CN103784427A

CN103784427A - 含桉烷型倍半萜的药物组合物及其在制药中的应用

Info

Publication number: CN103784427A
Application number: CN201410074452.4A
Authority: CN
Inventors: 陈纪军; 赵勇; 马云保; 黄晓燕; 耿长安; 张雪梅
Original assignee: Kunming Institute of Botany of CAS
Current assignee: Kunming Institute of Botany of CAS
Priority date: 2014-03-03
Filing date: 2014-03-03
Publication date: 2014-05-14
Anticipated expiration: 2034-03-03
Also published as: CN103784427B

Abstract

本发明提供以结构式（I）所示的两个桉烷型倍半萜7-桉烷-4(15)-1β,6α-二醇[7-eudesm-4(15)-ene-1β,6α-diol,1]和pumilaside A(2)为活性成分与可药用载体组成的药物组合物，它们在制备抗乙型病毒性肝炎的药物中的应用，以及化合物1和2及其药物组合物的制备方法。

Description

含桉烷型倍半萜的药物组合物及其在制药中的应用

技术领域：

本发明属于药物技术领域，具体地说，涉及含桉烷型倍半萜化合物1或/和2与可药用载体组成的治疗乙型病毒性肝炎的药物组合物，它们的制备方法，以及化合物1和2及其药物组合物在制备抗乙型病毒性肝炎的药物中的应用。

背景技术：

乙型病毒性肝炎简称乙型肝炎，是由乙型肝炎病毒(hepatitis Bvirus,HBV)引起的，一般通过血液和体液传播、呈慢性携带状态的传染病。其传染性比艾滋病强50～100倍，健康人群被感染后罹患肝硬化和肝细胞癌的风险增加1000倍，并最终导致死亡。据世界卫生组织(WHO)统计,全世界共有20亿HBV携带者，其中慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B,CHB)患者3.5亿；仅在中国就有约1.2亿人携带HBV，其中CHB患者超过3000万，每年约35万例患者死于CHB相关疾病。现有的抗HBV药物(主要包括疫苗、干扰素和核苷类)的疗效已得到确认，但由于易产生耐药性、作用靶点单一、副作用明显等原因仍无法满足临床需要。迄今为止，乙型肝炎依旧是威胁全世界人类健康的重要问题，抗HBV药物仍然是全球药物研发的热点之一。

天然产物由于结构复杂多样，从中寻找高效低毒、作用靶点新颖的先导化合物已经成为新型抗HBV药物研发的重要组成部分。据统计，通过体内和体外活性筛选被证实具有潜在抗HBV活性的天然产物类型包括木脂素、萜类、生物碱、黄酮、香豆素、环肽等。茵陈为菊科植物滨蒿Artemisia scoparia Waldst.et Kit.或茵陈蒿Artemisiacapillaris Thunb.的干燥地上部分。春季幼苗高6～10cm时采收或秋季花蕾长成至花初开时采割，除去杂质和老茎，晒干。春季采收的习称“绵茵陈”，秋季采割的称“花茵陈”。本品味苦、辛，微寒。归脾、胃、肝、胆经。关于茵陈药理活性的记载最早见于《神农本草经》中，谓其能除“热结黄疸，久服轻身益气耐老”。中医认为其气芳香，有清湿热，退黄疸的功效，临床上主要用来治疗黄疸尿少、湿疮瘙痒、黄疸型传染性肝炎等症状。

茵陈广泛用于慢性乙型肝炎的治疗。《中国药典》中收录的多种治疗乙肝的中药制剂(乙肝宁颗粒、乙肝养阴活血颗粒、小儿肝炎颗粒、护肝片、利肝隆颗粒、肝炎康复丸、茵芪肝复颗粒、茵栀黄口服液、茵胆平肝胶囊、黄疸肝炎丸、清肝利胆胶囊等)中均以茵陈作为主要药效组分。为揭示茵陈的活性成分，中外研究者其化学成分进行了大量研究，结果表明茵陈中主要含有香豆素，黄酮，色原酮，三萜，甾体，烯炔，长链脂肪族化合物，嘧啶，挥发油等。然而，现有文献中对于这些化合物活性的报导主要集中在保肝利胆方面，其抗HBV活性物质仍然不清楚。

桉烷型倍半萜存在于多种植物中，先前的研究表明该类化合物对HIV以及1型单纯疱疹病毒(HSV-1)病毒具有一定的抑制作用[Hayashi等，Journal of Antimicrobial Chemotherapy1996,37,759-68;Zhihua Sun等，Journal of Natural Products2004,67,1975-9]。赵昱等从菊科六棱菊属植物中分离得到的一系列对映桉烷型倍半萜醇和苷对HBsAg的分泌和HBV DNA的复制均具有一定的抑制作用[赵昱CN1935762A]。它们的结构与本申请所要求保护的化合物完全不同。

