CN107441046A - 一种复合蛋白质脂质体纳米制剂 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种复合蛋白质脂质体纳米制剂，所述纳米制剂为核壳结构，其中外壳由脂溶性的磷脂和维生素C衍生物组成，内核由蛋白质凝缩体组成。本发明除了可以有效地对内含胶原蛋白进行包裹与保护，同时纳米结构表面具有高脂溶壳层，可以极大地促进大分子胶原蛋白通过小肠表皮细胞层进入血液循环，有效地解决了现有的胶原蛋白制剂难以吸收的问题。
Description
技术领域
本发明属于纳米制剂领域，特别涉及一种复合蛋白质脂质体纳米制剂。
背景技术
胶原蛋白是人体组织结构的主要成分之一，也是人体内含量最多的一种蛋白质，约占人体蛋白质总量的30％，特别是人体皮肤成分中，有70％是由胶原蛋白组成。而且研究显示皮肤是人体表面积最大、最暴露的器官，也是最早老化的器官。而造成皮肤老化的主要原因就是皮肤中胶原蛋白的数量逐年在减少，一年大约下降1％。因而，胶原蛋白的有效再生是保持皮肤活性和缓解衰老的关键。然而，胶原蛋白是一种纤维性蛋白质，由于人体很难直接吸收蛋白质或多肽，口服蛋白质、多肽后，必须经过人的消化系统的处理，降解成氨基酸之后才能最终被人体吸收。目前，胶原蛋白产品十分丰富，以各种形态出现，有口服液、粉剂也有片剂。除了各类口服产品标注为“胶原蛋白”产品外，不少外用产品也在打胶原蛋白的概念，除了一些面膜、护肤液等标注含有“胶原蛋白”，然而胶原蛋白由于其分子量大，脂溶性差，电荷密度大等物理特性很难被皮肤直接吸收或通过胃肠粘膜吸收，因而传统的胶原蛋白制剂无法穿过皮肤的上层组织，进入真皮层或强化原本自然形成的胶原蛋白。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种复合蛋白质脂质体纳米制剂，该纳米制剂除了可以有效地对内含胶原蛋白进行包裹与保护，同时纳米结构表面具有高脂溶壳层，可以极大地促进大分子胶原蛋白通过小肠表皮细胞层进入血液循环，有效地解决了现有的胶原蛋白制剂难以吸收的问题。
本发明提供了一种复合蛋白质脂质体纳米制剂，所述纳米制剂为核壳结构，其中外壳由脂溶性的磷脂和维生素C衍生物组成，内核由蛋白质凝缩体组成。一方面，脂溶性的外壳有利于内含胶原蛋白的进一步凝缩和包裹，另一方面这种脂溶性的外壳有利于提高纳米制剂与肠胃粘膜的相容性，便于纳米制剂通过肠胃粘膜进入血液循环。
进一步的，所述脂溶性的磷脂为卵磷脂。
进一步的，所述维生素C衍生物由维生素C通过接枝乳酸基团制备而得。
进一步的，所述蛋白质凝缩体为胶原蛋白凝缩体。
进一步的，所述胶原蛋白凝缩体由胶原蛋白经过两级凝缩制备而得。
进一步的，上述凝缩包括通过调节溶液pH值至胶原蛋白的等电点实现胶原蛋白尺寸的初级凝缩。
进一步的，上述凝缩包括通过对溶液微氧化处理实现胶原蛋白尺寸的次级凝缩。
进一步的，通过加入氧化剂分子进行所述微氧化处理。
进一步的，所述氧化剂为H2O2或DMSO。
本发明可以同时对胶原蛋白凝缩体和促进胶原蛋白再生的维生素C衍生物实现有效的包裹和保护。其中，维生素C通过接枝乳酸基团生成脂溶性高的维生素C衍生物，该维生素C衍生物极易通过小肠内皮细胞层，以及通过具有表达胶原蛋白的细胞的细胞膜。另外，维生素C衍生物作为维生素C的前药分子，在生理条件下可以通过自水解的方式释放维生素C活性分子。
