CN1057568C

CN1057568C - Ｄ－α氨基酸的制备方法

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Publication number: CN1057568C
Application number: CN91112793A
Authority: CN
Inventors: 难波弘宪; 山田勇喜雄; 高野昌行; 池中康裕; 高桥里美; 矢岛丽嘉
Original assignee: Zhongyuan Chemical Industry Co ltd
Current assignee: Zhongyuan Chemical Industry Co ltd; Kanegafuchi Chemical Industry Co Ltd
Priority date: 1990-12-07
Filing date: 1991-12-07
Publication date: 2000-10-18
Anticipated expiration: 2006-12-07
Also published as: EP0515698A1; KR920703834A; DE69129899D1; KR100257212B1; DE69129899T2; EP0515698B1; WO1992010579A1; EP0515698A4; KR100247853B1; US5565344A; US5695968A; ES2121001T3; CN1063310A

Abstract

D-α-氨基酸的制备方法，其特征在于用含有有关除去D-N-氨基甲酰-α-氨基酸的氨基甲酰基并转化成对应的D-α-氨基酸的酶的遗传因子的DNA片段和载体DNA的重组体DNA，通过使之选自属于埃氏杆菌属，假单胞菌属，黄杆菌属，芽孢杆菌属，沙雷氏菌属，棒状菌属，或短颈细菌属的微生物的宿主菌体进行转化而得的转化体产生的有关酶的作用，在水性介质中使D-N-氨基甲酰-α-氨基酸转化成对应的D-α氨基酸，并采集生成的D-α-氨基酸。

Description

Ｄ－α氨基酸的制备方法

本发明涉及D-α氨基酸的制备方法，特别是涉及使用具有有关使D-N-氨基甲酰-α氨基酸转化成对应的D-α-氨基酸的酶的遗传因子的新型转化体的D-α-氨基酸的制备方法。

旋光活性的D-α-氨基酸类是作为药物中间体的重要化合物，尤其是，可以举出作为半合成青霉素类或半合成头孢菌素类的制造中间体的，D-苯基甘氨酸，D-对羟基苯基甘氨酸等工业上有用的化合物。作为这样的D-α-氨基酸类的制备方法，已知的有除去对应的D-N-氨基甲酰-α-氨基酸类的氨基甲酰基而制取的方法，而其除去氨基甲酰基是通过化学上的方法(特公昭58-4707号的说明书)或利用微生物的酶反应的方法(特公昭57-18793号说明书，特公昭63-20520号说明书，特公平1-48758号说明书)而进行的。

为了除去上述氨基甲酰基而采用的化学方法，由于大量使用硫酸等无机酸，因而存在着与此处理等相关的环境保护上的问题。另外，利用酶反应的方法，至今已知的作为酶供给源的微生物中都没有充分的酶产量，而且还具有在其酶的生产中必须用高价的海因化合物或N-氨基甲酰氨基酸化合物等的缺点。

本发明的目的在于要解决上述问题，研究制备高产量酶的微生物的同时，使用这样得到的酶源，以高效率地生产D-α-氨基酸。

在类似的技术中有特开昭63-24894号，但是该发明是关于L-α-氨基酸制法的技术，并没有示出关于D-α-氨基酸制备的实验例。

本发明是提供一种制备D-α-氨基酸的方法，其特征在于，使用含有有关除去D-N-氨基甲酰-α-氨基酸的氨基甲酰基并转化成对应的D-α-氨基酸的酶的遗传因子的DNA片段和载体DNA的重组体DNA，并将选自属于埃希氏杆菌属，假单胞菌属，黄杆菌属，芽孢菌属，沙雷氏菌属，棒状杆菌属或短颈细菌属的微生物的宿主菌体，通过转化而得的转化体生产的相应的酶的作用，在水性介质中使D-N-氨基甲酰(基)-α-氨基酸变换成对应的D-α-氨基酸，并采集生成的D-α-氨基酸。

另外，使由有关除去D-N-氨基甲酰-α-氨基酸的氨基甲酰基并使之变换成对应的D-α-氨基酸的酶的遗传因子与载体构成的重组体DNA导入微生物中，并发现该遗传因子质粒的例子，以前是完全不知道的，是通过本发明首获成功的。

用于本发明的，除去D-N-氨基甲酰-α-氨基酸的氨基甲酰基并变换成相应的D-α-氨基酸的酶，是在D-异构体中特异地起作用的酶，或是在D-体，L-体中起作用的酶，实际上都无妨。另外，对于D-N-氨基甲酰-α-氨基酸的立体选择性严格的酶，是叫做D-N-氨基甲酰-α-氨基酸酰胺水解酶。

用作本发明的含有遗传因子的DNA片段，可以举出，来源于真核生物，原核生物，病毒，噬菌体或质粒，并含有有关D-N-氨基甲酰-α-氨基酸酰胺水解酶的遗传因子的DNA片段。作为来自原核生物的遗传因子，是来自于属于细菌，特别是假单胞细菌属，土壤杆菌属，气杆菌属，短颈细菌属，芽胞杆菌属，黄杆菌属，沙雷氏杆菌属，细球菌属，节细菌属(ァスロバクタ-属，Arthrobacter)，产碱杆菌属，无色杆菌属，莫拉克氏菌属，副球菌(paracoccus)属等的细菌的遗传因子，较好的是有关D-N-氨基甲酰-α-氨基酸酰胺水解酶的遗传因子。这样的菌株的具体实例为如下所列：阴沟气杆菌(Aerobacter cloacae)I AM 1221、斑点芽孢杆菌(Bacillusmacroides)ATCC 12905、蜂房芽孢杆菌(Bacillus alvei)IFO 3343，产氨短颈细菌(Brevibacterium ammoniagenes)IFO 12071，黄色黄杆菌(Flavobacterium flavescens)IFO 3086、藤黄八叠球菌(Sarcinalutea)IFO 1099、粘质赛氏杆菌(Serratiamarcescens)IFO 3054、藤黄小球菌(Micrococcus luteus)IFO 12708、亲水气杆菌(Aeromonashydrophila)IFO 3820、土壤杆菌(Agrobacterium

)KNK 712(FERM BP-1900)、假单胞细菌(Pseudomonas)sp.KNK 003A(FERM BP-3181)、假单胞细菌(Pseudomonas)sp.KNK505(FREM BP-3182)、土壤杆菌(Agrobacterium)1302 NRRL B 11291：绿柱石色产碱细菌(Alkaligenes aquamarinus)AJ 11199、溶胶无色杆菌(Achro mobacter liqueqaciens)AJ 11198、无溶胶莫拉克斯菌(Moraxella nonliquefaciens)AJ 11221，脱氮副球菌(Paracoccusdenitrifi cans)AJ 11222，脆性节细菌(Arthrobacter fragilus)AJ11223等。

作为上述细菌的代表例，土壤杆菌(Agrobacterium

)KNK 712(FEKM BP-1900)、假单胞细菌(Pseudomonas)sp.KNK 003A(FERM BP-3181)和假单胞细菌(Pseudomonas)sp.KNK505(FREM BP-3182)的细菌学上的诸性质如下所示。

土壤杆菌(Agrobacterium )-KNK 712 (FERM BP-1900)(a)形态

(1)细胞的形状和大小：0.5～1.0×2.0～4.0μm、

杆菌

(2)有无细胞的多形性：无

(3)有无运动性、鞭毛的附着生长状态：有

亚茯苓属(サズポ-ラ-)

(4)有无孢子：无

(5)革兰氏染色性：阴性(b)在各种培养基上繁殖状态

(1)肉汁琼脂平板培养：良好的繁殖、圆形、隆起性、边缘平滑、表面平滑湿润、白色～乳色、光泽、不透明、液状

(2)肉汁琼脂斜面培养：旺盛地繁殖、在接种线上一样繁殖、隆起厚、表面平滑湿润、边缘平滑、白色～乳色、光泽、不透明、培养基上无变化

(3)肉汁明胶划线培养：微弱地生长、沿划线生长、在划线周边生长、不使明胶液化、白色～乳色、透明度不变化、培养基上无变化

(4)肉汁液体培养：中等程度的繁殖、混浊不均一、形成絮凝物、表面无繁殖

(5)石蕊·乳液：弱酸(c)生理学上的性质

(1)硝酸盐的还原：+

(2)脱氮反应：+

(3)MR试验：+

(4)Vp试验：-

(5)吲哚的生成：-

(6)硫化氢的生成：-

(7)淀粉的加水分解：-

(8)柠檬酸的利用：-[西蒙氏(simon′s)培养基]

(9)无机氮源：+(硝酸盐、铵盐)

