kg	0.076±0.041
POPS低剂量组	10	1g/kg	0.064±0.038
				POPS中剂量组	10	2g/kg	0.090±0.054*
POPS高剂量组	10	3g/kg	0.060±0.036

备注：与对照组比较 *P<0.05。

碳粒廓清试验是检验单核吞噬细胞系统功能的常用方法。吞噬细胞在体内的主要作用是：小吞噬细胞进行非特异性免疫防御，大吞噬细胞除吞噬杀灭病原体、异物、衰老和死亡细胞外，在特异性免疫形成过程中，参与识别、处理和呈递抗原，还能产生多种细胞因子。本试验显示POPS（2g/kg）对巨噬细胞吞噬功能有提高作用，表明对小鼠特异性免疫功能有一定增强作用。

对小鼠血清溶血素的影响：与对照组比较，阳性对照左旋咪唑片组、POP（3g/kg）和POPS（2g/kg）能升高吸光度值（OD）（P<0.05）。其它各给药组其差异没有统计学意义（P>0.05），果见表9。

表9 马齿苋多糖和多糖脂质体对血清溶血素的影响（x±s）

组别	动物数	剂量	OD值
				对照组	10	------	0.337±0.053
阳性对照左旋咪唑片组	10	0.01g/kg	0.466±0.145*
				POP低剂量组	10	1g/kg	0.315±0.095
POP中剂量组	10	2g/kg	0.348±0.088
				POP高剂量组	10	3g/kg	0.427±0.096*
POPS低剂量组	10	1g/kg	0.327±0.204
				POPS中剂量组	10	2g/kg	0.415±0.073*
POPS高剂量组	10	3g/kg	0.383±0.099

备注：与对照组比较 *P<0.05。

当B淋巴细胞受抗原（鸡红细胞）刺激后，分化为浆细胞，浆细胞产生一种抗体（免疫球蛋白）一溶血素，当再次接受相同抗原刺激时，溶血素和抗原在补体的参与下发生免疫反应（溶血），血清溶血素的含量反映了鸡红细胞免疫后的小鼠的特异性体液免疫。血溶素实验结果表明：POP（3g/kg）和POPS（2g/kg）对鸡红细胞诱导的小鼠血清溶血素生成具有促进作用，提示能够促进小鼠的特异性体液免疫功能。

实施例八：马齿苋多糖脂质体的质量标准

（1）感官指标： 感官指标应符合表10的规定。

表10 感官指标

项目	指 标
		外观、形态	粉末，圆形或椭球形
色泽	产品呈棕黄色或棕褐色
		气味	无异味
杂质	无肉眼可见杂质

（2）理化指标：理化指标应符合表11的规定。

表11 理化指标

（3）微生物指标： 微生物指标应符合表12的规定。

表12 微生物指标

项目	指标
		菌落总数 (cfu／g ) ≤	1000
大肠菌群 (MPN/100 g ) ≤	40
		霉菌 (cfu／g ) ≤	25
酵母菌 (cfu／g ) ≤	25
		致病菌（ 沙门氏菌、志贺氏菌、 溶血性链球菌、 金黄色葡萄球菌）	不得检出

Claims (5)

1.一种提高免疫力的马齿苋多糖脂质体的制备方法，其特征在于，具体制备方法步骤如下：

（1）选用主料为马齿苋多糖，是将马齿苋经分离提纯后的纯度为84.31%的马齿苋多糖，需在4℃下储存备用，辅料为卵磷脂和胆固醇、维生素C，选用卵磷脂和胆固醇作为壁材，脂药比按照卵磷脂与马齿苋多糖重量比计为2.5：1，壁材比按照卵磷脂与胆固醇重量比计为1.8：1，选用浓度为80%的乙醇作为油相的溶剂，马齿苋多糖、卵磷脂与胆固醇作为油相的溶质，其中，纯度为84.31%的马齿苋多糖的浓度为0.016g/ml，卵磷脂的浓度为0.04g/ml，胆固醇的浓度为0.022g/ml，维生素C的浓度为0.022g/ml；

（2）油相的制备：将上述步骤制备的马齿苋多糖、卵磷脂、胆固醇、维生素C溶解于上述步骤选用的浓度80%的乙醇中，在50～55℃水浴条件下至完全溶解；

（3）水相的制备：油相与水相按照体积比计比例为2:1；水相由冷冻保护剂、乳化剂、乳化剂和溶剂组成，其中，冷冻保护剂采用甘露醇，乳化剂采用Tween20，溶剂采用蒸馏水，添加甘露醇的含量为水相总量的5%，添加Tween20的含量为水相总量的5%，添加蒸馏水的含量为水相总量的90%，将冷冻保护剂甘露醇、乳化剂Tween20加入蒸馏水混匀至溶解；

（4）将步骤（2）制备的油相用注射器快速注入步骤（3）制备的水相中；

（5）将上述步骤（4）制备的马齿苋多糖脂质体溶液采取磁力搅拌，磁力搅拌速度40 r/min，搅拌5min，使其混合均匀；

（6）旋转蒸发：在55℃温度下经旋转蒸发器减压蒸发，确保乙醇完全蒸完；

（7）冷冻干燥：将上述经旋转蒸发后得到材料经避光冷冻干燥12个小时以上，制备粉末即可获得马齿苋多糖脂质体，包封率不低于95.7%。

2.一种如权利要求1所述的马齿苋多糖脂质体的制备方法获得的马齿苋多糖脂质体，其特征在于，制备的马齿苋多糖脂质体由油相和水相组成，油相与水相之比按照体积比计比例为2:1，油相由马齿苋多糖、卵磷脂、胆固醇、维生素C和浓度80%的乙醇组成，选用浓度为80%的乙醇作为油相的溶剂，马齿苋多糖、卵磷脂与胆固醇作为油相的溶质，其中，纯度为84.31%的马齿苋多糖的浓度为0.016g/ml，卵磷脂的浓度为0.04g/ml，胆固醇的浓度为0.022g/ml，维生素C的浓度为0.022g/ml；水相由冷冻保护剂、乳化剂、乳化剂和溶剂组成，其中，冷冻保护剂采用甘露醇，乳化剂采用Tween20，溶剂采用蒸馏水，添加甘露醇的含量为水相总量的5%，添加Tween20的含量为水相总量的5%，添加蒸馏水的含量为水相总量的90%。

3.如权利要求2所述的马齿苋多糖脂质体在双歧杆菌中应用。

4..如权利要求2所述的马齿苋多糖脂质体在乳酸菌中应用。

5..如权利要求2所述的马齿苋多糖脂质体在制备酸奶中应用。

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