CN102321553B - 羽毛角蛋白厌氧降解菌株18d-ta - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种羽毛角蛋白厌氧降解菌株18D-TA，属于微生物技术领域。该菌株的分类名称为Tepidimicrobium sp.，保藏编号为CGMCC NO.4800 。该菌株能快速地将完整羽毛完全降解，对角蛋白的降解效率高，且降解产物中附加的营养成分高，满足了工业化生产。

Description

羽毛角蛋白厌氧降解菌株18D-TA

技术领域

本发明涉及一种对天然角蛋白具有降解作用的微生物菌株，尤其是一种羽毛角蛋白厌氧降解菌株18D-TA。属于微生物技术领域。 

背景技术

随着家禽养殖业规模化、集约化的飞速发展，带来两方面主要问题：一方面是产生大量羽毛废弃物，按传统的填埋、焚烧或产气等方法去处理，严重污染环境；另一方面是加剧饲料原料特别是蛋白饲料短缺的严峻形势。面对这两方面的压力，世界各国对一些非常规资源，如鱼粉、羽毛粉的关注度越来越大。家禽羽毛中粗蛋白含量在80%以上，富含动物所需的多种必需氨基酸，但羽毛中90%非常稳定的角蛋白很难被胃肠道内的消化酶消化，因此长期以来并未被高效利用，从而造成可利用资源的浪费。

虽然国内外很早就开展了羽毛废弃物的资源化利用，但采用的方法主要是高温高压法、酸碱水解法、膨化法。这些物理化学方法具有较多的缺点，如设备要求高，投资大，耗能巨大，污染环境，羽毛粉营养价值低，质量不稳定，蛋白质的消化率低，严重制约了技术的应用与普及。

自然界存在某些特殊的微生物，因其分泌角蛋白酶能将难降解的羽毛角蛋白分解，这一研究领域受到科学家们越来越多的关注。目前已分离纯化出多个来自好氧微生物的角蛋白酶，但因其成本昂贵，不能实现工业化生产。而直接利用微生物发酵降解羽毛角蛋白，具有很多优点，如反应条件温和，耗能少，不污染环境，所得蛋白质或氨基酸产品营养价值高，消化率高，所以微生物发酵降解羽毛角蛋白具有巨大的应用价值潜能。

微生物发酵有好氧法和厌氧法。厌氧发酵角蛋白具有以下两点优势：一是厌氧条件下发酵产物能累积较多的蛋白质或氨基酸等高附加值产品；二是厌氧发酵无需提供通气设备，减少了发酵染菌的可能性，大大降低能耗和成本。

目前发现的厌氧降解羽毛角蛋白的微生物菌种很少且羽毛降解效率不是很高。1996年发现的Fervidobacterium  pennavorans 70℃，48 h后降解羽毛剩下羽毛主梗（Friedrich and Antranikian ，1996）；2002年分离了Fervidobacterium islandicum AW-1，70℃，24h后观测到氨基酸含量明显增加（Nam et al. 2002）；2008年获得了Clostridium sporogenes菌株，42℃，7天观测到羽毛完全降解（Ionata et al. 2008）。由于这些菌种降解羽毛时间较长，不能很好满足工业化生产的要求。因此，缺乏高效的羽毛厌氧降解菌株及相应的厌氧发酵技术工艺，成为限制这一绿色产业发展的瓶颈。

发明内容

本发明旨在克服现有技术的不足，提供一种厌氧降解羽毛角蛋白的微生物菌株18D-TA，该菌株不但能快速地将完整羽毛完全降解，而且对角蛋白的降解效率高，同时由于降解产物中所含附加营养成分较高，因而满足了工业化生产。

本发明的具体技术方案如下：

本发明提供的是一种羽毛角蛋白厌氧降解菌株18D-TA，它属于Tepidimicrobium菌属的菌种，该菌株的分类命名为Tepidimicrobium   sp. ， 2011年4月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种的保藏编号为CGMCC NO.  4800 。

