CN103705907A

CN103705907A - 一种鳖甲活性多肽提取物的制备方法及应用

Info

Publication number: CN103705907A
Application number: CN201310753790.6A
Authority: CN
Inventors: 叶晓川; 刘焱文; 刘丹; 李水清; 孔菲菲; 李捷; 马丽
Original assignee: Hubei College of Chinese Medicine
Current assignee: Hubei College of Chinese Medicine
Priority date: 2013-12-31
Filing date: 2013-12-31
Publication date: 2014-04-09
Anticipated expiration: 2033-12-31
Also published as: CN103705907B

Abstract

本发明属于中药提取物的制备技术领域，具体公开了一种鳖甲活性多肽提取物的制备方法及应用。本发明方法的具体步骤包括：鳖甲经水煎煮提取，提取液用蒸馏水稀释至相当于含鳖甲药材4-8g/100mL的浓度，分别采用微滤、多级超滤得到超滤液，减压浓缩，冷冻干燥得到分子量小于6KD的冻干粉。本发明采用多级膜分离方法制备鳖甲的活性多肽物质部位，经过中试试验，其工艺参数可过渡到产业化；所制备的鳖甲活性多肽提取物具有保肝作用，可以用于制备预防或治疗肝纤维化、酒精性肝损伤的药物或保健食品。

Description

一种鳖甲活性多肽提取物的制备方法及应用

技术领域

本发明涉及中药提取物的制备技术领域，具体涉及一种鳖甲活性多肽提取物的制备方法及应用。

背景技术

鳖甲为传统药食两用中药，来源于鳖科动物鳖(Trionyx sinensisWiegmann)的背甲，始载于《神农本草经》，性味咸，微苦，归肝、肾经，具有滋阴潜阳，软坚散结，退热除蒸的功效；主治阴虚发热，劳热骨蒸、癥瘕，虚风内动等病症。鳖甲及以其为君药的复方制剂临床常用于治疗肝纤维化疾患，具有良好的疗效。鳖甲的化学成分主要有氨基酸、多肽、多糖、微量元素及动物胶、蛋白等。文献报道，体外细胞实验研究显示鳖甲水提液中分子量6KD以下的肽类成分具有显著的抗肝纤维化作用。

鳖甲抗肝纤维化活性多肽提取物的制备，文献已有采用超声提取后用半透膜透析的方法的报道，该方法仅适应于实验室少量制备。

膜分离技术是在20世纪初出现，20世纪60年代后迅速崛起的一门分离新技术。膜分离技术由于兼有分离、浓缩、纯化和精制的功能，又有高效、节能、环保、分子级过滤及过滤过程简单、易于控制等特征，因此，目前已广泛应用于食品、医药、生物、环保、化工等领域，产生了巨大的经济效益和社会效益，已成为当今分离科学中最重要的手段之一。采用多级分离技术，对制备分子量相对较小的物质具有操作简便、分离效率高等优点，工艺过程可实现产业化。

发明内容

针对现有技术中存在的不足，本发明的第一个目的是提供一种鳖甲活性多肽提取物的制备方法，该方法通过水煎煮提取、多级膜过滤、减压浓缩、冷冻干燥等步骤从鳖甲中获得鳖甲活性多肽提取物。

