CN1082108A

CN1082108A - 微生物菌种w，含该微生物的酶组合物，该微生物的应用及尤其水解角蛋白的方法

Info

Publication number: CN1082108A
Application number: CN93104416A
Authority: CN
Inventors: G·安特拉尼坎
Original assignee: Degussa GmbH
Current assignee: Evonik Operations GmbH
Priority date: 1992-03-13
Filing date: 1993-03-13
Publication date: 1994-02-16
Also published as: US5569599A; DE4208275A1; JP3547434B2; DE59307554D1; DK0630401T3; ATE159286T1; ES2111741T3; EP0630401A1; JPH07504326A; EP0630401B1; AU3889693A; WO1993018134A1

Abstract

本发明涉及具有解蛋白活性的微生物菌种W，由此得到的酶组合物，该微生物的应用及水解角蛋白的方法，其中该微生物可嗜热生长并可用含角蛋白物质如羽毛作底物，而由该微生物在培养基中放出或位于该微生物上或其中的酶可在几天内将含角蛋白物质如羽毛，毛发或兽角溶解成氨基酸并在50—105℃ 和pH4—12间有活性，且肽如含角蛋白物质可优选在≥70℃下厌氧酶致水解。

Description

本发明涉及一种具有解蛋白性质的新微生物、一种含该微生物的酶组合物，该微物生物的应用，以及尤其水解角蛋白的方法。

众所周知，特异性酶，蛋白酶，能水解蛋白质，产生低聚肽并最终产生氨基酸。这些酶也可由微生物生成，例如由假单胞菌属的细菌、芽孢杆菌或变形杆菌生成。有些酶，即所谓的嗜热性酶，即使在≥70℃的温度下，也呈现O.g.活性，因此使尤其在工业上感兴趣的水解得以实现。这种嗜热性酶的一个来源，例如为嗜热性微生物。对此，BEF9第7/8期第466-470页（1992年）在K.Peek等人所著“用作工业催化剂的嗜热性酶”的论文中作了概述。由Biosci.Biotech.Biochem.，56（10）页1667-9页（1992年）已知另外一种在70℃以上还有一定活性的酶。这种酶除了表现出通常的解蛋白性质之外，还表现出一定的角蛋白酶活性。所以，用这种酶在高达90℃的温度下，即使毛发也会受浸蚀，但这要在PH为11.0时历时1h，尽管这种酶在所述条件下10min后就已丧失一半活性（参见Appl.Microbiol.Biotechnol（1989）30，第120-124）。由于Biosci中图26所述的即使在80℃以上的温度下人类毛发分解，甚至还显示更高度的分解，所以，这种分解必定是由于化学性质的，而不是酶性质的酶的失活。基于70℃时这种所述酶的稳定性急剧下降，这种酶不适于以工业规模，也即在数小时至不多几天之内来分解角蛋白，例如羽毛、兽角或毛发中所存在的角蛋白，这是因为，对完全的酶分解来说，所能分解的角蛋白数量，只不过是不到3h，尤其明确快于1h的分解量。

本发明的目的在于，分离并提供一种新的微生物，该微生物具有解蛋白性质，并且也能在比较短的时间内分解天然产物中的角蛋白。因此，本发明的目的还在于，提供一种含有这种微生物的、能分解角蛋白的酶组合物，并提供一种尤其用来分解角蛋白的方法。

关于微生物，所提出的发明目的通过以编号DSM 7003保藏的微生物菌种W来实现。

该微生物，即菌种W已于1992年3月12日保藏在德意志微生物及细胞培养物保藏有限股份公司（Mascheroder Weg 16，D-3300Braunschweig），并获得登记号DSM 7003。根据其性质，该微生物已命名为费尔维多菌（Fervidobacterium pennavorans）。

该微生物有生存能力，并根据关于国际上承认用于专利程序的微生物保藏的布达佩斯条约予以保藏并予发放。相应的证明材料、声明及表格PCT/RO/134均附于本申请。

该微生物及由其产生的蛋白酶均有良好活性，故而由该微生物得到的酶组合物，对各种蛋白质，尤其对角蛋白或含角蛋白的物质也具有良好的活性外活性。因此，由该微生物分离出来的酶组合物也可以使用。

F.pennavorans是最早知道的嗜热性微生物，它利用羽毛（例如鸡毛）作底物，而且非常好。

不论用这种新微生物，还是用所述酶组合物，都不仅可以处理不溶性结构蛋白，而且也可以处理可溶性蛋白。分解可进行得很完全。可是，在一般情况下，除了产生个别氨基酸之外，在需要的情况下也能产生在工业上进一步利用的短肽序列。同传统的方法相比，生物分解首先具有的优点是，可以不需要用化学及/或物理方法处理蛋白质。使用该新微生物或酶组合物的另一个优点在于，由于这种酶具有热稳定性，故而肽键的水解可以有利地在高温下进行，而且生物过程完全确保不受污染，从而主要也可以不使病原微生物污染。由于在蛋白水解性分解时产生的低聚肽或个别氨基酸是许多微生物的优异底物，所以按本发明可能实施的工艺方法，对于工业上的应用来说，尤为优越。由于温度较高，故而还可获得更好的底物溶解性，而且酶更易对底物发生作用。此外，本发明的酶组合物也还非常稳定，例如对DSD及尿素非常稳定。

除了主要分解含角蛋白的物质以外，这种新微生物或酶组合物也可用来消除含蛋白质的废物，此时若同其它微生物，例如产甲烷细菌一起使用，则会产生另外的优点。如果将所形成的肽或氨基酸进一步转化成甲烷，则可同时节省能量。除此之外，还能生成例如醇或其它酸。

属于本发明的酶组合物，可从含微生物菌种W的培养物中分离掉培养残余物，并在必要时，加以浓缩而得到。同样，也可从含微生物菌种W的培养物中洗去细胞而得到酶组合物。为了获得所述种类的酶组合物，若在胰酶解胨介质中培养微生物菌种W，以产生酶可诱导酶，则为有利。

属于本发明的还有一种酶组合物，它尤其可象上面所述那样获得，而且这种酶组合物可以含有一种或多种酶，并具有蛋白酶活性，同时，

-温度最佳值（PH10时）在70-90℃范围内，尤其在80℃;

-PH最佳值（80℃）在PH7至PH11的范围内，尤其在PH9至PH10的范围内;

-凝胶过滤解蛋白酶或分子量约200，000道尔顿并超过的酶复合物，而且用SDS活性凝胶测定分子量呈现在约200，000及约330，000之间的两个条带;

-在60℃下，0.2mM于PH7的磷酸盐缓冲液的底物和0.3mg/ml酶萃取物，测量距离为1cm时保温17h后，E₁₀₅值（与空白值相比），在N-丁二酰-Phe-pNA、N-丁二酰-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA及Z-Arg-pNA情况下＞0.5，在H-Gly-Glu-pNA情况下，介于0.3和0.5，在乙酰-Ala-pNA情况下介于0.1和0.3，以及在苯甲酰Dl-Arg-pNA、Z-Gly-Pro-pNA、苯甲酰-Lys-pNA、Z-Arg-pNA及乙酰-Tyr-pNA情况下小于0.1;

-下列抑制剂在所述浓度下，大致得下列残余活性：

抑制剂残余活性残余活性

(1mM) (5mM)

无 100% 100%

Pefabloc SC(Ser.) 83% -

PMSF(Ser.) 14% 10%

EDTA(Metallo.) 93% 85%

Iodoacetat(Cyst.) 83% 76%

-热稳定性如下：

-在PH为7和8.5，70℃和80℃时，稳定20h以上，

-在90℃下，6h后残余活性小于10%，

-在PH为10，80℃和90℃时，15min后完全失去活性，

-70℃时，6h后残余活性为40%，20h后完全失去活性。

选择能够代表一种或多种酶的“酶组合物”这种名称，是因为具有解蛋白活性的萃出物分子量很高[用Superdex 200进行凝胶过滤时，约200，000，而用SDS-PAGE（十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺梯度凝胶板电泳）在含0.1%明胶的以酰胺黑染色的凝胶作底物）时，介于200，000和约300，000之间]。这表明有可能存在一种酶复合物，它也许在所述条件下，却不能分离出来，含有相同或不同的亚单位。

原则上，本发明酶组合物及本发明方法可以同其它酶或酶组合物-在稳定性相当的情况下，直接结合使用。此外，也可在先或在后结合使用。借此，可按本发明经分解较大肽，尤其是不溶性肽，而促使例如低聚肽分解成氨基酸。

微生物菌种W及/或所述酶组合物可用来分解蛋白质，尤其也分解角蛋白或那些含有这类蛋白质的物质，特别是羽毛、兽角或毛发。其中尤其有益处的是分解羽毛，因为正是这种分解由于羽毛的特殊结构及其组成，迄今用酶分解还有着一些特别的困难。

由于养鸡场产生10，000t/a以上的羽毛废物，而且羽约有95%（重量）由β-角蛋白组成，所以本发明提供了一种将羽毛用纯化学方法分解成氨基酸的有利选择。

此外，微生物菌种W还可用来分离编码角蛋白酶的基因及/或用来插入另一种微生物中编码角蛋白酶的基因。在这种情况下，关系到相似Winnaker E.L.，基回与克隆：基因技术导论，VCH，Weinheim，1985;Manitis，Fritsch，Sambrock：分子克隆，实验手册，Cold Spring Harbour Lab.New York，1989.的按经验实施或可实施例的方法，其中将源自微生物菌种W、编码角蛋白酶的基因嵌入埃希氏大肠杆菌或芽孢杆菌，然后培育埃希氏大肠杆菌，以获取角蛋白酶。角蛋白酶可根据其温度稳定性，再经加热而容易地从这种埃希氏大肠杆菌或芽孢杆菌中分离出来。由于微生物菌种W作为厌氧微生物只能很慢地培育，所以按本发明在易于培养的埃希氏大肠杆菌或芽孢杆菌中的嵌入，使培育能更快，酶产率更高。

属于本发明的一种以一种酶或多种酶于50℃以上的温度下将肽，尤其是角蛋白或含角蛋白的物质如羽毛、毛发或兽角水解成低聚肽及/或氨基酸的方法，这样来实施，即在介乎50℃与105℃的温度下进行水解，同时将PH调节在4或＜11之间，而且通过选择所添加的酶数量，尤其是通过选择温度和PH值，以顾及可能伴随化学分解的酶性分解。此时，特别有利的是，PH最高为10.5。PH越高，化学分解的部分也越多，同时外消旋氨基酸或含外消旋氨基酸的低聚肽的量也增多。

此外，按本发明可实施一种将肽，尤其是角蛋白或含角蛋白的物质如羽毛、毛发或兽角用一种或多种酶在≥70℃的温度下，水解成低聚肽及/或氨基酸的方法，其中酶性分解为厌氧性的。特别有利的是，将厌氧性分解转变成前面首先提及的工艺方法。原则上，厌氧性工艺方法可在介于4和12之间的PH时进行，其中又以PH低于11，尤其至10.5为佳。用厌氧性分解法，可制得特别纯净的氨基酸，特别是诸如胱氨酸及半胱氨酸之类含硫氨基酸，不致被氧化。

有利的还有第三种将肽，尤其是将角蛋白或含角蛋白物质如羽毛、毛发或兽角用一种或多种酶水解成低聚肽及/或氨基酸的工艺方案，其中使用一种嗜温微生物，该嗜温微生物如上所述易于得到，并含有一个在≥70℃时编码活性蛋白酶，尤其编码角蛋白酶的基因，并且使该嗜温性微生物在≥70℃时，在含水培养基中与蛋白质，尤其与角蛋白或含角蛋白的物质反应，或者将含有所述基因的嗜温性微生物，在含水培养基中加热到≥70℃，并在必要时，分离掉沉淀下来的成分如部分嗜温性微生物之后，掺入蛋白质，尤其是角蛋白或含角蛋白的物质。编码蛋白酶，尤其角蛋白酶的基因，特别是一种如上所述，插入嗜温性微生物的基因。这种工艺方法特别适用于在工业上水解肽，尤其是水解羽毛。

该工艺方法允许实际上不产生杂质的操作，其中所制得的氨基酸及/或低聚肽比较纯净，或者可以简单地例如用过滤法同可能有的杂质如部分微生物分离开来。

按照本发明，有利的是另一种用一种或多种酶在＞50℃的温度下，将尤其不溶性蛋白质如角蛋白或含解蛋白的物质，例如羽毛、毛发或兽角水解成低聚肽及/或氨基酸的方法，其中水解用一种这种的酶数量，在一种这样的PH和一种这样的温度下进行，以使一种所加入的不溶性底物，尤其是羽毛、毛发或兽角，至早在3h后溶解，并且特别好的是，这些底物在24h后至少溶解50%（重量）。有利的是，这种方法在1至4天中止，而且特别是至少有80%（重量），尤其有90%（重量）以上，而特别有利的是实际上全部底物都溶解。

当在上述方法中使用角蛋白或含角蛋白的物质，尤其是羽毛时，可有益地省去预处理，例如压热处理，特别是省去一种在≥130℃温度下的预处理，而特别有益的是省去≥120℃的预处理。这样的预处理，在水解羽毛时迄今一直沿用，故而总有相当大部分氨基酸被外消旋化。

按本发明，上述各方法也可分两步进行，也即，在至少溶解一部分所用底物后，尤其在溶解50%（重量）以上所用底物后，在必要时，将水解产物在另外的条件（温度、PH）下，用一种或多种肽酶进一步处理。这用来使已产生的低聚肽更快或完全进一步水解。

属于本发明的还有一种用酶水解蛋白质，尤其是水解角蛋白或含有蛋白质的物质，尤其是水解羽毛、兽角或毛发的方法，其中水解用一种上述酶组合物及/或用微生物菌种W来进行。原则上，上述酶组合物可在本发明所有方法中使用。

下面根据各实施例和附图来详细阐述本发明。

附图中示出：

图1为本发明酶组合物的最佳PH;

图2为图1所述酶组合物的最佳温度;

图3为该酶组合物的酶活性;

图4为相似图3在添加胰蛋白胨条件下的酶活性;

图5为可溶性底物的酶分解;

图6为不溶性底物的酶分解;以及

图7为羽毛在2天内的分解。

新微生物菌种W从热的固氮菌（Azoren）来源物中分离出来。它可以在氮气氛和70℃下培养。为此可使用Hungate细管，该管中装有下列组成的培养基：

K₂HPO₄1.6g

NaH₂PO₄1.0g

（NH₄）₂SO₄1.5g

NaCl 3.0g

CaCl·2H₂O 0.1g

MgSO₄·7H₂O 0.3g

FeCl₂·6H₂O 6.0mg

胰蛋白胨 1.0g

酵母浸出物 1.0g

微量元素 1.0ml

维生素 1.0ml

刃天青（1mg/ml） 1.0ml

NaHCO₃1.0g

盐酸半胱氨酸 0.5g

加水至 1.0l

PH（以6N HCl调节） 6.0（压热处理后约为6.3）

微量元素：

MnCl₂·4H₂O 1.0g

CoCl₂·6H₂O 1.0g

NiCl₂·6H₂O 0.5g

ZnCl₂0.5g

CuSO₄0.5g

H₃BO₄0.2g

Na₂MO₄·2H₂O 0.1g

Na₂SeO₃·5H₂O 0.1g

VOSO₄·5H₂O 0.03g

加水至 1.0l

维生素溶液：

生物素 0.2g

叶酸 0.2g

维生素B₆/HCl 1.0g

维生素B₁/HCl 0.5g

维生素B₂0.5g

烟酸 0.5g

DL-泛酸钙 0.5g

维生素B₁₂0.01g

对氨基苯甲酸盐 0.5g

脂酮酸 0.5g

加水至 1.0l

PH（用1N NaOH调节） 7.0

向培养基中加入0.2%胰酶解胨或不溶性蛋白质，例如以羽毛的形式，来作为底物。接着向Hungate细管充入氮气。尔后，在一般常用的条件下，例在120℃下消毒30分钟。然而，如果使用结构蛋白质，则在较低温度，例如在100℃下消毒60分钟，以使天然蛋白质不致变性。接下来的保温，可在高温下进行，尤其是在70℃下进行。在厌氧条件下，细胞在约8至12h内增多，而且3天后可以确定结构蛋白的分解。

在用含有及不含有葡萄糖的芽孢培养基培育时，未证明有芽孢形成。经过氧化酶试验，未能证明有过氧化氢酶。

除此之外，这种新微生物菌种W还具有下列分解性质：

底物分解

乳糖 -

葡萄糖 -

果糖 -

麦芽糖 +

木糖 +

淀粉糖 +

阿拉伯糖 -

菊粉素 -

吐温（Tween）80 -

HEC（纤维素） -

出芽短梗孢糖 +

糖原 +

淀粉 +

明胶 -

胨 -

细菌用胨（Bactopepton） -

胶原 -

酪蛋白 -

胰酶解胨 +

支链淀粉 -

琥珀酸盐 -

酵母浸出物 +

革兰氏染色特性革兰氏阴性

KOH试验无反应

Xylanaleban -

＊不明显

用HPLC测定DNA中鸟苷十胞嘧啶含量，平均得G+C＝40.0±0.6%（mol）（测定3次）。测定按相似于Anal.Biochem.81，（1977年），第461-466页中对DNA分离所述的方法，Int.J.Syot.Bact.39，（1989年），第159-167页中对DNA分解。标准DNA及G+C测定方法，以及FEMS Microbiology Letters 25.（1984年）第125-128页中对色谱条件所述者来进行。

分析柱NUCLEOSIL 100-5C18（250×4mm）带有前置柱NUCLEOSIL 100-5C18（20×4mm）：温度26℃，流动溶剂0.6M（NH₄）H₂PO₄∶乙腈＝80∶6（体积比），PH4.4，0.7ml/min。压力约120巴，用未甲基化的AMBDA-DNA（Sigma公司产）进行标定。G+C含量为49.858%（mo），以P1核酸酶分解DNA;并用源自小牛血清的碱性磷酸酶（牛碱性磷酸酶）的脱磷酸化。

粗萃取物的制备

用超声波分裂发酵罐培养物的细胞（约1g/20ml磷酸盐50mM PH 6.8缓冲液）。（15min，50%，Sufe 6-7，用超声峰，Bransan Sonifier）。在显微镜控制以分裂成功后，将粗萃取物在4℃下以35，000×g离心分离。所得上清液用于酶测试。

活性：约0.3-0.8U/ml，视分裂的情况而定。

蛋白质：约1-2mg/ml。

解蛋白活性的测定

对可溶性蛋白质进行解蛋白活性测定

对可溶性蛋白质解蛋白活性的测量原理，是根据芳香族氨基酸因酶活性而从蛋白质，例如酪蛋白或牛血清白蛋白中释出。这些芳香族氨基酸，可在用三氯乙酸使反应停止并使未分解的蛋白质沉淀下来以后，在上清液中用光电计在280nm处检测到。

反应配料准备

将0.45ml0.25%（重量/体积）酪蛋白溶液（Hammersten质量级）置于相宜的B & R缓冲液（Britton & Robinson，J.Chem.Soc.（1931），第1456页，一种含H₃PO₄、CH₃COOH及H₃BO₃各0.4M的水溶液，以0.2N NaOH调至所需PH值）中，在冰上用0.05ml含酶试样在E型杯中滴定，并视活性而定，在对此酶最佳的温度（80℃）和PH值（10）下保温至多60min。接着，在上述配料中加入0.5ml10%（重量/体积）三氯乙酸（TCA），以停止反应并使蛋白质沉淀，在室温下保温15-30min，然后在Eppendorf型离心机（Heraeus Sepateck产，Osterode）以13，000转/分进行离心分离。在石英池中以280nm对照未经保温的空白值来测量清晰上清液的吸光度。

为测定酶活性起见，绘出0-1μM/配料范围内的酪氨酸标准曲线。酶活性（1单位）定义为每分钟释出1μmol芳香族氨基酸的量。由标准曲线的上升，得下列换算式：

U/l＝ (△E×1×20，000)/(t（min）)

酶组合物的制备：

为了制取本发明的酶组合物，将纯培养物或混合培养物中所吸引的细胞以10，000×g分离掉，酶组合物就存在于上清液中。由此可借助错流过滤或经由Amicon型蒸发室进行浓缩。不过，事实已表明，有一部分酶组合物中的酶结合在细胞膜上，故而将细胞分裂可有利于取得这部分酶。这种分裂可以举例来说，用超声或法兰西压榨机来进行。接着，可以如上所述，进一步浓缩酶。

酶组合物的特征

本发明的酶组合物可由一种或多种酶组成。如果这种酶组合物从含有本发明新微生物的混合培养物中获得，则也可含有其它微生物的异种酶。

在多次试验中，测定了该种酶组合物的蛋白酶活性（Klinge-berg M.，Haswa F.，Antranikian G.，（1990年）“厌氧高嗜热细菌中极度热稳定蛋白酶的特性”，Appl.Microbiol.Biotechnol.43：第715-719页）。在此情况下，使用0.25%底物溶液（是所需PH值的酪氨酸溶于B & R缓冲液所成的溶液），并如上所述测定活性。图1示出80℃时的最佳PH值。PH值在4至12范围内，优选为7至11范围内，尤其在9至10范围内。图2所示最佳温度值在PH10时所确定。可以看出，在50至105℃的宽泛范围内都具酶活性，而以70至90℃范围内为佳，尤以80℃时更佳。为测定热稳定性起见，分别在15′、30′、1h之后，每隔1h直到6h，以及20h后取样，并测定活性。在6h及20h之间未发现多大的活性衰减（＞10%）即意味稳定。

不同抑制剂对蛋白酶活性的影响

不同抑制剂的抑制作用，说明了活化中心和酶反应机理的情况。苯基甲基磺酰氟（PMSF）及二异丙基氟磷酸（DEP）在丝氨酸蛋白酶活化中心中，与丝氨酸上的OH基团结合，并且不可逆地抑制后者。乙二胺四乙酸二钠盐（EDTA）是一种金属螯合剂，并抑制金属蛋白酶。半胱氨酸位于活化中心的那些蛋白酶，可用碘代乙酸盐来不可逆地加以抑制。为了测定嗜热蛋白酶的活化中心，将这些酶同各相宜抑制剂在室温和PH7.0下一起保温，以不使DFP及PMSF水解。

反应配料准备：

470μl0.25%（重量/体积）酪氨酸溶于50mMPH10缓冲液（B & R）

25μl酶溶液

5μl抑制剂原液（见下）

在使用5μl抑制剂原液时，最终浓度相当于1mM。在使用25μl抑制剂原液（最终浓度5mM）时，只相应使用450μl底物液。首先将配料不加底物，在室温下温育1h，接着同底物一起，在对酶最佳的温度下温育1h。经温育后，用500μl10%（重量/体积）三氯乙酸溶液，使反应停止，并按上所述测定剩余活性。下面是所用的抑制剂溶液：

PMSF 17.3%（重量/体积），溶于乙醇中

EDTA 3.56%（重量/体积），溶于二次蒸馏水

碘代乙酸盐 14.4%（重量/体积），溶于二次蒸馏水

用培养物上清液中的蛋白酶水解色原性肽底物（E₄₀₅值）

为测定蛋白酶的底物特异性，将所述色原性肽底物以0.2mM最终浓度，同无细胞粗萃取物一起温育。

温育在低于蛋白酶的最佳温度和PH的条件下进行，以避免肽底物热水解或与PH有关的非酶性水解。

反应配料准备：

900μl0.2mM（重量/体积）底物溶液，溶于50mM Na-ρ缓冲液，PH7.0

100μl酶试样

60℃下温育17h

接着，马上在405nm吸光条件下，对照未经温育的空白值来测量所释出的对硝基苯胺。

SDS凝胶电泳

SDS凝胶的层厚为1.5mm。聚集凝胶浓度为4.5%（重量/体积），分离凝胶浓度为11.5%（重量/体积）。为制备凝胶，使用下列溶液：

丙烯酰胺溶液：

丙烯酰胺 29.2g

N，N-亚甲基双丙烯酰胺 0.8g

蒸馏水至100ml

过滤该溶液，以除去不溶性颗粒。

分离凝胶缓冲液：

Tris（α，α，α-三（羟甲基）甲胺） 18.15g

SDS 0.40g

蒸馏水至100ml

加入SDS之前，用浓盐酸将PH调至8.9。

聚集凝胶缓冲液：

Tris 6.05g

SDS 0.40g

蒸馏水至100ml

加入SDS之前，用浓盐酸将PH值调至6.8。

过硫酸铵溶液：

过硫酸铵 0.10g

蒸馏水 0.94g

电泳缓冲液：

Tris 3.00g

甘氨酸 14.40g

SDS 1.00g

蒸馏水至1，000ml

过硫酸铵溶液抑或在用前现配，抑或分成一定量在-20℃下贮存于Eppendorf型反应容器中，并在用前不久解冻。所有其它溶液可在4℃下贮存数周，而电泳缓冲液则随时现配。

凝胶的制备：

为制备凝胶板，先浇注分离凝胶。为此，将

分离凝胶缓冲液 1.4ml

丙烯酰胺溶液 2.1ml

蒸馏水 2.6ml

混匀，并用喷水泵除气。经添加

过硫酸铵溶液 40μl

TEMED 6μl

使聚合开始进行，并将溶液灌入模腔中，直至还有1.5cm的空间可容纳聚集凝胶。凝胶表面涂以1ml蒸馏水，以防干燥。约60min后，聚合过程结束，可浇注聚集凝胶。为此，将

聚集凝胶缓冲液 0.70ml

丙烯酰胺溶液 0.26ml

蒸馏水 1.04ml

混合、脱气，并添加

过硫酸铵溶液 10μl

TEMED（N，N，N′，N′-四甲基乙二2μl

胺

使聚合开始进行。在浇注聚集凝胶之前，先滗去分离凝胶中的水。在仍处于液态的凝胶中，以不产生气泡的方式插入梳片，有助于袋状小孔的形成。

样品准备：

在至多含有50μg蛋白质的至多50μl蛋白质溶液中，加入10μl变性缓冲液，该变性缓冲认含有下列组分：

SDS 2.00g

2-巯基乙醇 3.00g

10mM NaP缓冲液，PH 7.0 至100ml

将此配料在100℃下温育5min，接着国入2μl溴酚兰溶液及一调药刀尖量的蔗糖，并用一种Hamilton型注射器涂在凝胶上。

电泳的进行

为了移入样品，首先对每1.5mm凝胶厚度和10cm凝胶宽度，通以10mA的稳定电流强度。尔后，将样品移入聚集凝胶，并将电流强度提高到20mA。

银染色

在凝胶电泳分离很小量蛋白质时，蛋白质条带的检测经用银染色来进行。对此，在电泳以后，将凝胶置于下述各溶液中，在振荡器上进行温育：

固定液 60min

50%（重量/体积）乙醇 3×20min

0.03%（重量/体积）Na₂S₂O₅1min

蒸馏水（更换3次） 1min

银溶液 20min

并用蒸馏水冲洗2次。接着，将凝胶在轻微摇动的条件下在显影液中温育，一直到蛋白质条带明晰可见为止。将凝胶浸入50mMEDTA溶液，来停止染色反应。凝胶可在上述溶液中保存数周的时间。

固定液：乙醇 30ml

乙酸 10ml

甲醛溶液（37%） 50μl

蒸馏水至100ml

银溶液：AgNO₃0.1g

甲醛溶液（37%） 50μl

蒸馏水至100ml

显影液：Na₂CO₃6g

Na₂S₂O₅0.4mg

甲醛溶液（37%） 50μl

蒸馏水至100ml

SDS-聚丙烯酰胺凝胶中解蛋白活性的验证

具解蛋白活性的酶，可间接通过对浇入凝胶中的明胶进行染色来难证。为此，如上所述，浇注11%的SDS分离凝胶。然而，在误差范围内，不用2.6mlH₂O，而只用2.0ml，剩下的0.6ml用PH为8.5、溶于100mM甘氨酸缓冲液的1%明胶来代替。由此，在凝胶中产生0.1%的最终明胶浓度。如上所述，聚集凝胶不加入明胶进行浇注。样品的准备和电泳的进行同上所述。电泳完毕后，接着在4℃下将凝胶在2.5%Triton X-100溶液中温育60min，以使SDS从凝胶中溶解出来。紧接着，视所具活性而定，在最佳条件（PH10，80℃）下，将凝胶在50mM缓冲液中温育5-30min，随后在染色溶液中固定并染色60min。具解蛋白活性的条带，以约3小时脱色后，可在染上兰色的凝胶中见到浅色条带。

染色液：酰胺黑 0.1g

乙醇 30ml

乙酸 10ml

蒸馏水至100ml

脱色剂：乙醇 30ml

乙酸 10ml

蒸馏水至100ml

用Superdex 200（HPLC）进行凝胶过滤

酶萃取物：

1mg/ml 蛋白质

0.6U/ml

柱：Superdex high-load 200 16/60（120ml）

缓冲液：NaP PH6.8

流速：0.5ml/min

活性蛋白质峰值：在出现峰值的体积中，（最大标定蛋白质：200，000）大于200，000

金属离子对解蛋白活性的影响

金属离子约%活性1mM 约%活性5mM

AgCl₂0 0

CaCl₂85 117

CoCl₂143 187

CuCl₂17 0

FeCl₂127 0

FeCl₃93 0

MgCl₂171 125

MnCl₂110 120

NaCl 86 116

NaMoO₄91 95

NaSe₂O₃96 136

NaWO₄75 134

NiCl₂72 44

VOSO₄87 44

ZnCl₂57 37

将金属离子溶于缓冲液（50mM Na-ρ;PH6.6）。将50μl这种溶液与50μl粗萃取物一起在室温下温育1h，然后加入400μl底物（0.25%，PH10），并在80℃下温育1h。TCA沉淀及活性测定按上所述进行。

在另一项试验中，检验了新微生物在含0.25%羽毛作底物的复合培养物上的生长，同时确定酶活性（图3）。复合培养物中若添加0.25%胰胨（图4），则酶活性明显提高。

最后，图5及图6示出可溶性及不溶性底物的分解情况。在添加一定量酶（0.1U/ml）以后，确定底物分解的百分数，其中各将在羽毛底物上生长的新微生物细胞（左边条带F1）同胰胨上生长的细胞（右边条带F2）进行比较。

用酶进行的蛋白质分解，可最后用新微生菌种W的完整细胞来进行，或者在本发明的任一种酶组合物存在下，在活体外进行。在此情况下，活体外处理还有这样一种可能性，即蛋白质分解也可在厌氧条件下，在50-100℃及例如在PH10时进行，而且以这种厌氧方案（见上）为佳。

附件1

Ⅱ培育条件

培养基：

K₂HPO₄1.6g

NaH₂PO₄1.0g

（NH₄）₂SO₄1.5g

NaCl 3.0g

CaCl₂·2H₂O 0.1g

MgSO₄·7H₂O 0.3g

FeCl₂·6H₂O 6.0mg

胰胨 1.0g

酵母浸出物 1.0g

微量元素 1.0ml

维生素 1.0ml

刃天青（1mg/ml） 1.0ml

NaHCO₃1.0g

半胱氨酸HCl 0.5g

蒸馏水至1.0l

PH（用6N HCl调节） 6.0（压热处理后约6.3）

底物：每Hungate型细管1片羽毛[胰胨0.2%]

各Hungate细管在装料时通以N₂气。灭菌在100℃下进行60min，温度再高会使羽毛结构强烈变性。

温育：70℃下厌氧。细胞在8-12h内增多。3天后可确定羽毛的分解。

微量元素：

MnCl₂·4H₂O 1.0g

CoCl₂·6H₂O 1.0g

NiCl₂·6H₂O 0.5g

ZnCl₂0.5g

CuSO₄0.5g

H₃BO₄0.2g

Na₂MoO₄·2H₂O 0.1g

Na₂SeO₃·5H₂O 0.1g

VOSO₄·5H₂O 0.03g

蒸馏水至1.0l

维生素溶液：

生物素 0.2g

叶酸 0.2g

维生素B₆/HCl 1.0g

维生素B₁/HCl 0.5g

维生素B₂0.5g

烟酸 0.5g

DL-泛酸钙 0.5g

维生素B₁₂0.01g

对氨基苯甲酸盐 0.5g

脂酮酸 0.5g

蒸馏水至1.0l

PH（用1N NaOH调节） 7.0

附件2

Ⅶ.科学描述

该细菌能够于70℃下在复合培养基上生长。经10小时生长后，达到静止期。蛋白酶产生同样增加。90%的酶与细胞结合。培养在通N₂气和搅拌（约200转/分）下进行。该细胞为杆状。

底物分解

乳糖 -

葡萄糖 -

果糖 +

麦芽糖 +

木糖 +

阿拉伯糖 -

菊粉 -

吐温80 -

HEC（纤维素） -

出芽短梗孢糖 +

糖原 +

淀粉 +

明胶 -

胨 +

Bactopepton +

胶原蛋白 -

酪蛋白 +

胰胨 +

革兰氏染色性质：

经KOH试验和L-氨基肽酶试验，未涉及革兰氏阴性生物。革兰氏染色迄今未成。

芽孢：

在含有或不含有葡萄糖的芽孢培养基上培育后，未发现芽孢。在陈培养物中也未见芽孢。

过氧化氢酶：

用过氧化物酶试验，未检到过氧化氢酶。

Claims

1、以编号DSM 7003保藏的微生物菌种。

2、由含有权利要求1所述微生物的培养物得到的酶组合物，其中分离出培养物上清液，并在必要时予以浓缩。

3、由含有权利要求1所述微生物的培养物得到的酶组合物，其中将细胞分裂。

4、权利要求2或3所述的酶组合物，其特征在于，将所述微生物在胰胨介质中培养，以产生酶或诱发酶。

5、尤其按权利要求2至4所述的酶组合物，其特征在于，该组合物含有一种酶或多种酶，并具有蛋白酶活性，而且

-温度最佳值（PH为10时）在70-90℃范围内，尤其在80℃;

-PH最佳值（80℃时）在PH7至PH11范围内，尤其在PH9至PH10范围内;

-凝胶过滤证明，酶或酶复体的分子量约为200，000道尔，而且用SDS-活性凝胶测定分子量呈现两条在约200，000和约330，000范围内的条带;

-0.2mM溶于PH7磷酸盐缓冲液的底物及0.3mg/ml酶粗萃取物经60℃温育17h后的E₄₀₅值（对照空白值），在测量距离为1cm时，在N-琥珀酰基-Phe-pNA、N-琥珀酰基-Ala-Ala-Pro-phe-pNA及Z-Arg-pNA情况下＞0.5，在H-Gly-Glu-pNA情况下介乎0.3和0.5之间，在酰基-Ala-pNA情况下介乎0.1和0.3之间，而在苯酰基-DL-Arg-pNA、Z-Gly-Pro-pNA、苯酰基-Lys-pNA、Z-Arg-pNA及乙酰基-Tyr-pNA情况下则小于0.1;

-下列抑制剂在所述浓度下约产生下列残余活性：

抑制剂残余活性残余活性

(1mM) (5mM)

无 100% 100%

Pefabloc SC (Ser.) 83% -

PMSF (Ser.) 14% 10%

EDTA (Metallo.) 93% 85%

碘代乙酸盐 (Cyst.) 83% 76%

-热稳定性如下：

-PH7及PH8.5时，在70℃及80℃下经20h以上仍稳定，

-90℃下4h后残余活性小于10%，

-在PH10、80℃及90℃时，15min后活性完全丧失，

-70℃下6h后残余活性约为40%，20h后完全丧失。

6、权利要求1所述微生物及/或权利要求2至5中任一项所述酶组合物作分解蛋白质，尤其角蛋白或分解含这些蛋白质的物质，尤其羽毛、兽角或毛发的应用。

7、权利要求1所述微生物作分离编码角蛋酶的基因及/或作另一种微生物中插入编码角蛋酶的基因的应用。

8、在＞50℃温度下用一种或多种酶将肽，尤其将角蛋白或羽毛、毛发或兽角之类含角蛋白物质水解成低聚肽及/或氨基酸的方法，其特征在于，所述水解在介乎50℃和105℃的温度和介乎4和＜11的PH下进行，而且所述酶的分解是由一种可能伴随发生的化学分解的多重分解。

9、在≥70℃温度下用一种或多种酶将肽，尤其角蛋白或羽毛、毛发或兽角之类含角蛋白物质水解成低聚肽及/或氨基酸的方法，其特征在于，所述分解在厌氧条件下进行。

10、权利要求8所述的方法，其特征在于，所述水解在厌氧条件下进行。

11、权利要求9所述的方法，其特征在于，所述水解在介乎4和12之间的PH值下进行。

12、用一种或多种酶将肽，尤其将角蛋白或羽毛、毛发或兽角之类含角蛋白物质水解成低聚肽及或氨基酸的方法，其特征在于，将一种含有一个编码≥70℃时具活性肽酶，尤其角蛋白酶的插入基因的嗜中温微生物，在≥70℃时，于水介质中同肽，尤其与角蛋白或含角蛋白的物质反应;或者将该微生物在水培养基中，加热到≥70℃的温度，并将所述水培养基，在必要时分离出所沉淀组分后，与肽，尤其与角蛋白或含角蛋白的物质混合。

13、权利要求8-12中任一项所述的水解方法，其特征在于，在水解之前，将角蛋白或含角蛋白的物质，尤其是羽毛，不在≥120℃的温度下进行预处理。

14、权利要求8-13中任一项所述的水解方法，其特征在于，在溶解掉至少50%所用底物后，将水解产物用一种或多种肽酶进一步处理。

15、尤其按权利要求8-14中任一项所述，在＞50℃温度下，用一种或多种酶将角蛋白或羽毛、毛发或兽角之类含角蛋白物质水解成低聚肽及/或氨基酸的方法，其特征在于，以所加不溶性底物至早在3h后溶解的酶数量、PH及温度条件进行水解。

16、权利要求15所述的水解方法，其特征在于，以所加不溶性底物在24h后至少溶解50%（重量）的酶数量、PH及温度条件进行水解。

17、用酶水解蛋白质，尤其角蛋白或水解含蛋白物质，尤其水解羽毛、兽角或毛发的方法，其特征在于，用权利要求2至5中任一项所述酶组合物及/或用权利要求1所述微生物来进行水解。