(10)尿素酶：-

(11)氧化酶：+

(12)过氧化氢酶：+

(13)繁殖的范围：20～37℃、pH6.5～8.5

(14)对于氧的态度：需氧

(15)O-F试验：0

(16)来自于糖的酸和气体的生成：酶的生成-、气体的生成-(D-葡

萄糖)

(17)丙二酸的利用：-

(18)苯基丙氨酸的脱氨基酶反应：-

(19)脱羧酶反应：-(赖氨酸)

(20)精氨酸二氢化酶反应：-

(21)酪蛋白的分解性：-

(22)DNA的分解：-

(23)营养要求性：无

(24)碳氢化合物的同化性

D-葡萄糖：+

L-阿拉伯糖：+

蔗糖：+

D-果糖：+

丙二酸盐：-

纤维二糖：+

乙醇：-

D-木糖：+

D-酒石酸盐：-

山梨糖醇：+

サィトレ-ト：-

乳糖：+

甘露糖醇：+

内消旋环己六醇：+

棉子糖：+

L-鼠李糖：+

麦芽糖：+

α-甲基-D-葡糖苷：+

D-マンス-ス：+

水杨苷：-

N-乙酰基葡糖胺：+

葡萄糖酸盐：-

癸酸盐：-

己二酸盐：-

苯基乙酸盐：-

甲醇：-

(25)蛋黄反应：-

(26)β-乳溶淀粉酶：+

(27)偏流线的(ェフスㄐニ)的加水分解：+

(28)细胞色素·氧化酶：+

(29)吐温的分解：+(吐温80)

(30)3-酮乳糖的生成：-

假单胞细菌(Pseudomonas)sp.KNK 003A(FERM PB-3181)(a)形态

(1)细胞的形状和大小：0.5～0.7×1.2～2.5μm、杆菌

(2)有无细胞的多形性：无

(3)有无运动性：有

(4)有无孢子：无

(5)革兰氏染色性：阴性

(6)菌落的形态：圆形、正规、全面、平滑、辉状、半透明、

淡黄(b)生理学上的性质

(1)用3％KOH的溶菌：+

(2)氨基肽酶：+

(3)氧化酶：+

(4)过氧化氢酶：+

(5)菌的生长

厌氧条件：-

37/40℃ ：+/+

pH 5.6 ：-

Mac-Conkey琼脂：-

SS琼脂：-

Cetrimid琼脂：-

(6)酸的生成(O-F试验)

葡萄糖需氧的条件：-

葡萄糖厌氧的条件：-

(7)来自于葡萄糖的气体的生成：-

(8)酸的生成(ASS)

葡萄糖：+

果糖：-

木糖：+

(9)ONPG ：-

(10)ADH ：-

(11)ODC ：-

(12)VP ：-

(13)吲哚的生成：-

(14)硝酸盐的还原：-

(15)脱氮反应：-

(16)苯基丙氨酸脱氨基酶：-

(17)由蔗糖来的左聚糖的生成：-

(18)卵磷脂酶：-

(19)尿素酶：-

(20)加水分解

淀粉：-

明胶：-

酪蛋白：-

DNA ：-

吐温80 ：-

七叶苷：-

(21)酪氨酸的分解：-

(22)各种化合物的同化性

乙酸盐：弱

己二酸盐：-

癸酸盐：-

柠檬酸盐：-

柠康酸盐：-

乙醇酸盐：-

丙醇酸盐：+

乙酰丙酸盐：-

苹果酸盐(マレ-ト)：-

丙二苹果酸盐(マロネ-ト)：-

中康酸盐(メサコネ-ト)：-

苯基乙酸盐：-

苯基氨基甲酸甲乙盐(スベレ-ト)：-

m-酒石酸盐：-

D-酒石酸盐：-

L-阿拉柏糖：+

果糖：+

葡萄糖：+

甘露糖：+

麦芽糖：-

木糖：+

蔗糖：-

海藻糖：-

核糖：-

糖精酸盐(サッカレ-ト)：-

羟基丁酸盐：-

苯甲酸盐：-

甘露糖醇：+

葡萄糖酸盐：+

2-酮葡萄糖酸盐：+

N-乙酰基葡糖胺：-

L-丝氨酸：-

L-组氨酸：-

L-缬氨酸：-

(23)主要的呼吸(醌型)：泛醌10

假单胞细菌SP.KNK 505(FERM BP-3182)(a)形态

(1)细胞形状和大小：0.5～0.7×1.2～2.5μm、杆菌

(2)有无细胞的多形性：无

(3)有无运动性：有

(4)有无孢子：无

(5)革兰氏染色性：阴性

(6)菌落的形态：圆形、正规、全面、辉状、半透明、淡黄(b)生理学上的性质

(1)由3％KOH的溶菌：+

(2)氨基肽酶：+

(3)氧化酶：+

(4)过氧化氢酶：+

(5)菌的繁殖

厌氧条件：-

37/40℃ ：+/+

pH5.6 ：-

Mac-Conkey琼脂：-

ss琼脂：-

cetrimid琼脂：-

(6)酸的生成(O-F试验)

葡萄糖需氧条件：-

葡萄糖厌氧条件：-

(7)来自葡萄糖的气体的生成：-

(8)酸的生成(ASS)

葡萄糖：+

果糖：-

木糖：+

(9)ONPG ：-

(10)ADH ：-

(11)ODC ：-

(12)VP ：-

(13)吲哚的生成：-

(14)硝酸盐的还原：-

(15)脱氮反应：-

(16)苯基丙酸脱氨基酶(deaminase)：-

(17)来自蔗糖的左聚糖的生成：-

(18)卵磷酸酶：-

(19)尿素酶：-

(20)加水分解

淀粉：-

明胶：-

酪蛋白：-

DNA ：-

吐温80 ：-

七叶苷：-

(21)酪氨酸的分解：-

(22)各种化合物的同化性

乙酸盐：弱

己二酸盐：-

癸酸盐：-

柠檬酸盐：-

柠康酸盐：-

乙醇酸盐：-

丙醇酸盐：+

乙酰丙醇酸盐：-

苹果酸盐(マレ-ト malate)：-

丙二酸盐(マロネ-ト malonate)：-

中康酸盐(メサコネ-ト mesaconat)：-

苯基乙酸盐：-

辛二酸盐(スペレ-ト)：-

m-酒石酸盐：-

D-酒石酸盐：-

L-阿拉伯糖：+

果糖：+

葡萄糖：+

甘露糖：+

麦芽糖：-

木糖：+

蔗糖：-

海藻糖：-

核糖：-

糖精酸盐：-

羟基丁酸盐：-

苯甲酸盐：-

甘露糖醇：+

葡萄糖酸盐：+

2-酮葡萄糖酸盐：+

N-乙酰基葡糖胺：-

L-丝氨酸：-

L-组氨酸：-

L-缬氨酸：-

(23)主要的呼吸(醌型)泛醌10

从这样的菌株制得有关除去D-N-氨基甲酰-α-氨基酸的氨基甲酰基并转换成对应的D-α-氨基酸的酶的遗传因子时，通常，是根据从微生物的染色体提取遗传因子DNA的操作进行；提取后，得到含有作为目的之遗传因子的DNA片段并对其碱基序列进行剖析。接着进行培养产生除去D-N-氨基甲酰-α-氨基酸的氨基甲酰基并变换成对应的D-α-氨基酸的酶的微生物，以及导入该酶遗传因子的重组微生物，并且要对所产生的酶进行精制，决定该蛋白的分子量的同时，用气相蛋白质定序器等确定氨基末端附近的氨基酸序列。其次，比较这些DNA碱基序列和蛋白质的氨基末端序列，对除去氨基甲酰基的酶蛋白的编码的碱基序列部分的蛋白确定翻译开始部位，并也要考虑确定从该部位到翻译终止密码子的遗传因子的部分内编码酶蛋白与蛋白分子量的关系，从而确定作为目的之遗传因子(Malecular Cloning，A Laboratory Manual，2nd Ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press第4章，第13章)。以此，由土壤杆菌-KNK 712和假单胞菌sp.KNK003A得到了序列表中序列号1和2的DNA片段。使这样得到的该酶编码的遗传因子和/或含它的DNA片段，由于通常在一个氨基酸中对应多个碱基密码子，所以与具有该遗传因子和/或在DNA片段中编码对应的氨基酸序列的其它碱基序列的DNA片段是等价的，这一事实是清楚的。