另一方面，胶原蛋白通过三级凝缩处理得到超小尺寸的胶原蛋白脂质体。首先，通过调节胶原蛋白水溶液的pH值至胶原蛋白的等电点，可以实现胶原蛋白尺寸的初级凝缩；其次，通过对溶液的微氧化处理促使胶原蛋白中的硫醇基团形成分子内的二硫键，可以实现对胶原蛋白尺寸的次级凝缩；最后，通过具有脂溶性的卵磷脂分子与次级含胶原蛋白凝缩体的相互作用(主要作用方式包括胶原蛋白及其卵磷脂中的疏水基团复合)，降低胶原蛋白卵磷脂复合物的界面能，实现了对对胶原蛋白尺寸的终级凝缩，同时完成了对卵磷脂胶原蛋白凝缩体的包裹。
本发明除了有效地对胶原蛋白的保护，同时纳米结构表面具有高脂溶壳层，可以极大地促进大分子胶原蛋白通过小肠表皮细胞层进入血液循环。通过维生素C衍生物的加入，极大地促进了胶原蛋白在体内的再生。通过口服的方式可以促进人体对胶原蛋白吸收及再生，同时脂溶性的卵磷脂在血液中可以高效捕获危害人体健康的低密度脂蛋白，有利于降低血液黏稠度，降低多种血液病、血管病发生的风险。
有益效果
本发明除了可以有效地对内含胶原蛋白进行包裹与保护，同时纳米结构表面具有高脂溶壳层，可以极大地促进大分子胶原蛋白通过小肠表皮细胞层进入血液循环；配合维生素C衍生物对胶原蛋白的再生机制，极大地促进了吸收的胶原蛋白在体内再生，因而可以提升目前胶原蛋白保健品的效果，通过口服的方式促进人体对胶原蛋白吸收和再生；另外，脂溶性的卵磷脂在血液中可以高效捕获危害人体健康的低密度脂蛋白，有利于降低血液黏稠度，降低多种血液病、血管病发生的风险，具有良好的市场应用前景。
附图说明
图1为本发明的结构示意图；
图2为本发明维生素C衍生物的化学结构式；
图3为本发明维生素C衍生物的1H-NMR图谱；
图4为本发明促进生物体对胶原蛋白大分子的吸收和再生的技术原理图；
图5为动态光散射表征胶原蛋白各级凝缩体的尺寸分布；其中，a)：原始胶原蛋白的粒径分布(分子量：300kDa，浓度：0.5mg/mL，pH 7.4)；b)：胶原蛋白经过初级凝缩后的粒径分布(调整胶原蛋白溶液的pH至等电点，pH 6.5)；c)：胶原蛋白经过次级凝缩后的粒径分布(加入0.1mM H2O2)；d)：胶原蛋白经过终极凝缩后的粒径分布(与卵磷脂和维生素C衍生物复合)；
图6为透射电子显微镜表征本发明的形貌结构，比例尺：20nm；
图7为HUVEC对普通胶原蛋白和本发明的内吞活性比较；
图8为通过口服初始胶原蛋白和口服本发明对大鼠吸收胶原蛋白的影响；
图9为通过口服初始胶原蛋白和口服本发明对大鼠创伤部位胶原蛋白再生的影响；
图10为本发明对LDL(胆固醇)的清除效果，“反应前”为初始胆固醇溶液中胆固醇的含量，“反应后”为胆固醇溶液反应后游离的胆固醇含量。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
1.维生素C衍生物的制备方法：
脂溶性维生素C衍生物(图2)由维生素C分子与左旋丙交酯在异辛酸亚锡催化下反应生成，具体步骤如下：
天平分别称取0.1mol维生素C粉末和0.4mol左旋丙交酯，溶解于100mL无水甲苯溶液。充分溶解后加入0.5微升辛酸亚锡，恒温105℃反应3小时。减压蒸馏去除溶剂甲苯，产物通过水/二氯甲烷萃取获得。产物溶解于DMSO-d6通过1H-NMR分析，如图3所示。
维生素C通过酯键与乳酸连接，脂溶性增强，有助于维生素C分子穿过肠胃粘膜。连接的乳酸在生理条件下容易自水解，从而释放出活性维生素C分子，并且乳酸分子生物相容性极好，保证了维生素C衍生物的安全性。
2.胶原蛋白纳米制剂的制备方法：
初始胶原蛋白溶液：胶原蛋白采购于Sigma Aldrich，天平称取10毫克胶原蛋白，溶解于10mM PBS(pH 7.4)缓冲溶液，配制成0.5mg/mL胶原蛋白溶液，搅拌6小时后，通过动态光散射表征胶原蛋白初始态粒径；
