CN105440048A

CN105440048A - 1,3-苯并二噁茂类化合物山芝麻素及其药物用途

Info

Publication number: CN105440048A
Application number: CN201410505713.3A
Authority: CN
Inventors: 陈道峰; 殷翔; 史训龙; 朱海燕; 卢燕
Original assignee: Fudan University
Current assignee: Fudan University
Priority date: 2014-09-28
Filing date: 2014-09-28
Publication date: 2016-03-30

Abstract

本发明属于医药领域，涉及一种1,3-苯并二噁茂类新化合物及其在制备抗乙肝病毒和抗补体药物中的用途。本发明从山芝麻属植物山芝麻干燥地上部分分离得到1,3-苯并二噁茂类新化合物山芝麻素，经试验证实其具有较强的抗乙肝病毒活性，在最大无细胞毒浓度100μg/ml时，山芝麻素对HBsAg的抑制率为47.1％，而对HBeAg的IC₅₀值为53.7μg/ml，显著高于阳性对照拉米呋啶；另外，经体外抗补体活性测定结果显示其对补体系统经典途径和旁路途径补体激活有很强的抑制作用，对补体系统经典途径补体激活的CH₅₀值为0.014±0.003mg/ml，对旁路途径的AP₅₀值为0.036±0.005mg/ml。所述的山芝麻素可以作为活性成分用于制备抗乙肝病毒药物和抗补体药物。

Description

1,3-苯并二噁茂类化合物山芝麻素及其药物用途

技术领域

本发明属于医药领域，涉及一种从药用植物山芝麻中分离得到的1,3-苯并二噁茂类新化合物山芝麻素及其在制备抗乙肝病毒药物和抗补体药物中的用途。

背景技术

据有关统计显示，全世界大约有3亿多人为慢性乙肝病毒(HBV)携带者，我国约占半数。乙肝病毒感染已成为全球性的影响人类健康的主要疾病之一，由于HBV感染可以导致慢性肝炎、肝硬化和原发性肝癌，因此成为影响人类寿命的九大疾病之一。由于慢性HBV感染者较非携带者发生肝癌的相对危险率为217，因此在全世界每年大约有200万人死于乙肝引起的肝硬化和肝癌，而我国又是乙型肝炎的高发区，每年约有25万人死于与乙肝相关的慢性肝病(肝硬化与肝癌)。上述疾病给人民健康和国民经济带来巨大损失。因此，寻求高效低毒的抗HBV药物已成为刻不容缓的问题。

研究显示补体系统的过度激活会引发系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、急性呼吸窘迫综合征等多种重大疾病,然而目前对此类疾病尚缺乏较为理想的治疗药物，因此临床上急需高效、低毒、专一的新型补体抑制剂。从天然产物中研究开发补体抑制剂是近年来一个受到越来越多关注的重要研究领域，其具有成本低、毒性小等特点。国内外学者已从包括海洋生物在内的多种天然产物中分离得到多种具有补体系统抑制作用的单体化合物，为抗补体药物的研究与开发提供了广阔的前景。

山芝麻为梧桐科植物山芝麻(HelicteresangustifoliaL.)的干燥根或全株，味苦、性寒，归肺、大肠经，可解表清热、解毒消肿，用于治疗感冒发热、痄腮、乳娥、麻疹、咳嗽、泄泻痢疾、痈肿。药理研究表明山芝麻具有抗菌、抗炎、抗病毒及抗肿瘤等活性。为了进一步对其药用价值进行开发利用，对其化学成分及其生物活性的研究很有必要。

本申请的发明人拟提供从药用植物山芝麻中分离得到的1,3-苯并二噁茂类新化合物山芝麻素及其在制备抗乙肝病毒药物和抗补体药物中的用途。

发明内容

本发明的目的是提供一种从山芝麻中分离得到的1,3-苯并二噁茂类新化合物山芝麻素(helicterin)。

本发明的目的还在于提供上述化合物作为制备抗乙肝病毒药物中的用途。

本发明的目的还在于提供上述化合物作为制备抗补体药物中的用途。

本发明应用现代药理研究方法，从山芝麻属植物山芝麻(H.angustifolia)干燥地上部分的乙醇提取物乙酸乙酯萃取部位中分离得到1个1,3-苯并二噁茂类新化合物山芝麻素，对分离得到的单体化合物进行体外抗HBV和抗补体活性评价，实验证实其具有较强的抗HBV活性以及对补体系统经典途径和旁路途径补体激活均有较强的抑制作用。

