CN1090324A - 乙型肝炎重组体表面抗原的制备方法及以其为基的抗原和疫苗 - Google Patents
乙型肝炎重组体表面抗原的制备方法及以其为基的抗原和疫苗 Download PDFInfo
- Publication number
- CN1090324A CN1090324A CN93101738A CN93101738A CN1090324A CN 1090324 A CN1090324 A CN 1090324A CN 93101738 A CN93101738 A CN 93101738A CN 93101738 A CN93101738 A CN 93101738A CN 1090324 A CN1090324 A CN 1090324A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- antigen
- substratum
- inorganic phosphorus
- liters
- hepatitis
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 239000000427 antigen Substances 0.000 title claims abstract description 66
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 title claims abstract description 59
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 title claims abstract description 59
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 title claims abstract description 25
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 title claims abstract description 20
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title abstract description 12
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 68
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 claims abstract description 67
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 claims abstract description 67
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims abstract description 30
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims abstract description 30
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 claims abstract description 29
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 claims abstract description 29
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 claims abstract description 28
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 claims abstract description 28
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 claims abstract description 28
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims abstract description 25
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims abstract description 15
- 230000003570 biosynthesizing effect Effects 0.000 claims abstract description 15
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims abstract description 9
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 claims abstract description 6
- 230000035479 physiological effects, processes and functions Effects 0.000 claims abstract description 3
- 239000012752 auxiliary agent Substances 0.000 claims abstract 2
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 36
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 claims description 17
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 3
- 241000235070 Saccharomyces Species 0.000 claims 1
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 abstract description 23
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 abstract 1
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 28
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 27
- 235000002639 sodium chloride Nutrition 0.000 description 24
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 23
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 21
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 18
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 18