本发明所述的18D-TA菌株具有以下微生物学特性：

a、形态学的特性

菌株18D-TA在厌氧固体培养基培养3-5天出现0.5-1mm白色球形菌落，该菌株呈杆状，单生或多个连成线，也有单个球形，或者球形与杆状相连，且细胞壁较厚。

b、培养学的特性

以1% （w/v） tryptone（胰化蛋白胨）为碳源和氮源，再选取基本培养基严格厌氧培养后，取适量菌液以600nm下的吸光度作为指标，做菌株18D-TA的温度试验，pH试验，NaCl浓度试验，以及在最适温度、pH和NaCl浓度下的倍增时间试验。

经上述试验，菌株18D-TA的最适温度为45-60℃，pH 7.0-9.5，氯化钠浓度0.1-0.4%，倍增时间3.02h。

所述基本培养基的成分含量为：K₂HPO₄ 3g/L，KH₂PO₄ 2.5 g/L，NaCl 3 g/L，MgSO₄·7H₂O 0. 02 g/L，CaCO₃0. 02 g/L，维生素液1%（v/v），微量元素液1%（v/v），Cysteine-HCl·H₂O 0.1%(w/v)，质量体积浓度为0.1%的刃天青 0.1%（v/v），蒸馏水1 L，pH 7.0-7.5。

所述维生素液的组成为：生物素 2.00 mg，叶酸 2.00 mg，吡哆醇-盐酸10.00mg，二水合硫胺素-盐酸5.00 mg，核黄素 5.00mg，烟酸 5.00mg，D-泛酸钙 5.00mg，维生素 B₁₂ 0.10mg，对氨基苯甲酸 5.00mg，硫辛酸 5.00 mg，蒸馏水1000.00ml。 

所述微量元素液的组成为：MgSO₄ ·7 H₂O 3.00g，MnSO₄ · H₂O 0.50 g，NaCl 1.00 g，FeSO₄·7 H₂O 0.10 g，CoSO₄ ·7 H₂O 0.18 g，CaCl₂ · 2 H₂O 0.10 g，ZnSO₄ ·7 H₂O 0.18 g，CuSO₄·5 H₂O 0.01 g，KAl(SO₄)₂ ·12 H₂O 0.02g，H₃BO₃ 0.01g，Na₂MoO₄ · 2 H₂O 0.01 g，NiCl₂ · 6 H₂O 0.03g，Na₂SeO₃·5 H₂O 0.30mg，蒸馏水 1000.00ml。

c、生理生化特性

通过对菌株18D-TA分别进行革兰氏染色试验、芽孢鉴定试验（孔雀石绿法）、抗生素试验、底物利用试验、电子受体试验（以蛋白胨为电子供体）、吲哚产物鉴定试验（根据吲哚与对位二甲基氨基苯甲醛生成吲哚玫瑰圈法，采用Ebrlich′s试剂），其生理生化特性表现为：

A、菌株18D-TA为革兰氏阴性菌，产生芽孢和吲哚，对利福平、氯霉素和卡那霉素敏感，对红霉素、新霉素、青霉素和链霉素有抗性；

B、以蛋白胨为电子供体时，可作为菌株18D-TA电子受体的物质有：9，10-蒽醌-2，6-双磺酸钠（AQDS），FeCl₃ ，无定形Fe₂O₃，柠檬酸铁，Na₂S₂O₃， NaNO₃和延胡索酸钠等检测物质。

C、菌株18D-TA能利用的蛋白质类物质（1%--w/v）包括：Gelatin，明胶，大豆蛋白，蛋白胨，牛肉膏，酵母粉，脱脂牛奶，胶原蛋白，干酪素等以及一些难降解的硬角蛋白类物质，如鸡毛，鸭毛，头发，牛毛，猪毛，指甲等。氨基酸类物质中可利用的有：脯氨酸（20nmol/L）+丙氨酸（20nmol/L），脯氨酸（20nmol/L）+缬氨酸（20nmol/L），脯氨酸（20nmol/L）+丝氨酸（20nmol/L）。碳水化合物类物质中可利用的有：木聚糖（1%--w/v），糖原（1%--w/v），琥珀酸盐（20nmol/L），延胡索酸二钠（20nmol/L）；表现为弱生长的有：阿拉伯糖，乳糖，麦芽糖，鼠李糖，蜜二糖，棉子糖，果糖，蔗糖，葡萄糖，木糖，纤维二糖和海藻糖，所述碳水化合物的终浓度均为20nmol/L。