现有的研究表明，7-桉烷-4(15)-1β,6α-二醇(1)具有一定的抗疟原虫、抗炎活性，而pumilaside A(2)对肿瘤的生长具有一定的抑制作用。III-Min Chung等研究表明化合物1对氯喹敏感的恶性疟原虫(P.falciparum)具有一定的抑制作用,IC₅₀为42.1±2.1μM(III-MinChung等,Phytotherapy Research2010,24,451-3)。Piseth Khiev等也对其抗炎活性进行了研究，结果表明化合物1在0.5mg/耳的剂量下对豆蔻酰佛波醇乙酯(TPA)引起的小鼠耳水肿具有一定的抑制作用，抑制率为29.9%(A.Berenice AG等，Journal of Natural Products,2004,67,914-7)。此外，Xinya Xu等研究也表明pumilaside A(2)在A549,LAC,Hela以及HepG2细胞系中均显示出一定的抗肿瘤活性，IC₅₀在0.012-6.29μM之间(Xu XY等,Food Chemistry2010,123,1123-6)。

迄今，现有技术中没有关于7-桉烷-4(15)-1β,6α-二醇(1)和pumilaside A(2)抗乙型肝炎活性的报道，也没有它们及其药物组合物在制备或治疗乙型病毒性肝炎的药物中的应用的报道。

发明内容：

本发明的目的在于提供一类具有治疗乙型病毒性肝炎药用价值的式(I)所示的化合物1和2以及与可药用载体或赋形剂组成的药物组合物在制备抗乙型病毒性肝炎药物中的应用；化合物1和2及其药物组合物的制备方法。

为了实现本发明的上述目的，本发明提供了如下的技术方案：

结构式(I)所示的桉烷型倍半萜化合物1或/和2在制备抗乙型肝炎性病毒药物中的应用，

抗乙型肝炎病毒的药物组合物，含有结构式(I)所示的桉烷型倍半萜化合物1或/和2以及药学上可接受的载体。

本发明还提供了式(I)化合物1和2的制备方法，取茵陈蒿(Artemisia capillaris)全草，粉碎，用90%乙醇回流提取两次，每次3小时，合并乙醇提取液，过滤，减压浓缩至无醇味，将该提取液悬浮于水溶液中，用乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯部分用甲醇-氯仿溶解吸附于硅胶上，室温放置挥干溶剂，研碎后经硅胶柱层析，用甲醇-氯仿(0:100-60:40)洗脱，得到7个组分（A-G），组分D经过MCI CHP-20Pgel柱中压制备，甲醇-水(30:70-100:0)洗脱，得到4个流份D-1～D-4.D-1再通过硅胶柱层析，以乙酸乙酯-石油醚(20:80)洗脱，并经Sephadex LH-20柱(甲醇)纯化得到化合物1；组分F经过MCICHP-20P gel柱中压制备，甲醇-水(30:70-100:0)洗脱，得到4个流份F-1～F-4，F-2再通过硅胶柱层析，以甲酸-甲醇-氯仿(0.1:3:97)洗脱，并经Sephadex LH-20柱(甲醇)纯化得到化合物2。

同时提供了制备权利要求2所述的药物组合物的方法，化合物1或/和2加入可药用载体或赋形剂。

本发明化合物用作药物时，可以直接使用，或者以药物组合物的形式使用。该药物组合物含有0.1-99%，优选为0.5-90%的本发明化合物，其余为药物学上可接受的，对人和动物无毒和惰性的可药用载体和/或赋形剂。

所述的药用载体或赋形剂是一种或多种固体、半固体和液体稀释剂、填料以及药物制品辅剂。将本发明的药物组合物以单位体重服用量的形式使用。本发明的药物可经注射（静注、肌注）和口服两种形式给药。

具体实施方式：

为了更好地理解本发明的实质，下面将用本发明的试验例来说明本发明式(I)化合物7-桉烷-4(15)-1β,6α-二醇(1)和pumilaside A(2)的药理作用结果，但不以此试验例来限定本发明。

试验例1：

化合物7-桉烷-4(15)-1β,6α-二醇(1)和pumilaside A(2)对HBsAg，HBeAg分泌和HBV DNA复制的抑制作用以及对HepG2.2.15细胞的药物毒性。