- 239000011573 trace mineral Substances 0.000 description 18
- 235000013619 trace mineral Nutrition 0.000 description 18
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 18
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 18
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 18
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 18
- 150000003722 vitamin derivatives Chemical class 0.000 description 18
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 14
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 12
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 9
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 8
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 8
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 8
- PVNIIMVLHYAWGP-UHFFFAOYSA-N Niacin Chemical compound OC(=O)C1=CC=CN=C1 PVNIIMVLHYAWGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 6
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 6
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 6
- 235000019156 vitamin B Nutrition 0.000 description 6
- 239000011720 vitamin B Substances 0.000 description 6
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 238000005352 clarification Methods 0.000 description 4
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 3
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 description 3
- SQUHHTBVTRBESD-UHFFFAOYSA-N Hexa-Ac-myo-Inositol Natural products CC(=O)OC1C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C1OC(C)=O SQUHHTBVTRBESD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229930003756 Vitamin B7 Natural products 0.000 description 3
- FAPWYRCQGJNNSJ-UBKPKTQASA-L calcium D-pantothenic acid Chemical compound [Ca+2].OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC([O-])=O.OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC([O-])=O FAPWYRCQGJNNSJ-UBKPKTQASA-L 0.000 description 3
- 229960002079 calcium pantothenate Drugs 0.000 description 3
- 229960000367 inositol Drugs 0.000 description 3
- CDAISMWEOUEBRE-GPIVLXJGSA-N inositol Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O CDAISMWEOUEBRE-GPIVLXJGSA-N 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 3
- 229960003512 nicotinic acid Drugs 0.000 description 3
- 235000001968 nicotinic acid Nutrition 0.000 description 3
- 239000011664 nicotinic acid Substances 0.000 description 3
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 3
- CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N scyllo-inosotol Natural products OC1C(O)C(O)C(O)C(O)C1O CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 3
- 239000002002 slurry Substances 0.000 description 3
- MYVIATVLJGTBFV-UHFFFAOYSA-M thiamine(1+) chloride Chemical compound [Cl-].CC1=C(CCO)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N MYVIATVLJGTBFV-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 239000011735 vitamin B7 Substances 0.000 description 3
- 235000011912 vitamin B7 Nutrition 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000005903 acid hydrolysis reaction Methods 0.000 description 2
- 229940024546 aluminum hydroxide gel Drugs 0.000 description 2
- SMYKVLBUSSNXMV-UHFFFAOYSA-K aluminum;trihydroxide;hydrate Chemical compound O.[OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] SMYKVLBUSSNXMV-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 2