初级凝缩胶原蛋白溶液：天平称取10毫克胶原蛋白，溶解于10mM PBS(pH 7.4)缓冲溶液，配制成0.75mg/mL胶原蛋白溶液，搅拌6小时后，用0.1M HCl溶液调节初始胶原蛋白溶液pH至6.5，用纯水配制成0.5mg/mL胶原蛋白溶液，搅拌6小时后，通过动态光散射表征胶原蛋白的初级凝缩粒径；
次级凝缩胶原蛋白溶液：天平称取10毫克胶原蛋白，溶解于10mM PBS(pH 7.4)缓冲溶液，配制成0.75mg/mL胶原蛋白溶液，搅拌6小时后，用0.1M HCl溶液调节初始胶原蛋白溶液pH至6.5，加入H2O2溶液，配制成0.5mg/mL胶原蛋白溶液(H2O2：0.01mM)，搅拌6小时后，通过动态光散射表征胶原蛋白的次级凝缩粒径；
终级凝缩胶原蛋白溶液：天平称取10毫克胶原蛋白，溶解于10mM PBS(pH 7.4)缓冲溶液，配制成0.75mg/mL胶原蛋白溶液，搅拌6小时后，用0.1M HCl溶液调节初始胶原蛋白溶液pH至6.5，加入H2O2溶液，配制成0.5mg/mL胶原蛋白溶液(H2O2：0.1mM)，搅拌6小时后，将2mL卵磷脂溶液(0.2毫克维生素C衍生物)滴入上述制备好的胶原蛋白溶液形成纳米脂质体包裹物，搅拌6小时后，通过动态光散射表征胶原蛋白的终级凝缩粒径。
上述胶原蛋白及其各级胶原蛋白凝缩的粒径通过Zetasizer ZS90(MalvenInstruments,Southborough,MA)进行测试，结果见表1。其中散射光的角度设置是90°，测试温度是25℃。
表1动态光散射表征胶原蛋白各级凝缩体的尺寸表征。
| 胶原蛋白 | 初始态 | 初级凝缩 | 次级凝缩 | 终级凝缩 |
| 峰值粒径 | 11.2 | 9.6 | 8.1 | 6.3 |
| 分散指数 | 0.68 | 0.56 | 0.25 | 0.11 |
由图4可知，本发明的纳米制剂对胶原蛋白进行三级凝缩和包裹，一方面有利于对胶原蛋白分子的保护，另一方面有利于纳米制剂穿过肠胃粘膜。因而，这种纳米制剂技术可以实现纳米制剂大分子片段甚至完整的胶原蛋白分子穿过肠胃粘膜被人体迅速吸收。伴随着纳米制剂穿过肠胃粘膜进入血液循环的同时，维生素C衍生物也进入了人体循环系统，维生素C自身促进胶原蛋白合成的特性有助于吸收的胶原蛋白片段的迅速再生。
由图5可知，胶原蛋白尺寸不断减小，证明各级胶原蛋白成功凝缩。尺寸的不断减小有助于提高胶原蛋白对于肠胃粘膜的通透性。
3.透射电子显微镜
将10微升的终级凝缩胶原蛋白溶液与10微升醋酸双氧铀(染色剂)混合，反应15分钟后。吸取5微升滴在亲水处理后的铜网上，多余的液滴用滤纸吸走，并置于干燥的环境中待铜网完全干燥后，置于透射电镜(JEM-2100F)观察。由图6可知，成功制备了均一尺寸的胶原蛋白制剂。
4.人脐静脉内皮细胞(HUVEC)对胶原蛋白的内吞活性测试
该实验选用人脐静脉内皮(HUVEC)细胞株，实验的内容是针对HUVEC细胞对初始胶原蛋白及其本实施例的胶原蛋白纳米制剂的内吞活性进行测试。首先，将HUVEC细胞以每个孔104的密度种在24孔板上，每个孔都加入含胎牛血清的完全培养液400μL进行培养。在37℃和5％的CO2的培养箱条件下培养，24小时后取出，此时其生长密度至70％。然后在24孔板中加入待测量的初始胶原蛋白及其本发明的胶原蛋白纳米制剂(均包含1mg胶原蛋白，其中胶原蛋白的氨基有Alexa Fluor 633标记)。继续放在培养箱中培养48小时，用PBS溶液清洗细胞两次，这一操作可以将未被细胞内吞的胶原蛋白清洗掉。然后，每个孔中再加入100μL的细胞裂解液，待30分钟左右细胞完全裂解后，进行内吞活性进行测试，内吞的相对活性由流式细胞仪标定Alexa Fluor 633荧光强度。
