JP4610874B2 - 新規アミロマルターゼ - Google Patents
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Description
A)野生型アミロマルターゼポリペプチドのアミノ酸配列において、少なくとも1つの置換、付加または欠失を含み、
上記置換、付加または欠失は、上記野生型アミロマルターゼポリペプチドのアミノ酸配列において、アカボースと相互作用するアミノ酸残基の位置において、野生型配列のアミノ酸以外のアミノ酸へ置換されることを包含する、
アミロマルターゼポリペプチド。
A)野生型アミロマルターゼポリペプチドのアミノ酸配列において、少なくとも1つの置換、付加または欠失を含み、
上記置換、付加または欠失は、配列番号2に示されるThermus aquaticus ATCC 33923株由来のアミロマルターゼのアミノ酸配列の53位グリシン、54位チロシン、55位グリシン、56位アスパラギン酸、98位グリシン、101位チロシンおよび153位グリシンからなる群より選択される少なくとも1つの残基に対応する、上記野生型アミロマルターゼポリペプチドの残基の位置において、配列番号1において示されるそれぞれの残基の位置におけるアミノ酸以外のアミノ酸を有することを包含する、
アミロマルターゼポリペプチド。
上記置換、付加または欠失は、配列番号2に示されるThermus aquaticus ATCC 33923株由来のアミロマルターゼの54位チロシンに対応する残基の位置において、上記野生型アミロマルターゼポリペプチドの上記54位チロシンに対応する残基のアミノ酸以外のアミノ酸を有することを包含する、
アミロマルターゼポリペプチド。
A)配列番号2に示される配列において、少なくとも1つの置換、付加または欠失を含み、上記置換、付加または欠失は、54位のチロシンにおけるチロシン以外のアミノ酸への置換を包含する、配列、
を含む、アミロマルターゼポリペプチド。
本明細書において「アミロマルターゼ」および「アミロマルターゼ酵素」は特に示さない限り互換可能に用いられ、アミロマルターゼ活性を有する酵素を意味する。アミロマルターゼとしては、例えば、植物(馬鈴薯塊茎、発芽大麦、サツマイモ、ホウレンソウ緑葉)由来、微生物(大腸菌、インフルエンザ菌、ストレプトコッカス、クロストリディウム菌、Thermus属細菌(例えば、Thermus aquaticus、Thermus flavusなど)由来のものが挙げられるがそれらに限定されない。これらアミロマルターゼは、微生物同士、植物同士のみならず、植物と微生物との間でも互いにアミノ酸配列において類似性を有し、特にその基質相互作用部位はその配列がよく保存されている(図1参照。特に、Thermus aquaticus ATCC33923株由来のアミロマルターゼのアミノ酸配列の293位アスパラギン酸、340位のグルタミン酸、395位のアスパラギン酸およびそれに対応するアミノ酸残基の位置の部位が含まれる)。したがって、ある種のアミロマルターゼにおいて基質相互作用部位を担う配列に起因する酵素の特性は、別の種のアミロマルターゼにおける基質相互作用部位を担う対応する配列に起因する酵素の特性と類似している。このようなことは、三次元構造解析、コンピュータモデリングにおける解析結果からも明らかとなっている(Przylas I.et al.J.Mol.Biol.296,873−886(2000)、Przylas et al.Eur.J.Biochem.267、6903−6913(2000)参照)。
本発明のアミロマルターゼは、従来の野生型アミロマルターゼに比べて、基質に対する反応性が増加していることが一つの特徴である。本発明のアミロマルターゼはまた、従来の野生型アミロマルターゼに比べて、加水分解活性が低下していることも別の特徴である。好ましくは、本発明のアミロマルターゼは、従来の野生型アミロマルターゼに比べて、基質に対する反応性が増加し、活、加水分解活性が低下している。好ましくは、本発明のアミロマルターゼは、耐熱性である。本発明のアミロマルターゼは、好ましくは70℃10分間で、より好ましくは80℃10分間でも活性を維持し、好ましくは100℃10分間で、より好ましくは100℃で5分間で失活する。また、本発明のアミロマルターゼは、好ましくは70℃においても実質的に加水分解反応を触媒しない。
本発明のアミロマルターゼ改変体をコードする遺伝子もまた、本発明の範囲内にある。このような遺伝子は、本明細書の開示に基づいて、当該分野で公知の方法を用いて得ることができる。
クローン化された遺伝子または改変された遺伝子の発現は、それをコードするDNAを挿入した適切な発現ベクターの構築、発現ベクターの微生物への導入、ならびに組換え生物の培養および生産物の回収により達成される。これらの方法は、当業者に周知である。本発明に用いられる生物宿主には、原核生物および真核生物が含まれる。好ましい原核生物宿主には、中温菌、例えば大腸菌が含まれる。そのような組換え生物は、微生物であってもよいが、植物、動物などであってもよい。植物としては、例えば、双子葉植物、イネ、コムギ、オオムギ、トウモロコシなどの単子葉植物が挙げられるがそれらに限定されない。イネなどの穀物は、貯蔵タンパク質を種子に蓄積する性質を持っており、貯蔵タンパク質系を用いて、本発明の改変体を種子に蓄積するように発現させることは可能である(特開2002−58492明細書を参照)。
(1)環状α−1,4−グルカンの生産
本発明のアミロマルターゼ改変体を用いて、α−グルカンを基質として、環状α−1,4−グルカンであるシクロアミロースを生産し得る。この際、アミロマルターゼは、固定化酵素として使用することも可能である。
また、本発明のアミロマルターゼを用いて、アミロペクチンなどのα−1,6−結合を有する分岐構造を含むα−グルカンの環状化反応を触媒し、内分岐型環状グルカンおよび外分岐型環状グルカンなどのさまざまな構造を有する分岐型環状グルカンを生産し得る。この際、アミロマルターゼは固定化酵素として使用することも可能である。
本発明のアミロマルターゼ改変体は、食品中のデンプンに作用してデンプンの環状化反応を触媒する。その結果、食品中のデンプンは低分子化されて環状グルカンを生じる。この反応により生じる環状グルカンは、上述のように、非常に粘性が低く、溶解性に優れ、デンプンの老化抑制効果を有し、そして様々な物質を包接する能力を有する。従って、野生型同様、本発明のアミロマルターゼ改変体を使用して食品を改質し得る。代表的には、食品中のデンプンにアミロマルターゼを作用させて環状グルカンを蓄積させることにより、食品の物性(特に、保存時の安定性)および食感を改質させる。
本明細書において遺伝子(例えば、ポリペプチド、ポリヌクレオチドなど)の「相同性」とは、2以上の遺伝子配列の、互いに対する同一性の程度をいう。従って、ある2つの遺伝子の相同性が高いほど、それらの配列の同一性または類似性は高い。2種類の遺伝子が相同性を有するか否かは、配列の直接の比較、または核酸の場合ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーション法によって調べられ得る。2つの遺伝子配列を直接比較する場合、その遺伝子配列間でDNA配列が、代表的には少なくとも50%同一である場合、好ましくは少なくとも70%同一である場合、より好ましくは少なくとも80%、90%、95%、96%、97%、98%または99%同一である場合、それらの遺伝子は相同性を有する。
アミロマルターゼは最初、馬鈴薯から発見されたが、種々の植物、および大腸菌、Thermus属の細菌などの微生物に存在していることがわかっている。従って、本発明のアミロマルターゼ改変体を作製するための野生型アミロマルターゼはその起源は問わない。従って、植物由来の酵素をコードする遺伝子を本発明の改変(例えば、配列番号2に示されるThermus aquaticus ATCC 33923株由来のアミロマルターゼのアミノ酸配列の53位グリシン、54位チロシン、55位グリシン、56位アスパラギン酸、98位グリシン、101位チロシンおよび153位グリシンからなる群より選択される少なくとも1つの残基に対応する残基において、配列番号1において示されるそれぞれの位置におけるアミノ酸以外のアミノ酸を有する改変)を導入し、大腸菌などの宿主を用いて発現させたものであっても使用し得る。ここでは、馬鈴薯および大腸菌からのアミロマルターゼの精製方法を例として開示するが、これに限られない。
本発明のポリペプチドを認識する抗体の作製もまた当該分野において周知である。例えば、ポリクローナル抗体の作製は、取得したポリペプチドの全長または部分断片精製標品、あるいは本発明のタンパク質の一部のアミノ酸配列を有するペプチドを抗原として用い、動物に投与することにより行うことができる。
タンパク質の結晶構造解析は、当該分野において周知の方法を用いて行うことができる。そのような方法は、例えば、タンパク質のX線結晶構造解析(シュプリンガー・フェアラーク東京社)、生命科学のための結晶解析入門(丸善)などに記載されており、に記載されており、本明細書ではそのような方法を任意に用いることができる。
重原子同型置換法(Methods in ENZYMOLOGY 第115巻、Diffractipn Methods for Biological Macromolecules、Part B、H.W.Wyckoff、C.H.W.Hirs、およびS.N.Timasheff編、ならびにMethods in ENZYMOLOGY 第276巻、Macromolecular Crystallography、Part A、C.W.Carter、Jr.およびR.M.Sweet編)または多波長異常分散法(S.N.Timasheff編、ならびにMethods in ENZYMOLOGY 第276巻、Macromolecular Crystallography、Part A、C.W.Carter、Jr.およびR.M.Sweet編)もまた利用して立体構造解析を行うことも可能である。ここでは、ネイティブ結晶および重原子誘導体結晶の回折データ間の回折強度差、あるいは異なる波長で測定した回折データ間の回折強度差から、電子密度を計算するための初期位相を求めることにより立体構造を決定し得る。重原子同型置換法または多波長異常分散法を適用するアミロマルターゼの立体構造決定においては、重金属原子として例えば水銀、金、白金、ウラン、セレン原子などを含有した重原子誘導体結晶を用い得る。好ましくは、水銀化合物EMTSまたはカリウムジシアノ金(I)を利用した浸漬法により得られる重原子誘導体結晶が用いられる。
本発明のアミロマルターゼは、組成物(例えば、医薬組成物、農薬組成物、食用組成物)として提供され得る。そのような組成物は、その目的(医薬用、農薬用、食用など)に応じて、キャリアなどの追加の成分を含み得る。
本発明に用いられ得る直鎖のα−1,4−グルカンまたはこれを有する糖類としては、マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオースなどのマルトオリゴ糖、アミロース、アミロペクチン、グリコーゲン、澱粉、ワキシー澱粉、ハイアミロース澱粉、可溶性澱粉、デキストリン、澱粉枝きり物、澱粉部分加水分解物、ホスホリラーゼによる酵素合成澱粉、およびこれらの誘導体などが挙げられる。これらは、単独でもよく、あるいは組み合わせても使用し得る。ここで、澱粉枝きり物とは、澱粉にあるα−1,4−グルコシド結合以外の結合を酵素的に全部あるいは一部を切断して得られる物をいう。また、澱粉部分加水分解物とは、澱粉にあるα−1,4−グルコシド結合の一部を酵素的に、もしくは化学的に切断して得られるものをいい、例えば、重合度が100程度以上のアミロペクチン、重合度が20程度以上のアミロースなどが原料として用いられ得る。
1つの局面において、本発明は、アミロマルターゼ改変体を提供する。このアミロマルターゼ改変体またはアミロマルターゼポリペプチドは、そのアミノ酸配列において、アミロマルターゼポリペプチドのインヒビターであるアカボースと相互作用するアミノ酸残基の位置において、野生型アミロマルターゼのアミノ酸残基以外のアミノ酸に置換されていることを特徴とする。アカボースと相互作用するアミノ酸残基が野生型のアミノ酸残基とは異なるものに置換されていることによって、本発明は、酵素活性の上昇および/または副反応である加水分解活性を顕著に低下させることができた。特に、同一の改変により酵素活性の上昇および加水分解活性の低下を同時に達成したことは、従来の技術では予想不可能であり、顕著な効果といえる。
(1)アミロマルターゼの精製
Thermus aquaticus ATCC 33923株を、33リットルの培地(1% マルトース、0.4%イーストイクストラクト、0.8%ポリペプトン、0.2% NaCl,pH7.5)で70℃、18時間振とうした。菌体を遠心分離により集め、10mM KH2PO4−Na2HPO4(pH7.5)(緩衝液A)で洗浄した後、この緩衝液に再び懸濁し、超音波により菌体を破砕した。これを遠心分離して上清を粗酵素液とした。粗酵素液に終濃度1Mとなるように硫酸アンモニウムを添加し、4℃にて、一晩放置した後、1M硫酸アンモニウムを含む緩衝液Aで平衡化したフェニルトヨパールカラム(TOSOH製)にロードした。300mM硫酸アンモニウムを含む緩衝液Aで洗浄した後、緩衝液A中の硫酸アンモニウム濃度を300mMから0mMに変化させることによって酵素を溶出させ、活性画分を回収した。得られた酵素液を緩衝液Aに対して透析した。
アミロマルターゼの活性は、50mM酢酸ナトリウム緩衝液(pH5.5)中で、10%(w/v)マルトトリオースにアミロマルターゼを70℃で10分間作用させたときに生じるグルコースを、定量することにより測定した。
(1)実施例1で得た酵素液を、0.1%トリフルオロ酢酸(TFA)を含む48.4%アセトニトリル溶離液で平衡化したHPLC用C4カラム(Vydac 214TP54(0.46×25cm)、Vydac製)に酵素液をロードし、溶離液中のアセトニトリル濃度を48.4%から52.4%まで変化させることにより酵素を溶出した。得られた酵素液を減圧濃縮した。ペプチドシークエンサーを用いて、酵素のN末端アミノ酸配列を決定した(M−E−L−P−R−A−(配列番号3))。
上記(1)と同様にして、HPLC用C4カラムから酵素を溶出した。得られた酵素液を、減圧乾燥した後、8M尿素、0.4M NH4HCO3、4.5mM ジチオトレイトール(DTT)、10mMヨードアセトアミド(Iodeacetoamide)を含む溶液に溶解し、トリプシンを加えて、37℃にて24時間 反応させた。このようにして得られたトリプシン消化断片を、0.06% TFAを含む1.6%アセトニトリル溶離液で平衡化したHPLC用ODSカラム(Vydac 218TP54(0.46×25cm)、Vydac製)にロードし、溶離液中のアセトニトリル濃度を1.6%から78.4%まで変化させることにより溶出した。他のピークと良好に分離した3本のピーク画分を集め、減圧濃縮した。ペプチドシーケンサーにより、これらのペプチド断片のN末端アミノ酸配列を決定した(S−V−A−R−L−A−V−Y−P−V−Q−D−V−L−A−;M−N−Y−P−G−R−P−S−G−N−?−A−;I−I−G−D−M−P−I−F−V−A−E−D−(それぞれ配列番号4〜6))。
(A)Thermus aquaticus ATCC 33923株のゲノムライブラリーの作製
(A1)ゲノムDNAの調製
本菌株を1000mlの0.89% トリプトン、0.4%イーストイクストラクト、0.2%塩化ナトリウムを含む培地を入れた2Lの坂口フラスコ中で、70℃で、10〜16時間、振とう培養した。遠心分離により菌体を回収し、ゲノムDNAをフェノール法(SaitoおよびMiura、Biochimica et Biophysica Acta,72,619(1963))により調製した。
上記(A1)で得られたゲノムDNAを、制限酵素Sau3AIを用いて部分消化した後、塩化ナトリウム密度勾配遠心分離にかけ、5〜10KbpのDNA断片を有する画分を得た。得られたDNA断片画分と、BamHIで処理したλ−ZAP expressベクター(ストラタジーン社製)とを、T4DNAリガーゼを用いて連結した。この反応液をインビトロパッケージングキットであるラムダイン(ニッポンジーン社製)を用いて処理し、組換えλファージ懸濁液を得た。
大腸菌VCS257株を、10mMの塩化マグネシウムを含むL培地(10g/l トリプトン(Difco)、5g/l イーストイクストラクト(Difco)、10g/l NaCl、pH7.0)で振とう培養し、10mMの塩化マグネシウム溶液20mlに懸濁した。次いで、組換えλファージと混合して37℃で20分間保温した。その後、L寒天培地(10g/l トリプトン(Difco)、5g/l イーストイクストラクト(Difco)、10g/l NaCl、pH7.0、1.5%(w/v)Agar)上に、L上層寒天培地(10g/l トリプトン(Difco)、5g/l イーストイクストラクト(Difco)、10g/l NaCl、pH7.0、0.8%(w/v)Agar)を用いて重層し、37℃で一晩インキュベートして、溶菌斑が点在するプレートを得た。
(B1)アミロマルターゼ遺伝子単離のためのオリゴヌクレオチドプローブの作製
実施例2で決定したThermus aquaticus ATCC 33923株アミロマルターゼの部分アミノ酸配列(A−V−Y−P−V−Q−D−V)に対応する合成オリゴDNA(5’−GCIGTITAYCCIGTICARGAYGT−3’(配列番号7)(核酸の記載はIUPAC核酸コードに従う))を作製した。この合成オリゴDNAを、放射線ラベルして、アミロマルターゼ遺伝子単離のためのプローブとして使用した。
上記(A3)で作製したプレートにナイロンフィルター(アマシャム社製)を密着させ、アルカリ処理して、溶菌斑中の組換えλファージDNAを変性させ、フィルターに固定した。このフィルターを(B1)で作製したプローブの溶液に浸して、ハイブリダイゼーションを行った。X線フィルムに密着させてシグナルを検出することにより、アミロマルターゼ遺伝子を含む組換えλファージを選択した。
上述(B2)で得られた組換えλファージと、大腸菌(XLI−Blue MRF株)と、ヘルパーファージ(ExAssist)とを混合して、37℃で15分間保温した。その後、5mlのL培地を加え、37℃で、4〜6時間振とう培養した。その培養液を、70℃で、20分間加熱処理した後、遠心分離することにより上清を取り出し、ファージ溶液を得た。このファージ溶液20μlと大腸菌(XLOLR株)200μlとを混合して、37℃で15分間保温した。そして、その一部もしくは全量を、50μg/μlのカナマイシンを含有するL寒天培地にプレーティングし、10〜18時間、37℃で、保温した。出現したコロニーからプラスミドDNAを、アルカリ−SDS法(Sambrookら、Molecular Cloning、前出)により抽出して、アミロマルターゼ遺伝子を含むプラスミドDNAを得た。
上記で得られたプラスミドDNAについて、DNAシークエンサー(ABI社製)を用いて塩基配列を決定した。Thermus aquaticus ATCC 33923株のアミロマルターゼ遺伝子の全塩基配列を配列表の配列番号1に示す。配列表の配列番号2は、対応するアミノ酸配列である。
実施例1で精製したアミロマルターゼの酵素学的性質を、当業者に周知の方法を用いて分析した。本酵素の反応至適温度は65〜70℃であり、反応至適pHは5.5であった。また、本酵素は80℃にて10分間の熱処理を行っても、ほぼ100%の残存活性を有しており、ほとんど失活が認められなかった。しかし、100℃、10分間の熱処理により完全に失活した。
実施例3で得たThermus aquaticus ATCC 33923株由来のアミロマルターゼ遺伝子の核酸配列情報を用いて組換えアミロマルターゼを産生した。
上記実施例で得られたThermus aquaticus ATCC 33923株由来ゲノムDNAまたはプラスミドを鋳型とし、2種類のオリゴヌクレオチド(P1:5’−TTTCATATGGAGCTTCCCCGCGCTTTCGGTCTGCTT−3’(配列番号8)、P2:5’−TTTGAATTCGGGCTGGTCCACCTAGAGCCGTTCCGT−3’)(配列番号9)をプライマーとして用いて、終濃度10%のグリセロールを含む条件下でPCR(98℃10秒、68℃1分を25サイクル)を行った。この増幅により、アミロマルターゼの構造遺伝子のN末側に制限酵素NdeI部位、およびC末端側に制限酵素EcoRI部位が付加されたアミロマルターゼ遺伝子を得た。増幅DNAを制限酵素NdeIおよびEcoRIで完全消化した後、アガロース電気泳動を行い、アミロマルターゼ遺伝子を含む約1.5kbのDNA断片を回収した。
を有するオリゴヌクレオチドアダプターを挿入し、プラスミドpGEX−Ndeを得た(図2を参照)。
結晶構造解析用のアミロマルターゼの精製は、Przylas I.et al.J.Mol.Biol.296,873−886(2000)の記載に準じて行った。具体的には以下のとおりである。
実施例5と同様にしてThermus aquaticus ATCC 33923株由来の組換えアミロマルターゼの発現ベクターを作製した。本実施例では、実施例6で基質と相互作用することが判明した基のうち、例示として54位のチロシンをタンパク質をコードする他の天然アミノ酸すべて(すなわち、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、メチオニン、トレオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、システイン、プロリン、ヒスチジン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸、グルタミン、アルギニン、およびリジン)に置換した。その結果得られた配列番号2において、54位のチロシンがそれぞれのアミノ酸に変更されている以外は、配列番号2と同じ配列を有し、その改変体をコードする核酸分子は、同様に対応した変異を有する。他のアミノ酸への置換は、部位特異的変異誘発法を使用した。その詳細な説明を以下に記載する。
実施例7で作製したアミロマルターゼ改変体の酵素学的性質を、実施例5の天然型アミロマルターゼとともに当業者に周知の方法を用いて分析した。
(A)環状α−1,4−グルカンの生産(本発明のアミロマルターゼを用いたシクロアミロースの生産)
終濃度0.2%の酵素合成アミロースAS−110(中埜酢店製)を含む、1mlの緩衝液(50mM 酢酸ナトリウム緩衝液(pH5.5)、9%(v/v)DMSO)中で、実施例7で得られた精製アミロマルターゼ改変体0.022ユニットを70℃で作用させた。未反応の非環状アミロースをグルコアミラーゼによりグルコースに分解した後に、反応産物中のシクロアミロースを定量した。本発明のアミロマルターゼ改変体はアミロースを環状化し、反応開始1時間後までに最大反応収率に達した。比較として、Thermus aquaticus ATCC 33923株野生型アミロマルターゼを、同様の条件で作用させた。この場合、最大収率に達するのは6時間後であった。従って、本発明のアミロマルターゼ改変体は、基質に対する反応性が増加しており、シクロアミロースを生産するための酵素として従来のものより適していることが明らかである。
配列番号1:Thermusaquaticus ATCC 33923株の野生型核酸配列;
配列番号2:同上のアミノ酸配列;
配列番号3:部分アミノ酸配列1;
配列番号4〜6:部分アミノ酸配列2〜4;
配列番号7:合成オリゴ(実施例3);
配列番号8および9:PCRプライマー;
配列番号10および11:アダプター配列;
配列番号12、14、16、18、20:ポテト、E.coli、SynechocystisPCC6803、Clostridium butyricum、Chlamydia pneumoniaeのアミロマルターゼア核酸配列;
配列番号13、15、17、19、21:ポテト、E.coli、SynechocystisPCC6803、Clostridium butyricum、Chlamydia pneumoniaeのアミロマルターゼアミノ酸配列;
配列番号16〜27;改変体を作製する際に使用されたPCRプライマー。
Claims (18)
- 配列番号2に示されるThermus aquaticus ATCC 33923株由来のアミロマルターゼポリペプチドにおいて、配列番号2のアミノ酸配列の54位チロシンの、チロシン、フェニルアラニンおよびリジン以外のアミノ酸への置換を含むアミロマルターゼポリペプチド。
- 前記配列番号2のアミノ酸配列の54位チロシンの、チロシン、フェニルアラニンおよびリジン以外のアミノ酸への置換は、アラニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、アスパラギン、アルギニン、セリンまたはスレオニンへの置換を含む、請求項1に記載のアミロマルターゼポリペプチド。
- 前記配列番号2のアミノ酸配列の54位チロシンの、チロシン、フェニルアラニンおよびリジン以外のアミノ酸への置換は、グリシンまたはスレオニンへの置換を含む、請求項1に記載のアミロマルターゼポリペプチド。
- 前記配列番号2のアミノ酸配列の54位チロシンの、チロシン、フェニルアラニンおよびリジン以外のアミノ酸への置換は、グリシンへの置換を含む、請求項1に記載のアミロマルターゼポリペプチド。
- 配列番号2のアミロマルターゼポリペプチドに比較して、酵素活性の上昇および加水分解活性の低下の両方の特性を有する、請求項1〜4のいずれか1項に記載のアミロマルターゼポリペプチド。
- 前記加水分解活性の低下は、配列番号2のアミロマルターゼポリペプチドに比較して少なくとも10%以上の低下を含む、請求項5に記載のアミロマルターゼポリペプチド。
- 前記酵素活性の上昇は、配列番号2のアミロマルターゼポリペプチドに比較して少なくとも10%以上の上昇を含む、請求項5に記載のアミロマルターゼポリペプチド。
- 前記配列番号2のアミノ酸配列の54位チロシンの、チロシン、フェニルアラニンおよびリジン以外のアミノ酸への置換は、非保存的置換である、請求項1〜7のいずれか1項に記載のアミロマルターゼポリペプチド。
- 請求項1〜8のいずれか1項に記載のポリペプチドをコードする核酸配列を含む、核酸分子。
- 請求項9に記載の核酸分子を含む、ベクター。
- 請求項9に記載の核酸分子を含む、細胞。
- 請求項9に記載の核酸分子を含む、生物組織。
- 請求項9に記載の核酸分子を含む、ヒト以外のトランスジェニック生物。
- 請求項1〜8のいずれか1項に記載のアミロマルターゼポリペプチドを食品素材に、該素材の加熱処理前または加熱処理直後に添加する工程であって、該アミロマルターゼポリペプチドは該食品素材中のデンプンから環状グルカンを生成する、工程、を含む、食品の製造方法。
- 前記食品が、米飯類、和菓子、スナック菓子類、ベーカリー類、麺類、餃子およびシュウマイの皮、水産練り商品、冷凍もしくは冷蔵流通の加工食品、離乳食、ベビーフード、ペットフード、動物用飼料、飲料、スポーツ食品、ならびに栄養補助食品からなる群より選択される、請求項14に記載の方法。
- 請求項1〜8のいずれか1項に記載のポリペプチドを含有する、食品素材、食品添加物または食品改質剤。
- 直鎖のα−1,4−グルカンまたはこれらを含む糖類と、請求項1〜8のいずれか1項に記載のポリペプチドとを反応させる工程を包含する、α−1,4−グルコシド結合により構成される環状構造を分子内に1つ有するグルカンまたはその誘導体の製造方法。
- 直鎖のα−1,4−グルカンまたはこれらを含む糖類と、請求項1〜8のいずれか1項に記載のポリペプチドとを反応させる工程を包含する、食品素材、食品添加物、食品改質剤、飲食用組成物、輸液または接着用組成物の製造方法。
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