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 2
- 230000004087 circulation Effects 0.000 description 2
- 238000013016 damping Methods 0.000 description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 2
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 2
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 238000001471 micro-filtration Methods 0.000 description 2
- 238000012856 packing Methods 0.000 description 2
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 2
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 2
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 239000001117 sulphuric acid Substances 0.000 description 2
- 235000011149 sulphuric acid Nutrition 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-M Bisulfite Chemical compound OS([O-])=O LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 208000017667 Chronic Disease Diseases 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- FEWJPZIEWOKRBE-JCYAYHJZSA-N Dextrotartaric acid Chemical compound OC(=O)[C@H](O)[C@@H](O)C(O)=O FEWJPZIEWOKRBE-JCYAYHJZSA-N 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- YCKRFDGAMUMZLT-UHFFFAOYSA-N Fluorine atom Chemical compound [F] YCKRFDGAMUMZLT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010019799 Hepatitis viral Diseases 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010008038 Synthetic Vaccines Proteins 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 238000005377 adsorption chromatography Methods 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000011737 fluorine Substances 0.000 description 1
- 229910052731 fluorine Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 1
- ZCYVEMRRCGMTRW-YPZZEJLDSA-N iodine-125 Chemical compound [125I] ZCYVEMRRCGMTRW-YPZZEJLDSA-N 0.000 description 1
- 229940044173 iodine-125 Drugs 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 230000007483 microbial process Effects 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 238000003825 pressing Methods 0.000 description 1
- 238000012797 qualification Methods 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 1
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000005477 standard model Effects 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 229940095064 tartrate Drugs 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 201000001862 viral hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
- A61K39/29—Hepatitis virus
- A61K39/292—Serum hepatitis virus, hepatitis B virus, e.g. Australia antigen
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/576—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for hepatitis
- G01N33/5761—Hepatitis B
- G01N33/5764—Hepatitis B surface antigen
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2730/00—Reverse transcribing DNA viruses
- C12N2730/00011—Details
- C12N2730/10011—Hepadnaviridae
- C12N2730/10111—Orthohepadnavirus, e.g. hepatitis B virus
- C12N2730/10122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2730/00—Reverse transcribing DNA viruses
- C12N2730/00011—Details
- C12N2730/10011—Hepadnaviridae
- C12N2730/10111—Orthohepadnavirus, e.g. hepatitis B virus