本发明提供的1,3-苯并二噁茂类化合物山芝麻素具有以下化学结构：

本发明所述的化合物通过下述方法制备：

取山芝麻干燥地上部分15kg，粉碎，用95％乙醇回流提取3次(50L×3)，每次2h，合并提取液并浓缩得浸膏1.05kg，加水(4L)混悬，分别以等体积石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取5次，合并萃取液并浓缩至干，得乙酸乙酯萃取物160g。将乙酸乙酯萃取部位经硅胶(200-300目)柱色谱分离，依次以二氯甲烷-甲醇(50:1-0:1)梯度洗脱，得到11个流份(Fr.1-11)，其中流份Fr.3(30g)再经硅胶柱色谱(二氯甲烷-甲醇，30:1,20:1,10:1,5:1,1:1,1:2)、MPLC(甲醇-水，10:90-90:10梯度洗脱)和半制备HPLC(甲醇-水，42:58等度洗脱)纯化，分离得到化合物山芝麻素(helicterin)。

本发明的1,3-苯并二噁茂类化合物山芝麻素可用于制备抗乙肝病毒药物和抗补体药物。

附图说明

图1.山芝麻地上部分中1,3-苯并二噁茂类化合物山芝麻素的提取分离流程图。

具体实施方式

实施例1制备山芝麻素

取山芝麻干燥地上部分15kg，粉碎，用95％乙醇回流提取3次(50L×3)，每次2h，合并提取液并浓缩得浸膏1.05kg，加水(4L)混悬，分别以等体积石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取5次，合并萃取液并浓缩至干，得乙酸乙酯萃取物160g。将乙酸乙酯萃取部位经硅胶(200-300目)柱色谱分离，依次以二氯甲烷-甲醇(50:1-0:1)梯度洗脱，得到11个流份(Fr.1-11)，其中流份Fr.3(30g)再经硅胶柱色谱(二氯甲烷-甲醇，30:1,20:1,10:1,5:1,1:1,1:2)、MPLC(甲醇-水，10:90-90:10梯度洗脱)和半制备HPLC(甲醇-水，42:58等度洗脱)纯化，分离得到化合物山芝麻素(helicterin)；

所得化合物为白色无定形粉末；分子式：C₁₉H₁₆O₆；0(c0.2,MeOH)；IR(KBr)ν_max:3417(OH),2922,1738(C＝O),1662,1465,1377,1099,805cm^-1；UV(MeOH):λ_max(logε):284.3(3.91),318.4(3.88)nm；ESIMS：340；¹H-NMR(600MHz,DMSO-d₆)δ_H:7.91(1H,d,J＝1.3Hz,H-6'),7.47(1H,d,J＝1.6Hz,H-4),7.44(1H,dd,J＝8.1,1.7Hz,H-6),7.42(1H,d,J＝1.2Hz,H-4'),7.40(1H,s,H-2),7.05(1H,d,J＝8.1,H-7),6.10(2H,s,H-11),4.02(3H,s,3'-OCH₃),3.80(2H,t,J＝6.3Hz,H-3″),3.20(2H,t,J＝6.3Hz,H-2″)；¹³C-NMR(150MHz,DMSO-d₆)δ_C:198.5(C-1″),156.5(C-8),148.2(C-10),148.1(C-9),145.6(C-2'),144.7(C-3'),133.8(C-5'),130.4(C-1'),123.4(C-5),119.1(C-6),115.0(C-6'),108.9(C-7),105.8(C-4'),105.2(C-4),101.7(C-2),101.6(C-11),57.2(C-3″),41.5(C-2″),56.0(3'-OCH₃)；HRESIMS:m/z363.0838[M+Na]⁺(C₁₉H₁₆O₆Na；calcd.363.0839)。

实施例2体外抗HBV实验

应用HepG2的2.2.15细胞株(教育部/卫生部医学分子病毒学重点实验室，上海)，以每孔10×10⁵个细胞接种于24孔板，培养基为DMEM，生长液含10％胎牛血清，380μg/mlG418，0.03％谷胺酰胺，青霉素、链霉素各100μg/ml，在5％CO₂孵箱中37℃培养，48小时后，换成二甲基亚砜助溶的含药物的培养液，每种药物设3～5个浓度，每个浓度设4个平行孔，继续培养9天(每3天换液一次)，收集上清液用ELISA检测HBsAg及HBeAg含量。同样条件下以不含药物的培养液上清液作为对照组。同时用上述细胞株，用MTT法测定药物的细胞毒性。阳性对照为拉米呋啶(3TC)。结果证实本发明所述化合物具有显著的抗HBV活性，且有效浓度低，细胞毒性较小，当在最大无细胞毒浓度100μg/ml时，山芝麻素对HBsAg的抑制率为47.1％；对HBeAg的IC₅₀值为53.7μg/ml，显著高于阳性对照拉米呋啶(3TC)(如表1所示)。

