CN100443117C - 一种治疗性乙型肝炎的疫苗制剂、其制备方法及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种治疗性乙型肝炎的疫苗制剂，其特征在于包括：重组(酵母)乙肝疫苗(HBsAg)：40～80μg/ml，含铝0.5mg/ml。还公开了一种治疗性乙型肝炎的疫苗制剂的制备方法及其用途，以及含有治疗性乙型肝炎疫苗的组合物。该制剂可诱导细胞免疫应答而有利机体清除HBV，能增加Balb/c小鼠的细胞免疫功能，促Th1类细胞因子高水平表达，提高T增殖的水平，并且促特异性CTL活性提高。

Description

一种治疗性乙型肝炎的疫苗制剂、其制备方法及其用途

技术领域

本发明涉及一种治疗性乙型肝炎的疫苗制剂、制备方法及其用途，具体是指采用基因重组技术，通过酵母发酵的乙肝表面抗原制剂，属于生物制品领域。

背景技术

慢性乙型肝炎(CHB)是我国的常见病、多发病，而探索其治疗方法，主要从以下几个方面入手：抗病毒、调节免疫功能、护肝(促进肝细胞再生)、抗肝纤维化，防止癌变等，但抗病毒治疗是攻克本病的关键，这已形成共识。目前国内外公认的抗HBV药物是干扰素-α(IFN-α)和拉米呋啶。IFN-α的抗病毒机理包括免疫调节和直接抗病毒作用，而拉米呋啶则为抑制逆转录酶的活性，两者的治疗适应症均为SALT升高的HBsAg、HBeAg、HBV DNA阳性病人。IFN-α的常规应用为3～5mL，3/周×6个月，HBV DNA及HBeAg阴转、SALT复常者仅为30％左右，尚有副作用较多的缺点。拉米呋啶为核苷类似物，国内临床应用已有几年，能使血清HBV DNA迅速降低，有效率达90％，但停药后HBV又重新复制，反跳率达80％，且HBeAg阴转率很低，在用药6个月以上病例，容易出现P基因区“YMDD”变异。拉米呋啶的作用机制是抑制逆转录酶，阻断由mRNA逆转录为DNA的第一条链及由第一条链合成的第二条链，从而抑制病毒复制。但由于其对病毒复制的原始模板共价闭合环状DNA(cccDNA)并无影响，且对mRNA转译为各种病毒蛋白(包括HBeAg)也无作用，因此，决定了该药不能彻底清除HBV。最近，国外又报道新的嘌呤类核苷类似物-阿地福韦双脂，已在临床试验，对拉米呋啶治疗出现YMDD变异而耐药的病人有效，推荐剂量为10mg/d，但剂量＞30mg/d时可引起肾毒性。由于IFN-α及拉米呋啶对SALT正常的CHB患者(无症状HBV携带者)的临床疗效无显著性差异，已有学者将此类型病人列为不适合治疗对象，这使众多的CHB病人感到失望。但是否HBV携带者必须等待发展至肝细胞的免疫损害、SALT升高时才进行治疗呢？这是当前肝病研究者不能回避的一个重要问题。

目前公认的抗病毒药物之所以被限定于慢性乙肝转氨酶升高病例(免疫清除期)，究其原因并非完全归于感染病毒类型的不同(HBV基因型)或出现病毒的变异，而在很大程度上与患者处于免疫应答的不同状态(完全免疫耐受或部分免疫耐受)有关，从而导致抗病毒药物不能发挥作用，假如我们能够深入研究慢性乙肝患者不同阶段的免疫应答状态，并预先进行免疫调节治疗，恢复或启动免疫应答机制，同时联合抗病毒药物的应用，可能会提高临床治疗效果，这也是值得我们当前应该积极探索的问题。

2000年6月在日本召开的亚太国际肝病学术会议上已形成共识，把慢性乙肝免疫痛理分为三个连续阶段，即免疫耐受期、免疫清除期和病毒残留期。这是HBV感染后，由宿主T细胞介导的感染肝细胞表面所表达的抗原决定簇在不同阶段的免疫反应的结果，在临床上，可根据这三种不同时期的免疫应答而制订相应的治疗方案和措施，有可能更有利于机体清除HBV感染和促进肝细胞功能的恢复。

SALT正常而HBV DNA高水平复制者可视为处于免疫耐受期，免疫耐受期患者的免疫系统对病毒的高度耐受，呈现高滴度的血清HBeAg和HBV DNA，而宿主T细胞不产生免疫应答，故在临床上不出现肝病体征、症状和肝功能损伤，由于处于免疫不应答状态，对任何抗病毒治疗疗效均很差。有的学者主张此时期不适应或不需要抗病毒治疗，即等待患者演变或进入免疫清除期才进行治疗。

而SALT明显升高或反复波动，HBV中度复制可视为宿主免疫系统已识别并开始攻击肝靶细胞，得以清除HBV而在一定程度可导致肝细胞损伤，即免疫清除期。免疫清除期患者由于对免疫耐受逐渐减弱，出现HBeAg、HBV DNA滴度下降，血清SALT水平升高，提示宿主已出现免疫应答，不断清除感染的肝细胞内的HBV。临床实践已证明此时期是抗病毒治疗的最佳时间。

病毒残留期则为未被清除HBV整合形成潜在感染，正常SALT，低水平病毒复制。

目前已有充分实验资料及临床证据提示，CHB患者存在不同程度的免疫耐受，其具体表现为DC及T细胞的功能不足。

乙型肝炎病毒(HBV)感染慢性化的主要原因是宿主细胞免疫功能缺陷，对HBV产生了不同程度的免疫耐受。虽然已有一些抗HBV药物，但HBV的最终清除要依靠机体的主动免疫。因而寻找免疫调节药物，增强细胞免疫应答，上调特异性免疫，主动清除HBV是治疗CHB的重要环节。目前国内外研制的特异性免疫调节药物主要有HBsAg疫苗、HBsAg/前S₂疫苗、HBsAg复合疫苗和HBV DNA疫苗等，这些疫苗多以HBsAg为主要免疫原。

国内应用乙肝疫苗治疗CHB已有多年历史，早在“七.五”、“八.五”期间已提出乙肝疫苗联合猪苓多糖的治疗方案。但多年来对乙肝疫苗的临床应用缺乏规范化，治疗剂量、疗程均不统一，总的来说是剂量偏小，疗程偏短，并没有达到促进或恢复免疫调节的作用。因此，研制一种既能对HBV起到良好的预防作用，又能用来治疗HBV感染引起的疾病的疫苗，成为国内外疫苗疗法研究的方向。

发明内容

本发明的目的在于提供一种治疗性乙型肝炎的疫苗制剂，该制剂可诱导细胞免疫应答而有利机体清除HBV，能增加Balb/c小鼠的细胞免疫功能，促Th1类细胞因子高水平表达，提高特异性T细胞增殖的水平，同时促进特异性CTL活性的提高。

本发明的另一目的在于提供一种治疗性乙型肝炎的疫苗制剂的制备方法。

本发明的又一目的在于提供一种治疗性乙型肝炎的疫苗制剂的用途。

本发明的一种治疗性乙型肝炎的疫苗制剂，其特征在于包括：

重组(酵母)乙肝疫苗(HBsAg)：40～80μg/ml，

含铝0.5mg/ml

本发明的一种治疗性乙型肝炎的疫苗制剂的其余成分为生理盐水。

本发明的一种治疗性乙型肝炎的疫苗制剂，优选为：

重组(酵母)乙肝疫苗(HBsAg)：60～80μg/ml，

含铝0.5mg/ml。

其中最优选的为：

重组(酵母)乙肝疫苗(HBsAg)：60μg/ml，

含铝0.5mg/ml

本发明的一种用于治疗性乙型肝炎疫苗制剂的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

a)选用表达乙型肝炎表面抗原(HBsAg)的酵母工程菌，菌种经培养、发酵后采集得细胞悬液；

b)从细胞中提取抗原，并将抗原进行初步纯化得澄清抗原；

c)澄清抗原经疏水层析纯化，得纯III型抗原；

d)纯III型抗原经稀释、除菌过滤得无菌抗原，将无菌抗原合并液经灭活吸附，得疫苗原液，即得成品。

其中步骤b)所述的初步纯化包括细胞破碎、过滤、通过硅胶处理去除亲脂性杂质。

本发明硅胶处理过程中，可将硅胶沉淀经磷酸溶液洗涤2～3次，用硼酸钠溶液洗脱，超滤并离心后得澄清抗原；

步骤c)所述的疏水层析纯化是将抗原在疏水层析柱上吸附和解析。所述的疏水层析柱可采用丁基琼脂糖。

步骤d)所述的灭活吸附为先经福尔马林处理再经氢氧化铝原位吸附，即加入1∶40福尔马林至终浓度为100μg/ml，加热至34～38℃，保温24～96小时，再冷却到2～8℃，得到灭活抗原；按0.085ml/g的灭活抗原的比例加0.2～0.3M硫酸钾铝溶液，用1N氢氧化钠调PH值为7.0～7.2，搅拌2～3小时，得到汞前PH抗原；然后沉降18～24小时，弃去上清液，再用生理盐水清洗3次后，将清洗液加生理盐水至灭活吸附前的体积，最后加防腐剂进行搅拌得疫苗原液，所述的防腐剂为硫柳汞，所得疫苗原液的抗原浓度为40～80μg/ml，即为成品。