菌株18D-TA厌氧降解羽毛的情况：在45-60℃，pH 7.0-9.5，氯化钠浓度0.1-0.4%，严格厌氧条件下，该菌株能在18h-24h内将未经处理的羽毛完全降解，甚至该菌株作用9h后，羽毛结构就已经被崩解。

d、菌种鉴定结果

PCR扩增、测序：该菌株以tryptone（胰蛋白胨）为底物厌氧培养至指数生长期，离心收集菌体，按细菌基因组提取试剂盒提取总DNA，电泳观察。16S rRNA PCR反应所用引物为通用引物（27f ：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’；1492r：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’）。 

PCR反应体系（50μl）为：模板DNA 2μl，引物27f（10umol/L）和1492r（10umol/L）各1μl，2×PCR MasterMix（购置于上海生工生物工程技术服务有限公司）25μl，双蒸水 21μl。PCR反应程序：94℃预变性5min；94℃变性 1min，56 ℃退火1min，72℃延伸 2 min；第2步循环29次；72℃ 10 min，电泳观察。PCR产物纯化后送上海生工生物工程技术服务有限公司测序。

根据16S rRNA序列比较分析，所述菌株18D-TA的微生物分类地位为：domain Bacteria ，phylum "Firmicutes" ，class "Clostridia" ，order Clostridiales，family Incertae Sedis XI，genus Tepidimicrobium ，该菌株与Tepidimicrobium ferriphilum 的最大相似度为94.5%，初步鉴定为一个新种，命名为Tepidimicrobium. sp. 18D-TA，其16S rRNA序列在GenBank上的登录号为：JF727749。

构建系统发育树：在NCBI数据库中，提交待测菌株的16S rRNA序列，用BLAST软件进行相似性比对。选取与待测菌株相似性最高的属中所有的模式菌株的16S rRNA序列，用Clustalx软件进行多序列比对，再用序列分析软件MEGA4.1进行分析。最后采用Neighbour-jioning（邻接法），构建系统进化树。

本发明所述的菌株18D-TA是Tepidimicrobium属中首次报道能降解羽毛等角蛋白材料的菌株，且其降解羽毛角蛋白的速率也为最快的一种菌种，在菌株最适发酵条件（温度55℃，pH8.0-8.5，严格厌氧）下20h能将完整羽毛完全降解，从而为厌氧高效降解羽毛角蛋白废弃物提供了优良的天然微生物菌种资源。同时，利用现代生物技术——基因工程、代谢组学、生物系统学等高科技技术，还可进一步提高该菌株的羽毛角蛋白降解效率，并通过降解产物而获得高附加值的营养成分，使该菌株的工业生产前景更加广阔。

附图说明

图1为18D-TA菌株的形态结构图，包括扫描电镜图a和投射电镜图b。

图2为18D-TA菌株在不同时间内厌氧降解羽毛的变化图。

图3为18D-TA菌株对羽毛角蛋白降解的微观结构。

图4为18D-TA菌株的温度试验图。

图5为18D-TA菌株的pH试验图。

图6为18D-TA菌株的NaCl试验图。

图7为18D-TA菌株的生长周期试验图。

图8为16S rRNA序列按照邻接法构建的系统发育树示意图。

具体实施方式

实施例1：18D-TA菌株的筛选方法或分离方法

角蛋白厌氧降解菌的分离需在严格厌氧的条件下进行，通过富集培养和分离纯化达到分离出厌氧菌株的目的。

1.1试验装置与羽毛处理

由于细胞内缺乏SOD和细胞色素氧化酶，同时多数还缺乏过氧化氢酶，因此，严格厌氧微生物只能生长在氧化还原电势低于0.1V的环境中，即选用厌氧操作箱或由厌氧微生物研究中心提供的Hungate铜柱除氧系统厌氧装置。