用于本发明的载体，可以使用质粒，噬菌体及其衍生物，而该质粒，噬菌体及其衍生物是来自于可在属于埃希氏菌属，假单胞菌属，黄杆菌属，芽孢杆菌属，沙雷氏杆菌属，棒状杆菌属和短颈细菌属的细菌的细胞内自律复制的微生物。例如，可以使用「重组DNA实验指南」(科学技术厅研究开发局ラィフサィェンス课编：昭和62年9月6日改订)第55页中记载的宿主-载体系列。另外，为了提高酶的生产量可以使用具有强力的结构助催化剂之类的修饰载体。

含遗传因子的DNA片段和载体DNA的重组体的制作，可以通过在已知的离体重组DNA的技术方法来进行实施。离体DNA重组，通常是采用使含目的之遗传因子的供给体DNA与载体DNA的切断和结合(连接反应)而进行的(例如，可参见特愿昭56-211908号说明书，美国专利第4237224号)。采用连接反应，除了生成目的之重组体DNA外，还会生成多种的重组体DNA，为了选择性地取得目的重组体DNA，可以使用连接

反应液，并将属于埃希氏菌属，假单胞菌属，黄杆菌属，芽孢杆菌属，沙雷氏杆菌属，棒状杆菌属或短颈杆菌属的微生物进行直接转化，选择分离来自目的遗传因子的遗传信息的，已得到遗传物质的转化株，然后由该培养菌体中提取分离。

对于上述菌种不进行直接转化时，例如在大肠杆菌之类的其他微生物的宿主载体系列上一旦进行遗传因子的克隆，接着离体制作同合适的载体的重组体DNA之后，使之上述菌株转化，并且以上述相同的操作，对转化株进行选择分离也可以取得重组体。

为了制备重组体，可以广泛应用下列文献：S.N.Cohen等人，美国专利4,237,224号说明书；遗传因子操作实验法[高木康敬编著，讲谈社サィェラィフィック(1980)]；Method in Enzymology，68，Recombinant DNA[Ray Mv编，AcademicPress(1979)]；特愿昭56-21-1908号说明书等。

通过多种的重组体DNA进行转化的大肠杆菌的情况下，从转化株选择含目的遗传因子，即含有D-N-氨基甲酰-α氨基酸酰胺水解酶的遗传因子并显现该遗传因子的转化株的方法是，首先在含有氨必西林之类的选择标记的片上使之繁殖转化株的菌落。然后，收集含有这些重组体DNA的多种转化株的菌落，并悬浮于生理盐水中，再将该悬浮液接种于以D-N-氨基甲酰-α-氨基酸单独做氮源的液体的基本培养基上。在该培养基上，只可能繁殖可使D-N-氨基甲酰-α-氨基酸同化的转化株，即重新赋予D-N-氨基甲酰-α-氨基酸酰胺水解酶活性的转化株。将这样繁殖的培养液接种到上述基本培养基上，通过反复进行该操作，收集目的转化株。由收集的培养液以常规方法分离菌，并对分离的转化株进行培养，将D-N-氨基甲酰-α氨基酸作为基质进行菌体反应，通过确认D-α-氨基酸生成之事实可以得到含目的遗传因子的转化株。

从这样得到的转化株中，采用碱性变性的方法(参见MolecularCloning A Laboratory，Manual 2nd Ed.Cold Spring HarborLaboratory Press第1章)等的普通方法，提取重组体DNA，并在含有克隆的目的遗传因子之DNA片段中，使用酶的结构遗传因子进行亚克隆培养，再除去不要的DNA，或者构建使之在载体中具有强力助催化剂那样修饰的重组体DNA，并使上述的宿主菌进行转化，以使用所得的转化株，就可以提高目的酶的生产量。

转化株，以在通常的培养基上进行培养就可以显现导入的重组体DNA的物质。在重组体DNA上赋予来自遗传因子的DNA或载体DNA的性质的情况下，只要符合该性质也可以在培养基上补充试剂。

将如此得到的转化株以作为酶源而得到时，可以使用常规的培养基进行培养，而且根据需要还可以通过加入海因化合物，D-N-氨基甲酰-α-氨基酸，异丙基-1-硫代-β-D-半乳糖(IPIG)等和提高温度等，以进行为使酶衍生的处理。

为了培养转化株而使用的培养基，通常可以是含有碳源，氮源和无机离子的普通培养基。其中若加入维生素，氨基酸等有机微量营养成份，获得好结果的情况居多。作为碳源，适宜使用葡萄糖或蔗糖之类的糖类，乙酸之类的有机酸和醇类等。作为氮源，可以使用氨气，氨水和铵盐等。作为无机离子可以使用磷酸离子，镁离子，钾离子和铁离子等。

该培养如果在需氧条件及控制pH4～8，温度25～45℃的适当范围内进行1-10天的培养时，可以得到所希望的结果。

作为产生转化株的酶的作用状态，可以举出该转化株的培养液，菌体，菌体处理物，从菌体提取的酶，固定化菌体等。

作为菌体，培养结束后的培养液的原样，从培养液分离的菌体以及洗净的菌体等均能使用。作为菌体处理物，可以使用冷冻干燥菌体，丙酮干燥菌体、与甲苯或表面活性剂接触的菌体、用溶菌酶处理的菌体、在超声波中处理的菌体和机械磨碎的菌体等，此外还有具有由这些菌体的处理物得到的，除去D-N-氨基甲酰-α-氨基酸的甲酰基并变换成对应的D-α-氨基酸的酶活性的酶提取液，另外还可以使用这些菌体的固定物，菌体处理的不溶物，以及用于固定酶虿白的载体(例如阴离子交换树脂)上固定的固定物等。另外关于固定方法，例如可以参考特开昭63-185382号说明书。

用作固定的载体，适用的有Doulite A 568或DSI7186(ロ-ム·ァンド·ハ-ス社：注册商标)等的苯酚-甲醛阴离子交换树脂，Amberlite IRA 935，IRA 945，IRA 901(ロ-ム·ァンド·ハ-ス社：注册商标)，Lewatatit OC 1037(バィェル社：注册商标)，Diaion EX-05(三菱化成工业：注册商标)等聚苯乙烯树脂之类的各种胺或铵盐或者具有二乙醇胺型的官能基的各种阴离子交换树脂。也可以使用其他的DEAE-纤维素等载体。

另外，为使酶牢固而稳定地吸附，通常可以使用交联剂，适合的例子为戊二醛。所用的酶，不只是精制的酶，还可以使用部分精制酶，菌体破碎液，无细胞提取液等各种精制酶。

固定化酶的调制可以采用在酶液和载体上吸附酶后，使之进行交联处理等通常的调制方法。

成为本发明中的酶反应基质的D-N-氨基甲酰-α-氨基酸，可用通式R-CH(NHCONH₂)-COOH表示，而实际上供反应的状态是在所用的酶为对D-N-氨基甲酰-α-氨基酸具有严格的立体选择性的情况下，可以使用D-体或作为D-体与L-体的混合物。另外，氧也作用于L-氨基甲酰氨基酸而立体选择性不严格的情况或，作为也作用于L-体的酶的混合物而使用的情况下，只使用D-体，并且使生成的α-氨基酸变成D-体那样处理为好。

取代基R，可以为特公昭57-18793号，特公昭63-20520号，特公平1-48758号说明书中所述的广泛范围中的基团。但是尤其是为了赋予药物中间体之类工业上有用的化合物，R最好为苯基，用羟基取代了的苯基、烷基、取代烷基、芳烷基或噻嗯基。用羟基取代的苯基的情况下，该羟基可以为一个或一个以上，并且可以在邻、间、对位上进行取代，而有代表性的是对羟基苯基。烷基是碳原子数1～4的烷基，其对应的氨基酸成为D-丙氨酸，D-缬氨酸，D-亮氨酸、D-异亮氨酸等的基。取代的烷基是，以羟基、硫代烷基、羧基、氨基、苯基、羟基取代的苯基、或以酰胺基等取代的，含碳原子数1～4的烷基，其对应的氨基酸成为D-丝氨酸、D-苏氨酸、D-甲硫氨酸、D-半胱氨酸、D-天门冬酶胺、D-谷氨酰胺、D-酪氨酸、D-色氨酸、D-天冬氨酸、D-谷氨酸、D-组氨酸、D-赖氨酸、D-精氨酸、D-瓜氨酸等的基。芳烷基是碳原子数为7～8的，例如，苄基、苯乙基，其对应的氨基酸成为D-苯基丙氨酸等的基。

作为水性介质，可以使用含有水，缓冲剂乙醇之类有机溶剂的水性介质。另外根据需要，在水性介质中可以添加微生物的生长发育所需要的营养物质，抗氧化剂，表面活性剂，强化酶，羟基氨，金属等。