所得成品中含铝浓度为0.5mg/ml。

本发明所述的培养，发酵、采集和提取抗原为本领域公知技术。

医学上已证实，过多的注射铝对人体有害，因此本发明采用了新的制备方法，在提高疫苗抗原浓度的同时，并不改变铝在成品中的浓度，即本发明的一种用于治疗性乙型肝炎疫苗制剂中铝的含量不变，也就是虽然增加了抗原的注射量，但铝的量并未增加。而且经表面抗原吸附实验证明该浓度的铝含量能保证表面抗原的完全吸附。

根据患者的不同程度的免疫耐受状态，可将本发明所述乙肝疫苗制剂与不同的药物进行组合，形成不同组合物进行治疗。

比如针对患者在免疫清除期的免疫耐受状态，可采用如下组合物进行治疗：

本发明的一种含有治疗性乙型肝炎疫苗的组合物，其特征在于包括：乙型肝炎疫苗制剂和抗病毒药物，其中所述的抗病毒药物可为拉米呋啶和/或干扰素-α。乙型肝炎疫苗制剂含量为40～80μg，所述的拉米呋啶为90×30～110×30mg，所述的干扰素-α为12×3万单位～12×5万单位。

该组合物还包括：护肝药物，比如促肝细胞生长素，所述的促肝细胞生长素80×30～160×30mg。

该组合物进一步还可包括：绿脓杆菌制剂注射液或胸腺肽，所述的绿脓杆菌制剂注射液0.8×4～1×4ml，所述的胸腺肽120×4～160×4mg。

针对患者免疫耐受期的免疫耐受状态，可采用如下组合物进行治疗：

本发明的一种含有治疗性乙型肝炎疫苗的组合物，其特征在于包括：乙型肝炎疫苗制剂、胸腺肤和黄芪注射液，其中乙型肝炎疫苗制剂含量为40～80μg，胸腺肽120×4～160×4mg，黄芪注射液为35×4～40×4ml。

在免疫耐受期也可采用包括：乙型肝炎疫苗制剂、绿脓杆菌制剂和胸腺肽的组合物，其中乙型肝炎疫苗制剂含量为40～80μg，所述的绿脓杆菌制剂注射液0.8×4～1×4ml，所述的胸腺肽120×4～160×4mg。

为了使临床疗效更明显，本发明所述的组合物中的各种组分可分别进行包装，分别对患者进行给药，进行治疗。

本发明的一种治疗性乙型肝炎的疫苗制剂在制备治疗慢性乙型肝炎及HBV携带者药剂中的应用。

按患者免疫应答状态将CHB分为三个不同阶段，亦即免疫耐受期、免疫清除期、病毒残留期，根据不同的应答状态，可采用含有本发明所述乙肝疫苗制剂的不同组合物进行治疗。

CHB的免疫病理特点及免疫应答分期，提示患者存在不同程度的免疫耐受状态。因此，恢复或启动免疫应答功能可能是抗HBV治疗获得成效的重要前提，而恢复细胞免疫功能则要依赖免疫疗法。免疫疗法系指通过特异性和非特异性免疫治疗，使患者上调或恢复特异性DC及T细胞功能，对HBV抗原产生细胞免疫应答，从而为配合抗病毒药物抑制或清除HBV创造条件。免疫疗法是以促进和活化体内DC及T细胞为始动，上调恢复细胞免疫应答为过渡，清除肝内HBV为目的。

针对现状，采用免疫辩证方法指导临床治疗，按患者免疫应答状态将CHB分为三个不同阶段，亦即免疫耐受期、免疫清除期、病毒残留期，据此而制定相应不同的治疗方案；采用针对性的联合用药方案，废弃单用抗病毒药的轮换战术，病毒复制指标采用定量分析，如HBV DNA采用荧光PCR方法，HBeAg和HBsAg应用免疫分析定量法(雅培试剂)。以上的改进措施落实在以下的CHB抗病毒“三结合”方案上。

抗HBV治疗“三结合”方案是指免疫疗法与抗病毒药物相结合；特异性免疫治疗与非特异性免疫治疗相结合；增强DC与T细胞功能的药物相结合。“三结合”治疗方案是根据急性乙型肝炎免疫应答过程、步骤和HBV被清除的各个环节而提出来的，其主要内容是积极调动内因，促进和活化DC及T细胞功能，通过调节和恢复机体细胞免疫功能，并发挥以非细胞溶解为主的清除HBV机制，配合使用抑制HBV复制的药物(如拉米呋啶或干扰素)，达到完全清除肝内HBV。本方案的免疫疗法应包括特异性免疫治疗和非特异性免疫治疗，而特异性免疫治疗系指能产生特异性细胞免疫应答的治疗性乙肝疫苗，非特异性免疫治疗包括多组分胸腺肽、胸腺肽α1、IL-2、绿脓杆菌制剂和其它免疫调节剂以及与免疫调节有关的中草药，如黄芪注射液和当归注射液等。特异性免疫治疗以促进DC功能为主，非特异性免疫治疗以促进T细胞功能为主。本发明是以发挥免疫疗法和抗病毒药物疗法各自的优点，体现抗病毒治疗的多途径、多位点、主动和被动、抑制加清除等综合因素，以清除肝内HBV为总目的，达到临床治疗上的高效和低复发。

特异性免疫治疗主要指治疗性乙肝疫苗，包括HBV DNA疫苗、多肽疫苗、HBsAg复合物疫苗和HBsAg蛋白疫苗(前S₂基因和S基因蛋白疫苗)，

对CHB免疫清除期、SALT明显增高的病例，两者可联合应用，而对免疫耐受期病例，本发明认为应先进行免疫疗法(治疗性乙肝疫苗+免疫调节剂，如胸腺肽静脉点滴、IL-2肌注)3～6个月，当患者细胞免疫功能恢复到正常应答状态后，再进行抗病毒药物治疗，不仅使后者更好发挥抗病毒效果，而且可减少停药后HBVDNA反跳。

1.免疫耐受期

治疗原则：先应用免疫疗法3～6个月后，再应用抗病毒治疗。

免疫疗法方案：乙肝疫苗+胸腺肽+黄芪注射液或乙肝疫苗+绿脓杆菌制剂+胸腺肽

乙肝疫苗60μg，肌注，每月一次×12月

胸腺肽120mg加入10％葡萄糖液，静滴，每周3次×3～6个月，或胸腺肽40mg，肌注，每周2～3次×3～6个月

黄芪注射液40ml加入10％葡萄糖液，静滴，每周3次×2～3个月

绿脓杆菌制剂注射液1ml，皮下注射，每周一次×3～6个月

抗病毒药物：IFN-α或拉米呋啶(常规剂量及用法：IFN-α3万～5万单位，肌注，每周3次，拉米呋啶100mg，口服，每天1次)

2.免疫清除期：

治疗原则：免疫疗法+抗病毒药物+护肝

方案：乙肝疫苗+绿脓杆菌制剂注射液或胸腺肽+IFN-α或拉米呋啶+促肝细胞生长素

3.病毒残留期：

乙肝疫苗60μg，肌注，每月一次×12～24个月。

本发明所述的治疗性乙型肝炎的疫苗制剂可诱导细胞免疫应答而有利机体清除HBV，能增加Balb/c小鼠的细胞免疫功能，促进Th1类细胞因子高水平表达，提高特异性T细胞增殖的水平，同时促进特异性CTL活性的提高。采用本发明的制备方法提高了单批产量，在不影响产品质量的前提下提高了配制工序的生产能力，而且在提高疫苗浓度的同时，保持了铝稀释剂在成品中的浓度，减少了铝稀释剂对人体的毒副作用。本发明所述的治疗性乙型肝炎的疫苗制剂可用于治疗慢性乙型肝炎及HBV携带者。

附图说明

图1为实施例3用药前后对照组与HBsAg疫苗组血清中HBsAg含量比较图

具体实施方式

下面实施例进一步描述本发明，但所述实施例仅用于说明本发明而不是限制本发明。

实施例1

本实施例涉及乙型肝炎疫苗(HBsAg)急性毒性实验研究

1材料与方法

1.1仪器与药品、稀释剂

治疗性乙肝疫苗每支1ml，含HBsAg 60μg，含铝0.5mg，批号：T010702、铝稀释剂含铝0.5mg/ml、日立7020自动生化分析仪、AC920^EO血球分析仪(瑞典)、ELISA检测仪及试剂(美国HELIX)。