表1.山芝麻素对HBsAg和HBeAg分泌的抑制作用

/：当细胞毒性≥25％时不进行抑制率测试

实施例3体外抗补体经典途径激活试验

取补体(豚鼠血清)0.04ml，加入巴比妥缓冲液(BBS)配制成1:10的溶液，用BBS对倍稀释成1:20、1:40、1:80、1:160、1:320、1:640和1:1280的溶液。取1:1000溶血素、2％羊红细胞(SRBC)各0.1ml及各浓度补体0.2ml溶于0.2mlBBS中，混匀，37℃水浴30min后放入低温高速离心机，在4000rpm、4℃条件下离心5min。分别取每管上清0.2ml于96孔板，在405nm测定其吸光度。实验同时设置全溶血组(0.1ml2％SRBC、0.1ml溶血素溶于0.4ml三蒸水)。以三蒸水溶血管的吸光度作为全溶血标准，计算溶血率。以补体稀释度为X轴，溶血百分率为Y轴作图。选择达到相似高溶血率的最低补体浓度作为确保体系能正常溶血所需的临界补体浓度。取临界浓度的补体与供试品混匀，按上述方法于405nm下测定吸光度。实验同时设置供试品对照组、补体组和全溶血组；将供试品吸光度值扣除相应供试品对照组吸光度值后计算溶血率。以供试品浓度作为X轴，溶血抑制率作为Y轴作图，计算50％抑制溶血所需供试品的浓度(CH₅₀)。

实施例4体外抗补体旁路途径激活试验

取补体(人血清)0.2ml，加入AP稀释液(巴比妥缓冲液，pH＝7.4,含5mMMg²⁺,8mMEGTA)配制成1:5的溶液，并对倍稀释成1:10、1:20、1:40、1:80、1:160、1:320和1:640的溶液。取各浓度补体0.15ml、AP稀释液0.15ml及0.5％兔红细胞(RE)0.20ml，混匀，37℃水浴30min后置于低温高速离心机，在4000rpm、4℃条件下离心5min。分别取每管上清0.2ml于96孔板，在405nm测定吸光度。实验同时设置全溶血组(0.20ml0.5％RE溶于0.3ml三蒸水)。以三蒸水溶血管的吸光度作为全溶血标准，计算溶血率。以补体稀释度为X轴，溶血百分率为Y轴作图。选择达到相似高溶血率的最低补体浓度作为确保体系能正常溶血所需的临界补体浓度。取确定的临界浓度的补体与供试品混匀，按上述方法于405nm下测定其吸光度。实验同时设置供试品对照组、补体组和全溶血组。将供试品吸光度值扣除相应供试品对照组吸光度值后计算溶血率。以供试品浓度作为X轴，溶血抑制率作为Y轴作图，计算50％抑制溶血所需供试品的浓度(AP₅₀)。

经过体外抗补体活性测定，结果表明，本发明的化合物对补体系统经典途径和旁路途径补体激活均有较强的抑制作用，50％溶血所需最小供试品浓度如表2所示。

表2.山芝麻素对补体经典途径和旁路途径的补体抑制作用(Mean±SD,n＝3)

本发明中实验采用的试剂均为本领域公知技术，可市购。

Claims

1.如下化学结构的1,3-苯并二噁茂类化合物山芝麻素：

2.按权利要求1所述的1,3-苯并二噁茂类化合物山芝麻素，其特征在于，通过下述方法制备，

取山芝麻干燥地上部分，粉碎，用95％乙醇回流提取3次，每次2h，合并提取液并浓缩得浸膏，加水混悬，分别以等体积石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取5次，合并萃取液并浓缩至干，得乙酸乙酯萃取物；将乙酸乙酯萃取部位经硅胶200-300目柱色谱分离，依次以二氯甲烷-甲醇50:1-0:1梯度洗脱，得到11个流份为Fr.1-11，其中流份Fr.3再经硅胶柱色谱其中：二氯甲烷-甲醇，30:1,20:1,10:1,5:1,1:1,1:2、MPLC其中：甲醇-水，10:90-90:10梯度洗脱和半制备HPLC其中甲醇-水，42:58等度洗脱纯化，分离得到化合物山芝麻素。

3.权利要求1所述的1,3-苯并二噁茂类化合物山芝麻素在制备抗乙肝病毒药物中的用途。

4.权利要求1所述的1,3-苯并二噁茂类化合物山芝麻素在制备抗补体药物中的用途。

5.按权利要求3所述的用途，其特征在于，所述的1,3-苯并二噁茂类化合物山芝麻素抗HBV的活性。

6.按权利要求3所述的用途，其特征在于，所述的1,3-苯并二噁茂类化合物山芝麻素抑制补体系统经典途径和旁路途径补体激活。