JP2001069981A

JP2001069981A - デカルバミラーゼの立体構造およびその利用法

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Publication number: JP2001069981A
Application number: JP24679799A
Authority: JP
Inventors: Takanao Nakai; 孝尚中井; Soichi Morikawa; 壮一守川; Kiyoto Ishii; 清人石井; Hironori Nanba; 弘憲難波; Reika Yajima; 麗嘉矢島; Yasuhiro Ikenaka; 康裕池中; Satomi Takahashi; 里美高橋
Original assignee: Kanegafuchi Chemical Industry Co Ltd
Current assignee: Kanegafuchi Chemical Industry Co Ltd
Priority date: 1999-08-31
Filing date: 1999-08-31
Publication date: 2001-03-21
Also published as: EP1209234A4; WO2001016337A1; KR20020037044A; CN1376202A; EP1209234A1

Abstract

(57)【要約】【課題】デカルバミラーゼのＸ線結晶構造解析により
その立体構造を明らかにし、その立体構造を利用して基
質であるＤ−Ｎ−カルバモイル−α−アミノ酸類に対す
る反応性の向上等を目指した分子設計を行うことによ
り、工業利用により有利な優れたデカルバミラーゼ変異
体を提供すること。【解決手段】Ｘ線結晶構造解析により決定したデカル
バミラーゼの立体構造および変異体の立体構造モデルお
よび基質、生成物等との複合体の立体構造モデル、およ
びこれら立体構造を利用した分子設計手法、およびこの
方法を利用してデカルバミラーゼ変異体を得る方法、お
よびこの方法で得られたデカルバミラーゼ変異体、なら
びにデカルバミラーゼと構造が類似するタンパク質の変
異体を設計および製造する方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、Ｄ−Ｎ−カルバモ
イル−α−アミノ酸を対応するＤ−α−アミノ酸に変換
する酵素（以下、デカルバミラーゼという）の結晶に関
する。また、本発明は、該結晶を用いたＸ線結晶構造解
析により決定されたデカルバミラーゼの立体構造および
その利用、特に、該立体構造を利用したデカルバミラー
ゼの耐熱性、有機溶剤耐性、空気酸化に対する耐性等の
安定性、酵素反応の至適ｐＨの変更および比活性向上に
関するアミノ酸の変異を設計する方法に関する。さら
に、本発明は、上記立体構造を利用してデカルバミラー
ゼ変異体を製造する方法、得られたデカルバミラーゼ変
異体、および、その利用に関する。

【０００２】

【従来の技術】光学活性なＤ−α−アミノ酸類は医薬中
間体として重要な化合物であり、特に半合成ペニシリン
類または半合成セファロスポリン類の製造中間体である
Ｄ−フェニルグリシン、Ｄ−パラヒドロキシフェニルグ
リシンなどが工業的に有用な化合物例として挙げられ
る。このようなＤ−α−アミノ酸類の製造法としては、
対応するＤ−Ｎ−カルバモイル−α−アミノ酸類のカル
バモイル基を除去してこれらを得る方法が公知であり、
この際のカルバモイル基の除去は化学的方法または微生
物の酵素反応を利用する方法によって行われる。

【０００３】カルバモイル基の除去を行う酵素は、デカ
ルバミラーゼと呼ばれる。この酵素は、Ｄ−Ｎ−カルバ
モイル−α−アミノ酸のＤ−α−アミノ酸類への変換を
触媒する。この酵素は、シュードモナス属、アグロバク
テリウム属、アエロバクター属、アエロモナス属、プレ
ビバクテリウム属、バチルス属、フラボバクテリウム
属、セラチア属、ミクロコッカス属、アースロバクター
属、アルカリゲネス属、アクロモバクター属、モラキセ
ラ属、パラコッカス属、ブラストバクター属、およびコ
マモナス属から同定されている。デカルバミラーゼのア
ミノ酸配列および／または核酸配列は、アグロバクテリ
ウム属から決定されており、例えば、Ａｇｒｏｂａｃｔ
ｅｒｉｕｍｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒＮＲＲＬＢ１
１２９１およびＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｓｐ．
ＫＮＫ７１２（カネカ菌）が挙げられる。

【０００４】一般に、酵素は常温または高温でこれを反
応に用いる工業利用の際の条件に耐え得るほど十分な安
定性を有していない場合が多く、その安定性が生産物の
コストに影響する場合が多い。また、酵素反応を有利に
進行させる手段として、固定化酵素または固定化菌体等
のいわゆる「バイオリアクター」として繰り返し反応に
用いることが行われているが、この際にも酵素の安定性
によって使用回数が制限され、生産物のコストに与える
影響が大きい。

【０００５】有用な反応を触媒する酵素を有効に工業利
用するためには、安定性などの物性または触媒能の高い
優れた酵素を迅速かつ効率的に創製する手法が望まれ
る。物性または機能を改良した酵素を取得する方法とし
ては、酵素をコードする遺伝子に化学処理または酵素処
理などにより人為的な変異を加え、変異を含んだ組換え
体ＤＮＡを宿主細胞に導入して、目的の機能および／ま
たは物性を有する酵素をスクリーニングするいわゆるラ
ンダムスクリーニング法がよく知られている。一方、近
年の構造生物学の進歩に伴い、酵素などの数多くのタン
パク質の立体構造がＸ線結晶解析またはＮＭＲ解析によ
り明らかにされてきており、その立体構造および分子設
計手法を用いたタンパク質の物性または機能改変も盛ん
に行われるようになっている。

【０００６】ここで、「タンパク質の立体構造」とは、
あるアミノ酸配列を有するタンパク質がある条件下で折
り畳まれて形成される、ある条件およびそのアミノ酸配
列によって規定されるタンパク質の三次元構造のことを
いう。タンパク質の立体構造は、例えば、Ｘ線結晶構造
解析または核磁気共鳴によって決定され得る。

【０００７】デカルバミラーゼの物性の改変について
は、ランダムスクリーニング法により耐熱性の向上した
酵素生産株（Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ１０９）をスクリーニ
ングすることに成功し、工業利用に有利なデカルバミラ
ーゼ変異体が取得されている（国際公開ＷＯ９４／０３
６１３号パンフレット）。また、部位特異的変異誘発に
より、安定性の向上した変異体（特開平９−１７３０６
８号公報）が取得されている。しかし、これらの例は、
アミノ酸の一次配列のみに基づいて変異体を作製したも
のであって、酵素の立体構造を利用した合理的な分子設
計手法を活用したものではない。

【０００８】これまでにデカルバミラーゼおよびその類
縁酵素であって、その立体構造が明らかにされたものは
知られていない。デカルバミラーゼは、アミノ酸配列が
既に知られているタンパク質の配列データベース、ＰＩ
ＲＲｅｌｅａｓｅ５７（米国国立バイオテクノロジー
情報センター、ＮＣＢＩ）に対する配列類似性解析から
アミダーゼ、ニトリラーゼ等の加水分解酵素と２５〜３
０％程度の弱い配列類似性を有することが明らかになっ
ている。しかしながら、弱い配列類似性を有するこれら
の酵素の立体構造は、これまでいずれも明らかにはされ
ていない。そのため、分子設計手法でしばしば用いられ
る類似タンパク質の立体構造を用いたいわゆるホモロジ
ーモデリングの手法（例えば、Ｓｗｉｓｓ−Ｐｄｂｖｉ
ｅｗｅｒ（モデリングプログラム）（ＳｗｉｓｓＩｎ
ｓｔｉｔｕｔｅｏｆＢｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ
（ＳＩＢ）、ＥｘＰＡＳｙＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉ
ｏｌｏｇｙＳｅｒｖｅｒ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅ
ｘｐａｓｙ．ｃｈ／より入手可能））；Ｇｕｅｘ、
Ｎ．およびＰｅｉｔｓｃｈ，Ｍ．Ｃ．（１９９７）ＳＷ
ＩＳＳ−ＭＯＤＥＬａｎｄｔｈｅＳｗｉｓｓ−Ｐ
ｄｂＶｉｅｗｅｒ：Ａｎｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔｆ
ｏｒｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅｐｒｏｔｅｉｎｍｏ
ｄｅｌｉｎｇ、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ１
８、２７１４−２７２３）により、デカルバミラーゼの
立体構造を推定することは事実上不可能であった。ま
た、仮に類縁酵素の立体構造が決定されたとしても、３
０％に満たない弱い配列類似性では、合理的な分子設計
手法を適用するために十分な精度をもって立体構造モデ
ルを得ることは難しい。酵素反応の至適ｐＨの変更、比
活性向上に関するアミノ酸変異等を精度良く予測し、そ
れに基づき分子設計するためには、デカルバミラーゼの
精密な原子座標データが必須である。デカルバミラーゼ
の立体構造を決定することができれば、精密な立体構造
の解析、およびこれに基づく合理的な分子設計手法を適
用することが可能となり、ひいては工業利用に有利な改
変酵素を迅速かつ効率的に取得することも可能となる。

【０００９】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、このような
課題を解決すべく、現在工業利用に供されているデカル
バミラーゼの単結晶を取得し、Ｘ線結晶構造解析により
その立体構造を明らかにすることを目的とする。本発明
はまた、デカルバミラーゼの立体構造を利用して、基質
であるＤ−Ｎ−カルバモイル−α−アミノ酸類に対する
反応性の向上、反応ｐＨの最適化、熱および空気酸化に
対する安定性向上等を目指した分子設計を行うことによ
り、工業利用により有利な優れたデカルバミラーゼ変異
体を提供すること、および得られたデカルバミラーゼ変
異体を利用したＤ−α−アミノ酸の製造方法を提供する
ことを目的とする。

【００１０】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決するために鋭意検討を行った結果、デカルバミラ
ーゼの単結晶およびその重原子誘導体結晶を取得し、こ
れら結晶の重原子同型置換法および多波長異常分散法を
用いたＸ線結晶構造解析によりデカルバミラーゼの精密
な立体構造を決定し、そしてこれらの立体構造を基に特
性の改善された変異体を作製することにより、本発明を
完成するに至った。

【００１１】本発明は、直方晶系の空間群Ｐ２₁２₁２お
よび配列番号１に示されるアミノ酸配列、または直方晶
系の空間群Ｐ２₁２₁２₁および配列番号２に示されるア
ミノ酸配列を有する、デカルバミラーゼ結晶に関する。
結晶が直方晶系の空間群Ｐ２ ₁２₁２および配列番号１に
示されるアミノ酸配列、または空間群Ｐ２₁２₁２₁およ
び配列番号２に示されるアミノ酸配列を有する、デカル
バミラーゼ結晶に関する。一つの実施態様において、上
記結晶は直方体形状の単位格子を有し、単位格子定数：
ａ＝６６．５〜６８．５Å、ｂ＝１３５．５〜１３８．
０Å、ｃ＝６６．５〜６８．５Åを有し得る。また、上
記アミノ酸配列が配列番号１であり得る。別の実施態様
において、上記結晶は直方体形状の単位格子を有し得、
そして単位格子定数：ａ＝６８．５〜７０．５Å、ｂ＝
１３８．０〜１４０．５Å、ｃ＝６８．５〜７３．０Å
を有し得る。他の実施態様において、上記結晶は直方体
形状の単位格子を有し得、そして、単位格子定数：ａ＝
８１．５〜８２．５Å、ｂ＝１３３．０〜１３５．０
Å、ｃ＝１１９．５〜１２１．５Åを有し得る。また、
上記アミノ酸配列は配列番号２であり得る。１つの局面
において、本発明は結晶中のデカルバミラーゼ１分子当
たり少なくとも１つ以上の重金属原子を含む結晶を提供
し得る。一つの実施態様において、上記重金属原子は水
銀、金、白金、鉛、イリジウム、オスミウムおよびウラ
ンのうちいずれかであり得る。他の実施態様において、
本発明はデカルバミラーゼ結晶を液体窒素下で凍結させ
ることにより調製される凍結結晶を提供し得る。