1材料和方法

1.1材料:7-桉烷-4(15)-1β,6α-二醇(1)和pumilaside A(2)(I)；泰诺福韦（江西晨阳药业有限公司）；HepG2.2.15细胞(广州空军医院)；高糖DMEM(GIBCO)；G418(GIBICO)；胎牛血清(GIBICO)；L–谷氨酰胺(AMRESCO)；青霉素，链霉素[石药集团中诺药业(石家庄)有限公司]。

1.2仪器：酶标仪Bio-RAD680(美国)；CO2培养箱Thermo Forma3310(美国)；倒置生物显微镜XD-101型(南京)；荧光定量PCR仪Mastercycler ep realplex型(德国eppendorf公司)；低温高速离心机Centrifuge5415D型(德国eppendorf公司)。

1.3实验过程：HepG2.2.15细胞生长培养基组成为高糖DMEM，10%的胎牛血清，0.03%L–谷氨酰胺，100mg/L G418,100IU青霉素以及100IU链霉素。维持液组成为高糖DMEM，2%的胎牛血清，0.03%L–谷氨酰胺，100mg/L G418,100IU青霉素以及100IU链霉素。供试药物由维持液稀释配制成一定浓度的含药培养基。将胰酶消化后的单细胞悬液接种于细胞板上，于48h后换为含药培养基，每种药物用维持液四倍稀释为四个药物浓度，同时设置只加维持液的细胞对照组，并以泰诺福韦做阳性药物对照。用MTT法测定药物对细胞的毒性；用酶联免疫法测定HBsAg和HBeAg载量，用荧光定量PCR法检测HBV DNA载量。

1.3.1药物细胞毒性测定：

根据Mosmann建立的MTT法检测药物的细胞毒性。具体方法是：HepG2.2.15细胞接种于48孔板，3×10⁴细胞每孔，加入生长培养基，于5％CO₂，37℃培养箱中培养72h，吸除原培养基，加入不同浓度含药培养基，于5％CO₂，37℃培养箱中继续培养72h后吸除培养基，按0.2mL每孔加入浓度为0.8mg/mL的MTT，于37℃5%CO₂孵育4h后弃上清，每孔中加入0.2mL二甲基亚砜，于37℃孵育10min，至生成的蓝紫色结晶物完全溶解，在酶标仪上测定溶液在490nm下的吸光度值。根据结果计算药物对细胞的破坏百分率：

η_destroy=(A_{细胞对照组}–A_{供试样品组})/(A_{细胞对照组}–A_空白组)×100。

1.3.2抑制HBsAg和HBeAg分泌活性的测定：

利用ELISA（酶联免疫吸附试验）法，测定样品对HBsAg和HBeAg抑制活性。HepG2.2.15细胞接种于48孔板，3×10⁴细胞每孔，加入生长培养基，于5％CO₂，37℃培养箱中培养72h，吸除原培养基，加入不同浓度含药培养基，于5％CO₂，37℃培养箱中培养72h。取上清液，分别利用HBsAg和HBeAg试剂盒检测。利用酶标仪测定溶液在的吸光度值（490nm）。

抑制率η_inhibitory=(A_{细胞对照组}–A_{供试样品组})/(A_{细胞对照组}–A_空白组)×100

IC₅₀=Anti lg[(50–<50%抑制率)/(>50%抑制率–<50%抑制率)×lg(稀释倍数)+lg(<50%抑制率的浓度)]

SI=CC₅₀/IC₅₀

1.3.3抑制HBV DNA复制活性的测定：

具体方法是：HepG2.2.15细胞按5×10⁵个每孔接种于24孔细胞板，于5％CO₂，37℃培养箱中用生长培养基培养，72h后更换为含药培养基，48h后继续以含药培养基更换原培养基，培养48h。使用血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒(TIANamp Gemomic DNAKit，TIANGEN，China)提取细胞DNA。用HBV核酸定量检测试剂盒(QIAGEN,Co.,Ltd,Shenzhen)荧光定量PCR法定量检测HBVDNA载量。取2μL DNA样品，加入37.6μL HBV PCR反应液，0.4μL Taq酶，0.06μL UNG。PCR反应在Mastercycler Ep Realplex System定量PCR仪(Eppendorf,Masteraycler Eprealplex,German)上进行，扩增程序为：37℃：5min；94℃：1min；95℃：5sec，60℃：30sec，40个循环。根据结果计算药物的抑制百分率：

η_inhibition=(A_{细胞对照组}–A_{供试样品组})/(A_{细胞对照组}–A_空白组)×100。

2.结果：

CC₅₀为半数细胞致死浓度，根据破坏百分率η_destroy计算得到。IC₅₀为半数病毒抑制浓度，根据抑制百分率η_inhibition计算得到。最终结果以选择指数(SI=CC₅₀/IC₅₀)来评价。