- C12N2730/10134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Virology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Mycology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Public Health (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Steroid Compounds (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
通过将菌株——抗原生产菌,如啤酒酵母菌
ДAH-041/pBИК-1,在培养基中培养并生物合成,
该培养基含有胨和酵母提取物,并保持无机磷含量,
在培养时的培养基中无机磷的含量为40—
200mg/l,而在生物合成时为5—50mg/l,接着破坏
酵母细胞并分出抗原,制备乙型肝炎重组体表面抗
原。在生物合成阶段,规定补充加入新鲜的培养基,
它含有重量比相当于0.05—0.15∶0.05—0.15—1.0
的胨、酵母提取物和葡萄糖。以重组体表面抗原为基
的抗乙型肝炎的疫苗,该疫苗还含有助剂、防腐剂和
生理上容许的稀释剂。
Description
本发明涉及用于预防病毒性乙型肝炎的药物免疫生物学制剂,即涉及含有乙型肝炎病毒抗原的制剂。更具体地说,本发明涉及乙型肝炎重组体表面抗原(HBsAg)以及在其基础上的疫苗。
本发明也涉及用微生物方法制备这种抗原,特别是,涉及用于培养表达重组体抗原的重组体酵母的培养基。在一个实施方案中,本发明也涉及提供该培养基的方法。
由于所述疾病的普遍性和这种传染性慢性病的高发病率,使有效地制备抗乙型肝炎疫苗成为迫切问题。
这方面的主要任务是制备乙型肝炎表面抗原,这是此种疫苗的基础(有效成分)。就目前技术水平而言,这种疫苗中还可含有辅剂(如氢氧化铝凝胶),防腐剂及生理上能采用的稀释剂(如磷酸盐缓冲液或生理溶液)。
已知的抗乙型肝炎疫苗是基于由供血者血的血清中的HBs-抗原(参阅如Tabor等人,J.Med Virol,PP 65-74)。在该制备方法中,在2~3阶段失活下,表面抗原的产率约为10%。这些疫苗必须仔细检查并适当的纯化以除去可能含有的乙型肝炎病毒的信息粒子和其他病毒,如存在于血清中的逆转录病毒。
进而制得疫苗,这些疫苗用微生物合成HBs-抗原细胞转化的重组体DNA的方法制备,在DNA组分中包括基因HBsAg。已知使用大肠杆菌(E.coli)细菌系、哺乳动物细胞和酵母细胞作为宿主细胞。如Valenzuela P等人(Nature,1982,vol,298,pp 347-350)的文章中所述,使用转化的酵母细胞啤酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)以合成HBsAg。
从Wampler D.等人(PANS,1985,vol82,P6830)的文章已知,由菌株-啤酒酵母菌的酵母生产菌制备HBs-抗原的方法,包括在菌株-具有高含量磷的培养基中的生产菌培养时,将细胞转入低磷含量的培养基中以再繁殖HBs-抗原,然后在有流水转子的离心机上洗出细胞。然后将没有培养基的细胞浆料用磷酸缓冲液稀释至开始的体积,并借助高压均化器破坏细胞。所得最终产品的产率为29%。
在1985年3月27日公开的,分类号A61K39/29的专利文件EP0135435中描述了通过将啤酒酵母菌菌株ATCC 20665 H52的细胞在含有酵母提取物葡萄糖的YEHD培养基中培养的方法制备疫苗,菌株酵母-HBsAg生产菌的培养是使用同一YEHD培养基分二步进行,并且在第一和第二阶段中,在发酵罐中补充添加同一YEHD培养基,在第一阶段中以60ml/小时的速率,在第二阶段中以2~4.8升/小时的速率供给。在发酵结束时得到3.1Kg的湿润生物量,在该生物量破坏后,从一升发酵罐中分离出50μg HBsAg。
在PCT/US86/01702(87年2月26日国际公开号WO87/01129)申请中,描述了于25℃,在保持平衡的游离氨基酸浓度为20~160g/l的培养基中培养能生产HBsAg的酵母的方法。该培养基也含有6g/l浓度的葡萄糖、盐和维生素。在培养时、补充加入400g/l葡萄糖浓度的培养基。在消耗1630g葡萄糖时产生生物量为177g。
由SU,A,1389060,分类号为A61K39/29的发明证书中已知还有一种制备乙型肝炎重组体疫苗的方法,该方法包括在合成HBs-抗原阶段中在不含磷酸盐的培养基中培养菌种-酵母生产菌并使用多孔硅胶上的吸附色谱法,用PH9.1~9.5的碳酸氢盐缓冲液洗脱,接着在50%酒石酸K(Na)-25%甘油在组成比1∶1时的密度梯度下用离心法分离抗原。在该方法中所制备产品的分离复杂性保证了其纯度,但是,在发酵和破坏酵母细胞的步骤后,乙型肝炎表面抗原产率在一升发酵罐中为200~300μg抗原。该方法对实验室使用是有意义的。
因而,由现有技术看显然的是,在制备乙型肝炎抗原中所需发明创造性的问题是发明这些方法的参数和培养基的组成,它们可以保证工业规模制备足够纯净的抗原,但现在通常工程设计出的方法还没有找到这些参数。
本发明的目的是创立使用不同种类培养基原料,以足以工业规模生产的简单而可靠的制备乙型肝炎重组体表面抗原的方法。
本发明的目的还有使用不同种类培养基原料以制备乙型肝炎重组体抗原,该抗原在通常的均质化、澄清、过滤和纯化后用于制备疫苗。
本发明的另一个目的是制备以重组体表面抗原为基的抗乙型肝炎的疫苗。
用制备乙型肝炎重组体表面抗原的方法达到了上述和其他目的,在该方法中,包括在含有胨和酵母提取物的培养基中培养酵母生产菌HBs-抗原菌株和合成HBs-抗原,接着破坏酵母细胞并分离抗原,在该情况下,在培养阶段以及在生物合成阶段的培养基中,要保持含有严格确定浓度的无机磷。
已发现,在培养菌株阶段,无机磷的浓度范围保持在40~200mg/l,在生物合成阶段,保持在5~50mg/l,这样可以得到最佳产率的抗原而不取决于原料种类。同时,在培养生物量阶段以及抗原的生物合成阶段,所使用的培养基中含有无机磷超出本发明所示的范围时,则抗原产率迅速下降,甚至在某些情况下导致合成的停止。
在优选的方案中,在生物合成阶段,可适当地补充加入新鲜的含有胨、酵母提取物和葡萄糖培养基。
在抗原的合成步骤中补充加入的含有胨、酵母提取物和葡萄糖的培养基的量,特别是在最佳重量比分别为0.05~0.15∶0.05~0.15∶1.0时,可提高酵母的生物量积累,同时也提高抗原的产率。
在培养时,可使用任何已知的含有携带促使生产免疫基因HBsAg的基因HBsAg的重组体质粒的酵母菌株。例如,可以使用菌株啤酒酵母菌DBY746/pNMVG-46Грановски
等人,МолекулярнаяГенетика Микробиологин и Вирусология,1986,No,8,12~19页),或菌株啤酒酵母菌ДАН-041/рВМК-1,该菌株已在全苏工业微生物保藏处(ВКИИ)登记,收藏号为遗传和选种的Y1875ВНИИ,该保藏处具有相应于为专利程序目的的国际承认微生物保藏的布达佩斯条件的国际保藏组织资格(Russian Federdtion Research Institute for Genetics andIndustrial Microorganism Breeding(VNIIG),RU,113545,Moscow,Dorozhnayavul.,8),或菌株啤酒酵母菌IRDBP11/pCGA7,它以No.y-1232寄存在VNIIG处。