1.2实验动物

清洁级SD大鼠，SPF级NIH小鼠均由广州中医药大学实验动物中心提供。大鼠体重为200-240克，小鼠：雌20-23克，雄23-27克。健康食蟹猴由广东省顺德实验动物研究所提供，年龄2-3岁。

1.3小鼠急毒实验方法

NIH小鼠按性别体重随机分为三组，即注射用生理盐水组(0.5ml/只)，治疗性乙肝疫苗组(0.5ml/只)，铝稀释剂组(0.5ml/只)。每组10只，雌雄各半。皮下给药后立即观察动物的反应情况，并继续观察4周，在第7、14、21、28天称量动物体重，于给药后28天取血检测生化指标(ALT、AST、BUN、Crea、GLU、GGT)。处死动物，进行剖检，取心、肝、脾、肺、肾、肾上腺、胸腺，称重。

1.4大鼠急毒实验方法

取SD大鼠随机分为三组，即注射用生理盐水组(1ml/只)，治疗性乙肝疫苗组(1ml/只)，铝稀释剂组(1ml/只)。余下方法同小鼠急毒实验。

1.5小鼠长毒实验方法

取NIH小鼠160只，分为高剂量组(12μg/只)、中剂量组(6μg/只)、低剂量组(3μg/只)，生理盐水对照组，每组30只。另设两个卫星组：高剂量组(12μg/只)，生理盐水对照组，每组20只，供免疫学检测用。颈背部皮下每天一次，连续3周，停药后观察4周。检测指标参考文献[4]，分为一般观察、血液学检测、血液生化学检测、病理学检查、组织学检查、恢复期观察，系统解剖观察及称脏器重量及计算脏器系数。对于免疫学指标检测分别取两个卫星组雌雄动物各5只的血样，检测抗-HBs及其亚型IgG2a，检测时间为末次给药后第二天及恢复期结束。

1.6猴长毒实验方法

取24只食蟹猴随机分为4组，雌雄各半。高剂量组(42μg/Kg)，中剂量组(21μg/Kg)，低剂量组(10.5μg/Kg)，注射用生理盐水对照组。皮下给药每天一次，连续21天，停药后连续观察4周。检测指标参考文献，基本上同小鼠长毒实验检测项目，增加心电图、尿液、免疫学检测。

2结果

2.1小鼠急毒实验结果

动物的外观、活动未见异常变化及死亡。各组动物体重均有增加，没有显著性差异(P＞0.05)；各组间食量没有显著性差异(P＞0.05)。四周后用0.5％戊巴比妥钠腹腔注射麻醉取血，检测血生化指标(ALT、AST、BUN、Crea、GLU、GGT)，各组间没有显著性差异(P＞0.05)；肉眼剖检各组未见异常，心、肝、脾、肺、肾、肾上腺、胸腺的重量和脏器系数各组间没有显著性差异(P＞0.05)。结论：小鼠注射治疗性乙肝疫苗的LD50＞30μg/只。

2.2大鼠急毒实验结果

与小鼠急毒实验检测指标的结果基本相同，在增加的血液学指标中(红细胞计数、血红蛋白、血小板、白细胞计数及分类)也没有显著性差异。只是治疗性乙肝疫苗组肝脏脏器的重量和系数比生理盐水组，差异有显著性(P＜0.05＝，其它脏器无显著差异。结论：大鼠注射治疗性乙肝疫苗的LD50＞30μg/只。

2.3小鼠长毒实验结果

一般观察：实验期间，各组动物外观、行为活动未见异常，食量及体重增加无显著性差异(P＞0.05)。给药组第三周起个别动物注射部位有硬结。

血液学检查：末次给药后24小时，高剂量组雌性动物的白细胞计数与空白对照组比较，有非常显著减少(P＜0.01)，中剂量组雄性动物的白细胞计数与空白对照组比较，有显著性减少(P＜0.05＝，但都没有明显的剂量反应关系，且在正常范围内波动；给药组雌性动物的血红蛋白量与空白对照组比较，有显著性减少(P＜0.05)，其中高剂量组有非常显著性减少(P＜0.01)，并有一定的剂量反应。其它血液学指标与空白对照组比较，差异无显著性意义(P＞0.05)。

停药后4周(即首次给药后49天)，高剂量级雌性动物的红细胞计数升高，与空白对照组比较，差异有显著性意义(P＜0.05)。其它血液学指标与空白对照组比较，差异无显著性意义(P＞0.05)。

血液生化学检查：末次给药后24小时(即首次给药后21天)，低剂量组雌性动物的血糖(GLU)水平升高，与空白对照组比较，有非常显著意义(P＜0.01)，但没有明显的剂量反应关系，并在正常参考值范围内；中剂量级雌性动物的总胆固醇(TCHO)水平升高，与空白对照组比较，差异有非常显著性意义(P＜0.01)；中剂量雄性动物有两只丙氨基转移酶(ALT)明显升高(分别为183和138U/L)，其它血液生化学指标与空白对照组比较，差异无显著性意义(P＞0.05)。

停药后4周(即首次给药后49天)，高剂量组有一只雄性动物的丙氨酸氨基转移酶(ALT)较高(210U/L)，高剂量雌性和低剂量雄性的天门冬氨酸氨基转移酶(AST)升高，与空白对照组比较，差异有显著性意义(P＜0.05)。

病理学检查：末次给药后24小时(即首次给药后21天)及停药后4周(即首次给药后49天)，各组动物的主要器官均末见明显病理性改变，但颈背部有硬结的动物解剖见皮下有黄豆大小的黄色硬结。

脏器重量及脏器系数：末次给药后24小时(即首次给药后21天)，中低剂量组雄性动物的肝脏重量和脏器系数增大，与空白对照组比较，差异有显著性意义(P＜0.05)；给药各组动物脾脏的脏器重量和脏器系数增大，其中高剂量的脏器重量、低剂量的雌与雄的脏器重量和脏器系数与空白对照组比较，差异有显著性意义(P＜0.05)。给药组其他的脏器重量及脏器重量及脏器系数与空白对照组比较，差异无显著性意义(P＞0.05)。

停药后4周(即首次给药后49天)，给药各组的主要脏器重量及脏器系数与空白对照组比较，差异无显著性意义(P＞0.05)。

组织学检查：未次给药后24小时(即首次给药后21天)组织学检查，心脏在给药组与空白对照组均出现轻微出血，且无明显差异。高剂量组肝脏以肝细胞轻到中度颗粒变性和空泡变性为主，偶见轻微小灶性坏死，空白对照组病变以肝细胞颗粒变性为主，但程度稍轻。高剂量组肾脏可见间质出血，偶见炎性细胞浸润和肾小管管型，肾小球病变均不明显，空白对照组与给药组病变类似。高剂量组和空白对照组多数以肺泡毛细胞血管充血、出血及轻度的间质性肺炎为主，且程度相似。高剂量组和空白对照组脾白髓均可见滤泡轻度增生。高剂量组多数可见肠道粘膜下层淋巴细胞浸润。中低剂量组肝脏以轻度到中度的颗粒变性为主，侧有间质的炎性细胞浸润。肾脏可见间质出血，偶有炎性细胞浸润，肾小管和肾小球病变不明显。综上所述，高剂量组除引起注射部位轻微炎性反应外，未发现与药物毒性相关的其它特征性病变。中、低剂量组也未见与药物毒性相关的其它特征性病变。

停药后4周(即首次给药后49天)组织学检查，心脏在高剂量与空白对照组均出现轻度出血和炎性细胞浸润，且无明显差异。高剂量组肝脏以轻度到中度的颗粒变性为主，未见明显炎性反应和坏死，空白对照组病变也以轻度的颗粒变性为主，但程度较轻。高剂量组和空白对照组多数以肺泡毛细胞血管充血、出血和轻度的间质性肺为主，且程度相似。高剂量组和对照组脾白髓可见滤泡轻度增生。高剂量组注射部位偶见轻度水肿和炎性细胞浸润。中低剂量组肝脏以轻度的颗粒变性为主，偶有间质的炎性细胞浸润。肾脏可见间质出血，肾小管和肾小球病变不明显。综上所述，高剂量组仅引起轻微的肝细胞颗粒变性和肾间质的出血外，未发现与药物毒性相关的其它特征性病变。中、低剂量组也未见与药物毒性相关的其它特征性病变。

综上所述，在本试验条件下：

给药组第三周起有个别动物颈背部皮下(注射部位)有硬结，临床长期使用时应引起注意。给药组动物可对受试疫苗产生免疫应答反应，血清中可检到对应的抗体，部分动物可检测到IgG2a；停药后4周，抗HBs仍存，IgG2a水平升高，阳性率升高。剂量达6μg/只(约相当于300μg/kg，单次剂量给为单次人临床拟用量的300倍，以体表面积计，约为单次人临床拟用理的24倍)，可对动物的肝功能有一定的影响。未见明显的迟发性毒性反应。