CC₅₀，IC₅₀及SI的计算公式：

A=log(>50%时的η_destroy/η_inhibition的药物浓度)

B=log(<50%时的η_destroy/η_inhibition的药物浓度)

C=|A–B|

CC₅₀=Anti log[(50–<50%时的η_destroy)×C/(>50%时的η_destroy–<50%时的η_destroy)]+B

IC₅₀=Antilog[(50–<50%时的η_inhibition)×C/(>50%时的η_inhibition–<50%时的η_inhibition)]+B

SI=CC₅₀/IC₅₀

具体结果见表1：

表1化合物1和2在HepG2.2.15细胞对HBV抑制活性和细胞毒性(单位μM)

3、结论：

实验结果显示，化合物7-桉烷-4(15)-1β,6α-二醇(1)和pumilaside A(2)在体外对HBV DNA复制都具有显著的抑制作用，其IC₅₀值分别为19.70和12.01μM，且细胞毒性较低，选择指数分别为105.5和139.2。化合物2对HBsAg和HBeAg的分泌具有较强的抑制活性，IC₅₀值分别为15.02以及9.00μM，选择指数分别为111.3和185.9。化合物1对HBsAg和HBeAg也具有一定的抑制作用，IC₅₀值分别为155.29(SI=13.4)和107.52(SI=19.3)。

以下通过实施例来进一步阐明本发明的制备方法及药物组成，但并不以此来限定本发明的实质性内容。

实施例1：

化合物1和2的制备：

化合物1和2的提取分离:

采集茵陈蒿全草(10kg)，其学名经鉴定为Artemisia capillarisThunb.，用90%乙醇回流提取两次，每次3小时，合并乙醇提液，减压回收乙醇至无醇味。将该提取液悬浮于水溶液中，用乙酸乙酯萃取。乙酸乙酯部分用甲醇-氯仿溶解吸附于硅胶上，室温放置挥干溶剂，研碎后经硅胶柱层析，用甲醇-氯仿(0:100-60:40)洗脱，得到7个组分（A-G）。。组分D经过MCI CHP-20P gel柱中压制备，甲醇-水(30:70-100:0)洗脱，得到4个流份D-1～D-4.D-1再通过硅胶柱层析，以乙酸乙酯-石油醚(20:80)洗脱，并经Sephadex LH-20柱(甲醇)纯化得到化合物1(12mg)。组分F经过MCI CHP-20P gel柱中压制备，甲醇-水(30:70-100:0)洗脱，得到4个流份F-1～F-4.F-2再通过硅胶柱层析，以甲酸-甲醇-氯仿(0.1:3:97)洗脱，并经Sephadex LH-20柱(甲醇)纯化得到化合物2(43mg)。化合物1和2的结构通过与文献(Kamel A等,Journal of Natural Prodructs1995,58,428-31;Xu X等,Food Chemistry2010,123,1123-6)对比得以确定。

制备得到的化合物1的波谱数据为:HRESIMS m/z:239.1966[M+H]⁺(计算值239.2006)。¹H-NMR(400MHz,氘代氯仿)δ:5.01(1H,s,H-15a),4.74(1H,s,H-15b),3.71(1H,m,H-6),3.42(1H,dd,J=11.0,4.5Hz,H-1),0.95(3H,d,J=7.0Hz,H-12),0.87(3H,d,J=7.0Hz,H-13),0.70(3H,s,H-14)。¹³C-NMR(100MHz,氘代氯仿)δ:79.0(d,C-1),31.8(t,H-2),35.0(t,H-3),146.1(s,C-4),55.8(d,C-5),66.9(d,C-6),49.2(d,C-7)，18.0(t,H-8),36.2(t,C-9),41.6(s,C-10),25.9(d,C-11),21.1(q,C-12),16.1(q,C-13),11.6(q,C-14),107.8(t,C-15)。

化合物2的波谱数据为：HRESIMS m/z:441.2459[M+Na]⁺(计算值441.2458)。¹H-NMR(400MHz,氘代氯仿)δ:4.67(1H,dd,J=11.3,4.0Hz,H-6),4.51(1H,d,J=7.4Hz,H-1'),3.28(1H,m,H-1),2.19(1H,m,H-11),1.93(1H,d,J=11.2Hz,H-5),1.39(3H,s,H-14),1.10(3H,d,J=6.6Hz,H-12),0.98(3H,d,J=6.5Hz,H-13),0.96(3H,s,H-15).¹³C-NMR(100MHz,氘代氯仿)δ:80.7(d,C-1),29.1(t,C-2),41.1(t,C-3),74.5(s,C-4),51.6(d,C-5),79.7(d,C-6),42.8(d,C-7),24.0(t,C-8),37.3(t,C-9),43.2(s,C-10),26.8(d,C-11),23.5(q,C-12),24.2(q,C-13),24.4(q,C-14),14.9(q,C-15),100.4(d,C-1'),76.2(d,C-2'),78.7(d,C-3'),72.3(d,C-4'),78.6(d,C-5'),63.5(t,C-6')。