由图7可知，相比普通的胶原蛋白，本发明的胶原蛋白制剂可以提升2-3个数量级内皮细胞对胶原蛋白内吞的效率。这一结果证明本发明极大地提升了胶原蛋白与胃肠粘膜的相容性，改善了人体对胶原蛋白吸收差的问题。
5.活体对胶原蛋白的吸收测试
活体实验中，14C标记的胶原蛋白作为初始原料制备纳米胶原蛋白制剂，净含2克胶原蛋白制剂或2克初始胶原蛋白通过0号胶囊包裹后，经口服的方式由大鼠服下。服用15分钟后，胶原蛋白的吸收率由血液中14C的相对含量表示，其中14C在血液中的绝对浓度由发射型计算机断层照相机定量。
由图8可知，相比普通的胶原蛋白，本发明的胶原蛋白制剂可以提升近20倍人体对胶原蛋白的吸收能力。这一结果证明本发明极大地提升了胶原蛋白与胃肠粘膜的相容性，改善了人体对胶原蛋白吸收差的问题。
6.活体对胶原蛋白的再生测试
大鼠腹部由手术刀片平整刮掉2cm×2cm平面创伤口，平面创伤界面由水凝胶型消炎创可贴保护。创伤形成15分钟后，进行活体对胶原蛋白的再生实验。在活体实验中，14C标记的胶原蛋白作为初始原料制备纳米胶原蛋白制剂，净含2克胶原蛋白制剂或2克初始胶原蛋白通过0号胶囊包裹后，经口服的方式由大鼠服下。服用15分钟后，14C在创伤面的绝对含量由发射型计算机断层照相机定量。
针对口服胶原蛋白再生的能力，由图9可知，相比普通的胶原蛋白，本发明的胶原蛋白制剂可以提升超过50倍胶原蛋白再生的效果。这一结果证明本发明除了可以提升人体对胶原蛋白分子的吸收，同时加入的维生素C衍生物进一步加强了胶原蛋白的再生活性。
7.胆固醇的消除活性测试
天平称取胆固醇5mg，溶解于0.2mL的DMSO中，待胆固醇溶解后，逐滴缓慢加入50mL的PBS缓冲溶液中(10mM，pH 7.4)形成均质的溶液。上述溶液与50mL胶原蛋白纳米制剂溶液混合(含25mg胶原蛋白)，震荡反应24小时。反应后溶液经过超速离心处理(10，000g)选择性的沉降胶原蛋白纳米制剂复合物，最终通过分析上清溶液中的游离胆固醇的浓度来评估纳米制剂对胆固醇的消除活性，其中游离的胆固醇浓度由LC-MS测定。
由图10可知，本发明的胶原蛋白制剂有利于捕捉危害人体健康的低密度脂蛋白胆固醇(LDL，如胆固醇分子)，证明本发明有利于人体清除LDL，有利于降低血液黏稠度，维持血液健康和血管功能活性。
Claims (9)
1.一种复合蛋白质脂质体纳米制剂，其特征在于：所述纳米制剂为核壳结构，其中外壳由脂溶性的磷脂和维生素C衍生物组成，内核由蛋白质凝缩体组成。
2.根据权利要求1所述的一种复合蛋白质脂质体纳米制剂，其特征在于：所述脂溶性的磷脂为卵磷脂。
3.根据权利要求1所述的一种复合蛋白质脂质体纳米制剂，其特征在于：所述维生素C衍生物由维生素C通过接枝乳酸基团制备而得。
4.根据权利要求1所述的一种复合蛋白质脂质体纳米制剂，其特征在于：所述蛋白质凝缩体为胶原蛋白凝缩体。
5.根据权利要求4所述的一种复合蛋白质脂质体纳米制剂，其特征在于：所述胶原蛋白凝缩体由胶原蛋白经过两级凝缩制备而得。
6.根据权利要求5所述的一种复合蛋白质脂质体纳米制剂，其特征在于：通过调节溶液pH值至胶原蛋白的等电点实现胶原蛋白尺寸的初级凝缩。
7.根据权利要求5所述的一种复合蛋白质脂质体纳米制剂，其特征在于：通过对溶液微氧化处理实现胶原蛋白尺寸的次级凝缩。
8.根据权利要求7所述的一种复合蛋白质脂质体纳米制剂，其特征在于：通过加入氧化剂分子进行所述微氧化处理。
9.根据权利要求8所述的一种复合蛋白质脂质体纳米制剂，其特征在于：所述氧化剂为H2O2或DMSO。
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