本品多次给予小鼠(连续21次)的最大无毒作用剂量为3μg/只(约相当于150μg/kg，单次剂量约为单次人临床拟用量的150倍；以体表面积计，约为单次人临床拟用量的12倍)。

2.4猴长毒实验结果

一般观察：试验期间，各组动物外观、行为活动未见异常，未见死亡；在给药第15天，高、低剂量组各有一只动物的大腿内侧皮肤出现红斑，持续3天后消退；给药组的动物体重及体温变化不大，与空白对照组比较，差异无显著性意义(P＞0.05)。

抗体检测结果

抗体和补体：试验前、给药3周、恢复期结束，各给药组猴血清的IgM、IgG、IgA、C3水平与空白对照组比较，差异无显著性意义(P＞0.05)

抗HBs：给药后2、3周，各给药组猴血清中均可检测出高水平的抗HBs，与空白对照组比较，差异有非常显著性意义(P＜0.01)；给药食蟹猴的抗HBs阳性率，与空白对照组比较，差异有非常显著性意义(P＜0.01)。停药后4周，给药食蟹猴血清中可检测出较高水平的抗HBs阳性率，与空白对照组比较，差异有非常显著性意义(P＜0.01)。

心电图检测：给药前、给药3周及停药后4周，各组动物心电图均为窦性心律，各项指标均在正常范围内；各给药组动物的各项心电图指标与空白对照组比较，差异无显著性意义(P＞0.05)。

血液学检查：给药3周，给药组动物的白细胞计数升高，与空白对照组比较，差异有显著性意义(P＜0.05)；高、中剂量组的血小板升高，与空白对照组比较，差异有显著性意义(P＜0.05)；其它血液学指标与空白对照组比较，差异无显著性意义(P＞0.05)。停药后4周，给药组动物的血液学指标与空白对照组比较，差异无显著性意义(P＞0.05)。

血液生化学检查：给药3周，高剂量组动物的ALT、AST、BUN、LDH升高，ALB下降，与空白对照组比较，差异有显著性意义(P＜0.05)；中剂量的TP下降，与空白对照组比较，差异有显著性意义(P＜0.05)，但没有明显的剂量反应关系；其中血液生化指标与空白对照组比较，差异无显著意义(P＞0.05)。停药后4周，给药组动物的血液生化学指标与空白对照组比较，差异无显著性意义(P＞0.05)。

尿常规检查：给药前、药期3周及恢复期4周，各组动物尿常规的各项指标均在正常范围内，给药组与空白对照组比较，差异无显著性意义(P＞0.05)；尿蛋白、亚硝酸盐、红细胞、白细胞等指标各组动物均出现个别的阳性，无剂量反应关系，且空白对照组也有类似的情况，故实际意义不大。

病理学检查：系统解剖：给药后3周及停药后4周，各组动物的主要器官均未见明显病理性改变。

脏器重量及脏器系数：给药后3周及停药后4周，各给药组动物的脏器重量及脏器系数与空白对照组比较，差异无显著性意义(P＞0.05)。

组织学检查：给药后3周，心脏在给药组与空白对照组均出现轻度出血和炎性细胞浸润，且无明显差异。高剂量组肝脏以肝细胞轻到中度颗粒变性为主，偶见轻微炎性细胞浸润和点状坏死；中低剂量组也以轻度的颗粒性为主，坏死和血管的变化不明显；空白对照组病变以轻度的肝细胞颗粒变性为主，但程度稍轻，其余病变不明显。高剂量组肾脏主要表现为间质出血，偶见肾小管变性和管型，肾小球的病变不明显；中低剂量组与此类似，但程度较轻；空白对照组以间质的出血性炎症为主，其它病变不明显。给药组肺部多数以不同程度的间质性肺炎为主，其它病变少见；空白对照组与此类似，但程度较低。给药组和空白对照组脾白髓均可见局部滤泡轻度增生。给药组胃肠道常见淋巴细胞等炎性细胞浸润性增生，且随剂量降低而减轻；空白对照组胃肠道的炎性反应较轻。此外，高剂量组注射部位可见轻度水肿和炎性细胞浸润，中低剂量组也有类似变化。综上所述，高剂量组除引起轻度的肝细胞变性、肾小管的轻微变性、肠道有炎性细胞增生性变化以及引起注射部位轻微炎性反应外，未发现与药物毒性相关的其它特征性病变。

停药后4周，心脏在给药组与空白对照组均出现轻度出血和炎性细胞浸润，且无明显差异。给药组(高、中、低剂量组)肝脏以肝细胞轻到中度颗粒变性为主，坏死和血管的变化不明显；空白对照组病变以轻度有肝细胞颗粒变性为主，但程度稍轻，其余病变不明显。高剂量组肾脏主要表现为间质出血，偶见肾小管变性和管型，肾小球的病变不明显；中低剂量组与此类似，但程度较轻；空白对照组以间质的出血性炎症为主，其它病变不明显。给药组肺部多数以不同程度的间质性肺炎为主，其它病变少见；空白对照组与此类似，但程度较轻。给药组和空白对照组脾白髓均可见局部滤泡轻度增生。高剂量组胃肠道常见淋巴细胞等炎性细胞浸润性增生，中、低剂量组反应轻微；空白对照组胃肠道的炎性反应不明显。综上所述，高剂量组除引起轻度的肝细胞变性、肠道的炎性细胞增生性变化，未发现与药物毒性相关的其它特征性病变。

3.讨论

在小鼠长毒实验中给药组第三周起有个别动物颈背部皮下(注射部位)有硬结，临床长期使用时应引起注意。给药组动物可对受试疫苗产生免疫应答反应，血清中可检到对应的抗体，部分动物可检测到IgG2a；停药后4周，抗HBs仍存，IgG2a水平升高，阳性率升高。剂量达6μg/只(约相当于300μg/kg，单次剂量给为单次人临床拟用量的300倍，以体表面积计，约为单次人临床拟用量的24倍)，可对动物的肝功能有一定的影响。未见明显的迟发性毒性反应。本品多次给予小鼠(连续21次)的最大无毒作用剂量为3μg/只(约相当于150μg/kg，单次剂量约为单次人临床拟用量的150倍；以体表面积计，约为单次人临床拟用量的12倍。

在食蟹猴长毒实验中，给药组动物可对受试疫苗产生免疫应答反应，高、低剂量组各有一动物出现皮肤红斑，血清中可检到对应的抗体，血白细胞计数升高。剂量过42μg/kg(约为人临床拟用剂量的42倍)；以体面积计，约为单次人临床拟用量的17倍)经皮下注射给予食蟹猴(每天一次，连续3周)，对肝、肾功能指标有一定的影响，停药后可恢复。提示临床试验进行监测病人的肝、肾功能。未见明显的迟发性毒性反应。本品对食蟹猴的最大无毒作用剂量为21μg/kg(约为人临床拟用量的21倍；以体面积计，约为单次人临床拟用量的8倍)。

总之，本实验结果提示本发明乙型肝炎疫苗在拟定的临床方案中是安全的。

实施例2

本实施例涉及乙型肝炎疫苗(HBsAg)对小鼠细胞免疫应答的影响

1.1.材料：

重组(酵母)乙型肝炎疫苗[Recombinant Hepatitis B Vaccine(yeast)，以下均简称RHBV]，每支1ml，主要含重组(酵母)HBsAg亚单位60μg，溶剂均用铝稀释剂0.5mg/ml(深圳康泰生物制品股份有限公司产品)。实验动物用6～8周龄的SPF级别Balb/c小鼠，雌雄各半，体重16～18g(购自华中科技大学同济医院实验动物部)。主要试剂和仪器有RPMI-1640培养基(Sigma公司)，小牛血清(四季青生物公司)，氚-胸腺嘧啶核苷(³H-TdR，北京原子能研究所)，IL-2，IFN-γ检测试剂盒(深圳晶美生物工程公司)，乙型肝炎表面抗体检测试剂盒(上海实业科华生物技术公司)，HRP标记羊抗鼠(Serotec公司)，特异性HBsAg-T细胞表位短肽(赛百盛生物工程公司)，P815细胞(中科院上海细胞所)，乳酸脱氢酶检测试剂盒(Sigma公司)，液体闪烁仪(Beckman公司)，全自动酶标仪550型(Bio-RAD公司)。

2.2.方法：

(1)分组和给药方法：设RHBV单次免疫和加强免疫(在单次免疫后4周时进行)两组，均采用右下肢肌肉注射给药。于单次免疫后4周和加强免疫后2周分别观察RHBV对鼠T淋巴细胞增殖，IL-2、IFN-γ及抗HBs IgG2a产生的影响。并观察加强免疫后对CTL活化的影响。每大组均随机分为以下四组，每组鼠数见各表。