羽毛处理：家禽活宰点收集到的羽毛经流水冲洗干净，45℃-55 ℃烘干2-3天，备用。羽毛经粉碎机粉碎，过100目筛子，供固体培养使用。

1.2富集培养 

富集培养基的配制：预先加入500ml蒸馏水于1L的三角瓶中，称取培养基的组成成分，溶解后，再加水至1L。煮沸5-8min，冷却至室温，加入0.1%（w/v）Cysteine- HCl·H₂O，用5mol/l KOH调节pH至7.0-7.5，加入质量体积浓度为0.1%的刃天青溶液0.1%（v/v），通N₂（2.0m³/h），煮沸15min，冷却后取50ml培养基分装于预先加有1%（w/v）的羽毛作为唯一碳源和氮源的120ml血清瓶中，加上铝封。121℃，高温湿热灭菌30min。

无菌无氧的NaHCO₃和Na₂S溶液的配置：取500ml蒸馏水加于1L的三角瓶中，煮沸约10min，在Hungate铜柱除氧系统厌氧装置下，通N₂（2.0m³/h），煮沸20min，冷却后，取70ml水分装于预先加有NaHCO₃（10%--w/v）和Na₂S（3%--w/v）的血清瓶中，待全部溶解后塞好内塞，加上铝封。用60ml注射器每瓶分别补加约120ml N₂，121℃，高温湿热灭菌30min，待用。

接种：接种前补加无菌无氧的NaHCO₃溶液和Na₂S溶液，使其终浓度分别达到0.1%（w/v）和0.3%（w/v），接种量10%，55℃静置培养。待60-70%的羽毛被降解时，转接于新鲜的富集培养基中继续富集3-4代。

所述富集培养基的成分含量为：羽毛1%，蛋白胨1%，NaCl 3 g/L，MgSO₄·7H₂O 0. 02 g/L，0.1%（w/v）Cysteine- HCl·H₂O，质量体积浓度为0.1% 刃天青溶液0.1%（v/v），蒸馏水1 L，pH 7.0-7.5。

1.3分离纯化

烘干的羽毛用粉碎机粉碎，过100目筛子，得到羽毛粉，供配制固体管时使用。将富集后的培养物分别接种于液体选择培养基和固体培养基，采用Hungate滚管法，利用梯度稀释，对样品进行分离纯化，具体步骤如下：

（1）滚管：厌氧琼脂糖固体培养基的制备：制备过程与富集培养基相同，按4.5ml/管分装于螺口厌氧试管中，121℃，高温湿热灭菌30min。

将灭菌后处于液体状态的固体培养基置于50-55℃水浴中，补加NaHCO₃溶液和Na₂S溶液，使其终浓度分别达到0.1%（w/v）和0.3%（w/v），用无菌无氧注射器取0.2ml-0.3ml富集培养物，注入一支呈融化状态的固体培养管中，轻轻颠倒混合均匀，从中再取0.2ml-0.3ml接菌的固体培养基，转接至第二支固体培养管中，这样反复稀释至10^-6~10^-8。将接好菌的固体培养管放置于装有冰水混合物的滚管机上进行滚管，待固体培养基均匀覆盖于厌氧管内壁后，将管好的固体管垂直放置， 55℃培养。每个菌样重复2次。

所述液体选择培养基的成分含量为：羽毛1%（w/v），K₂HPO₄ 3 g/L，KH₂PO₄ 2.5 g/L，NaCl 3 g/L，MgSO₄·7H₂O 0.02 g/L，CaCO₃  0. 02 g/L，维生素液1%（v/v），微量元素液1%（v/v），0.1% （w/v）Cysteine- HCl·H₂O，质量体积浓度为0.1% 刃天青溶液0.1%（v/v），蒸馏水1 L，pH 7.0-7.5。

所述维生素液、微量元素液的组成含量与基本培养基中所述的相同。

所述固体培养基的成分含量为：羽毛粉0.8%，K₂HPO₄ 3 g/L，KH₂PO₄ 2.5 g/L，NaCl 3 g/L，MgSO₄·7H₂O 0. 02 g/L，CaCO₃  0. 02 g/L，琼脂糖2%（w/v），维生素液1%（v/v），微量元素液1%（v/v），0.1% （w/v）Cysteine- HCl·H₂O，质量体积浓度为0.1% 刃天青溶液0.1%（v/v），蒸馏水1 L，pH 7.0-7.5。

所述维生素液、微量元素液的组成含量与基本培养基中所述的相同。

（2）挑取菌落：菌的纯化过程是多次挑取单菌落、稀释滚管的过程。

制备挑取菌落用的弯头毛细管：将玻璃细管（内径0.5cm，外径0.8cm，长15cm），两端塞入脱脂棉，在酒精喷灯火焰上加热并拉成毛细管，端部内径约为0.5mm。121℃，30min高温湿热灭菌，烘干备用。

制备无菌无氧的选择培养基，制备方法同富集培养基，每支厌氧管中分装10ml培养基。制备无菌无氧的氮气管备用。

挑取菌落时，在Hungate操作系统中完成。将待挑取菌落的固体管管口朝上，固定于铁架台上，管身与水平面成30度角。打开固体管的同时，将Hungate操作系统的气流大小调至适当（从排气针吹出的气流横向吹酒精灯火焰达到1cm左右为宜）、排气针头经火焰灼烧灭菌冷却后迅速伸入固体管内，保证固体管处于无氧状态。打开液体培养基厌氧管胶塞，并迅速将火焰灼烧过的排气针插入液体管液面上方。以同样的方法打开无菌无氧氮气管，用作挑菌时的换气管。

将毛细管在火焰上灼烧，使末端弯曲至约90度，用镊子去除多余弯曲部分，保留2-3mm。毛细管另一端套乳胶管，在换气管中深吸一口氮气，以保证毛细管中无氧。将毛细管插入固体管中，并缓慢移至待挑取菌落处（不能碰到管内壁），吸取菌落，移出毛细管并快速插入液体管内，折断毛细管，盖上内塞，拔出针头，盖紧盖子，厌氧静置培养。

重复滚管挑菌3~4次直至所得培养物菌体形态、菌落形态及颜色均一致，革兰氏染色结果一致。

所述选择培养基的成分含量为：羽毛1% （w/v），K₂HPO₄ 3 g/L，KH₂PO₄ 2.5 g/L，NaCl 3 g/L，MgSO₄·7H₂O 0. 02 g/L，CaCO₃  0. 02 g/L，维生素液1%（v/v），微量元素液1%（v/v），0.1%（w/v）Cysteine- HCl·H₂O，质量体积浓度为0.1% 刃天青溶液0.1%（v/v），蒸馏水1 L，pH 7.0-7.5。

所述维生素液、微量元素液的组成含量与基本培养基中所述的相同。

实施例2：羽毛角蛋白降解作用的研究

制备选择培养基，制备方法同富集培养基，分装于预先装有完整羽毛的厌氧管中，121℃，30min高温湿热灭菌，补加NaHCO₃和Na₂S溶液（无菌无氧，终浓度分别为0.1%（w/v）和0.3%（w/v）），接种分离纯化的角蛋白厌氧降解菌18D-TA 10%（v/v），55℃静置培养，观察羽毛被降解的情况。

实施例3：菌株的鉴定

形态特征：

1）光学显微镜观察

无菌注射器取适量培养物制片，使用Nikon Eclipse 80i相差显微镜于40×，100×观察，用Nikon DXM-1200C相机拍照。

2）扫描显微镜观察

    取对数生长期菌液，离心收集菌体，以PBS缓冲液（pH7.2）冲洗，滴加于盖玻片上，自然干燥。样品置于2.5%戊二醛磷酸缓冲液（pH7.2），4℃冰箱过夜固定，用30%，50%，70%，80%、95%乙醇逐级脱水，每次15min。样品送四川大学分析测试中心做扫描电镜分析，喷金后，Amray-1000B扫描电镜观察并拍照。

3）透射电镜观察

a)取对数生长期菌液2-4ml，放于离心管中，用1500-2000rpm离心10-15min，弃去上清液。

b)用移液枪沿管壁缓慢加入约0.5%戊二醛固定液，于4℃静置15-30min。

c)10000-13000rpm离心10-15min，弃去上清液。

d)用移液枪沿管壁缓慢加入3%戊二醛固定液预固定，送四川大学华西医院电镜室做透射电镜分析。

e)1%四氧化锇再固定，丙酮逐级脱水，Epon81包埋，半薄切片光学定位，超薄切片，醋酸铀及枸橼酸铅双重染色，日H-600IV型透射电镜观察并拍照。

培养特征：

以1% （w/v） tryptone 为唯一碳源和氮源，再选取基本培养基严格厌氧培养后，用菌液在600nm下的吸光度作为指标，做菌株18D-TA的温度试验，pH试验，NaCl浓度试验，倍增时间试验（在最适温度，pH，NaCl浓度下）。

生理生化实验：

对菌株18D-TA进行革兰氏染色试验：革兰氏染色方法 （刘芬et al.,2002）；芽孢鉴定试验：孔雀石绿法；抗生素试验：7种抗生素，终浓度200ng/ml；底物利用试验；电子受体试验：向含有1%大豆蛋白胨（电子供体）的培养基中分别加入20mmol/L的电子受体物质---9，10-蒽醌-2,6-双磺酸钠（AQDS），FeCl₃ ，无定形Fe₂O₃，柠檬酸铁，Na₂S₂O₃，NaNO₃，延胡索酸钠，Na₂SO₄，NaNO₂，亚硒酸钠，然后接种，55℃厌氧培养，定期检测生长情况或产物的产生—铁离子采用盐酸邻菲罗啉分光光度计法；吲哚产物鉴定试验：根据吲哚与对位二甲基氨基苯甲醛生成吲哚玫瑰圈法，采用Ebrlich′s试剂。

化学分类：

菌株以tryptone为底物培养至指数生长期，离心收集菌体，按细菌基因组提取试剂盒（购置上海生工生物工程技术服务有限公司）说明方法提取总DNA，电泳观察。16S rRNA PCR反应所用引物为通用引物（27f ：5^’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3^’；1492r：5^’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3^’）。

PCR反应体系（50μl）为：模板DNA 2μl，引物27f（10umol/L）和1492r（10umol/L）各1μl，2×PCR MasterMix（购置于上海生工生物工程技术服务有限公司）25μl，双蒸水 21μl。PCR反应程序如下：94℃预变性5min；94℃变性 1min，56 ℃退火1min，72℃延伸 2 min；第2步循环29次；72℃ 10 min，电泳观察。PCR产物纯化后送上海生工生物工程技术服务有限公司测序。

系统发育树构建：在NCBI数据库中，提交待测菌株的16S rRNA序列，用BLAST软件进行相似性比对。选取与待测菌株相似性最高的属中所有的模式菌株的16S rRNA序列，用Clustalx软件进行多序列比对，再用序列分析软件MEGA4.1进行分析。最后采用Neighbour-jioning（邻接法），构建系统进化树。

实施例4：对比试验

制备选择培养基，分装于预先装有完整羽毛的厌氧管中，121℃，30min高温湿热灭菌，补加NaHCO₃和Na₂S溶液（无菌无氧，终浓度分别为0.1%和0.3%），实验组接种分离纯化的角蛋白厌氧降解菌18D-TA 10%，对照组不接菌，55℃静置培养一段时间后，对比观察羽毛被降解的情况。实验组在9h时羽绒从羽轴上脱落，14h脱落的羽绒被降解，18h羽轴被降解，只剩羽毛中最硬的羽柄部分。电镜观察羽毛显微结构变化，9h后对照组羽毛呈完整的竹节状，实验组羽毛已被该菌崩解。 

Claims (2)

1.一种羽毛角蛋白厌氧降解菌株18D-TA，其特征在于：该菌株的分类命名为Tepidimicrobium    sp. ，2011年4月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种的保藏编号为CGMCC NO.  4800 。

2.一种如权利要求1所述的羽毛角蛋白厌氧降解菌株18D-TA在水解角蛋白或含有角蛋白的物质成短肽或氨基酸方面的应用，所述含有角蛋白的物质是指羽毛、头发、猪毛、牛毛或指甲。

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