本发明的另一个目的是提供一种上述方法制备的鳖甲活性多肽提取物在制备预防或治疗肝纤维化、酒精性肝损伤的药物或保健食品中的应用。

本发明的第一个目的通过如下技术方案来实现：

一种鳖甲活性多肽提取物的制备方法，步骤如下：

（1）取鳖甲粉碎成粗粉，加水煎煮1-3次，每次加4-12倍重量的水，每次煎煮1-3小时，滤过，合并滤液，得鳖甲提取液；

所述鳖甲为醋鳖甲，最佳加水量是鳖甲粗粉重量的6倍；

所述的煎煮最佳次数为3次，最佳煎煮时间为每次3小时；

（2）将鳖甲提取液用蒸馏水稀释至相当于含鳖甲药材（4-8）g/100mL的浓度，然后用孔径为0.3μm的微滤膜过滤，得微滤液；

所述鳖甲提取液稀释后的最佳浓度为相当于含鳖甲药材6g/100mL；

（3）微滤液用截留分子量为15KD-25KD的超滤膜在0.15-0.3Mpa压力下进行第一次超滤，收集透过液，弃去截留液；

（4）将步骤（3）所得透过液用截留分子量为6KD-10KD的超滤膜在0.5-1.5Mpa压力下进行第二次超滤，分别收集透过液和截留液；

（5）向步骤（4）收集的截留液中加入3-5倍体积的蒸馏水稀释，所得稀释液用截留分子量为6KD-10KD的超滤膜在0.5-1.5Mpa压力下进行第三次超滤，收集透过液，弃去截留液；

（6）合并步骤（4）和（5）所得的透过液，经减压浓缩，冷冻干燥，即得鳖甲活性多肽提取物。得到的鳖甲活性多肽提取物中分子量小于6KD的物质的含量为85.3-98.5%，总多肽含量为46.3-64.1%。

微滤液依次采用截留分子量为15KD-25KD与6KD-10KD两个分子量段超滤膜进行超滤的最佳组合为20KD和8KD。

根据上述制备方法得到的鳖甲活性多肽提取物，可用于制备预防或治疗肝纤维化、酒精性肝损伤的药物或保健食品。

本说明书中所记载的百分含量均为质量百分含量。

与现有技术相比，本发明的优点和有益效果在于：

鳖甲抗肝纤维化活性多肽提取物的制备，文献已有采用超声提取后用半透膜透析的方法的报道。该方法系采用常压透析，所耗费时间长，仅适用于实验室少量制备。

鳖甲提取液中含有大量大分子的蛋白等物质，若直接选择所需截留分子量的超滤膜，则大分子蛋白易沉积在膜表面，阻塞膜孔，增加扩散阻力，造成通量下降，产品收得率低。本发明采用多级膜分离技术，提取液先用微滤膜过滤，除去大分子蛋白，再用截留分子量为15KD-25KD的超滤膜超滤，最后用截留分子量为6KD-10KD的超滤膜超滤两次，具有操作简便、分离效率高、超滤膜重复使用率高进而降低生产成本、无环境污染、制备工艺可进行产业化等优点，符合中药现代化的要求。

整体动物实验研究证实，本发明所得的鳖甲活性多肽提取物具有很好的保肝作用，既可以单独使用又可以与其他药物配伍联合使用，特别适用于制备预防或治疗肝纤维化、酒精性肝损伤的药物或保健食品。

本发明所得的鳖甲活性多肽提取物适用于多种药用的剂型，其剂型包括口服液、片剂、胶囊剂、软胶囊剂、硬胶囊剂、颗粒剂、混悬剂、粉剂、注射剂、溶液剂和喷雾剂等。

具体实施方式

下面结合具体实施例进一步阐述本发明的提取物的制备方法及其应用。

以下实施例1-6中所用原料均为醋鳖甲，系常规市售中药材。

我国传统医学治疗肝病时，采用醋制鳖甲入药。中医理论认为，生鳖甲养阴清热，潜阳熄风之力较强，用于热病伤阴或内伤虚热，虚风内动等症。醋制入肝、肾经，鳖甲砂炒醋淬后，质地酥脆，能增强药物入肝消积、软肝散结的作用。申请人前期研究结果表明，醋鳖甲和生鳖甲均具有抗肝纤维化的作用，但醋鳖甲的药效优于生鳖甲。故本发明以醋鳖甲为原料。