【００１２】別の局面において、本発明は、デカルバミ
ラーゼ結晶の製造方法であって、１〜５０ｍｇ／ｍｌの
濃度でデカルバミラーゼの溶液を与える工程、５〜３０
重量％の濃度でポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ある
いはメトキシポリエチレングリコール（ＰＥＧＭＭＥ）
を含有し、かつ６．０〜９．０のｐＨを与える濃度の緩
衝剤を含有する沈澱剤溶液を与える工程、該デカルバミ
ラーゼ溶液を該沈澱剤溶液と混合する工程、および得ら
れる混合溶液を、該溶液中のデカルバミラーゼ結晶が既
定の大きさ以上に成長するまで既定の期間放置する工程
を包含する、方法を提供する。１つの実施態様におい
て、本発明の方法はまた、混合する工程が、デカルバミ
ラーゼ溶液の液滴を前記沈澱剤溶液の液滴と混合させる
ことを包含し、そして放置する工程が、混合工程で得ら
れる混合液滴を密閉容器中で沈澱剤溶液を保持する溶液
溜め部上に懸垂させることを包含し、ここで、該溶液溜
め部中の該沈澱剤溶液の蒸気圧は該混合液滴の蒸気圧よ
り低い。本発明の方法はまた、混合する工程が、前記デ
カルバミラーゼ溶液の液滴を上記沈澱剤溶液の液滴と混
合させることを包含し、そして上記放置する工程が、混
合工程で得られる混合液滴を密閉容器中で沈澱剤溶液を
保持する溶液溜め部の液滴台に静置させることを包含
し、ここで、該際溶液溜め部中の該沈澱剤溶液の蒸気圧
は該混合液滴の蒸気圧より低い。別の実施態様におい
て、本発明の方法における混合溶液を放置する期間は１
日から３週間である。他の実施態様において、本発明の
方法は、上記デカルバミラーゼの溶液を与える工程の後
に、該デカルバミラーゼ溶液をサイズ排除半透膜内に配
置させる工程をさらに包含し、そして前記混合する工程
が、該半透膜を通して沈澱剤溶液を該デカルバミラーゼ
溶液中に拡散させることをさらに包含する。他の実施態
様において、本発明の方法における上記混合する工程
が、上記沈澱剤溶液を前記デカルバミラーゼ溶液に徐々
に添加することを包含し、そして上記放置する工程が、
得られる混合溶液を密閉容器内で放置することを包含す
る。別の局面において、本発明は、図１に示すタンパク
質立体構造トポロジーを有する立体構造により特徴付け
られるデカルバミラーゼに関する。一つの実施態様にお
いて、本発明は、４本のαヘリックスおよび１２本のβ
ストランドの二次構造を含む４層サンドイッチ構造を有
する、デカルバミラーゼに関する。本発明の好ましい実
施態様において、酵素反応に関与するアミノ酸残基は、
システイン１残基、グルタミン酸２残基、およびリジン
１残基であり、酵素反応の基質がＤ−Ｎ−カルバモイル
−α−アミノ酸であって、図３に示す基質結合様式を有
する活性部位の立体構造により特徴付けられる。本発明
の別の実施態様において、本発明は、デカルバミラーゼ
活性を有する酵素分子であって、少なくとも、配列番号
１または２における以下のアミノ酸：４６位のＧｌｕ、
１２６位のＬｙｓ、１４５位のＧｌｕ、および１７１位
のＣｙｓに対応するアミノ酸から形成される活性部位腔
を有する、酵素分子に関する。別の実施態様において、
活性部位腔において、基質であるＤ−Ｎ−カルバモイル
−α−アミノ酸は、反応時に前記配列番号１または２の
１２６位のＬｙｓ、１４３位のＨｉｓ、１４５位のＧｌ
ｕ、１７４位のＡｒｇ、１７５位のＡｒｇ，および１９
７位のＴｈｒに対応するアミノ酸と相互作用する。他の
実施態様では、上記活性部位腔において、前記配列番号
１または２の４６位のＧｌｕ、１４５位のＧｌｕおよび
１７１位のＣｙｓに対応するアミノ酸は水分子を介して
水素結合している。なお別の実施態様において、上記Ｄ
−Ｎ−カルバモイル−α−アミノ酸は、Ｄ−Ｎ−カルバ
モイル−フェニルグリシン、Ｄ−Ｎ−カルバモイル−パ
ラヒドロキシフェニルグリシン、Ｄ−Ｎ−カルバモイル
−フェニルアラニン、Ｄ−Ｎ−カルバモイル−バリン、
Ｄ−Ｎ−カルバモイル−アラニン、Ｄ−Ｎ−カルバモイ
ル−システイン、Ｄ−Ｎ−カルバモイル−アスパラギン
酸、Ｄ−Ｎ−カルバモイル−グルタミン酸、Ｄ−Ｎ−カ
ルバモイル−グリシン、Ｄ−Ｎ−カルバモイル−ヒスチ
ジン、Ｄ−Ｎ−カルバモイル−イソロイシン、Ｄ−Ｎ−
カルバモイル−リジン、Ｄ−Ｎ−カルバモイル−ロイシ
ン、Ｄ−Ｎ−カルバモイル−メチオニン、Ｄ−Ｎ−カル
バモイル−アスパラギン、Ｄ−Ｎ−カルバモイル−プロ
リン、Ｄ−Ｎ−カルバモイル−グルタミン、Ｄ−Ｎ−カ
ルバモイル−アルギニン、Ｄ−Ｎ−カルバモイル−セリ
ン、Ｄ−Ｎ−カルバモイル−スレオニン、Ｄ−Ｎ−カル
バモイル−トリプトファン、Ｄ−Ｎ−カルバモイル−チ
ロシンからなる群から選択される。さらに別の実施態様
において、本発明は、本発明のデカルバミラーゼの立体
構造から分子設計手法により構築された、デカルバミラ
ーゼあるいはその変異体とＤ−Ｎ−カルバモイル−α−
アミノ酸あるいはＤ−α−アミノ酸との複合体立体構造
により特徴付けられるデカルバミラーゼ複合体に関す
る。

【００１３】本発明の一つの局面において、本発明は、
デカルバミラーゼ変異体を設計する方法であって、デカ
ルバミラーゼの請求項１４、１６、または２１のいずれ
か１項に記載の立体構造に基づいて物性および／または
機能を改変したデカルバミラーゼ変異体を設計する工
程、を包含する、方法に関する。別の局面において、本
発明は、デカルバミラーゼ変異体を設計する方法であっ
て、デカルバミラーゼ活性を有する酵素の結晶を生成す
る工程、該結晶のＸ線結晶構造解析により立体構造を決
定する工程、および決定した該結晶の立体構造に基づい
て物性および／または機能の向上したデカルバミラーゼ
変異体を設計する工程を包含する方法に関する。さらに
別の局面において、本発明は、デカルバミラーゼ変異体
を製造する方法であって、該方法が、デカルバミラーゼ
活性を有する酵素の結晶を生成する工程、該結晶のＸ線
結晶構造解析により該結晶の立体構造を決定する工程、
決定した該結晶の立体構造に基づいて物性および／また
は機能の向上したデカルバミラーゼ変異体を設計する工
程、および該デカルバミラーゼ変異体を産生する工程を
包含する、方法に関する。一つの実施態様において、本
発明の方法で使用される上記立体構造は、本発明のデカ
ルバミラーゼの立体構造である。別の実施態様におい
て、上記デカルバミラーゼ変異体を設計する工程は、酵
素の基質特異性の変更、酵素比活性の変更、酵素の安定
性向上、至適ｐＨの最適化および酵素の水溶性の変更か
らなる群から選択される１以上の酵素特性の改変を目的
とする。さらに別の実施態様において、上記デカルバミ
ラーゼ変異体の製造方法は、酵素の安定性向上を目的と
する。好ましくは、酵素の安定性向上に関する変異体の
設計は空気酸化による活性低下を招くアミノ酸残基を置
換する変異を含む。他の実施態様において、上記酵素特
性の改変は、酵素比活性の変更および至適ｐＨの最適化
を含む。

【００１４】別の局面において、本発明は、本発明の方
法によって得られたデカルバミラーゼ変異体に関する。
本発明はまた、本発明の立体構造を利用してデカルバミ
ラーゼのインヒビターをスクリーニングおよび／または
設計する方法を提供する。さらに別の局面において、本
発明は、デカルバミラーゼ結晶の立体構造またはデカル
バミラーゼの立体構造を利用して、アミノ酸一次配列が
デカルバミラーゼと少なくとも３０％の類似性を有する
別のポリペプチド酵素またはタンパク質酵素を改変方法
を提供する。

【００１５】

【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。

【００１６】本明細書において、「デカルバミラーゼ活
性」とは、Ｄ−Ｎ−カルバモイル−α−アミノ酸を、そ
のアミノ酸を修飾しているカルバモイル基を除去してＤ
−α−アミノ酸に変換する活性をいう。「デカルバミラ
ーゼ」とは、デカルバミラーゼ活性を有する酵素をい
う。デカルバミラーゼの例としては、配列番号１または
配列番号２のアミノ酸配列を有する酵素が挙げられる。
配列番号１のアミノ酸配列を有するデカルバミラーゼ
は、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｓｐ．ＫＮＫ７１
２から単離され配列決定された。配列番号２のアミノ酸
配列を有する酵素は、配列番号１からランダム変異によ
るスクリーニングにより、Ｅ．ｃｏｌｉ変異株から得た
酵素である。

【００１７】本明細書において、デカルバミラーゼまた
は他の酵素の変異体の「変異体」とは、もとの酵素のア
ミノ酸配列のアミノ酸が少なくとも１つ以上置換、付
加、もしくは欠失、または修飾されたアミノ酸配列を有
し、もとの酵素の活性の少なくとも一部を保持する改変
された酵素をいう。「活性断片」とは、あるタンパク質
酵素またはポリペプチド酵素のアミノ酸配列の一部を有
する断片であって、もとの酵素の活性の少なくとも一部
を保持する断片をいう。ここで、「活性の少なくとも一
部」とは、代表的には、もとの酵素の少なくとも１０％
の比活性、好ましくは元の酵素の少なくとも５０％の比
活性をいうが、所望によって、１０％未満の比活性をい
う場合もある。

【００１８】本明細書において、「ネイティブ結晶」と
は、デカルバミラーゼを硫安、ポリエチレングリコール
などの沈澱剤および添加塩類等を適切な組成で含有する
緩衝液中で、単結晶にまで成長させたものであって、重
金属原子を含有しない結晶をいう。

【００１９】本明細書において、「重原子誘導体結晶」
とは、以下のいずれかの結晶をいう：（ｉ）調製したネ
イティブ結晶を水銀、金、白金、鉛、イリジウム、オス
ミウムおよびウランなどの重金属化合物を含んだ溶液に
浸漬することで、結晶性を崩すことなく、結晶中のデカ
ルバミラーゼに重金属原子を共有結合あるいは配位結合
等により結合させた結晶、（ｉｉ）硫安、ポリエチレン
グリコールなどの沈澱剤および添加塩類等を適切な組成
で含有する緩衝液であって、さらに適切な濃度で上記重
金属化合物を含有する溶液中で、デカルバミラーゼを単
結晶にまで成長させた結晶、および（ｉｉｉ）デカルバ
ミラーゼのメチオニンおよび／またはシステイン残基が
セレノメチオニンおよび／またはセレノシステインに置
換した変異体を用いて得られる結晶。

【００２０】本発明の一つの実施態様において、配列番
号１または２のアミノ酸配列を有するデカルバミラーゼ
の結晶は、用いる溶液の濃度およびｐＨを規定の範囲内
（デカルバミラーゼの濃度については、１〜５０ｍｇ／
ｍｌ、ポリエチレングリコールまたはメトキシポリエチ
レングリコールの濃度については５〜３０重量％、ｐＨ
については６．０〜９．０）に細心に調節しながら、ポ
リエチレングリコール（ＰＥＧ）またはメトキシポリエ
チレングリコール（ＰＥＧＭＭＥ）、緩衝剤および任意
の添加塩類を含有する沈澱剤溶液から成長させ得る。タ
ンパク質の結晶成長に一般的に用いられる三種類の基本
技術のいずれか、すなわち蒸気拡散法、透析法およびバ
ッチ法（ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇ
ｙ、第１１４巻、ＤｉｆｆｒａｃｔｉｏｎＭｅｔｈｏ
ｄｓｆｏｒＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＭａｃｒｏｍｏｌｅ
ｃｕｌｅｓＰａｒｔＡまたは第２７６巻Ｍａｃｒｏｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒＣｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ
ＰａｒｔＡ）のいずれかを用い得るが、蒸気拡散法が
好ましい。

【００２１】蒸気拡散法は、沈澱剤を含むタンパク質溶
液の液滴を、より高濃度の沈澱剤を含む緩衝液（外液）
の入った容器中に置き、密封後静置しておく方法であ
る。液滴の置き方によって、懸滴（ｈａｎｇｉｎｇ−ｄ
ｒｏｐ）法およびシッティングドロップ（ｓｉｔｔｉｎ
ｇｄｒｏｐ）法がある。懸滴（ハンギングドロップ）
法は、タンパク質溶液の小さな液滴をカバーグラス上に
配置し、カバーグラスを溶液溜め（リザーバー）上で反
転させ、密封する。他方、シッティングドロップ法で
は、リザーバー内部にに適切な液滴台を設置し、タンパ
ク質溶液の小滴を液滴台上に配置し、カバーグラス等で
リザーバーを密封する。リザーバー中の溶液は沈澱剤を
含有し、沈澱剤はタンパク質小滴中にも少量存在する。
蒸気拡散法で使用する沈澱剤溶液は、以下の成分を含有
するように形成させる：（ａ）分子量４０００〜９００
０、好ましくは平均分子量７５００と１０〜２０重量％
の濃度とを有するＰＥＧまたはＰＥＧＭＭＥ、（ｂ）添
加塩として０．１〜０．５Ｍの濃度を有する食塩、塩化
リチウム、塩化マグネシウム（最良の結果は０．２Ｍ塩
化リチウムによって得られる）、および（ｃ）ｐＨ６．
５〜８．０、好ましくはｐＨ７．５を与えるに十分な量
の緩衝剤。０．０５〜０．１ＭのＨＥＰＥＳ（Ｓｉｇｍ
ａ、ＳｔＬｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）がこの目的に使
用できる。リン酸ナトリウム、リン酸カリウムおよびト
リス（ヒドロキシメチル）アミノメタンマレート等の他
の緩衝剤もまた用い得る。

【００２２】「バッチ法」とは、タンパク質溶液に沈澱
剤溶液を少しずつ加え、わずかに濁ったところ不溶物を
遠心分離して除去後、上清を小さな試験管に入れて密封
した後に静置しておく方法をいう。また、「透析法」と
は、タンパク質溶液を沈澱剤の入った緩衝液（外液）に
対して、半透膜を用いて透析する方法をいう（Ｍｅｔｈ
ｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、第１１４巻、Ｄ
ｉｆｆｒａｃｔｉｏｎＭｅｔｈｏｄｓｆｏｒＢｉｏｌ
ｏｇｉｃａｌＭａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓＰａｒｔ
Ａ）。

【００２３】本明細書において、「既定の大きさ」と
は、Ｘ線結晶構造解析で測定可能な最低限の大きさをい
い、本発明のデカルバミラーゼの場合、好ましくは０．
３×０．３×０．１ｍｍであり得る。また、「既定の期
間」とは、結晶の大きさが既定の大きさ以上に達するの
に十分な期間をいい、本発明のデカルバミラーゼの場
合、好ましくは１日〜３週間であり得る。

【００２４】上記のように調製したＸ線結晶構造解析に
適した既定の大きさを有する配列番号１のデカルバミラ
ーゼのネイティブ結晶は、（１）菱形板状の外形を有
し、そして（２）同一外形を有する結晶であっても、異
なる単位格子定数を有し得る。また、Ｘ線結晶構造解析
には適さないが、沈澱剤、緩衝液等の条件を適切に選択
することによって、針状あるいは柱状の外形を有する小
型あるいは微小結晶が得られる。このような結晶の用途
に関して酵素の微小結晶をグルタルアルデヒド等のタン
パク質架橋試薬によって架橋することによって、有機溶
媒を含む状態においても酵素反応を長期間安定に行うこ
とを可能とするＣＬＥＣ（Ｃｒｏｓｓ−Ｌｉｎｋｅｄ
ＥｎｚｙｍｅＣｒｙｓｔａｌ）と呼ばれる技術が報告
されている（Ｎ．Ｌ．Ｓｔ．Ｃｌａｉｒ＆Ｍ．Ａ．
Ｎａｖｉａ、（１９９２）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏ
ｃ．１１４，７３１４−７３１６）。本発明によって得
られるデカルバミラーゼの結晶は、ＣＬＥＣ技術の適用
範囲を拡大するものである。