按照本发明方法制备的乙型肝炎重组体表面抗原,可用于制备乙型肝炎重组体酵母的疫苗,也可用于建立诊断程序。
实施例1
将含有无机磷40~42mg/l和以下组成(重量%)的9~10升消毒培养基装入工作体积为10升的生物反应器中:
有0.5~0.6mg/g 3.0
无机磷起始含量由酪蛋白酸水解物得到的胨
有0.5~0.6mg/g 1.0
无机磷起始含量的酵母提取
物
葡萄糖 2.0
盐:
KCl 0.100
NaCl 0.010
无水CaCl20.020
MgSO4·7H2O 0.102
(NH4)2SO40.500
微量元素溶液 0.50ml/l
含有(mg%)
Kl 20.0
H3BO32.0
MnSO42.0
MoO4(NH4)22.0
FeSO410.0
蒸馏水 加到100ml
微生素溶液 1.0ml/l
含有(mg%)
氯化硫胺素 20.00
维生素B620.00
维生素B2(单核苷酸) 20.00
泛酸钙 20.00
烟酸 20.00
正氨基苯甲酸 20.00
生物素 0.20
肌醇 1000.0
蒸馏水 加到100ml
蒸馏水 余量
在PH5.0~5.5时,将1.01 S.c.DBY 746/pNMVG-46的酵母培养物加入该培养基中,该培养物细胞滴定为每立方厘米培养液中4.1×107,它是在以下基本组成培养基中(重量%)培养的:
KH2PO40.100
NaCl 0.010
无水CaCl20.020
MgSO4·7H2O 0.102
(NH4)2SO40.500
葡萄糖 2.00
微量元素溶液 0.50ml/l,
含有(mg%):
Kl 20.0
H3BO32.0
MnSO42.0
MoO4(NH4)22.0
FeSO410.0
蒸馏水 加到100ml
维生素溶液 1.00ml/l,
含有(mg%):
氯化硫胺素 20.00
维生素B620.00
维生素B2(单核苷酸) 20.0
泛酸钙 20.00
烟酸 20.00
正氨基苯甲酸 20.00
生物素 0.20
肌醇 1000.0
蒸馏水 加到100ml
蒸馏水 余量
在29+1℃下培养20小时后得到在每立方厘米培养液体中有2.0×108细胞的细胞滴定度的积累培养物。
将10升该培养物转入工作容积为100升的生物反应器中,该反应器中装有含5.0~6.0mg/l无机磷的消毒培养基,其组成(重量%)为:
有0.5~0.6mg/g无 1.5
机磷起始含量的由酪蛋白酸
水解物得到的胨
有2.0~2.5mg/g无机磷起始 0.1
含量的酵母提取物
葡萄糖 2.0
盐:
KCl 0.100
NaCl 0.010
无水CaCl20.020
MgSO4·7H2O 0.102
(NH4)2SO40.500
微量元素溶液 0.50ml/l
含有(mg%)
Kl 20.0
H3BO32.0
MnSO42.0
FeSO410.0
蒸馏水 加到100ml/l
维生素溶液 1.00ml/l
含有(mg%)
氯化硫胺素 20.00
维生素B620.00
维生素B2(单核苷酸) 20.0
泛酸钙 20.00
烟酸 20.00
正氨基苯甲酸 20.00
生物素 0.20
肌醇 1000.0
蒸馏水 加到100ml
在PH5.5~6.0时于温度30℃下进行培养22小时。
在Westfalia型流水离心机中以500l/小时流速得到的培养液每立方厘米中含有1.4×108细胞。细胞浆料用PH9.0,0.05M的碳酸盐缓冲液,通过使用孔径为0.2~0.45微米的膜滤器的微量过滤方法洗涤或用同一组成的缓冲液洗脱三次以除去培养基,然后在Westfalia型流水离心机上以500l/小时分出生物量。
将所得的1.2Kg生物量悬浮在10升碳酸盐缓冲液中,缓冲液组成为:
Na2CO3-NaHCO30.05M
NaCl 0.15M
EDTA、 10mM
苯甲基磺酰氟 0.2mM
吐温-20 0.3%(重量)
其次,用Gaulin APV型均质化器在600~700大气压下进行破坏生物量的细胞三个循环。得到15升相应的均化物,测定其中抗原含量。
抗原滴定度是20μg/ml澄清均化物。抗原的产量是一升培养液体为3.0mg。HBsAg含量通过使用Abbott Auszyme Ⅱ仪器的免疫酶分析方法测定。抗原活性使用HBsAg(OCO42-28-153-88)活性标样作为标堆,按μg/ml测量,该标准样品由A.A.Тарсевича命名的ГИСК制备并按国际标准活性校准过。在聚丙烯酰胺凝胶中于还原条件下,在电泳图中,重组体抗原呈现单体24KD的带状。使用以碘-125标记的商业抗-HBs通过免疫印迹方法表明带的免疫特性。
实施例2
在含有9升消毒培养基的生物反应器中,该培养基含有195~200mg/l的无机磷,其组成为(重量%):
含有4.5~5.0mg/g 2.0
无机磷起始含量的胨
(ДИФКО公司)
含有起始浓度为10~11mg/g无机 1.0
磷的酵母提取物
葡萄糖 2.0
与实施例1相同的盐、微量元素、维生素,在PH5.0~5.5下加入1升啤酒酵母ДАН041/pBMK-1的酵母培养物,将该培养物在与实施例1中同样的基本培养基中培养,并在每立方厘米培养液中有4.4×107细胞滴定度。
在29+1℃下培养24小时,得到每立方厘米培养液中有2.8×108细胞滴定度的积累培养物。
将10升该培养物转入生物反应器,它含90升含有50mg/l无机磷的消毒培养基,其组成(重量%)为:
含有起始浓度为4.5~5.0mg/g 1.0
无机磷的胨(ДИФКО公司)
含有起始浓度为10~11mg/g无机 0.1
磷的酵母提取物(ДИФКО公司)
葡萄糖 2.0
与实施例1相同的盐、微量元素、维生素、在30℃温度下于PH5.5~6.0培养24小时。
将最后所得的在每立方厘米中含有2.0×108细胞的培养液体按实施例1相似的方法进行处理。
全部湿的生物量重1.5Kg,澄清的均化物体积为1.5升,抗原滴定度是22μg/ml澄清的均化物。1升培养液的抗原产量是3.3mg。
实施例3
方法类似于实施例2进行;在生物量的培养阶段中使用含有300mg/l无机磷的培养基。该培养基是由2%(重量)含8.0mg/g无机磷起始浓度的胨和1.0%(重量)含15.0mg/g无机磷起始浓度的酵母提取物所制备的。在抗原的生物合成步骤中,使用含100mg/l无机磷的培养基,该培养基由含有上述起始无机磷含量的1%(重量)胨和0.1(重量)酵母提取物配制成的。得到1.8Kg湿生物量;在该情况下没有抗原的生物合成。
实施例4
在生物反应器中,有9升含有100mg/l无机磷的消毒培养基,其组成(重量%)为:
有2.0~2.5/mg无机磷起始含量 2.0
的酪蛋白硫酸水解物(本国的)
有5.0~6.0mg/g无机磷起始含 1.0
量的酵母提取物(本国的)
葡萄糖 2.0
与实施例1相同的盐、微量元素、维生素,在PH5.0~5.5下加入1.0升S.c IRDBY-11/pCGA7酵母培养物,它在实施例1同样的基本培养基中培养,并在每立方厘米培养液体中有4.3×107细胞的滴定度。
在29+1℃下培养20小时每立方厘米培养液中有2.2×108细胞滴定度的积累培养物。
将10升该培养物转入生物反应器,它装有90升含有25~30mg/l无机磷的消毒培养基,其组成(重量%)为:
有2.0~2.5/mg无机磷起始含量 1.0
的酪蛋白硫酸水解物(本国的)
有5.0~6.0mg/g无机磷起始含 0.1
量的酵母提取物(本国的)
葡萄糖 2.0
如实施例1相同的盐、微量元素、维生素,在PH5.0~5.5时于30℃下培养24小时。