在水溶性介质中边培养上述微生物的菌体，同时使菌体与D-N-氨基甲酰-α-氨基酸接触而起作用的情况下，可以使用含有D-N-氨基甲酰-α-氨基酸，并含有该微生物的生长发育中所需的碳源，氮源，无机离子等营养物质的水性介质。另外，如果添加维生素，氨基酸等有机微量营养物质，得到好结果的情形较多。作为碳源，适用的有葡萄糖，蔗糖等糖类，乙酸之类的有机酸，醇类等。作为氮源，可以使用氨气，氨水，铵盐等。作为无机离子可以使用磷酸离子，镁离子，钾离子，铁离子等。

在需氧条件下的培养，是控制在pH4～8，温度25～45℃的适当范围内进行。如果进行1～10天的培养，那么D-N-氨基苯甲酰-α-氨基酸以高产率地只变换成D-α-氨基酸。

对此，将上述微生物的培养液，在溶解或悬浮D-N-氨基甲酰-α-氨基酸的水性介质中，直接与培养菌体，菌体处理物，酶提取液，固定化菌体，菌体不溶物，或固定化酶蛋白进行反应的情况下，调节适当温度10～80℃，pH值保持在4～9.5，暂时静置或搅拌就可以。如此经过5～100小时，则在水性介质中生成大量的D-α-氨基酸，并聚积。另外，随着反应的进行，也可以分开添加D-N-氨基甲酰-α-氨基酸。所生成的D-α-氨基酸，可以采用常规方法进行分离和精制。

另外，其中得到的D-α-氨基酸，可以用通式：R-CHNH₂-COOH(R的定义同前)表示。

实施例

下面展示本发明的具体实施方案。并且采用高速液相色谱法(HPLC)或薄层色谱法(TLC)检测并定量分析了生成的D-α-氨基酸。实施例1

土壤杆菌-KNK 712(FERM BP-1900)的染色体DNA和载体DNA的重组体DNA的构建：-

将土壤杆菌KNK 712(FERM BP-1900)用2升的L-液体培养基(胨10克/升，酵母提取液5克/升，氯化钠5克/升；pH7.0)于33℃培养27小时后，收集菌体，得到20克菌体。根据Marmur法从得到的菌体中提取染色体DNA。在该染色体250μg中添加2单位的Sau 3AI，使之在37℃反应30分钟进行部分分解。用琼脂糖凝胶电泳从部分分解DNA中得到4～9kbp的DNA片段。另一方面，用BamHI完全切断质粒pUC18，并将其通过T4DNA连接酶与来自如前得到的染色体的DNA片段相连接，得到多种的重组体质粒的混合液。

实施例2

含有来自于土壤杆菌KNK 712(FERM BP-1900)的，含有使D-N-氨基甲酰-α氨基酸变换成对应的D-α-氨基酸而有关的遗传因子的质粒的选出：-

使用实施例1的质粒混合液，通过常规方法使大肠杆菌(Escherichia coli)JM109进行转化。然后将其在含有选择标识的氨必西林的表1的培养基上进行平皿培养。

表1

细菌培养基用胨 1克

酵母提取液 0.5克

氯化钠 0.5克

氨必西林 100毫克

琼脂 15克

加水使之作成1升(pH7.0)

收集繁殖的菌落，将其接种到以D-N-氨基甲酰-丙氨酸作为单一氮源的表2的液体培养基上进行培养。

表2

Na₂HPO₄ 6克

KH₂PO₄ 3克

NaCl 0.5克

MgSO₄ 0.12克

CaCl₂ 11毫克

葡萄糖 2克

氨必西林 50毫克

硫氨素 1毫克

D-N-氨基甲酰-丙氨酸 1克

加水使之作成1升(pH7.0)

在此，只是显现目的遗传因子的转化株在表2的培养基中将D-N-氨基甲酰-丙氨酸作为N源进行同化，并可以繁殖。将用表2的培养基繁殖的培养液接种于相同的培养基上，以反复进行该操作，累积目的转化株。从该累积培养液，用表1的培养基进行转化株的纯分离。将该纯分离菌接种到含有100毫克/升氨必西林的10毫升L-液体培养基(胨10克/升，酵母提取液5克/升，氯化钠5克/升；pH7.0)上，在37℃培养16小时之后，对1毫升培养液采菌，取除上清液，于0.5毫升的基质溶液(0.5％D-N-氨基甲酰-对羟基苯基甘氨酸，0.05％Triton X-100、0.1M磷酸缓冲液(以下称做KPB)；pH7.0)中使菌体悬浮，在37℃反应3小时。将该反应液点滴到TLC中，展开之后，用(水合)茚三酮显色时，表示与标准样一致的D-对羟基苯基甘氨酸的噬菌斑。由以上操作可以确认纯分离的转化株含有目的酶的遗传因子的质粒。该株含有的质粒作为pAHD101。

下面通过碱变性法由上述转化株大量调制pAHD101，经测定，表明具有图1所示的结构。

用pAHD101转化的大肠杆菌 JM109，得到大肠杆菌JM109pAHD101。实施例3

来自假单胞杆菌(Pseudomonas)sp.KNK 003A(FERM BP-3181)的，含有使D-N-氨基甲酰-α-氨基酸变换成对应的D-α-氨基酸而有关的遗传因子的质粒的选出：-

用实施例1同样的方法，得到假单胞杆菌sp.KNK 003A(FERM BP-3181)的染色体DNA片段和质粒pUC18的，多种的重组体质粒混合液，使用该混合液，通过常规方法对大肠杆菌JM 109进行转化。由该多种转化株，除了用含100毫克/升IPTG的表2的液体培养基代替原来2的液体培养基外，其他按实施例2相同的方法，得到含有质粒的转化株，该质粒含有将D-N-氨基甲酰-α-氨基酸向对应的D-α-氨基酸变换的有关酶的遗传因子。将该株含有的质粒命名为pPHD301。

然后由上述转化株大量调制pPHD301，经测定表明具有图2所示的结构。

用pPHD301转化的大肠杆菌JM109，得到大肠杆菌JM109 pPHD301。实施例4

pPHD101的亚克隆：-.

将实施例2得到的pAHD101用Sma I和EcoR I完全分解，通过琼脂糖凝胶电泳得到2.7kbp的Sma I-EcoR I片段。此外，将质粒pUC19用Sma I和EcoR I完全分解，再通过连接酶将pAHD101的Sma I-EcoR I片段和T4DNA进行连接，并以该已连接的质粒将大肠杆菌JM109进行转化，并将转化株放在含异丙基-1-硫代-β-D-半乳糖(IPTG)、5-氯-4-溴-3-吲哚-β-D-半乳糖(XgaI)和氨必西林的L-培养基(1％的胨，0.5％酵母提取液，0.5％氯化钠，1.5％琼脂；pH7.0)上进行培养。

其中，由于在pUC19上含pAHD101的Sma I-EcoR I片段的质粒不呈青色，而成为白色菌落，则选择白色菌落。为了确认该选择的菌具有目的之酶活性，将其接种在合有100毫克/升氨必西林的10毫升L-液体培养基(1％胨，0.5％酵母提取液，0.5％氯化钠)上，采菌培养后的培养液1毫升，取除上清液，将菌体悬浮于0.5毫升的基质溶液(0.5％D-N-氨基甲酰-对羟基苯基甘氨酸、0.05％Triton X-100、0.1M磷酸缓冲液；pH7.0)中，在37℃进行反应3小时。将该反应液在TLC上点滴，展开后用水合茚三酮进行显色时，表示与标准一致的D-对羟基苯基甘氨酸的噬菌斑。将含有该转化株的质粒命名为pAD107。

下面调制质粒pAD107，并用Sal I部分加水分解，通过琼脂糖凝胶电泳得到含有pUC19部分的4.5kbp的片段。使用T4DNA连接酶使该片段环状化，使用该质粒大肠杆菌JM109进行转化。从含有氨必西林的L-培养基上取得转化株，采用与上述同样方法进行菌体反应，获得具有使D-N-氨基甲酰-对羟基苯基甘氨酸转变成D-对羟基苯基甘氨酸能力的转化株。将含有该转化株的质粒命名为pAD108。。

再由上述转化株调制pAD108，经测定，表明具有图3所示的结构。

用pAD108转化的大肠杆菌 JM109，称做大肠杆菌JM109pAD108。微生物工程研究之寄存编号为FERM BP-3184。实施例5

pPHD301的亚克隆；-

对实施例3得到的pPHD301用Acc I进行完全分解，再通过琼脂糖凝胶电泳得到含pUC18部分的5.2kbp的片段。用T4DNA连接酶使该片段进行环状化，用该质粒对大肠杆菌JM109进行转化。从含有氨必西林的L-培养基上取得转化株，按实施例4相同的方法进行菌体反应，以便获得转化株，该转化株具有液D-N-氨基甲酰-对羟基苯基甘氨酸变换成D-对羟基苯基甘氨酸的能力。将含有该转化株的质粒称作pPD302。