【００２５】本発明の１つの実施態様において、Ｘ線結
晶構造解析に有効な重原子誘導体結晶、すなわちネイテ
ィブ結晶の結晶性を保持しつつ、結晶中のタンパク質に
重金属原子が結合した結晶が提供される。重原子誘導体
結晶は、タンパク質のＸ線結晶構造解析の基本技術であ
る重原子同型置換法および多波長異常分散法を適用する
際に利用される。デカルバミラーゼの重原子誘導体結晶
は、ネイティブ結晶が溶解、崩壊せず少なくとも数日以
上安定に保存され得る、所要の濃度を与える重金属化合
物を含有させた溶液に結晶を浸漬する浸漬法により調製
し得る。浸漬法に使用される重金属化合物は、金、白
金、イリジウム、オスミウム、水銀、鉛、ウラン、サマ
リウムなどを含む金属塩あるいは有機金属化合物であ
る。重金属浸漬法では、０．１〜１００ｍＭ濃度の重金
属化合物、例えば水銀化合物であるＥＭＴＳ（エチル水
銀チオサリチル酸ナトリウム塩）、カリウムジシアノ金
（Ｉ）などを含有し、所望のｐＨを与える適切な沈澱剤
および添加塩組成を有する保存溶液が使用し得る。保存
溶液の好ましい例は、２０〜３０重量％ポリエチレング
リコール６０００および０．２Ｍ塩化リチウムを含む
０．０１ＭＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）である。
重金属原子が結晶中に導入、すなわち結晶中のタンパク
質に結合しているかどうかの判定は、浸漬法により調製
した結晶のＸ線回折強度データを収集し、あらかじめ取
得しているネイティブ結晶の回折強度データと比較する
ことによって行い得る。

【００２６】あるいは、デカルバミラーゼを生産する微
生物（例えば、アグロバクテリウム属のＤＮＡを有する
組換えＥ．ｃｏｌｉなど）を重金属原子であるセレンを
含有したセレノメチオニンあるいはセレノシステインを
含む培地で生育、培養することにより、デカルバミラー
ゼ中のメチオニンあるいはシステイン残基がセレノメチ
オニンあるいはセレノシステインに置換した変異体が取
得され得る。このように浸漬法を用いることなく重金属
原子をタンパク質中に導入したデカルバミラーゼが取得
されれば、上記条件等を用いた結晶化により重原子誘導
体結晶を調製し得る。

【００２７】一般に、タンパク質の結晶は、Ｘ線により
かなり損傷を受けることが知られているので、Ｘ線結晶
構造解析を成功させるためには、損傷を受け難い結晶を
取得することが重要である。近年では、結晶を凍結さ
せ、凍結状態のままで回折データを測定することで高品
質、高分解能の回折データを取得する試みが行われてい
る（ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ第
２７６巻、ＭａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒＣｒｙｓｔ
ａｌｌｏｇｒａｐｈｙ、ＰａｒｔＡ、Ｃ．Ｗ．Ｃａｒ
ｔｅｒ、Ｊｒ．およびＲ．Ｍ．Ｓｗｅｅｔ編、[13]Ｐｒ
ａｃｔｉｃａｌＣｒｙｏｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈ
ｙ（Ｄ．Ｗ．Ｒｏｄｇｅｒｓ））。一般に、タンパク質
結晶の凍結には、凍結による結晶の崩壊を防ぐ目的で、
グリセロールなどの凍結安定化剤を含む溶液で処理する
などの工夫がなされる。本発明においては、デカルバミ
ラーゼのネイティブ結晶および重原子誘導体の凍結結晶
は、凍結安定化剤を添加することなく、結晶化小滴ある
いは浸漬溶液中の結晶を取り出し、液体窒素に直接浸漬
して瞬時に凍結させることで調製し得る。凍結結晶はま
た、凍結安定化剤を添加した保存液に浸漬した結晶に対
して上記瞬時に凍結させる操作を行うことによっても調
製し得る。

【００２８】類縁タンパク質の立体構造が未知であり、
その立体構造を利用した分子置換法による構造解析が不
可能なデカルバミラーゼなどの新規タンパク質の立体構
造決定においては、重原子同型置換法（Ｍｅｔｈｏｄｓ
ｉｎＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ第１１５巻、Ｄｉｆｆ
ｒａｃｔｉｐｎＭｅｔｈｏｄｓｆｏｒＢｉｏｌｏ
ｇｉｃａｌＭａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ、Ｐａｒ
ｔＢ、Ｈ．Ｗ．Ｗｙｃｋｏｆｆ、Ｃ．Ｈ．Ｗ．Ｈｉｒ
ｓ、およびＳ．Ｎ．Ｔｉｍａｓｈｅｆｆ編、ならびにＭ
ｅｔｈｏｄｓｉｎＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ第２７６
巻、ＭａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒＣｒｙｓｔａｌｌ
ｏｇｒａｐｈｙ、ＰａｒｔＡ、Ｃ．Ｗ．Ｃａｒｔｅ
ｒ、Ｊｒ．およびＲ．Ｍ．Ｓｗｅｅｔ編）または多波長
異常分散法（Ｓ．Ｎ．Ｔｉｍａｓｈｅｆｆ編、ならびに
ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ第２７
６巻、ＭａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒＣｒｙｓｔａｌ
ｌｏｇｒａｐｈｙ、ＰａｒｔＡ、Ｃ．Ｗ．Ｃａｒｔｅ
ｒ、Ｊｒ．およびＲ．Ｍ．Ｓｗｅｅｔ編）が適用され得
る。すなわち、ネイティブ結晶および重原子誘導体結晶
の回折データ間の回折強度差、あるいは異なる波長で測
定した回折データ間の回折強度差から、電子密度を計算
するための初期位相を求めることにより立体構造を決定
し得る。重原子同型置換法または多波長異常分散法を適
用するデカルバミラーゼの立体構造決定においては、重
金属原子として例えば水銀、金、白金、ウラン、セレン
原子などを含有した重原子誘導体結晶を用い得る。好ま
しくは、水銀化合物ＥＭＴＳまたはカリウムジシアノ金
（Ｉ）を利用した浸漬法により得られる重原子誘導体結
晶が用いられる。

【００２９】ネイティブ結晶および重原子誘導体結晶の
回折データは、Ｒ−ＡＸＩＳＩＩｃ（理学電機）ある
いはＳＰｒｉｎｇ−８（西播磨大型放射光施設）のタン
パク質結晶構造解析用ビームラインを用いて測定し得
る。多波長異常分散法を適用するための複数波長での回
折データ測定は、ＳＰｒｉｎｇ−８のタンパク質結晶構
造解析用ビームラインを用いて実施し得る。測定した回
折画像データは、Ｒ−ＡＸＩＳＩＩｃ付属のデータ処
理プログラムまたはプログラムＤＥＮＺＯ（マックサイ
エンス）または同様な画像処理プログラム（または単結
晶解析用ソフトウェア）を用いて、反射強度データに処
理される。ネイティブ結晶の反射強度データ、複数波長
での重原子誘導体結晶の反射強度データ波長の測定によ
り得られた反射強度データから、差パターソン図を利用
して結晶中のタンパク質に結合した重金属原子の位置を
求めた後、プログラムＰＨＡＳＥＳ（Ｗ．Ｆｕｒｅｙ、
ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＰｅｎｎｓｙｌｖａｎｉ
ａあるいはＣＣＰ４（ＢｒｉｔｉｓｈＢｉｏｔｅｃｈ
ｎｏｌｏｇｙ＆ＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＳｃｉｅｎ
ｃｅＲｅｓｅａｒｃｈＣｏｕｎｓｉｌ、ＳＥＲＣ）
または同様の回折データ解析プログラムを用いて重原子
位置パラメータを精密化することにより初期位相が決定
される。決定された初期位相は、プログラムＤＭ（ＣＣ
Ｐ４パッケージ）または同様な位相改良プログラム（電
子密度改良プログラム）を用いた溶媒平滑化法およびヒ
ストグラムマッチング法に従って、デカルバミラーゼ結
晶中の溶媒領域を３０〜５０％、好ましくは３５％とし
て、低分解能から高分解能まで徐々に位相拡張計算を行
うことにより信頼性の高い位相へと改良される。タンパ
ク質の結晶は、その体積の３０〜６０％がタンパク質以
外の溶媒分子（主として水分子）で占有されている。本
明細書において、溶液中の溶媒分子の占める体積を「溶
媒領域」とする。一般に、得られたタンパク質結晶が非
結晶学的な対称を有する場合には、非結晶学的対称（Ｎ
ＣＳ）平均化と呼ばれる電子密度の平均化を行うことに
より、さらに位相の信頼性を高めることが可能である。
デカルバミラーゼの結晶は、結晶の密度測定の結果から
非対称単位中に２分子が含まれることがわかっており、
結晶中のデカルバミラーゼ分子は非結晶学的な２回軸を
持つことが推定される。溶媒平滑化法を適用した後の位
相を用いて計算した電子密度図および精密化した重原子
座標から、並進および回転を含む非結晶学的対称マトリ
ックスが算出される。同時に溶媒平滑化法で得られた電
子密度図から、マスクと呼ばれるタンパク質の分子が存
在する領域を同定し得る。非結晶学的対称マトリックス
およびマスクを用いて、プログラムＤＭなどによりＮＣ
Ｓ平均化計算を行うことにより、信頼性の高い位相に改
良され、立体構造モデルの構築に用いる電子密度図が得
られる。

【００３０】デカルバミラーゼの立体構造モデルは、プ
ログラムオー（プログラムＯ）（Ａ．Ｊｏｎｅｓ、Ｕｐ
ｐｓａｌａＵｎｉｖｅｒｓｉｔｅｔ、スウェーデン）
により３次元グラフィックス上に表示した電子密度図か
ら、以下の手順で構築し得る。まず、特徴的なアミノ酸
配列を有する複数の領域（トリプトファン残基を含む部
分配列など）を電子密度図上で探し出す。次に、見出し
た領域を起点にしてアミノ酸配列を参照しながら、電子
密度に適合するアミノ酸残基の部分構造をプログラムＯ
を用いて３次元グラフィックス上で構築する。、順次こ
の作業を繰り返すことにより、デカルバミラーゼのすべ
てのアミノ酸残基を相当する電子密度に適合させ、分子
全体の初期立体構造モデルを構築する。構築された立体
構造モデルは、それを出発モデル構造として、構造精密
化プログラムであるＸＰＬＯＲ（Ａ．Ｔ．Ｂｒｕｎｇｅ
ｒ、ＹａｌｅＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）の精密化プロト
コルに従って、立体構造を記述する三次元座標が精密化
される。また、デカルバミラーゼ（例えば、配列番号１
に示されるデカルバミラーゼ）のネイティブ結晶の立体
構造およびデカルバミラーゼ変異体（例えば、配列番号
２に示される配列を有するデカルバミラーゼ変異体）ネ
イティブ結晶の立体構造は、得られたＥＭＴＳ誘導体結
晶の立体構造を用いた分子置換法により初期位相を求
め、前記の電子密度改良、モデル構築、構造精密化手順
に従うことにより各々の立体構造を決定し得る。このこ
とにより、本発明のデカルバミラーゼの立体構造の決定
が完成される。決定したデカルバミラーゼの立体構造に
ついて、タンパク質立体構造の公的データバンクである
プロテインデータバンク（ＰＤＢ）に登録されている種
々のタンパク質（デカルバミラーゼと機能において類似
する酵素を含む）の立体構造との比較を行い得る。デカ
ルバミラーゼと同様の脱カルバミル化反応を触媒するＮ
−カルバミル−ザルコシン−アミドハイドラーゼの立体
構造が知られているが（プロテインデータバンクＩＤ、
１ＮＢＡ）、デカルバミラーゼの立体構造は、この酵素
の立体構造との構造類似性は認められない。プロテイン
データバンクに立体構造が登録されているタンパク質の
中では、ペニシリンアシラーゼ（１ＰＮＫ）、グルコサ
ミン−６−ホスフェイト合成酵素（１ＧＤＯ）、グルタ
ミンホスフォリボシルピロホスフェイトアミドトラン
スフェラーゼ（１ＥＣＦ）、およびプロテオソーム（１
ＰＭＡ）などがその立体構造に含まれるドメインと呼ば
れる部分構造において、２層に積層したβシートの両側
にαヘリックス構造が密着した４層サンドイッチと呼ば
れる構造を有しており、デカルバミラーゼの立体構造と
の類似性が認められる。しかし、これらドメイン構造と
デカルバミラーゼの立体構造とでは、αヘリックスおよ
びβストランドの幾何学的な並び、いわゆるタンパク質
立体構造トポロジー（Ｔ．Ｐ．Ｆｌｏｒｅｓら、（１９
９４）、Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．７、３１−３７）が異なっ
ている。すなわち、デカルバミラーゼの立体構造は、β
シート構造内において平行βストランドを有することを
特徴とするものであり（図１）、４層サンドイッチ構造
を有するタンパク質としても、デカルバミラーゼは新規
の立体構造である。このように、「トポロジー」とは、
本明細書中において、タンパク質の二次構造単位の並び
または空間配置のことをいう。

【００３１】本明細書において、「αヘリックス」と
は、タンパク質またはポリペプチドの二次構造の一つで
あり、アミノ酸が３．６残基ごとに１回転したピッチが
５．４の螺旋構造を有するエネルギー的に最も安定な構
造の１つをいう。αヘリックスを形成しやすいアミノ酸
としては、グルタミン酸、リジン、アラニン、およびロ
イシンなどが挙げられる。逆に、αヘリックスを形成し
にくいアミノ酸としては、バリン、イソロイシン、プロ
リン、およびグリシンなどが挙げられる。また、本明細
書において、「βシート」とは、タンパク質またはポリ
ペプチドの二次構造の一つであり、ジグザグに伸びたコ
ンホメーションを有する二本以上のポリペプチド鎖が平
行に並び、ペプチドのアミド基およびカルボニル基が、
それぞれ隣接するペプチド鎖のカルボニル基およびアミ
ド基との間に水素結合を形成することによりエネルギー
的に安定なシート状により合わさった構造をいう。な
お、「平行βシート」とは、βシートのうち、隣接する
ポリペプチド鎖のアミノ酸配列の並び方が同じ方向のも
のをいい、「逆平行βシート」とは、βシートのうち、
隣接するポリペプチド鎖のアミノ酸の並び方が逆方向の
ものをいう。さらに、本明細書において、「βストラン
ド」とは、βシートを形成するジグザグに伸びたコンフ
ォメーションを有する１本のペプチド鎖をいう。

【００３２】デカルバミラーゼのカルボキシ末端約３０
残基の領域（配列番号１または２のアミノ酸２８０位付
近〜カルボキシ末端３０３位）は、分子間相互作用によ
り二量体形成に関与していることが明らかとなった。ま
た、本研究に供したデカルバミラーゼ結晶中では、二量
体がさらに分子間相互作用により四量体を形成している
ことが明らかとなった。デカルバミラーゼの４層サンド
イッチ構造は、４本のαヘリックスおよび１２本のβス
トランドの２次構造単位よりなる。表１においては、す
べての２次構造単位を示した。

【００３３】

【表１】

【００３４】以下、本発明のデカルバミラーゼの立体構
造の特徴についてまとめた。

【００３５】（１）６本のβストランドからなるβシー
トが２層に積層し、その両側に各２本のαヘリックスが
密着した４層サンドイッチと呼ばれる構造を有する（図
１および図２）。図１において、アミノ末端から数えて
１，３，５、および６番目のαへリックス４本（それぞ
れ、α１、α３，α５、およびα６と称する）が密着し
ている。

【００３６】（２）βシートは、６本の平行βストラン
ドから主として形成され、立体構造既知のタンパク質に
は見られない配向を有する（図１）。

【００３７】（３）酵素反応を触媒するアミノ酸残基と
してシステイン１残基、グルタミン酸２残基、リジン１
残基、ヒスチジン１残基およびアルギニン２残基を含
む、立体構造既知の酵素にない基質結合様式を有する
（図３）活性部位を形成している（図４）。

【００３８】（４）カルボキシ末端約３０残基の領域
が、分子間相互作用により二量体構造を形成している。

【００３９】なお、上記立体構造の具体的な座標データ
に関しては、プロテインデータバンク（ＰＤＢ、Ｐｒｏ
ｔｅｉｎＤａｔａＢａｎｋ、ＴｈｅＲｅｓｅａｒ
ｃｈＣｏｌｌａｂｏｒａｔｏｒｙＦｏｒＳｔｒｕｃ
ｔｕａｌＢｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ（ＲＣＳＢ）
が運営）にＣｏｍｐｏｕｎｄ：Ｎ−Ｃａｒｂａｍｙｌ−
Ｄ−ＡｍｉｎｏＡｃｉｄＡｍｉｄｏｈｙｄｒｏｌａ
ｓｅ、Ｅｘｐ．Ｍｅｔｈｏｄ：Ｘ−ｒａｙＤｉｆｆｒ
ａｃｔｉｏｎとして登録予定であり、本明細書中でこの
データを援用する。

【００４０】本発明のデカルバミラーゼの立体構造決定
が完成することによって、酵素の触媒活性に関与する残
基を推定し得、さらに酵素単独の立体構造だけでなく、
酵素に基質（例えば、Ｄ−Ｎ−カルバモイル−ヒドロキ
シフェニルグリシン）を結合させた複合体の立体構造モ
デルを分子モデリングの手法（Ｓｗｉｓｓ−ＰＤＢＶｉ
ｅｗｅｒ（前出）、Ａｕｔｏｄｏｃｋ（Ｏｘｆｏｒｄ
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ）、Ｇｕｅｘ、Ｎ．およびＰｅｉｔ
ｓｃｈ，Ｍ．Ｃ．（１９９７）ＳＷＩＳＳ−ＭＯＤＥ
ＬａｎｄｔｈｅＳｗｉｓｓ−ＰＤＢＶｉｅｗｅ
ｒ：Ａｎｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔｆｏｒｃｏｍｐ
ａｒａｔｉｖｅｐｒｏｔｅｉｎｍｏｄｅｌｉｎｇ、
Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ１８、２７１４−２
７２３；Ｍｏｒｒｉｓ，Ｇ．Ｍら、Ｊ．Ｃｏｍｐｕｔａ
ｔｉｏｎａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９：１６３９−
１６６２、１９９８；Ｍｏｒｒｉｓ，Ｇ．Ｍ．ら、Ｊ．
Ｃｏｍｐｕｔａｅｒ−ＡｉｄｅｄＭｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｄｅｓｉｇｎ、１０、２９４−３０４、１９９６；Ｇ
ｏｏｄｓｅｌｌ、Ｄ．Ｓ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇ
ｎｉｔｉｏｎ、９：１−５、１９９６）により容易に構
築し得る。本立体構造および立体構造モデルから、活性
部位に存在し、触媒反応群のアミノ酸残基に関する構造
および活性部位における反応機構に関する知見を入手し
得る。デカルバミラーゼの活性部位は、Ｇｌｕ４６、Ｌ
ｙｓ１２６、Ｈｉｓ１４３、Ｇｌｕ１４５、Ｃｙｓ１７
１、Ａｒｇ１７４およびＡｒｇ１７５のアミノ酸残基を
含む腔（窪み）から形成されている（図４）。アミダー
ゼ、ニトリラーゼなど、デカルバミラーゼと弱い配列類
似性を有する酵素とのアミノ酸配列比較により見出され
る保存されたアミノ酸残基の解析から、Ｇｌｕ４６、Ｌ
ｙｓ１２６、Ｇｌｕ１４５、Ｃｙｓ１７１が触媒反応に
強く関与していることが示唆される。特にＣｙｓ１７１
は、酵素反応の中間体であるアシル中間体を形成するの
に必須な触媒残基と推定され（図３）、デカルバミラー
ゼがシステインヒドラーゼであることを示している。本
知見は、Ｃｙｓ１７１のＳｅｒ１７１への変異で触媒活
性が失われる実験事実にも一致している（Ｒ．Ｇｒｉｆ
ａｎｔｉｎｉら、（１９９６）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．２７１，９３２６−９３３１）。Ａｒｇ１７４およ
びＡｒｇ１７５の役割は、基質であるＤ−Ｎ−α−カル
バミルアミノ酸のカルボキシル基を静電相互作用によっ
て、安定化することに寄与していると考えられる。

【００４１】これら立体構造より得られた知見に基づい
て、デカルバミラーゼの安定性向上または酵素活性の向
上を目的とした改変設計を行い得る。本明細書におい
て、酵素の「安定性」とは、通常の生体環境よりも高い
温度（例えば７０℃）で酵素を変性させた後でも、酵素
活性が熱変性前と比較して、少なくとも１０％、好まし
くは少なくとも２５％、より好ましくは少なくとも５０
％、さらに好ましくは少なくとも８０％、最も好ましく
は少なくとも９０％残存していることをいう。安定性の
向上は、例えば、ΔＴｍ（変性温度の差分）で測定し得
る。本明細書において「酵素活性」とは、デカルバミラ
ーゼについて言及する場合、Ｄ−Ｎ−カルバモイル−α
−アミノ酸を対応するＤ−α−アミノ酸に変換する活性
をいう。

【００４２】本明細書において、変異体分子の「設計方
法」または「分子設計手法」とは、変異前のタンパク質
またはポリペプチド分子（例えば、天然型分子）のアミ
ノ酸配列および立体構造を解析することによって、各ア
ミノ酸がどのような特性（例えば、触媒活性、他の分子
との相互作用など）を担うかを予測し、所望の特性の改
変（例えば、触媒活性の向上、タンパク質の安定性の向
上など）をもたらすために適切なアミノ酸変異を算出す
ることをいう。この設計方法は、好ましくはコンピュー
ターを用いて行われる。このような設計方法で用いられ
るコンピュータープログラムの例としては、本明細書に
おいて言及されるように、以下が挙げられる：構造を解
析するプログラムとして、Ｘ線回折データの処理プログ
ラムであるＤＥＮＺＯ（マックサイエンス）；位相を決
定するための処理プログラムとして、ＰＨＡＳＥＳ（Ｕ
ｎｉｖ．ｏｆＰｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ、ＰＡ、ＵＳ
Ａ）；初期位相の改良のためのプログラムとして、プロ
グラムＤＭ（ＣＣＰ４パッケージ、ＳＥＲＣ）；３次元
グラフィックスを得るためのプログラムとしてプログラ
ムＯ（ＵｐｐｓａｌａＵｎｉｖｅｒｓｉｔｅｔ、Ｕｐ
ｐｓａｌａ、スウェーデン）；立体構造精密化プログラ
ムとして、ＸＰＬＯＲ（ＹａｌｅＵｎｉｖｅｒｓｉｔ
ｙ、ＣＴ、ＵＳＡ）；そして、変異導入モデリングのた
めのプログラムとして、Ｓｗｉｓｓ−ＰＤＢＶｉｅｗｅ
ｒ（前出）。

【００４３】本明細書中において、変異体の設計に利用
されるアミノ酸変異としては、アミノ酸の置換のほか
に、アミノ酸の付加、欠失、または修飾もまた挙げられ
る。アミノ酸の置換とは、もとのペプチドを１つ以上、
例えば、１〜２０個、好ましくは１〜１０個、より好ま
しくは１〜５個のアミノ酸で置換することをいう。アミ
ノ酸の付加とは、もとのペプチド鎖に１つ以上、例え
ば、１〜２０個、好ましくは１〜１０個、より好ましく
は１〜５個のアミノ酸を付加することをいう。アミノ酸
の欠失とは、もとのペプチドから１つ以上、例えば、１
〜２０個、好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜
５個のアミノ酸を欠失させることをいう。アミノ酸修飾
は、アミド化、カルボキシル化、硫酸化、ハロゲン化、
アルキル化、グリコシル化、リン酸化、水酸化、アシル
化（例えば、アセチル化）などを含むが、これらに限定
されない。置換、または付加されるアミノ酸は、天然の
アミノ酸であってもよく、非天然のアミノ酸、またはア
ミノ酸アナログでもよい。天然のアミノ酸が好ましい。

【００４４】用語「天然のアミノ酸」とは、天然のアミ
ノ酸のＬ-異性体を意味する。天然のアミノ酸は、グリ
シン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セ
リン、メチオニン、トレオニン、フェニルアラニン、チ
ロシン、トリプトファン、システイン、プロリン、ヒス
チジン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン
酸、グルタミン、γ-カルボキシグルタミン酸、アルギ
ニン、オルニチン、およびリジンである。特に示されな
い限り、本明細書でいう全てのアミノ酸はＬ体である。

【００４５】用語「非天然アミノ酸」とは、タンパク質
中で通常は天然に見出されないアミノ酸を意味する。非
天然アミノ酸の例として、ノルロイシン、パラ−ニトロ
フェニルアラニン、ホモフェニルアラニン、パラ−フル
オロフェニルアラニン、３−アミノ−２−ベンジルプロ
ピオン酸、ホモアルギニンのＤ体またはＬ体およびＤ−
フェニルアラニンが挙げられる。

【００４６】「アミノ酸アナログ」とは、アミノ酸では
ないが、アミノ酸の物性および／または機能に類似する
分子をいう。アミノ酸アナログとしては、例えば、エチ
オニン、カナバニン、２−メチルグルタミンなどが挙げ
られる。

【００４７】本発明のさらなる実施態様において、デカ
ルバミラーゼの変異体はまた、アンモニウム塩（アルキ
ルまたはアリールアンモニウム塩を含む）、硫酸塩、硫
酸水素塩、リン酸塩、リン酸水素塩、リン酸二水素塩、
チオ硫酸塩、炭酸塩、重炭酸塩、安息香酸塩、スルホン
酸塩、チオスルホン酸塩、メシレート（メチルスルホン
酸）塩、エチルスルホン酸塩、およびベンゼンスルホン
酸塩のようなペプチドの塩の形態を取り得る。

【００４８】以下、変異体を生成するためのタンパク質
のアミノ酸の変異について議論する。アミノ酸の置換な
どを実施する方法は、化学合成、または遺伝子工学を利
用する技術においてアミノ酸をコードするＤＮＡ配列の
コドンを変化させることを含むが、これらに限定されな
い。

【００４９】あるアミノ酸は、相互作用結合能力の明ら
かな低下または消失なしに、例えば、カチオン性領域ま
たは基質分子の結合部位のようなタンパク質構造におい
て他のアミノ酸に置換され得る。あるタンパク質の生物
学的機能を規定するのは、タンパク質の相互作用能力お
よび性質である。従って、特定のアミノ酸の置換がアミ
ノ酸配列において、またはそのＤＮＡコード配列のレベ
ルにおいて行われ得、置換後もなお、もとの性質を維持
するタンパク質が生じ得る。従って、生物学的有用性の
明らかな損失なしに、種々の改変が、開示されたペプチ
ドまたはこのペプチドをコードする対応するＤＮＡにお
いて行われ得る。

【００５０】上記のような改変を設計する際に、アミノ
酸の疎水性指数が考慮され得る。タンパク質における相
互作用的な生物学的機能を与える際の疎水性アミノ酸指
数の重要性は、一般に当該分野で認められている（Ｋｙ
ｔｅ．ＪおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ，Ｒ．Ｆ．Ｊ．Ｍｏ
ｌ．Ｂｉｏｌ．１５７（１）：１０５−１３２，１９
８２）。アミノ酸の疎水的性質は、生成したタンパク質
の二次構造に寄与し、次いでそのタンパク質と他の分子
（例えば、酵素、基質、レセプター、ＤＮＡ、抗体、抗
原など）との相互作用を規定する。各アミノ酸は、それ
らの疎水性および電荷の性質に基づく疎水性指数を割り
当てられる。それらは：イソロイシン（＋４．５）；バ
リン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルア
ラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．
５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．
８）；グリシン（−０．４）；スレオニン（−０．
７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．
９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；
ヒスチジン（−３．２）；グルタミン酸（−３．５）；
グルタミン（−３．５）；アスパラギン酸（−３．
５）；アスパラギン（−３．５）；リジン（−３．
９）；およびアルギニン（−４．５））である。

【００５１】あるアミノ酸を、同様の疎水性指数を有す
る他のアミノ酸により置換して、そして依然として同様
の生物学的機能を有するタンパク質（例えば、酵素活性
おいて等価なタンパク質）を生じさせ得ることが当該分
野で周知である。このようなアミノ酸置換において、疎
水性指数が±２以内であることが好ましく、±１以内で
あることがより好ましく、および±０．５以内であるこ
とがさらにより好ましい。疎水性に基づくこのようなア
ミノ酸の置換は効率的であることことが当該分野におい
て理解される。米国特許第４、５５４、１０１号に記載
されるように、以下の親水性指数がアミノ酸残基に割り
当てられている：アルギニン（＋３．０）；リジン（＋
３．０）；アスパラギン酸（＋３．０±１）；グルタミ
ン酸（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラ
ギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン
（０）；スレオニン（−０．４）；プロリン（−０．５
±１）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．
５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．
３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イ
ソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェ
ニルアラニン（−２．５）；およびトリプトファン（−
３．４）。アミノ酸が同様の親水性指数を有しかつ依然
として生物学的等価体を与え得る別のものに置換され得
ることが理解される。このようなアミノ酸置換におい
て、親水性指数が±２以内であることが好ましく、±１
以内であることがより好ましく、および±０．５以内で
あることがさらにより好ましい。

【００５２】本発明において、「保存的置換」とは、ア
ミノ酸置換において、元のアミノ酸と置換されるアミノ
酸との親水性指数または／および疎水性指数が上記のよ
うに類似している置換をいう。保存的置換の例は、当業
者に周知であり、例えば、次の各グループ内での置換：
アルギニンおよびリジン；グルタミン酸およびアスパラ
ギン酸；セリンおよびスレオニン；グルタミンおよびア
スパラギン；ならびにバリン、ロイシン、およびイソロ
イシン、などが挙げられるがこれらに限定されない。

【００５３】酵素の比活性向上および反応の至適ｐＨの
最適化を目指した分子設計においては、立体構造から得
られた触媒反応機構に関する情報は極めて有用である。
本発明においては、デカルバミラーゼのＣｙｓ１７１の
側鎖スルフィド（ＳＨ）基のｐＫａを変化させることに
よって、比活性および至適ｐＨの変化を伴うアミノ酸変
異を設計し得る。具体的には、タンパク質の静電ポテン
シャル計算（高橋ら、（１９９２）、Ｂｉｏｐｏｌｙｍ
ｅｒｓ３２，８９７−９０９）により、ＳＨ基のｐＫ
ａに対するアミノ酸変異の効果を見積もることができ、
適切なアミノ酸変異を設計し得る。例えば、Ｃｙｓ１７
１の硫黄原子近傍の静電場をより正の電場にし、Ｃｙｓ
１７１のチオール基（ＳＨ）の解離を促進させ、かつＧ
ｌｕ４６および／またはＧｌｕ１４５の側鎖カルボキシ
基近傍の静電場にはあまり影響しない変異が望ましい。

【００５４】本発明のデカルバミラーゼの立体構造か
ら、デカルバミラーゼ中に存在する５つのシステイン残
基は、触媒活性および空気酸化に対する耐性等の機能、
物性に関与していることが推定される。デカルバミラー
ゼのシステイン残基の役割については、上記菌株（Ａｇ
ｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｓｐ．ＫＮＫ７１２（カネカ
菌））由来のデカルバミラーゼと比較して、高い配列相
同性を有する、異なる菌株（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕ
ｍｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒＮＲＲＬＢ１１２９
１）由来のデカルバミラーゼについて、アミノ酸変異な
らびに変性剤およびＣｙｓ修飾試薬の組合せによる研究
がなされている（Ｒ．Ｇｒｉｆａｎｔｉｎｉら、（１９
９６）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１，９３２６−
９３３１）。この研究では、５残基のシステインはいず
れもジスルフィド結合の形成には関与しないこと、Ｃｙ
ｓ１７１に対応するＡ．ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒＮ
ＲＲＬＢ１１２９１由来のデカルバミラーゼのＣｙｓ１
７２のＳｅｒへの置換で触媒活性が失われるが、それ以
外のシステインの変異では触媒活性に影響がないことか
ら、Ｃｙｓ１７１が触媒活性に必須であることが推定さ
れている。これは、他の類縁酵素においても、対応する
システイン残基が保存されていることからも強く示唆さ
れる。本明細書中において、「対応する」アミノ酸と
は、あるタンパク質分子またはポリペプチド分子におい
て、比較の基準となるタンパク質またはポリペプチドに
おける所定のアミノ酸と同様の作用を有するか、または
有することが予測されるアミノ酸をいい、特に酵素分子
にあっては、活性部位中の同様の位置に存在し触媒活性
に同様の寄与をするアミノ酸をいう。

【００５５】配列番号１および２のアミノ酸配列を有す
るデカルバミラーゼでは、また、Ｃｙｓ１９２およびＣ
ｙｓ２４９は化学修飾を受け難く、分子内に埋もれてい
ることが、そしてＣｙｓ２４２およびＣｙｓ２７８は容
易に化学修飾を受け、分子表面のループ構造部分に位置
していることが推定されている。配列番号１のＣｙｓ２
４２およびＣｙｓ２７８に対応する、Ａ．ｒａｄｉｏ
ｂａｃｔｅｒＮＲＲＬＢ１１２９１の２残基（それ
ぞれ、Ｃｙｓ２４３およびＣｙｓ２７９）のシステイン
をアラニンに置換することで安定性を向上した変異体が
取得されている（特開平８−８４５８４号公報）。上記
のように、Ｃｙｓ２４２およびＣｙｓ２７８について
は、立体構造から分子表面に存在することが確認され、
これらＣｙｓ残基がデカルバミラーゼの空気酸化に対す
る耐性に関与していることが示唆される。分子内に埋も
れたＣｙｓ１９２およびＣｙｓ２４９については、空気
酸化に対する耐性向上への寄与は大きくないと推定され
るが、側鎖体積あるいは分子内空孔を補完するように、
より嵩高い疎水性アミノ酸残基に置換した変異体を作製
することにより、熱または有機溶剤に対する安定性の向
上したデカルバミラーゼが創製され得る。

【００５６】デカルバミラーゼの空気酸化による酵素活
性の低下および保存安定性には、システイン残基だけで
なくメチオニン残基の関与も考えられ得る。本発明のデ
カルバミラーゼの立体構造から、デカルバミラーゼ中に
ある９つのメチオニン残基のうち、完全に分子内部に埋
もれたものが５残基存在する一方で、完全に分子外部に
露出したものが２残基（Ｍｅｔ２３８およびＭｅｔ２４
３）ターン構造部分に存在し、この２残基はデカルバミ
ラーゼの空気酸化に対する耐性に大きく関わっているこ
とが推定される。本明細書において「ターン」構造また
は「βターン」構造とは、タンパク質の立体構造におい
て、二次構造の間で、ペプチド主鎖の進み方向を大きく
変化させる３つ以上のアミノ酸残基からなる局所構造を
いう。また、Ｍｅｔ４およびＭｅｔ７２は、分子表面近
傍に存在し、ほとんど分子内部に埋もれているが溶媒分
子等ものの容易に接触し得る部位にあるため、これらも
デカルバミラーゼの空気酸化に対する耐性に関与してい
る可能性がある。これら構造的知見から、デカルバミラ
ーゼの空気酸化に対する耐性向上が期待される別のアミ
ノ酸置換を設計し得る。すなわち、Ｍｅｔ４およびＭｅ
ｔ７２を、側鎖体積あるいは分子内空孔を補完し、かつ
空気酸化を受けない疎水性アミノ酸残基に置換した変異
体を作製することにより耐性向上を達成し得る。Ｍｅｔ
２３８およびＭｅｔ２４３は、完全に分子外部に露出し
ていることから、好ましくはこれら残基を空気酸化を受
けない中性あるいは親水性アミノ酸に置換することによ
り耐性の向上を達成し得る。さらに、デカルバミラーゼ
のアミノ酸Ｍｅｔ２３８からＭｅｔ２４３までの領域に
より構成されるターン構造部分には、空気酸化に弱いＣ
ｙｓ２４２も含まれることから、これら３残基を適切な
アミノ酸に置換した３重変異体を作製、あるいは３残基
を含むターン構造を欠失した変異体を作製することによ
って、空気酸化に対する耐性を向上し得る。また、これ
ら残基を含むターン構造の配列を他のタンパク質のβタ
ーン構造と入れ替えることによっても、空気酸化に対す
る耐性を向上し得る。システインおよびメチオニンの変
異体設計においては、これら残基を他のアミノ酸にコン
ピューター上で変異させ、変異体の安定性について構造
エネルギーを解析することにより、最適なアミノ酸を選
択し得る。

【００５７】システイン残基およびメチオニン残基以外
にも、タンパク質分子内の空孔（例えば、デカルバミラ
ーゼのアミノ酸Ａｓｎ９２の近傍に形成される空孔）を
補填するアミノ酸変異、エネルギー的に不利なコンフォ
メーションを有するアミノ酸（例えば、デカルバミラー
ゼのアミノ酸Ｐｒｏ２０３およびＶａｌ２３６）の変
異、およびαヘリックス構造の安定化など、一般的に知
られているタンパク質の安定化要因に着目した設計も行
い得る。

【００５８】前記アミノ酸変異による改変設計と異なる
設計戦略として、デカルバミラーゼの酵素活性に関与し
ないと推定される領域を欠失させ、デカルバミラーゼを
より低分子量の酵素へと改変することにより安定性を向
上させ得る。例えば、活性部位から離れた位置にあるル
ープ状構造領域の一部または全部を欠失させることによ
り、より緻密なデカルバミラーゼへと改変し得る。ま
た、デカルバミラーゼのカルボキシ末端から約３０残基
の領域は、二量体形成に関与していることが本発明者ら
により推定された。デカルバミラーゼは、一般的な緩衝
液中において触媒能を示す場合は、二量体あるいは四量
体として存在すると推定される。他方、タンパク質の変
性状態からの巻き戻り過程からは、単量体タンパク質の
方が有利であると推定される。カルボキシ末端約３０残
基の領域の一部または全部を欠失することにより、二量
体形成を阻害し、安定な単量体を調製し得る。工業的に
は、デカルバミラーゼは担体に固定化したいわゆる固定
化酵素として利用されるが、この場合も単量体の方が、
より効率的な固定化を達成し得る。

【００５９】本発明におけるデカルバミラーゼ変異体
は、上記の方法以外にも、多くの方法により設計または
調製され得る。例えば、デカルバミラーゼ活性を有する
酵素の配列は、本発明を用いて変異に望ましいと同定さ
れた部位において、オリゴヌクレオチド特異的変異誘発
または他の従来の技術（例えば、欠失）手段により変異
され得る。あるいは、デカルバミラーゼの変異体は、特
定のアミノ酸の、天然に存在しないアミノ酸での部位特
異的置換により作製され得る。例えば、デカルバミラー
ゼ変異体は、特定のシステインまたはメチオニン残基
の、セレノシステインまたはセレノメチオニンとの置換
により作製され得る。これは、天然システインまたはメ
チオニンのいずれか（あるいは両方）を涸渇させ、かつ
セレノシステインまたはセレノメチオニン（あるいは両
方）を富化した増殖培地上で、野生型ポリペプチドまた
は変異体ポリペプチドのいずれかを発現し得る宿主生物
を増殖させることにより達成され得る。相同組換え法を
用いる場合、合成オリゴヌクレオチドを用いて、デカル
バミラーゼをコードするＤＮＡ配列中に変異が導入され
得る。これらのオリゴヌクレオチドは所望の変異部位に
隣接するヌクレオチド配列を含む。変異は、デカルバミ
ラーゼの完全長ＤＮＡ配列、あるいはそのフラグメント
ポリペプチドをコードする任意の配列中に作製され得
る。

【００６０】本発明に従って、上記方法または当該分野
で公知の代替方法により産生される変異デカルバミラー
ゼＤＮＡ配列は、発現ベクターを用いて発現され得る。
当該分野で周知であるように、発現ベクターは、典型的
には宿主ゲノムから独立した宿主細胞中での自己複製を
可能にするエレメント、および選択目的のための１つ以
上の表現型マーカーを含む。所望のデカルバミラーゼ変
異体コード配列を囲むＤＮＡ配列の挿入の前または後
に、発現ベクターはまた、プロモーター、オペレータ
ー、リボソーム結合部位、翻訳開始シグナル、および必
要に応じてリプレッサー遺伝子または種々のアクチベー
ター遺伝子ならびに終止シグナルをコードする制御配列
を含む。いくつかの実施態様において、産生された変異
体の分泌が所望される場合、「シグナル配列」をコード
するヌクレオチドがデカルバミラーゼ変異体コード配列
の前に挿入され得る。制御配列の制御下での発現のため
には、所望のＤＮＡ配列は、制御配列に作動可能に連結
されなければならない。すなわち、制御配列の制御下に
あるデカルバミラーゼ変異体をコードする配列は、この
配列の発現産物の産生を可能にするために、適切なリー
ディングフレームを維持するように開始シグナル（すな
わちＡＴＧ）を有さなければならない。

【００６１】広範な周知の利用可能な発現ベクターは、
いずれも本発明の変異されたデカルバミラーゼコード配
列を発現するのに有用である。これらは、公知の細菌プ
ラスミド（例えば、ｐＢＲ３２２）、より広い宿主域
のプラスミド（例えば、ＲＰ４、ファージＤＮＡ）、２
μプラスミドまたはそれらの誘導体のような酵母プラス
ミドならびにプラスミドおよびファージＤＮＡの組合わ
せから得られるベクターのような、染色体ＤＮＡ配列、
非染色体ＤＮＡ配列および合成ＤＮＡ配列のセグメント
からなるベクターを包含する。

【００６２】さらに、ＤＮＡ配列に作動可能に連結した
場合、その発現を制御する、任意の広範な発現制御配列
が、本発明による変異されたＤＮＡ配列を発現するため
にこれらのベクター中で使用される。このような有用な
発現制御配列としては、例えば、ウイルスの遺伝子発現
を制御することが公知である他の配列およびこれらの組
み合わせが挙げられる。

【００６３】広範な種の宿主がまた、本発明によるデカ
ルバミラーゼ変異体の産生に有用である。これらの宿主
として、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓおよ
びＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓのような細菌、酵母のよう
な真菌、ＣＨＯ細胞のような動物細胞、植物細胞および
トランスジェニック宿主細胞が挙げられる。

【００６４】すべての発現ベクターおよび発現系が、本
発明の変異ＤＮＡ配列を発現し、そしてデカルバミラー
ゼ変異体を産生するのに、同じ様式で機能するとは限ら
ないことが理解されるべきである。全ての宿主が同一の
発現系を用いて等しく良好に機能するわけではない。し
かし、当業者は、過度な実験を行うことなくそして本発
明の範囲を逸脱することなく、適切なベクター、発現制
御配列および宿主を選択し得る。