得到的培养液体每立方厘米有2.0×108细胞的滴定度。按类似于实施例1所述进行分离,洗去生物量的残留培养基,破坏生物量细胞并澄清均化物。
全部湿生物量重1.35Kg,得到15升有21mg/ml抗原滴定度的澄清的均化物。1升培养液的抗原产量为3.15mg。
实施例5
在装有9升含40mg/l无机磷的消毒培养基的生物反应器中,该培养基组成(重量%)为:
含有0.05mg/g无机磷起 3.0
始浓度的胨(本国的)
含有4.0~5.0mg/g无 1.0
机磷起始浓度的酵母提取物(本国的)
葡萄糖 2.0
如实施例1的盐、微量元素、维生素,在PH5.0~5.5时加入酵母培养物S.o.DBY 746/pNMVG-46并按实施例1所述进行培养。在培养阶段生物量的细胞滴定度每立方厘米的培养液中是1.8×107细胞。
将10升培养物装入生物反应器,其工作容积100升,装有90升含有4~5mg/l无机磷的消毒培养基,其组成(重量%)为:
含有0.05mg/g无机磷起 3.0
始浓度的胨(本国的)
含有4.0~5.0mg/g 0.1
无机磷起始浓度的酵母
提取物(本国的)
葡萄糖 2.0
如实施例1的盐、微量元素、维生素,于PH5.5~6.0,在30℃下培养24小时。
将每立方厘米有1.4×108细胞滴定度的培养液体按类似实施例1所述进行处理。
得到1.15Kg湿的生物量;15升相应的18μg/ml抗原滴定度的均化物。一升培养液体的抗原产量是2.7mg。
实施例6
在装有9升含有2.0mg/l无机磷消毒培养基中,该培养基的组成(重量%)为:
含有0.05mg/g无机磷起 0.5
始浓度的胨(本国的)
含有2.0~2.5mg/g无 0.1
机磷起始浓度的酵母提取物(本国的)
葡萄糖 2.0
如实施例1的盐、微量元素、维生素,在PH5.0~5.5时,加入酵母培养物S.c.DBY 746/pNMVG-46并按实施例1所述进行培养。在生物量培养阶段的细胞滴定度是每立方厘米培养液中为5.0×107细胞。
将10升培养物转入工作容积为100升的生物反应器,它装有90升含有2.0mg/l无机磷的消毒培养基,其组成(重量%)为:
含有0.05mg/g无机磷起 0.1
始浓度的胨(本国的)
含有2.0~2.5mg/g无 0.1
机磷起始浓度的酵母提取物
葡萄糖 2.0
如实施例1的盐、微量元素、维生素,于PH5.5~6.0在30℃下培养24小时。
将滴定度为每立方厘米中1.0×107细胞的培养液体按类似实施例1所述进行处理。
得到0.110Kg湿生物量和15升抗原滴定度为1.5μg/ml的澄清均化物。1升培养液的抗原产量为0.225mg。
实施例7
在装有9升如实施例1中组成的消毒培养基的工作容积为10升的生物反应器中,在PH5.0~5.5时加入1.0升S.c.DBY 746/pNMVG-46的酵母培养物,其滴定度为每立方厘米培养液中有4.2×108细胞,它是在实施例1同样组成的基本培养基中培养的。
在29+1℃温度下培养20小时后,得到细胞滴定度为每立方厘米培养液体中有2.0×108细胞的积累培养物。
将10升该培养物转入工作容积100升的生物反应器中,该反应器装有起始70升含5.0~6.0mg/l无机磷的消毒培养基,其组成(重量%)为:
有0.5~0.6mg/g无 1.5
机磷起始含量的由酪蛋白酸
水解物得到的胨
有2.0~2.5mg/g无 0.1
机磷起始含量的酵母提取物
葡萄糖 1.0
如实施例1的盐、微量元素、维生素,于PH5.5~6.0,在30℃温度下进行培养40小时。
在培养过程中,自培养6小时开始,补充加入20升含有5.0~6.0mg/l无机磷的消毒培养基,其组成(重量%)为:
含有0.5~0.6mg/g无机 5.0
磷起始浓度的由酪蛋白酸水解物得到的胨
含有2.0~2.5mg/g无机
磷起始浓度的酵母提取物 4.2
葡萄糖 42.0
(即:这些主要成分的比例,接近于0.12∶0.1∶1.0)还有盐:
KCl 0.350
NaCl 0.035
无水CaCl20.070
MgSO4×7H2O 0.350
微量元素溶液(成分如实施例1) 1.75ml/l
维生素溶液(成分如实施例1) 3.5ml/l
如实施例1,在Westfalia型流水离心机上以500升/小时流速得到所制的培养液,它含有每立方厘米6.7×108细胞。用PH9.0的0.05M,碳酸盐缓冲液,通过使用孔径为0.2~0.45μm的膜滤器的微过滤方法洗涤或者用同一组成的缓冲液洗三次以使细胞浆料除去培养基,接着在Westfalia型流水离心机上以500升/小时流速分离出生物量。
所得的5.0Kg生物量悬浮在50升碳酸盐缓冲液中,其组成为:
Na2CO3-NaHCO30.05M
NaCl 0.15M
EDTA 10mM
苯甲基磺酸氟 0.2mM
吐温-20 0.3%(重量)
然后,也与实施例一样,用均化器Gaulin APV型在600~700大气压力下进行破坏生物量的细胞三个循环。用Westfalia型流水离心机在液体流速60升/小时下澄清均化物。得到70升澄清的均化物,测定其中的抗原含量。
抗原滴定度是28μg/ml。一升培养液体的抗原产量为19.5mg。如实施例1测定HBsAg含量和抗原活性。
实施例8
第一步骤的工艺类似于实施例2进行。将所得的10升积累培养物转入生物反应器,该反应器中装有70升与实施例2相同的消毒培养基,但还含有1%(重量)的葡萄糖。在30℃温度下培养48小时,并在培养过程中,从生长10小时开始补充加入18升消毒培养基,其成分(重量%)为:
含有4.5~5.0mg/g无 5.0
机磷起始浓度的胨
含有10~11mg/g无机起 4.2
始浓度的酵母提取物
葡萄糖 42.0
(即其比例相应于0.12∶0.1∶1.0)还有与实施例7相同的盐、微量元素、维生素。
最后所得的培养基液体在每立方厘米中含有8.8×108细胞,将它按类似实施例1所述进行处理。
全部湿的生物量重为6.2Kg,澄清的均化物量为70升,它含有32μg/ml抗原。1升培养液体的抗原产量为22.5mg。
实施例9
方法类似于实施例8进行,在生物量培养阶段使用含有无机磷300mg/l的培养基。培养基由2%(重量)含有8mg/g无机磷的胨和1%(重量)有15.0mg/g无机磷起始含量的酵母提取物组成。在抗原的生物合成阶段使用含有100mg/l无机磷的培养基,该培养基由有上述无机磷含量的1%(重量)胨和0.1%(重量)酵母提取物组成。用于补充加入的培养基由上述胨和酵母提取物,还有葡萄糖制得,其比例为0.20∶0.20∶1.0。得到8.0Kg湿的生物量。没有抗原的生物合成。
实施例10
在生物反应器中装有9升有105~110mg/l无机磷含量的消毒培养基,其组成(重量%)为:
有0.05mg/g无机磷起始含量的胨 3.0
有10~11mg/g无机磷起始含量的 1.0
酵母提取物
葡萄糖 2.0
于PH5.0~5.5下在其中加入1升酵母培养物,如实施例1进行培养,并在每立方厘米培养液中有4.3×107细胞滴定度。在29±1℃下培养20小时。得到的积累培养物在每立方厘米培养液体中有2.3×108细胞滴定度。
将10升培养物转入生物反应器,它装有70升含有10mg/l无机磷的消毒培养基,其组成(重量%)为:
有0.05mg/g无机磷起始含量的胨 1.5
有10~11mg/g无机磷起始含量的 0.1
酵母提取物
葡萄糖 1.0
如实施例1的盐、微量元素、维生素,于PH5.5~6.0,在30℃温度下培养48小时。在培养过程中自生长8小时开始,补充加入20升消毒培养基,其组成(重量%)为:
有0.05mg/g无机磷起始含量的胨 5.0