实施例1：

一种鳖甲活性多肽提取物的制备方法，步骤如下：

（1）取鳖甲粉碎成粗粉，加水煎煮2次，每次加4倍重量的水，每次煎煮3小时，滤过，合并滤液，得鳖甲提取液；

（2）将鳖甲提取液用蒸馏水稀释至相当于含鳖甲药材4g/100mL的浓度，然后用孔径为0.3μm的微滤膜过滤，得微滤液；

（3）微滤液在0.3Mpa的压力下通过截留分子量为15KD的超滤膜，收集透过液，弃去截留液；

（4）将步骤（3）所得透过液在1.5Mpa的压力下通过截留分子量为6KD的超滤膜，分别收集透过液和截留液；

（5）向步骤（4）收集的截留液中加入3倍体积的蒸馏水稀释，所得稀释液在1.5Mpa的压力下通过截留分子量为6KD的超滤膜，收集透过液，弃去截留液；

（6）合并步骤（4）和（5）所得的透过液，经减压浓缩后冷冻干燥，即得鳖甲活性多肽提取物。

经测试，制得的鳖甲活性多肽提取物中，分子量小于6KD的物质的含量为98.5%，总多肽含量为46.3%。

实施例2：

一种鳖甲活性多肽提取物的制备方法，步骤如下：

（1）取鳖甲粉碎成粗粉，加水煎煮3次，每次加6倍重量的水，每次煎煮3小时，滤过，合并滤液，得鳖甲提取液；

（2）将鳖甲提取液用蒸馏水稀释至相当于含鳖甲药材6g/100mL的浓度，然后用孔径为0.3μm的微滤膜过滤，得微滤液；

（3）微滤液在0.2Mpa的压力下通过截留分子量为20KD的超滤膜，收集透过液，弃去截留液；

（4）将步骤（3）所得透过液在0.8Mpa的压力下通过截留分子量为8KD的超滤膜，分别收集透过液和截留液；

（5）向步骤（4）收集的截留液中加入4倍体积的蒸馏水稀释，所得稀释液在0.8Mpa的压力下通过截留分子量为8KD的超滤膜，收集透过液，弃去截留液；

经测试，制得的鳖甲活性多肽提取物中，分子量小于6KD的物质的含量为95.0%，总多肽含量为55.7%。

实施例3：

一种鳖甲活性多肽提取物的制备方法，步骤如下：

（1）取鳖甲粉碎成粗粉，加水煎煮3次，每次加8倍重量的水，每次煎煮2小时，滤过，合并滤液，得鳖甲提取液；

（2）将鳖甲提取液用蒸馏水稀释至相当于含鳖甲药材8g/100mL的浓度，然后用孔径为0.3μm的微滤膜过滤，得微滤液；

（3）微滤液在0.15Mpa的压力下通过截留分子量为25KD的超滤膜，收集透过液，弃去截留液；

（4）将步骤（3）所得透过液在0.5Mpa的压力下通过截留分子量为10KD的超滤膜，分别收集透过液和截留液；

（5）向步骤（4）收集的截留液中加入5倍体积的蒸馏水稀释，所得稀释液在0.5Mpa的压力下通过截留分子量为10KD的超滤膜，收集透过液，弃去截留液；

经测试，制得的鳖甲活性多肽提取物中，分子量小于6KD的物质的含量为85.3%，总多肽含量为64.1%。

实施例4：

一种鳖甲活性多肽提取物的制备方法，步骤如下：

（1）取鳖甲粉碎成粗粉，加水煎煮3次，每次加10倍重量的水，每次煎煮1小时，滤过，合并滤液，得鳖甲提取液；

（5）向步骤（4）收集的截留液中加入4倍体积的蒸馏水稀释，所得稀释液在1.5Mpa的压力下通过截留分子量为6KD的超滤膜，收集透过液，弃去截留液；

经测试，制得的鳖甲活性多肽提取物中，分子量小于6KD的物质的含量为97.1%，总多肽含量为51.4%。

实施例5：

一种鳖甲活性多肽提取物的制备方法，步骤如下：

（1）取鳖甲粉碎成粗粉，加12倍重量的水煎煮1次，煎煮3小时，滤过，滤液即为鳖甲提取液；

（4）将步骤（3）所得透过液在0.5Mpa的压力下通过截留分子量为10KD的超滤膜，分别收集截留液和透过液；

经测试，制得的鳖甲活性多肽提取物中，分子量小于6KD的物质的含量为89.4%，总多肽含量为58.8%。

实施例6：最佳实施例的中试实验

一种鳖甲活性多肽提取物的制备方法，步骤如下：

将鳖甲粉碎成粗粉，称取鳖甲粗粉20kg，加水煎煮3次，每次加120kg的水，每次煎煮3小时，滤过，合并滤液，得鳖甲提取液；

将鳖甲提取液用蒸馏水稀释至相当于含鳖甲药材6g/100mL的浓度，然后用孔径为0.3μm的微滤膜过滤；

所得微滤液先在0.2Mpa的压力下通过截留分子量为20KD的超滤膜，分别收集截留液和透过液，分别记为截留液1和透过液1；

将所得透过液1在0.8Mpa的压力下通过截留分子量为8KD的超滤膜，分别收集截留液和透过液，分别记为截留液2和透过液2；

向截留液2中加入4倍体积的蒸馏水稀释，所得稀释液在0.8Mpa的压力下通过截留分子量为8KD的超滤膜，分别收集截留液和透过液，分别记为截留液3和透过液3；

合并透过液2和透过液3，经减压浓缩后冷冻干燥，即得鳖甲活性多肽提取物（冻干粉）。三批中试结果见表1。

表1中试试验结果

中试实验结果显示，本发明研究的方法工艺参数可行，可过渡到产业化生产。

实施例7

用上述实施例6制备得到的第1批鳖甲活性多肽提取物进行药理实验，同时以实施例6第1批生产中截留液1和截留液3的混合液（取适量混合液，用分子量为6KD的半透膜透析3次，经测试，该混合液中分子量小于6KD的物质含量为4.2%）作对照组，以证明本发明方法制备的鳖甲活性多肽提取物具有保肝作用，可用于制备预防或治疗肝纤维化的药物。

鳖甲活性多肽提取物抗肝纤维化的实验研究

雄性SPF级SD大鼠，160±20g，适应环境5天后随机分为6组，即正常组（A组）、模型组（B组）、阳性药物组（秋水仙碱，C组），鳖甲活性多肽提取物高剂量组（D组）、鳖甲活性多肽提取物低剂量组（E组）、对照组（F组），每组10只。造模期间，模型组及给药组皮下注射40%CCl₄（用花生油溶解），首次按5ml/kg皮下注射，以后按3ml/kg皮下注射，正常组按同剂量生理盐水皮下注射，每周2次，共12周。造模的同时灌胃给药，剂量分别为秋水仙碱组0.2mg/kg，鳖甲活性多肽提取物高、低剂量分别为36g/kg、18g/kg（以药材量计），对照组36g/kg（以药材量计），正常组和模型组给予相应生理盐水，每天给药一次，给药时间为12周。实验结束后，采用水合氯醛麻醉，摘眼球取血，分离血清，分别检测谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、透明质酸(HA)、Ⅲ型胶原（PCⅢ）、IV型胶原(IV-C)、层粘连蛋白(LN)。结果见表2。

表2鳖甲活性多肽提取物对大鼠血清ALT、AST、HA、PCⅢ、IV-C和LN水平的影响

注：与正常组相比^##P＜0.01；与模型组相比^*P<0.05，^**P<0.01

研究表明，ALT主要存在于肝细胞浆中，AST存在于肝细胞浆及肝细胞的线粒体中。在正常情况下，ALT和AST只有少量释放到血液中，故血清中的ALT、AST值一般较低。但是，当肝组织受到损伤或者各种原因导致细胞膜通透性增加时，ALT和AST便大量释放到血液中。而HA、LN、PCⅢ、IV型胶原则是反映肝纤维化程度的重要指标。

上述实验结果显示，与正常组相比，模型组大鼠血清的ALT、AST、HA、PCⅢ、IV-C和LN含量均有极显著性差异（P＜0.01），表明肝纤维化动物模型造模成功；与模型组相比，实施例6制备的鳖甲活性多肽提取物高、低剂量均能极显著降低ALT、AST、HA、PCⅢ、IV-C和LN水平，效果与阳性对照药相当，显示出很好的抗肝纤维化作用，而对照组则无作用。整体动物实验结果证明，本发明制备的鳖甲活性多肽提取物具有良好的抗肝纤维化作用。

实施例8

用上述实施例6制备得到的第1批鳖甲活性多肽提取物进行对小鼠急性酒精性肝损伤的保护作用实验

SPF级雄性昆明小鼠，体重18-22g，随机分为正常组，模型组，鳖甲活性多肽提取物高、中、低剂量组（以药材计，18，12，6g·kg^-1），联苯双酯组（200mg·kg^-1），每组10只。除正常组及模型组外，其他各组给药30天，每天给药一次，第30天模型组及各给药组采用50%乙醇一次灌胃制备小鼠急性酒精性肝损伤模型。测定小鼠血清ALT、AST值，肝组织匀浆测丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)。结果见表3，表4。

表3鳖甲活性多肽提取物对小鼠血清ALT、AST酶的影响

注：与正常组相比^##P<0.01；与模型组相比^*P<0.05，^**P<0.01（表4同）

表4鳖甲活性多肽提取物对小鼠肝组织SOD、MDA、GSH的影响

与正常组相比，模型组小鼠血清的ALT、AST含量及小鼠肝组织MDA、SOD、GSH含量均有显著或极显著性差异（P<0.05或（P<0.01），表明小鼠急性酒精性肝损伤动物模型造模成功；与模型组相比，鳖甲活性多肽提取物能显著或极显著降低小鼠血清中ALT、AST水平，降低小鼠肝组织中MDA含量，提高SOD、GSH含量。实验结果表明，本发明制备的鳖甲活性多肽提取物对酒精引起的小鼠急性肝损伤具有保护作用，其作用机制可能是通过清除氧自由基、抑制脂质过氧化来减轻酒精对肝细胞的损伤。

本说明书中所描述的具体实施例仅仅是对本发明精神作举例说明。本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，但并不会偏离本发明的精神或者超越所附权利要求书所定义的范围。

Claims

1.一种鳖甲活性多肽提取物的制备方法，步骤如下：

（6）合并步骤（4）和（5）所得的透过液，经减压浓缩，冷冻干燥，即得鳖甲活性多肽提取物。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述鳖甲为醋鳖甲。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述步骤（6）得到的鳖甲活性多肽提取物中分子量小于6KD的物质的含量为85.3-98.5%，总多肽含量为46.3-64.1%。

4.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于：所述步骤（1）中，每次加水量为鳖甲粗粉重量的6倍。

5.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于：所述步骤（1）中，煎煮次数为3次，煎煮时间为每次3小时。

6.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于：所述步骤（2）中，

所述鳖甲提取液稀释后的浓度为相当于含鳖甲药材6g/100mL。

7.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于：所述步骤（3）中，所用超滤膜的截留分子量为20KD；所述步骤（4）中，所用超滤膜的截留分子量为8KD；所述步骤（5）中，所用超滤膜的截留分子量为8KD。

8.根据权利要求1-7中任一所述的制备方法制得的鳖甲活性多肽提取物在制备预防或治疗肝纤维化的药物或保健食品中的应用。

9.根据权利要求1-7中任一所述的制备方法制得的鳖甲活性多肽提取物在制备预防或治疗酒精性肝损伤的药物或保健食品中的应用。