实施例2：

按实施例1的方法先制得化合物1或/和2，用少量的DMSO溶解后，按常规加注射用水，精滤，灌封灭菌制成注射液。

实施例3：

按实施例1的方法先制得化合物1或/和2，用少量的DMSO溶解后，将其溶于无菌注射用水中，搅拌使溶解，用无菌抽滤漏斗过滤，再无菌精滤，分装于安瓿中，低温冷冻干燥后无菌熔封得粉针剂。

实施例4：

将实施例1所分离得到的化合物1和2，分别按其与赋形剂重量比为9:1的比例加入赋形剂，制成粉剂。

实施例5：

按实施例1的方法先制得化合物1和2，分别按其与赋形剂重量比为5:1的比例加入赋形剂，制粒压片。

实施例6：

按实施例1的方法先制得化合物1和2，分别按常规口服液制法制成口服液。

实施例7：

按实施例1的方法先制得化合物1或/和2，按其与赋形剂重量比为5:1的比例加入赋形剂，制成胶囊。

实施例8：

按实施例1的方法先制得化合物1或/和2，按其与赋形剂重量比为3:1的比例加入赋形剂，制成胶囊。

实施例9：

按实施例1的方法先制得化合物1或/和2，分别按其与赋形剂重量比为5:1的比例加入赋形剂，制成颗粒剂。

Claims

1.结构式(I)所示的桉烷型倍半萜化合物1或/和2在制备抗乙型肝炎病毒药物中的应用，

2.用于治疗乙型病毒性肝炎的药物组合物，其中含有治疗有效量的权利要求1中结构式(I)所示的桉烷型倍半萜化合物1或/和2和药学上可接受的载体。

3.权利要求1所述式(I)化合物1和2的制备方法，取茵陈蒿(Artemisia capillaris)全草，粉碎，用90%乙醇回流提取两次，每次3小时，合并乙醇提取液，过滤，减压浓缩至无醇味，将该提取液悬浮于水溶液中，用乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯部分用甲醇-氯仿溶解吸附于硅胶上，室温放置挥干溶剂，研碎后经硅胶柱层析，用甲醇-氯仿(0:100-60:40)洗脱，得到7个组分（A-G），组分D经过MCI CHP-20Pgel柱中压制备，甲醇-水(30:70-100:0)洗脱，得到4个流份D-1～D-4.D-1再通过硅胶柱层析，以乙酸乙酯-石油醚(20:80)洗脱，并经Sephadex LH-20柱(甲醇)纯化得到化合物1；组分F经过MCICHP-20P gel柱中压制备，甲醇-水(30:70-100:0)洗脱，得到4个流份F-1～F-4，F-2再通过硅胶柱层析，以甲酸-甲醇-氯仿(0.1:3:97)洗脱，并经Sephadex LH-20柱(甲醇)纯化得到化合物2。

4.制备权利要求2所述的药物组合物的方法，首先取茵陈蒿(Artemisia capillaris)全草，粉碎，用90%乙醇回流提取两次，每次3小时，合并乙醇提取液，过滤，减压浓缩至无醇味，将该提取液悬浮于水溶液中，用乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯部分用甲醇-氯仿溶解吸附于硅胶上，室温放置挥干溶剂，研碎后经硅胶柱层析，用甲醇-氯仿(0:100-60:40)洗脱，得到7个组分（A-G），组分D经过MCI CHP-20Pgel柱中压制备，甲醇-水(30:70-100:0)洗脱，得到4个流份D-1～D-4.D-1再通过硅胶柱层析，以乙酸乙酯-石油醚(20:80)洗脱，并经Sephadex LH-20柱(甲醇)纯化得到化合物1；组分F经过MCICHP-20P gel柱中压制备，甲醇-水(30:70-100:0)洗脱，得到4个流份F-1～F-4，F-2再通过硅胶柱层析，以甲酸-甲醇-氯仿(0.1:3:97)洗脱，并经Sephadex LH-20柱(甲醇)纯化得到化合物2；然后化合物1或/和2按常规制剂制作方法加入可药用载体或赋形剂。