【００６５】例えば、選択の際は、そのベクターの複製
能力が考慮されねばならない。発現制御配列の選択の
際、種々の要因がまた考慮されるべきである。これら
は、例えば、系の相対的強度、その制御能力、本発明の
デカルバミラーゼ変異体をコードするＤＮＡ配列との適
合性、特に潜在的二次構造に関する適合性がまた考慮さ
れるべきである。宿主は、選択されたベクターとの適合
性、宿主に対するデカルバミラーゼ変異体の毒性、成熟
産物を分泌する能力、タンパク質を適切に折り畳む能力
および適切な高次構造を形成する能力、発酵要求性、宿
主からのデカルバミラーゼ変異体の精製の容易さおよび
安全性の考察により選択されるべきである。これらのパ
ラメーター内で、当業者は有用な量の変異デカルバミラ
ーゼを産生し得る、種々のベクター／発現制御系／宿主
の組合わせを選択し得る。

【００６６】これらの系または他の系で産生されるデカ
ルバミラーゼ変異体は、デカルバミラーゼ活性を有する
天然の酵素を精製するために使用される工程を含む種々
の従来の工程により、精製され得る。

【００６７】一旦、デカルバミラーゼへの変異が所望の
位置（例えば、活性部位、安定性に関する部位、または
結合部位など）で作製されると、得られた変異体は、目
的のいくつかの特性のいずれかについて試験され得る。

【００６８】例えば、変異体は、生理学的ｐＨにおける
荷電の変化についてスクリーニングされ得る。これは変
異前のデカルバミラーゼの等電点（ｐＩ）と比較したデ
カルバミラーゼ変異体の等電点を測定することにより決
定される。等電点は、Ｗｅｌｌｎｅｒ，Ｄ．、Ａｎａ
ｌｙｔ．Ｃｈｅｍ．、４３、５９７頁（１９７１）
の方法によるゲル電気泳動により測定される。表面荷電
が変化した変異体は、本発明の構造情報により提供され
るように、酵素の表面に位置する置換アミノ酸によって
変化したｐＩを有するデカルバミラーゼタンパク質であ
る。

【００６９】さらに、変異体は、変異前のデカルバミラ
ーゼと比較して高い比活性についてスクリーニングされ
得る。変異体の活性は、例えば、本明細書中に記載のア
ッセイ（下記の実施例７を参照のこと）を用いて、Ｄ
−Ｎ−カルバモイル−α−アミノ酸のＤ−α−アミノ酸
類への変換能力を測定することにより決定される。

【００７０】本発明のデカルバミラーゼ変異体を利用し
て製造されたＤ−α−アミノ酸類は、医薬中間体（例え
ば、Ｄ−フェニルグリシンおよびＤ−パラヒドロキシフ
ェニルグリシン）として、医薬（例えば、合成ペニシリ
ンおよび合成セファロスポリン）の製造に利用し得る。
このように製造した医薬を含有する薬学的組成物もま
た、本発明に従って提供され得る。薬学的組成物は、賦
形剤、安定剤、キャリアなどを含む薬学的に受容可能な
任意の補助成分を含有し得る。

【００７１】本発明のデカルバミラーゼ変異体を利用し
て製造されたＤ−α−アミノ酸類を農薬中間体（例え
ば、Ｄ−バリン）として、農薬（例えば、フルバリネー
ト）の製造に利用し得る。このように製造した農薬を含
有する農薬組成物もまた本発明に従って提供され得る。
本明細書中において、農学組成物は、賦形剤、安定剤、
キャリアなどの農学的に受容可能な任意の補助成分を含
有し得る。

【００７２】本発明のデカルバミラーゼ変異体を利用し
て製造されたＤ−α−アミノ酸類を食品添加物の中間体
（例えば、Ｄ−アラニンおよびＤ−アスパラギン酸）と
して、食品添加物（例えば、アリテーム）の製造に利用
し得る。

【００７３】本発明のさらに他の実施態様において、デ
カルバミラーゼ変異体またはそれに類似する酵素のイン
ヒビターが設計され、そして製造され得る。インヒビタ
ーは、デカルバミラーゼの構造情報を利用して設計され
得る。当業者は、例えば、Ｓｅｇｅｌ，Ｉ．Ｈ．、Ｅｎ
ｚｙｍｅＫｉｎｅｔｉｃｓ、Ｊ．Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏ
ｎｓ、（１９７５）による標準式を用いるコンピュータ
ー適合酵素反応速度論データにより、インヒビターが競
合的、不競合的、または非競合的であることを同定し得
る。さらに、デカルバミラーゼまたはその類似酵素の反
応中間体（例えば、基質または反応生成物との複合体の
立体構造）の情報を用いて、インヒビターを設計するこ
とが可能である。このような情報は、公知のデカルバミ
ラーゼまたはその類似酵素インヒビターとして公知の化
合物の改良アナログの設計、および新規クラスのインヒ
ビターの設計に有用である。

【００７４】本発明のさらに別の実施態様において、本
発明のデカルバミラーゼの立体構造を利用して、デカル
バミラーゼのアミノ酸配列に類似するポリペプチド酵素
またはタンパク質酵素（例えば、アミダーゼまたはニト
リラーゼ）を改変し得る。改変は、上記の変異体の設計
と同様の指針に従って行われ得る。ここで、「類似す
る」ポリペプチド酵素またはタンパク質酵素は、好まし
くは、そのアミノ酸配列が、配列番号１または２に示さ
れるデカルバミラーゼのアミノ酸配列と、全長アミノ酸
配列について、代表的には少なくとも３０％、好ましく
は、少なくとも５０％、より好ましくは、少なくとも８
０％同一であり、特にデカルバミラーゼの活性部位を規
定する領域（配列番号１または２のアミノ酸Ｇｌｕ４
６、Ｌｙｓ１２６、Ｇｌｕ１４５、およびＣｙｓ１７１
を含む、アミノ酸番号３８〜４９，１０８〜１２７，１
４３〜１４８および１６４〜１７７の範囲）内のアミノ
酸について、代表的には、少なくとも６０％、好ましく
は少なくとも８０％、より好ましくは９０％、さらに好
ましくは９５％同一である。

【００７５】ある酵素についての特性を、類似する酵素
の立体構造を用いて変換した例には、エクスパンダーゼ
（Ｅｘｐａｎｄａｓｅ）と称する酵素の基質特異性変換
に類似構造を有するイソペニシリン合成酵素の立体構造
を利用した研究がある。国際公開ＷＯ９７／０２００５
号パンフレットを参照のこと。この文献においては、立
体構造がすでに決定されたイソペニシリン合成酵素（Ｒ
ｏａｃｈ（１９９５）、Ｎａｔｕｒｅ、３７５、７００
〜７０４頁）と一次構造（アミノ酸配列）に類似性があ
り、その立体構造が類似することが示唆されていたエク
スパンダーゼの基質認識に関与するアミノ酸残基を両方
の酵素の配列比較によって同定し、それらのアミノ酸残
基の変異によってエクスパンダーゼの基質特異性を変換
してペニシリンＧに作用する変異酵素を作製することに
成功している。

【００７６】アミノ酸配列の同一性の比較は、例えば、
以下の配列分析用ツールを用いて算出し得る：ＦＡＳＴ
Ａ（Ｗ．Ｒ．ＰｅａｒｓｏｎおよびＤ．Ｊ．Ｌｉｐｍａ
ｎ、ＰＮＡＳ８５、２４４４−２４４８（１９８
８））；ＢＬＡＳＴ（Ｓ．Ｆ．Ａｌｔｓｃｈｕｌ、Ｔ．
Ｌ．Ｍａｄｄｅｎ、Ａ．Ａ．Ｓｃｈａｆｆｅｒ、Ｊ，−
Ｈ．、Ｚｈａｎｇ、Ｚ．Ｚｈａｎｇ、Ｗ．Ｍｉｌｌｅ
ｒ、およびＤ．Ｊ．Ｌｉｐｍａｎ（１９９７）Ｎｕｃ
ｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２
（１９９７））；ＵｎｉｘベースのＧＣＧＷｉｓｃｏｎ
ｓｉｎＰａｃｋａｇｅ（ＰｒｏｇｒａｍＭａｎｕａｌｆ
ｏｒｔｈｅＷｉｓｃｏｎｓｉｎＰａｃｋａｇｅ、Ｖｅｒ
ｓｉｏｎ８、１９９４年９月、ＧｅｎｅｔｉｃｓＣｏｍ
ｐｕｔｅｒＧｒｏｕｐ、５７５ＳｃｉｅｎｃｅＤｒｉｖ
ｅＭａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ、ＵＳＡ５３７
１１；Ｒｉｃｅ、Ｐ．（１９９６）ＰｒｏｇｒａｍＭａ
ｎｕａｌｆｏｒＥＧＣＧＰａｃｋａｇｅ、ＰｅｔｅｒＲ
ｉｃｅ、ＴｈｅＳａｎｇｅｒＣｅｎｔｒｅ、Ｈｉｎｘｔ
ｏｎＨａｌｌ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＣＢ１０１ＲＱ、
Ｅｎｇｌａｎｄ）およびｔｈｅＥｘＰＡＳｙＷｏｒｌｄ
ＷｉｄｅＷｅｂ分子生物学用サーバー（ＧｅｎｅｖａＵ
ｎｉｖｅｒｓｉｔｙＨｏｓｐｉｔａｌａｎｄＵｎｉｖｅ
ｒｓｉｔｙｏｆＧｅｎｅｖａ、Ｇｅｎｅｖａ、Ｓｗｉｔ
ｚｅｒｌａｎｄ）およびＭａｃＶｅｃｔｏｒ６．０
（帝人システムテクノロジー）。

【００７７】本発明に従って、上記方法を利用して得ら
れた、デカルバミラーゼのアミノ酸配列に類似するポリ
ペプチド酵素またはタンパク質酵素の変異体が提供され
得る。これらの酵素の変異体は、その野生型酵素に代え
て、例えばバイオリアクターなどで、使用され得る。

【００７８】本発明に従って、デカルバミラーゼなどの
上記分子の立体構造の３次元座標データおよび／または
分子設計手法および／または改変方法のプログラムを記
録した電磁気記憶媒体もまた提供され得る。電磁気媒体
としては、例えば、磁気テープ、磁気ディスク、光磁気
ディスク、光ディスク媒体などが挙げられる。

【００７９】以下の実施例にて、本発明をさらに詳細に
説明するが、これらは本発明の例示の目的で提供される
ものであり、なんら本発明を限定するものではない。

【００８０】

【実施例】以下の実施例で使用した試薬類は、言及した
場合を除き、ナカライテスク、和光純薬、またはＳＩＧ
ＭＡ（ＳｔＬｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）から入手し
た。

【００８１】（実施例１）デカルバミラーゼのネイティ
ブ結晶の調製公知の方法（Ｈ．Ｎａｎｂａら、Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏ
ｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６２、８７５−８８
１（１９９８）を参照のこと）により得られたデカルバ
ミラーゼを１０〜２０ｍｇ／ｍｌの濃度に調製したデカ
ルバミラーゼ溶液（０．００１ＭＨＥＰＥＳ緩衝液、
ｐＨ７．５）１０μｌおよび沈澱剤として１５〜２０重
量％ポリエチレングリコール６０００（ナカライテスク
社製）、０．２Ｍ塩化リチウムを含む０．１ＭＨＥＰ
ＥＳ緩衝液、ｐＨ７．５（シグマ社製）１０μｌを液滴
台上で混合し、前記沈澱剤組成をもつ溶液３００μｌを
リザーバー溶液として密封した後、蒸気拡散法により２
０〜２５℃で結晶化を行った。結晶化開始後、約２日か
ら二週間程度で０．３×０．３×０．１ｍｍ〜０．６×
０．６×０．３ｍｍの寸法にまで結晶が成長した。

【００８２】（実施例２）デカルバミラーゼの重原子誘
導体結晶の調製実施例１で得られたネイティブ結晶を顕微鏡下、液滴台
上の小滴より取り出し、水銀化合物の一つであるＥＭＴ
Ｓ（エチル水銀チオサリチル酸ナトリウム塩）濃度を
０．５〜１．０ｍＭに調製した２０重量％ポリエチレン
グリコール６０００（ナカライテスク製）、０．２Ｍ塩
化リチウムを含む０．１ＭＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ
７．５）に終夜浸漬させることにより重原子誘導体を調
製した。

【００８３】（実施例３）デカルバミラーゼ結晶の凍結実施例１および２で調製したデカルバミラーゼのネイテ
ィブ結晶および重原子誘導体結晶を、グリセロール等の
凍結安定化剤を添加することなく、結晶化液滴から取り
出し、直接液体窒素に浸漬して瞬間凍結した。

【００８４】（実施例４）デカルバミラーゼ結晶のＸ線
回折データの収集多波長異常分散法による解析を行うため、放射光施設Ｓ
Ｐｒｉｎｇ−８で回折データ測定を行った。測定には、
液体窒素中で凍結したＥＭＴＳ誘導体結晶を用いて行っ
た。測定は、水銀の異常分散を考慮した３波長（０．９
８、１．００、１．２７Å）で行った。３波長の回折デ
ータはすべて１個の結晶から収集することできた。測定
した５３フレーム分の回折画像データをデータ処理プロ
グラムＤＥＮＺＯ（ＭｃＳｃｉｅｎｃｅ）にて処理した
結果を表２に示した。デカルバミラーゼのネイティブ結
晶については、１．００Å波長を用いて凍結状態で回折
データ測定を行い、その処理結果を表３に示した。な
お、独立反射数、単位格子定数または格子定数などの用
語についてはＸ線解析入門（角戸正夫ら、東京化学同
人）を参照のこと。

【００８５】

【表２】

【００８６】

【表３】

【００８７】（実施例５）重原子座標の決定および位相
改良ＥＭＴＳ誘導体結晶について測定した３波長の回折デー
タのうち１．００Åのデータをネイティブ結晶のデータ
と仮定して０．９８Åをアノマラス（ａｎｏｍａｌｏｕ
ｓ）、１．２７Åをアイソモルファス（ｉｓｏｍｏｒｐ
ｈｏｕｓ）データとして、差パターソン関数およびアノ
マラス差パターソン関数を計算し、そのハーカー面（差
パターソン図と呼ばれる。図５〜図７）を描き、ハーカ
ー面上の強度の強いピーク位置とそのクロスベクトルに
相当する顕著なピーク位置から重原子位置の同定を試み
た。各のハーカー面で強度の強いパターソンピークを２
つの差パターソン図（１．００−０．９８Åのデータ間
および１．００−１．２７Åのデータ間）から選び出
し、２つの水銀原子（水銀１および水銀２）を同定し、
その座標を求めた。確認は、まず、水銀１のみの座標を
用いて位相を計算し、その位相を使って差フーリエ計算
から水銀２の座標を計算し、水銀２の自己ピークおよび
水銀１−水銀２の交差ピークが差パターソン図に存在す
るかどうかで判定することにより行った。これら以外に
結合した水銀原子の位置を見いだすために、水銀１およ
び２の座標を用いて重原子位置パラメータの精密化およ
び位相計算を行い、差フーリエ計算によりその位置を求
め、水銀２を同定した場合と同様に自己ピークおよび交
差ピークの確認を行った。その結果、さらに４個の水銀
原子に相当する自己ピークおよび交差ピークを確認する
ことができ、水銀３、水銀４、水銀５および水銀６の座
標を決定した。

【００８８】波長１．００Åで測定した１．８Å分解能
のＥＭＴＳ誘導体結晶のデータを用いて、求めた６個の
水銀原子座標（重原子パラメータ）をプログラムＭＬＰ
ＨＡＲＥ（ＣＣＰ４パッケージ）（ＳＥＲＣ）を用いて
精密化し、初期位相を決定した。精密化後のフィギャー
・オブ・メリット（ｆｉｇｕｒｅｏｆｍｅｒｉｔ）
の平均値は０．５０であった。その後、プログラムＤＭ
（ＣＣＰ４パッケージ、ＳＥＲＣ）を用いた溶媒平滑化
法およびヒストグラムマッチング法をデカルバミラーゼ
結晶中の溶媒領域を３５％として低分解能から高分解能
まで徐々に位相を拡張することで初期位相の改良を行っ
た。また、デカルバミラーゼの結晶は、結晶の密度測定
の結果から非対称単位中に２分子が含まれることがわか
っており、非結晶学的な対称を利用して、ＮＣＳ平均化
と呼ばれる電子密度の平均化を行うことにより位相改良
を行った。まず、この方法を適用するために、デカルバ
ミラーゼ結晶中の非結晶学的な２回軸の決定を行った。
溶媒平滑化法を適用した後の位相を用いて電子密度図を
計算し、３次元グラフィックス上で重原子位置および電
子密度図を表示し、水銀原子の座標間の中点同士を結ん
だ２本の線がＺ軸（結晶学的な２回軸の１つ）上で直行
していることがわかった。したがってデカルバミラーゼ
分子は、この２本の非結晶学的な２回軸および結晶学的
な２回軸の計３本が（２２２）の対称を持っていると推
定された。電子密度図の各セクションを詳細に観察し、
それぞれ２分子の中心座標を決定し、並進および回転を
含む非結晶学的対称マトリックスを算出した。同時に溶
媒平滑化法で得られた電子密度図からマスクと呼ばれる
タンパク質の分子が存在する領域を同定した。求めた非
結晶学的対称マトリックスおよびマスクを用いて、プロ
グラムＤＭを用いてＮＣＳ平均化計算を行った。その結
果、２分子間の相関係数は、０．９２と高い相関を示
し、自由Ｒ因子（ｆｒｅｅＲ−ｆａｃｔｏｒ）は２
４．５％であった。改良された電子密度図は極めて明瞭
（例えば、図８を参照のこと。図８において、ペプチド
主鎖のつながりが連続した電子密度として観察され、図
中央には４６位のＧｌｕ、１７１位のＣｙｓ、および１
４５位のＧｌｕと同定されるアミノ酸側鎖に対応する電
子密度が観察される。）で、αヘリックスまたはβシー
トなどの二次構造部分はアミノ酸の主鎖の流れを明確に
追うことができ、また芳香族アミノ酸側鎖などの電子密
度も明瞭であった。

【００８９】（実施例６）デカルバミラーゼの立体構造
モデルの構築および精密化実施例５で得られた電子密度図からプログラムオー
（Ｏ）（ＵｐｐｓａｌａＵｎｉｖｅｒｓｉｔｅｔ）を用
いて、３次元グラフィックス上でデカルバミラーゼの立
体構造モデルを組み立てた。電子密度をアミノ酸配列に
対応させるため、まず、トリプトファン残基など特徴的
な電子密度を有する部分アミノ酸配列に相当する電子密
度を電子密度図上で見出し、アミノ酸配列を参照しなが
ら電子密度に適合するアミノ酸残基の部分構造をプログ
ラムＯを用いて構築し、順次この作業を繰り返すことに
より、デカルバミラーゼのすべてのアミノ酸残基（３０
３残基）を相当する電子密度に適合させ、分子全体の初
期立体構造モデルを構築した。得られた立体構造モデル
を出発モデル構造として、立体構造精密化プログラムで
あるＸＰＬＯＲの精密化プロトコル（ＸＰＬＯＲマニュ
アル、ＹａｌｅＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）に従って立体
構造の精密化を行った。精密化は、電子密度図からのず
れの大きい局所構造の修正および水分子に相当する電子
密度を同定し精密化計算に水分子を含める操作を繰り返
し、Ｒ値および自由Ｒ値（ｆｒｅｅＲ−ｆａｃｔｏ
ｒ）を指標に精密化を進めた。水分子を加えたネイティ
ブ結晶における最終モデル構造のＲ値は、５００−１．
７Å分解能の反射データに対して、１９．６％であっ
た。

【００９０】（実施例７）デカルバミラーゼの安定化設
計デカルバミラーゼの安定化設計の一例として、エネルギ
ー的に不利なアミノ酸残基を変異することにより安定性
の向上が見られた例を示す。本発明の立体構造から計算
した２０３位のプロリン、Ｐｒｏ２０３の主鎖二面角
（φ −６０°、ψ −４４°）は、αヘリックス構造
に特徴的な二面角を有している。一般にプロリン残基
は、ヘリックス構造を不安定化する、あるいは壊す残基
として働くことが知られている。デカルバミラーゼの２
０３位にプロリンが存在することで、主鎖構造に歪みを
生じ、構造を不安定化すると推定される。この部位は、
ヘリックス構造に特徴的な二面角を有することから、ヘ
リックス構造に適したアミノ酸残基に置換することによ
り、天然状態の構造エネルギーを安定化しうる。例え
ば、αヘリックス構造を取りやすいアミノ酸残基とし
て、アラニン（Ａｌａ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、ロ
イシン（Ｌｅｕ）、セリン（Ｓｅｒ）などに置換しう
る。２０３位のアミノ酸を天然型２０種類のアミノ酸に
変異し、それぞれの構造については、ＡＭＢＥＲのポテ
ンシャルパラメーター（Ｗｅｉｎｅｒ、Ｐ．Ａ．ら、
Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ７（２）：２３０
−２５２，１９８６）により構造エネルギーを算出し、
構造エネルギー値の低いアミノ酸変異がより望ましい変
異であるとして、この部位での最適アミノ酸変異を求め
た。その結果、アスパラギン酸＞スレオニン＞セリン＞
バリン＞グルタミン酸＞イソロイシン＞アラニン＞フェ
ニルアラニン＞チロシン＞ロイシン＞ヒスチジン＞アス
パラギン＞グルタミン＞システイン＞プロリンとなっ
た。実施例１で調製したアミノ酸変異体の変性温度を表
４に示す（国際公開番号ＷＯ９４／０３６１３）。以下
のいずれの変異においても、安定性の向上(ΔＴｍ＝
３．４〜８．２℃)が認められる。これらは、プロリン
以外のアミノ酸に変異したことで、主鎖構造の歪みを解
消したと考えるのが妥当である。また、グルタミン酸
（ΔＴｍ＝８．２℃）に変異したものが最も高い安定性
を示すが、これはグルタミン酸への変異により、グルタ
ミン酸の側鎖カルボキシル基が近傍にある１３９位のア
ルギニン側鎖のグアニジノ基とイオン結合あるいは水素
結合を形成することができ、新たに加わった相互作用の
寄与として他の変異体に比べ高い安定性を示すと考えら
れる。Ｈｉｓ変異体の安定性の増加が、ΔＴｍ＝３．４
℃と他の変異体に比べて小さいのは、ｐＨ７．０付近で
ヒスチジンが正電荷を持った場合、１３９位のアルギニ
ンとの静電的な反発により、主鎖の歪みを解消すること
による安定化の寄与分を減じたためと考えられる。

【００９１】計算により求めた２０３位の最適アミノ酸
変異の安定性の順位は、実験により求めた変性温度の向
上の大きさと完全には一致しないが、いずれも天然型デ
カルバミラーゼのプロリン残基よりも構造エネルギーの
低い（安定な）方から数えて上位に位置し、実験結果と
よく一致した。

【００９２】

【表４】

【００９３】変性温度は、上記のように調製した（粗）
酵素液を各温度にて１０分間の熱処理、熱変性による不
溶物を除去した後の活性を測定し、残存比活性５０％を
示す温度と定義する。残存比活性の測定は以下のように
行った。１．０重量％になるようにＮ−カルバモイル−
Ｄ−α−パラヒドロキシフェニルグリシンを０．１Ｍリ
ン酸緩衝液ｐＨ７．０に溶解した基質溶液１ｍｌに、酵
素溶液０．１ｍｌを加え、４０℃、２０分間反応させ、
２０％トリクロロ酢酸０．２５ｍｌを添加して酵素反応
を停止させた後、活性を変換されたＤ−α−パラヒドロ
キシフェニルグリシンを内部標準としてＤ−フェニルア
ラニンを用いて高速液体クロマトグラフィーにより定量
することにより算出した。変異株は、スクリーニングで
得られた変異株の識別番号を示す。ΔＴｍは、変異前の
デカルバミラーゼの変性温度からの差異を示す。

【００９４】

【発明の効果】本発明によれば、デカルバミラーゼおよ
びデカルバミラーゼ変異体の立体構造および変異体の立
体構造モデルが提供される。本酵素の立体構造は、耐熱
性、有機溶剤耐性、空気酸化に対する耐性等の安定性、
酵素反応の至適ｐＨの変更および比活性向上に関するア
ミノ酸変異の合理的な分子設計に有用である。このこと
によって、工業利用に有利な改変酵素を迅速かつ効率的
に取得することが可能となる。さらには、本酵素の立体
構造が類縁関係にあるアミダーゼまたはニトリラーゼな
どの酵素群の中で唯一決定されたものであり、これら酵
素群の工業利用分野で有意義に応用され得ることは明ら
かである。

【００９５】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Kaneka Corporation <120> Three-dimensional structure of decarbamilase and the use thereof <130> J199247416 <140>ND <141>1999-08-31 <160> 2 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 303 <212> PRT <213> Agrobacterium sp. <400> 1 Thr Arg Gln Met Ile Leu Ala Val Gly Gln Gln Gly Pro Ile Ala Arg 1 5 10 15 Ala Glu Thr Arg Glu Gln Val Val Val Arg Leu Leu Asp Met Leu Thr 20 25 30 Lys Ala Ala Ser Arg Gly Ala Asn Phe Ile Val Phe Pro Glu Leu Ala 35 40 45 Leu Thr Thr Phe Phe Pro Arg Trp His Phe Thr Asp Glu Ala Glu Leu 50 55 60 Asp Ser Phe Tyr Glu Thr Glu Met Pro Gly Pro Val Val Arg Pro Leu 65 70 75 80 Phe Glu Lys Ala Ala Glu Leu Gly Ile Gly Phe Asn Leu Gly Tyr Ala 85 90 95 Glu Leu Val Val Glu Gly Gly Val Lys Arg Arg Phe Asn Thr Ser Ile 100 105 110 Leu Val Asp Lys Ser Gly Lys Ile Val Gly Lys Tyr Arg Lys Ile His 115 120 125 Leu Pro Gly His Lys Glu Tyr Glu Ala Tyr Arg Pro Phe Gln His Leu 130 135 140 Glu Lys Arg Tyr Phe Glu Pro Gly Asp Leu Gly Phe Pro Val Tyr Asp 145 150 155 160 Val Asp Ala Ala Lys Met Gly Met Phe Ile Cys Asn Asp Arg Arg Trp 165 170 175 Pro Glu Ala Trp Arg Val Met Gly Leu Arg Gly Ala Glu Ile Ile Cys 180 185 190 Gly Gly Tyr Asn Thr Pro Thr His Asn Pro Pro Val Pro Gln His Asp 195 200 205 His Leu Thr Ser Phe His His Leu Leu Ser Met Gln Ala Gly Ser Tyr 210 215 220 Gln Asn Gly Ala Trp Ser Ala Ala Ala Gly Lys Val Gly Met Glu Glu 225 230 235 240 Asn Cys Met Leu Leu Gly His Ser Cys Ile Val Ala Pro Thr Gly Glu 245 250 255 Ile Val Ala Leu Thr Thr Thr Leu Glu Asp Glu Val Ile Thr Ala Ala 260 265 270 Val Asp Leu Asp Arg Cys Arg Glu Leu Arg Glu His Ile Phe Asn Phe 275 280 285 Lys Gln His Arg Gln Pro Gln His Tyr Gly Leu Ile Ala Glu Leu 290 295 300 <210> 2 <211> 303 <212> PRT <213> E.coli <400> 2 Thr Arg Gln Met Ile Leu Ala Val Gly Gln Gln Gly Pro Ile Ala Arg 1 5 10 15 Ala Glu Thr Arg Glu Gln Val Val Val Arg Leu Leu Asp Met Leu Thr 20 25 30 Lys Ala Ala Ser Arg Gly Ala Asn Phe Ile Val Phe Pro Glu Leu Ala 35 40 45 Leu Thr Thr Phe Phe Pro Arg Trp Tyr Phe Thr Asp Glu Ala Glu Leu 50 55 60 Asp Ser Phe Tyr Glu Thr Glu Met Pro Gly Pro Val Val Arg Pro Leu 65 70 75 80 Phe Glu Lys Ala Ala Glu Leu Gly Ile Gly Phe Asn Leu Gly Tyr Ala 85 90 95 Glu Leu Val Val Glu Gly Gly Val Lys Arg Arg Phe Asn Thr Ser Ile 100 105 110 Leu Val Asp Lys Ser Gly Lys Ile Val Gly Lys Tyr Arg Lys Ile His 115 120 125 Leu Pro Gly His Lys Glu Tyr Glu Ala Tyr Arg Pro Phe Gln His Leu 130 135 140 Glu Lys Arg Tyr Phe Glu Pro Gly Asp Leu Gly Phe Pro Val Tyr Asp 145 150 155 160 Val Asp Ala Ala Lys Met Gly Met Phe Ile Cys Asn Asp Arg Arg Trp 165 170 175 Pro Glu Ala Trp Arg Val Met Gly Leu Arg Gly Ala Glu Ile Ile Cys 180 185 190 Gly Gly Tyr Asn Thr Pro Thr His Asn Pro Glu Val Pro Gln His Asp 195 200 205 His Leu Thr Ser Phe His His Leu Leu Ser Met Gln Ala Gly Ser Tyr 210 215 220 Gln Asn Gly Ala Trp Ser Ala Ala Ala Gly Lys Ala Gly Met Glu Glu 225 230 235 240 Asn Cys Met Leu Leu Gly His Ser Cys Ile Val Ala Pro Thr Gly Glu 245 250 255 Ile Val Ala Leu Thr Thr Thr Leu Glu Asp Glu Val Ile Thr Ala Ala 260 265 270 Val Asp Leu Asp Arg Cys Arg Glu Leu Arg Glu His Ile Phe Asn Phe 275 280 285 Lys Gln His Arg Gln Pro Gln His Tyr Gly Leu Ile Ala Glu Leu 290 295 300

【図面の簡単な説明】

【図１】デカルバミラーゼのタンパク質立体構造トポ
ロジー図。βストランド構造を三角印で、αヘリックス
構造を丸印で示した。「Ｎ−ｔｅｒｍ」はアミノ末端
を、「Ｃ−ｔｅｒｍ」はカルボキシ末端を、それぞれ表
す。

【図２】デカルバミラーゼのリボン−ストランド図。
βストランド構造を板状に、αヘリックス構造を螺旋で
示した。触媒活性に関与するアミノ酸側鎖をボール−ス
ティック表記で示した。

【図３】デカルバミラーゼの活性部位における基質結
合様式の模式図。Ｒ−は、Ｄ−α−アミノ酸の側鎖であ
る。残基番号および三文字表記によるアミノ酸名を示し
た。

【図４】デカルバミラーゼの触媒活性部位の立体構
造。βストランド構造を板状に、αヘリックス構造を螺
旋で示し、触媒活性に関与するアミノ酸側鎖をボール−
スティック表記で表し、残基番号および三文字表記によ
るアミノ酸名を示した。

【図５】１．００Åおよび０．９８Åの回折データか
ら計算した差パターソン図のハーカー面。

【図６】１．００Åおよび１．２７Åの回折データか
ら計算した差パターソン図のハーカー面。

【図７】０．９８Åをアノマラス（ａｎｏｍａｌｏｕ
ｓ）データとして計算したアノマラス差パターソン図の
ハーカー面。

【図８】本発明の立体構造を示す、触媒活性部分の代
表的な電子密度図。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者石井清人兵庫県明石市大蔵谷東山478番地の６ 302 号室 (72)発明者難波弘憲兵庫県加古川市尾上町旭３−41 グランドゥール尾上409号室 (72)発明者矢島麗嘉兵庫県明石市小久保120番地の55 Ａ804号室 (72)発明者池中康裕兵庫県神戸市西区井吹台東町５丁目21番３号 (72)発明者高橋里美兵庫県神戸市垂水区神和台１丁目13番13号Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA03 AA20 BA11 4B050 CC03 CC07 DD02 FF03C FF03E FF17C FF17E FF18C HH01 KK05 LL05

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】直方晶系の空間群Ｐ２₁２₁２および配列
番号１に示されるアミノ酸配列、または直方晶系の空間
群Ｐ２₁２₁２₁および配列番号２に示されるアミノ酸配
列を有する、デカルバミラーゼ結晶。
【請求項２】前記結晶が直方体形状の単位格子を有
し、単位格子定数：ａ＝６６．５〜６８．５Å、ｂ＝１
３５．５〜１３８．０Å、ｃ＝６６．５〜６８．５Åを
有し、そして前記アミノ酸配列が配列番号１である、請
求項１に記載のデカルバミラーゼ結晶。
【請求項３】前記結晶が直方体形状の単位格子を有
し、単位格子定数：ａ＝６８．５〜７０．５Å、ｂ＝１
３８．０〜１４０．５Å、ｃ＝６８．５〜７３．０Åを
有し、そして前記アミノ酸配列が配列番号１である、請
求項１に記載のデカルバミラーゼ結晶。
【請求項４】前記結晶が直方体形状の単位格子を有
し、単位格子定数：ａ＝８１．５〜８２．５Å、ｂ＝１
３３．０〜１３５．０Å、ｃ＝１１９．５〜１２１．５
Åを有し、そして前記アミノ酸配列が配列番号２であ
る、請求項１に記載のデカルバミラーゼ結晶。
【請求項５】結晶中のデカルバミラーゼ１分子当たり
少なくとも１つ以上の重金属原子を含む請求項１から４
のいずれか１項に記載の結晶。
【請求項６】重金属原子が水銀、金、白金、鉛、イリ
ジウム、オスミウムおよびウランのうちいずれかである
請求項５に記載の結晶。
【請求項７】請求項１から６のいずれか１項に記載の
デカルバミラーゼ結晶を液体窒素下で凍結させることに
より調製される凍結結晶。
【請求項８】デカルバミラーゼ結晶の製造方法であっ
て、１〜５０ｍｇ／ｍｌの濃度でデカルバミラーゼの溶
液を与える工程、５〜３０重量％の濃度でポリエチレン
グリコール（ＰＥＧ）あるいはメトキシポリエチレング
リコール（ＰＥＧＭＭＥ）を含有し、かつ６．０〜９．
０のｐＨを与える濃度の緩衝剤を含有する沈澱剤溶液を
与える工程、該デカルバミラーゼ溶液を該沈澱剤溶液と
混合する工程、および得られる混合溶液を、該溶液中の
デカルバミラーゼ結晶が既定の大きさ以上に成長するま
で既定の期間放置する工程を包含する、方法。
【請求項９】前記混合する工程が、前記デカルバミラ
ーゼ溶液の液滴を前記沈澱剤溶液の液滴と混合させるこ
とを包含し、そして前記放置する工程が、混合工程で得
られる混合液滴を密閉容器中で沈澱剤溶液を保持する溶
液溜め部上に懸垂させることを包含し、ここで、該溶液
溜め部中の該沈澱剤溶液の蒸気圧は該混合液滴の蒸気圧
より低い、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】前記混合する工程が、前記デカルバミ
ラーゼ溶液の液滴を前記沈澱剤溶液の液滴と混合させる
ことを包含し、そして前記放置する工程が、混合工程で
得られる混合液滴を密閉容器中で沈澱剤溶液を保持する
溶液溜め部の液滴台に静置させることを包含し、ここ
で、該際溶液溜め部中の該沈澱剤溶液の蒸気圧は該混合
液滴の蒸気圧より低い、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】前記混合溶液を放置する期間が１日〜
３週間である、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】前記デカルバミラーゼの溶液を与える
工程の後に、該デカルバミラーゼ溶液をサイズ排除半透
膜内に配置させる工程をさらに包含し、そして前記混合
する工程が、該半透膜を通して沈澱剤溶液を該デカルバ
ミラーゼ溶液中に拡散させることを包含する、請求項８
に記載の方法。
【請求項１３】前記混合する工程が、前記沈澱剤溶液
を前記デカルバミラーゼ溶液に徐々に添加することを包
含し、そして前記放置する工程が、得られる混合溶液を
密閉容器内で放置することを包含する、請求項８に記載
の方法。
【請求項１４】以下の図に示すタンパク質立体構造ト
ポロジーを有する立体構造により特徴付けられるデカル
バミラーゼまたはその活性断片：【化１】。
【請求項１５】４本のαヘリックスおよび１２本のβ
ストランドを含む二次構造を含む４層サンドイッチ構造
を有する、デカルバミラーゼまたはその活性断片。
【請求項１６】酵素反応に関与するアミノ酸残基がシ
ステイン１残基、グルタミン酸２残基、およびリジン１
残基であり、酵素反応の基質がＤ−Ｎ−カルバモイル−
α−アミノ酸であって、以下の図に示す基質結合様式を
有する活性部位の立体構造により特徴付けられる、デカ
ルバミラーゼまたはデカルバミラーゼ変異体、あるいは
それらの活性断片：【化２】ここで、置換基Ｒは、Ｄ−Ｎ−カルバモイル−α−アミ
ノ酸の側鎖である。
【請求項１７】Ｄ−Ｎ−カルバモイル−α−アミノ酸
を基質とするデカルバミラーゼ活性を有する酵素分子で
あって、少なくとも、配列番号１または２における以下
のアミノ酸：４６位のＧｌｕ、１２６位のＬｙｓ、１４
５位のＧｌｕ、および１７１位のＣｙｓ、に対応するア
ミノ酸から形成される活性部位腔を有する、酵素分子ま
たはその活性断片。
【請求項１８】前記活性部位腔において、前記Ｄ−Ｎ
−カルバモイル−α−アミノ酸が、反応時に前記配列番
号１または２の１２６位のＬｙｓ、１４３位のＨｉｓ、
１４５位のＧｌｕ、１７４位のＡｒｇ、１７５位のＡｒ
ｇ、および１９７位のＴｈｒに対応するアミノ酸と相互
作用し得る、請求項１７に記載の酵素分子またはその活
性断片。
【請求項１９】前記活性部位腔において、前記配列番
号１または２の４６位のＧｌｕ、１４５位のＧｌｕ、お
よび１７１位のＣｙｓに対応するアミノ酸が水分子を介
して水素結合している、請求項１７または１８に記載の
酵素分子またはその活性断片。
【請求項２０】前記Ｄ−Ｎ−カルバモイル−α−アミ
ノ酸が、Ｄ−Ｎ−カルバモイル−フェニルグリシン、Ｄ
−Ｎ−カルバモイル−パラヒドロキシフェニルグリシ
ン、Ｄ−Ｎ−カルバモイル−フェニルアラニン、Ｄ−Ｎ
−カルバモイル−バリン、Ｄ−Ｎ−カルバモイル−アラ
ニン、Ｄ−Ｎ−カルバモイル−システイン、Ｄ−Ｎ−カ
ルバモイル−アスパラギン酸、Ｄ−Ｎ−カルバモイル−
グルタミン酸、Ｄ−Ｎ−カルバモイル−グリシン、Ｄ−
Ｎ−カルバモイル−ヒスチジン、Ｄ−Ｎ−カルバモイル
−イソロイシン、Ｄ−Ｎ−カルバモイル−リジン、Ｄ−
Ｎ−カルバモイル−ロイシン、Ｄ−Ｎ−カルバモイル−
メチオニン、Ｄ−Ｎ−カルバモイル−アスパラギン、Ｄ
−Ｎ−カルバモイル−プロリン、Ｄ−Ｎ−カルバモイル
−グルタミン、Ｄ−Ｎ−カルバモイル−アルギニン、Ｄ
−Ｎ−カルバモイル−セリン、Ｄ−Ｎ−カルバモイル−
スレオニン、Ｄ−Ｎ−カルバモイル−トリプトファン、
およびＤ−Ｎ−カルバモイル−チロシンからなる群から
選択される、請求項１６〜１９のいずれか１項に記載の
酵素分子またはその活性断片。
【請求項２１】請求項１４または１５に記載のデカル
バミラーゼの立体構造から分子設計手法により構築され
た、デカルバミラーゼまたはその変異体あるいはそれら
の活性断片とＤ−Ｎ−カルバモイル−α−アミノ酸ある
いはＤ−α−アミノ酸との複合体立体構造により特徴付
けられる、デカルバミラーゼ複合体。
【請求項２２】デカルバミラーゼ変異体を設計する方
法であって、デカルバミラーゼの請求項１４、１６、ま
たは２１のいずれか１項に記載の立体構造に基づいて物
性および／または機能を改変したデカルバミラーゼ変異
体を設計する工程を包含する、方法。
【請求項２３】デカルバミラーゼ変異体を設計する方
法であって、デカルバミラーゼ活性を有する酵素の結晶
を生成する工程、該結晶のＸ線結晶構造解析により該結
晶の立体構造を決定する工程、および決定した立体構造
に基づいて物性および／または機能の向上したデカルバ
ミラーゼ変異体を設計する工程を包含する、方法。
【請求項２４】前記立体構造が、請求項１４、１６、
または２１のいずれか１項に記載のデカルバミラーゼの
立体構造である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】デカルバミラーゼ変異体を製造する方
法であって、デカルバミラーゼ活性を有する酵素の結晶
を生成する工程、該結晶のＸ線結晶構造解析により該結
晶の立体構造を決定する工程、決定した立体構造に基づ
いて物性および／または機能の向上したデカルバミラー
ゼ変異体を設計する工程、および該デカルバミラーゼ変
異体を産生する工程を包含する、方法。
【請求項２６】前記立体構造が、請求項１４、１６、
または２１のいずれか１項に記載のデカルバミラーゼの
立体構造である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】前記デカルバミラーゼ変異体を設計す
る工程が、酵素の基質特異性の変更、酵素比活性の変
更、酵素の安定性向上、酵素の至適ｐＨの最適化、およ
び酵素の水溶性の変更からなる群から選択される１以上
の酵素特性の改変を目的とする、請求項２６に記載の方
法。
【請求項２８】前記酵素特性の改変が、酵素の安定性
向上を含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】酵素の安定性向上に関する変異体の設
計が、空気酸化による活性低下を招くアミノ酸残基を置
換する変異を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】前記酵素特性の改変が、酵素比活性の
変更および酵素の至適ｐＨの最適化を含む、請求項２７
に記載の方法。
【請求項３１】請求項２５〜３０のいずれか１項に記
載の製造方法によって得られたデカルバミラーゼ変異
体。
【請求項３２】請求項１〜７のいずれか１項に記載の
デカルバミラーゼ結晶の立体構造または請求項１４、１
６、または２１のいずれか１項に記載のデカルバミラー
ゼの立体構造を利用して、アミノ酸一次配列がデカルバ
ミラーゼと類似する別のポリペプチド酵素またはタンパ
ク質酵素を改変する方法。