下面调制质粒pPD302，用Sph I和Acc I进行完全分解之后，通过琼脂糖凝胶电泳，得到1.8kbp的Sph I-Acc I片段。另外，用Sph I和Acc I对质粒pUC19进行完全分解，通过T4DNA连接酶与pPD302的Sph I-Acc I片段连接，并用该连接了的质粒对大肠杆菌进行转化。从含有氨必西林的L-培养基上取得转化株，并按实施例4相同方法进行菌体反应，得到具有使D-N-氨基甲酰-对羟基苯基甘氨酸变换成D-对羟基苯基甘氨酸能力的转化株，将该转化株的质粒称做pPD304。由上述转化株调制pPD304，经测定时，表明具有图4所示的结构。

用pPD304转化了的大肠杆菌JM109称做为大肠杆菌JM109pPD304。微工研寄存编号为FERM BP-3183。实施例6

通过由转化株得到的酶使D-N-氨基甲酰-α-氨基酸变换成D-α-氨基酸：-

用实施例4得到的质粒pAD108，使大肠杆菌进行转化。将该株用含有氨必西林100μg/ml和IPTG 100μg/ml的L-液体培养基于37℃培养16小时。由100ml该培养液收集菌体，并于0.1M KPB(pH7.0)中进行悬浮使之成为10ml。将其于冰冷条件下经超声波粉碎之后，进行离心分离，将上清液作为粗酶液而获得。用该粗酶液使之以表3所示的各种D-N-氨基甲酰-α-氨基酸作为底物进行反应。反应是将上述粗酶液100μl加到40mMD-N-氨基甲酰-α-氨基酸(表3)，0.2MKPB(pH7.0)2ml中并于40℃进行20分钟，并将生成的D-α-氨基酸用HPLC进行定量。其结果示于表3中。另外，这对的JM109pAD108的D-N-氨基甲酰-α-氨基酸酰胺水解酶的比活性提高了土壤杆菌KNK712(FERM BP-1900)的粗酶液的10倍。实施例7

通过由转化株得到的酶使D-N-氨基甲酰-α-氨基酸转化为D-α-氨基酸：-

使用按实施例5得到的质粒pPD304，使大肠杆菌JM109进行转化。按实施例6相同的方法由该株得到粗酶液。使用该粗酶液按实施例6相同的方法进行反应。该结果示于表3中。另外，这时的JM109pPD304的D-N-氨基甲酰-α-氨基酸酰胺水介酶的比活性提高假单胞杆菌(pseudomonas)sp.KNK003A(FERM BP-3181)的粗酶液的40倍。实施例8

通过由转化株得到的酶使D-N-氨基甲酰-对羟基苯基甘氨酸转化为D-对羟基苯基甘氨酸：-

使用按实施例4得到的质粒pAD108使大肠杆菌 JM109进行转化。按实施例6的相同方法对该株进行培养。由100毫升培养液进行收集菌体，用0.1M KPB(pH7.0)洗净之后再悬浮于100毫升之5％D-N-氨基甲酰-对羟基苯基甘氨酸、0.05％Triton X-100、0.1M KPB(Hp7.0)中之后，于40℃下搅拌20分钟并进行反应。将这样得到的反应液在6000转/分下离心10分钟除去菌体，在浓盐酸中使pH下降到2.7并使其吸附在阳离子交换树脂IR-120B(H⁺型)上，再用5％ NH+OH溶出。然后，用IRC-84(H⁺型)脱盐，并以AF树脂脱色。再将该脱色液浓缩结晶析出，由水进行重结晶得到3.8克白色粉末。该结晶的比旋光度为[α]_D ²⁰＝-158(C＝1，1N的HCl中)，并在TLC上给予点滴，其IR与标准样D-对羟基苯基甘氨酸是一致的。实施例9

固定化D-N-氨基甲酰-α-氨基酸酰胺水解酶的调制：-

对于按实施例6相同方法得到的大肠杆菌JM109的pAD108的转化株的培养液20D毫升收集菌之后，用0.1MKPB(pH7.0)洗净，并悬浮于20毫升的0.1M KPB(pH7.0)中，通过超声波进行菌体的破碎。将该菌体破碎液于12000转/分下离心20分钟，上清液作为粗酶液被得到。在该粗酶液中加入2克用0.1M KPB(pH7.0)平衡化了的阴离子交换树脂Duolite A-568，并于4℃下搅拌15小时，使酶被吸附。该液中加入戊二醛使其最终浓度成为0.1％，搅拌1小时，进行交联处理后，过滤收集树脂，并用0.1M的KPB洗净，得到2克固定化D-N-氨基甲酰-α-氨基酸酰胺水解酶。实施例10

通过固定化酶使D-N-氨基甲酰-对羟基苯基甘氨酸转化为D-对羟基苯基甘氨酸：-

将按实施例9得到的固定化D-N-氨基甲酰-α-氨基酸酰胺水解酶2克加入到100毫升之2％D-N-氨基甲酰-对羟基苯基甘氨酸、0.1M kpb(pH7.0)中，一面用1N的HCl保持pH为7.0，一面于40℃下搅拌20小时并进行反应：反应后静置，抽吸反应液后，按实施例8相同的方法精制生成的氨基酸，得到1.5克D-对羟基苯基甘氨酸。

表3

反应底物生成氨基酸氨基酸生成量

(毫摩尔/升)

JM109 JM109 JM109

pAD108 pPD304D-N-氨基甲酰-对 D-对羟基苯基甘 9.5 0.14 0羟基苯基甘氨酸氨酸D-N-氨基甲酰-对 D-苯基甘氨酸 9.7 0.06 0羟基苯基甘氨酸D-N-氨基甲酰高苯 D-高苯基丙氨酸 3.9 0.78 0基丙氨酸D-N-氨基甲酰苯基 D-苯基丙氨酸 4.2 0.98 0丙氨酸D-N-氨基甲酰亮氨 D-亮氨酸 6.4 1.37 0酸D-N-氨基甲酰缬 D-缬氨酸 6.6 0.98 0氨酸D-N-氨基甲酰 D-丙氨酸 7.0 1.56 0丙氨酸实施例11

使来自土壤杆菌KNK712(FERM BP-1900)的D-N-氨基甲酰-α-氨基酸转化为对应的D-α-氨基酸的酶的遗传因子的DNA碱基序列的剖析：

用限制性酶EcoR I和Hind III(宝酒造制)将含有来自土壤杆菌KNK 712(FERM BP-1900)的D-N-氨基甲酰-α-氨基酸酰胺水解酶(以下称酰胺水解酶)的遗传因子的质粒pAD108切断，通过琼脂糖凝胶电泳分离，调制1.8kb的DNA片段。再用各种限制性酶切断该片段，并使用T4-DNA连接酶(宝酒造制)连接在M13mp18或M13mp19上，使之在大肠杆菌JM109中转染并得到噬菌斑。将该单一噬菌斑接种到1.5毫升的已接种1％JM109的2YT培养基(16克/升细菌胰蛋白胨(Difco社)、10克/升酵母提取液(Difco社)、5克/升NaCl)上，于37℃振动培养5小时。离心分离后，往上清液中加入20％的聚乙二醇6000和25M NaCl溶液200微升，于室温下放置15分钟后，以沉淀回收噬菌体粒子。将其溶于100微升TE溶液[10mM Tris HCl(pH8.0)、1mM EDTA]中，用50微升苯酚(用TE溶液饱和)提取后，添加10微升3M乙酸钠溶液和250微升乙醇，于-20℃下放置一夜，并进行离心分离。将沉淀干燥之后，溶于50微升TE溶液中。用其7微升，通过使用SEQU ENASE(注册商标)Ver.2的DNA定序装置(United States Biochemical Corp.制)并根据其使用说明书进行反应和电泳、自动射线照相。然后从该结果确定序列表序列编号1中所示的KNK 712株的酰胺水解酶遗传因子的DNA碱基序列。实施例12

将来自假单胞杆菌sp.KNK 003A(FERM BP-3181)的D-N-氨基甲酰-α-氨基酸转化为对应的D-α-氨基酸的酶的遗传因子的DNA碱基序列剖析：

用限制性酶BamH I以及Hind III(宝酒造制)切断含有来自KNK 003A的酰胺水解酶遗传因子的质粒pPD304，通过琼脂糖凝胶电泳，分离调制1.8kb的DNA片段。再用各种限制性酶切断该片段，并用T4-DNA连接酶(宝酒造制)在M13mp18或M13mp19中进行连接，使之在大肠杆菌JM109中转染以得到噬菌斑。将该单一噬菌斑接种于1.5毫升的已接种1％JM109的2YT培养基(16克/升细菌胰蛋白胨(Difco社)、10克/升酵母提取液(Difco社)、5克/升NaCl)上，于37℃下振荡培养5小时。离心分离后，往上清液中添加20％聚乙二醇6000和25M NaCl溶液200微升，于室温下放置15分钟后，离心分离并将噬菌体粒子作为沉淀而回收。将其溶于100微升TE溶液[10mM Tris HCl(pH8.0)、1mM EDTA]中，用50微升苯酚(以TE溶液饱和)提取后，加入10微升3M乙酸钠溶液和250微升乙醇，于-20℃下放置一夜，进行离心分离。将沉淀干燥后，再溶解于50微升TE溶液中。用其7微升，通过使用SEQUENASE(注册商标)ver.2的DNA定序装置(United States Biochemical Corp.制)，遵照其使用说明书进行反应和电泳，自动射线照相。然后从该结果确定序列表序列号2中所示的，来自KNK003A株的酰胺水解酶遗传因子的DNA碱基序列。实施例13

来自土壤杆菌KNK 712(FERM BP-1900)的，D-N-氨基甲酰-α-酰胺水解酶的精制：-

将KNK 712(FERM BP-1900)在表4中所示的培养基上于33℃下培养25小时。

表4

甘油 25克

蔗糖 5克

KH₂PO₄ 5克

Na₂HPO₄ 5克

Mg₃O₄·7H₂O 1克

MnCl₂·4H₂O 10毫克

酵母提出物 4克

尿素 2克

D-N -氨基甲酰-对- 1克

羟基苯基甘氨酸

加水使之成为1升。(pH6.5)

集菌该培养液21升，通过超声波粉碎菌体，将残渣用离心除去后，通过硫酸鱼精蛋白处理(0.1毫克/毫克蛋白)进行除核酸。然后将离心的上层清液于50℃下进行20分钟的热处理，除去沉淀之后，添加硫酸铵使蛋白沉淀，用具有活性的15％到35％饱和硫酸铵以回收沉淀的蛋白的所要部分。将该所要的部分溶解，进行DEAE-5pw柱子(柬ソ-社制)的HPLC，通过NaCl的浓度梯度进行溶出，回收所要的活性部分。在这个阶段里与菌体粉碎液进行比较，酰胺水解酶的比活性大约增加20倍。通过SDS-聚丙烯酰胺电泳进行分析时，该酰胺水解酶在分子量大约为35000附近泳动。实施例14

来自土壤杆菌KNK 712(FERM BP-1900)的D-N-氨基甲酰-α-氨基酸酰胺水解酶的蛋白氨基末端的氨基酸序列的确定：-

将按实施例13得到的土壤杆菌KNK 712(FERM)BP-1900)生产的酰胺水解酶精制标准样装入逆相HPLC柱子(AP-303；YMC社制)中，通过乙腈的浓度梯度使之溶出。将含有该酰胺水解酶的所要部分装入气相蛋白质定序器(ァプラィド·バィオシステムバ社制)，进行剖析时表明，酰胺水解酶是在氨基末端具有序列表序列号1的氨基酸编号1到20的序列的蛋白质。实施例15

来自假单胞杆菌sp.KNK 003A(FERM BP-3181)的D-N-氨基甲酰-α-氨基酸酰胺水解酶的精制：-

将假单胞杆菌sp.KNK 003A(FERM BP-3181)于表5所示的培养基上并在45℃下培养3天。

表5

甘油 10克

葡萄糖 5克

KH₂PO₄ 3.5克

Na₂HPO₄ 3.5克

MgSO₄·7H₂O 0.5克

MnCl₂·4H₂O 20毫克

FeSO₄ 10毫克

CaCO₃ 1克

肉提取物 2克

酵母提取物 2克

细菌培养基用胨 2克

D-N-氨基甲酰·丙 1克

氨酸

加水使之成为1升。(pH7.0)

集菌该培养液26升，按实施例13所示的相同方法通过超声波粉碎菌体，通过硫酸鱼精蛋白处理除核酸、热处理(65℃，20分钟)、通过硫酸铵沉淀的部分(分离具有由于50％到70％饱和硫酸铵沉淀的酰胺水解酶活性的蛋白质部分)进行使用DEAE-5pw柱子的HPLC。将该活性部分吸附到生物凝胶HT(ハィオラツドラボラリト-ズ社制)柱子上，通过硫酸铵的浓度梯度使之溶出，将活性部分浓缩并通过Sephacryl s-300(ファルシァ·L K B·バィオテクノロジ-社制)柱子进行凝胶过滤。

接着，进行等电点电泳时(pH4至6.5)，该酰胺水解酶可在pH5.7附近泳动，所以可切出表示该活性的区域部分的凝胶，再从其中提取蛋白质。在这阶段里与菌体粉碎液进行比较，酰胺水解酶的比活性大约增加100倍。将该试样通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分析时，酰胺水解酶可在分子量大约38000附近泳动。另外将该试样通过Sephacryl s-200柱子进行凝胶过滤时，于分子量大约为67000处的位置被溶出。实施例16

来自假单胞杆菌sp.KNK003A(FERM BP-3181)D-N-氨基甲酰-α-氨基酸酰胺水解酶的蛋白质氨基末端的氨基酸序列的确定：-

将按实施例15得到的假单胞杆菌sp.KNK003A(FERM BP-3181)的酰胺水解酶精制标准样装入逆相HPLC柱子中，通过乙腈的浓度梯度进行溶出。将含有酰胺水解酶的所要部分装入气相蛋白质定序器并进行剖析时表明，酰胺水解酶是在氨基末端具有序列表序列编号2的氨基编号1到20的序列的蛋白质。实施例17

重组大肠杆菌制作的D-N-氨基甲酰-α-氨基酸酰胺水解酶的精制：-

将按实施例4得到的大肠杆菌JM109·pAD108和按实施例5得到的大肠杆菌JM109·pPD304，按实施例6中所示方法进行培养。通过离心从培养液收集菌体，通过超声波对菌体进行粉碎，除残渣后，再以SDS-聚丙烯酰胺电泳对这些粗酶液进行分析。在大肠杆菌JM109·pAD108的培养菌体破碎液中酰胺水解酶在分子量大约35000的位置处泳动，而在染色后的用比重计的剖析中，完全可溶性菌体蛋白质的大约50％为由酰胺水解酶所占有。另外，大肠杆菌JM109·pPD304培养菌体破碎液中酰胺水解酶在分子量约38000的位置泳动而在染色后的以比重计的剖析中，完全可溶性菌体蛋白质的大约15％由酰胺水解酶所占有。实施例18

重组大肠杆菌制作的 D-N-氨基甲酰-α-氨基酸酰胺水解酶的蛋白质氨基末端序列的确定：-

将按实施例17获得的大肠杆菌JM109·pAD108的培养菌体破碎液于50℃下加热处理30分钟，通过离心除沉淀后，添加硫酸铵使之成为30％的饱和状态，使蛋白质沉淀。通过离心分离沉淀的蛋白质，并溶解于脱离子水中后，用NAP-10柱子(ファルシァ·L K B·バィオテクノロジ-社制)进行脱盐，装入气相蛋白质定序器中。该结果表明，序列表序列编号1的氨基酸编号从1到16的序列和在该序列的前面于各个氨基末端具有附加一个甲硫氨酸残基的序列的蛋白质均以等量混合在一起的。

如上述内容很清楚，本发明是应用遗传因子重组技术，有可能从D-N-氨基甲酰-α-氨基酸类高效率地生产D-α-氨基酸类的发明。

附图的简单说明

图1表示用按本发明得到的质粒pAHD101的限制性酶的切断平面图。

图2表示用按本发明得到的质粒pPHD301的限制性酶的切断平面图。

图3表示用按本发明得到的质粒pAD108的限制性酶的切断平面图。

图4表示用按本发明得到的质粒pPD304的限制性酶的切断平面图。

大肠杆菌(Esherichia coli)JM109/pAD108(FERM BP-3184)和大肠杆菌(Esherichia coli)JM109/pPD304(FERM BP-3183)已于1991年12月6日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏号分别为：CCTCC NO：M91095和CCTCC NO：M91096。

序列表

序列编号：1

序列的长度：1785

序列的型；核酸

链数：二条链

局部结构解析：直链状

序列的种类：基因组DNA

起源

生物名：土壤杆菌

株名：KNK 712(FERM BP-1900)GTCGACGGCG GGCTCGCGCG AGAGCTTGTC AAGCAGCGCA AATTCCGGTT CCGCTCCGGT 60TGACAGATCA AAAATTTTAC GCCTGTTATT GTCGTGCTGC ATGTAATATT TCGTACTTTA 120TGTAGAATTT GCATTGCGCC GCGAGTCACA AAGCCGGTTT TCGGCGATGT GTTTCACAAC 180GTTTTCCCGG CCGCTGGGCC GGACATCACC TAGGAAGGAG CAGAGGTTCA TG ACA CGT 238

Thr Arg

1CAG ATG ATA CTT GCA GTG GGA CAA CAA GGT CCG ATC GCG CGC GCG GAG 286Gln Met Ile Leu Ala Val Gly Gln Gln Gly Pro Ile Ala Arg Ala Glu

5 10 15ACA CGC GAA CAG GTC GTC GTT CGT CTT CTC GAC ATG CTG ACG AAA GCC 334Thr Arg Glu Gln Val Val Val Arg Leu Leu Asp Met Leu Thr Lys Ala

20 25 30GCG AGC CGG GGC GCG AAT TTC ATT GTC TTC CCC GAA CTC GCG CTT ACG 382Ala Ser Arg Gly Ala Asn Phe Ile Val Phe Pro Glu Leu Ala Leu Thr35 40 45 50ACC TTC TTC CCG CGC TGG CAT TTC ACC GAC GAG GCC GAG CTC GAT AGC 430Thr Phe Phe Pro Arg Trp His Phe Thr Asp Glu Ala Glu Leu Asp Ser

55 60 65TTC TAT GAG ACC GAA ATG CCC GGC CCG GTG GTC CGT CCA CTC TTT GAG 478Phe Tyr Glu Thr Glu Met Pro Gly Pro Val Val Arg Pro Leu Phe Glu

70 75 80AAG GCC GCG GAA CTC GGG ATC GGC TTC AAT CTG GGC TAC GCT GAA CTC 526Lys Ala Ala Glu Leu Gly Ile Gly Phe Asn Leu Gly Tyr Ala Glu Leu

85 90 95GTC GTC GAA GGC GGC GTC AAG CGT CGC TTC AAC ACG TCC ATT TTG GTG 574Val Val Glu Gly Gly Val Lys Arg Arg Phe Asn Thr Ser Ile Leu Val

100 105 110GAT AAG TCA GGC AAG ATC GTC GGC AAG TAT CGT AAG ATC CAT TTG CCG 622Asp Lys Ser Gly Lys Ile Val Gly Lys Tyr Arg Lys Ile His Leu Pro115 120 125 130GGT CAC AAG GAG TAC GAG GCC TAC CGG CCG TTC CAG CAT CTT GAA AAG 670Gly His Lys Glu Tyr Glu Ala Tyr Arg Pro Phe Gln His Leu Glu Lys

135 140 145CGT TAT TTC GAG CCG GGC GAT CTC GGC TTC CCG GTC TAT GAC GTC GAC 718Arg Tyr Phe Glu Pro Gly Asp Leu Gly Phe Pro Val Tyr Asp Val Asp

150 155 160GCC GCG AAA ATG GGG ATG TTC ATC TGC AAC GAT CGC CGC TGG CCT GAA 766Ala Ala Lys Met Gly Met Phe Ile Cys Asn Asp Arg Arg Trp Pro Glu

165 170 175GCC TGG CGG GTG ATG GGC CTC AGG GGC GCC GAG ATC ATC TGC GGC GGC 814Ala Trp Arg Val Met Gly Leu Arg Gly Ala Glu Ile Ile Cys Gly Gly

180 185 190TAC AAC ACG CCG ACC CAC AAT CCC CCT GTT CCC CAG CAC GAC CAC CTG 862Tyr Asn Thr Pro Thr His Asn Pro Pro Val Pro Gln His Asp His Leu195 200 205 210ACG TCC TTC CAC CAT CTC CTA TCG ATG CAG GCC GGG TCT TAT CAG AAC 910Thr Ser Phe His His Leu Leu Ser Met Gln Ala Gly Ser Tyr Gln Asn

215 220 225GGG GCC TGG TCC GCG GCC GCG GGC AAG GTG GGC ATG GAG GAG AAC TGC 958Gly Ala Trp Ser Ala Ala Ala Gly Lys Val Gly Met Glu Glu Asn Cys

230 235 240ATG CTG CTC GGC CAC TCC TGC ATC GTG GCG CCG ACC GGG GAA ATC GTC 1006Met Leu Leu Gly His Ser Cys Ile Val Ala Pro Thr Gly Glu Ile Val

245 250 255GCT CTC ACT ACG ACG CTG GAA GAC GAG GTG ATC ACC GCC GCC GTC GAT 1054Ala Leu Thr Thr Thr Leu Glu Asp Glu Val Ile Thr Ala Ala Val Asp

260 265 270CTC GAT CGC TGC CGG GAA CTG CGT GAA CAC ATC TTC AAC TTC AAG CAG 1102Leu Asp Arg Cys Arg Glu Leu Arg Glu His Ile Phe Asn Phe Lys Gln275 280 285 290CAT CGT CAG CCC CAG CAC TAT GGT CTG ATC GCG GAA CTC 1141His Arg Gln Pro Gln His Tyr Gly Leu Ile Ala Glu Leu

295 300TGAGGTTGCC GAAAAGCATG TGTGTCGTTG TTCTCGGCGC CTGGGTCACA TCCAGGCGCG 1201CCAGGGTGAC GCTGGTGGAA TAGTACCACG ACCGCTTCAG GGCGATCCGC AAGGAGATGC 1261GGGTCGCCGG AGCGGCAAAG CCCGACATTC GTTTCGCACC GACGGCCGTC GTGAACTCGA 1321CAGTCCGCGA GAAGGGCGTA TTGCGCGGCC TGGACCTGTA CGTGGAACTG TAGCCCATAT 1381ATAGATTTCC AAAGAGTTTC GGCGAGGCGC GGCGCGCCTA GCCCCATGTG AGCGAGAACC 1441GTGCCCAGAT CAAAGAATGA GACCGACGCG CCGGCCGCGG CAAAGGATGA TCCTCAGGGT 1501CGGATCTATC GCTCCGCCCT GAAGCAGGAG GGCGCACGCT GGCTGCTGAC GGCGGAGGAA 1561GGGTTGCTGG CAAAGCCCAA GCCGCCCGGC CTTGTTCCGG CACTTGAGAA TGCGATCGCC 1621ATCGTCGATT ACATCAACGG TACACCGCCC CATATCGCGT CCCTGGCGGA GCTTTCAACG 1681ACGCTCGGGA TATCCAAGAG CCACTGTCAC TCCATCCTCA AGACGCTGAC GCATTTCGGC 1741TGGCTGAAAT TCGACAATCG CTCAAAGAGC TACGAGCTGA ATTC 1785

序列编号：2

序列的长度：1820

序列的类型：核酸

链的数量：两条链

局部结构解析：直链状

序列的种类：基因组DNA

起源

生物名称：假单胞细菌sp.

株名：KNK003A(FERM BP-3181)GCATGCGCGG GGAACTGAAG AACTTGCAAG ACGAACTCGG CATTACCTTC GTGCATGTAA 60CCCATACCCA GCCTGAGGCG ATCGCGCTCG CCGACATGGT GGTTGTGATG GATACGGGCC 120GCATAGAGCA GGCAGCGAGC GCCAACGAAA TCTACAACCG GCCCGCGACG CCCTATGTGG 180CGCGCTTCAT GGGCGGCCAA AACGTGTTGA CGGGGAGGGT GGAGAGCATC TCGCCCACCG 240GCATGGTGCT GAAAAGCGAA AAGGGCGAGA TCTTCAATGC GCCTCTTACG GGTGCTGCGC 300CGAAGCTGGG CGAACCCGTA TCGATATCCA TGCGCCGCGA CCGCATCAGC ATCAGCAAGC 360CGCAAAACGG CAAGGGCGCG CAGCAGGCTG ACGCGGTAAC GGGTGTGGTC GATTCCACGG 420AATACCAGGG CAGCTTCGTG AAGGTCAGCA TAGTGCTCGA CGGTGGCGAG ACCTTCGTCG 480CAAACATGCC CGACCATGAA TTTTTCGCGG AACCGGTGGA TCACGGCGTC CCGGTGGTCG 540CCCGCTGGAA ACCGGAGCAT GTGCATGTCC TGTCCAAGTC TGACCGGGGC GCCGACCACA 600CCGAAATCTA CCGCTTCCCT GCAGGCGAAA ATACCGTTTC AATGGGCAAG GGGCGGCAAA 660CGGGGTTGAG ACGACCCGGT TTATCGAGGA GGACGAGATG ACA CGC ATC GTC AAT 715