空白对照组：注射同量生理盐水

RHBV低剂量组：注射RHBV 30/μg/kg(0.5μg/只)/次

RHBV中剂量组：注射RHBV 90/μg/kg(1.5μg/只)/次

RHBV高剂量组：注射RHBV 270/μg/kg(4.5μg/只)/次

(2)检测方法：

①无菌取小鼠脾脏，置1640培养基中制备细胞悬液，2000r/min离心30min后弃上清，加0.75％NH₄Cl 2ml，3min时加1640培养基至10ml，1500r/min离心5min，弃上清，加10％小牛血清1640培养基1ml，调整细胞终浓度5×10⁶/ml，加入培养板200ul/孔。实验孔加终浓度为5μg/ml的无铝佐剂的HBsAg疫苗(17μl/孔)，对照孔加等量生理盐水，一式三复孔此后分二份操作。一份置37℃、5％CO₂培养56h，每孔加³H-TdR 20μl，继续同法培养16h后用细胞收集仪将细胞收集于玻璃纤维滤纸上，滤纸片干燥后置测量瓶中，加入2ml闪烁液，用液闪仪测定每分钟脉冲数(cpm)。以每分钟脉冲数代表淋巴细胞增殖程度。②另一份，37℃、5％CO₂培养48h，收集上清200μl/管，冻存于-20℃冰箱待测。检测严格按IL-2、IFN-γ检测试剂盒使用说明书操作，用酶标仪读取各孔OD值，在标准曲线上核算出IL-2和IFN-γ浓度值。以上两项实验统计学用SPSS10.0分析软件进行方差齐性检验，因方差不齐均用秩和检验。③抗HBs IgG2a检测时，先将小鼠待测血清加入96孔培养板，50μl/孔(空白孔不加)，37℃30min后洗板5次，每孔加入1∶4000HRP标记的羊抗鼠IgG2a，37℃30min时，再洗板5次后加显色剂，用酶标仪读各孔OD值。以空白对照作为阴性对照，样品OD值/阴性对照OD平均值≥2.1判为阳性，阴性对照OD值＜0.05按0.05计算，高于0.05按实际OD值计算，统计学采用X²检验。④CTL功能检测采用乳酸脱氢酶(LDH)分析法^[3]：取小鼠脾淋巴细胞，用含5μg/ml特异性短肽的1640培养基培养，第二天加IL-21000U/ml、ConA5μg/ml。至淋巴细胞成簇生长，有多个核淋巴细胞时，收集、计数、调整细胞数至10⁶/ml，作为CTL反应的效应细胞。胰酶消化对数生长期的P815细胞，用含10μg/ml短肽的1640培养液悬浮P815细胞，培养过夜。加丝裂霉素至25μg/ml，温育45min，用1640培养基洗涤4次后观察。若细胞成活率在95％以上，调整细胞数至10⁴/ml，作为CTL反应的靶细胞。按效应细胞：靶细胞1000∶1比例，加入96细胞培养板，并补加1640培养基至100μl，同时设靶细胞的最大释放孔：以10％Triton X-100代替效应细胞；自然释放孔：以1640代替效应细胞；培养基本底：只含100μl培养基；校正本底：含100μl培养基及10％的Triton X-100。每个样本作3个重复孔。4h后观察靶细胞，若最大释放孔靶细胞未完全破坏，再加TritonX-100至20％，待靶细胞完全破坏，200g离心2min，吸出上清，与LDH反应液反应20min后，加入终止液，在酶标仪492波长上读取每孔OD值，检出特异性CTL活化过程中LDH释放量。按下式计算特异CTL释放率：

自然释放：自然释放-培养基的本底

最大释放：最大释放-校正本底

自然释放率：自然释放/最大释放

最大释放率：最大释放/培养基的本底

校正的最大：最大释放/校正本底

特异CTL释放率：(试验-自然释放-培养基的本底)/(最大释放-自然释放)。

计算特异CTL释放率，＞60％者为有特异性CTL活化

统计学处理：特异性CTL活化鼠数量组间差别用Fisher’s确切概率法检验。

结果分析：

1.1不同剂量RHBV对小鼠T淋巴细胞增殖的影响：见表1

表1不同剂量RHBV对小鼠T淋巴细胞增殖影响(X±S)

与空白对照组比：^**P＜0.01

结果提示：RHBV中、高剂量免疫小鼠后，T淋巴细胞³H-TdR掺入量比对照组显著增高(P均＜0.01)；加强免疫后增高更明显，且低剂量组也有显著增高(P＜0.01)。

2.2不同剂量RHBV诱生小鼠H-2、IFN-γ的比较：见表2

表2不同剂量RHBV诱生小鼠IL-2、IFN-γ的比较(X±S)

与空白对照组比：^*P＜0.05  ^**P＜0.01

结果提示：中、高剂量RHBV单次免疫后四周，T淋巴细胞产生IL-2和IFN-γ显著增多(P均＜0.05)。加强免疫后，两者增高更显著(P均＜0.01)，且低剂量组IL-2、IFN-γ浓度增高也有显著意义(P均＜0.05)。

3.3.不同剂量RHBV对小鼠抗HBs IgG2a产生的影响：见表3

表3不同剂量RHBV对小鼠抗HBs IgG2a产生的影响(X±S)

^*与低剂量组比：P＜0.01  △与单次免疫比：P＜0.05

结果提示：RHBV单次免疫后4周，可诱导小鼠产生与细胞免疫有关的抗HBs亚类IgG2a，中剂量与高剂量组阳转率显著高于低剂量组(P＜0.01)，加强免疫后，低剂量组阳转率明显高于单次免疫(P＜0.05)。

4.4.不同剂量RHBV对小鼠特异性CTL活化的影响：见表4

表4不同剂量RHBV免疫6周时对小鼠CTL活化的影响(％)

^**与空白对照组比P＜0.01，高剂量组用药4周时，死亡1只鼠，原因不明。

结果提示：HBIR免疫小鼠达到一定剂量时，可使部分鼠特异性CTL释放率＞60％，达到特异性CTL活化。

实施例3

本实施例涉及乙型肝炎疫苗(HBsAg)对HBV基因小鼠HBV标志的影响

1.材料和方法

1.1 HBsAg疫苗：深圳康泰生物制品股份有限公司提供，批号：T010702，每支1ml，含重组(酵母)HBsAg亚单位60μg，溶剂均用铝稀释剂(0.5mg/ml)，批号：A010621。

1.2实验动物：HBV转基因小鼠：SPF级，合格证为粤检证字：2002A001号，雌雄各半，体重16～18克。本中心自行构建，饲养繁殖.

1.3主要检测试剂HBsAg EIA检测试剂盒：上海实业科华生物技术有限公司，HBsAg固相快速法定量药盒：中国原子能研究院同位素研究所，HBsAg免疫组化试剂：Dako公司，美国公司HBV DNA荧光定量PCR试剂盒：美国AmgGen公司

1.4小鼠分组及给药方法：

选HBsAg阳性HBV转基因小鼠30只，分为两组，铝稀释剂对照组15只，HBsAg疫苗组15只，剂量为300μg/Kg，用铝稀释剂稀释至200μl，每周皮下注射1次，12周改为每2周注射1次，24周后又改为每4周注射1次，注射前采血，注射后每4周采血1次，分离血清，置-20℃保存检测定量HBsAg和HBV DNA含量。36周时各处死8只，取肝组织，用常规免疫组化法，检测肝组织HBsAg表达。

1.5统计学处理：球型检验，广义线性模型重复测量数据方差分析

2.结果

表5用药前后两组小鼠血清中HBsAg含量比较(X±S，ng/ml)

球型检验：P＜0.01，表明时间与用药有交互作用

多元方差分析：(1)时间效应：P＜0.01，表明用药前后有不同；

              (2)时间×分组II III

表5与图1结果提示：用药前两组小鼠血清中HBsAg含量无明显差别，有可比性。接种HBsAg疫苗后HBV转基因小鼠血清中HBsAg含量虽在3个月时降低不明显，但6个月时明显降低，9个月时显著降低；而铝稀释剂未使HBV转基因鼠血清中HBsAg含量降低。

2.2肝组织HBsAg免疫组化检测结果表明：用药9个月时HBsAg疫苗组肝组织HBsAg表达量少于对照组。

2.3血清中HBV DNA检测结果

表6用药前后对照组与HBsAg疫苗组血清中HBV DNA含量比较

组别	用药前10<sup>4</sup>以上	用药后降低10<sup>2</sup>
			HBsAg疫苗组	7	3
对照组	6	0

结果提示HBsAg疫苗可降低HBV转基因小鼠中HBV DNA的复制和表达。

实施例4

本实施例涉及HBsAg疫苗对HBV转基因小鼠细胞免疫调节的影响

1.材料

1.1实验药品：基因重组(酵母)乙肝疫苗(含HBsAg，60μg/ml/支；含铝0.5mg/ml/支，批号：T010702)。铝稀释剂含铝0.5mg/ml/支(批号：A010621)。

1.2实验动物：HBV转基因小鼠由本中心自行构建、饲养、繁殖。

1.3主要试剂：³H-TdR(1mci/ml)购自中国原子能研究所；PPO，POPOP购自广州医药公司；小鼠IL-2、IFNγ检测的ELISA试剂盒购自Med Systems DiagnosisGmbH.Vienna。

2.方法

2.1不同免疫次数的实验动物分组及免疫方案

取8周龄雌性HBV转基因小鼠32只，随机分为两组，每组16只，对照组每只注射铝稀释剂200μl，乙肝疫苗组每只注射用铝稀释剂稀释的HBsAg 200μl(含HBsAg 6μg)。一周后每组各处死8只，检测细胞因子及T细胞增殖，余下的动物每周同法注射一次，12周后改为2周一次，24周后改为4周一次，8个月后处死作同法检测。

2.2不同免疫剂量的实验动物分组及按常规免疫

取130只HBV转基因小鼠随机分为两大组，每组65只。第一大组又随机分为5组：盐水组，铝稀释剂组，乙肝疫苗低剂量组(0.6μg/只)，中剂量组(1.8μg/只)，高剂量组(5.4μg/只)。初次免疫后9周处死小鼠进行细胞因子诱生实验。第二大组分组及免疫剂量同上，只是免疫方案改为经初次免疫4周后，加强免疫一次，同样于初次免疫后9周处死小鼠进行细胞因子诱生实验。

2.3细胞因子诱生实验

取受检小鼠脱颈椎处死，取脾，按常规制备浓度为5×10⁶/ml的细胞悬液，分别加入24孔培养板(1ml/孔)，加不含铝佐剂HBsAg疫苗刺激(5μg/ml)，37℃、5％CO₂培养48h后，收集培养上清置于-20℃待检。

2.4T淋巴细胞增殖实验

取5×10⁶/ml脾淋巴细胞，加入U型96孔培养板(200ul/孔)，实验孔加不含铝佐剂的HBsAg疫苗(5μg/ml)，对照孔加等量生理盐水，同一实验为一式三分复管，置37℃、5％CO₂培养56h后，每孔加³H-TdR 20μl，继续同法培养16h后，用细胞收集仪将细胞取集于玻璃纤维滤纸上，滤纸片充分干燥后置测量瓶中，加入2ml闪烁液，用液闪仪测定每分钟脉冲数(cpm)。

3.结果

3.1HBV转基因小鼠经不同免疫次数后Th1类细胞因子水平的比较

表7.两组小鼠经免疫1周及8个月后诱生细胞因子的水平对比(pg/ml)

注：^**P＜0.01

表7结果说明，免疫一周时疫苗组与铝佐剂组所诱生的Th1类细胞因子(IL-2、IFNγ)的水平有增高的趋势，但无显著性。而免疫8个月后疫苗组的IL-2、IFNγ的水平较铝佐剂组有显著增加，分别是铝佐剂组的2.8倍和6.8倍，与一周时所诱生的IL-2、IFNγ水平相比也同样有显著性升高，分别是2倍和17倍。而免疫8个月后铝佐剂组的IL-2的水平较一周时无显著性变化，但IFNγ的水平提高了近5倍。

3.2不同免疫次数HBV转基因小鼠T细胞增殖水平的比较

表8、免疫1周及8个月HBV转基因小鼠T细胞增殖水平的结果

注：^*P＜0.05

表8结果表明免疫8个月后，乙肝疫苗组的T细胞增殖显著高于铝剂组，同样显著高于免疫1周时的疫苗组。但一周时两组T细胞增殖无显著性差别。可见T细胞增殖的结果与细胞因子的检测结果是一致的。

3.3不同剂量的乙肝疫苗按计划免疫诱生IL-2的水平比较

表9不同剂量的乙肝疫苗计划免疫诱生IL-2的水平比较

组别	单次免疫	加强免疫
			盐水组	76.9±55.8	154.4±89.1
铝佐剂组	58.2±88.6	175.1±100.4
			低剂量组	100.3±82.3	220.0±111.7
中剂量组	195.9±278.0	229.8±218.4
			高剂量组	297.4±296.0	302.0±283.4

表9结果说明按常规免疫后无论单次免疫还是加强免疫，各剂量组之间及其与铝佐剂和盐水组的IL-2的水平都无显著差别。说明单次免疫后9周及9周内免疫两次不足以显著激发免疫耐受小鼠的细胞免疫应答。

实施例5

本实施例涉及含有治疗性乙型肝炎疫苗的组合物对CHB的抗病毒治疗的研究

一、病例选择

病例来源均为中国人民解放军第四五八医院肝炎专科门诊和部份住院病人，观察时间自2000年10月～2002年10月。诊断符合2000年9月第十次全国病毒性肝炎会议修订的诊断标准。观察CHB病例分为免疫耐受期、免疫清除期、残余整合期(2)。根据三种不同免疫应答状态制定不同治疗方案，观察病例按2∶1比例，随机分为治疗组和对照组。

本组分期标准：

免疫耐受期：ALT基本正常，高复制水平HBeAg和HBV DNA。

免疫清除期：ALT反复异常，即在正常值1倍以上、10倍以下、中等或低复制水平的HBeAg和HBV DNA。

残余整合期：ALT恢复正常，HBsAg仍阳性，但无HBeAg及HBV DNA复制。

观察病例基本情况见表9

表9两组病人的基本情况

组别	分期	例数	病程(年)	性别	ALT	HBeAg	HBV DNA
											(中位数)	男：女	正常值上限倍数	(S/N)	(Log拷贝)
治疗组	免疫耐受期	42	2.86	32/10	-	248±78	8.9±1.8
									免疫清除期	34	3.05	26/8	1.5±1.8	238±64	6.8±1.9
	残余整合期	12	4.16	10/2	-	-	-
								对照组	免疫耐受期	21	2.94	16/5	-	254±75	8.8±1.9
	免疫清除期	17	3.14	14/3	1.6±1.7	224±58	6.9±1.7

二、药物

1.重组(酵母)乙型肝炎疫苗：系由重组酵母表达的乙型肝炎表面抗原(HBsAg)经纯化、加佐剂吸附后制成，每安瓿1.0ml，HBsAg含量10μg，深圳康泰生物制品股份有限公司生产提供。

2.佰安注射液。系含I、II、IV型菌毛的绿脓杆菌经杀灭后制成，浓度为每毫升含菌18亿±10％混悬液水针剂。每安瓿1ml。海南微克西药业有限公司生产提供。

3.胸腺肽注射液：免疫调节药，每安瓿2ml含20mg，肌注或静脉点滴。广东宏远集团药业有限公司生产提供。

4.拉米呋啶：葛兰素-史克公司生产提供。

三、治疗分组和方法

1.治疗组免疫疗法联合拉米呋啶。特异性免疫疗法采用乙肝疫苗，而非特异性免疫治疗分别用胸腺肽、佰安注射液。

具体方案：

(1)免疫耐受期：先进行免疫疗法3～6个月，继而应用拉米呋啶抗病毒治疗6～12个月。

免疫疗法所用特异免疫制剂为乙肝疫苗40～80μg，肌注，每月一次×12月。非特异性制剂为胸腺肽40mg，肌注，每周二次×6个月或胸腺肽120mg加入10％葡萄糖液250ml，静滴，每周3～5次×3个月。其后3个月改为胸腺肽40mg肌注。佰安注射液，2ml，皮下注射，每周1～2次×3～6个月。

(2)免疫清除期：免疫疗法联合拉米呋啶同时应用。方法同免疫耐受期。

(3)残余整合期：单用特异性免疫疗法-乙型肝炎疫苗，每月一次×12个月。

2.对照组免疫耐受期及免疫清除期均单用拉米呋啶，疗程同治疗组。残留整合期未设对照组。

四、实验检查及判断

血清ALT按赖氏法。

HBsAg及HBeAg定量分析：采用全自动快速微粒子酶免分析系统1MX检测HBsAg、HBeAg滴度。仪器及试验盒均为美国雅培公司产品，实际可检测滴度范围为0.5～800.0S/N，滴度＞2.1为阳性。

HBV DNA定量检测：使用AG-9600荧光DNA分析检测仪，采用美国Biotronics公司生产的荧光标记法HBV DNA定量试剂盒进行定量聚合酶链反应(PCR)检测。实际检测HBV DNA含量范围在10⁴至10¹¹拷贝/ml之间。

结果

一、免疫清除期治疗效果

治疗组34例，其中应用乙肝疫苗6～19月，平均12.7月，拉米呋啶6～15个月，平均10.6月，胸腺肽3～8个月，平均5.2月。

1.对ALT影响

表10两组治疗对ALT影响

组别	例数	治前水平	治疗后	治疗期间
							(正常值上限倍数)	复常例数(％)	反跳例数(％)
治疗组	34	1.5±1.8	30(88.2)	2/30(6.7)
					对照组	17	1.6±1.7	13(76.5)	3/13(23.1)

2.对HBeAg影响

表11两组治疗对HBeAg影响

组别	例数	HBeAg阴转例数(％)	HBeAg/抗HBe血清转换例数(％)	HBeAg滴度下降1/3以上例数(％)
					治疗组	34	15(44.1)<sup>*</sup>	11(32.4)<sup>*</sup>	10(29.4)
对照组	17	2(11.8)	1(5.9)	3(17.6)

^*P＜0.05

3.对HBV DNA影响

表12两组治疗对HBV DNA影响

组别	例数	HBV DNA阴转例数(％)	HBV DNA滴度下降例数(％)
				治疗组	34	28(82.5)	3(8.8)
对照组	17	12(70.6)	2(11.8)

4.对HBsAg影响：治疗组和对照组于治疗前后均未发现HBsAg阴转病例。

二、免疫耐受期治疗效果

治疗组观察42例，其中应用乙肝疫苗42例(6～19个月，平均13.0月)；胸腺肽40例(3～12个月，平均7个月)，佰安30例(4～8个月，平均6.3月)，拉米呋啶42例(6～15个月，平均11.0月)。

1.对ATL影响

治疗组42例，在治疗过程中出现短暂ALT升高10例(23.8％)，约持续4～6周后恢复正常，对照组未出现此现象。

2.对HBcAg影响

表13两组治疗对HBeAg影响

组别	例数	HBeAg阴转例数(％)	HBeAg/抗HBe血清转换例数(％)	HBeAg滴度下降1/3以上例数(％)
					治疗组	42	11(26.2)<sup>*</sup>	8(19.1)	9(21.4)
对照组	21	1(4.8)	0(0)	3(14.3)

^*P＜0.05

3.对HBV DNA影响

表14两组治疗对HBV DNA影响

组别	例数	HBV DNA阴转例数(％)	HBV DNA滴度下降例数(％)
				治疗组	42	23(54.8)<sup>*</sup>	11(26.2)
对照组	21	6(28.6)	9(42.9)

^*P＜0.05

4.对HBsAg影响

治疗组与对照组于治疗前后均未发现HBsAg阴转病例。

三、残留整合期治疗效果

本组12例患者，应用乙型肝炎疫苗60&micro；g，肌注，每月一次共连续12个月，未采用其它抗病毒药或免疫调节剂，治疗期间每隔3个月检测HBsAg滴度，于治疗9～12个月后，HBsAg滴度较治疗前下降1/3以上者5例，但未见阴转病例，其余7例未见变化。

讨论：

对慢性乙肝免疫耐受期的42例患者应用免疫疗法3～6个月后，再进行拉米呋啶抗病毒治疗(平均13个月)，HBeAg阴转率、HBeAg/抗HBe血清转换率和HBV DNA阴转率分别为26.2％、19.1％和54.8％，较单用拉米呋啶对照组HBeAg阴转率4.8％，血清转换率为0％和HBV DNA阴转率28.6％有明显提高，P＜0.05，提示免疫疗法对免疫耐受期病人提高免疫应答率有一定作用。

治疗前ALT水平＜2倍及＞2倍以上病例各为17例。ALT＜2倍者HBeAg阴转率为29.4％(5/17)，ALT＞2倍以上者为82.4％(14/17)。两组比较差异非常显著，P＜0.01。提示治疗前ALT升高病例确与免疫应答率明显相关。对免疫清除期治疗组与对照组比较，治疗组HBeAg阴转率明显高于对照，P＜0.05。提示免疫疗法有助于提高临床疗效。

实施例6

本实施例涉及治疗性乙型肝炎的疫苗制剂的剂量研究。

一、动物实验结果

根据实施例2的研究结果，不同剂量的乙肝疫苗在小鼠体内诱导的细胞免疫效果，无论是T淋巴细胞增殖实验、诱生小鼠IL-2、IFN，还是小鼠抗HBsAg IgG2a的影响，中剂量组(1.5ug/只)与高剂量组(4.5ug/只)都比对照组和低剂量组有显著性增高，而两者之间无显著性差异。另外，根据小鼠长期毒性实验结果，反复给药后最大无毒剂量为3ug/只，因此，太高的剂量不仅没有能明显地提高细胞免疫功能，反而会带来毒副作用。在小鼠实验中1.5ug/只的剂量是合适的。

二、治疗性乙肝疫苗治疗慢性乙型肝炎临床研究

(一)病例选择：

1.诊断标准：参照2000年9月，西安中华医学会传染病与寄生虫病学分会、肝病学分会联合修订的《病毒性肝炎防治方案》标准。

1)病原学诊断标准：临床符合慢性肝炎，血清HBsAg阳性，或兼并有一种以上HBV感染标志阳性(HBeAg，抗HBe，抗HBc，HBV-DNA)。

2)临床诊断：病史超过半年，目前仍有肝炎症状、体征及肝功能异常者，诊断为慢性肝炎。发病日期不明或虽无肝炎病史，但影像学、腹腔镜或肝活体组织病理检查符合慢性肝炎改变或根据症状、体征、化验综合分析亦可做出相应判断。

2.症状、体征分级：

脘腹胀满：0分：无

          1分：偶有腹胀，程度轻

          2分：经常腹胀，尚可忍受，可自行缓解

          3分：持续腹胀，难以忍受，难以自行缓解

倦怠乏力：0分：无

          1分：稍倦，不耐劳力

          2分：倦怠较甚，可坚持轻体力劳动

          3分：四肢无力，勉强支持日常活动

胁肋疼痛：0分：无

          1分：偶尔痛，程度轻

          2分：经常痛，疼痛尚能忍受

          3分：时常痛，疼痛难以忍受

纳差：    0分：无

          1分：较正常，食量略有减少

          2分：较正常，食量减少近二分之一

          3分：较正常，食量减少二分之一以上

恶心：    0分：无

          1分：偶有，症状较轻

          2分：经常恶心，尚可忍受

          3分：频频恶心，难以忍受

3.入选病例标准

1)符合慢性乙型肝炎的诊断标准。

2)HBsAg、HBeAg、HBV-DNA持续阳性6个月以上。

3)SALT升高超过正常值2.0倍(即赖氏120单位)，最高值6.0倍(赖氏240单位)以内。

4)年龄在20-50岁之间。

5)男、女不限。

6)自愿参加临床试验，已签署知情同意书者。

4.排除病例标准

1)不符合上述诊断标准者。

2)年龄在20岁以下或50岁以上。

3)妊娠或哺乳期妇女。

4)已知对本药组成成分过敏者。

5)合并心血管、肺、肾及造血系统等原发性疾病、精神障碍患者。

(二)试验方法：

1、分组方法：

治疗组病例数为每个剂量100例，对照组病例数为100例，可为住院病人和门诊病人，按受试者的就诊顺序发给相应药物编码的药。

药品来源：

治疗组药物：

名称：治疗性乙肝疫苗

来源：深圳康泰生物制品股份有限公司

规格：60μg/支，40μg/支，80μg/支。

对照组药物：

名称：治疗性乙肝疫苗安慰剂(注射用生理盐水)

来源：深圳康泰生物制品股份有限公司

规格：1ml/支

用药方法：

治疗组药物：治疗性乙肝疫苗

用法：肌肉注射(前臂三角肌)

用药剂量：每次60μg，第1、2次注射为每隔2周1次，从第3次开始为每4周1次，连续5次，总剂量为注射7次。

对照组药物：治疗性乙肝疫苗安慰剂(注射用生理盐水)

用法：肌肉注射(前臂三角肌)