有10~11mg/g无机磷起始含量的 4.2
酵母提取物
葡萄糖 42.0
还有如实施例7的盐、微量元素和维生素。胨-酵母提取物-葡萄糖之比为0.12∶0.1∶1.0。
制得的培养液体含有每立方厘米中7.8×108细胞,将它按类似于实施例1中所述进行处理。
全部湿的生物量重5.8Kg,澄清的均化物量为70升,它含有30μg/ml抗原。1升培养液的抗原产量为21.0mg。
实施例11
按类似于实施例7中所述条件培养啤酒酵母菌ДAH-041/pBMK-1的积累培养物和生物合成抗原。在发酵罐中生物合成阶段,在培养6小时开始,补充加入22升消毒培养基,其组成(重量%)为有0.5~0.6mg/l无机磷起始含量的由酪蛋白酸水解物得到的胨-2.1;有5.0~5.3mg/l无机磷起始含量的酵母提取物-0.1;葡萄糖42.0(即,其比相应为0.05∶0.05∶1.0),还有如实施例7中的盐、微量元素和维生素。
由离心机得到的培养液体在每立方厘米中有6.3×108细胞。生物量的分离、其洗涤、细胞的破坏及所得均化物的澄清步骤也类似于实施例7。
得到4.7Kg湿的生物量;澄清的均化物的量等于70升,其抗原滴定度为25μg/ml,1升培养物的抗原产量是17.5mg。
实施例12
不同于实施例7的是在生物反应器中合成抗原的步骤中,自生长6小时开始,补充加入20升消毒培养基,其组成(重量%)为:有0.5~0.6mg/l无机磷起始含量的胨-6.90;有2.0~2.5mg/l无机磷起始含量的酵母提取物-6.9;葡萄糖46.0(即相当于比例0.15∶0.15∶1.0);如实施例7,也有盐、微量元素和维生素。
所得培养液体在每立方厘米中有8.0×108细胞的滴定度,按类似于实施例7中所述,将它处理。
全部湿的生物重量5.9Kg,澄清的均化物的量是70升,在澄清均化物中的抗原滴定度是35μg/ml,1升培养液体的抗原产量是24.5mg。
实施例13
按实施例12方法制得的重组体表面抗原,以分类号A61K39/29的发明证书SUA1389060中所述的方法进行纯化。
由纯化的HBsAg制备疫苗,该疫苗在1ml(一种接种用剂量)中含有20μg抗原、0.17~0.25mg氢氧化铝凝胶(换算为Al3+)和最大浓度为0.02%的福尔马林。
将在12~14g重的小鼠系Balb/c上的试验中疫苗的免疫原性换算为ED50是0.3~0.4μg(其中疫苗的ED50剂量引起50%小鼠血清转化的剂量)。
在对志愿者的试验中,表明与已知的相比较具有低的疫苗反应性。
所列出的实施例表明,按本发明方法可以制备乙型肝炎的重组体表面抗原,同时在使用不同来源的原料时均有良好的产量。
在本发明优选实施范围内,本方法在使用不同种类的原料(不同来源的胨和酵母提取物)时,可以提高乙型肝炎重组体表面抗原的产量80倍。
同时,在实施例3、6和9中可看到,在生物量培养阶段和抗原的生物合成阶段中所用的培养基含有超出本发明范围的无机磷则不可能制备满足工业产量的抗原。
本发明方法可用于使用不同种类培养基原料以制备工业量的乙型肝炎重组体抗原的生物工艺学。按本方法制得的抗原可用于制备对乙型肝炎有效和安全的疫苗,以及用于诊断乙型肝炎病毒或对其他抗体的诊断程序。
Claims (6)
1、制备乙型肝炎重组体表面抗原的方法,该方法包括培养酵母菌株-在含有胨和酵母提取物的培养基中抗原和抗原生物合成的生产菌,破坏酵母细胞并分离抗原,其特征在于,酵母培养是在含有40~200mg/l的培养基中进行,而抗原的生物合成是在含有5~5mg/l无机磷的培养基中进行。
2、权利要求1的方法,其特征在于,作为生产乙型肝炎抗原的菌株是使用啤酒酵母(Saccharomyces cerevisice)菌株ДAH-041/pBMK-1,该菌株寄存在VN11G保藏处,寄存号为Y-1875。
3、权利要求1或2的方法,其特征在于,在生物合成过程中进行补充加入新鲜的含有胨、酵母提取物和葡萄糖的培养基。
4、权利要求3的方法,其特征在于,补充加入的新鲜培养基,含有胨、酵母提取物和葡萄糖的重量比为0.05~0.15∶0.05~0.15∶1.0。
5、按权利要求1、2或4制得的乙型肝炎重组体表面抗原。
6、按权利要求1、2或4制得的抗乙型肝炎疫苗,该疫苗还含有助剂、防腐剂和生理上容许的稀释剂。
Priority Applications (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
PCT/RU1992/000258 WO1993012815A1 (en) | 1991-12-27 | 1992-12-25 | Method for obtaining recombinant surface antigen of hepatitis b, antigen and vaccine based on it |
AU32697/93A AU3269793A (en) | 1991-12-27 | 1992-12-25 | Method for obtaining recombinant surface antigen of hepatitis B, antigen and vaccine based on it |
CN93101738A CN1090324A (zh) | 1991-12-27 | 1993-01-20 | 乙型肝炎重组体表面抗原的制备方法及以其为基的抗原和疫苗 |
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
SU5025798/14A RU2045073C1 (ru) | 1991-12-27 | 1991-12-27 | Способ получения рекомбинантного поверхностного антигена гепатита в |
SU5025861/14A RU2045760C1 (ru) | 1991-12-27 | 1991-12-27 | Способ получения рекомбинантного поверхностного антигена гепатита в |
CN93101738A CN1090324A (zh) | 1991-12-27 | 1993-01-20 | 乙型肝炎重组体表面抗原的制备方法及以其为基的抗原和疫苗 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN1090324A true CN1090324A (zh) | 1994-08-03 |
Family
ID=36793879
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN93101738A Pending CN1090324A (zh) | 1991-12-27 | 1993-01-20 | 乙型肝炎重组体表面抗原的制备方法及以其为基的抗原和疫苗 |
Country Status (3)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN1090324A (zh) |
AU (1) | AU3269793A (zh) |
WO (1) | WO1993012815A1 (zh) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN100443117C (zh) * | 2003-05-13 | 2008-12-17 | 深圳康泰生物制品股份有限公司 | 一种治疗性乙型肝炎的疫苗制剂、其制备方法及其用途 |