Thr Arg Ile Val Asn

1 5GCA GCC GCC GCG CAG ATG GGG CCC ATC AGC CGG TCC GAA ACG CGC AAG 763Ala Ala Ala Ala Gln Met Gly Pro Ile Ser Arg Ser Glu Thr Arg Lys

10 15 20GAT ACG GTC CGG CGC CTG ATC GCG CTC ATG CGC GAG GCG AAG GCC CGC 811Asp Thr Val Arg Arg Leu Ile Ala Leu Met Arg Glu Ala Lys Ala Arg

25 30 35GGT TCC GAC CTT GTC GTC TTT ACC GAA CTC GCG CTC ACC ACC TTC TTT 859Gly Ser Asp Leu Val Val Phe Thr Glu Leu Ala Leu Thr Thr Phe Phe

40 45 50CCC CGC TGG GTG ATC GAG GAC GAA GCT GAG CTC GAC AGC TTC TAC GAG 907Pro Arg Trp Val Ile Glu Asp Glu Ala Glu Leu Asp Ser Phe Tyr Glu

55 60 65AAG GAG ATG CCA GGG CCC GAA ACC CAG CCG CTC TTC GAT GAG GCG AAG 955Lys Glu Met Pro Gly Pro Glu Thr Gln Pro Leu Phe Asp Glu Ala Lys70 75 80 85CGC TTG GAG ATC GGC TTC TAT CTC GGT TAT GCC GAG CTG GCG GAG GAG 1003Arg Leu Glu Ile Gly Phe Tyr Leu Gly Tyr Ala Glu Leu Ala Glu Glu

90 95 100GGC GGC AGG AAG CGG CGC TTC AAC ACC TCT ATC CTT GTG GAC CGC AGC 1051Gly Gly Arg Lys Arg Arg Phe Asn Thr Ser Ile Leu Val Asp Arg Ser

105 110 115GGC CGG ATC GTC GGC AAG TAC CGC AAG GTG CAC CTG CCC GGG CAC AAA 1099Gly Arg Ile Val Gly Lys Tyr Arg Lys Val His Leu Pro Gly His Lys

120 125 130GAG CCG CAG CCC GGC AGG AAA CAC CAG CAT CTC GAG AAA CGC TAT TTC 1147Glu Pro Gln Pro Gly Arg Lys His Gln His Leu Glu Lys Arg Tyr Phe

135 140 145GAG CCC GGC GAT CTC GGC TTC GGT GTC TGG CGC GCC TTC GAC GGC GTA 1195Glu Pro Gly Asp Leu Gly Phe Gly Val Trp Arg Ala Phe Asp Gly Val150 155 200 205ATG GGC ATG TGC ATT TGC AAC GAC CGC CGC TGG CCG GAG ACC TAC CGG 1243Met Gly Met Cys Ile Cys Asn Asp Arg Arg Trp Pro Glu Thr Tyr Arg

210 215 220GTC ATG GGC TTG CAG GGA GTG GAG ATG GTC ATG CTG GGC TAC AAC ACG 1291Val Met Gly Leu Gln Gly Val Glu Met Val Met Leu Gly Tyr Asn Thr

225 230 235CCG TAT GAC CAT ACC GGT CAC GAC GAC ATC GAT TCA CTC ACC CAG TTT 1339Pro Tyr Asp His Thr Gly His Asp Asp Ile Asp Ser Leu Thr Gln Phe

240 245 250CAC AAT CAT CTC TCC ATG CAG GCG GGC GCC TAC CAG AAT TCG ACC TGG 1387His Asn His Leu Ser Met Gln Ala Gly Ala Tyr Gln Asn Ser Thr Trp

255 260 265GTG ATC GGC ACC GCC AAA TGC GGC ACC GAG GAG GGC TCC AAA ATG GTG 1435Val Ile Gly Thr Ala Lys Cys Gly Thr Glu Glu Gly Ser Lys Met Val270 275 280 285GGG CAG AGC GTG ATC GTT GCG CCC TCC GGC GAG ATC GTC GCT ATG GCC 1483Gly Gln Ser Val Ile Val Ala Pro Ser Gly Glu Ile Val Ala Met Ala

290 295 300TGC ACG ATC GAG GAC GAG ATC ATC ACC GCA CGC TGC GAT CTC GAC ATG 1531Cys Thr Ile Glu Asp Glu Ile Ile Thr Ala Arg Cys Asp Leu Asp Met

305 310 315GGC AAG CGC TAC CGC GAG ACC ATC TTC GAT TTC GCC CGC CAT CGC GAG 1579Gly Lys Arg Tyr Arg Glu Thr Ile Phe Asp Phe Ala Arg His Arg Glu

320 325 330CCC GAC GCC TAT CGC CTG ATC GTC GAA CGC AAA GGG GCT GTG CCG CCG 1627Pro Asp Ala Tyr Arg Leu Ile Val Glu Arg Lys Gly Ala Val Pro Pro

335 340 345CCG CAG TGA 1636Pro Gln350TCGGAACCTG AAAACGAAAT ATCCCGCCGG ACGGTGGGAA GGTGAAAGGA GGAGTCTCCA 1696TGACAACAGT TATCAAGGGT GGAACATCGT CGCCGCCGAT CGCAGCTATG AAGCCGATAT 1756CCTGATCGAA GGCGAAAAGA TCGCCCAGAT CGGCAGGGAT CTGCAGGGCG ACAAGATTGT 1816CGAC 1820

Claims

1.D-α-氨基酸的制备方法，其特征在于，在酶的作用下，使D-N-氨基甲酰-α-氨基酸在水性介质中转化成对应的D-α-氨基酸，然后收集生成的D-α-氨基酸，所述酶是用下述方法获得的：用含有载体DNA和一段DNA片段的重组DNA转化属于埃希氏杆菌属微生物的宿主菌体细胞，培养所得到的转化体，所述DNA片段具有编码序列表序列编号1的氨基酸编号1至303的氨基酸序列的基因，或序列表序列编号2的氨基酸编号1至311的氨基酸序列的基因。

2.权利要求1记载的制备方法，其中所述DNA片段具有序列表序列编号1的碱基编号1-1785的碱基序列，或者与其等价的碱基序列，或具有序列表序列编号2的碱基编号1-1820的碱基序列，或者与其等价的碱基序列。

3.权利要求1或2记载的制备方法，其中D-N-氨基甲酰-α-氨基酸是一种用通式

R-CH(NHCONH₂)-COOH

(式中R表示苯基、用羟基取代的苯基、烷基、取代烷基、芳烷基或噻吩基)表示的化合物。

4.权利要求1或2记载的制备方法，其中转化体产生的酶，被用作该转化体、菌体、菌体处理物、从菌体提取的提取物、固定化菌体或固定化酶的培养液。

5.权利要求2记载的制备方法，其中所述具有序列编号1的碱基序列的DNA片段来源于土壤杆菌属细菌。

6.权利要求2记载的制备方法，该所述具有序列编号2的碱基序列的DNA片段来源于假单胞菌属细菌。

7.权利要求6记载的制备方法，其中所述细菌是假单胞菌KNK 003A(FERM BP3181)。

8.权利要求5记载的制备方法，其中所述细菌是土壤杆菌KNK 712(FERM BP1900)。

9.权利要求1或2记载的制备方法，其中所述载体质粒是pUC18或pUC19。

10.权利要求1或2记载的制备方法，其中所述重组质粒是pAD101、pAD108、pPHD301或pPHD304。

11.权利要求1或2记载的制备方法，其中所述的转化体是大肠杆菌JM 109 pAHD 101、大肠杆菌JM 109 pAD 108(CCTCC M91095)、大肠杆菌JM109 pPHD 301或大肠杆菌JM 109 pPD 304(CCTCC M91096)。

12.D-N-氨基甲酰-α-氨基酸酰胺水解酶的制备方法，其特征在于，用含有载体DNA和一段DNA片段的重组DNA转化属于埃希氏杆菌属微生物的宿主菌体细胞，培养所得到的转化体，所述DNA片段具有编码序列表序列编号1的氨基酸编号1至303的氨基酸序列的基因，或序列表序列编号2的氨基酸编号1至311的氨基酸序列的基因。

13.权利要求12记载的制备方法，其中所述DNA片段具有序列表序列编号1的碱基编号1-1785的碱基序列，或者与其等价的碱基序列，或具有序列表序列编号2的碱基编号1-1820的碱基序列，或者与其等价的碱基序列。