用药剂量：每次60μg，第1、2次注射为每隔2周1次，从第3次开始为每4周1次，连续5次，总剂量为注射7次。

5.疗程：24周为一疗程，停药后两组均随访6个月

6.观察项目及观察指标：

(1)、安全性观测

①、一般体格检查。

②、血、尿、便常规化验。

③、心电图。

④、肾功能检查(BUN、Cr)。

(2)、疗效性观测

①、临床症状：脘腹胀满，倦怠乏力，胁肋疼痛，纳呆，恶心。

②、体征：肝脾触诊

③、血清胆红素测定、ALT、AST、总蛋白(TP)、A/G检测；

④、血清病原学检测：HBsAg，抗-HBs，HBeAg，抗HBe，抗-HBc，抗-HBc-IgM(以上用ELISA)。测定HBV-DNA(荧光PCR法)。

注：测定HBV-DNA需留1.5ml的血清。

(3)、观察指标及时间点

①、症状、体征：初诊，用药后每个月各观察记录1次，随访3、6个月各记录1次，共记录9次。

②、一般理化检查及安全性检查治疗前、用药3个月、以及用药6个月后、各做1次，共3次。

③、肝功能治疗于治疗前、用药3个月、以及用药6个月后、随访3个月、6个月各做1次，共5次。

④、血清病原学检查于治疗前、用药3个月、以及用药6个月后、随访3个月、6个月各做1次，各做1次，共5次。

(三)疗效标准：

本药物疗效判断均分显效、有效、无效三项。

1.病毒学应答

显效：HBV DNA(荧光PCR)于治疗后阴转者。

有效：未达显效标准，但定量下降大于2个对数级者。

无效：未达到上述标准者，停药后出现反跳者，另统计反跳率。

2.血清免疫学应答

显效：HBeAg于治疗后阴转者。

有效：未达到显效标准，但HBeAg定量下降，较治疗前下降50％以上者。

无效：未达到上述标准者。

3.综合评价标准

显效：

(1)自觉症状消失。

(2)肝脾肿大缩小或稳定不变者，其它慢肝体征减轻或稳定不变。

(3)肝功能检查ALT恢复正常。

(4)乙型肝炎病人乙肝病毒复制标记物转阴。

(5)一般健康状况好转，能胜任原职工作。

上述指标稳定6个月者。

有效：

(1)自觉症状好转或消失。

(2)肝脾肿大及其它慢肝体征稳定不变。

(3)肝功能检查，ALT恢复正常。

(4)乙型肝炎病人血清乙肝病毒复制标记物转阴。

上述指标稳定6个月者。

无效：未达到上述标准者。

(四)结果

40ug治疗组中显效为4例，有效为6例，总有效率为10％。60ug治疗组中显效为10例，有效为15例，总有效率为25％。80ug治疗组中显效为11例，有效为15例，总有效率为26％。对照组中显效为1例，有效为2例，总有效率为3％。从以上结果来看，治疗组与对照组比较有显著性差异，而且高、中剂量组与低剂量比较同样有显著性差异，但高、中剂量组比较无显著性差异。综合以上动物实验的结果，临床选择60ug/剖是切实可行的，而且是最佳的。

实施例7

选用表达乙型肝炎表面抗原(HBsAg)的酵母工程，菌种采用常规方法，经培养、发酵后采集得细胞悬液；

然后从细胞中提取抗原，并将抗原进行细胞破碎、匀浆，经孔径为0.45μm的过滤器过滤后，再经超滤并浓缩，加入硅胶溶液，保温3小时，3600rpm离心25分钟，将硅胶沉淀经磷酸溶液洗涤3次，用硼酸钠溶液洗脱，超滤并离心后得澄清抗原；

澄清抗原经丁基琼脂糖疏水层析柱上吸附和解析，得纯III型抗原；

纯III型抗原经稀释、除菌过滤得60μg/ml无菌抗原；将无菌抗原合并液加入1∶40福尔马林至终浓度为100μg/ml，加热至36℃，保温24小时，再冷却到4℃，得到灭活抗原；按0.085ml/g的灭活抗原的比例加0.21M硫酸钾铝溶液，用1N氢氧化钠调PH值为7.2，搅拌2小时，得到汞前PH抗原；然后沉降24小时，弃去上清液，再用生理盐水清洗3次后，将清洗液加生理盐水至灭活吸附前的体积，最后加硫柳汞防腐剂进行搅拌得60μg/ml疫苗原液，即为成品；其中重组(酵母)乙肝疫苗(HBsAg)：60μg/ml，含铝0.5mg/ml。

实施例8

选用表达乙型肝炎表面抗原(HBsAg)的酵母工程，菌种采用常规方法，经培养、发酵后采集得细胞悬液；

然后从细胞中提取抗原，并将抗原进行细胞破碎、匀浆，经孔径为0.45μm的过滤器过滤后，再经超滤并浓缩，加入硅胶溶液，保温2.5小时，3000rpm离心30分钟，将硅胶沉淀经磷酸溶液洗涤2次，用硼酸钠溶液洗脱，超滤并离心后得澄清抗原；

除菌抗原经丁基琼脂糖疏水层析柱上吸附和解析，得纯III型抗原；

纯III型抗原经稀释、除菌过滤得40μg/ml无菌抗原；将无菌抗原合并液加入1∶40福尔马林至终浓度为100μg/ml，加热至36℃，保温76小时，再冷却到6℃，得到灭活抗原；按0.085ml/g的灭活抗原的比例加0.22M硫酸钾铝溶液，用1N氢氧化钠调PH值为7.0，搅拌3小时，得到汞前PII抗原；然后沉降20小时，弃去上清液，再用生理盐水清洗3次后，将清洗液加生理盐水至灭活吸附前的体积，最后加硫柳汞防腐剂进行搅拌得40μg/ml疫苗原液，即得成品，其中重组(酵母)乙肝疫苗(HBsAg)：40μg/ml，含铝0.5mg/ml。

实施例9

选用表达乙型肝炎表面抗原(HBsAg)的酵母工程，菌种采用常规方法，经培养、发酵后采集得细胞悬液；

然后从细胞中提取抗原，并将抗原进行细胞破碎、匀浆，经孔径为0.45μm的过滤器过滤后，再经超滤并浓缩，加入硅胶溶液，保温2小时，3600rpm离心20分钟，将硅胶沉淀经磷酸溶液洗涤3次，用硼酸钠溶液洗脱，超滤并离心后得澄清抗原；

澄清抗原经丁基琼脂糖疏水层析柱上吸附和解析，得纯III型抗原；

纯III型抗原经稀释、除菌过滤得80μg/ml无菌抗原；将无菌抗原合并液加入1∶40福尔马林至终浓度为100μg/ml，加热至38℃，保温82小时，再冷却到2℃，得到灭活抗原；按0.085ml/g的灭活抗原的比例加0.2M硫酸钾铝溶液，用1N氢氧化钠调PH值为7.2，搅拌3小时，得到汞前PH抗原；然后沉降18小时，弃去上清液，再用生理盐水清洗3次后，将清洗液加生理盐水至灭活吸附前的体积，最后加硫柳汞防腐剂进行搅拌得80μg/ml疫苗原液，即得成品，集中重组(酵母)乙肝疫苗(HBsAg)：80μg/ml，含铝0.5mg/ml。

尽管对本发明已作了详细的说明并引证了一些具体实例，但对本领域技术人员来说，只要不离开本发明的精神和范围可作各种变化或修正是显然的。

Claims (9)

1.一种治疗性乙型肝炎的疫苗制剂在制备治疗慢性乙型肝炎及HBV携带者药剂中的应用，其中所述的治疗性乙型肝炎的疫苗制剂由下列成分组成：

重组酵母乙肝疫苗：40～80μg/ml，

含铝0.5mg/m1，

其余成分为生理盐水。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述的治疗性乙型肝炎的疫苗制剂由下列成分组成：

重组酵母乙肝疫苗：60～80μg/ml，含铝0.5mg/ml，其余成分为生理盐水。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于所述的治疗性乙型肝炎的疫苗制剂由下列成分组成：

重组酵母乙肝疫苗：60μg/ml，含铝0.5mg/ml，其余成分为生理盐水。

4.一种制备权利要求1所述应用的治疗性乙型肝炎疫苗制剂的方法，其特征在于包括以下步骤：

a)选用表达乙型肝炎表面抗原的酵母工程菌，菌种经培养、发酵后采集得细胞悬液；

b)然后再从细胞中提取抗原，并将抗原进行初步纯化得澄清抗原；

c)澄清抗原经疏水层析纯化，得纯抗原；

d)纯抗原经稀释、除菌过滤得无菌抗原，将无菌抗原合并液经灭活吸附，得疫苗原液，即得成品。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于步骤b)所述的初步纯化包括细胞破碎、过滤、通过硅胶处理去除亲脂性杂质，所述的过滤为微孔过滤和超滤。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于步骤c)所述的疏水层析纯化是将抗原在疏水层析柱上吸附和解析。

7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于步骤d)所述的灭活吸附为先经福尔马林处理再经氢氧化铝原位吸附，即加入1∶40福尔马林至终浓度为100μg/ml，加热至34～38℃，保温24～96小时，再冷却到2～8℃，得到灭活抗原；按0.085ml/g的灭活抗原的比例加0.2～0.3M硫酸钾铝溶液，用1N氢氧化钠调PH值为7.0～7.2，搅拌2～3小时，得到汞前PH抗原；然后沉降18～24小时，弃去上清液，再用生理盐水清洗3次后，将清洗液加生理盐水至灭活吸附前的体积，最后加防腐剂进行搅拌得疫苗原液，所述的防腐剂为硫柳汞。

8.根据权利要求1-3任何一项所述的应用，其特征在于所述的治疗性乙型肝炎的疫苗制剂与抗病毒药物联合用药。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于所述的抗病毒药物为拉米呋啶和/或干扰素-α，所述的拉米呋啶的量为90×30～110×30mg，所述的干扰素-α的量为3×12万单位～5×12万单位，所述治疗性乙型肝炎的疫苗制剂的量为40～80μg。