Family Cites Families (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4769238A (en) * | 1981-08-04 | 1988-09-06 | The Regents Of The University Of California | Synthesis of human virus antigens by yeast |
NZ201705A (en) * | 1981-08-31 | 1986-03-14 | Genentech Inc | Recombinant dna method for production of hepatitis b surface antigen in yeast |
JPS60193925A (ja) * | 1984-03-13 | 1985-10-02 | Chemo Sero Therapeut Res Inst | 凍結乾燥製剤化ワクチン |
FI861417A0 (fi) * | 1985-04-15 | 1986-04-01 | Endotronics Inc | Hepatitis b ytantigen framstaelld med rekombinant-dna-teknik, vaccin, diagnostiskt medel och cellinjer samt foerfaranden foer framstaellning daerav. |
JPH089637B2 (ja) * | 1986-06-18 | 1996-01-31 | 財団法人阪大微生物病研究会 | B型肝炎ウイルス抗原とその製造法 |
FR2608052B1 (fr) * | 1986-12-10 | 1990-04-13 | Pasteur Vaccins | Procede de preparation d'un vaccin contre l'hepatite b et vaccin obtenu |
FR2635532B1 (fr) * | 1988-07-29 | 1992-05-22 | Pasteur Institut | Particules hbsag recombinantes hybrides : caracteristiques morphologiques de l'antigene hbsag contenant 1 sequence immunogene induisant des anticorps neutralisants diriges contre hiv ou susceptible d'etre reconnue par de tels anticorps; sequences nucleotidiques codant pour de telles particules; vaccins les contenant |
GB9007024D0 (en) * | 1990-03-29 | 1990-05-30 | Imperial College | Novel vaccine |
-
1992
- 1992-12-25 AU AU32697/93A patent/AU3269793A/en not_active Abandoned
- 1992-12-25 WO PCT/RU1992/000258 patent/WO1993012815A1/ru active Application Filing
-
1993
- 1993-01-20 CN CN93101738A patent/CN1090324A/zh active Pending
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN100443117C (zh) * | 2003-05-13 | 2008-12-17 | 深圳康泰生物制品股份有限公司 | 一种治疗性乙型肝炎的疫苗制剂、其制备方法及其用途 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
WO1993012815A1 (en) | 1993-07-08 |
AU3269793A (en) | 1993-07-28 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN1193042C (zh) | 用于改进胰岛素和胰岛素类似物的制备方法的c肽 | |
CN1039616A (zh) | 巴斯德毕赤酵母醇氧化酶ii调节区 | |
CN86107885A (zh) | 酵母生产乙型肝炎表面抗原 | |
CN1172003C (zh) | N-乙酰神经氨酸的制造方法 | |
CN1283780C (zh) | 一种无桔霉素红曲霉基因工程菌的构建方法 | |
CN101029082A (zh) | 一种人源化抗egfr单克隆抗体的重组制备方法 | |
CN1990871A (zh) | 重组人纤溶酶原Kringle 5(hk5)生产方法 | |
CN1036036A (zh) | 细胞结合的葡糖基转移酶,一种它的抗体,以及含该抗体作为有效成份的龋齿预防组合物 | |
CN1171992C (zh) | L-脯氨酸4位羟基化酶的制备方法 | |
CN1874787A (zh) | 预防/治疗hbv感染和hbv介导疾病的组合物 | |
CN1066292A (zh) | 名为“路斯绰达克星”的新的化合物,其制备方法及其治疗应用 | |
CN1570115A (zh) | 优化的sars冠状病毒刺突蛋白基因 | |
CN101050463A (zh) | 源于稻瘟病菌的真菌致病性基因mgATG5及其用途 | |
CN1090324A (zh) | 乙型肝炎重组体表面抗原的制备方法及以其为基的抗原和疫苗 | |
CN1082108A (zh) | 微生物菌种w,含该微生物的酶组合物,该微生物的应用及尤其水解角蛋白的方法 | |
CN1211489C (zh) | 一种从细菌菌体内分离提取聚羟基脂肪酸酯的方法 | |
CN1433430A (zh) | 肝炎病毒岗哨病毒ⅰ(svi) | |
CN1772903A (zh) | 新型果聚糖蔗糖酶基因及其用途 | |
CN1260347C (zh) | 一株产乙内酰脲酶系的节杆菌 | |
CN1918297A (zh) | 编码α 1,6-甘露糖基转移酶的新的多形汉逊氏酵母基因和用同一基因有缺陷的多形汉逊氏酵母突变株生产重组糖蛋白的方法 | |
CN1206343C (zh) | 利用丁香假单胞菌制备假单胞霉素 | |
CN1742555A (zh) | 人工杂交灵芝的生产及其应用 | |
CN1250737C (zh) | 含CpG DNA畜禽疫苗佐剂的PCR制备方法 | |
CN1279057C (zh) | 重组的抗cd25单克隆抗体、其编码序列及应用 | |
CN1256431C (zh) | 重组人甲状旁腺激素基因、其表达载体及重组人甲状旁腺激素蛋白的制备方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C01 | Deemed withdrawal of patent application (patent law 1993) | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |