DK177092B1

DK177092B1 - Alfa-glucanphosphorylase med forbedret termostabilitet samt fremstilling og anvendelser heraf

Info

Publication number: DK177092B1
Application number: DKPA200600045A
Authority: DK
Inventors: Michiyo Yanase; Hiroki Takata; Kazutoshi Fujii; Takeshi Takaha; Takashi Kuriki
Original assignee: Ezaki Glico Co
Priority date: 2003-06-18
Filing date: 2006-01-10
Publication date: 2011-08-01
Also published as: WO2004113525A1; US7723090B2; CN1809636B; US20100047891A1; JPWO2004113525A1; CN1809636A; US20060275875A1; JP4540067B2; DK200600045A; US7569377B2

Description

DK 177092 B1

α-GLUCANPHOSPHORYLASE MED FORBEDRET TERMOSTABILITET SAMT FREMSTILLING OG ANVENDELSER HERAF

TEKNISK OMRÅDE

5 Den foreliggende opfindelse angår termostabil α-glucanphosphorylase og et gen, som koder for denne termostabile α-glucanphosphorylase. Den foreliggende opfindelse angår desuden en fremgangsmåde til fremstilling af termostabil a-glucanphosphory-lase.

10 BAGGRUNDSTEKNIK

α-glucanphosphorylase (i det følgende også betegnet GP) er et enzym, der fx anvendes til syntese af glucose-1-phosphat (i det følgende også betegnet G-1-P) og glu-cansyntese. G-1-P anvendes fx som medicinsk antibakterielt middel, antitumormiddel (som platinkompleks), lægemiddel til behandling af hjertesygdom (som et aminsalt) 15 eller et substrat til glucansyntese. GP er vidt udbredt i planter, fx i rodknolde såsom kartofler; dyr, fx i kaninmuskel; og mikroorganismer såsom gær.

Blandt de ovennævnte er plante GP nyttig, da den generelt har evne til at syntetisere glucaner med en høj molekylvægt.

Forskellige GP’er kan anvendes til fremstilling af G-1-P eller glucaner, bl.a. anven-20 des kartoffel GP i mange tilfælde, fordi der let kan opnås en relativt stor mængde af enzymet.

Ved industriel produktion af G-1-P eller en glucan under anvendelse af GP er det nødvendigt i det væsentlige at fjerne anden enzymaktivitet stammende fra kontaminering af GP, især phosphataseaktivitet og amylaseaktivitet. Escherichia coli og Bacillus 25 subtilis er ønskelige værter til ekspression af et GP-gen, når der produceres store mængder GP. Som vist i fig. 4 og fig. 5 har Escherichia coli imidlertid amylaseaktivitet og phosphataseaktivitet, og Bacillus subtilis har amylaseaktivitet. Som vist i fig. 4 og 5 kan enzymer, der udtrykkes af disse værter, imidlertid ikke inaktiveres ved varmebehandling ved 55°C, men kan inaktiveres næsten fuldstændigt ved varmebehandling 30 ved 60°C. Derfor har der været ønske om en planteafledt GP med varmeresistens, hvorved dens aktivitet ikke går tabt.

Som reference er specifikke numeriske værdier for amylaseaktivitet og phosphataseaktivitet i celleekstrakter fra forskellige bakterier (Escherichia coli TG-1-stamme,

Escherichia coli BL21-stamme og Bacillus subtilis ANA-1-stamme) før og efter op-35 varmning vist i følgende tabel 1.

2 DK 177092 B1 (Tabel 1)_ _Phosphataseaktivitet (%)_Amylaseaktivitet (%)_ _TG£I_BIJ21_TG-1 BL21 ANA-1 Før op- 100 100 100 100 100 varmning 50°C 99,1 98,6 21,6 28,6 33,8 55°C 60,9 74,5 9,1 9,7 19,8 60°C 2,9 3,1 0,4 0 3,0 65°C_2J>_210_09_0_2,4

Imidlertid kendes der ikke en plante GP, som kan syntetisere glucaner med høj molekylvægt og har termostabilitet, især GP, som kan opretholde tilstrækkelig aktivitet 5 ved høje temperaturer (fx 60°C til 75°C). Med hensyn til GP, der stammer fra andre organismer end planter, er der beskrevet GP med høj termostabilitet, GP udtrykt af ekstreme termofile bakterier (Thermus aquaticus, Thermococcus litoralis, Aquifex aeo-licus og lignende). Da ovennævnte GP stammer fra andre organismer end planter, er den imidlertid ude af stand til at syntetisere glucaner med høj molekylvægt og er såle-10 des mindre anvendelig.

GP’er klassificeres i to grupper baseret på homologi mellem aminosyresekvenser (se ikke-patentdokument 1). GP med 30% eller mere identitet med kartoffel GP klassificeres som en gruppe A GP, og en GP med mindre end 30% identitet med kartoffel GP og med 30% eller mere identitet med GP fra Thermus aquaticus klassificeres som 15 en gruppe B GP.

En glucan, der fremstilles under anvendelse af GP, som stammer fra Thermus og tilhører gruppe B, har en betydeligt lavere molekylvægt i sammenligning med en glucan, der fremstilles under anvendelse af kartoffel GP, som klassificeres som en gruppe A GP. Af denne årsag er der det problem, at glucaner med høj molekylvægt ikke kan 20 opnås under anvendelse af GP stammende fra Thermus.

For at løse disse problemer er der behov for en planteafledt GP, som er fordelagtig til industriel anvendelse og har høj termostabilitet.

Teoretiske fremgangsmåder til at gøre et almindeligt enzym mere termostabilt, såsom prolinteori og aminosyresubstitution baseret på information om enzymets steriske 25 struktur, er blevet forsøgt, men er ikke nødvendigvis lykkedes. Af denne årsag udføres der fortiden fremgangsmåder baseret på tilfældig mutation eller fremgangsmåder under anvendelse af en kombination af tilfældig mutation og teoretisk metodologi. Ved hver af disse fremgangsmåder skal ethvert protein imidlertid karakteriseres ved at prøve sig frem.

3 DK 177092 B1

Hvad angår andre enzymer end GP, er det beskrevet, at når først positionen af én eller flere bestemte aminosyrer, der er involveret i at forbedre et enzyms termostabilitet, er bestemt, kan et enzym gøres termostabilt ved substitution af den eller de specificerede aminosyrerester med andre aminosyrerester (se fx ikke-patentdokument 3 til 5).

5 Et eksempel på GP med forbedret termostabilitet er beskrevet med hensyn til

Escherichia coli-maltodextrinphosphorylase (se ikke-patentdokument 2). I dette dokument beskrives termostabil Escherichia coli-maltodextrinphosphorylase. Maltodextrin-phosphorylase er én type GP. I denne GP med forbedret termostabilitet er asparagin i position 133 erstattet med alanin. Denne asparagin i position 133 er til stede i et aktivt 10 sted og er et bindingssted for pyridoxal-5’-phosphat, som er et coenzym, der er essentielt i den enzymatiske reaktion. I denne GP med forbedret termostabilitet forbedres termostabilitet med ca. 15°C, og den optimale reaktionstemperatur forhøjes fra ca.

45°C til ca. 60°C, og GP denatureres ved ca. 67°C i sammenligning med naturlig GP.

Denne Escherichia coli GP, der ligner Thermus GP, har imidlertid ikke evnen til at syn-15 tetisere glucaner med høj molekylvægt. Enzymaktiviteten ved optimale temperaturer for GP med forbedret termostabilitet, som beskrives i dette dokument, er desuden lavere end naturlig GP’s enzymaktivitet ved en optimal temperatur. Det vil sige, at på grund af mutation er dens evne til at syntetisere en glucan formindsket. Af denne årsag beskriver dette dokument, at substitution i position 133 ikke er at foretrække, i det mindste 20 ud fra et synspunkt med hensyn til glucansyntetiserende evne.

Et enzymprotein er sædvanligvis ustabilt og er følsomt over for fysiske faktorer såsom pH, temperatur, etc. samt proteaser og kan således let nedbrydes. Blandt enzymer er der også enzymer, som bliver mere ustabile og derfor let nedbrydes ved høje grader af oprensning. Af denne årsag skal enzymer fremstilles ved så lave temperatu-25 rer som muligt og skal fremstilles før enhver anvendelse. Nedbrydning af et enzym kan undertrykkes ved frysning og lagring. Imidlertid nedbrydes proteiner efter optøning i nogle tilfælde, og håndtering er derfor vanskelig, når et enzym lagres trosset og derefter optøs. Når et enzym nedbrydes, ændrer den steriske struktur sig generelt, og enzymets beskaffenhed med hensyn til optimal pH, pH-stabilitet, reaktionshastighed, 30 substrataffinitet og lignende ændres på tilsvarende måde. Undertiden formindskes eller inaktiveres enzymaktiviteten. Som sådan har nedbrydning af et enzymprotein en stor indflydelse på enzymreaktion. Af denne årsag er det for industrier, der anvender enzymer, ønskeligt at anvende enzymer, der så vidt muligt har udmærket stabilitet.

Det har været kendt, at naturlig kartoffel type L GP også let nedbrydes, og selv når 35 oprenset GP afkøles og lagres, nedbrydes den gradvist fra tidspunktet for oprensning.

4 DK 177092 B1 Når nedbrydning af et GP-protein kan undertrykkes, bliver det muligt at fremstille en stor mængde GP og lagre den i lang tid, hvorved produktionseffektiviteten øges, hvilket er en betydelig fordel med hensyn til både lagring og anvendelse af et enzym. Af denne årsag er det også foretrukket at tilvejebringe GP, som kan lagres i lang tid uden ned-5 brydning.

(Ikke-patentdokument 1)

Takeshi Takaha, et el., "Structure and Properties of Thermus aqaticus a-Glucan Phosphorylase Expressed in Escherichia coli", J. Appl. Glycosi., 2001, Vol.48, No.1, 10 pp.71-78 (Ikke-patentdokument 2)

Richard Griepier, et al., "Mechanism of thermal denaturation of maltodextrin phosphorylase from Escherichia coli", Biochem. J., 2000, 346, pp.255-263 15 (Ikke-patentdokument 3)

Martin Lehmann and Markus Wyss, "Engineering proteins for thermostability: the use of sequence alignments versus rational design and directed evolution", Current Opinion in Biotechnology, 2001, 12, pp.371-375 20 (Ikke-patentdokument 4) M. Lehmann, et al., "The consensus concept for thermostability engineering of proteins", Biochemica Biophysica Acta, 2000, 1543, pp.408-415 25 (Ikke-patentdokument 5)

Junichi Miyazaki, et al., "Ancestral Residues Stabilizing 3-lsopropylmalate Dehydrogenase of an Extreme Thermophile: Experimental Evidence Supporting the Thermophilic Common Ancestor Hypothesis", J. Biochem, 2001, 129, pp.777-782

30 BESKRIVELSE AF OPFINDELSEN

PROBLEMER, SOM SKAL LØSES AF OPFINDELSEN Den foreliggende opfindelse har til hensigt at løse de ovenfor nævnte problemer, og et formål med den foreliggende opfindelse er at tilvejebringe en planteafledt a-35 glucanphosphorylase, som har bedre termostabilitet end den konventionelle a- 5 DK 177092 B1 glucanphosphorylase. Mere specifikt er et formål med den foreliggende opfindelse at tilvejebringe en planteafledt α-glucanphosphorylase, som har udmærket lagerstabilitet ud over termostabilitet.

5 MIDLER TIL LØSNING AF PROBLEMERNE

Som et resultat af grundige undersøgelser for at løse de ovenfor nævnte problemer har nærværende opfindere fundet, at en planteafledt GP med forbedret termostabilitet opnås ved at substituere en aminosyrerest i en bestemt position i aminosyresekvensen af en plante GP. Baseret på disse fund har nærværende opfindere fuldført den forelig-10 gende opfindelse.

For at løse de ovenfor nævnte problemer fortsatte nærværende opfindere med en intensiv undersøgelse og fandt som et resultat heraf til sidst, at de ved at substituere en aminosyrerest i en specifik position af aminosyresekvensen af en plante GP gjorde den ovenfor nævnte opdagelse, hvilket resulterede i færdiggørelse af den foreliggende 15 opfindelse på basis heraf.

En α-glucanphosphorylase med forbedret termostabilitet ifølge den foreliggende opfindelse er en α-glucanphosphorylase med forbedret termostabilitet, som opnås ved at modificere en naturlig a-glucanphosphorylase, hvor den naturlige α-glucanphosphorylase stammer fra en plante, og hvor 20 (I) den naturlige α-glucanphosphorylase inkluderer en motivsekvens 1L: H-A- E-F-T-P-V-F-S, og hvor α-glucanphosphorylasen med forbedret termostabilitet har en aminosyrerest I, L eller V i position 4 i motivsekvensen 1L; (II) den naturlige α-glucanphosphorylase inkluderer en motivsekvens 1Ha: H-A-Q-Y-T-P-H-F-S, og hvor α-glucanphosphorylasen med forbedret termostabi- 25 litet har en aminosyrerest L i position 4 i motivsekvensen 1Ha; (III) den naturlige α-glucanphosphorylase inkluderer en motivsekvens 1Hb: H-A-K-Y-S-P-H-F-S, og hvor α-glucanphosphorylasen med forbedret termostabilitet har en aminosyrerest L i position 4 i motivsekvensen 1 Hb; (IV) den naturlige α-glucanphosphorylase inkluderer en motivsekvens 2: A-L-G- 30 N-G-G-L-G og hvor α-glucanphosphorylasen med forbedret termostabilitet har en aminosyrerest A, C, D, E, G, Η, I, L, M, F, S, T, V eller Y i position 4 i motivsekvensen 2; (V) den naturlige α-glucanphosphorylase inkluderer en motivsekvens 3L: R-l-V-K-F-l-T-D-V og hvor α-glucanphosphorylasen med forbedret termostabilitet 35 har en aminosyrerest C, I, L, M eller W i position 7 i motivsekvensen 3; 6 DK 177092 B1 (VI) den naturlige α-glucanphosphorylase inkluderer en motivsekvens 3Ha: R-l-V-K-L-V-T-D-V og hvor α-glucanphosphorylasen med forbedret termostabilitet har en aminosyrerest I i position 7 i motivsekvensen 3Ha; eller (Vil) den naturlige α-glucanphosphorylase inkluderer en motivsekvens 3Hb: R-l-5 V-K-L-V-N-D-V og hvor α-glucanphosphorylasen med forbedret termostabili tet har en aminosyrerest I i position 7 i motivsekvensen 3Hb; hvora-glucanphosphorylase med forbedret termostabilitet harden samme amino-syresekvens som den naturlige α-glucanphosphorylase med undtagelse af substitutionen som defineret i (l-VII) eller en aminosyresekvens i hvilken, udover en substitution 10 som defineret i (l-VII), en eller flere aminosyrerester er deleteret, substitueret eller tilføjet til en aminosyresekvens af en naturlige a-glucanphosphorylase; hvor enzymeaktiviteten af α-glucanphosphorylasen med forbedret termostabilitet er ækvivalent med eller bedre end den naturlige α-glucanphosphorylase og hvor enzymaktiviteten af α-glucanphosphorylasen med forbedret termostabilitet ved 15 37°C efter opvarmning i en 20 mM citratbuffer (pH 6,7) ved 60°C i 10 minutter er 20% eller mere af enzymaktiviteten af α-glucanphosphorylasen med forbedret termostabilitet ved 37°C før opvarmning.

I en udførelses form har α-glucanphosphorylasen med forbedret termostabilitet en aminosyrerest, som er forskellig fra den i den naturlige α-glucanphosphorylase i mindst 20 én position valgt fra gruppen bestående af: en position svarende til position 4 i motivsekvensen 1L: H-A-E-F-T-P-V-F-S eller en position svarende til position 4 i motivsekvensen 1H: H-A-Q-Y-S-P-H-F-S; en position svarende til position 4 i motivsekvensen 2: A-L-G-N-G-G-L-G; og en position svarende til position 7 i motivsekvensen 3L: R-l-V-K-F-l-T-D-V eller en 25 position svarende til position 7 i motivsekvensen 3H: R-l-V-K-L-V-N-D-V; og hvor enzymaktiviteten af α-glucanphosphorylasen med forbedret termostabilitet ved 37°C efter opvarmning i en 20 mM citratbuffer (pH 6,7) ved 60°C i 10 minutter er 20% eller mere af enzymaktiviteten ved 37°C af α-glucanphosphorylasen med forbedret termostabilitet før opvarmningen.

30 I én udførelsesform kan den naturlige α-glucanphosphorylase have en amino syrerest, som er forskellig fra en aminosyrerest af den naturlige a-glucanphosphorylase i en position svarende til position 4 i motivsekvensen 1L; eller en position svarende til position 4 i motivsekvensen 1H; eller en position svarende til position 7 i motivsekvensen 3L; eller en position svarende til position 7 i motivsekvensen 3H.

7 DK 177092 B1 I én udførelsesform kan aminosyresekvensen af en naturlig a-glucanphosphorylase have mindst 50% identitet med en aminosyresekvens valgt fra gruppen bestående af position 1 til position 916 af SEQ ID NO: 2; position 1 til position 912 af SEQ ID NO: 4; position 1 til position 893 af SEQ ID NO: 6; position 1 til position 939 af SEQ ID NO: 8; 5 position 1 til position 962 af SEQ ID NO: 10; position 1 til position 971 af SEQ ID NO: 12; position 1 til position 983 af SEQ ID NO: 14; position 1 til position 928 af SEQ ID NO: 16; position 1 til position 951 af SEQ ID NO: 18; position 1 til position 832 af SEQ ID NO: 20; position 1 til position 840 af SEQ ID NO: 22; position 1 til position 841 af SEQ ID NO: 24; position 1 til position 842 af SEQ ID NO: 26; position 1 til position 841 10 af SEQ ID NO: 28; og position 1 til position 838 af SEQ ID NO: 30.

I én udførelsesform kan aminosyresekvensen af en naturlig a-glucanphosphorylase kodes af et nukleinsyremolekyle, som hybridiserer under stringente betingelser til et nukleinsyremolekyle bestående af en basesekvens, som koder for en aminosyresekvens valgt fra gruppen bestående af: position 1 til position 916 af SEQ ID NO: 2; posi-15 tion 1 til position 912 af SEQ ID NO: 4; position 1 til position 893 af SEQ ID NO: 6; position 1 til position 939 af SEQ ID NO: 8; position 1 til position 962 af SEQ ID NO: 10, position 1 til position 971 af SEQ ID NO: 12; position 1 til position 983 af SEQ ID NO: 14; position 1 til position 928 af SEQ ID NO: 16; position 1 til position 951 af SEQ ID NO: 18; position 1 til position 832 af SEQ ID NO: 20; position 1 til position 840 af SEQ 20 ID NO: 22; position 1 til position 841 af SEQ ID NO: 24; position 1 til position 842 af SEQ ID NO: 26; position 1 til position 841 af SEQ ID NO: 28; og position 1 til position 838 af SEQ ID NO: 30.

I én udførelsesform kan den naturlige α-glucanphosphorylase være en type L a-glucanphosphorylase og kan have en aminosyrerest, som er forskellig fra den i den 25 naturlige α-glucanphosphorylase i mindst én position valgt fra gruppen bestående af: en position svarende til position 4 i motivsekvensen 1L; en position svarende til position 4 i motivsekvensen 2; og en position svarende til position 7 i motivsekvensen 3L.

I én udførelsesform kan den naturlige α-glucanphosphorylase være type H a-glu-canphosphorylase og kan have en aminosyrerest, der er forskellig fra den i den naturli-30 ge α-glucanphosphorylase i mindst én position valgt fra gruppen bestående af: en position svarende til position 4 i motivsekvensen 1H; en position svarende til position 4 i motivsekvensen 2; og en position svarende til position 7 i motivsekvensen 3H.

I én udførelsesform kan aminosyresekvensen af den naturlige a-glucanphosphorylase vælges fra gruppen bestående af: position 1 til position 916 af SEQ ID NO: 2; po-35 sition 1 til position 912 af SEQ ID NO: 4; position 1 til position 893 af SEQ ID NO: 6; 8 DK 177092 B1 position 1 til position 939 af SEQ ID NO: 8; position 1 til position 962 af SEQ ID NO: 10; position 1 til position 971 af SEQ ID NO: 12; position 1 til position 983 af SEQ ID NO: 14; position 1 til position 928 af SEQ ID NO: 16; position 1 til position 951 af SEQ ID NO: 18; position 1 til position 832 af SEQ ID NO: 20; position 1 til position 840 af SEQ 5 ID NO: 22; position 1 til position 841 af SEQ ID NO: 24; position 1 til position 842 af SEQ ID NO: 26; position 1 til position 841 af SEQ ID NO: 28; og position 1 til position 838 af SEQ ID NO: 30.

I én udførelsesform kan den naturlige α-glucanphosphorylase stamme fra kartoffel eller Arabidopsis thaliana.

10 I én udførelsesform kan α-glucanphosphorylasen ifølge den foreliggende opfindelse have en aminosyrerest, som er forskellig fra aminosyreresten i den naturlige a-glucan-phosphorylase i mindst to positioner valgt fra gruppen bestående af: en position svarende til position 4 i motivsekvensen 1L eller en position svarende til position 4 i motivsekvensen 1H; en position svarende til position 4 i motivsekvensen 2; og en position 15 svarende til position 7 i motivsekvensen 3L eller en position svarende til position 7 i motivsekvensen 3H.

I én udførelsesform kan en α-glucanphosphorylase ifølge den foreliggende opfindelse have en aminosyrerest, som er forskellig fra en aminosyrerest i en naturlig a-glucanphosphorylase i en position svarende til position 4 i motivsekvensen 1L eller en 20 position svarende til position 4 i motivsekvensen 1H; en position svarende til position 4 i motivsekvensen 2; og en position svarende til position 7 i motivsekvensen 3L eller en position svarende til position 7 i motivsekvensen 3H.

I én udførelsesform kan en aminosyrerest i en position svarende til position 4 i motivsekvensen 1L eller en position svarende til position 4 i motivsekvensen 1H vælges 25 fra gruppen bestående af I, L og V.

I én udførelsesform kan en aminosyrerest i en position svarende til position 4 i motivsekvensen 1L eller en position svarende til position 4 i motivsekvensen 1H vælges fra gruppen bestående af I og L.

I én udførelsesform kan en aminosyrerest i en position svarende til position 4 i mo-30 tivsekvensen 2 vælges fra gruppen bestående af A, C, D, E, G, Η, I, L, M, F, S, T, V og Y.

I én udførelsesform kan en aminosyrerest i en position svarende til position 4 i motivsekvensen 2 vælges fra gruppen bestående af C, G, S og V.

9 DK 177092 B1 I én udførelsesform kan en aminosyrerest i en position svarende til position 7 i motivsekvensen 3L eller en position svarende til position 7 i motivsekvensen 3H vælges fra gruppen bestående af C, I, L, V og W.

I én udførelsesform kan en aminosyrerest i en position svarende til position 7 i mo-5 tivsekvensen 3L eller en position svarende til position 7 i motivsekvensen 3H vælges fra gruppen bestående af C, I, L og V.

I én udførelsesform kan enzymaktiviteten af a-glucanphosphorylasen med forbedret termostabilitet ved 37°C efter opvarmning i en 20 mM citratbuffer (pH 6,7) ved 60°C i 10 minutter være 30% eller mere af enzymaktiviteten af α-glucanphosphorylasen med 10 forbedret termostabilitet ved 37°C før opvarmning.

I én udførelsesform er enzymaktiviteten af α-glucanphosphorylasen med forbedret termostabilitet ved 37°C efter opvarmning i en 20 mM citratbuffer (pH 6,7) ved 65°C i 2 minutter 10% eller mere af enzymaktiviteten af α-glucanphosphorylasen med forbedret termostabilitet ved 37°C før opvarmning.

15 I én udførelsesform kan α-glucanphosphorylasen med forbedret termostabilitet ha ve forbedret lagerstabilitet i sammenligning med naturlig a-glucanphosphorylase.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen er en fremgangsmåde til fremstilling af a-glucanphosphorylase med forbedret termostabilitet, hvilken fremgangsmåde omfatter, at: 20 et første nukleinsyremolekyle, der omfatter en basesekvens, som koder for en før ste α-glucanphosphorylase, modificeres for at opnå et andet nukleinsyremolekyle, der omfatter en modificeret basesekvens; der fremstilles en ekspressionsvektor, som omfatter det andet nukleinsyremolekyle; ekspressionsvektoren indføres i en celle for at udtrykke a-glucanphosphorylase 25 med forbedret termostabilitet; og den udtrykte α-glucanphosphorylase med forbedret termostabilitet opsamles, idet den første α-glucanphosphorylase stammer fra en plante; hvor (I) den første α-glucanphosphorylase inkluderer en motivsekvens 1L: H-A-E-F-T-P-V-F-S, og hvor α-glucanphosphorylasen med forbedret termostabilitet 30 har en aminosyrerest I, L eller V i position 4 i motivsekvensen 1L; (II) den første α-glucanphosphorylase inkluderer en motivsekvens 1 Ha: H-A-Q-Y-T-P-H-F-S, og hvor α-glucanphosphorylasen med forbedret termostabilitet har en aminosyrerest L i position 4 i motivsekvensen 1Ha; 10 DK 177092 B1 (III) den første α-glucanphosphorylase inkluderer en motivsekvens 1 Hb: H-A-K-Y-S-P-H-F-S, og hvor α-glucanphosphorylasen med forbedret termostabilitet har en aminosyrerest L i position 4 i motivsekvensen 1 Hb; (IV) den første α-glucanphosphorylase inkluderer en motivsekvens 2: A-L-G-N- 5 G-G-L-G og hvor α-glucanphosphorylasen med forbedret termostabilitet har en aminosyrerest A, C, D, E, G, Η, I, L, M, F, S, T, V eller Y i position 4 i motivsekvensen 2; (V) den første α-glucanphosphorylase inkluderer en motivsekvens 3L: R-l-V-K-F-l-T-D-V og hvor α-glucanphosphorylasen med forbedret termostabilitet 10 har en aminosyrerest C, I, L, M eller W i position 7 i motivsekvensen 3; (VI) den første α-glucanphosphorylase inkluderer en motivsekvens 3Ha: R-l-V-K-L-V-T-D-V og hvor α-glucanphosphorylasen med forbedret termostabilitet har en aminosyrerest I i position 7 i motivsekvensen 3Ha; eller (Vil) den første α-glucanphosphorylase inkluderer en motivsekvens 3Hb: R-l-V-15 K-L-V-N-D-V og hvor α-glucanphosphorylasen med forbedret termostabilitet har en aminosyrerest I i position 7 i motivsekvensen 3Hb; hvor α-glucanphosphorylasen med forbedret termostabilitet har den samme amino-syresekvens som en første α-glucanphosphorylase med undtagelse af substitutionen som defineret i (l-VII) eller en aminosyresekvens i hvilken, udover en substitution som 20 defineret i (l-VII), en eller flere aminosyrerester er deleteret, substitueret eller tilføjet til en aminosyresekvens af den første a-glucanphosphorylase; hvor enzymeaktiviteten af α-glucanphosphorylasen med forbedret termostabilitet er ækvivalent med eller bedre end den første α-glucanphosphorylase og hvor enzymaktiviteten af α-glucanphosphorylasen med forbedret termostabilitet ved 25 37°C efter opvarmning i en 20 mM citratbuffer (pH 6,7) ved 60°C i 10 minutter er 20% eller mere af enzymaktiviteten af α-glucanphosphorylasen med forbedret termostabilitet ved 37°C før opvarmning.

I en udførelsesform har α-glucanphosphorylasen med forbedret termostabilitet en aminosyrerest, som er forskellig fra en aminosyrerest i den første a-glucanphosphory-30 lase i mindst én position valgt fra gruppen bestående af: en position svarende til position 4 i motivsekvensen 1L: H-A-E-F-T-P-V-F-S eller en position svarende til position 4 i motivsekvensen 1H: H-A-Q-Y-S-P-H-F-S; en position svarende til position 4 i motivsekvensen 2: A-L-G-N-G-G-L-G; og en position svarende til position 7 i motivsekvensen 3L: R-l-V-K-F-l-T-D-V eller en 35 position svarende til position 7 i motivsekvensen 3H: R-l-V-K-L-V-N-D-V; og hvor 11 DK 177092 B1 enzymaktiviteten af α-glucanphosphorylasen med forbedret termostabilitet ved 37°C efter opvarmning i en 20 mM citratbuffer (pH 6,7) ved 60°C i 10 minutter er 20% eller mere af enzymaktiviteten af α-glucanphosphorylasen med forbedret termostabilitet ved 37°C før opvarmning.

5 I én udførelsesform kan en aminosyrerest af α-glucanphosphorylasen med forbed ret termostabilitet i en position svarende til position 4 i motivsekvensen 1L eller en position svarende til position 4 i motivsekvensen 1H; eller en position svarende til position 7 i motivsekvensen 3L eller en position svarende til position 7 i motivsekvensen 3H være forskellig fra aminosyreresten i den første a-glucanphosphorylase.

10 I én udførelsesform kan den første α-glucanphosphorylase være en type L a-glu- canphosphorylase og kan have en aminosyrerest, som er forskellig fra den i den naturlige α-glucanphosphorylase i mindst én position valgt fra gruppen bestående af: en position svarende til position 4 i motivsekvensen 1L; en position svarende til position 4 i motivsekvensen 2; og en position svarende til position 7 i motivsekvensen 3L.

15 I én udførelsesform kan den første α-glucanphosphorylase være en type Η a- glucanphosphorylase og kan have en aminosyrerest, som er forskellig fra den i den naturlige α-glucanphosphorylase i mindst én position valgt fra gruppen bestående af: en position svarende til position 4 i motivsekvensen 1H; en position svarende til position 4 i motivsekvensen 2; og en position svarende til position 7 i motivsekvensen 3H.

20 I én udførelsesform kan den første α-glucanphosphorylase stamme fra kartoffel eller Arabidopsis thaliana.

Et nukleinsyremolekyle ifølge den foreliggende opfindelse omfatter en basesekvens, som koder for α-glucanphosphorylasen med forbedret termostabilitet.

En vektor ifølge den foreliggende opfindelse omfatter nukleinsyremolekylet.

25 En celle ifølge den foreliggende opfindelse omfatter nukleinsyremolekylet.

En fremgangsmåde til at syntetisere en glucan ifølge opfindelsen omfatter reaktion af en reaktionsopløsning indeholdende α-glucanphosphorylasen med forbedret termostabilitet, en saccharosephosphorylase, saccharose, en primer og uorganisk phosphor-syre eller glucose-1-phosphat til fremstilling afen glucan.

30 I én udførelsesform kan reaktionen udføres ved en temperatur på fra 60°C til 75°C.

En anden fremgangsmåde til at syntetisere en glucan ifølge opfindelsen omfatter reaktion af en reaktionsopløsning indeholdende α-glucanphosphorylasen med forbedret termostabilitet, en primer og glucose-1-phosphat til fremstilling af en glucan.

I én udførelsesform kan reaktionen udføres ved en temperatur på fra 60°C til 75°C.

12 DK 177092 B1

En fremgangsmåde til at syntetisere glucose-1-phosphat ifølge opfindelsen omfatter reaktion af en reaktionsopløsning indeholdende α-glucanphosphorylase med forbedret termostabilitet ifølge krav 1, en glucan og uorganisk phosphorsyre til fremstilling af glucose-1-phosphat.

5 I én udførelsesform kan reaktionen udføres ved en temperatur på fra 60°C til 75°C.

a-glucanphosphorylasen med forbedret termostabilitet ifølge den foreliggende opfindelse er en α-glucanphosphorylase med forbedret termostabilitet, som opnås ved at modificere en naturlig plante a-glucanphosphorylase, hvor α-glucanphosphorylasen med forbedret termostabilitet har en aminosyrerest, 10 som er forskellig fra en aminosyrerest i den naturlige α-glucanphosphorylase i: en position svarende til position 4 i motivsekvensen 1L: H-A-E-F-T-P-V-F-S eller en position svarende til position 4 i motivsekvensen 1H: H-A-Q-Y-S-P-H-F-S; en position svarende til position 4 i motivsekvensen 2: A-L-G-N-G-G-L-G; og en position svarende til position 7 i motivsekvensen 3L: R-l-V-K-F-l-T-D-V eller en 15 position svarende til position 7 i motivsekvensen 3H: R-l-V-K-L-V-N-D-V; hvor enzymaktiviteten af α-glucanphosphorylasen med forbedret termostabilitet ved 37°C efter opvarmning i en 20 mM citratbuffer (pH 6,7) ved 60°C i 10 minutter er 20% eller mere af enzymaktiviteten af α-glucanphosphorylasen med forbedret termostabilitet ved 37°C før opvarmning, og 20 α-glucanphosphorylasen med forbedret termostabilitet har evne til at syntetisere en amylose med en vægtgennemsnitlig molekylvægt på 600 kDa eller mere.

En anden α-glucanphosphorylase med forbedret termostabilitet ifølge den foreliggende opfindelse er en α-glucanphosphorylase med forbedret termostabilitet, som opnås ved at modificere en naturlig a-glucanphosphorylase, 25 hvor den naturlige α-glucanphosphorylase stammer fra en plante, α-glucanphosphorylasen med forbedret termostabilitet haren aminosyrerest, som er forskellig fra den i den naturlige α-glucanphosphorylase i mindst én position valgt fra gruppen bestående af: en position svarende til phenylalanin i position 39 (F39); en position svarende til asparagin i position 135 (N135); og en position svarende til threonin i 30 position 706 (T706) af en aminosyresekvens med SEQ ID NO: 2; og hvor enzymaktiviteten af α-glucanphosphorylasen med forbedret termostabilitet ved 37°C efter opvarmning i en 20 mM citratbuffer (pH 6,7) ved 60°C i 10 minutter er 20% eller mere af enzymaktiviteten af α-glucanphosphorylasen med forbedret termostabilitet ved 37°C før opvarmning.

13 DK 177092 B1 I én udførelsesform har α-glucanphosphorylasen med forbedret termostabilitet en aminosyrerest, som er forskellig fra en aminosyrerest i den naturlige a-glucanphospho-rylase i en position svarende til phenylalanin i position 39 (F39); eller en position svarende til threonin i position 706 (T706) af en aminosyresekvens med SEQ ID NO: 2.

5 I én udførelsesform har en aminosyresekvens af den naturlige a-glucanphosphory- lase mindst 50% identitet med en aminosyresekvens valgt fra gruppen bestående af: position 1 to position 916 of SEQ ID NO: 2; position 1 to position 912 of SEQ ID NO:4; position 1 til position 893 af SEQ ID NO: 6; position 1 til position 939 af SEQ ID NO:8; position 1 til position 962 af SEQ ID NO: 10; position 1 til position 971 af SEQ ID NO:

10 12; position 1 til position 983 af SEQ ID NO: 14; position 1 til position 928 af SEQ ID

NO: 16; position 1 til position 951 af SEQ ID NO: 18; position 1 til position 832 af SEQ ID NO:20; position 1 til position 840 af SEQ ID NO: 22; position 1 til position 841 af SEQ ID NO:24; position 1 til position 842 af SEQ ID NO: 26; position 1 til position 841 af SEQ ID NO:28; og position 1 til position 838 af SEQ ID NO: 30.

15 I én udførelsesform kodes aminosyresekvensen af den naturlige a-glucanphospho- rylase af et nukleinsyremolekyle, som hybridiserer under stringente betingelser til et nukleinsyremolekyle bestående af en basesekvens, som koder for en aminosyresekvens valgt fra gruppen bestående af: position 1 til position 916 af SEQ ID NO: 2; position 1 til position 912 af SEQ ID NO: 4; position 1 til position 893 af SEQ ID NO: 6; po-20 sition 1 til position 939 af SEQ ID NO: 8; position 1 til position 962 af SEQ ID NO: 10; position 1 til position 971 af SEQ ID NO: 12; position 1 til position 983 af SEQ ID NO: 14; position 1 til position 928 af SEQ ID NO: 16; position 1 til position 951 af SEQ ID NO: 18; position 1 til position 832 af SEQ ID NO: 20; position 1 til position 840 af SEQ ID NO: 22; position 1 til position 841 af SEQ ID NO: 24; position 1 til position 842 af 25 SEQ ID NO: 26; position 1 til position 841 af SEQ ID NO: 28; og position 1 til position 838 af SEQ ID NO: 30.

I én udførelsesform er basesekvensen valgt fra gruppen bestående af SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID 30 NO: 23, SEQ ID NO. 25, SEQ ID NO: 27 og SEQ ID NO: 29.

I én udførelsesform er den naturlige α-glucanphosphorylase en type L a-glucan-phosphorylase.

I én udførelsesform er den naturlige α-glucanphosphorylase en type H a-glucan-phosphorylase.

14 DK 177092 B1 I én udførelsesform er en aminosyresekvens af den naturlige a-glucanphospho-rylase valgt fra gruppen bestående af: position 1 til position 916 af SEQ ID NO: 2; position 1 til position 912 af SEQ ID NO: 4; position 1 til position 893 af SEQ ID NO: 6; position 1 til position 939 af SEQ ID NO: 8; position 1 til position 962 af SEQ ID NO: 10; 5 position 1 til position 971 af SEQ ID NO: 12; position 1 til position 983 af SEQ ID NO: 14; position 1 til position 928 af SEQ ID NO: 16; position 1 til position 951 SEQ ID NO: 18; position 1 til position 832 af SEQ ID NO: 20; position 1 til position 840 af SEQ ID NO: 22; position 1 til position 841 af SEQ ID NO: 24; position 1 til position 842 af SEQ ID NO: 26; position 1 til position 841 af SEQ ID NO: 28; og position 1 til position 838 af 10 SEQ ID NO: 30.

I én udførelsesform stammer den naturlige α-glucanphosphorylase fra kartoffel eller Arabidopsis thaliana.

I én udførelsesform har α-glucanphosphorylasen med forbedret termostabilitet en aminosyrerest, som er forskellig fra en aminosyrerest i den naturlige a-glucanphospho-15 rylase i mindst to positioner valgt fra gruppen bestående af: en position svarende til phenylalanin i position 39 (F39); en position svarende til asparagin i position 135 (N135); og en position svarende til threonin i position 706 (T706) af en aminosyresekvens med SEQ ID NO: 2.

I én udførelsesform har α-glucanphosphorylasen med forbedret termostabilitet en 20 aminosyrerest, som er forskellig fra en aminosyrerest i den naturlige a-glucanphospho-rylase i en position svarende til phenylalanin i position 39 (F39); en position svarende til asparagin i position 135 (N135); og en position svarende til threonin i position 706 (T706) af en aminosyresekvens med SEQ ID NO: 2.

I én udførelsesform er en aminosyrerest i en position svarende til F39 valgt fra 25 gruppen bestående af isoleucin, valin og leucin.

I én udførelsesform er en aminosyrerest i en position svarende til F39 isoleucin eller leucin.

I én udførelsesform er en aminosyrerest i en position svarende til N135 valgt fra gruppen bestående af alanin, cystein, asparaginsyre, glutaminsyre, glycin, histidin, iso-30 leucin, leucin, methionin, phenylalanin, serin, threonin, valin og tyrosin.

I én udførelsesform er en aminosyrerest i en position svarende til N135 cystein, glycin, serin eller valin.

I én udførelsesform er en aminosyrerest i en position svarende til T706 valgt fra gruppen bestående af cystein, isoleucin, leucin, valin og tryptophan.

15 DK 177092 B1 I én udførelsesform er en aminosyrerest i en position svarende til T706 cystein, isoleucin, leucin eller valin.

I én udførelsesform er enzymaktiviteten af a-glucanphosphorylasen med forbedret termostabilitet ved 37°C efter opvarmning i en 20 mM citratbuffer (pH 6,7) ved 60°C i 5 10 minutter 30% eller mere af enzymaktiviteten af α-glucanphosphorylasen med for bedret termostabilitet ved 37°C før opvarmning.

I én udførelsesform er enzymaktiviteten af α-glucanphosphorylasen med forbedret termostabilitet ved 37°C efter opvarmning i en 20 mM citratbuffer (pH 6,7) ved 65°C i 2 minutter 30% eller mere af enzymaktiviteten af α-glucanphosphorylasen med forbedret 10 termostabilitet ved 37°C før opvarmning.

En fremgangsmåde til fremstilling af en α-glucanphosphorylase med forbedret termostabilitet ifølge den foreliggende opfindelse omfatter, at et første nukleinsyremoleky-le, der omfatter en basesekvens, som koder for en første α-glucanphosphorylase, modificeres for at opnå et andet nukleinsyremolekyle, der omfatter en modificeret basese-15 kvens; der fremstilles en ekspressionsvektor, der omfatter det andet nukleinsyremolekyle; ekspressionsvektoren indføres i en celle for at udtrykke en a-glucanphosphoryla-se med forbedret termostabilitet, og den udtrykte α-glucanphosphorylase med forbedret termostabilitet opsamles, idet den første α-glucanphosphorylase stammer fra en plante, α-glucanphosphorylasen med forbedret termostabilitet har en aminosyrerest, 20 som er forskellig fra en aminosyrerest i den første α-glucanphosphorylase i mindst én position valgt fra gruppen bestående af en position svarende til phenylalanin i position 39 (F39), en position svarende til asparagin i position 135 (N135) og en position svarende til threonin i position 706 (T706) af den i SEQ ID NO: 2 viste aminosyresekvens, og hvor enzymaktiviteten af α-glucanphosphorylasen med forbedret termostabilitet ved 25 37°C efter opvarmning i en 20 mM citratbuffer (pH 6,7) ved 60°C i 10 minutter er 20% eller mere af enzymaktiviteten ved 37°C af α-glucanphosphorylasen med forbedret termostabilitet ved 37°C før opvarmning.

I én udførelsesform er en aminosyrerest i α-glucanphosphorylasen med forbedret termostabilitet i en position svarende til phenylalanin i position 39 (F39); eller en positi-30 on svarende til threonin i position 706 (T706); af den i SEQ ID NO: 2 viste aminosyresekvens forskellig fra en aminosyrerest i den første a-glucanphosphorylase.

I én udførelsesform er den første α-glucanphosphorylase en type L a-glucanphos-phorylase.

I én udførelsesform er den første α-glucanphosphorylase en type H a-glucanphos-35 phorylase.

16 DK 177092 B1 I én udførelsesform stammer den første α-glucanphosphorylase fra kartoffel eller Arabidopsis thaliana.

5 En vektor ifølge den foreliggende opfindelse omfatter nukleinsyremolekylet.

En celle ifølge den foreliggende opfindelse omfatter nukleinsyremolekylet.

En fremgangsmåde til at syntetisere en glucan ifølge den foreliggende opfindelse omfatter reaktion af en reaktionsopløsning indeholdende α-glucanphosphorylasen med forbedret termostabilitet, en saccharosephosphorylase, saccharose, en primer, uorga-10 nisk phosphorsyre eller glucose-1-phosphat til fremstilling af en glucan.

I én udførelsesform udføres reaktionen ved en temperatur på fra 60°C til 75°C.

En fremgangsmåde til at syntetisere en glucan ifølge den foreliggende opfindelse omfatter reaktion af en reaktionsopløsning indeholdende α-glucanphosphorylasen med forbedret termostabilitet, en primer og glucose-1-phosphat.

15 I én udførelsesform udføres reaktionen ved en temperatur på fra 60°C til 75°C.

En fremgangsmåde til at syntetisere glucose-1-phosphat ifølge den foreliggende opfindelse omfatter reaktion af en reaktionsopløsning indeholdende a-glucanphospho-rylasen med forbedret termostabilitet, en glucan og uorganisk phosphorsyre til fremstilling af glucose-1-phosphat.

20 I én udførelsesform udføres reaktionen ved en temperatur på fra 60°C til 75°C.

En α-glucanphosphorylase med forbedret termostabilitet ifølge den foreliggende opfindelse er en α-glucanphosphorylase med forbedret termostabilitet, der er opnået ved at modificere en naturlig plante α-glucanphosphorylase, hvor a-glucanphosphoryla-sen med forbedret termostabilitet har en aminosyrerest, som er forskellig fra en amino-25 syrerest i den naturlige α-glucanphosphorylase i mindst én position valgt fra gruppen bestående af: en position svarende til phenylalanin i position 39 (F39); en position svarende til asparagin i position 135 (N135); og en position svarende til threonin i position 706 (T706) af den i SEQ ID NO: 2 viste aminosyresekvens, hvor enzymaktiviteten afa-glucanphosphorylase med forbedret termostabilitet ved 37°C efter opvarmning i en 20 30 mM citratbuffer (pH 6,7) ved 60°C i 10 minutter er 20% eller mere af enzymaktiviteten af α-glucanphosphorylase med forbedret termostabilitet ved 37°C før opvarmning, og α-glucanphosphorylasen med forbedret termostabilitet har evne til at syntetisere amylase med en vægtgennemsnitlig molekylvægt på 600 kDa eller mere.

17 DK 177092 B1

OPFINDELSENS VIRKNING

Ifølge den foreliggende opfindelse blev der opnået et planteafledt GP-enzym med udmærket termostabilitet ved høje temperaturer (fx 60°C eller højere).

Ifølge α-glucanphosphorylasen med forbedret termostabilitet ifølge den foreliggen-5 de opfindelse er en glucansyntesereaktion mulig ved høje temperaturbetingelser (fx 60°C eller højere), under hvilke naturlige GP-enzymer ikke kan reagere.

Den foreliggende opfindelse opnår den fordel, at når et gen, der koder for a-glucan-phosphorylasen med forbedret termostabilitet ifølge den foreliggende opfindelse (fx et gen, der koder for GP med forbedret termostabilitet, og som er opnået ved forbedring 10 af termostabiliteten af kartoffel GP), højudtrykkes i en mesofil bakterievært, såsom

Escherichia coli, kan kontaminerende enzymer stammende fra værtsbakterien simpelt hen fjernes ved at opvarme bakteriecelleekstrakten, som indeholder et enzym med forbedret termostabilitet, ved 60°C ifølge den foreliggende opfindelse. Især kan amyla-seaktivitet og phosphataseaktivitet, som giver store problemer under industriel anven-15 delse af GP-enzymer, i betydeligt omfang reduceres ved varmebehandling. Derfor er fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse fordelagtig med hensyn til enzymoprensning.

Fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse er ikke blot effektiv i kartoffelafledt GP og Arabidopsis thaliana-afledt GP, men kan også hensigtsmæssigt anvendes 20 til at forbedre termostabiliteten af andre gruppe A GP’er, der udviser høj homologi med en aminosyresekvens af kartoffel GP eller Arabidopsis thaliana-GP.

Derfor kan der opnås andre organisme-afledte GP’er med forbedret termostabilitet, som har en aminosyrerest, der er forskellig fra den i en naturlig a-glucanphosphorylase i mindst én position valgt fra gruppen bestående af: 25 en position svarende til position 4 i motivsekvensen 1L: H-A-E-F-T-P-V-F-S eller en position svarende til position 4 i motivsekvensen 1H: H-A-Q-Y-S-P-H-F-S; en position svarende til position 4 i motivsekvensen 2: A-L-G-N-G-G-L-G; og en position svarende til position 7 i motivsekvensen 3L: R-l-V-K-F-l-T-D-V eller en position svarende til position 7 i motivsekvensen 3H: R-l-V-K-L-V-N-D-V.

30 Der kan opnås andre organisme-afledte GP’er med forbedret termostabilitet, som har en aminosyrerest, der er forskellig fra en aminosyrerest i en naturlig a-glucanphos-phorylase i mindst én position valgt fra gruppen bestående af: en position svarende til phenylalanin i position 39 (F39); en position svarende til asparagin i position 135 (N135); og en position svarende til threonin i position 706 (T706) afen aminosyrese-35 kvens med SEQ ID NO: 2.

18 DK 177092 B1

Ifølge den foreliggende opfindelse tilvejebringes også GP med forbedret termostabilitet, som har forbedret lagerstabilitet.

KORT BESKRIVELSE AF TEGNINGERNE

5 Fig. 1 A: Fig. 1A viser aminosyresekvenserne af α-glucanphosphorylaser stammen de fra forskellige planter, som blev alignet under anvendelse af multipel alignment af GENETYX-WinVer. 4.0.

Fig. 1B: Fig. 1B er en fortsættelse af fig. 1A. Positioner af motivsekvenser 1 og 2 er vist.

10 Fig. 1C: Fig. 1C er en fortsættelse af fig. 1B.

Fig. 1D: Fig. 1D er en fortsættelse af fig. 1C.

Fig. 1E: Fig. 1E er en fortsættelse af fig. 1D.

Fig. 1F: Fig. 1F er en fortsættelse af fig. 1E.

Fig. 1G: Fig. 1G er en fortsættelse af fig. 1F. Positionen af motivsekvens 3 er vist.

15 Fig. 1H: Fig. 1H er en fortsættelse af fig. 1G.

Fig. 11: Fig. 11 er en fortsættelse af fig. 1H.

Fig. 2: Fig. 2 viser skematisk et insertionssted for et a-glucanphosphorylasegen i et plasmid.

Fig. 3: Fig. 3 er en graf, som viser resterende enzymatisk aktivitet (%), når forskelli-20 ge α-glucanphosphorylaser med forbedret termostabilitet inkuberes ved 60°C i 30 minutter eller ved 65°C i 2 minutter.

Fig. 4: Fig. 4 er en graf, som viser resterende enzymatisk aktivitet (%) af phosphatase, efter at forskellige bakterier (Escherichia coli TG-1 og Escherichia coli BL21) er opvarmet ved 50°C, 55°C, 60°C eller 65°C i 30 minutter.

25 Fig. 5: Fig. 5 er en graf, som viser resterende enzymatisk aktivitet (%) af amylase, efter at forskellige bakterier (Escherichia coli TG-1, Escherichia coli BL21 og Bacillus subtilis ANA-1) er opvarmet ved 50°C, 55°C, 60°C eller 65°C i 30 minutter.

Fig. 6: Fig. 6 er en graf, som viser ændring i specifik enzymaktivitet overtid af et GP-enzym med forbedret termostabilitet (trippelmutant (F39L+N135S+T706I)) og et 30 naturligt kartoffel type L GP-enzym.

Fig. 7: Fig. 7 er en graf, som viser mængden af syntetiseret amylose, når et GP-enzym med forbedret termostabilitet (trippelmutant (F39L+N135S+T706I)) og et naturligt kartoffel type L GP-enzym holdes ved 37°C, 50°C, 55°C eller 60°C i 18 timer.

19 DK 177092 B1

Fig. 8: Fig. 8 er en graf, som viser restaktivitet, efter at naturlig kartoffel type L GP og GP’er, der er substitueret med forskellige aminosyrer i F39, er inkuberet ved 60°C i 10 minutter eller ved 65°C i 2 minutter.

Fig. 9: Fig. 9 er en graf, som viser restaktivitet, efter at naturlig kartoffel type L GP 5 og GP’er, der er substitueret med forskellige aminosyrer i N135, er inkuberet ved 60°C i 10 minutter eller ved 65°C i 2 minutter.

Fig. 10: Fig. 10 er en graf, som viser restaktivitet, efter at naturlig kartoffel type L GP og GP’er, der er substitueret med forskellige aminosyrer i T706, er inkuberet ved 60°C i 10 minutter eller ved 65°C i 2 minutter.

10 Fig. 11: Fig. 11 er en graf, som viser restaktivitet, efter at naturlig kartoffel type PI

GP og trippelmutant (Y36L+N133S+T628I) kartoffel type Fl GP er inkuberet ved 58°C i 10 minutter, 60°C i 10 minutter eller ved 65°C i 2 minutter.

Fig. 12: Fig. 12 er en graf, som viser resterende enzymaktivitet, efter at naturlig Arabidopsis thaliana type H GP og trippelmutant (Y40L+N136S+N631I) Arabidopsis 15 thaliana type H GP er inkuberet ved 58°C i 10 minutter, ved 60°C i 10 minutter eller ved 65°C i 2 minutter.

Fig. 13: Fig. 13 er et polyacrylamid-gelelektroforese-fotografi, som viser molekylvægten af naturlig kartoffel type L GP og syv slags GP’er med forbedret termostabilitet umiddelbart efter oprensning og efter lagring ved 4°C i 5 måneder. Bane 1 viser natur-20 lig kartoffel type L (vildtype) GP, bane 2 viser F39L GP, bane 3 viser N135S GP, bane 4 viser T706I GP, bane 5 viser F39L+N135S GP, bane 6 viser F39L+T706I GP, bane 7 viser N135S+T706I GP, og bane 8 viser F39L+N135S+T706I GP.

BEDSTE UDFØRELSESFORM FOR OPFINDELSEN 25 Den foreliggende opfindelse vil blive forklaret nedenfor. Det skal være klart, at ud tryk, der anvendes i denne beskrivelse, i hele beskrivelsen anvendes i de betydninger, der normalt anvendes på området, medmindre andet specifikt er angivet.

(1. a-glucanphosphorylase) 30 I den foreliggende beskrivelse anvendes ”a-glucanphosphorylase” og ”GP” i flæng, medmindre andet specifikt er angivet, og betegner et enzym med a-glucanphosphory-laseaktivitet. α-glucanphosphorylase klassificeres i EC2.4.1.1. a-glucanphosphoryla-seaktivitet henviser til aktiviteten af at katalysere en reaktion, der producerer glucose-1-phosphat og et partielt nedbrydningsprodukt af a-1,4-glucan ud fra uorganisk 35 phosphorsyre og a-1,4-glucan eller en omvendt reaktion deraf, a-glucanphosphorylase 20 DK 177092 B1 kaldes i nogle tilfælde phosphorylase, stivelsesphosphorylase, glycogenphosphorylase, maltodextrinphosphorylase og lignende, α-glucanphosphorylase kan også katalysere en a-1,4-glucansyntesereaktion, som er den omvendte reaktion af phosphorolyse. I hvilken retning en bestemt reaktion forløber, afhænger af mængden af et substrat. Ef-5 tersom mængden af uorganisk phosphorsyre er stor, forløber reaktionen af glucan-phosphorylase in vivo i retning af phosphorolyse. Når mængden af uorganisk phosphorsyre er lille, forløber reaktionen hen mod syntese af a-1,4-glucan.

Det ser ud til, at alle kendte α-glucanphosphorylaser har behov for pyridoxal-5’-phosphat til aktivering og deler en lignende katalytisk mekanisme. Selvom enzymer, 10 der har forskellig oprindelse, er forskellige med hensyn til substratpræference og form for regulering, tilhører alle α-glucanphosphorylaser en stor gruppe, der omfatter mange α-glucanphosphorylaser. Denne store gruppe omfatter glycogenphosphorylase der stammer fra bakterier, gær og dyr, stivelsesphosphorylase der stammer fra planter og maltodextrinphosphorylase der stammer fra bakterier.

15 Det er beskrevet, at et minimalt primermolekyle til en glucansyntesereaktion af a- glucanphosphorylase er maltotetraose. Det er også beskrevet, at et minimalt substrat, der er effektivt til en glucannedbrydningsreaktion, er maltopentaose. Det har generelt været antaget, at disse er træk, der er fælles for α-glucanphosphorylaser. I de senere år er det imidlertid beskrevet, at α-glucanphosphorylase stammende fra Thermus ther-20 mophilus og α-glucanphosphorylase stammende fra Thermococcus litoralis har forskellig substratspecificitet fra andre α-glucanphosphorylaser. Hvad angår disse a-glucan-phosphorylaser, er en minimal primer til glucansyntese maltotriose, og et minimalt substrat til glucannedbrydning er maltotetraose.

Det antages, at α-glucanphosphorylase er allestedsnærværende i forskellige plan-25 ter, dyr og bakterier, som kan oplagre stivelse eller glycogen.

Eksempler på en plante, som producerer α-glucanphosphorylase, omfatter rod- og rodknoldeafgrøder såsom kartofler (også betegnet irsk kartoffel), søde kartofler, yams, taro og kassava; grønsager såsom kål og spinat; kornafgrøder såsom majs, ris, hvede, byg, rug og kolbehirse; bønner såsom favabønner, ærter, sojabønner, adzukibønner og 30 brogede havebønner; forsøgsplanter såsom Arabidopsis thaliana; Citrus hybrid kultivar, alger og lignende.

En organisme, der producerer α-glucanphosphorylase, er ikke begrænset til ovenstående eksempler.

Det foretrækkes, at en første α-glucanphosphorylase, som anvendes i fremgangs-35 måden ifølge den foreliggende opfindelse, er en naturlig α-glucanphosphorylase og- 21 DK 177092 B1 stammer fra en plante. Generelt har naturlig α-glucanphosphorylase, der stammer fra en plante, evnen til at syntetisere amylose med høj molekylvægt. Disse a-glucanphos-phorylasers termostabilitet er imidlertid lav. Af denne årsag kan de ikke katalysere reaktioner ved høje temperaturer (fx ca. 60°C eller højere). Når en reaktion udføres ved 5 fra ca. 30°C til ca. 40°C, som er den optimale reaktionstemperatur for GP fra planter (fx kartoffel), opstår der af denne årsag et problem med kontaminering med forskellige mikrober eller ældning af glucanen, og glucan eller G-1-P kan ikke produceres effektivt.

α-glucanphosphorylaser fra planter klassificeres i type L og type H, afhængigt af deres affinitet for glycogen. Type L α-glucanphosphorylase henviser til a-glucanphos-10 phorylaser, som har lav affinitet for glycogen. Type L a-glucanphosphorylaser foretrækker generelt maltodextrin, amylase og amylopectin frem for glycogen som substrat (Hiroyuki Mori, et al., "A Chimeric α-Glucan phosphorylase of Plant Type L and H Isozymes", The Journal of Biological Chemistry, 1993, vol.268, No.8, pp.5574-5581).

Type H α-glucanphosphorylase henviser til α-glucanphosphorylaser med høj affinitet 15 for glycogen. Generelt har type H α-glucanphosphorylaser ekstremt høj affinitet for forskellige glucaner, herunder glycogen.

Ifølge Toshio Fukui, et al., Biochemistry of Vitamin B6, 1987, pp.267-276, er Km (Michaelis-konstant) for kartoffelblad type L α-glucanphosphorylase for glycogen fx 1,4 x 10'3(M), mens Km for kartoffelblad type H α-glucanphosphorylase for produktion af 20 glycogen er 4 x 10'6(M). Desuden er Km for en hovedbestanddel af kartoffelrodknold a-glucanphosphorylase for produktion af glycogen 2,4 x 10'3(M), og denne klassificeres som type L. Km af en mindre bestanddel af α-glucanphosphorylase for produktion af glycogen er 1 x 10'6(M), og denne klassificeres som type H.

Som det er kendt på området, er Michaelis-konstanten én af de kinetiske parame-25 tre, som bestemmes ud fra afhængigheden af en indledende hastighed i en enzymatisk reaktion af substratkoncentration. Michaelis-konstanten er substratkoncentrationen på ettidspunkt, hvor den indledende hastighed bliver 1/2 af den maksimale hastighed,

Vmax. Michaelis-konstanten har koncentrationsenhederne. Michaelis-konstanten er særegen for et enzym under et specifikt sæt af målebetingelser. Denne konstant er et mål, 30 der viser et enzyms affinitet for et substrat. Efterhånden som Michaelis-konstanten bliver mindre, bliver affiniteten for et substrat større.

Type L α-glucanphosphorylase og type H α-glucanphosphorylase har fx følgende forskel i egenskaber.

22 DK 177092 B1 (Tabel 2)___

TypeLGP _Type H GP_

Krydsreaktivitet af antistof over for en hovedbestand- Tilstedeværelse Fravær del af kartoffelrodknold GP___

Krydsreaktivitet af antistof

Fravær Tilstedeværelse standdel af kartoffelrod- knold GP___ Følsomhed over for prote- l^av olyse_____

Lokalisering Plastid (amyloplast eller Cvtosol __chloroplast)____ I en særlig udførelsesform er det endvidere foretrukket, at en a-glucanphosphoryla-se, som anvendes i fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse, er en type L 5 α-glucanphosphorylase. Kartoffel type L a-glucanphosphorylase er længere end kartoffel type H glucanphosphorylase og omfatter en aminosyresekvens på 78 rester, som ikke ses i type H og er indsat i en central region af polypeptidkæden. Af denne årsag er molekylvægten af en underenhed af kartoffelblad type L α-glucanphosphorylase fx ca.

104.000 Da, og molekylvægten afen underenhed af kartoffelblad type H a-glucanphos-10 phorylase er ca. 94.000 Da. Molekylvægten af en underenhed af en hovedbestanddel af kartoffelrodknold α-glucanphosphorylase er ca. 104.000 Da, og molekylvægten af en underenhed af en mindre bestanddel af kartoffelrodknold α-glucanphosphorylase er ca.

94.000 Da. Om en bestemt α-glucanphosphorylase er type L eller type H, kan bestemmes ved tilstedeværelsen af en region, der er homolog med denne amino- 15 syresekvens på 78 rester, uden faktisk at måle affinitet.

Type L og type H bestemmes generelt ved en omfattende gennemgang afen række egenskaber såsom enzymaktivitet, molekylvægt, substratspecificitet, lokalisering af enzym, homologi af en primær sekvens og tilstedeværelsen af en indsat sekvens. Derfor er grænsen mellem type L og type H generelt ikke klar i nogle tilfælde, men af be-20 kvemmelighedshensyn i forbindelse med den foreliggende opfindelse kan det bestemmes, om α-glucanphosphorylase er type L eller type H, ved tilstedeværelsen af et overgangspeptid i en α-glucanphosphorylase. Karakteristika for en overgangspeptidsekvens er kendte på området. Sekvenser, som koder for et overgangspeptid, er type L, og sekvenser, som ikke koder for et overgangspeptid, er type H.

25 Eksempler på planter, som producerer type L α-glucanphosphorylase, omfatter kartofler (også betegnet irske kartofler), søde kartofler, favabønner, Arabidopsis thalia-na, spinat, majs og ris.

23 DK 177092 B1 I en anden udførelsesform er en første (naturlig) α-glucanphosphorylase, som anvendes i fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse, fortrinsvis en type Η a-glucanphosphorylase. Eksempler på planter, som producerer type H a-glucanphospho-rylase, omfatter kartofler, hvede, Citrus hybrid kultivar, ris, favabønner, Arabidopsis 5 thaliana og søde kartofler.

cDNA-sekvensen af en naturlig type L α-glucanphosphorylase stammende fra kartoffel er vist i SEQ ID NO: 1, og den deraf kodede aminosyresekvens er angivet i position 1 til position 916 af SEQ ID NO: 2.

cDNA-sekvensen af en naturlig type L α-glucanphosphorylase stammende fra sød 10 kartoffel er vist i SEQ ID NO: 3, og den deraf kodede aminosyresekvens er angivet i position 1 til position 912 af SEQ ID NO: 4.

cDNA-sekvensen af en anden naturlig type L α-glucanphosphorylase stammende fra kartoffel er vist i SEQ ID NO: 5, og den deraf kodede aminosyresekvens er angivet i position 1 til position 893 af SEQ ID NO: 6.

15 En cDNA-sekvens af en naturlig type L α-glucanphosphorylase stammende fra favabønne er vist i SEQ ID NO: 7, og den deraf kodede aminosyresekvens er angivet i position 1 til position 939 af SEQ ID NO: 8.

cDNA-sekvensen af en naturlig type L α-glucanphosphorylase stammende fra Arabidopsis thaliana er vist i SEQ ID NO: 9, og den deraf kodede aminosyresekvens er 20 angivet i position 1 til position 962 af SEQ ID NO: 10.

cDNA-sekvensen af en naturlig type L α-glucanphosphorylase stammende fra spinat er vist i SEQ ID NO: 11, og den deraf kodede aminosyresekvens er angivet i position 1 til position 971 af SEQ ID NO: 12.

cDNA-sekvensen af en naturlig type L α-glucanphosphorylase stammende fra 25 majs er vist i SEQ ID NO: 13, og den deraf kodede aminosyresekvens er angivet i position 1 til position 983 af SEQ ID NO: 14.

cDNA-sekvensen af en naturlig type L α-glucanphosphorylase stammende fra ris er vist i SEQ ID NO: 15, og den deraf kodede aminosyresekvens er angivet i position 1 til position 928 af SEQ ID NO: 16.

30 cDNA-sekvensen af en anden naturlig type L α-glucanphosphorylase stammende fra ris er vist i SEQ ID NO: 17, og den deraf kodede aminosyresekvens er angivet i position 1 til position 951 af SEQ ID NO: 18.

cDNA-sekvensen af en naturlig type H α-glucanphosphorylase stammende fra hvede er vist i SEQ ID NO: 19, og den deraf kodede aminosyresekvens er angivet i 35 position 1 til position 832 af SEQ ID NO: 20.

24 DK 177092 B1 cDNA-sekvensen af en naturlig type H α-glucanphosphorylase stammende fra en Citrus hybrid kultivar er vist i SEQ ID NO: 21, og den deraf kodede aminosyresekvens er angivet i position 1 til position 840 af SEQ ID NO: 22.

cDNA-sekvensen af en naturlig type H α-glucanphosphorylase stammer fra ris er 5 vist i SEQ ID NO: 23, og den deraf kodede aminosyresekvens er angivet i position 1 til position 841 af SEQ ID NO: 24.

cDNA-sekvensen af en naturlig type H α-glucanphosphorylase stammende fra fa-vabønne er vist i SEQ ID NO: 25, og den deraf kodede aminosyresekvens er angivet i position 1 til position 842 af SEQ ID NO: 26.

10 cDNA-sekvensen af en naturlig type H α-glucanphosphorylase stammende fra Ara- bidopsis thaliana er vist i SEQ ID NO: 27, og den deraf kodede aminosyresekvens er angivet i position 1 til position 841 af SEQ ID NO: 28.

cDNA-sekvensen af en naturlig type H α-glucanphosphorylase stammende fra kartoffel er vist i SEQ ID NO: 29, og den deraf kodede aminosyresekvens er angivet i posi-15 tion 1 til position 838 af SEQ ID NO: 30.

Den partielle sekvens af et cDNA fra en naturlig type H a-glucanphosphorylase stammende fra sød kartoffel er vist i SEQ ID NO: 31, og den deraf kodede aminosyresekvens er angivet i SEQ ID NO: 32. En komplet sekvens af naturlig type Η a-glucanphosphorylase afstammende fra sød kartoffel kan opnåsved konventionelle 20 fremgangsmåder under anvendelse af denne partielle sekvens.

En første (naturlig) α-glucanphosphorylase, som anvendes i fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse, er fortrinsvis fra en plante og er fortrinsvis fra kartoffel, sød kartoffel, favabønne, Arabidopsis thaliana, spinat, majs, ris, hvede eller en Citrus hybrid kultivar, er mere foretrukket fra kartoffel, sød kartoffel, favabønne, Arabidopsis 25 thaliana, spinat, majs eller ris og er mest foretrukket fra kartoffel. Det foretrækkes, at den første (naturlige) α-glucanphosphorylase, som anvendes i fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse, er en type L α-glucanphosphorylase. Den første (naturlige) α-glucanphosphorylase, som anvendes i fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse, er fortrinsvis en α-glucanphosphorylase af type L, L2 eller H fra kartoffel, 30 type L eller H fra sød kartoffel, type L eller H fra favabønne, type L eller H fra Arabidopsis thaliana, type L fra spinat, type L fra majs, type L eller H fra ris, type H fra hvede eller type H fra en Citrus hybrid kultivar, er mere foretrukket α-glucanphosphorylase af type L eller L2 fra kartoffel, type L fra sød kartoffel, type L fra favabønne, type L fra Arabidopsis thaliana, type L fra spinat, type L fra majs eller type L fra ris og er mest 35 foretrukket α-glucanphosphorylase af type L fra kartoffel.

25 DK 177092 B1 I den foreliggende beskrivelse betyder et enzym ’’stammende fra” en organisme ikke blot, at enzymet er isoleret direkte fra organismen, men betegner også et enzym, der er opnået under anvendelse af organismen i en hvilken som helst form. Når et gen, der koder for et enzym, som opnås fra en organisme, fx indføres i Escherichia coli, og 5 det udtrykte enzym derefter isoleres fra Escherichia coli, henvises der til enzymet som værende ’’stammende fra” organismen.

Et gen, som koder for kartoffel type L GP, kan fx fremstilles ved følgende procedure.

Som beskrevet af Takaha et al. (Journal of Biological Chemistry, Vol.268, pp. 1391-10 1396, 1993) fremstilles der først et mRNA ud fra en kartoffelrodknold under anvendelse af velkendte fremgangsmåder, og et cDNA-bibliotek fremstilles under anvendelse af et kommercielt tilgængeligt kit og lignende.

Baseret på den kendte GP-gensekvens (database GenBank accessionsnummer D00520) fremstilles der derefter PCR-primere, og PCR udføres under anvendelse af 15 det ovenfor nævnte cDNA-bibliotek som template. Fx når: PCR-primer 1: 5’AAAT CG AT AGG AGG AAAAC AT AT G ACC TTG AGT GAG AAA AT 3’ (SEQ ID NO: 38) og PCR-primer 2: 5’ G AAGGT ACCTTTT C ATT C ACTT CCCCCTC3’ (SEQ ID NO: 39) 20 anvendes som PCR-primere, kan et gen amplificeres under følgende betingelser.

Der udføres 30 cykler af en PCR-reaktion, idet én cyklus er 30 sekunder ved 94°C, 1 minut ved 50°C og 3 minutter ved 72°C.

Den understregede del af PCR-primer 1 svarer til en strukturel gensekvens ved den N-terminale region af et type L GP modent protein, og den understregede del af PCR-25 primer 2 svarer til basesekvensen umiddelbart efter termineringskodonen af et type L GP-strukturgen.

Alternativt kan et GP-gen også fremstilles direkte ved kemisk syntese baseret på den kendte GP-gensekvensinformation uden fremstilling af et cDNA-bibliotek. En fremgangsmåde til syntese af et gen er fx beskrevet i Te’o, et al. (FEMS Microbiological 30 Letters, vol. 190, pp. 13-19, 2000).

Det resulterende GP-gen kan indsættes i en egnet vektor ved fremgangsmåder, som er velkendte for fagmanden på området. Som vektor for Escherichia coli kan der fx anvendes pMW118 (fremstillet af Nippon Gene Co., Ltd.), pUC18 (fremstillet af TAKARA BIO), pKK233-2 (fremstillet af Amersham-Pharmacia-Biotech), pET3d (fremstillet af 35 STRATAGENE) og lignende, og som vektor for Bacillus subtilis kan der anvendes 26 DK 177092 B1 pUB110 (som kan fremskaffes fra American Type Culture Collection) og pHY300PLK (fremstillet af TAKARABIO) og lignende.

Når et gen amplificeres under anvendelse af PCR-primerne 1 og 2, kan der fx selekteres et plasmid, der har en sekvens som vist i fig. 2, ved at indsætte det amplifice-5 rede gen i plasmidet pMW118, som på forhånd er skåret med Smal. Dette anvendes til fx at transformere Escherichia coli TG-1, en ampicillinresistent stamme selekteres derefter, og den resulterende rekombinant plasmid-holdige stamme dyrkes, og ved at ekstrahere et plasmid kan der derved opnås et GP-gen.

10 (2. Forbedring af a-glucanphosphorylases termostabilitet)

En fremgangsmåde ifølge den foreliggende opfindelse omfatter, at et første nukle-insyremolekyle, der omfatter en basesekvens, som koder for en første a-glucanphos-phorylase, modificeres for at opnå et andet nukleinsyremolekyle indeholdende en modificeret basesekvens; der fremstilles en ekspressionsvektor omfattende det andet nu-15 kleinsyremolekyle; ekspressionsvektoren indføres i en celle for at udtrykke en a- glucanphosphorylase med forbedret termostabilitet; og den udtrykte a-glucanphospho-rylase med forbedret termostabilitet opsamles.

(2.1 Isolering af et nukleinsyremolekyle, der omfatter en basesekvens, som koder for 20 en første (naturlig) a-glucanphosphorylase)

Et nukleinsyremolekyle, der omfatter en basesekvens, som koder for a-glucanphosphorylase med forbedret termostabilitet ifølge den foreliggende opfindelse, er også inden for rammerne af den foreliggende opfindelse. Et sådant nukleinsyremolekyle kan opnås under anvendelse af fremgangsmåder, som er kendte på området, baseret på 25 beskrivelsen i den foreliggende ansøgning.

Et nukleinsyremolekyle, der omfatter en basesekvens, som koder for naturlig a-glucanphosphorylase, kan isoleres direkte fra en plante, der producerer en naturligt forekommende α-glucanphosphorylase som beskrevet ovenfor.

Først isoleres naturlig α-glucanphosphorylase fx fra kartoffel, Arabidopsis thaliana, 30 spinat eller lignende. For at eksemplificere en procedure for kartoffel a-glucanphosphorylase skrælles først 1,4 kg kommercielt tilgængelige kartoffelrodknolde. Rodknolden, hvorfra skrællen er fjernet, moses i en saftpresse for at opnå en flydende mos. Denne flydende mos filtreres derefter med et filter for at opnå et filtrat. Til filtratet tilsættes en Tris-buffer (pH 7,0) til en slutkoncentration på 100 mM for at opnå en enzymopløsning.

35 Denne enzymopløsning opvarmes yderligere i et vandbad ved 55°C i yderligere 10 27 DK 177092 B1 minutter, hvorefter væsketemperaturen når50°C. Efter opvarmning centrifugeres denne enzymopløsning ved 8.500 omdr./minut i 20 minutter under anvendelse afen centrifuge (AVANTI J-25I fremstillet af BECKMANN) for at fjerne uopløselige proteiner og derved opnå en supernatant.

5 Ammoniumsulfat tilsættes til supernantanten til en slutkoncentration på 100 g/l, og dette lades henstå ved 4°C i 2 timer for at præcipitere proteiner. Derefter anvendes en centrifuge (AVANTI J-25I fremstillet af BECKMANN) til at centrifugere opløsningen ved 8.500 omdr./minut i 20 minutter for at fjerne uopløselige proteiner. Endvidere tilsættes ammoniumsulfat til den resulterende supernatant til en slutkoncentration på 250 g/l, og 10 dette lades henstå ved 4°C i 2 timer for at præcipitere proteiner. Derefter anvendes en centrifuge (AVANTI J-25I fremstillet af BECKMANN) til at centrifugere opløsningen ved 8.500 omdr./minut i 20 minutter for at opsamle uopløselige proteiner.

De opsamlede uopløselige proteiner suspenderes i 150 ml 25 mM Tris-buffer (pH 7,0). Den suspenderede enzymopløsning dialyseres natten over mod den samme buf-15 fer. Prøven efter dialyse adsorberes over på en anionbytterharpiks Q-Sepharose (fremstillet af Pharmacia), som er blevet præ-ækvilibreret, og vaskes derefter med en buffer indeholdende 200 mM natriumchlorid. Derefter elueres proteinerne med en buffer indeholdende 400 mM natriumchlorid, og eluatet opsamles for at opnå en delvist oprenset kartoffelrodknold glucanphosphorylaseholdig opløsning.

20 Afhængigt af den fremskaffede kartoffel kan en α-glucanphosphorylaseholdig op løsning, der er opnået på dette trin, anvendes til trypsinbehandling, men yderligere oprensning er nødvendig i nogle tilfælde. I sådanne tilfælde kan den oprensede kartoffel-α-glucanphosphorylaseholdige opløsning om nødvendigt opnås ved at kombinere en fraktion fra gelfiltreringskromatografi, hvor der fx anvendes Sephacryl S-200HR (frem-25 stillet af Pharmacia), og en fraktion fra hydrofob kromatografi, hvor der fx anvendes

Phenyl-TOYOPEARL650M (fremstillet af Tosoh Corporation). Oprensning af a-glucan-phosphorylase fra andre plantearter kan udføres på lignende måde.

Den således opnåede oprensede a-glucanphosphorylase behandles med trypsin, det resulterende trypsinbehandlede fragment separeres ved HPLC, og amino-30 syresekvensen af N-terminalen af hvert af de separerede peptidfragmenter bestemmes under anvendelse af et peptidsekventeringsapparat. Under anvendelse af syntetiske oligonukleotidprober, der er fremstillet på basis af den identificerede amino-syresekvens, screenes derefter et egnet genombibliotek eller et cDNA-bibliotek, hvorved der kan opnås et nukleinsyremolekyle (også betegnet som et gen), der omfatter en 35 basesekvens, som koder for naturlig α-glucanphosphorylase. Fundamentale strategier 28 DK 177092 B1 til fremstilling af oligonukleotidprober og et DNA-bibliotek og screening af dem ved hy-bridisering af nukleinsyrer er velkendte for fagmanden på området. Se fx Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1989); DNA Cloning, vol. I og II (redigeret af D. N. Glover, 1985); Oligonucleotide Synthesis (redigeret af M. J. Gait, 1984); Nuc-5 leic Acid Hybridization (redigeret af B. D. Hames & S. J. Higgins, 1984).

Baseret på homologi med en basesekvens af visse a-glucanphosphorylaser, for hvilke en basesekvens, der koder for a-glucanphosphorylase er kendt, screenes fx alternativt et cDNA-bibliotek eller et genombibliotek ved hybridisering under anvendelse af nukleinsyreprober, der indeholder mindst en del af denne basesekvens, hvorved 10 der kan opnås et nukleinsyremolekyle, som indeholder basesekvensen afen anden type α-glucanphosphorylase. Sådanne fremgangsmåder er kendte inden for området.

Alternativt fremstilles degenererede primere svarende til en region, som er konserveret i aminosyresekvensen af forskellige α-glucanphosphorylaser, og der udføres PCR under anvendelse af fx et cDNA-bibliotek eller et genombibliotek fra en ønsket art 15 som template, og der kan opnås en basesekvens af α-glucanphosphorylase stammende fra arten. Sådanne fremgangsmåder er kendte på området.

Når et genombibliotek eller et cDNA-bibliotek screenes, kan det resulterende nukleinsyremolekyle subklones under anvendelse af fremgangsmåder, der er velkendte for fagmanden på området. Ved at blande λ-fag indeholdende et ønsket gen, egnet Esche-20 richia coli og egnet hjælperfag kan der fx let opnås et plasmid indeholdende et ønsket gen. Ved at transformere egnet Escherichia coli under anvendelse af en opløsning indeholdende et plasmid kan et ønsket gen derefter subklones. Ved at dyrke de resulterende transformanter kan der opnås et plasmid-DNA, fx ved en alkalisk SDS-metode, og basesekvensen af et ønsket gen kan bestemmes. En fremgangsmåde til bestem-25 melse af en basesekvens er velkendt for fagmanden på området. Under anvendelse af PCR-primere, som er syntetiseret på basis af en basesekvens af et DNA-fragment, og under anvendelse af en polymerasekædereaktion (PCR), hvor det genomiske DNA eller cDNA’et fra kartoffel anvendes som template, kan et a-glucanphosphorylasegen endvidere amplificeres direkte.

30 I den foreliggende beskrivelse kan "nukleinsyremolekylet” bestå af kun naturlige nukleotider, kan indeholde ikke-naturlige nukleotider eller kan bestå af kun ikke-naturlige nukleotider. Eksempler på et ikke-naturligt nukleotid omfatter derivatiserede nukleotider (også betegnet som nukleotidanaloger). Det ’’derivatiserede nukleotid” og "nukleotidanalogen” henviser til de nukleotider, som er forskellige fra naturligt fore-35 kommende nukleotider, men har en lignende funktion som det oprindelige nukleotid.

29 DK 177092 B1 Sådanne derivatiserede nukleotider og nukleotidanaloger er velkendte på området.

Eksempler på sådanne derivatiserede nukleotider og nukleotidanaloger omfatter, men er ikke begrænset til, phosphorthioat, phosphoramidat, methylphosphonat, chiralt methylphosphonat, 2-O-methylribonukleotid og peptid-nukleinsyre (PNA).

5 (2.2 Modifikation af det første nukleinsyremolekyle, der omfatter en basesekvens, som koder for en første a-glucanphosphorylase)

Et første nukleinsyremolekyle, der omfatter en basesekvens, som koder for en første α-glucanphosphorylase, modificeres for at opnå en anden nukleinsyre, der indehol-10 der en modificeret basesekvens. Et første nukleinsyremolekyle kan være et nukleinsyremolekyle, der har en basesekvens, som koder for en naturlig a-glucanphosphorylase, og som er opnået som ovenfor (2.1). Det første nukleinsyremolekyle kan også være et nukleinsyremolekyle, der omfatter en basesekvens, som koder for a-glucanphosphorylase, som har i det væsentlige den samme enzymaktivitet som enzymaktiviteten af na-15 turlig α-glucanphosphorylase, og hvori 1 eller nogle få eller flere aminosyrer er substitueret, deleteret eller tilføjet til en basesekvens, som koder for naturlig a-glucanphos-phorylase. "Har i det væsentlige den samme enzymaktivitet” henviser til, at enzymaktiviteten, når α-glucanphosphorylase efter modifikation måles under de samme betingelser som α-glucanphosphorylase før modifikation, er inden for ±20%, fortrinsvis inden 20 for ±10%, mere foretrukket inden for ±5% af enzymaktiviteten af a-glucanphosphorylase før modifikation.

Modifikation kan foretages ved at udføre site-directed mutagenese, mutagenese under anvendelse af et mutagen (behandling af et omhandlet gen med et mutagent middel såsom nitrit, ultraviolet strålebehandling) eller "error prone” PCR. Det foretræk-25 kes at anvende site-directed mutagenese ud fra det synspunkt, at den ønskede mutation let opnås, fordi den ønskede mutation kan indføres i et ønsket sted, når der anvendes site-directed mutagenese. Alternativt kan et nukleinsyremolekyle med en ønsket sekvens syntetiseres direkte. Sådanne kemiske syntesefremgangsmåder er velkendte på området.

30 Nærværende opfindere fandt, at ved at substituere en aminosyrerest i en bestemt position i aminosyresekvensen af en naturlig α-glucanphosphorylase stammende fra en plante med en anden aminosyrerest forbedres den resulterende a-glucanphospho-rylases termostabilitet. En sådan bestemt position kan bestemmes ved at aligne en hvilken som helst af følgende motivsekvenser eller aminosyresekvensen i SEQ ID NO: 35 2 og foretage en sammenligning af den ønskede aminosyresekvens: 30 DK 177092 B1 motivsekvens 1L: H-A-E-F-T-P-V-F-S (SEQ ID NO: 44) eller en motivsekvens 1H: H-A-Q-Y-S-P-H-F-S (SEQ ID NO: 45), motivsekvens 2: A-L-G-N-G-G-L-G (SEW ID NO: 46) og motivsekvens 3L: R-l-V-K-F-l-T-D-V (SEQ ID NO: 47) eller motivsekvens 3H: R-l-V-5 K-L-V-N-D-V (SEQ ID NO: 48).

Motivsekvenserne 1L, 2 og 3L findes i aminosyresekvensen (SEQ ID NO: 2) af kartoffel type L α-glucanphosphorylase. Disse motivsekvenser er til stede i følgende positioner i kartoffel type L α-glucanphosphorylase: motivsekvens 1L: position 36 til position 44 af den i SEQ ID NO: 2 viste aminosyresekvens; motivsekvens 2: position 132 til 10 position 139 af den i SEQ ID NO: 2 viste aminosyresekvens; motivsekvens 3L: position 700 til position 708 af den i SEQ ID NO: 2 viste aminosyresekvens. Motivsekvenserne 1H, 2 og 3H findes i aminosyresekvensen af ris type H α-glucanphosphorylase. Disse motivsekvenser er til stede i følgende positioner i ris type H a-glucanphosphorylase: motivsekvens 1H: position 36 til position 44 af den i SEQ ID NO: 24 viste amino-15 syresekvens; motivsekvens 2: position 132 til position 139 af den i SEQ ID NO: 24 viste aminosyresekvens; motivsekvens 3H: position 625 til position 633 af den i SEQ ID NO: 24 viste aminosyresekvens. Naturlig α-glucanphosphorylase har generelt disse motivsekvenser eller sekvenser med høj homologi med dem. Positionen af disse motivsekvenser i andre plante α-glucanphosphorylaser kan let bestemmes af fagmanden på 20 området.

Ved fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse modificeres et nukleinsy-remolekyle, der omfatter en basesekvens, som koder for en første a-glucanphosphory-lase, således at der opnås α-glucanphosphorylase med forbedret termostabilitet, der kodes af et modificeret nukleinsyremolekyle, som har en aminosyrerest, der er forskel-25 lige fra en aminosyrerest af den naturlige α-glucanphosphorylase i mindst én position valgt fra gruppen bestående af: en position svarende til phenylalanin i position 342 (F39); en position svarende til asparagin i position 135 (N135); og en position svarende til threonin i position 706 (T706) af en aminosyresekvens med SEQ ID NO: 2. Et nukleinsyremolekyle, der omfatter en basesekvens, som koder for den første a-glucanphos-30 phorylase, modificeres fortrinsvis således, at en aminosyresekvens i en position svarende til phenylalanin i position 309 (F39) eller en position svarende til threonin i position 706 (T706) af en aminosyresekvens som vist i SEQ ID NO: 2 af a-glucanphosphorylase med forbedret termostabilitet, som kodes af et modificeret nukleinsyremolekyle, er forskellig fra den for den naturlige a-glucanphosphorylase.

31 DK 177092 B1

Som det anvendes i den foreliggende beskrivelse, betegner ’’positionen svarende til phenylalanin i position 39 (P39) af en aminosyresekvens i SEQ ID NO: 2” en position, som er alignet med phenylalanin i position 39 som vist i SEQ ID NO: 2, når en ønsket aminosyresekvens og en aminosyresekvens i SEQ ID NO: 2 alignes, således at homo-5 logi mellem de to sekvenser er højest, om nødvendigt ved at indsætte et gap i én af sekvenserne. Når der indføres et gap i SEQ ID NO: 2, tælles gappet ikke med, når antallet af aminosyrerester beregnes. Ovenstående udtryk henviser mere foretrukket til en position, som er alignet med phenylalanin i position 39 i SEQ ID NO: 2, når en aminosyresekvens i SEQ ID NO: 2 og en ønsket aminosyresekvens alignes under betingel-10 ser med gap penalty (peptid): insert=-10, forlængelse=-3, gap forlængelse på topposition: setted (checked), Match Mode: Local Match under anvendelse af en scoretabel for default i multipel alignment af GENETYX-WIN Ver. 4.0. En scoretabel for default med hensyn til en aminosyre er vist i følgende tabel 3.

15 (Tabel 3) C 12, S 0, 2, T -2, 1. 3, P -3. 1, 0. 6.

A -2, 1, 1, 1, 2, G -3. 1, 0,-1, 1. 5, N -4, 1, 0,-1, 0, 0, 2, D -5, 0, 0,-1, 0. 1, 2. 4, E -5, 0, 0,-1. 0, 0. 1. 3, 4, Q -5,-1,-1, 0, 0,-1, 1, 2, 2, 4, U -3,-1,-1, 0.-1,-2, 2, 1, 1, 3. 6.

R -4, 0.-1, 0,-2,-3, 0,-1,-1, 1. 2, 6, K -5, 0. 0,-1.-1,-2. 1. 0, 0, 1. 0, 3, 5, M -5,-2,-1.-2,-1,-3,-2,-3,-2,-1,-2, 0, 0, 6.

I -2.-1, 0,-2,-1,-3,-2,-2,-2,-2,-2,-2,-2, 2, 5, L -6,-3,-2,-3,-2.-4,-3,-4,-3,-2,-2,-3,-3, 4, 2, 6, V -2,-1, 0,-1. 0,-1. -2, -2, -2, -2, -2, -2, -2, 2, 4, 2, 4, p -4,-3,-3,-5,-4,-5,-4,-6,-5,-5,-2.-4,-5, 0, 1. 2,-1, 9, Y 0,-3,-3,-5.-3.-5,-2,-4,-4,-4, 0,-4,-4,-2,-1,-1,-2, 7,10, VI -S,-2,-5,-6,-6,-7,-4,-7,-7,-5,-3, 2,-3,-4,-5,-2,-6, 0, 0,17, B -4, 0, 0,-1. 0, 0, 2, 3, 2. 1. 1,-1, 1,-2,-2,-3,-2,-5,-3,-5. 2, Z -5, 0,-1, 0, 0,-1. 1, 3, 3, 3, 2, 0, 0,-2,-2,-3.-2,-5,-4,-6. 2, 3, X 0, 0, 0. 0, 0. o, o, o, o, o, o, o, o, o, o, o, 0, 0, 0, 0. o, o, o

c’sTPAGNDEQHRKMILVFYWBZX

Den multiple alignment af GENETYX-WIN Ver. 4.0 er baseret på følgende algoritme. I dette alignment-program er alle mulige par af sekvenser alignet, to sekvensalign- 32 DK 177092 B1 ments udføres som en round robin (parvis alignment), og heriblandt bestemmes sekvenser af en kombination med et højt konserveringsforhold (score i parvis alignment) som fælles sekvenser, en hypotetisk sekvens produceres ud fra fælles sekvenser (en fælles del forbliver, som den er, og med hensyn til ikke-fælles dele selekteres en hvil-5 ken som helst af sekvenserne). En round robin mellem alle sekvenser undtagen den sekvens, der udgør den hypotetiske sekvens, og en hypotetisk sekvens genereres ved den samme procedure, indtil den endelige hypotetiske sekvens er produceret. Derefter anvendes information om insertion og skift af GAP anvendt til at producere den hypotetiske sekvens på den oprindelige sekvens for at udgøre et hele, og den multiple align-10 ment er komplet. En beregningsligning for denne parvise alignment er som følger.

Når sekvenser a og b, der hver har en sekvenslængde på m eller n, og respektive sekvenser udtrykkes som: a=a1 a2 a3 ... am b=b1 b2 b3 ... bm, 15 vises en GAP penalty g med følgende ligning: -g=s(ai,<p)=a(cp,bj).

En ligning til opnåelse af en alignmentscore er som følger: G(0,0)=0 G(i,0)=i(-g) 20 G(0,j)=j(-g) -gk=-[oc+p (k-1)] E(i,j)={G(i-1,j)-a,E(i-1,j)- β} F(i,j)=max{G(i,j-1)- a,F(i,j-1)- β} G(i,j)=max{E(i,j),G(i-1,j-1)+s(ai,bj),F(i,j)} 25 α er GAP-insertions-penalty, og β er GAP-forlængelses-penalty. E, F og G er en scorematrix, og på basis af denne produceres en pass-matrix.

En position svarende til asparagin i position 135 (N135) og en position svarende til threonin i position 706 (T706) konstrueres på lignende måde.

I multiple alignments af GENETYX-WIN Ver. 4.0 under de ovenfor nævnte bet-30 ingelser blev SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID

NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28 og SEQ ID NO: 30 alignet med SEQ ID NO: 2. Som et resultat heraf blev phenylalanin eller tyrosin alignet i en position svarende til phenylalanin i position 39 (F39) af den i SEQ ID NO: 2 viste ami-35 nosyresekvens, asparagin blev alignet i en position svarende til asparagin i position 33 DK 177092 B1 135 (N135) af aminosyresekvensen i SEQ ID NO: 2, og threonin, asparagin eller aspa-raginsyre blev alignet i en position svarende til threonin i position 706 (T706) af den i SEQ ID NO: 2 viste aminosyresekvens. Resultater af denne alignment er vist i fig. 1A til fig. 11. I fig. 1A til fig. 11 betegner "kartoffel type L” aminosyresekvensen (SEQ ID NO: 5 2) af en kartoffel type L α-glucanphosphorylase. "Kartoffel type L2” betegner amino syresekvensen (SEQ ID NO: 6) af en kartoffel anden type L a-glucanphosphorylase.

"Sød kartoffel type L” betegner aminosyresekvensen (SEQ ID NO: 4) af en sød kartoffel type L α-glucanphosphorylase. "Favabønne type L" betegner aminosyresekvensen (SEQ ID NO: 8) af en favabønne type L α-glucanphosphorylase. ’’Arabidopsis thaliana 10 type L” betegner aminosyresekvensen (SEQ ID NO: 10) af Arabidopsis thaliana type L α-glucanphosphorylase. "Spinat” betegner aminosyresekvensen (SEQ ID NO: 12) af en spinat type L α-glucanphosphorylase. "Ris type L” betegner aminosyresekvensen (SEQ ID NO: 16) af en ris type L α-glucanphosphorylase. ”Ris type L2” betegner aminosyresekvensen (SEQ ID NO: 18) afen ris anden type L α-glucanphosphorylase. "Majs 15 type L” betegner aminosyresekvensen (SEQ ID NO: 14) af en majs type L a-glucan-phosphorylase. ’’Kartoffel type H” betegner aminosyresekvensen (SEQ ID NO: 30) af en kartoffel type H α-glucanphosphorylase. ’’Favabønne type H” betegner aminosyresekvensen (SEQ ID NO: 26) afen favabønne type H a-glucanphosphorylase.

"Arabidopsis thaliana type H” betegner aminosyresekvensen (SEQ ID NO: 28) af en 20 Arabidopsis thaliana type H α-glucanphosphorylase. ”Ris type H” betegner aminosyresekvensen (SEQ ID NO: 24) afen ris type H α-glucanphosphorylase. ’’Hvede” betegner aminosyresekvensen (SEQ ID NO: 20) af en hvede type H a-glucanphosphory-lase. "Citrus type H” betegner aminosyresekvensen (SEQ ID NO: 22) af en Citrus hybrid kultivartype H α-glucanphosphorylase. ”E. coli MalQ” betegner amino-25 syresekvensen (SEQ ID NO: 35) af en Escherichia coli maltodextrinphosphorylase.

Maltodextrinphosphorylase er én type a-glucanphosphorylase.

I sød kartoffel type L α-glucanphosphorylase er en position svarende til phenylala-nin i position 39 (F39) af en aminosyresekvens i SEQ ID NO: 2 fx position 39 af en aminosyresekvens i SEQ ID NO: 4, en position svarende til asparagin i position 135 30 (N135) af den i SEQ ID NO: 2 viste aminosyresekvens er position 135 af den i SEQ ID

NO: 4 viste aminosyresekvens, og en position svarende til threonin i position 706 (T706) af den i SEQ ID NO: 2 viste aminosyresekvens er position 702 af den i SEQ ID NO: 4 viste aminosyresekvens.

I kartoffel anden type L α-glucanphosphorylase er en position svarende til F39 af 35 den i SEQ ID NO: 2 viste aminosyresekvens fx position 11 af den i SEQ ID NO: 6 viste 34 DK 177092 B1 aminosyresekvens, en position svarende til N135 af den i SEQ ID NO: 2 viste amino-syresekvens er position 107 af den i SEQ ID NO: 6 viste aminosyresekvens, og en position svarende til T706 af den i SEQ ID NO: 2 viste aminosyresekvens er position 683 af den i SEQ ID NO: 6 viste aminosyresekvens.

5 I favabønne type L a-glucanphosphorylase er en position svarende til F39 af den i SEQ ID NO: 2 viste aminosyresekvens fx position 43 af den i SEQ ID NO: 8 viste aminosyresekvens, en position svarende til N135 af den i SEQ ID NO: 2 viste aminosyresekvens er position 139 af den i SEQ ID NO: 8 viste aminosyresekvens, og en position svarende til T706 af den i SEQ ID NO: 2 viste aminosyresekvens er position 729 10 af den i SEQ ID NO: 8 viste aminosyresekvens.

I Arabidopsis thaliana type L α-glucanphosphorylase er en position svarende til F39 af den i SEQ ID NO: 2 viste aminosyresekvens fx position 106 af den i SEQ ID NO: 10 viste aminosyresekvens, en position svarende til N135 af den i SEQ ID NO: 2 viste aminosyresekvens er position 202 af den i SEQ ID NO: 10 viste aminosyresekvens, og 15 positionen svarende til T706 af den i SEQ ID NO: 2 viste aminosyresekvens er position 752 af den i SEQ ID NO: 10 viste aminosyresekvens.

I spinat type L α-glucanphosphorylase er en position svarende til F39 af den i SEQ ID NO: 2 viste aminosyresekvens fx position 112 af den i SEQ ID NO: 12 viste aminosyresekvens, en position svarende til N135 af den i SEQ ID NO: 2 viste amino-20 syresekvens er position 208 af den i SEQ ID NO: 12 viste aminosyresekvens, og en position svarende til T706 af den i SEQ ID NO: 2 viste aminosyresekvens er position 761 af den i SEQ ID NO: 12 viste aminosyresekvens.

I majs type L α-glucanphosphorylase er en position svarende til F39 af den i SEQ ID NO: 2 viste aminosyresekvens fx position 95 af den i SEQ ID NO: 14 viste amino-25 syresekvens, en position svarende til N135 af den i SEQ ID NO: 2 viste aminosyresekvens er position 191 af den i SEQ ID NO: 14 viste aminosyresekvens, og en position svarende til T706 af den i SEQ ID NO: 2 viste aminosyresekvens er position 773 af den i SEQ ID NO: 14 viste aminosyresekvens.

I ris type L α-glucanphosphorylase er en position svarende til F39 af en aminosyre-30 sekvens i SEQ ID NO: 2 fx position 41 af den i SEQ ID NO: 16 viste aminosyresekvens, en position svarende til N135 af den i SEQ ID NO: 2 viste aminosyresekvens er position 137 af den i SEQ ID NO: 16 viste aminosyresekvens, og en position svarende til T706 af den i SEQ ID NO: 2 viste aminosyresekvens er position 718 af den i SEQ ID NO: 16 viste aminosyresekvens.

35 DK 177092 B1 I en anden ris type L α-glucanphosphorylase er en position svarende til F39 af den i SEQ ID NO: 2 viste aminosyresekvens fx position 91 af den i SEQ ID NO: 18 viste aminosyresekvens, en position svarende til N135 af den i SEQ ID NO: 2 viste aminosyresekvens er position 187 af den i SEQ ID NO: 18 viste aminosyresekvens, og en 5 position svarende til T706 af den i SEQ ID NO: 2 viste aminosyresekvens er position 741 af den i SEQ ID NO: 18 viste aminosyresekvens.

I hvede type H α-glucanphosphorylase er en position svarende til F39 af den i SEQ ID NO: 2 viste aminosyresekvens fx position 31 af den i SEQ ID NO: 20 viste aminosyresekvens, en position svarende til N135 af den i SEQ ID NO: 2 viste amino-10 syresekvens er position 127 af den i SEQ ID NO: 20 viste aminosyresekvens, og en position svarende til T706 af den i SEQ ID NO: 2 viste aminosyresekvens er position 622 af den i SEQ ID NO: 20 viste aminosyresekvens.

I en Citrus hybrid kultivartype H α-glucanphosphorylase er en position svarende til F39 af den i SEQ ID NO: 2 viste aminosyresekvens fx position 42 af den i SEQ ID NO: 15 22 viste aminosyresekvens, en position svarende til N135 af den i SEQ ID NO: 2 viste aminosyresekvens er position 138 af den i SEQ ID NO: 22 viste aminosyresekvens, og en position svarende til T706 af den i SEQ ID NO: 2 viste aminosyresekvens er position 630 af den i SEQ ID NO: 22 viste aminosyresekvens.

I ris type H α-glucanphosphorylase er en position svarende til F39 af den i SEQ ID 20 NO: 2 viste aminosyresekvens fx position 39 af den i SEQ ID NO: 24 viste aminosyresekvens, en position svarende til N135 af den i SEQ ID NO: 2 viste aminosyresekvens er position 135 af den i SEQ ID NO: 24 viste aminosyresekvens, og en position svarende til T706 af den i SEQ ID NO: 2 viste aminosyresekvens er position 631 af den i SEQ ID NO: 24 viste aminosyresekvens.

25 I favabønne type H α-glucanphosphorylase er en position svarende til F39 af den i SEQ ID NO: 2 viste aminosyresekvens fx position 43 af den i SEQ ID NO: 26 viste aminosyresekvens, en position svarende til N135 af den i SEQ ID NO: 2 viste aminosyresekvens er position 139 af den i SEQ ID NO: 26 viste aminosyresekvens, og en position svarende til T706 af den i SEQ ID NO: 2 viste aminosyresekvens er position 30 632 af den i SEQ ID NO: 26 viste aminosyresekvens.

I Arabidopsis thaliana type Fl α-glucanphosphorylase er en position svarende til F39 af den i SEQ ID NO: 2 viste aminosyresekvens fx position 40 af den i SEQ ID NO: 28 viste aminosyresekvens, en position svarende til N135 af den i SEQ ID NO: 2 viste aminosyresekvens er position 136 af den i SEQ ID NO: 28 viste aminosyresekvens, og 36 DK 177092 B1 en position svarende til T706 af den i SEQ ID NO: 2 viste aminosyresekvens er position 631 af den i SEQ ID NO: 28 viste aminosyresekvens.

I kartoffel type H a-glucanphosphorylase er en position svarende til F39 af den i SEQ ID NO: 2 viste aminosyresekvens fx position 36 af den i SEQ ID NO: 30 viste 5 aminosyresekvens, en position svarende til N135 af den i SEQ ID NO: 2 viste aminosyresekvens er position 133 af den i SEQ ID NO: 30 viste aminosyresekvens, og en position svarende til T706 af den i SEQ ID NO: 2 viste aminosyresekvens er position 628 af den i SEQ ID NO: 30 viste aminosyresekvens.

En position afen aminosyrerest, som forbedrer termostabilitet, kan ikke blot be-10 stemmes ved alignment med sekvensens 916 aminosyrerester som vist i SEQ ID NO: 2, men også ved alignment med én eller flere sekvenser valgt fra gruppen bestående af ovennævnte motivsekvenser 1L eller 1H, 2 og 3L eller 3H. For så vidt som de hidtil kendte plante a-glucanphosphorylaser blev alignet, er den således bestemte position den samme i det tilfælde, hvor SEQ ID NO: 2 anvendes, og det tilfælde, hvor motivse-15 kvenserne 1L eller 1H, 2 og 3L eller 3H anvendes.

Motivsekvensen 1L er godt konserveret i type L α-glucanphosphorylaser, mens motivsekvensen 1H er godt konserveret i type H α-glucanphosphorylase. Det kan siges, at en position svarende til phenylalanin i position 39 (F39) af den i SEQ ID NO: 2 viste aminosyresekvens er en position svarende til position 4 i motivsekvensen 1L eller 20 1H.

Motivsekvensen 2 er almindeligvis konserveret i type L og type H a-glucanphos-phorylaser. Det kan siges, at en position svarende til asparagin i position 135 (N135) af den i SEQ ID NO: 2 viste aminosyresekvens er en position svarende til position 4 i motivsekvensen 2.

25 Motivsekvensen 3L er godt konserveret i type L α-glucanphosphorylaser, mens motivsekvensen 3H er godt konserveret i type H α-glucanphosphorylaser. Det kan siges, at en position svarende til threonin i position 706 (T706) af den i SEQ ID NO: 2 viste aminosyresekvens er en position svarende til position 7 i motivsekvensen 3L eller 3H.

30 På denne måde kan positionen af en aminosyrerest, som forbedrer termostabilitet, også specificeres under anvendelse af motivsekvenserne. En position af en aminosyrerest, som forbedrer termostabilitet, kan være mindst én position valgt fra gruppen bestående afen position svarende til position 4 i en motivsekvens 1L: Pl-A-E-F-T-P-V-F-S eller en position svarende til position 4 i en motivsekvens 1H: H-A-Q-Y-S-P-H-F-S; 35 en position svarende til position 4 i en motivsekvens 2: A-L-G-N-G-G-L-G; og en positi- 37 DK 177092 B1 on svarende til position 7 i en motivsekvens 3L: R-l-V-K-F-l-T-D-V eller en position svarende til position 7 i en motivsekvens 3H: R-l-V-K-L-V-N-D-V.

I forbindelse med fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse kan det derfor siges, at et nukleinsyremolekyle, der omfatter en basesekvens, som koder for en 5 første a-glucanphosphorylase, modificeres således, at a-glucanphosphorylase med forbedret termostabilitet, der kodes afen modificeret nukleinsyre, har en aminosyre-rest, som er forskellig fra en aminosyrerest af den naturlige α-glucanphosphorylase i mindst én position valgt fra gruppen bestående af en position svarende til position 4 i en motivsekvens 1L: H-A-E-F-T-P-V-F-S eller en position svarende til position 4 i en 10 motivsekvens 1H: H-A-Q-Y-S-P-H-F-S; en position svarende til position 4 i en motivsekvens 2: A-L-G-N-G-G-L-G; og en position svarende til position 7 i en motivsekvens 3L: R-l-V-K-F-l-T-D-V eller en position svarende til position 7 i en motivsekvens 3H: R-l-V-K-L-V-N-D-V.

I den foreliggende beskrivelse henviser ’’motivsekvens” til en partiel sekvens, som 15 ses mellem aminosyresekvenser af en flerhed af proteiner og er almindeligt eller i høj grad konserveret. Motivsekvensen har generelt en særlig funktion i mange tilfælde, men i den foreliggende beskrivelse kaldes dette motivsekvens, selv når en bestemt funktion ikke er identificeret, når blot sekvensen er konserveret blandt en flerhed af aminosyresekvenser.

20 En aminosyrerest ”i position 4 i en motivsekvens 1L” henviser til en aminosyrerest, som er den fjerde, når den tælles i rækkefølge, når aminosyreresten ved N-terminalen (venstre ende) af motivsekvensen 1L tages som position 1. "Position 4 i en motivsekvens 1H”, "position 4 i en motivsekvens 2”, "position 7 i en motivsekvens 3L”, "position 7 i en motivsekvens 3H” og lignende er tilsvarende.

25 Disse motivsekvenser er generelt godt konserverede i α-glucanphosphorylaser fra planter. Motivsekvenserne 1L eller 1H og 3L eller 3H er godt konserverede i a-glucan-phosphorylaser fra planter, men er ikke konserverede i α-glucanphosphorylaser stammende fra dyr, mikroorganismer eller lignende. Motivsekvens 2 er godt konserveret i a-glucanphosphorylaser fra næsten alle organismer såsom planter, dyr og mikroorga-30 nismer. Motivsekvens 2 indeholder en aminosyrerest, som formodes at være involveret i binding af et substrat og binding af pyridoxal-5’-phosphat, som er et coenzym, og er en del af de regioner, der er essentielle for aktivitet. Positionerne af motivsekvenserne 1L og 1H og positionen af motivsekvens 2 er vist i fig. 1B. Positionerne af motivsekvenserne 3L og 3H er vist i fig. 1G.

38 DK 177092 B1

Som det anvendes her, betegner ”en position svarende til position 4 i en motivsekvens 1L: H-A-E-F-T-P-V-F-S eller en position svarende til position 4 i en motivsekvens 1H: H-A-Q-Y-S-P-H-F-S” en position, som er alignet med en aminosyrerest i position 4 i motivsekvensen 1L eller motivsekvensen 1H, når en ønsket aminosyresekvens og 5 motivsekvensen 1L eller motivsekvensen 1H alignes uden at indsætte et gap, således at homologi mellem sekvenserne er størst. Det henviser mere foretrukket til den position, som alignes med aminosyreresten i position 4 i motivsekvensen 1L eller motivsekvensen 1H, når der udføres maksimal matching af GENETYX-WIN Ver. 4.0 (Genetics Co., Ltd.) under betingelser uden gaps.

10 En position svarende til position 4 i motivsekvens 2 og en position svarende til posi tion 7 i motivsekvens 3L og en position svarende til position 7 i motivsekvens 3H konstrueres på lignende måde.

Maksimal matching af GENETYX-WIN Ver. 4.0 er som følger: mens substitution og deletion betragtes, alignes sekvensdata, som skal analyseres, og sekvensdata, som 15 skal sammenlignes, således at aminosyrepar, der matcher mellem disse sekvenser, bliver størst, derefter scores henholdsvis matches, mismatches og gaps, en sum beregnes, og alignment ved den laveste sum gives som output (reference: Takashi, K., og Gotoh, O. 1984. Sequence Relationships among Various 4.5 S RNA Species J. Bi-ochem. 92:1173-1177). Fortrinsvis udføres alignment under betingelser med Mat-20 ches=-1; Mismatches=1; Gaps=lngen; *N+=2.

Under anvendelse af maksimal matching af GENETYX-WIN Ver. 4.0 blev kartoffel type L (SEQ ID NO: 2), sød kartoffel type L (SEQ ID NO: 4), kartoffel anden type L (SEQ ID NO: 6), favabønne type L (SEQ ID NO: 8), Arabidopsis thaliana type L (SEQ ID NO: 10), spinat type L (SEQ ID NO: 12), majs type L (SEQ ID NO: 14), ris type L 25 (SEQ ID NO: 16), ris anden type L (SEQ ID NO: 18), hvede type H (SEQ ID NO: 20),

Citrus hybrid kultivartype Fl (SEQ ID NO: 22), ris type Fl (SEQ ID NO: 24), favabønne type Fl (SEQ ID NO: 26), Arabidopsis thaliana type H (SEQ ID NO: 28) og kartoffel type Fl (SEQ ID NO: 30) alignet med en motivsekvens 1L eller en motivsekvens 1H. Analyse af maksimal matching blev udført under betingelser med Matches=-1; Mismat-30 ches=1; Gaps=0; *N+=2.

Ved maksimal matching af GENETYX-WIN Ver. 4.0 under ovennævnte betingelser blev SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28 og SEQ ID NO: 30 alignet med hver 35 motivsekvens (motivsekvens 1L, 1H, 2, 3L eller 3H). Som et resultat heraf blev phenyl- 39 DK 177092 B1 alanin eller tyrosin alignet med en position svarende til position 4 i motivsekvensen 1L eller en position svarende til position 4 i motivsekvensen 1H, asparagin blev alignet med en position svarende til position 4 i motivsekvensen 2, og threonin, asparagin eller asparaginsyre blev alignet med en position svarende til position 7 i motivsekvensen 3L 5 eller en position svarende til position 7 i motivsekvensen 3H. Motivsekvenserne 1L, 2 og 3L er partielle sekvenser af SEQ ID NO: 2, og motivsekvenserne 1H, 2 og 3H er partielle sekvenser af SEQ ID NO: 24.

Med hensyn til hver af SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, 10 SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28 og SEQ ID NO: 30 blev resultaterne af en alignment under anvendelse af en fuld længde af SEQ ID NO: 2 og resultater af en alignment under anvendelse af motivsekvenserne 1L, 1H, 2, 3L og 3H sammenlignet. Som et resultat heraf var i hver af SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ 15 ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28 og SEQ ID NO: 30 en position svarende til position 39 af SEQ ID NO: 2 og en position svarende til position 4 i motivsekvensen 1L eller 1H den samme. En position svarende til position 135 af SEQ ID NO: 2 og en position svarende til position 4 i motiv 2 var den samme. En position svarende til position 706 af SEQ ID NO: 2 og en position 20 svarende til position 7 i motiv 3L eller 3H var den samme. På denne måde blev det bekræftet, at selv når alignment blev udført under anvendelse af motivsekvenser, er de samme positioner specificeret som dem, der specificeres, når aminosyresekvensen i SEQ ID NO: 2 anvendes.

Et nukleinsyremolekyle, der omfatter en modificeret basesekvens, som er opnået 25 ved at modificere et nukleinsyremolekyle, der omfatter en basesekvens, som koder for den aminosyresekvens, der er vist i position 1 til position 916 af SEQ ID NO: 2, position 1 til position 912 af SEQ ID NO: 4, position 1 til position 893 af SEQ ID NO: 6, position 1 til position 939 af SEQ ID NO: 8, position 1 til position 962 af SEQ ID NO: 10, position 1 til position 971 af SEQ ID NO: 12, position 1 til position 983 af SEQ ID NO: 14, positi-30 on 1 til position 928 af SEQ ID NO: 16, position 1 til position 951 af SEQ ID NO: 18, position 1 til position 832 af SEQ ID NO: 20, position 1 til position 840 af SEQ ID NO: 22, position 1 til position 841 af SEQ ID NO: 24, position 1 til position 842 af SEQ ID NO: 26, position 1 til position 841 af SEQ ID NO: 28 og position 1 til position 838 af SEQ ID NO: 3 som vist i sekvenslisten, er inden for rammerne af den foreliggende op-35 findelse.

40 DK 177092 B1

Et nukleinsyremolekyle, der omfatter en modificeret basesekvens, som er opnået ved at modificere et nukleinsyremolekyle, der omfatter en basesekvens som vist i SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, 5 SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27 eller SEQ ID NO: 29 som vist i sekvenslisten, er inden for rammerne af den foreliggende opfindelse.

Et nukleinsyremolekyle, der omfatter en modificeret basesekvens, som er opnået ved at modificere et nukleinsyremolekyle, der omfatter en basesekvens, som koder for en aminosyresekvens med mindst 50% identitet med en aminosyresekvens valgt fra 10 gruppen bestående af: position 1 til position 916 af SEQ ID NO: 2; position 1 til position 912 af SEQ ID NO: 4; position 1 til position 893 af SEQ ID NO: 6; position 1 til position 939 af SEQ ID NO: 8; position 1 til position 962 af SEQ ID NO: 10; position 1 til position 971 af SEQ ID NO: 12; position 1 til position 983 af SEQ ID NO: 14; position 1 til position 928 af SEQ ID NO: 16; position 1 til position 951 af SEQ ID NO: 18; position 1 til 15 position 832 af SEQ ID NO: 20; position 1 til position 840 af SEQ ID NO: 22; position 1 til position 841 af SEQ ID NO: 24; position 1 til position 842 af SEQ ID NO: 26; position 1 til position 841 af SEQ ID NO: 28; og position 1 til position 838 af SEQ ID NO: 30; som vist i sekvenslisten, er inden for rammerne af den foreliggende opfindelse.

I forbindelse med den foreliggende opfindelse henviser "identitet” af en sekvens, 20 såsom en aminosyresekvens og en basesekvens, til graden af forekomst af den samme aminosyre (base, når basesekvenser sammenlignes) mellem to sekvenser. Identitet bestemmes generelt ved at sammenligne to aminosyresekvenser eller to basesekvenser og sammenligne disse to sekvenser, som er alignet i et optimalt format, der kan indeholde additioner eller deletioner. Procentvis identitet beregnes ved at bestem-25 me det antal positioner, hvor en aminosyre (base, når basesekvenser sammenlignes) er den samme i disse to sekvenser, dividere antallet af de samme positioner med det samlede antal sammenlignede positioner og multiplicere det opnåede resultat med 100 for at opnå en procentvis identitet mellem de to sekvenser.

Som et eksempel kan en aminosyresekvens af naturlig a-glucanphosphorylase, 30 som anvendes til opnåelse af α-glucanphosphorylase med forbedret termostabilitet ifølge den foreliggende opfindelse, være den samme som, dvs. 100% identisk med en aminosyresekvens (dvs. kontrolaminosyresekvens) valgt fra gruppen bestående af position 1 til position 916 af SEQ ID NO: 2; position 1 til position 912 af SEQ ID NO: 4; position 1 til position 893 af SEQ ID NO: 6; position 1 til position 939 af SEQ ID NO: 8; 35 position 1 til position 962 af SEQ ID NO: 10; position 1 til position 971 af SEQ ID NO: 41 DK 177092 B1 12; position 1 til position 983 af SEQ ID NO: 14; position 1 til position 928 af SEQ ID NO: 16; position 1 til position 951 af SEQ ID NO: 18; position 1 til position 832 af SEQ ID NO: 20; position 1 til position 840 af SEQ ID NO: 22; position 1 til position 841 af SEQ ID NO: 24; position 1 til position 842 af SEQ ID NO: 26; position 1 til position 841 5 af SEQ ID NO: 28; og position 1 til position 838 af SEQ ID NO: 30; eller denne amino-syresekvens kan indeholde én eller flere ændrede aminosyrerester i sammenligning med en kontrolaminosyresekvens. Sådanne ændringer kan vælges fra gruppen bestående af en deletion, en substitution, herunder konservativ og ikke-konservativ substitution, eller en insertion af mindst én aminosyre. Denne ændring kan optræde i en positi-10 on af en aminoterminal eller en carboxyterminal af en kontrolaminosyresekvens eller kan optræde i en hvilken som helst anden position end disse terminaler. Ændring af en aminosyrerest kan være afbrudt af én rest, eller nogle få rester kan være tilgrænsende.

I den foreliggende beskrivelse beregnes den procentvise identitet af sekvenser under anvendelse af maksimal matching af GENETYX-WIN Ver. 4.0 (Genetics Co., Ltd.).

15 Dette program aligner sekvensdata, som skal analyseres, og sekvensdata, som skal sammenlignes, således at aminosyrepar, der matches mellem sekvenser, bliver størst, mens substitution og deletion betragtes, og derefter giver en score for hver af matches, mismatches og gaps, beregner en sum, giver alignment som output ved den mindste sum og derefter beregner identitet (reference: Takashi, K., og Gotoh, O. 1984. Se-20 quence Relationships among Various 4.5 S RNA Species J. Biochem. 92:1173-1177).

Under anvendelse af maksimal matching af GENETYX-WIN Ver. 4.0 blev den procentvise identitet af sød kartoffel type L (SEQ ID NO: 4), kartoffel anden type L (SEQ ID NO: 6), favabønne type L (SEQ ID NO: 8), Arabidopsis thaliana type L (SEQ ID NO: 10), spinat type L (SEQ ID NO: 12), majs type L (SEQ ID NO: 14), ris type L (SEQ ID 25 NO: 16), ris anden type L (SEQ ID NO: 18) og hvede type H (SEQ ID NO: 20), Citrus hybrid kultivartype H (SEQ ID NO: 22), ris type H (SEQ ID NO: 24), favabønne type H (SEQ ID NO: 26), Arabidopsis thaliana type H (SEQ ID NO: 28) og kartoffel type H (SEQ ID NO: 30) med kartoffel type L (SEQ ID NO: 2) beregnet, og resultater er vist i tabel 4. Analyse af maksimal matching blev udført under betingelser med Matches=-1; 30 Mismatches=1; Gaps=1; *N+=2.

42 DK 177092 B1

TabeU__ _Omhandlet sekvens__Identitet

Kartoffel type L__100

Kartoffel anden type L__70,3

Arabidopsis thaliana type L__72,1

Spinat type L__72,7

Ris type L__73,8

Ris anden type L__67,7

Majs type L__70,2 Sød kartoffel type L__78,6

Favabønne type L__72,5

Kartoffel type H__57,5

Arabidopsis thaliana type H__57,8

Ris type H__57,0

Favabønne type H__58,6

Citrus hybrid kultivartype H__57,5

Hvede type Fl__57,6

Et nukleinsyremolekyle, der omfatter en modificeret basesekvens, der er opnået ved at modificere et nukleinsyremolekyle, som hybridiserer under stringente betingelser 5 med et nukleinsyremolekyle bestående af en basesekvens valgt fra gruppen bestående af SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27 og SEQ ID NO: 29 som vist i sekvenslisten, er inden for rammerne af den foreliggende opfindelse. Fagmanden på 10 området kan let selektere et ønsket a-glucanphosphorylasegen.

Som det anvendes her, henviser udtrykket ’’stringent betingelse” til betingelser, under hvilke en sekvens hybridiserer med en specifik sekvens, men ikke med en ikke-specifik sekvens. Selektion af hensigtsmæssige stringente betingelser er velkendt for fagmanden på området og er fx beskrevet i Molecular Cloning (Sambrook, et al., sup-15 ra). Specifikt betyder betingelserne, at et polynukleotid, som kan identificeres under anvendelse af de betingelser, under hvilke hybridisering udføres ved 65°C i en opløsning indeholdende 50% formamid, 5xSSC (750 mM NaCI, 75 mM trinatriumcitrat), 50 mM natriumphosphat (pH 7,6), 5x Denharts opløsning (0,2% BSA, 0,2% Ficoll 400 og 0,2% polyvinylpyrrolidon), 10% dextransulfat og 20 pg/ml denatureret klippet lakse-20 sperma-DNA under anvendelse af et filter, på hvilket DNA afledt fra en koloni eller en plaque er blevet immobiliseret, og filteret vaskes under betingelser ved 65°C under anvendelse afen SSC-opløsning (saltvand-natriumcitrat) med en 0,1 til 2 folds koncentration (sammensætningen afen SSC-opløsning med en 1 folds koncentration er 150 mM natriumchlorid, 15 mM natriumcitrat).

43 DK 177092 B1

Et modificeret nukleinsyremolekyle, som kan anvendes i fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse, kan være et nukleinsyremolekyle, som blev modificeret konservativt i forhold til et nukleinsyremolekyle, som omfatter en basesekvens, der koder for en første α-glucanphosphorylase. Det "nukleinsyremolekyle, som blev modifice-5 ret konservativt i forhold til et nukleinsyremolekyle, som omfatter en basesekvens, der koder for en første α-glucanphosphorylase” henviser til et nukleinsyremolekyle, der omfatter en basesekvens, som koder for en aminosyresekvens, der er den samme eller i det væsentlige den samme som en aminosyresekvens, der kodes af en basesekvens, som koder for den første α-glucanphosphorylase. Den "aminosyresekvens, der i det 10 væsentlige er den samme som en aminosyresekvens, der kodes af en basesekvens, som koder for den første α-glucanphosphorylase” henviser til en aminosyresekvens, som har i det væsentlige den samme enzymaktivitet som den første a-glucanphospho-rylase. På grund af degenereringen af den genetiske kode koder mange funktionelt ækvivalente basesekvenser for en foreskrevet aminosyresekvens. Kodonerne GCA, 15 GCC, GCG og GCT koder fx alle for aminosyren alanin. I alle positioner, hvor alanin er specificeret af en GCA-kodon, kan kodonen derfor ændres til GCC, GCG eller GCT uden at ændre den kodede alanin. Med hensyn til en aminosyre, som kodes af en flerhed af kodoner, kan kodonen i alle positioner, hvor aminosyren specificeres af en kodon, på lignende måde ændres til en hvilken som helst anden kodon, der koder for 20 aminosyren, uden at ændre den bestemte aminosyre, som kodes. En sådan variation i en basesekvens er en "tavs mutation”, som er én type konservativt ændret mutation.

Alle basesekvenser i den foreliggende beskrivelse, som koder for et polypeptid, omfatter også alle mulige tavse ændringer af nukleinsyren. Tavs mutation omfatter ’’tavs substitution”, hvor en kodende nukleinsyre ikke ændres, og det tilfælde, hvor en nukle-25 insyre ikke oprindeligt koder for en aminosyre. Når en bestemt nukleinsyre koder for en aminosyre, har tavs mutation den samme betydning som tavs substitution. I den foreliggende beskrivelse henviser "tavs substitution” til substitution afen basesekvens, der koder for en bestemt aminosyre, med en anden basesekvens, der koder for den samme aminosyre, i en basesekvens. Baseret på fænomenet med degenerering af den 30 genetiske kode er en sådan tavs substitution mulig i det tilfælde, hvor der er en flerhed af basesekvenser, som koder for en bestemt aminosyre (fx glycin). Et polypeptid, som har en aminosyresekvens, der kodes af en basesekvens, som produceres ved tavs substitution, har derfor den samme aminosyresekvens som det oprindelige polypeptid.

Derfor kan a-glucanphosphorylasen med forbedret termostabilitet ifølge den forelig-35 gende opfindelse omfatte tavse substitutioner på basesekvensniveau ud over en modi- 44 DK 177092 B1 fikation, som er tilsigtet i forbindelse med den foreliggende opfindelse (substitution udføres, således at a-glucanphosphorylasen har en aminosyrerest, som er forskellig fra en aminosyrerest af den naturlige a-glucanphosphorylase i mindst én position valgt fra gruppen bestående afen position svarende til position 4 i motivsekvensen 1L eller 1H, 5 en position svarende til position 4 i motivsekvens 2 eller en position svarende til position 7 i motivsekvensen 3L eller 3H eller en position svarende til phenylalanin i position 39 (F39) af en aminosyresekvens med SEQ ID NO: 2, en position svarende til aspara-gin i position 135 (N135) og en position svarende til threonin i position 706 (T706). På området forstås det, at hver kodon i en nukleinsyre (undtagen ATG, som kun er én ko-10 don, der sædvanligvis koder for methionin, og TGG, som kun er én kodon, der sædvanligvis koder for tryptophan) kan modificeres for at producere det funktionelt samme molekyle. Hver tavs mutation af en nukleinsyre, der koder for et polypeptid, er derfor implicit inkluderet i hver beskrevet sekvens. En sådan ændring kan fortrinsvis udføres således, at substitution af cystein, som er en aminosyre, der i høj grad påvirker et poly-15 peptids konformation, undgås.

En basesekvens, der koder for α-glucanphosphorylase med forbedret termostabilitet ifølge den foreliggende opfindelse, kan ændres i konformitet med kodonbrugen i en organisme, i hvilken sekvensen indføres til ekspression. Kodonbrug afspejler brugen i et gen, som udtrykkes i høj grad i organismen. Når ekspression er hensigten i Escheri-20 chia coli, kan sekvensen fx fremstilles til at være optimal til ekspression i Escherichia coli i overensstemmelse med den publicerede tabel over kodonbrug (fx Sharp, et al.,

Nucleic Acids Research 16, No.17, p.8207 (1988)).

(2.3 Fremstilling af ekspressionsvektorer) 25 En ekspressionsvektor fremstilles under anvendelse af et nukleinsyremolekyle, der omfatter basesekvensen, som er modificeret som beskrevet ovenfor. En fremgangsmåde til fremstilling af en ekspressionsvektor under anvendelse af en bestemt nuklein-syresekvens er velkendt for fagmanden på området.

Når der henvises til et nukleinsyremolekyle i den foreliggende beskrivelse, henviser 30 en "vektor” til et nukleinsyremolekyle, som kan overføre en ønsket basesekvens til en ønsket celle. Eksempler på sådanne vektorer omfatter en vektor, som kan replikere autonomt i en ønsket celle eller kan inkorporeres i et kromosom i en ønsket celle og har en promotor i en position, der er egnet til transkription af en modificeret basesekvens. I den foreliggende beskrivelse kan vektoren være et plasmid.

45 DK 177092 B1

Som det anvendes her, henviser ’’ekspressionsvektor" til en vektor, som kan udtrykke en modificeret basesekvens (dvs. en basesekvens, som koder for modificeret a-glucanphosphorylase) i en ønsket celle. En ekspressionsvektor indeholder ud over en modificeret basesekvens forskellige reguleringselementer såsom en promotor, der re-5 gulerer ekspression deraf, og om nødvendigt faktorer, der er nødvendige til replikation i en ønsket celle og selektion af en rekombinant (fx replikationsorigin (ori) og en selek-terbar markør såsom et lægemiddelresistensgen). I en ekspressionsvektor er en modificeret basesekvens operabelt bundet, således at den transkriberes og translateres.

Reguleringselementer omfatter en promotor, en terminator og en enhancer. Når sekre-10 tion af et udtrykt enzym uden for en celle er hensigten, er en basesekvens, der koder for et sekretionssignalpeptid, desuden bundet opstrøms for en modificeret basesekvens i den korrekte læseramme. Det er et forhold, som er velkendt for fagmanden, at både typen af en ekspressionsvektor, som anvendes til indføring i en bestemt organisme (fx bakterie), og arten af et reguleringselement og andre faktorer, som anvendes i 15 ekspressionsvektoren, kan variere afhængigt af en ønsket celle.

Som det anvendes her, er "terminator” en sekvens, som er beliggende nedstrøms for en proteinkodende region og er involveret i termination af transkription efter transkription af en basesekvens til et mRNA og i tilføjelse af en poly A-sekvens. Det er kendt, at terminatoren har indflydelse på ekspressionsniveauet af et gen med hensyn til 20 stabiliteten af et mRNA.

Som det anvendes her, henviser "promotor” til en region på et DNA, som bestemmer et transkriptionsinitieringssted i et gen og direkte regulerer transkriptionsfrekven-sen og er en basesekvens, til hvilken en RNA-polymerase binder og derved initierer transkription. Eftersom regionen afen promotor sædvanligvis er en region ca. 2 kb eller 25 mindre opstrøms for en første exon af en formodet proteinkodende region i mange tilfælde, når en proteinkodende region i en genombasesekvens forudsiges under anvendelse af DNA-analysesoftware, kan en promotorregion være formodet. En formodet promotorregion varierer med ethvert strukturelt gen og er sædvanligvis opstrøms for et strukturelt gen uden begrænsning og kan være nedstrøms for et strukturelt gen. En 30 formodet promotorregion er fortrinsvis til stede ca. 2 kb eller mindre opstrøms for et første exontranslationsinitieringspunkt.

Som det anvendes her, kan "enhanceren” anvendes til at forøge et ønsket gens ekspressionseffektivitet. En sådan enhancer er velkendt på området. En flerhed af en-hancere kan anvendes, men kun én kan anvendes eller kan overhovedet ikke anven-35 des.

46 DK 177092 B1

Som det anvendes her, henviser "operabelt bundet” til, når en ønsket basesekvens er anbragt under kontrol af en transkriptions- og translationsregulerende sekvens (fx promotor, enhancer og lignende) eller en translationsregulerende sekvens, som udfører ekspression (dvs. operation). For at en promotor er operabelt bundet til et gen, er 5 en promotor sædvanligvis anbragt umiddelbart opstrøms for genet, men det er ikke nødvendigt, at en promotor er anbragt grænsende op til genet.

For operabelt at binde en modificeret nukleinsyresekvens til det ovenfor nævnte reguleringselement bør et ønsket a-glucanphosphorylasegen i nogle tilfælde processeres. Eksempler inkluderer det tilfælde, hvor afstanden mellem en promotor og en ko-10 dende region er for lang, og reduktion i transkriptionseffektivitet forudsiges, det tilfælde, hvor afstanden mellem et ribosombindingssted og en translationsinitieringskodon ikke er egnet, og lignende. Eksempler på processeringsmidlerne omfatter fordøjelse med et restriktionsenzym, fordøjelse med en exonuklease såsom Bal31 og Exolll eller indføring af site-directed mutagenese under anvendelse af et enkeltstrenget DNA såsom 15 M13 eller PCR.

(2.4 Ekspression af a-glucanphosphorylase med forbedret termostabilitet)

Den som ovenfor beskrevet fremstillede ekspressionsvektor indføres derefter i en celle, hvorved α-glucanphosphorylase med forbedret termostabilitet udtrykkes.

20 I den foreliggende beskrivelse henviser "ekspression” af et enzym til in vivo- eller in vitro-transkription og -translation af en basesekvens, som koder for enzymet, og produktion af det kodede enzym.

En celle, i hvilken en ekspressionsvektor indføres (også betegnet som en vært), omfatter prokaryoter og eukaryoter. En celle, i hvilken en ekspressionsvektor indføres, 25 kan let selekteres, idet forskellige betingelser såsom nemhed af ekspression af a- glucanphosphorylase, nemhed af dyrkning, væksthastighed og sikkerhed tages i betragtning. Når α-glucanphosphorylase fx anvendes til at syntetisere amylose med en høj molekylvægt, foretrækkes det at anvende en celle, som ikke producerer amylase eller kun producerer amylase i et lavt niveau, da det foretrækkes, at a-glucanphospho-30 rylase ikke indeholder amylase som kontaminant. Eksempler på en sådan celle omfatter mikroorganismer såsom bakterier og svampe. Eksempler på mere foretrukne celler omfatter mesofile mikroorganismer (fx Escherichia coli, Bacillus subtilis). I den foreliggende beskrivelse er den ’’mesofile mikroorganisme” en mikroorganisme, som har en væksttemperatur i et normalt temperaturmiljø, og henviser især til en mikroorganisme, 35 som har en optimal væksttemperatur på 20°C til 40°C. En celle kan fx være en mikro- 47 DK 177092 B1 organismecelle eller kan være en plante- eller dyrecelle. Afhængigt af den celle, som skal anvendes, kan et enzym ifølge den foreliggende opfindelse være et enzym, som har gennemgået posttranslationel processering. En plante omfatter, men er ikke begrænset til, en tokimbladet og en énkimbladet såsom ris, hvede, byg og majs. En korn-5 sort såsom ris har den egenskab, at den akkumulerer et lagerprotein i et frø, og under anvendelse af et lagerproteinsystem kan kornsorten udtrykkes således, at en a-glucan-phosphorylase med forbedret termostabilitet ifølge den foreliggende opfindelse akkumuleres i et frø (se japansk offentliggjort ansøgning nr. 2002-58492).

Ved fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse kan teknikken med at ind-10 føre en ekspressionsvektor i en celle være en hvilken som helst teknik, som er kendt på området. Eksempler på en sådan teknik omfatter fx transformation, transduktion og transfektion. En sådan teknik med at indføre et nukleinsyremolekyle er velkendt på området og er konventionel og beskrevet fx i Ausubel F.A. et al. red. (1988), Current Protocols in Molecular Biology, Wiley, New York, NY; Sambrook J, et al. (1987) Mole-15 cular Cloning: A Laboratory Manual, 2. udgave, Cold Spring Harbor Laboratory Press,

Cold Spring Harbor, NY, og Bessatsu Jikkenkagaku "Idenshidounyu & Hatsugen kai-seki jikkenhou", Yodosha, 1997.

Når en plantecelle anvendes som celle, er en fremgangsmåde til re-differentiering af en transformant til et væv eller en plante velkendt på området. Eksempler på en så-20 dan fremgangsmåde er beskrevet i følgende: Rogers, et al., Methods in Enzymology 118:627-640 (1986); Tabata, et al., Plant Cell Physiol., 28:73-82 (1987); Shaw, Plant Molecular Biology: A Practical Approach. IRL press (1988); Shimamoto, et al., Nature 338: 274 (1989); og Maliga, et al., Methods in Plant Molecular Biology: A laboratory course. Cold Spring Harbor Laboratory Press (1995). En fremgangsmåde til transfor-25 mation af en træagtig plante er beskrevet i Molecular Biology of Woody Plants (Vol. I, II) (red. S. Mohan Jain, Subhash C. Minocha), Kluwer Academic Publishers, (2000).

Desuden er en fremgangsmåde til transformation af en træagtig plante beskrevet i detaljer i fx Plant Cell Reports (1999) 19:106-110. Fagmanden på området kan derfor re-differentiere en transformant ved på passende måde at anvende den ovenfor nævnte 30 velkendte fremgangsmåde, afhængigt af den ønskede transgene plante. Et ønsket gen indføres i den således opnåede transgene plante, og indføringen af et gen kan bekræftes under anvendelse af en kendt fremgangsmåde såsom Northern blotting og Western blot-analyse eller andre velkendte konventionelle teknikker.

Ved at dyrke en celle, i hvilken der er blevet indført en ekspressionsvektor, og som 35 har erhvervet evnen til at udtrykke α-glucanphosphorylase med forbedret termostabili- 48 DK 177092 B1 tet (også betegnet som en transformeret celle), kan α-glucanphosphorylase med forbedret termostabilitet udtrykkes i en celle. Betingelserne for dyrkning af en transformeret celle vælges på hensigtsmæssig måde afhængigt afarten af den værtscelle, som skal anvendes, og arten af en ekspressionsregulerende faktor i en ekspressionsvektor.

5 Der kan fx anvendes en sædvanlig rystekulturfremgangsmåde.

Det medium, der anvendes til dyrkning af en transformeret celle, er ikke særligt begrænset, når blot den anvendte celle dyrkes og kan udtrykke ønsket a-glucanphos-phorylase med forbedret termostabilitet. I et medium kan der ud over en carbonkilde og en nitrogenkilde anvendes uorganiske salte alene såsom salte af phosphorsyre, Mg2+, 10 Ca2+, Mn2+, Fe2+, Fe3+, Zn2+, Co2+, Ni2+, Na+, K+ eller ved at blande dem på hensigts mæssig måde om nødvendigt. Om nødvendigt kan der desuden tilsættes forskellige uorganiske stoffer eller organiske stoffer, som er nødvendige til dyrkning af en transformeret celle eller ekspression af ønsket α-glucanphosphorylase med forbedret termostabilitet.

15 Temperaturen til dyrkning af en transformeret celle kan vælges til at være egnet til dyrkning afen transformeret celle, som skal anvendes. Temperaturen er sædvanligvis 15°C til 60°C. Dyrkning af en transformeret celle fortsættes i et tilstrækkeligt tidsrum til at udtrykke α-glucanphosphorylase med forbedret termostabilitet.

Når der anvendes en ekspressionsvektor med en inducerbar promotor, kan eks-20 pression reguleres ved tilsætning af en inducer, ændring af dyrkningstemperaturen og indstilling af mediekomponenter. Når der fx anvendes en ekspressionsvektor med en lactoseinducerbar promotor, kan ekspressionen induceres ved tilsætning af isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG).

25 (2.5 Opsamling af α-glucanphosphorylase med forbedret termostabilitet)

Den således udtrykte α-glucanphosphorylase med forbedret termostabilitet kan derefter opsamles. Når den udtrykte α-glucanphosphorylase med forbedret termostabilitet produceres i en transformeret celle, opsamles en celle fra en kultur af transformerede celler fx ved at centrifugere eller filtrere kulturen. Den opsamlede celle suspende-30 res i en egnet buffer og knuses under anvendelse af en konventionel metode (ultralyd,

French-presse, lysozymbehandling) til opnåelse afen rå enzymopløsning. En rå enzymopløsning eller et oprenset enzym med forbedret specifik aktivitet opnås desuden ved at oprense den rå enzymopløsning ved en fremgangsmåde, der på hensigtsmæssig måde kombinerer konventionelle enzymoprensningsmetoder såsom centrifugering, 35 kromatografi, membranfraktionering, elektroforese og udsaltning. Når der ikke er inde- 49 DK 177092 B1 holdt et enzym, som hydrolyserer en glucan såsom a-amylase, kan der anvendes et råt enzym, som det er, fx til fremstilling af en glucan med høj molekylvægt.

Ved at producere α-glucanphosphorylase med forbedret termostabilitet som beskrevet ovenfor bliver det muligt i betydeligt omfang at forbedre naturlig a-glucanphos-5 phorylases termostabilitet. Den udtrykte α-glucanphosphorylase med forbedret termostabilitet kan desuden oprenses på simpel måde ved at udnytte termostabiliteten deraf.

Ved at varmebehandle en celleekstrakt, som indeholder α-glucanphosphorylase med forbedret termostabilitet, ved ca. 60°C insolubiliseres kontaminerende enzymer kort beskrevet. Ved at centrifugere de insolubiliserede stoffer for at fjerne dem og udføre 10 dialysebehandling opnås oprenset α-glucanphosphorylase med forbedret termostabilitet.

(3. α-glucanphosphorylase med forbedret termostabilitet) α-glucanphosphorylase med forbedret termostabilitet ifølge den foreliggende opfin-15 delse, der er opnået ved ovennævnte fremgangsmåde, har en aminosyrerest, som er forskellig fra en aminosyrerest i den naturlige α-glucanphosphorylase i mindst én position valgt fra gruppen bestående af en position svarende til position 4 i motivsekvensen 1L: H-A-E-F-T-P-V-F-S eller en position svarende til position 4 i motivsekvensen 1H: H-A-Q-Y-S-P-H-F-S; en position svarende til position 4 i motivsekvensen 2: A-L-G-N-G-20 G-L-G; og en position svarende til position 7 i motivsekvensen 3L: R-l-V-K-F-l-T-D-V eller en position svarende til position 7 i motivsekvensen 3H: R-l-V-K-L-V-N-D-V.

α-glucanphosphorylase med forbedret termostabilitet ifølge den foreliggende opfindelse har en aminosyrerest, som er forskellig fra en aminosyrerest i den naturlige a-glucanphosphorylase i mindst én position valgt fra gruppen bestående af en position 25 svarende til phenylalanin i position 39 (F39) af den i SEQ ID NO: 2 viste aminosyre-sekvens; en position svarende til asparagin i position 135 (N135) af den i SEQ ID NO: 2 viste aminosyresekvens; og en position svarende til threonin i position 706 (T706) af den i SEQ ID NO: 2 viste aminosyresekvens. α-glucanphosphorylase med forbedret termostabilitet ifølge den foreliggende opfindelse kan indeholde en aminosyresekvens, 30 i hvilken én eller flere aminosyrer ud over substitution af en aminosyre i disse positioner er deleteret, substitueret eller tilføjet i forhold til en aminosyresekvens af naturlig a-glucanphosphorylase.

I én udførelsesform indeholder α-glucanphosphorylase med forbedret termostabilitet ifølge den foreliggende opfindelse en aminosyresekvens, i hvilken én eller flere 35 aminosyrer er deleteret, substitueret eller tilføjet i forhold til en aminosyresekvens af 50 DK 177092 B1 plante α-glucanphosphorylase, og har en aminosyrerest, som er forskellig fra en ami-nosyrerest i den naturlige α-glucanphosphorylase i mindst én position valgt fra gruppen bestående af en position svarende til phenylalanin i position 39 (F39) af den i SEQ ID NO: 2 viste aminosyresekvens; en position svarende til asparagin i position 135 (N135) 5 af den i SEQ ID NO: 2 viste aminosyresekvens; og en position svarende til threonin i position 706 (T706) af den i SEQ ID NO: 2 viste aminosyresekvens.

Enzymet ifølge den foreliggende opfindelse er en α-glucanphosphorylase med forbedret termostabilitet, der er opnået ved at modificere en naturlig plante a-glucanphos-phorylase, indeholder en aminosyresekvens, i hvilken én eller flere aminosyrer erdele-10 teret, substitueret eller tilføjet i forhold til en aminosyresekvens af den naturlige a- glucanphosphorylase og har en aminosyrerest, som er forskellig fra en aminosyrerest i den naturlige α-glucanphosphorylase i mindst én position valgt fra gruppen bestående af en position svarende til phenylalanin i position 39 (F39) af den i SEQ ID NO: 2 viste aminosyresekvens; en position svarende til asparagin i position 135 (N135) af den i 15 SEQ ID NO: 2 viste aminosyresekvens; og en position svarende til threonin i position 706 (T706) af den i SEQ ID NO: 2 viste aminosyresekvens.

Det er foretrukket, at enzymet ifølge den foreliggende opfindelse har en aminosyrerest, som er forskellig fra naturlig α-glucanphosphorylase i mindst to positioner valgt fra gruppen bestående af: en position svarende til phenylalanin i position 39 (F39) 20 i aminosyresekvensen i SEQ ID NO: 2; en position svarende til asparagin i position 135 (N135) af den i SEQ ID NO: 2 viste aminosyresekvens; og en position svarende til threonin i position 706 (T706) af den i SEQ ID NO: 2 viste aminosyresekvens. Det er mest foretrukket, at enzymet ifølge den foreliggende opfindelse har en aminosyrerest, som er forskellig fra naturlig α-glucanphosphorylase i alle positioner af en position sva-25 rende til phenylalanin i position 39 (F39) af den i SEQ ID NO: 2 viste aminosyresekvens; en position svarende til asparagin i position 135 (N135) af den i SEQ ID NO: 2 viste aminosyresekvens; og en position svarende til threonin i position 706 (T706) af den i SEQ ID NO: 2 viste aminosyresekvens.

Det antages, at de ovenfor nævnte tre positioner af naturlig a-glucanphosphorylase 30 interagerer med omgivende aminosyrer i α-glucanphosphorylases steriske struktur og danner en sterisk partiel struktur, som destabiliserer enzymet. Ved at ændre en rest i disse positioner til en anden aminosyrerest stabiliseres enzymet, og termostabiliteten forbedres. Da rester i disse positioner sterisk-strukturelt interagerer med omgivende aminosyrerester, har substitution af aminosyreresterne desuden uventet betydningsful-35 de virkninger. I tilfælde af kartoffel type L α-glucanphosphorylase har substitution af F i 51 DK 177092 B1 en position af F39 med andre rester fx uventet betydningsfulde konsekvenser. I kartoffel type H α-glucanphosphorylase er en aminosyre i en position svarende til F39 desuden fx Y, og substitution af Y med andre aminosyrer har uventet betydningsfulde virkninger.

5 I enzymet ifølge den foreliggende opfindelse kan en aminosyrerest i en position svarende til position 4 eller F39 i motivsekvensen 1L eller 1H være en anden aminosyre end en aminosyrerest, som findes i naturlig α-glucanphosphorylase. En aminosyrerest i en position svarende til position 4 eller F39 i motivsekvensen 1L eller 1H er fortrinsvis en alifatisk aminosyre eller en heterocyklisk aminosyre, mere foretrukket en 10 alifatisk aminosyre, særligt foretrukket en forgrenet aminosyre (dvs. valin, leucin eller isoleucin), specielt foretrukket isoleucin eller leucin, mest foretrukket leucin.

I enzymet ifølge den foreliggende opfindelse kan en aminosyrerest i en position svarende til position 4 eller N135 i en motivsekvens 2 være en anden aminosyre end en aminosyrerest, som findes i naturlig α-glucanphosphorylase. En aminosyrerest i en 15 position svarende til position 4 eller N135 i en motivsekvens 2 er fortrinsvis en alifatisk aminosyre eller en heterocyklisk aminosyre, mere foretrukket alanin, cystein, aspara-ginsyre, glutaminsyre, glycin, histidin, isoleucin, leucin, methionin, phenylalanin, serin, threonin, valin eller tyrosin, særligt foretrukket cystein, glycin, serin eller valin.

I enzymet ifølge den foreliggende opfindelse kan en aminosyrerest i en position 20 svarende til position 7 eller T706 i motivsekvensen 3L eller 3H være en anden aminosyre end en aminosyrerest, som findes i naturlig α-glucanphosphorylase. En aminosyrerest i en position svarende til position 7 eller T706 i en motivsekvens 3L eller 3H er fortrinsvis en alifatisk aminosyre, mere foretrukket en forgrenet aminosyre (dvs. valin, leucin eller isoleucin) eller en svovlholdig aminosyre (dvs. cystein, cystin, methionin), 25 særligt foretrukket cystein, isoleucin, leucin, valin eller tryptophan, særligt foretrukket cystein, isoleucin, leucin eller valin, mest foretrukket isoleucin.

Ved fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse til fremstilling af a-glucan-phosphorylase med forbedret termostabilitet kan der udføres en substitution, addition, deletion eller modifikation af en aminosyre ud over ændring af genstanden ifølge opfin-30 delsen (såsom den substitution, at en α-glucanphosphorylase har en aminosyrerest, som er forskellig fra en aminosyrerest i den naturlige α-glucanphosphorylase i mindst én position valgt fra gruppen bestående af en position svarende til phenylalanin i position 39 (F39) af den i SEQ ID NO: 2 viste aminosyresekvens, en position svarende til asparagin i position 135 (N135) af den i SEQ ID NO: 2 viste aminosyresekvens og en 35 position svarende threonin i position 706 (T706) af den i SEQ ID NO: 2 viste amino- 52 DK 177092 B1 syresekvens). Substitution af en aminosyre henviser til substitution af én aminosyre med en anden aminosyre. Addition af en aminosyre henviser til indsættelse af én eller flere, fx 1 til 10, fortrinsvis 1 til 5, mere foretrukket 1 til 3 aminosyrer i en hvilken som helst position af den oprindelige aminosyresekvens. Deletion afen aminosyre henviser 5 til fjernelse af én eller flere, fx 1 til 10, fortrinsvis 1 til 5, mere foretrukket 1 til 3 aminosyrer fra den oprindelige aminosyresekvens. Eksempler på aminosyremodifikation omfatter, men er ikke begrænset til, amidering, carboxylering, sulfatering, halogenering, alkylering, glycosylering, phosphorylering, hydroxylering og acylering (fx acetylering). α-glucanphosphorylase med forbedret termostabilitet ifølge den foreliggende opfindel-10 se kan syntetiseres ved en peptidsyntesemetode, og i et sådant tilfælde kan en aminosyre, som skal substitueres eller tilføjes, være en naturlig aminosyre, en ikke-naturlig aminosyre eller en aminosyreanalog. En naturlig aminosyre foretrækkes.

α-glucanphosphorylase med forbedret termostabilitet ifølge den foreliggende opfindelse kan være en enzymanalog, som har den samme enzymaktivitet som a-glucan-15 phosphorylase. Som det anvendes her, betegner udtrykket ’’enzymanalog” en enhed, som er en forskellig forbindelse fra et naturligt enzym, men er ækvivalent i mindst én kemisk funktion eller biologisk funktion med et naturligt enzym. Enzymanalogen omfatter derfor en enhed, i hvilken én eller flere aminosyreanaloger er tilføjet eller substitueret i forhold til det oprindelige naturlige enzym. Enzymanalogen har en sådan addition 20 eller substitution, at dens funktion (fx α-phosphorylaseaktivitet eller termostabilitet) er i det væsentlige den samme som eller bedre end funktionen af det oprindelige naturlige enzym. En sådan enzymanalog kan fremstilles under anvendelse af teknikker, som er velkendte på området. Derfor kan enzymanalogen være en polymer indeholdende en aminosyreanalog. I den foreliggende beskrivelse omfatter "enzym” denne enzymana-25 log, medmindre andet er angivet.

I den foreliggende beskrivelse kan "aminosyren” være en naturlig aminosyre, en ikke-naturlig aminosyre, et aminosyrederivat eller en aminosyreanalog. En naturlig aminosyre foretrækkes.

Udtrykket "naturlig aminosyre” betegner en L-isomer af en naturlig aminosyre. En 30 naturlig aminosyre erglycin, alanin, valin, leucin, isoleucin, serin, methionin, threonin, phenylalanin, tyrosin, tryptophan, cystein, prolin, histidin, asparaginsyre, asparagin, glutaminsyre, glutamin, γ-carboxyglutaminsyre, arginin, ornithin og lysin. Medmindre andet er angivet, er alle aminosyrer, som der henvises til i den foreliggende beskrivelse, i L-form, og en udførelsesform, hvor der anvendes en aminosyre i D-form, er også 35 inden for rammerne af den foreliggende opfindelse.

53 DK 177092 B1

Udtrykket ”ikke-naturlig aminosyre” betegner en aminosyre, som sædvanligvis ikke findes i et protein i naturen. Eksempler på den ikke-naturlige aminosyre omfatter nor-leucin, para-nitrophenylalanin, homophenylalanin, para-fluorphenylalanin, 3-amino-2-benzylpropionsyre, en D-form eller en N-form af homoarginin og D-phenylalanin.

5 Udtrykket ’’aminosyrederivat” betegner en aminosyre, som opnås ved at derivatise- re en aminosyre.

Udtrykket ’’aminosyreanalog” betegner et molekyle, som ikke er en aminosyre, men ligner en aminosyre med hensyn til fysiske egenskaber og/eller funktion. Eksempler på en aminosyreanalog omfatter fx ethionin, canavanin og 2-methylglutamin.

10 I den foreliggende beskrivelse kan der henvises til en aminosyre med et hvilket som helst af de almindeligt kendte trebogstavssymboler og étbogstavssymboler, som anbefales af IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission. Der kan på tilsvarende måde henvises til et nukleotid med en almindeligt accepteret étbogstavskode.

α-glucanphosphorylase med forbedret termostabilitet, som omfatter en modifikation 15 på grund af substitution, addition eller deletion af én eller nogle få eller flere aminosyrer i forhold til aminosyresekvensen af naturlig α-glucanphosphorylase ud overden ønskede modifikation, er inden for rammerne af den foreliggende opfindelse. En sådan a-glu-canphosphorylase med forbedret termostabilitet, der omfatter substitution, addition eller deletion af én eller nogle få eller flere aminosyrer, kan fremstilles ved de fremgangs-20 måder, der er beskrevet i fx Molecular Cloning, A Laboratory Manual, anden udgave,

Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), Current Protocols in Molecular Biology,

Supplement 1-38, John Wiley & Sons (1987-1997), Nucleic Acids Research, 10, 6487 (1982), Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 79, 6409 (1982), Gene, 34, 315 (1985), Nucleic Acids Research 13, 443 (1985), Proc. Natl. Acad. Sci USA, 82, 488 (1985), Proc. Natl.

25 Acad. Sci., USA, 81, 5662 (1984), Science, 224, 1431 (1984), PCT WO 85/00817 (1985), Nature, 316, 601 (1985).

En α-glucanphosphorylase med forbedret termostabilitet ifølge den foreliggende opfindelse kan fremstilles under anvendelse af fremgangsmåder, som er velkendte på området. Deletion, substitution eller addition afen aminosyre i a-glucanphosphorylasen 30 med forbedret termostabilitet ifølge den foreliggende opfindelse kan fx udføres ved site-directed mutagenese, som er en velkendt teknik. Proceduren med site-directed mutagenese er velkendt på området, se fx Nucl. Acid Research, Vol.10, pp.6487-6500 (1982).

I den foreliggende beskrivelse henviser “substitution, addition eller deletion af én 35 eller nogle få eller flere aminosyrer” eller ’’substitution, addition eller deletion af mindst 54 DK 177092 B1 én aminosyre”, når det anvendes med hensyn til a-glucanphosphorylase med forbedret termostabilitet, til antallet af substitutioner, additioner eller deletioner i en sådan grad, at α-glucanphosphorylases enzymaktivitet ikke går tabt; enzymaktiviteten bliver fortrinsvis ækvivalent med eller bedre end en standard (fx naturlig a-glucanphosphoryla-5 se). Fagmanden på området kan let vælge α-glucanphosphorylase med forbedret termostabilitet med den ønskede beskaffenhed. Alternativt kan ønsket a-glucanphospho-rylase med forbedret termostabilitet syntetiseres direkte kemisk. En sådan kemisk syntesefremgangsmåde er velkendt på området.

Den således fremstillede α-glucanphosphorylase med forbedret termostabilitet iføl-10 ge den foreliggende opfindelse har fortrinsvis ca. 40%, mere foretrukket ca. 45%, mere foretrukket ca. 50%, mere foretrukket ca. 55%, mere foretrukket ca. 60%, mere foretrukket ca. 65%, mere foretrukket ca. 70%, mere foretrukket ca. 75%, mere foretrukket ca. 80%, mere foretrukket ca. 85%, mere foretrukket ca. 90%, mere foretrukket ca.

95% og mest foretrukket ca. 99% identitet med en aminosyresekvens af en første (na-15 turlig) α-glucanphosphorylase (fortrinsvis kartoffel type L a-glucanphosphorylase).

Efter design af den ovenfor nævnte ændring kan en aminosyres hydrofobicitetsin-deks tages i betragtning. Betydningen af et hydrofobt aminosyreindeks for at bibringe et protein en interagerende biologisk funktion er generelt anerkendt på området (Kyte, J. og Doolittle, R. F. J. Mol. Biol.157 (1): 105-132, 1982). En aminosyres hydrofobe 20 beskaffenhed bidrager til et produceret enzyms sekundære struktur og definerer da interaktion mellem proteinet og andre molekyler (fx enzym, substrat, receptor, DNA, antistof, antigen og lignende). En aminosyre tildeles et hydrofobicitetsindeks baseret på hydrofobicitet og beskaffenheden afen ladning deraf. De er: isoleucin (+4,5); valin (+4,2); leucin (+3,8); phenylalanin (+2,8); cystein/cystin (+2,5); methionin (+1,9); alanin 25 (+1,8); glycin (-0,4); threonin (-0,7); serin (-0,8); tryptophan (-0,9); tyrosin (-1,3); prolin (-1,6); histidin (-3,2); glutaminsyre (-3,5); glutamin (-3,5); asparaginsyre (-3,5); aspara-gin (-3,5); lysin (-3,9); og arginin (-4,5).

Det er velkendt på området at substituere en bestemt aminosyre med en anden aminosyre, som har et lignende hydrofobicitetsindeks, hvorved der kan produceres et 30 protein, som stadig har lignende biologiske funktioner (fx protein, som har ækvivalent enzymaktivitet). Ved en sådan aminosyresubstitution er et hydrofobicitetsindeks fortrinsvis inden for ±2, mere foretrukket inden for ±1, endnu mere foretrukket inden for ±0,5. Det vil forstås på området, at en sådan substitution af en aminosyre baseret på hydrofobicitet er effektiv. Som beskrevet i US-patent nr. 4.554.101 tildeles aminosyre-35 rester følgende hydrofilitetsindeks: arginin (+3,0); lysin (+3,0); asparaginsyre (+3,0 +1); 55 DK 177092 B1 glutaminsyre (+3,0 ±1); serin (+0,3); asparagin (+0,2); glutamin (+0,2); glycin (0); thre-onin (-0,4); prolin (-0,5+1); alanin (-0,5); histidin (-0,5); cystein (-1,0); methionin (-1,3); valin (-1,5); leucin (-1,8); isoleucin (-1,8); tyrosin (-2,3); phenylalanin (-2,5); og tryptophan (-3,4). Det er klart, at en aminosyre kan substitueres med en anden aminosyre, 5 som har et lignende hydrofilitetsindeks, og stadig kan tilvejebringe en biologisk ækvivalent. Ved en sådan aminosyresubstitution er hydrofilicitetsindekset fortrinsvis inden for ±2, mere foretrukket inden for +1 og endnu mere foretrukket inden for ±0,5.

I forbindelse med den foreliggende opfindelse betegner ’’konservativ substitution” substitution, ved hvilken hydrofilicitetsindekset og/eller hydrofobicitetsindekset ertilsva-10 rende som beskrevet ovenfor mellem den oprindelige aminosyre og en aminosyre, som skal substitueres ved aminosyresubstitution. Eksempler på konservativ substitution er velkendte for fagmanden på området og omfatter, men er ikke begrænset til, substitution blandt fx hver af følgende grupper: arginin og lysin; glutaminsyre og asparaginsyre; serin og threonin; glutamin og asparagin; og valin, leucin og isoleucin.

15 (3.2 Fremgangsmåde til bedømmelse af termostabilitet) α-glucanphosphorylasen med forbedret termostabilitet ifølge den foreliggende opfindelse har ét træk, idet enzymaktiviteten af a-glucanphosphorylase med forbedret termostabilitet ved 37°C, efter at den er opvarmet i en 20 mM citratbuffer (pH 6,7) ved 20 60°C i 10 minutter, er 20% eller mere af enzymaktiviteten af a-glucanphosphorylase med forbedret termostabilitet ved 37°C før opvarmning. Enzymaktiviteten af a-glucan-phosphorylase med forbedret termostabilitet ved 37°C efter opvarmning i en 20 mM citratbuffer (pH 6,7) ved 60°C i 10 minutter er fortrinsvis ca. 20% eller mere, mere foretrukket ca. 25% eller mere, mere foretrukket ca. 30% eller mere, mere foretrukket ca.

25 40% eller mere, mere foretrukket ca. 50% eller mere, mere foretrukket ca. 55% eller mere, mere foretrukket ca. 60% eller mere, endnu mere foretrukket ca. 65% eller mere, yderligere foretrukket ca. 70% eller mere, særligt foretrukket ca. 80% eller mere, mest foretrukket ca. 90% eller mere af enzymaktiviteten af α-glucanphosphorylase med forbedret termostabilitet ved 37°C før opvarmningen.

30 Enzymaktiviteten af α-glucanphosphorylase med forbedret termostabilitet ved 37°C

efter opvarmning i en 20 mM citratbuffer (pH 6,7) ved 65°C i 2 minutter er fortrinsvis ca.

40% eller mere, mere foretrukket ca. 45% eller mere, yderligere foretrukket ca. 50% eller mere, yderligere foretrukket ca. 55% eller mere, særligt foretrukket ca. 60% eller mere, mest foretrukket ca. 65% eller mere af enzymaktiviteten ved 37°C af a-glucan-35 phosphorylase med forbedret termostabilitet før opvarmningen.

56 DK 177092 B1 (3.2.1 Fremgangsmåde til måling af α-glucanphosphorylases (GP) aktivitet)

Denne fremgangsmåde til måling af GP-enzymaktivitet kvantificerer fri uorganisk phosphorsyre (Pi) produceret ud fra G-1-P.

5 (i) 200 pi af en reaktionsopløsning (indeholdende 12,5 mM G-1-P, 1% dextrin og en enzymopløsning i en 100 mM acetatbuffer (pH 6,0)) inkuberes ved 37°C i 15 minutter.

(ii) 800 μΙ af et molybdænreagens (15 mM ammoniummolybdat, 100 mM zinkacetat) tilsættes, og dette omrøres for at standse reaktionen.

(iii) 200 μΙ 568 mM ascorbinsyre (pH 5,8) tilsættes, efterfulgt af blanding.

10 (iv) Efter inkubation ved 37°C i 15 minutter måles absorbansen ved 850 nm under anvendelse af et spektrofotometer.

(v) Absorbansen måles på tilsvarende måde under anvendelse af uorganisk phosphorsyre, der har en kendt koncentration, og der produceres en standardkurve.

(vi) En absorbansværdi, der er opnået for en prøve, tilpasses til denne standard- 15 kurve, og mængden af uorganisk phosphorsyre i prøven bestemmes. Uorganisk phosphorsyre kvantificeres som en phosphorsyreion. Mængden af glucose-1-phosphat kvantificeres ikke. I den foreliggende beskrivelse defineres én enhed a-glucanphospho-rylaseaktivitet som den aktivitet, der producerer 1 μ mol uorganisk phosphorsyre (Pi) i ét minut, som én enhed (U), målt ved denne målemetode.

20 (3.2.2 Fremgangsmåde til måling af termostabilitet)

Termostabilitet måles ved følgende fremgangsmåde.

(i) 0,2 U/ml af en enzymopløsning (i 20 mM citratbuffer (pH 6,7)) inkuberes ved 55°C, 60°C eller 65°C i fra 0 til 60 minutter.

25 (ii) En prøve af enzymopløsningen tages ved en række tidspunkter og holdes på is.

(iii) Enzymopløsningsprøverne fra (ii) fortyndes 10 gange, og enzymaktivitet måles ifølge en GP-aktivitetsmålemetode. Et forhold af enzymaktivitet Aefter for a-glucanphos-phorylase med forbedret termostabilitet ved 37°C efter opvarmning i en 20 mM citratbuffer (pH 6,7) ved 60°C i 10 minutter beregnes ud fra enzymaktivitet Afør ved 30 37°C for α-glucanphosphorylasen med forbedret termostabilitet før opvarmning ved (Aefter) / (Afør) x 100 (%). Et forhold af enzymaktivitet Aefter for a-glucanphosphorylasen med forbedret termostabilitet efter opvarmning i forhold til enzymaktivitet Afør for a-glucanphosphorylasen med forbedret termostabilitet før opvarmning betegnes også som restaktivitet.

35 57 DK 177092 B1 (3.3 Fremgangsmåde til bedømmelse af evne til at syntetisere amylose) a-glucanphosphorylasen med forbedret termostabilitet ifølge den foreliggende opfindelse har det træk, at den har evne til at syntetisere en glucan (især amylose), der har en vægtgennemsnitlig molekylvægt på fortrinsvis ca. 60 kDa eller mere, mere 5 foretrukket ca. 100 kDa eller mere, yderligere foretrukket ca. 150 kDa eller mere, yderligere foretrukket ca. 200 kDa eller mere, yderligere foretrukket ca. 250 kDa eller mere, yderligere foretrukket ca. 300 kDa eller mere, yderligere foretrukket ca. 350 kDa eller mere, yderligere foretrukket ca. 400 kDa eller mere, yderligere foretrukket ca. 450 kDa eller mere, yderligere foretrukket ca. 500 kDa eller mere, yderligere foretrukket ca. 550 10 kDa eller mere, yderligere foretrukket ca. 600 kDa eller mere, mest foretrukket ca. 650 kDa eller mere. En glucan, der har en vægtgennemsnitlig molekylvægt på fra ca. 5 kDa til ca. 599 kDa, er tungt opløselig i vand, mens en glucan, der har en vægtgennemsnitlig molekylvægt på ca. 600 kDa eller mere, har den særlige fordel, at den er vandopløselig. En vægtgennemsnitlig molekylvægt for en glucan, der er syntetiseret af a-glucan-15 phosphorylasen med forbedret termostabilitet ifølge den foreliggende opfindelse, har ikke en bestemt øvre grænse, men en glucan på op til 1000 kDa, op til 10.000 kDa, op til 100.000 kDa, kan syntetiseres med udmærket produktivitet.

"Har evne til at syntetisere amylose med en vægtgennemsnitlig molekylvægt på 60 kDa eller mere” betegner, at den vægtgennemsnitlige molekylvægt for amylose, der er 20 syntetiseret ved inkubation ved 37°C i 18 timer under anvendelse af 40 μΜ maltotetra-ose, 250 mM glucose-1-phosphat, en 200 mM acetatbuffer (pH 5,5) og en 4 U/ml reaktionsopløsning af α-glucanphosphorylase med forbedret termostabilitet (oprenset enzym), er 60 kDa eller mere. Evnen til at syntetisere amylose med en anden vægtgennemsnitlig molekylvægt defineres på lignende måde, og "har evne til at syntetisere 25 amylose med en vægtgennemsnitlig molekylvægt på 600 kDa eller mere” betegner fx, at den vægtgennemsnitlige molekylvægt for amylose, der er syntetiseret under disse betingelser, er 600 kDa eller mere.

En vægtgennemsnitlig molekylvægt for amylose kan fx måles ved følgende fremgangsmåde.

30 Først opløses syntetiseret amylose fuldstændigt i 1N natriumhydroxid, dette neutra liseres med en egnet mængde saltsyre, og ca. 30 til 300 pg af en alikvot af amylose underkastes gelfiltreringskromatografi under anvendelse af både et differentia le-refraktometer og en flervinklet lysspredningsdetektor, hvorved der opnås en gennemsnitlig molekylvægt.

58 DK 177092 B1

Som søjle anvendes mere specifikt Shodex SB806M-HQ (fremstillet af SHOWA DENKO K.K.), og som detektor anvendes en flervinklet lysspredningsdetektor (DAWN-DSP, fremstillet af Wyatt Technology) og et differentiale-refraktometer (Shodex RI-71, fremstillet af SHOWA DENKO K.K.) ved at forbinde dem i denne rækkefølge. En søjle 5 holdes ved 40°C, og en 0,1 M natriumnitratopløsning anvendes som eluent ved en strømningshastighed på 1 ml/minut. Det resulterende signal opsamles under anvendelse af et dataanalysesoftware (handelsnavn ASTRA, fremstillet af Wyatt Technology) og analyseres under anvendelse af det samme software, hvorved der opnås en vægtgennemsnitlig molekylvægt.

10 (3.4 Fremgangsmåde til bedømmelse af lagerstabilitet) α-glucanphosphorylasen med forbedret termostabilitet ifølge den foreliggende opfindelse har fortrinsvis forbedret lagerstabilitet i sammenligning med naturlig a-glucan-phosphorylase. I den foreliggende beskrivelse betegner ’’forbedret lagerstabilitet”, at 15 enzymet knap nok nedbrydes under lagring i sammenligning med naturlig a-glucan-phosphorylase.

I én udførelsesform henviser lagerstabilitet til stabilitet ved lagring ved 4°C. Når a-glucanphosphorylasen med forbedret termostabilitet ifølge den foreliggende opfindelse i dette tilfælde lagres ved 4°C i et bestemt tidsrum efter oprensning, er enzymproteinets 20 molekylvægt næsten ækvivalent med molekylvægten umiddelbart efter oprensning.

Når naturlig α-glucanphosphorylase lagres ved 4°C i lang tid, nedbrydes den generelt, og enzymproteinets molekylvægt reduceres i sammenligning med umiddelbart efter oprensning. Efter at α-glucanphosphorylasen med forbedret termostabilitet ifølge den foreliggende opfindelse fortrinsvis lagres ved 4°C i 1 måned, mere foretrukket lagres 25 ved 4°C i 3 måneder, mest foretrukket lagres ved 4°C i 5 måneder, har den en molekyl vægt, der omtrent er ækvivalent med molekylvægten umiddelbart efter oprensning.

I et andet aspekt henviser lagerstabilitet til stabilitet ved lagring ved 37°C. Når a-glucanphosphorylasen med forbedret termostabilitet ifølge den foreliggende opfindelse i dette tilfælde lagres ved 37°C i et bestemt tidsrum efter oprensning, er enzymprotei-30 nets molekylvægt omtrent ækvivalent med molekylvægten umiddelbart efter oprensning. Når naturlig α-glucanphosphorylase lagres ved 37°C i lang tid, nedbrydes den generelt, og enzymproteinets molekylvægt reduceres i sammenligning med umiddelbart efter oprensning. Efter at α-glucanphosphorylasen med forbedret termostabilitet ifølge den foreliggende opfindelse fortrinsvis lagres ved 37°C i 4 dage, mere foretrukket 35 lagres ved 37°C i 7 dage, mest foretrukket lagres ved 37°C i 10 dage, har den i et an- 59 DK 177092 B1 det aspekt en molekylvægt, som omtrent er ækvivalent med molekylvægten umiddelbart efter oprensning.

α-glucanphosphorylasen med forbedret termostabilitet ifølge den foreliggende opfindelse kan naturligvis lagres ved en hvilken som helst temperatur, der normalt anven-5 des til lagring. En temperatur, der anvendes til lagring, kan være en hvilken som helst temperatur mellem ca. 4°C til ca. 37°C (fx ca. 4°C, ca. 5°C, ca. 10°C, ca. 20°C, ca.

25°C, ca. 37°C og lignende).

Lagerstabilitet kan bedømmes ved en hvilken som helst fremgangsmåde, der er kendt på området. Et enzymprotein umiddelbart efter oprensning og et enzymprotein, 10 som er blevet lagret ved en forudbestemt temperatur i et bestemt tidsrum, underkastes fx polyacrylamid-gelelektroforese (nativ PAGE), og lagerstabilitet kan bedømmes ved at sammenligne disse enzymproteiners molekylvægt.

(4. Fremgangsmåde til fremstilling af glucan under anvendelse af enzymet ifølge den 15 foreliggende opfindelse) α-glucanphosphorylasen med forbedret termostabilitet ifølge den foreliggende opfindelse kan med fordel anvendes i en fremgangsmåde til syntese af en glucan. En fremgangsmåde til syntese af en glucan under anvendelse af a-glucanphosphorylasen med forbedret termostabilitet ifølge den foreliggende opfindelse kan være en hvilken 20 som helst fremgangsmåde til syntese af en glucan, som kendes på området, men det foretrækkes at anvende den foreliggende α-glucanphosphorylase i en fremgangsmåde (også betegnet SP-GP-fremgangsmåde) til reaktion af saccharosephosphorylase og en α-glucanphosphorylase på saccharose og en primer på samme tid. SP-GP-fremgangsmåden har den fordel, at der kan fremstilles en ligekædet glucan under an-25 vendelse af et billigt substrat.

En fremgangsmåde til syntese af en glucan ifølge den foreliggende opfindelse omfatter reaktion af en reaktionsopløsning indeholdende α-glucanphosphorylasen med forbedret termostabilitet ifølge den foreliggende opfindelse, en saccharosephosphorylase, saccharose, en primer og uorganisk phosphorsyre eller glucose-1-phosphat til 30 fremstilling af en glucan.

Fremgangsmåden til syntese af en glucan ifølge den foreliggende opfindelse kan være en fremgangsmåde, der ikke er baseret på en SP-GP-fremgangsmåde. I tilfælde af en sådan fremgangsmåde omfatter fremgangsmåden til syntese af en glucan ifølge den foreliggende opfindelse reaktion af en reaktionsopløsning, der indeholder a- 60 DK 177092 B1 glucanphosphorylasen med forbedret termostabilitet ifølge den foreliggende opfindelse, en primer og glucose-1-phosphat, til fremstilling af en glucan.

I den foreliggende beskrivelse betegner ’’glucan” et saccharid, der indeholder D-glucose som bestanddel og har mindst to saccharidenheder eller mere af en saccharid-5 enhed bundet med en a-1,4-glucosidbinding. En glucan kan være et ligekædet, forgrenet eller cyklisk molekyle. En ligekædet glucan har samme betydning som a-1,4-glu-can. I en ligekædet glucan er saccharidenheder kun bundet med en a-1,4-glucosid-binding. En glucan, der indeholder én eller flere a-1,6-glucosidbindinger, er en forgrenet glucan. En glucan indeholder fortrinsvis i nogen grad en ligekædet del. En ligekæ-10 det glucan uden nogen forgrening er mere foretrukket.

Det foretrækkes, at en glucan har et lille antal (dvs. antallet af a-1,6-glucosidbindin-ger) forgreninger i nogle tilfælde. I sådanne tilfælde er antallet af forgreninger repræsentativt 0 til 10.000, fortrinsvis 0 til 1000, mere foretrukket 0 til 500, yderligere foretrukket 0 til 100, yderligere foretrukket 0 til 50, yderligere foretrukket 0 til 25, yderligere 15 foretrukket 0.

I glucanen ifølge den foreliggende opfindelse er forholdet mellem antallet af a-1,4-glucosidbindinger og antallet af a-1,6-glucosidbindinger, idet a-1,6-glucosidbindingen lades være 1, fortrinsvis 1 til 10.000, mere foretrukket 2 til 5000, yderligere foretrukket 5 til 1000, yderligere foretrukket 10 til 500.

20 a-1,6-glucosidbinding kan være vilkårligt fordelt i en glucan eller kan være ensartet fordelt. En fordeling i et sådant omfang, at der dannes en ligekædet del på 5 eller flere saccharidenheder i en glucan, foretrækkes.

En glucan kan være konstrueret kun af D-glucose eller kan være et derivat, der er modificeret i en sådan grad, at en sådan glucans beskaffenhed ikke forringes. Det fore-25 trækkes, at glucanen ikke er modificeret.

En glucan har en molekylvægt på repræsentativt ca. 8x103 eller mere, fortrinsvis ca. 1x104 eller mere, mere foretrukket ca. 5x104 eller mere, yderligere foretrukket ca.

1x105 eller mere, yderligere foretrukket ca. 6x105 eller mere. En glucan har en molekylvægt på repræsentativt ca. 1x108 eller mindre, fortrinsvis ca. 3x107 eller mindre, mere 30 foretrukket ca. 1x107 eller mindre, yderligere foretrukket ca. 5x10® eller mindre, yderligere foretrukket ca. 1x106 eller mindre. I forbindelse med den foreliggende opfindelse henviser en glucans molekylvægt til en vægtgennemsnitlig molekylvægt, medmindre andet er beskrevet.

Fagmanden på området kan let forstå, at en glucan med en ønsket molekylvægt 35 opnås ved på passende måde at vælge en mængde af et substrat, en mængde af et 61 DK 177092 B1 enzym, en reaktionstid og lignende, som anvendes i fremstillingsfremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse.

SP-GP-fremgangsmåden, som har udmærket produktivitet, er beskrevet i international publikation nr. WO 02/097107.

5 Ved fremstillingsfremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse anvendes fx a-glucanphosphorylase med forbedret termostabilitet, saccharosephosphorylase, saccharose, en primer, uorganisk phosphorsyre eller glucose-1-phosphat, en buffer og et opløsningsmiddel, som opløser det, som hovedmaterialer. Sædvanligvis tilsættes alle disse materialer ved reaktionens påbegyndelse, og et hvilket som helst materiale 10 blandt dem kan desuden tilsættes under reaktionen. Ved fremstillingsfremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse kan der om nødvendigt anvendes et enzym valgt fra gruppen bestående af et "debranching” enzym, et "branching” enzym, 4-a-glucano-transferase og glycogen-’debranching” enzym. Et enzym, der er valgt fra gruppen bestående af: et "debranching” enzym, et "branching” enzym, 4-a-glucanotransferase og 15 et glycogen-’debranching” enzym, kan tilsættes til en reaktionsopløsning fra begyndelsen af fremstillingsfremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse eller kan tilsættes til en reaktionsopløsning midtvejs, afhængigt af den ønskede glucanstruktur.

I den foreliggende beskrivelse henviser "saccharosephosphorylase” til et hvilket som helst enzym, som omdanner en α-glycosylgruppe i saccharose til en phosphat-20 gruppe til udførelse af phosphorolyse. En reaktion, der katalyseres af saccharosephosphorylase, repræsenteres af følgende ligning:

Saccharose + uorganisk phosphorsyre <-> a-D-glucose-1-phosphat + D-fructose Saccharosephosphorylase er indeholdt i forskellige organismer i den naturlige verden. Eksempler på en organisme, der producerer saccharosephosphorylase, omfatter, 25 men er ikke begrænset til, bakterier, som tilhører slægten Streptococcus (fx Streptococcus thermophilus, Streptococcus mutans, Streptococcus pneumoniae og Streptococcus mitis), Leuconostoc mesenteroides, Pseudomonas sp., Clostridium sp., Pullula-ria pullulans, Acetobacterxylinum, Agrobacterium sp., Synecococcus sp., E. coli, Listeria monocytogenes, Bifidobacterium adolescentis, Aspergillus niger, Monilia sitophila, 30 Sclerotinea escerotiorum og Chlamydomonas sp.

Saccharosephosphorylase kan afledes af en hvilken som helst organisme, der producerer saccharosephosphorylase. Det foretrækkes, at saccharosephosphorylase i nogen grad har termostabilitet. Det er mere foretrukket, at saccharosephosphorylase, når den er til stede alene, har højere termostabilitet. Det foretrækkes fx, at når saccha-35 rosephosphorylase opvarmes ved 55°C i 30 minutter i nærværelse af 4% saccharose, 62 DK 177092 B1 bevares aktivitet, som er 20% eller mere af aktiviteten af saccharosephosphorylase før opvarmning. Saccharosephosphorylase kan fortrinsvis afledes af en bakterie valgt fra gruppen bestående af: Streptococcus mutans, Streptococcus pneumoniae, Leucono-stoc mesenteroides, Oenococcus oeni, Bifidobacterium longum, Agrobacterium vitis, 5 Pseudomonas saccharophila, Escherichia coli og Listeria innocua, den kan mere foretrukket afledes af en bakterie valgt fra gruppen bestående af: Streptococcus mutans,

Streptococcus pneumoniae, Leuconostoc mesenteroides og Oenococcus oeni, og den kan yderligere foretrukket afledes af Streptococcus mutans eller Streptococcus pneumoniae.

10 Saccharose er et disaccharid, som har en molekylvægt på ca. 342, repræsenteret af C12H22O11. Saccharose findes i alle planter, som har evne til fotosyntese. Saccharose kan isoleres fra en plante eller kan syntetiseres kemisk. Ud fra et omkostningssynspunkt foretrækkes det, at saccharose isoleres fra en plante. Eksempler på en plante, der indeholder en stor mængde saccharose, omfatter sukkerrør og sukkerroe. Saft fra 15 sukkerrør indeholder ca. 20% saccharose. Sukkerroesaft indeholder ca. 10 til 15% saccharose. Saccharose kan tilvejebringes i et hvilket som helst oprensningstrin fra saften fra en plante indeholdende saccharose til oprenset sukker.

Henholdsvis α-glucanphosphorylase med forbedret termostabilitet og saccharosephosphorylase, som anvendes i fremstillingsfremgangsmåden ifølge den foreliggen-20 de opfindelse, kan anvendes i en reaktion, selv når de er immobiliseret, uanset om det er et oprenset enzym eller et råt enzym, og reaktionsformatet kan være et batchformat eller et kontinuerligt format. Som immobiliseringsmetode kan der anvendes en bærerbindingsmetode (fx kovalent bindingsmetode, ionbindingsmetode eller fysisk adsorptionsmetode), en tværbindingsmetode eller en inklusionsmetode (gittertype eller mikro-25 kapseltype).

Eksempler på en primer omfatter maltooligosaccharid, amylose, amylopectin, glycogen, dextrin, pullulan, koblingssukker, stivelse og et derivat deraf.

I den foreliggende beskrivelse henviser uorganisk phosphorsyre til et stof, som kan donere et phosphatsubstrat i reaktionen af SP. I den foreliggende beskrivelse henviser 30 et phosphatsubstrat til et stof, som er et råmateriale for phosphatdelen af glucose-1- phosphat. Det antages, at uorganisk phosphorsyre ved saccharosephosphorolyse, som katalyseres af saccharosephosphorylase, virker som substrat i form af en phosphation.

Eftersom dette substrat konventionelt kaldes uorganisk phosphorsyre inden for området, kaldes dette substrat også uorganisk phosphorsyre i den foreliggende beskrivelse.

35 Uorganisk phosphorsyre omfatter phosphorsyre og et uorganisk salt af phosphorsyre.

63 DK 177092 B1 Sædvanligvis anvendes uorganisk phosphorsyre i vand indeholdende en kation såsom en alkalimetalion. Da phosphorsyre, et phosphatsalt og en phosphation er i en ligevægtstilstand, er det i dette tilfælde ikke muligt at skelne mellem phosphorsyre og et phosphatsalt. For nemheds skyld kaldes phosphorsyre og et phosphat derfor kollektivt 5 uorganisk phosphorsyre. I forbindelse med den foreliggende opfindelse er uorganisk phosphorsyre fortrinsvis et hvilket som helst metalsalt af phosphorsyre, mere foretrukket et alkalimetalsalt af phosphorsyre. Foretrukne specifikke eksempler på uorganisk phosphorsyre omfatter natriumdihydrogenphosphat, dinatriumhydrogenphosphat, tri-natriumphosphat, kaliumdihydrogenphosphat, dikaliumhydrogenphosphat, trikalium-10 phosphat, phosphorsyre (H3P04), ammoniumdihydrogenphosphat og diammonium-hydrogenphosphat.

Kun én type eller en flerhed af typer af uorganiske phosphorsyrer kan være indeholdt i et SP-GP-reaktionssystem ved reaktionens påbegyndelse.

Uorganisk phosphorsyre kan fx tilvejebringes ved at nedbryde et phosphorsyrekon-15 densat såsom polyphosphorsyre (fx pyrophosphorsyre, triphosphorsyre og tetra- phosphorsyre) eller et salt deraf ved en fysisk, kemisk eller enzymatisk reaktion og tilsætte dette til en reaktionsopløsning.

I den foreliggende beskrivelse henviser glucose-1-phosphat til glucose-1 -phosphat (C6Hi309P) og et salt deraf. Glucose-1-phosphat er fortrinsvis et hvilket som helst me-20 talsalt af glucose-1-phosphat (C6Hi309P) i en snæver betydning, mere foretrukket et hvilket som helst alkalimetalsalt af glucose-1-phosphat (C6Hi309P). Foretrukne specifikke eksempler på glucose-1-phosphat omfatter dinatriumglucose-1-phosphat, dika-liumglucose-1-phosphat og glucose-1-phosphat (C6Hi309P). I den foreliggende beskrivelse betegner glucose-1-phosphat, hvis kemiske formel ikke er angivet i parentes, 25 glucose-1-phosphat i vid betydning, dvs. glucose-1-phosphat (C6H1309P) i en snæver betydning og et salt deraf.

Kun én type eller en flerhed af typer af glucose-1-phosphater kan være indeholdt i et SP-GP-reaktionssystem ved reaktionens påbegyndelse.

Ved fremgangsmåden til fremstilling af en glucan ifølge den foreliggende opfindelse 30 kan der om nødvendigt anvendes et ”debranching”-enzym, når der dannes en forgrening i produktet, såsom når der anvendes et udgangsmateriale indeholdende en a-1,6-glucosidbinding.

Et ”debranching”-enzym, som kan anvendes i den foreliggende opfindelse, er et enzym, som kan spalte en a-1,6-glucosidbinding. Et ”debranching”-enzym klassificeres 35 i to typer isoamylase (EC 3.2.1.68), der virker godt på både amylopectin og glycogen, 64 DK 177092 B1 og a-dextrin-endo-1,6-a-glucosidase (også betegnet pullulanase) (EC 3.2.1.41), der virker på amylopectin, glycogen og pullulan.

Et ”debranching”-enzym er til stede i mikroorganismer, bakterier og planter. Eksempler på en mikroorganisme, som producerer et ”debranching”-enzym, omfatter 5 Saccharomyces cerevisiae og Chlamydomonas sp. Eksempler på en bakterie, som producerer et ”debranching”-enzym, omfatter Bacillus brevis, Bacillus acidopullulyticus,

Bacillus macerans, Bacillus stearothermophilus, Bacillus circulans, Thermus aquaticus,

Klebsiella pneumoniae, Thermoactinomyces thalpophilus, Thermoanaerobacter etha-nolicus og Pseudomonas amyloderamosa. Eksempler på en plante, som producerer et 10 ”debranching”-enzym, omfatter kartoffel, sød kartoffel, majs, ris, hvede, byg, havre og sukkerroe. En organisme, som producerer et ”debranching”-enzym, er ikke begrænset til ovenstående eksempler.

Ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen kan der om nødvendigt anvendes et ”branching”-enzym, hvis det ønskes at danne en forgrening i produktet.

15 Et ”branching”-enzym, som kan anvendes i den foreliggende opfindelse, er et en zym, som kan overføre en del af en a-1,4-glucankæde til position 6 af en bestemt glu-coserest i denne a-1,4-glucankæde til dannelse af en forgrening. Et ”branching”-enzym kaldes også et 1,4-a-glucan-”branching”-enzym, et forgreningsdannende enzym eller et Q-enzym.

20 Et ”branching”-enzym er til stede i en mikroorganisme, et dyr og en plante. Eksem pler på en mikroorganisme, som producerer et ”branching”-enzym, omfatter Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis, Bacillus caldolyticus, Bacillus lichecniformis, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus coagulans, Bacillus caldovelox, Bacillus thermocate-nulatus, Bacillus smithii, Bacillus megaterium, Bacillus brevis, alkalofil Bacillus sp., 25 Streptomyces coelicolor, Aquifex aeolicus, Synechosystis sp., E. coli, Agrobacterium tumefaceins, Thermus aquaticus, Rhodothermus obamensis, Neurospora crassa og gær. Eksempler på et dyr, som producerer et ”branching”-enzym, omfatter pattedyr såsom menneske, kanin, rotte og svin. Eksempler på planter, som producerer et ”bran-ching”-enzym, omfatter alger; rodknold- og rodafgrøder såsom kartofler, sød kartoffel, 30 yams og kassava; grønsager såsom spinat; kornsorter såsom majs, ris, hvede, byg, rug og kolbehirse; og bønner såsom ærter, sojabønner, adzukibønner og brogede havebønner. En organisme, som producerer et ”branching”-enzym, er ikke begrænset til ovenstående eksempler.

Ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen kan der om nødvendigt anvendes 4-a-glu-35 canotransferase, når der dannes en cyklisk struktur i produktet.

65 DK 177092 B1 4-a-glucanotransferase, som kan anvendes i den foreliggende opfindelse, kaldes også et disproportionerende enzym, et D-enzym eller amylomaltase, og er et enzym, som kan katalysere en sukkeromdannende reaktion (disproportionerende reaktion) af maltooligosaccharid. 4-a-glucanotransferase er et enzym, som overfører en glucosyl-5 gruppe eller en maltosyl- eller maltooligosyl-enhed fra en ikke-reducerende terminal af et donormolekyle til en ikke-reducerende terminal af et acceptormolekyle. En enzymreaktion fører derfor til disproportion af polymerisationsgraden af maltooligosaccharid, som først var givet. Når et donormolekyle og et acceptormolekyle er det samme, forårsages en intramolekylær overførsel, og som et resultat heraf opnås der et produkt med 10 en cyklisk struktur.

4-a-glucanotransferase er til stede i mikroorganismer og planter. Eksempler på en mikroorganisme, som producerer 4-a-glucanotransferase, omfatter Aquifex aeolicus,

Streptococcus pneumoniae, Clostridium butylicum, Deinococcus radiodurans, Haemophilus influenzae, Mycobacterium tuberculosis, Thermococcus litralis, Thermotoga ma-15 ritima, Thermotoga neapolitana, Chlamydia psittaci, Pyrococcus sp., Dictyoglomus thermophilum, Borrelia burgdorferi, Synechosystis sp., E. coli og Thermus aquaticus.

Eksempler på planter, som producerer 4-a-glucanotransferase, omfatter rodknold- og rodafgrøder såsom kartofler, søde kartofler, yams og kassava; kornsorter såsom majs, ris og hvede; og bønner såsom ærter og sojabønner. En organisme, som producerer 4-20 α-glucanotransferase, er ikke begrænset til ovenstående eksempler.

Ved fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse kan der om nødvendigt anvendes et glycogen-”debranching”-enzym, når der dannes en cyklisk struktur i et produkt.

Et glycogen-”debranching”-enzym, som kan anvendes i den foreliggende opfindel-25 se, er et enzym, som har to typer aktiviteter, a-1,6-glucosidaseaktivitet og 4-a-glucano-transferaseaktivitet. Da et glycogen-”debranching”-enzym har 4-a-glucanotransferase-aktivitet, opnås der et produkt med en cyklisk struktur.

Et glycogen-”debranching”-enzym er til stede i mikroorganismer og dyr. Eksempler på en mikroorganisme, som producerer et glycogen-”debranching”-enzym, omfatter 30 gær. Eksempler på dyr, som producerer et glycogen-”debranching”-enzym, omfatter pattedyr såsom menneske, kanin, rotte og svin. En organisme, som producerer et gly-cogen-”debranching”-enzym, er ikke begrænset til ovenstående eksempler.

Et opløsningsmiddel, som anvendes i fremstillingsfremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse, kan være et hvilket som helst opløsningsmiddel, når blot det er et 66 DK 177092 B1 opløsningsmiddel, som ikke forringer enzymaktiviteten af saccharosephosphorylase og a-glucanphosphorylase.

Så vidt som en reaktion, der producerer en glucan, kan forløbe, er det ikke nødvendigt, at et opløsningsmiddel fuldstændigt opløser materialer, som anvendes i frem-5 stillingsfremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse. Når et enzym bæres på en fast bærer, er det fx ikke nødvendigt, at et enzym opløses i et opløsningsmiddel.

Det er endvidere ikke nødvendigt, at alle reaktionsmaterialerne såsom saccharose er opløst, og det er tilstrækkeligt, at en del af materialerne er opløst i et sådant omfang, at en reaktion kan forløbe.

10 Et repræsentativt opløsningsmiddel er vand. Et opløsningsmiddel kan være vand i et cellelysat, ledsagende saccharosephosphorylase eller α-glucanphosphorylase efter fremstillingen af saccharosephosphorylase eller a-glucanphosphorylase.

Et hvilket som helst andet stof kan være indeholdt i en opløsning indeholdende en α-glucanphosphorylase, en saccharosephosphorylase, saccharose, en primer og uor-15 ganisk phosphorsyre eller glucose-1-phosphat, når blot interaktion mellem saccharo-sephosphorylasen og saccharose og interaktion mellem a-glucanphosphorylasen og primeren ikke hæmmes. Eksempler på et sådant stof omfatter en buffer, en bestanddel af en mikroorganisme, der producerer α-glucanphosphorylase (fx bakterie, svamp), en bestanddel af en mikroorganisme, der producerer saccharosephosphorylase (fx bakte-20 rie, svamp), salte og en mediekomponent.

Mængder af disse materialer, som skal anvendes, er kendte og kan vælges på passende måde af fagmanden på området.

Ved fremstillingsfremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse fremstilles der først en reaktionsopløsning. En reaktionsopløsning kan fx fremstilles ved at tilsætte en 25 α-glucanphosphorylase, en saccharosephosphorylase, fast saccharose, en primer og uorganisk phosphorsyre eller glucose-1-phosphat til et egnet opløsningsmiddel. Alternativt kan en reaktionsopløsning fremstilles ved at blande opløsninger, der hver især indeholder en α-glucanphosphorylase, en saccharosephosphorylase, saccharose, en primer eller uorganisk phosphorsyre eller glucose-1-phosphat. Alternativt kan en reak-30 tionsopløsning fremstilles ved at blande andre faste bestanddele til en opløsning, der indeholder nogle bestanddele blandt en α-glucanphosphorylase, en saccharosephosphorylase, saccharose, en primer og uorganisk phosphorsyre eller glucose-1-phosphat. En hvilken som helst buffer kan om nødvendigt tilsættes til denne reaktionsopløsning med det formål at justere pH, når blot den ikke inhiberer en enzymreaktion.

35 Til denne reaktionsopløsning kan der om nødvendigt tilsættes et enzym valgt fra grup- 67 DK 177092 B1 pen bestående af: et ”debranching”-enzym, et ”branching”-enzym, 4-a-glucanotransfe-rase og et glycogen-”debranching”-enzym.

En reaktionsopløsning opvarmes derefter om nødvendigt ved de fremgangsmåder, der er kendte på området, for at reagere den. En reaktionstemperatur kan være en 5 hvilken som helst temperatur, når blot opfindelsens virkning opnås. Når saccharose- koncentrationen i en reaktionsopløsning ved reaktionens påbegyndelse er ca. 5% til ca.

100%, kan en reaktionstemperatur repræsentativt være en temperatur på ca. 30°C til ca. 75°C. Det foretrækkes, at temperaturen afen opløsning i dette reaktionstrin er en sådan temperatur, at aktivitet (aktiviteter), som er ca. 20% eller mere, fortrinsvis ca.

10 30% eller mere af aktiviteten af mindst én af, fortrinsvis aktiviteter af både saccharo- sephosphorylase og a-glucanphosphorylase, som er indeholdt i denne opløsning før en reaktion, forbliver efter en forudbestemt reaktionstid. Denne temperatur er fortrinsvis ca. 55°C til ca. 75°C, mere foretrukket ca. 60°C til ca. 75°C, yderligere foretrukket ca.

60°C til ca. 70°C, særligt foretrukket ca. 60°C til ca. 65°C.

15 En reaktionstid kan sættes til at være en hvilken som helst tid i lyset af reaktions temperaturen, molekylvægten af en glucan, som produceres ved reaktionen, og et enzyms restaktivitet. En reaktionstid er repræsentativt ca. 1 time til ca. 100 timer, mere foretrukket ca. 1 time til ca. 72 timer, endnu mere foretrukket ca. 2 timer til ca. 36 timer, mest foretrukket ca. 2 timer til ca. 24 timer.

20 På denne måde fremstilles en opløsning indeholdende en glucan.

(5. Fremgangsmåde til syntese af glucose-1-phosphat under anvendelse af et enzym ifølge den foreliggende opfindelse) α-glucanphosphorylase med forbedret termostabilitet ifølge den foreliggende opfin- 25 delse kan også med fordel anvendes i en fremgangsmåde til syntese af glucose-1- phosphat. En fremgangsmåde til syntese af glucose-1-phosphat under anvendelse af α-glucanphosphorylase med forbedret termostabilitet ifølge den foreliggende opfindelse kan være en hvilken som helst fremgangsmåde til syntese af glucose-1-phosphat, som er kendt på området.

30 En fremgangsmåde til syntese af glucose-1-phosphat ifølge den foreliggende op findelse omfatter reaktion af en reaktionsopløsning indeholdende a-glucanphosphorylase med forbedret termostabilitet ifølge den foreliggende opfindelse, en glucan og uorganisk phosphorsyre til fremstilling af glucose-1-phosphat.

68 DK 177092 B1

Definitionen af en glucan og uorganisk phosphorsyre, der anvendes i en fremgangsmåde til syntese af glucose-1-phosphat ifølge den foreliggende opfindelse, er den samme som i ovennævnte 4.

Mængder af materialer, der skal anvendes i en fremgangsmåde til syntese af glu-5 cose-1-phosphat, er kendte og kan vælges på passende måde af fagmanden på området.

Ved en fremgangsmåde til syntese af glucose-1-phosphat ifølge den foreliggende opfindelse fremstilles der først en reaktionsopløsning. En reaktionsopløsning kan fx fremstilles ved at tilsætte α-glucanphosphorylase, en glucan og uorganisk phosphorsy-10 re til et egnet opløsningsmiddel. Alternativt kan en reaktionsopløsning fremstilles ved at blande opløsninger, der hver især indeholder α-glucanphosphorylase, en glucan eller uorganisk phosphorsyre. Alternativt kan en reaktionsopløsning fremstilles ved at blande andre faste bestanddele til en opløsning indeholdende nogle bestanddele blandt a-glucanphosphorylase, en glucan og uorganisk phosphorsyre. Til denne reaktionsop-15 løsning kan der om nødvendigt tilsættes en hvilken som helst buffer med det formål at justere pH, når blot den ikke inhiberer en enzymreaktion. Til denne reaktionsopløsning kan der om nødvendigt tilsættes et ”debranching”-enzym.

Derefter opvarmes reaktionsopløsningen om nødvendigt ved en fremgangsmåde, der er kendt på området, for at reagere den. En reaktionstemperatur kan være en hvil-20 ken som helst temperatur, når blot opfindelsens virkning opnås. En reaktionstemperatur kan repræsentativt være ca. 30°C til ca. 75°C. Det foretrækkes, at opløsningens temperatur i dette reaktionstrin er en sådan temperatur, at aktivitet, som er ca. 20% eller mere, mere foretrukket ca. 30% eller mere af aktiviteten af a-glucanphosphoryla-se, som er indeholdt i denne opløsning før en reaktion, forbliver efter en forudbestemt 25 reaktionstid. Denne temperatur er fortrinsvis ca. 55°C til ca. 75°C, mere foretrukket ca.

60°C til ca. 75°C, yderligere foretrukket ca. 60°C til 70°C, særligt foretrukket ca. 60°C til ca. 65°C.

En reaktionstid kan sættes til at være en hvilken som helst tid i lyset af en reaktionstemperatur og et enzyms restaktivitet. En reaktionstid er repræsentativt ca. 1 time til 30 ca. 100 timer, mere foretrukket ca. 1 time til ca. 72 timer, endnu mere foretrukket ca. 2 timer til ca. 36 timer, mest foretrukket ca. 2 timer til ca. 24 timer.

På denne måde fremstilles en opløsning indeholdende glucose-1-phosphat.

69 DK 177092 B1 (6. Anden fremstillingsfremgangsmåde under anvendelse af et enzym ifølge den foreliggende opfindelse) α-glucanphosphorylase med forbedret termostabilitet ifølge den foreliggende opfindelse kan anvendes i en hvilken som helst fremstillingsfremgangsmåde, som kendes 5 på området, og hvor der anvendes α-glucanphosphorylase, ud over de ovenfor nævnte fremstillingsfremgangsmåder. Anvendelse af α-glucanphosphorylase med forbedret termostabilitet ifølge den foreliggende opfindelse i disse fremstillingsfremgangsmåder kan let udføres af fagmanden på området.

10 (7. Anvendelse af glucan, der er opnået ved en fremstillingsfremgangsmåde ifølge den foreliggende opfindelse)

En glucan, der er opnået ved fremstillingsfremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse, kan anvendes, således som det er kendt på området angående en glucan.

Blandt glucaner, især uopløselig amylose, forventes den samme funktion som kostfi-15 ber, og anvendelse i helsekost kan forventes. Da amylose har de karakteristika, at det fx er i stand til at inkludere iod eller fedtsyrer i et molekyle, forventes desuden anvendelse inden for områderne lægemidler, kosmetik eller sanitære produkter. Amylose kan anvendes som råmateriale til fremstilling af cyclodextrin og cycloamylose, som har samme inklusionsevne som amylose. En film indeholdende amylose har desuden en 20 brudstyrke, som er sammenlignelig med en plast i generel anvendelse, og er meget lovende som materiale til en bionedbrydelig plast. På denne måde forventes mange anvendelser af amylose.

(8. Anvendelse af glucose-1-phosphat, som er opnået ved syntesefremgangsmåden 25 ifølge den foreliggende opfindelse)

Glucose-1-phosphat, som er opnået ved syntesefremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse, kan anvendes, således som det er kendt på området vedrørende glucose-1-phosphat. Glucose-1-phosphat anvendes som medicinsk antibakterielt middel, antitumormiddel (som et platinkompleks), lægemiddel til behandling af hjertesyg-30 dom (som et aminsalt) eller substrat til syntese af en glucan.

Den foreliggende opfindelse vil blive forklaret nedenfor baseret på eksempler, men følgende eksempler er kun tilvejebragt til eksemplificeringsformål. Omfanget af den foreliggende opfindelse er derfor ikke begrænset af ovenstående detaljerede beskrivelse af opfindelsen og følgende eksempler, men er kun begrænset af patentkravene.

35 70 DK 177092 B1

Eksempler (1. Målemetode og beregningsmetode)

Respektive stoffer i forbindelse med den foreliggende opfindelse blev målt under 5 anvendelse af følgende målemetoder.

(1.1 Kvantificering af glucose)

Glucose blev kvantificeret under anvendelse af et kommercielt tilgængeligt målekit.

Glucose måles under anvendelse af et glucose AR-ll-farvefremkaldende reagens 10 (fremstillet af Wako Pure Chemical Industries, Ltd.).

(1.2 Kvantificering af fructose)

Fructose blev kvantificeret under anvendelse af et kommercielt tilgængeligt målekit.

Fructose måles under anvendelse af et F-kit, D-glucose/D-fructose (fremstillet af 15 Roche).

(1.3 Kvantificering af glucose-1-phosphat)

Glucose-1-phosphat blev kvantificeret ved følgende fremgangsmåde. Til 300 μΙ af et målereagens (200 mM Tris-HCI (pH 7,0), 3 mM NADP, 15 mM magnesiumchlorid, 3 20 mM EDTA, 15 μΜ glucose-1,6-diphosphat, 6 μg/ml phosphoglucomutase, 6 μg/ml glucose-6-phosphat-dehydrogenase) tilsættes 600 μΙ afen opløsning indeholdende korrekt fortyndet glucose-1-phosphat, dette omrøres, og den resulterende reaktionsblanding reageres ved 37°C i 30 minutter. Derefter måles absorbans ved 340 nm under anvendelse af et spektrofotometer. Absorbans måles på lignende måde under anven-25 delse af glucose-1-phosphat med en kendt koncentration til fremstilling af en standardkurve. En absorbans, der opnås for en prøve, tilpasses til denne standardkurve for at opnå en glucose-1-phosphat-koncentration i en prøve. Aktivitet med hensyn til at producere én pmol glucose-1-phosphat i 1 minut defineres sædvanligvis som én enhed. Ved denne kvantificeringsmetode kvantificeres kun glucose-1-phosphat, og 30 mængden af uorganisk phosphorsyre kvantificeres ikke.

(1.4 Kvantificering af uorganisk phosphorsyre)

Uorganisk phosphorsyre blev opnået som phosphationer ved følgende fremgangsmåde. Til en opløsning (200 μΙ) indeholdende uorganisk phosphorsyre blandes 800 μΙ 35 af et molybdænreagens (15 mM ammoniummolybdat, 100 mM zinkacetat), hvorefter 71 DK 177092 B1 der tilsættes 200 μΙ 568 mM ascorbinsyre (pH 5,0), dette omrøres, og den resulterende reaktionsblanding reageres ved 37°C i 30 minutter. Derefter måles absorbans ved 850 nm under anvendelse af et spektrofotometer. Absorbans måles på lignende måde under anvendelse af uorganisk phosphorsyre med en kendt koncentration til fremstil-5 ling af en standardkurve. En absorbans, der er opnået for en prøve, tilpasses til denne standardkurve for at opnå et mål for den uorganiske phosphorsyre i en prøve. Ved denne kvantificeringsmetode kvantificeres mængden af uorganisk phosphorsyre, og mængden af glucose-1-phosphat kvantificeres ikke.

10 (1.5 Fremgangsmåde til beregning af udbytte af glucan fremstillet ud fra glucose-1- phosphat)

Udbyttet af en glucan (fx amylose), som fremstilles under anvendelse af a-glucan-phosphorylase og som udgangsmateriale glucose-1-phosphat uden at anvende saccharosephosphorylase, opnås ved følgende ligning ud fra mængder af uorganisk 15 phosphorsyre og glucose i en opløsning efter afslutning af reaktionen.

(Glucanudbytte (%)) = (glucose anvendt i glucansyntese (mM)) + (initial glucose-1-phosphat (mM)) x 100 = {(uorganisk phosphorsyre fremstillet ved reaktion (mM)) - (glucose efter reaktion 20 (mM))} + (initial glucose-1-phosphat (mM)) x 100 (1.6 Fremgangsmåde til beregning af udbytte af glucan fremstillet ud fra saccharose)

Udbyttet af en glucan (fx amylose), som fremstilles under anvendelse af uorganisk phosphorsyre som udgangsstof i en SP-GP-fremgangsmåde, opnås ved følgende 25 ligning ud fra mængder af glucose, fructose og glucose-1-phosphat i en opløsning efter afslutning af reaktionen.

Glucan (mM glucoseækvivalent) = (fructose (mM) - (glucose-1-phosphat (mM)) - (glucose (mM)) 30

Denne ligning er baseret på følgende princip.

Ved fremstillingsfremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse kan der først forekomme en reaktion (A) i overensstemmelse med følgende ligning.

35 (A) saccharose + uorganisk phosphorsyre —> glucose-1-phosphat + fructose 72 DK 177092 B1

Denne reaktion katalyseres af saccharosephosphorylase. Ved denne reaktion reageres saccharose og uorganisk phosphorsyre til fremstilling af de samme molære mængder glucose-1-phosphat og fructose. Når den resulterende fructose ikke længere 5 reagerer med andre stoffer, kendes en molær mængde produceret glucose-1-phosphat ved at måle en molær mængde fructose.

Saccharosephosphorylase kan katalysere hydrolyse af saccharose ved følgende reaktion (B) som en sidereaktion ud over ovennævnte reaktion (A).

10 (B) Saccharose —► glucose + fructose

En mængde af glucose, som er inkorporeret i en glucan, beregnes som følger.

Mængde af glucose, som er inkorporeret i en glucan 15 = (mængde glucose-1-phosphat fremstillet ved reaktion (A)) - (mængde ikke-reageret glucose-1-phosphat) = (mængde fructose fremstillet ved reaktion (A)) - (mængde ikke-reageret glucose-1-phosphat) 20 I lyset af den fructose, der fremstilles ved reaktion (B), beregnes den mængde fructose, der fremstilles ved reaktion (A), som følger: Mængde fructose fremstillet ved reaktion (A) = (mængde fructose efter afslutning af reaktionen) - (mængde glucose efter afslutning 25 af reaktionen)

Udbyttet af en glucan opnås derfor ved følgende ligning.

(Glucan (mM glucoseækvivalent)) 30 = (fructose (mM)) - (glucose-1-phosphat (mM)) - (glucose (mM))

Udbyttet af en glucan, der fremstilles under anvendelse af glucose-1-phosphat som udgangsmateriale, opnås ved følgende ligning ud fra mængden af initial glucose-1-phosphat samt mængder af glucose, fructose og glucose-1-phosphat i en opløsning 35 efter afslutning af reaktionen.

73 DK 177092 B1 (Glucan (mM glucoseækvivalent)) = (initial glucose-1-phosphat (mM)) + (fructose (mM) - (glucose (mM)) 5 - (glucose-1-phosphat efter reaktion (mM))

Denne ligning er baseret på følgende princip.

I en reaktionsopløsning fremstilles der ud over initial glucose-1-phosphat glucose-1-phosphat ved en reaktion (A). Det vil sige, at initial glucose-1-phosphat og fremstillet 10 glucose-1-phosphat kan anvendes til glucansyntese. Ved at trække den mængde glucose-1-phosphat, der er tilbage i en reaktionsopløsning efter afslutning af reaktionen, fra den mængde glucose-1-phosphat, som kan anvendes til glucansyntese, kan man beregne den mængde glucose-1-phosphat, der anvendes i en reaktion, dvs. den mængde glucose, der er inkorporeret i en glucan. Derfor kan den mængde glucose, 15 der er inkorporeret i en glucan, opnås ved ovennævnte ligning. Denne ligning kan også anvendes, når uorganisk phosphorsyre og glucose-1-phosphat anvendes sammen som udgangsmateriale i et SP-GP-reaktionssystem.

(1.7 Fremgangsmåde til beregning af udbytte af glucan fremstillet ud fra saccharose) 20 Udbyttet af en glucan, når den er fremstillet under anvendelse af uorganisk phos phorsyre som udgangsmateriale, opnås ved følgende ligning.

(Glucanudbytte (%)) = (glucan (mM glucoseækvivalent)) / (initial saccharose (mM)) x 100 25

Udbyttet af en glucan, når den er fremstillet under anvendelse af glucose-1-phos-phat som udgangsmateriale, opnås ved følgende ligning.

(Glucanudbytte (%)) 30 = {(initial glucose-1-phosphat (mM)) + (fructose (mM)) - (glucose (mM) - (glucose-1- phosphat efter reaktion (mM))} + {(initial saccharose (mM)) + (initial glucose-1-phos-phat (mM))}x 100

Denne ligning kan også anvendes, når uorganisk phosphorsyre og glucose-1-35 phosphat anvendes sammen som udgangsmateriale i et SP-GP-reaktionssystem.

74 DK 177092 B1 (Eksempel 1: Fremstilling, screening og sekventering af kartoffel a-glucanphosphoryla-se med forbedret termostabilitet)

For kort at ridse op blev en vilkårlig mutation indført i et kartoffel type L a-glucan-5 phosphorylasegen, et gen med en vilkårlig mutation indført deri blev indført i

Escherichia coli, α-glucanphosphorylase med en vilkårlig mutation indført deri blev udtrykt, og Escherichia coli, der blandt udtrykte α-glucanphosphorylaser udtrykte a-glucanphosphorylase med forbedret termostabilitet og med evnen til at syntetisere en glucan efter opvarmning ved 60°C i 10 minutter, blev selekteret, en gen af a-glucan-10 phosphorylase med forbedret termostabilitet blev isoleret fra denne Escherichia coli, og sekvensen deraf blev bestemt.

Detaljer er som følger.

Først blev der fremstillet et gen af kartoffel type L α-glucanphosphorylase (GP).

Ifølge beskrivelsen af Takaha, et al. (Journal of Biological Chemistry, vol.268, pp.1391-15 1396, 1993) blev et mRNA fremstillet ud fra en kartoffelrodknold under anvendelse af en velkendt fremgangsmåde, og et cDNA-bibliotek blev fremstillet under anvendelse af et kommercielt tilgængeligt kit.

Baseret på den kendte GP-gensekvens (database GenBank accessionsnummer D00520) blev PCR-primer 1 og PCR-primer 2 derefter designet. Under anvendelse af 20 ovennævnte cDNA-bibliotek som template, og idet der som PCR-primer 1 og 2 blev anvendt PCR-primer 1: 5'AAATCGATAGGAGGAAAACAT ATG ACC TTG AGT GAG AAA AT 3’ (SEQ ID NO: 38) 25 og PCR-primer 2: 5' G AAG GT ACCTTTT C ATT C ACTT CCCCCTC3’ (SEQ ID NO: 39), 30 blev der udført PCR for at amplificere et gen af kartoffel GP. PCR-betingelser var PCR-reaktion på 30 cykler, idet én cyklus var 94°C i 30 sekunder, 50°C i 1 minut og 72°C i 3 minutter. Den understregede del af PCR-primer 1 svarer til en strukturel gensekvens ved den N-terminale region af et type L GP modent protein, og den understregede del af PCR-primer 2 svarer til basesekvensen umiddelbart efter stopkodonen af et type L 35 GP-strukturgen.

Det amplificerede GP-gen blev indsat i et plasmid pMW118 (fremstillet af Nippon Gene Co., Ltd.), som i forvejen var blevet skåret med Smal, og et plasmid med en sekvens som i figur 2 blev selekteret. Dette plasmid blev indført i Escherichia coli TG-1 75 DK 177092 B1 ved en calciumphosphat-præcipitationsmetode, en ampicillinresistent stamme blev selekteret, denne ampicillinresistente stamme blev dyrket, og et plasmid blev opsamlet fra denne ampicillinresistente stamme, hvorved genet af en kartoffel type L GP blev opnået.

5 Det resulterende gen af en kartoffel type L GP blev amplificeret ved en "error- prone” PCR-fremgangsmåde, som er kendt for fagmanden på området (referencer:

Leung, et. al. (Technique 1, 11-15, 1989) og Cadwell og Joyce (PCR Methods Ap-plic.2,28-33, 1992), og under anvendelse af PCR-primer 3 og PCR-primer 4, 10 PCR-primer 3: 5’-TT CGGAT CCT CACCTT GAGT GAG AAAATT CAC-3’ (SEQ ID NO: 40) og PCR-primer 4: 5’-TTCGGATCCTTTTCATTCACTTCCCCCTC-3’ (SEQ ID NO: 41), 15 blev der udført en PCR-reaktion ved 90°C i 30 sekunder og derefter 25 cykler, idet én cyklus var 94°C i 30 sekunder og 68°C i 3 minutter og derefter 68°C i 1 minut. Basesubstitution blev indført i gennemsnitlig 2 til 3 positioner af det amplificerede DNA-frag-ment. Den understregede del af PCR-primer 3 svarer til en strukturel gensekvens ved 20 den N-terminale region af et type L GP modent protein, og den understregede del af PCR-primer 4 svarer til en basesekvens umiddelbart efter en stopkodon af et type L GP strukturelt gen.

Et GP-genamplificeret fragment med en vilkårlig mutation indført deri blev indsat i et plasmid pET3d (fremstillet af STRATAGENE), som i forvejen var skåret med BamHI, 25 og et plasmidbibliotek til screening af GP med forbedret termostabilitet med en vilkårlig mutation indført deri blev fremstillet. Escherichia coli BL21 (DE3) blev transformeret med dette plasmid, og en transformant blev fortyndet, således at der blev opnået en uafhængig koloni, og udpladet på et ampicillinholdigt LB-agarmedium (50 pg/ml ampi-cillin, trypton 1% fremstillet af Difco, gærekstrakt 0,5% fremstillet af Difco, NaCI 0,5%, 30 1,5% agarose, pH 7,3), efterfulgt af dyrkning ved 30°C i 24 timer. Kolonier på den re sulterende plade blev overført til et nylonmembranfilter. Overfladen på et filter, på hvilke kolonier var adhæreret, blev tørret tilstrækkeligt, og dette filter blev inkuberet ved 60°C i 10 minutter i en 20 mM citratbuffer (pH 6,7). Efter overførsel blev den resterende plade inkuberet yderligere ved 37°C i nogle få timer og blev derefter lagret ved 4°C 35 som en masterplade. Det varmebehandlede filter blev sat på en gel (indeholdende 76 DK 177092 B1 0,05% dextrin, 50 mM G-1-P, 100 mM citratbuffer (pH 6,7), 0,7% agarose) indeholdende et substrat til glucansyntese, således at en koloniadhæreret overflade blev adhære-ret til en geloverflade, og denne blev inkuberet ved 50°C i timer. Filteret, som blev skrællet af gelen, blev nedsænket i en iodopløsning (0,1% kaliumiodid, 0,01% iod), og 5 glucan, der var syntetiseret på filteret, blev detekteret ved en iodstivelsesreaktion. Kolonier, der svarede til pletter farvet med blåt, blev isoleret fra en masterplade.

Fra hver af de således opnåede Escherichia coli blev der opsamlet et plasmid ved en fremgangsmåde, der er kendt på området, og basesekvensen af et gen af a-glucan-phosphorylase med forbedret termostabilitet i dette plasmid blev bestemt under anven-10 delse af et DNA-sekventeringsapparat (fremstillet af ABI).

Når aminosyresekvensen, der blev kodet af dette gen af a-glucanphosphorylase med forbedret termostabilitet, blev sammenlignet med en aminosyresekvens af naturlig kartoffel type L (dvs. før mutation) α-glucanphosphorylase, var en mutation indført i aminosyrerne i position 39, position 135 eller position 706 af naturlig kartoffel type L a-15 glucanphosphorylase, og aminosyrerne var substitueret som henholdsvis F39—>L, N135—>S og T706—>l. Derudover sås der også forbedring i termostabilitet i en GP, i hvilken F39 var muteret til en anden aminosyre end L, N135 var muteret til en anden aminosyre end S, eller T706 var muteret til en anden aminosyre end I.

20 (Eksempel 2-1A: Fremstilling af kartoffel type L α-glucanphosphorylase med forbedret termostabilitet ved site-directed mutagenese) I det foreliggende eksempel blev der fremstillet GP med forbedret termostabilitet, som kun havde én substitution i en position, der blev fundet at bidrage til at forbedre termostabilitet i eksempel 1, GP med forbedret termostabilitet, som havde en kombina-25 tion af hvilke som helst to, og GP med forbedret termostabilitet, som havde alle 3. Som eksempel er aminosyresekvensen af GP med forbedret termostabilitet, som har alle tre mutationer (F39L+N135S+T706I), angivet i SEQ ID NO: 34, og en basesekvens, der koder derfor, er angivet i SEQ ID NO: 33. Til sammenligning blev der fremstillet GP, i hvilken aminosyrerne i position 39, position 135 og position 706 ikke var substitueret, 30 og en aminosyre i en position, der ikke havde nogen forbindelse med disse aminosyre-positioner, var substitueret (GP, i hvilken kun lysin i position 467 var substitueret med asparagin, og GP, i hvilken kun threonin i position 711 var substitueret med alanin).

Mange fremgangsmåder til substitution af en aminosyre er publiceret (reference: Kin-kel, T.A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 488 (1995), Vandeyar, M., et al., Gene, 35 65:129-133 (1988), Sugimoto, M., et al., Anal. Biochem., 179:309-311 (1989), Taylor, 77 DK 177092 B1 J. W. og Eckstein, F., Nucl. Acids Res., 13:8764 (1985), Nelson, M. og McClelland, M.,

Methods Enzymol., 216:279-303 (1992)). I forbindelse med den foreliggende opfindelse anvendtes et Quick change XL Site-Directed Mutagenesis-kit (fremstillet af STRATAGENE). Idet der blev anvendt et plasmid indeholdende et kartoffel type L GP-gen 5 indsat i et plasmid pMW-118 som vist i eksempel 1 som template, og idet der blev anvendt ét sæt mutationsindførte primere pr. mutation, hvor hvervar ca. 35 bp komplementære i forhold til en central, mutationsindført position og blev designet for at indføre en mutation af F39L, N135S, T706I, K467D eller T711A, blev der udført PCRforat udføre site-directed mutagenese. Der blev fremstillet et plasmid pMW-PGP, der inde-10 holdt det således opnåede gen, som koder for GP med forbedret termostabilitet.

Escherichia coli TG-1 blev transformeret med dette plasmid, og en transformant blev fortyndet, således at der blev opnået en uafhængig koloni, og udpladet på et ampicil-linholdigt LB-agarmedium (50 pg/ml ampicillin, trypton 1% fremstillet af Difco, gærekstrakt 0,5% fremstillet af Difco, NaCI 0,5%, 1,5% agarose, pH 7,3), efterfulgt af dyrk-15 ning ved 37°C natten over. Escherichia coli, der var dyrket på dette ampicillinholdige LB-agarmedium, indeholder et indført plasmid. På denne måde blev der fremstillet Escherichia coli, som udtrykte GP med forbedret termostabilitet. Ved at ekstrahere et plasmid fra den resulterende Escherichia coli og sekventere et gen, der kodede for GP, blev det bekræftet, at et plasmid indeholdt i Escherichia coli, som var opnået i det fore-20 liggende eksempel, har et muteret GP-gen, der koder for GP med forbedret termostabilitet, og har en ønsket mutation.

Det blev bekræftet som følger, at GP, der blev udtrykt af Escherichia coli som opnået i det foreliggende eksempel, har forbedret termostabilitet. Escherichia coli TG-1 indeholdende et indført plasmid blev inokuleret på et ampicillinholdigt LB-medium (50 25 pg/ml ampicillin, trypton 1% fremstillet af Difco, gærekstrakt 0,5% fremstillet af Difco,

NaCI 0,5%, pH 7,3), dette blev dyrket ved 37°C til en logaritmisk middelfase, temperaturen blev sænket til omkring 22°C, og isopropyl^-D-thiogalactosid, som er en geneks-pressionsinducer, blev tilsat til en slutkoncentration på 0,1 mM, og pyridoxin-hydro-chlorid blev tilsat til en slutkoncentration på 1 mM efterfulgt af dyrkning ved 22°C i ca.

30 20 timer. Kulturen blev centrifugeret for at opsamle bakterieceller, bakteriecellerne blev suspenderet i en buffer, og suspensionen blev sonikeret for at opnå en bakteriecelleekstrakt. Denne bakterieekstrakt blev behandlet ved 60°C i 30 minutter for at opnå en autentisk GP-præparation.

Når en glucan blev fremstillet under anvendelse af den resulterende autentiske GP-35 præparation ved en fremgangsmåde til reaktion af saccharosephosphorylase og a- 78 DK 177092 B1 glucanphosphorylase på saccharose og en primer (fremgangsmåden er beskrevet i international publikation nr. WO 02/097107), kunne en højmolekylær glucan opnås i et højt udbytte med hensyn til al a-glucanphosphorylase med forbedret termostabilitet.

På den anden side blev GP, i hvilken en aminosyre i en position, som ikke havde 5 nogen forbindelse med forbedring af termostabilitet, var blevet substitueret, inaktiveret ved behandling ved 60°C i 30 minutter, og en glucan kunne ikke fremstilles.

(Eksempel 2.1B: Fremstilling af modificeret kartoffel type L a-glucanphosphorylase substitueret med forskellige aminosyrer) 10 På samme måde som i eksempel 2-1A, bortset fra at der blev anvendt primere, der var designet således, at ét sted af F39, N135 og T706 var substitueret med en anden aminosyrerest, blev der fremstillet et plasmid indeholdende et modificeret a-glucan-phosphorylasegen, og forskellige modificerede autentiske GP-præparationer blev opnået.

15 Termostabilitet af disse modificerede autentiske GP-præparationer blev undersøgt i detaljer i eksempel 3-1 (3-1) nedenfor.

(Eksempel 2-2A: Fremstilling af kartoffel type H α-glucanphosphorylase med forbedret termostabilitet ved site-directed mutagenese) 20 På samme måde som i eksempel 2-1A, bortset fra at der blev anvendt et kartoffel- afledt type Fl a-glucanphosphorylasegen i stedet for et kartoffelafledt type L a-glucan-phosphorylasegen, blev der fremstillet et plasmid indeholdende et gen fra a-glucanphosphorylase med forbedret termostabilitet, og der blev opnået en autentisk GP-præ-paration. I det foreliggende eksempel blev der fremstillet en GP med forbedret termo- 25 stabilitet, som kun havde én substitution i en position svarende til N135S eller T706I af en aminosyresekvens af kartoffel type L α-glucanphosphorylase (henholdsvis position 133 og position 628 af en aminosyresekvens af kartoffel type H a-glucanphosphorylase) blandt substitutionspositioner, som blev fundet at bidrage til forbedring af termostabilitet i eksempel 1.

30 Når disse autentiske GP-præparationer blev anvendt til at udføre en behandling ved 60°C i 30 minutter som i eksempel 2-1A, og en glucan blev fremstillet, kunne der med hensyn til al a-glucanphosphorylasen med forbedret termostabilitet opnås en glucan med høj molekylvægt svarende til naturlig kartoffel type H a-glucanphosphorylase.

79 DK 177092 B1 (Eksempel 2-2B: Fremstilling af kartoffel type H α-glucanphosphorylase med forbedret termostabilitet ved site-directed mutagenese) På samme måde som i eksempel 2-1A, bortset fra at der blev anvendt et kartoffelafledt type H α-glucanphosphorylasegen i stedet for et kartoffelafledt type L a-glucan-5 phosphorylasegen, og der blev anvendt en mutationsindført primer, der var designet således, at aminosyrerester i en position svarende til F39 (Y36), en position svarende til N135 (N133) og en position svarende til T706 (T628) var substitueret med henholdsvis leucin (L), serin (S) og isoleucin (I), blev der fremstillet et plasmid indeholdende et gen af α-glucanphosphorylase med forbedret termostabilitet, og der blev opnået en 10 trippelmuteret (Y36L+N133S+T628I) autentisk GP-præparation. I det foreliggende eksempel blev der fremstillet en GP med forbedret termostabilitet, der havde substitutioner i alle tre positioner, som var blevet fundet at bidrage til forbedring af termostabilitet i eksempel 1.

Varmeresistens af disse modificerede autentiske GP-præparationer blev undersøgt 15 i detaljer i eksempel 3-2 (2) nedenfor.

(Eksempel 2-2C: Fremstilling af Arabidopsis thaliana type Fl a-glucanphosphorylase med forbedret termostabilitet ved site-directed mutagenese) Først blev der fremstillet et gen af Arabidopsis thaliana type H a-glucanphosphory-20 lase (GP) under anvendelse af et kommercielt tilgængeligt Arabidopsis cDNA (PCR Ready First Strand cDNA, fremstillet af Wako Pure Chemical Industries, Ltd.).

Baseret på den kendte Arabidopsis thaliana GP-gensekvens (database GenBank accessionsnummer AL133292; CAB61943.1) blev PCR-primere 5 og 6 mere specifikt designet. Idet ovennævnte Arabidopsis cDNA blev anvendt som template, og under 25 anvendelse af: PCR-primer 5: 5ΆΑΑΤCGATAGGAGGAAAACAT ATG GCA AAC GCC AAT GGA AAA GCT GCG ACT AGT TTA CCG GAG AAA AT C TC 3’ (SEQ ID NO: 42) 30 og PCR-primer 6: 5’GAAGGTACC TTA GGG AAC AGG ACA AGC CTC AAT GTT CCA AAT CTC TTT GGC ATA CTG AG 3’ (SEQ ID NO: 43), 80 DK 177092 B1 blev der udført PCR for at amplificere et Arabidopsis thaliana type H GP-gen. Betingelserne for PCR-reaktionen var 30 cykler, idet én cyklus var 94°C i 30 sekunder, 60°C i 1 minut og 72°C i 3 minutter. Den understregede del af PCR-primer 5 svarer til et strukturelt gen ved den N-terminale region af et modent protein af et Arabidopsis thaliana type 5 H GP-gen, og den understregede del af PCR-primer 6 svarer til et strukturelt gen ved den C-terminale region af et modent protein af et Arabidopsis thaliana type H GP-gen.

Det amplificerede Arabidopsis thalianae type H GP-gen blev indsat i et plasmid pMW118 (fremstillet af Nippon Gene Co., Ltd.), som i forvejen var skåret med Smal, dette plasmid blev indført i Escherichia coli TG-1 under anvendelse af en kompetent 10 cellemetode, en ampicillinresistent stamme blev selekteret, denne ampicillinresistente stamme blev dyrket, og et plasmid blev opsamlet fra denne ampicillinresistente stamme, hvorved der blev opnået et Arabidopsis thaliana type H GP-gen.

På samme måde som i eksempel 2-1A, bortset fra at der blev anvendt det resulterende Arabidopsis thalianae type H GP-gen i stedet for et kartoffel type L a-glucan-15 phosphorylasegen, og der blev anvendt en mutationsindført promotor, der var designet således, at aminosyrerester i en position svarende til F39 (Y40), en position svarende til N135 (N136) og en position svarende til T706 (N631) var substitueret med henholdsvis leucin (L), serin (S) og isoleucin (I), blev der fremstillet et plasmid indeholdende et gen af a-glucanphosphorylase med forbedret termostabilitet, og der blev opnået 20 en trippelmuteret (Y40L+N136S+N6311) autentisk GP-præparation. I det foreliggende eksempel blev der fremstillet en GP med forbedret termostabilitet, der havde substitutioner i alle tre positioner, som var blevet fundet at bidrage til forbedring af termostabilitet i eksempel 1.

Termostabilitet af disse modificerede autentiske GP-præparationer blev undersøgt i 25 detaljer i eksempel 3-2 (2) nedenfor.

(Eksempel 3-1: Fremstilling af forskellige α-glucanphosphorylaser med forbedret termostabilitet i stor skala og sammenligning af termostabililtet) 30 (1) Storskalafremstilling af enzym

Respektive Escherichia coli’er, der udtrykte en GP med forbedret termostabilitet som fremstillet i eksempel 2-1A eller 2-1B, blev dyrket i et TB-medium (indeholdende Terrific broth (GIBCO) 47 g/l, glycerol 4 ml/l og 50 pg/ml ampicillin) ved 37°C i 5 timer, IPTG og pyridoxinchlorid blev tilsat til denne dyrkningsopløsning til slutkoncentrationer 35 på 0,1 mM IPTG og 1 mM pyridoxin-hydrochlorid, og dette blev yderligere dyrket ved 81 DK 177092 B1 22°C i 24 timer. Derefter blev bakterieceller opsamlet ved centrifugering af kulturen, og mediekomponenter blev fjernet ved vask med en 20 mM citratbuffer. Bakterieceller efter vask blev suspenderet i en 20 mM citratbuffer, bakterieceller blev lyseret med en sonikator og centrifugeret, og supernatanten blev anvendt som bakteriecelleekstrakt.

5 Den resulterende bakteriecelleekstrakt blev sat på en Q-Sepharose FF-søjle, som på forhånd var blevet ækvilibreret, og en fraktion indeholdende en GP med forbedret termostabilitet, som blev elueret ved en koncentrationsgradient på 0,1 M til 0,3 M NaCI i en 20 mM citratbuffer (pH 6,7), blev opsamlet. Den opsamlede enzymfraktion blev sat på en Phenyl-TOYOPEARL 650M-søjle, som i forvejen var ækvilibreret, og en fraktion 10 indeholdende en GP med forbedret termostabilitet, der blev elueret ved en koncentrationsgradient på 17,5% til 7,5% mættet ammoniumsulfat i en 20 mM citratbuffer, blev opsamlet. Den opsamlede enzymfraktion blev sat på en HiTrap HQP-søjle, som i forvejen var blevet ækvilibreret, og en aktiv fraktion, der blev elueret ved en koncentrationsgradient på 0,1 M til 0,4 M NaCI i en 20 mM citratbuffer, blev opsamlet. Det resulteren-15 de aktive fragment blev endvidere sat på en Resource Q-søjle, som i forvejen var blevet ækvilibreret, og denne blev elueret ved en koncentrationsgradient på 0,1 M til 0,4 M NaCI i en 20 mM citratbuffer, hvilket gav et oprenset enzymholdigt aktivt fragment.

Det resulterende oprensede enzymholdige aktive fragment blev underkastet ca.

1 pg nativ PAGE (nativ polyacrylamid-gelelektroforese). Som et resultat heraf blev der 20 for alle Escherichia coli, der udtrykte GP med forbedret termostabilitet, genkendt et enkelt bånd ved en molekylvægt på ca. 210 kDa, og intet bånd sås ved noget andet sted. Da GP forudsiges at have en molekylvægt på ca. 104 kDa ud fra aminosyre-sekvensen, antages det, at GP har en dimer struktur. På denne måde blev det vist, at GP med forbedret termostabilitet blev oprenset ensartet.

25 (2) Måling af aktivitet af oprenset GP med forbedret termostabilitet

Aktiviteten af GP med forbedret termostabilitet, som var oprenset under (1), blev målt. Målingen blev udført som følger. Først blev en 200 pi reaktionsopløsning (indeholdende 12,5 mM G-1-P, 1% dextrin og en enzymopløsning i en 100 mM acetatbuffer 30 (pH 6,0)) inkuberet ved 37°C i 15 minutter. Derefter blev der tilsat 800 μΙ af et molybdænreagens (15 mM ammoniummolybdat, 100 mM zinkacetat), og der blev omrørt for at standse reaktionen. Derefter blev der tilsat 200 μΙ 568 mM ascorbinsyre (pH 5,8), dette blev blandet og inkuberet ved 37°C i 15 minutter, og absorbansen ved 850 nm blev målt under anvendelse af et spektrofotometer. I det foreliggende eksempel blev 35 GP-enzymaktivitet målt ved at kvantificere fri uorganisk phosphorsyre produceret ud fra 82 DK 177092 B1 G-1-P. Den mængde af et enzym, der producerede 1 μιτηοΙ uorganisk phosphorsyre i ét minut, blev defineret som én enhed (U).

(3-1) Sammenligning af termostabilitet ved 60°C og 65°C af GP med forbedret termo-5 stabilitet som fremstillet i eksempel 2-1A

Termostabilitet ved 60°C og 65°C af respektive GP’er med forbedret termostabilitet, som var fremstillet i eksempel 2-1A og fremstillet i stor målestok og oprenset under (1), blev sammenlignet. Som kontrol blev der anvendt naturlig (ikke muteret) kartoffel type L α-glucanphosphorylase, som var oprenset ved samme fremgangsmåde.

10 Først blev 0,2 U/ml af en oprenset enzymopløsning (i en 20 mM citratbuffer (pH

6,7)) inkuberet ved 60°C eller 65°C i 0 til 30 minutter. En alikvot af enzymopløsningen blev udtaget på specifikke tidspunkter, såsom 0, 2, 10, 20 og 30 minutter, og holdt på is. Prøver af enzymopløsningen, der var holdt på is, blev fortyndet 10 gange med en 20 mM citratbuffer (pH 6,7), og enzymaktivitet blev målt ifølge den i (2) beskrevne aktivi-15 tetsmålemetode. Termostabilitet af et enzym blev bedømt ved forholdet af enzymaktivitet ved 37°C af et enzym efter inkubation (dvs. restaktivitet), når enzymaktiviteten ved 37°C af et enzym før inkubation ved 60°C eller 65°C tages til at være 100%. Resultater af inkubation ved 60°C er vist i følgende tabel 5. Resultater af inkubation ved 65°C er vist i følgende tabel 6.

20

Tabel 5 __ Restaktivitet (%) efter inkubation ved 60°C__

' Γ F39L

Tid Sffi poqi N135 T7nR| F39L N135S +N135

(min) “Θ| F39L S T706' +NP5 +T706I +T706I S

iypeL S +T7Q6| 0 100 100 100 100 100 100 100 100 10 8,4 61,2 65,4 70,5 101 100 101 98,8 20 1,2 58,3 55,2 50,8 99,6 100 100 96,3 30 0,7 34,7 52,1 36,6 98,3 101 98,5 94,6~ 83 DK 177092 B1

Tabel 6 __ Restaktivitet (%) efter inkubation ved 65°C__

· F39L

Tid SS poo, N135 T7nRI F39L, F39L N135S +N135

(min) kfrtof^el F39L S T706 +N^35 +T706I +T706I S

typeL S +T706I

0 100 100 100 100 100 100 100 100 2 1,3 40,2 86,5 22,9 86,8 50,8 61,9 90,3 10 0 0,5 1,4 0,3 18,2 9,3 16,9 61,1 20 0 0,4 0,6 0,3 2,9 0,9 2,8 47,7 ~30 0 I 0,4 | 0,2 0,3 0,2 0,2 0,7 31,4 I ovenstående tabel 5 og tabel 6 betegner naturlig kartoffel type L naturlig kartoffel 5 type L α-glucanphosphorylase. F39L betegner naturlig kartoffel type L a-glucanphos-phorylase, i hvilken phenylalanin i position 39 er substitueret med leucin. T706I betegner naturlig kartoffel type L α-glucanphosphorylase, i hvilken threonin i position 706 er substitueret med isoleucin. N135S betegner naturlig kartoffel type L a-glucanphospho-rylase, i hvilken asparagin i position 135 er substitueret med serin. F39L+T706I beteg-10 ner naturlig kartoffel type L α-glucanphosphorylase, i hvilken phenylalanin i position 39 er substitueret med leucin, og threonin i position 706 er substitueret med isoleucin.

N135S+T706I betegner naturlig kartoffel type L α-glucanphosphorylase, i hvilken asparagin i position 135 er substitueret med serin, og threonin i position 706 er substitueret med isoleucin. F39L+N135S betegner naturlig kartoffel type L α-glucanphosphorylase, i 15 hvilken phenylalanin i position 39 er substitueret med leucin, og asparagin i position 135 er substitueret med serin. F39L+N135S+T706I betegner naturlig kartoffel type L a-glucanphosphorylase, i hvilken phenylalanin i position 39 er substitueret med leucin, asparagin i position 135 er substitueret med serin, og threonin i position 706 er substitueret med isoleucin. Blandt de i tabel 5 og tabel 6 viste resultater er resultaterne af 20 opvarmning ved 60°C i 30 minutter og resultater af opvarmning ved 65°C i 2 minutter vist i figur 3 som en kurve.

Det blev fundet, at GP med forbedret termostabilitet ifølge den foreliggende opfindelse har meget forbedret termostabilitet i sammenligning med naturlig kartoffel type L GP. Fra GP med ringere termostabilitet til GP med udmærket termostabilitet sættes i 25 rækkefølge som følger: naturlig kartoffel type L GP < F39L < T706I < N135S < F39L+T706I < N135S+T706I < F39L+N135S < F39L+N135S+T706I. Substitution i kun ét sted blandt aminosyrerester i tre steder bidrog til forbedret termostabilitet. Det sås endvidere, at termostabilitet forbedres dramatisk ved multipel substitution af disse aminosyrerester.

30 84 DK 177092 B1

(3-2) Sammenligning af termostabiliteter ved 60°C og 65°C af modificeret GP fremstillet i eksempel 2-1B

Varmeresistens ved 60°C og 65°C af respektive modificerede GP’er, som var fremstillet i eksempel 2-1B og fremstillet i stor målestok og oprenset i eksempel 3-1 (1), blev 5 sammenlignet. Som kontrol blev der anvendt naturlig (ikke muteret) kartoffel type L a-glucanphosphorylase, der var oprenset ved samme fremgangsmåde.

Først blev 0,2 U/ml af en oprenset enzymopløsning (i en 20 mM citratbuffer (pH 6,7)) inkuberet ved 60°C i 10 minutter eller 65°C i 2 minutter. På et forudbestemt tidspunkt (10 minutter eller 2 minutter) blev der udtaget en alikvot af en enzymopløsning, 10 som blev holdt på is. Prøver af enzymopløsningen, som var holdt på is, blev fortyndet 10 gange med en 20 mM citratbuffer (pH 6,7), og enzymaktivitet blev målt ifølge den under (2) beskrevne aktivitetsmålemetode. Et enzyms termostabilitet blev bedømt ved forholdet af et enzyms enzymaktivitet ved 37°C efter inkubation (dvs. restaktivitet), når enzymets enzymaktivitet ved 37°C før inkubation ved 60°C i 10 minutter eller 65°C i 2 15 minutter tages til at være 100%. Resultater er vist i følgende tabel 7 og figur 8 til 10.

Tabel 7 85 DK 177092 B1

Remaining activity of Remaining activity of position 39 substituted mutant position 135 substituted mutant

Remaining activity (%) Remaining activity (%)

F39 60°C 65°C N135 60°C 65°C

10 min 2 min _10 min_2 mi n WT 8.4 1.3 WT 8.4 1.3 I 45.2 14.5 A 76.2 79.0 L 61.2 40.2 C 85.0 76.9 V 21.6 3.3 D 42.8 26.7 E 20.3 24.0

Remaining activity of position 706 substituted mutant G 85.2 58.4

Remaining activity(%) H 48.4 19.6 T706 60°C 65°C 1 60-0 26·0 10 min 2 min Π.% 15.6 WT 8.4 1.3 M 59i4 52,6 C 65.4 31.6 F 435 35·5 I 70.5 22.9 S 65‘4 86·5 L 57.6 57.8 T 734 624 V 68.7 59.2 V 82·8 79·3 W 24.4 2.9 Y 44.8 35.4 5 I ovenstående tabel 7 betegner WT naturlig kartoffel type L α-glucanphosphorylase.

I hver kolonne betegner en aminosyre, der er vist med en étbogstavsforkortelse, en aminosyre substitueret i en modificeret GP. En enhed, der udtrykkes med I i en kolonne mærket med F39 i venstre side, betegner fx modificeret GP, i hvilken phenylalanin 86 DK 177092 B1 (F) i position 39 er substitueret med isoleucin (I). Dette gælder også for modificeret GP i andre kolonner.

Étbogstavsforkortelse for en aminosyre er velkendt for fagmanden på området og er som følger: A, alanin; C, cystein; D, asparaginsyre; E, glutaminsyre; F, phenylalanin; 5 G, glycin; H, histidin; I, isoleucin; K, lysin; L, leucin; M, methionin; N, asparagin; P, pro-lin; Q, glutamin; R, arginin; S, serin; T, threonin; V, valin; W, tryptophan; Y, tyrosin.

Som et resultat sås det, at når aminosyrer i position 39, position 135 og position 706 substitueres med andre aminosyrer end bestemte aminosyrer substitueret i ovennævnte eksempel 2-1A, forbedres termostabiliteten af naturlig kartoffel type L GP.

10 Når man betragtede restaktivitet efter inkubation ved 60°C i 10 minutter, når phe nylalanin i position 39 var substitueret med isoleucin, leucin eller valin, var termostabiliteten af modificeret GP bedre end for naturlig kartoffel type L GP. Med hensyn til substitution i position 39 var substitution med leucin (restaktivitet efter inkubation ved 60°C i 10 minutter er 61,2%) bedst med hensyn til termostabilitet. Når asparagin i position 15 135 blev substitueret med alanin, cystein, asparaginsyre, glutaminsyre, glycin, histidin, isoleucin, leucin, methionin, phenylalanin, serin, threonin, valin eller tyrosin, var termostabilitet af modificeret GP bedre end for naturlig kartoffel type L GP. Med hensyn til substitution i position 135 var substitution med alanin (restaktivitet efter inkubation ved 60°C i 10 minutter er 76,2%), cystein (restaktivitet efter inkubation ved 60°C i 10 minut-20 ter er 85,0%), glycin (restaktivitet efter inkubation ved 60°C i 10 minutter er 85,2%), isoleucin (restaktivitet efter inkubation ved 60°C i 10 minutter er 60,0%), serin (restaktivitet efter inkubation ved 60°C i 10 minutter er 65,4%), threonin (restaktivitet efter inkubation ved 60°C i 10 minutter er 73,4%) eller valin (restaktivitet efter inkubation ved 60°C i 10 minutter er 82,8%) særligt udmærket med hensyn til termostabilitet. Nårthre-25 onin i position 706 blev substitueret med cystein, isoleucin, leucin, valin eller tryptophan, var termostabilitet af modificeret GP bedre end for naturlig kartoffel type L GP.

Med hensyn til substitution i position 706 var substitution med cystein (restaktivitet efter inkubation ved 60°C i 10 minutter er 65,4%), isoleucin (restaktivitet efter inkubation ved 60°C i 10 minutter er 70,5%) eller valin (restaktivitet efter inkubation ved 60°C i 10 mi-30 nutter er 68,7%) særligt udmærket med hensyn til termostabilitet.

Når man betragter restaktivitet efter inkubation ved 65°C i 2 minutter, når phenylalanin i position 39 blev substitueret med isoleucin, leucin eller valin, var termostabilitet af modificeret GP bedre end for naturlig kartoffel type L GP. Med hensyn til substitution i position 39 var substitution med leucin (restaktivitet efter inkubation ved 65°C i 2 mi-35 nutter er 40,2%) mest udmærket med hensyn til termostabilitet. Når asparagin i positi- 87 DK 177092 B1 on 135 blev substitueret med alanin, cystein, asparaginsyre, glutaminsyre, glycin, histi-din, isoleucin, leucin, methionin, phenylalanin, serin, threonin, valin eller tyrosin, var termostabilitet af modificeret GP bedre end for naturlig kartoffel type L GP. Med hensyn til substitution i position 135 var substitution med alanin (restaktivitet efter inkubation 5 ved 65°C i 2 minutter er 79,0%), cystein (restaktivitet efter inkubation ved 65°C i 2 minutter er 76,9%), glycin (restaktivitet efter inkubation ved 65°C i 2 minutter er 58,4%), methionin (restaktivitet efter inkubation ved 65°C i 2 minutter er 52,6%), serin (restaktivitet efter inkubation ved 65°C i 2 minutter er 86,5%), threonin (restaktivitet efter inkubation ved 65°C i 2 minutter er 62,4%) eller valin (restaktivitet efter inkubation ved 65°C 10 i 2 minutter er 79,3%) særligt udmærket med hensyn til termostabilitet. Når threonin i position 706 blev substitueret med cystein, isoleucin, leucin, valin eller tryptophan, var termostabilitet af modificeret GP bedre end for naturlig kartoffel type L GP. Med hensyn til substitution i position 706 var substitution med leucin (restaktivitet efter inkubation ved 65°C i 2 minutter er 57,8%) eller valin (restaktivitet efter inkubation ved 65°C i 2 15 minutter er 59,2%) særligt udmærket med hensyn til termostabilitet.

Som et resultat heraf blev det fundet, af termostabiliteten af modificeret GP ifølge den foreliggende opfindelse blev meget forbedret i sammenligning med naturlig kartoffel type L GP.

20 (Eksempel 3-2: Fremstilling af type H GP-enzym med forbedret termostabilitet) (1) Storskalafremstilling af enzym

Hver af Escherichia coli, der udtrykte kartoffel type H GP med forbedret termostabilitet, og Escherichia coli, der udtrykte Arabidopsis thaliana type H GP med forbedret termostabilitet som fremstillet i henholdsvis eksempel 2-2B og 2-2C, blev dyrket i et 25 TB-medium (indeholdende Terrific broth (GIBCO) 47 g/l, glycerol 4 ml/l og 50 pg/ml ampicillin) ved 37°C i 5 timer, IPTG og pyridoxin-hydrochlorid blev tilsat til denne dyrkningsopløsning til slutkoncentrationer på 0,1 mM IPTG og 1 mM pyridoxin-hydrochlorid, og dette blev dyrket yderligere ved 22°C i 24 timer. Derefter blev bakterieceller opsamlet ved at centrifugere kulturen, og kulturbestanddele blev fjernet ved vask med en 20 30 mM citratbuffer (pH 6,7). Bakterieceller efter vask blev suspenderet i en 20 mM citratbuffer (pH 6,7), bakterieceller blev lyseret med en sonikator og centrifugeret, og super-natanten blev anvendt som bakteriecelleekstrakt. Den resulterende bakteriecelleekstrakt blev oprenset ved ionbytterkromatografi og hydrofob kromatografi for at opsamle en oprenset enzymholdig aktiv fraktion, som udviste et enkelt bånd ved nativ PAGE 35 (nativ polyacrylamid-gelelektroforese).

88 DK 177092 B1 (2) Sammenligning af termostabiliteter af type H GP-enzymer med forbedret termostabilitet

Termostabilitet ved 60°C og 65°C af respektive GP’er med forbedret termostabilitet 5 som oprenset under (1) blev sammenlignet. Som kontrol blev der anvendt naturlig (ikke muteret) kartoffel type H GP og Arabidopsis thaliana type H GP, der var oprenset ved samme fremgangsmåde.

0,2 U/ml af en oprenset enzymopløsning (20 mM citratbuffer (pH 6,7)) blev inkuberet ved 58°C i 10 minutter, 60°C i 10 minutter eller 65°C i 2 minutter og holdt på is. En-10 zymopløsningen, der var holdt på is, blev fortyndet 10 gange med en 20 mM citratbuffer (pH 6,7), og enzymaktivitet blev målt ifølge den i eksempel 3-1 (2) beskrevne aktivitetsmålemetode. Et enzyms termostabilitet blev bedømt ved forholdet af enzymets enzymaktivitet ved 37°C efter inkubation (dvs. restaktivitet), når enzymets enzymaktivitet ved 37°C før inkubation ved 58°C i 10 minutter, 60°C i 10 minutter eller 65°C i 2 minut-15 ter tages til at være 100%. Resultater for kartoffel type H GP med forbedret termostabilitet og naturlig kartoffel type H GP er vist i følgende tabel 8 og figur 11. Resultater for Arabidopsis thaliana type H GP med forbedret termostabilitet og naturlig Arabidopsis thaliana type H GP er vist i følgende tabel 9 og figur 12.

20 Tabel 8

RpetektivitPt af Restaktivitet (%) af kartoffel Temperatur og inku- ™ H type H GP med forbedret ter- bationstid pp mostabilitet _____(Y36L+N133S+T628I) 58°C 10 min__0__75β_ 60°C 10 min__0__48J3_ 65°C 2 min 0 34,5

Tabel 9___ ~ " . „ I Restaktivitet (%) af I R^taWivifét(%)afArabidop-

Temperatur og inku- Arabidopsis s'= *f''an? HGP d bationstid .....r,,.____u forbedret termostabilitet __thaliana type H GP (Y40L+N136S+T631I) 58°C 10 min__V>__408_ 60°C 10 min__05__203_ 65°C 2 min 0,5 29,2

Ud fra disse resultater havde kartoffel type H GP med forbedret termostabilitet iføl-25 ge den foreliggende opfindelse en restaktivitet på 34,5% selv efter opvarmning ved 65°C i 2 minutter. På den anden side havde naturlig kartoffel type H GP en restaktivitet på 0% efter opvarmning ved 65°C i 2 minutter. Ud fra dette blev det fundet, at kartoffel 89 DK 177092 B1 type H GP med forbedret termostabilitet ifølge den foreliggende opfindelse har en høj termostabilitet i sammenligning med naturlig kartoffel type H GP.

Desuden havde Arabidopsis thaliana type H GP med forbedret termostabilitet ifølge den foreliggende opfindelse en restaktivitet på 29,2% selv efter opvarmning ved 65°C i 5 2 minutter. På den anden side havde naturlig Arabidopsis thaliana type H GP en rest aktivitet på 0,5% efter opvarmning ved 65°C i 2 minutter. Ud fra dette blev det fundet, at Arabidopsis thaliana type H GP med forbedret termostabilitet ifølge den foreliggende opfindelse har en høj termostabilitet i sammenligning med naturlig Arabidopsis thaliana type H GP.

10 (Eksempel 4: Syntese af amylose med en vægtgennemsnitlig molekylvægt på 600 kDa eller mere under anvendelse af α-glucanphosphorylase med forbedret termostabilitet)

Under anvendelse af α-glucanphosphorylase med forbedret termostabilitet ifølge den foreliggende opfindelse blev det undersøgt, om amylose med en vægtgennemsnit-15 lig molekylvægt på 600 kDa eller mere kan syntetiseres. Som a-glucanphosphorylase med forbedret termostabilitet blev der anvendt en hvilken som helst af de forskellige GP’er med forbedret termostabilitet (enkeltmutant F39L, enkeltmutant N135S, enkeltmutant T706I, dobbeltmutant (F39L+N135S), dobbeltmutant (F39L+T706I), dobbeltmutant (N135S+T706I) og trippelmutant (F39L+N135S+T706I)) som fremstillet i ovenstå-20 ende eksempel 3-1 (1).

Som kontrol blev der anvendt Bacillus stearothermophillus a-glucanphosphorylase (også betegnet Bacillus stearothermophillus) og Thermus aquaticus a-glucanphospho-rylase (også betegnet Thermus aquaticus).

En amylosesyntesereaktion blev udført ved 50°C i 18 timer under anvendelse af en 25 reaktionsopløsning med den i følgende tabel 10 beskrevne sammensætning.

Tabel 10_

Sammensætning af reaktionsopløsning

Maltotetraose(G4) 40 μM

Glucose-1-phosphat 250 mM

Acetatbuffer (pH 5,5) 200 mM

a-glucanphosphorylase 4 U/ml 90 DK 177092 B1

Udbyttet af amylose, der var syntetiseret ved denne reaktion, blev beregnet ved en beregningsmetode som beskrevet under 1.5 af ovennævnte “1. Målemetode og beregningsmetode”.

Den vægtgennemsnitlige molekylvægt af amylose syntetiseret ved denne reaktion 5 blev målt ved følgende fremgangsmåde. Amylose, der var syntetiseret ved denne reaktion, blev fuldstændigt opløst i 1N natriumhydroxid og neutraliseret med en hensigtsmæssig mængde saltsyre, og ca. 30 til 300 pg af en alikvot af amylose blev underkastet gelfiltreringskromatografi under anvendelse af et differentiale-refraktometer og en flervinklet lysspredningsdetektor tilsammen for at opnå en vægtgennemsnitlig molekyl-10 vægt.

Mere specifikt blev Shodex SB806M-HQ (fremstillet af SHOWA DENKO K.K.) anvendt som søjle, og en flervinklet lysspredningsdetektor (DAWN-DSP, fremstillet af Wyatt Technology) blev anvendt som detektor, og et differentiale-refraktometer (Shodex RI-71, fremstillet af SHOWA DENKO K.K.) blev anvendt ved at forbinde dem i 15 denne rækkefølge. Søjlen blev holdt ved 40°C, og som eluent blev der anvendt en 0,1 M natriumnitratopløsning ved en gennemstrømningshastighed på 1 ml/minut. Det resulterende signal blev opsamlet under anvendelse af et dataanalysesoftware (handelsnavn ASTRA, fremstillet af Wyatt Technology), og dette blev analyseret under anvendelse af samme software, hvorved der blev opnået en vægtgennemsnitlig molekylvægt.

20 Denne metode betegnes også som MALLS-analysemetode.

Udbytterne og molekylvægtene af syntetiseret amylose, der var opnået på denne måde, er vist i følgende tabel 11.

Tabel 11 25 _Udbytte og molekylvægt af syntetiseret amylose_

Udbytte af Molekylvægt α-glucanphosphorylase amylose af amylose _[%)_(kDa) GP med forbedret termostabilitet (F39L) 51,2 668 GP med forbedret termostabilitet (N135S) 47,8 735 GP med forbedret termostabilitet (T706I) 45,3 675 GP med forbedret termostabilitet (F39L+N135S) 44,7 673 GP med forbedret termostabilitet (F39L+T706I) 47,5 706 GP med forbedret termostabilitet (N135S+T706I) 42,7 655 GP med forbedret termostabilitet „ o R4C- (F39L+N135S+T7061) ’

Bacillus stearothermophillus 17,3 20,0

Thermus aquaticus_27,8_44,3 91 DK 177092 B1

Som beskrevet ovenfor blev det fundet, at GP med forbedret termostabilitet ifølge den foreliggende opfindelse kan syntetisere højmolekylær amylose med en vægtgennemsnitlig molekylvægt på ca. 600 kDa eller mere. Desuden blev det fundet, at GP med forbedret termostabilitet ifølge den foreliggende opfindelse har et udbytte af amy-5 lose på ca. 40% eller mere. Bacillus stearothermophillus GP og Thermus aquaticus GP, der blev anvendt som sammenligningseksempel, er enzymer med termostabilitet, men de kan ikke syntetisere højmolekylær amylose.

(Eksempel 5: Syntese af amylose ud fra saccharose under anvendelse af a-glucan-10 phosphorylase med forbedret termostabilitet)

Under anvendelse af α-glucanphosphorylase med forbedret termostabilitet ifølge den foreliggende opfindelse og under anvendelse af saccharose som råmateriale blev der syntetiseret amylose. Som α-glucanphosphorylase med forbedret termostabilitet blev der anvendt en hvilken som helst af de forskellige GP’er med forbedret termostabi-15 litet (enkeltmutant F39L, enkeltmutant N135S, enkeltmutant T706I, dobbeltmutant (F39L+N135S), dobbeltmutant (F39L+T706I), dobbeltmutant (N135S+T706I) og trip-pelmutant (F39L+N135S+T706I)) som fremstillet i ovenstående eksempel 3-1 (1).

En amylosesyntesereaktion blev udført ved 50°C i 18 timer under anvendelse afen reaktionsopløsning med den i følgende tabel 12 beskrevne sammensætning.

20

Tabel 12_

Sammensætning af reaktionsopløsning__

Saccharose 58,5 mM

Maltotetraose (G4) 10 μΜ

Uorganisk phosphorsyre (Pi) 10 mM

Saccharosephosphorylase 1 U/ml q-glucanphosphorylase_ 1 U/ml

Udbyttet (%) af amylose, der var syntetiseret ved denne reaktion, blev beregnet ved en beregningsligning som beskrevet under 1.7 af ovennævnte “1. Målemetode og 25 beregningsmetode”.

Den vægtgennemsnitlige molekylvægt af amylose, der var syntetiseret ved denne reaktion, blev målt ved samme metode som i eksempel 4 ovenfor. Udbytterne og de vægtgennemsnitlige molekylvægte af syntetiseret amylose opnået på denne måde er vist i følgende tabel 13.

30 92 DK 177092 B1

Tabel 13 _Udbytte og vægtgennemsnitlig molekylvægt af syntetiseret amylose Vægtgennem-Udbytte af snitlig molekyl-α-glucanphosphorylase amylose vægt af amy- (%) lose _(kDa) GP med forbedret termostabilitet (F39L) 50,8 672 GP med forbedret termostabilitet (N135S) 47,8 740 GP med forbedret termostabilitet (T706I) 44,6 675 GP med forbedret termostabilitet .. q R7.

(F39L+N135S) 44,y b/4 GP med forbedret termostabilitet (F39L+T706I) 47,5 707 GP med forbedret termostabilitet 49 q R£,7 (N135S+T706I) ’ GP med forbedret termostabilitet „ „ R4q (F39L+N135S+T706I)_^_b4y

Som beskrevet ovenfor blev det fundet, at GP med forbedret termostabilitet ifølge 5 den foreliggende opfindelse kan syntetisere amylose med høj molekylvægt på ca. 600 kDa ligesom naturlig GP, når amylose syntetiseres under anvendelse af saccharose som råmateriale. Desuden blev det fundet, at amyloseudbyttet er højt, såsom ca. 40% eller mere svarende til naturlig GP.

10 (Eksempel 6: Syntese af glucan ud fra glucose-1-phosphat under anvendelse af GP med forbedret termostabilitet under høje temperaturbetingelser (50°C, 55°C og 60°C))

Under anvendelse af en a-glucanphosphorylase med forbedret termostabilitet ifølge den foreliggende opfindelse og under anvendelse af glucose-1-phosphat som råmateriale blev amylose syntetiseret under høje temperaturbetingelser. GP med forbedret 15 termostabilitet (trippelmutant (F39L+N135S+T706I)) som fremstillet i eksempel 3-1 (1) blev anvendt, og som kontrol blev der anvendt naturlig kartoffel type L GP oprenset ved samme fremgangsmåde.

En amylosesyntetiserende reaktion blev udført ved at holde en reaktionsopløsning indeholdende G-1-P 6,1 g/l, maltotetraose (G4) 0,3 g/l og GP 20 U/l ved 37°C, 50°C, 20 55°C eller 60°C i 18 timer. Mængden af syntetiseret amylose i reaktionsproduktet blev målt med tiden. Mængden af syntetiseret amylose (g/l) blev beregnet baseret på følgende ligning.

(Mængde syntetiseret amylose (g/l)) 25 = (glucose (mM) anvendt til amylosesyntese) x 180 (molekylvægt af glucose) 93 DK 177092 B1 = [(uorganisk phosphorsyre (mM) produceret ved reaktionen) - (glucose (mM) efter reaktion)] x 180 (molekylvægt af glucose) Mængden af syntetiseret amylose efter reaktion i 18 timer er vist i følgende tabel 14 5 og figur 7.

Tabel 14 Mængde syntetiseret amylose (g/l)__

Reaktions- Naturlig kartoffel GP med forbedret temperatur__type L GP__termostabilitet_ 37°C__2β__3J_ 50°C__312__313_ 55°C__2i5__2J_ 60°C 0 1,5 10 Når GP med forbedret termostabilitet blev anvendt, blev der syntetiseret ca. 3 g/l amylose ved 37°C, 50°C og 55°C, og endog ca. 1,5 g/l amylose blev syntetiseret ved 60°C. Når der på den anden side blev anvendt naturlig kartoffel type L GP, blev der syntetiseret amylose ved 37°C, 50°C og 55°C, men amylose blev overhovedet ikke syntetiseret ved 60°C. Det antages, at i naturlig kartoffel type L GP blev GP inaktiveret 15 på et indledende trin af reaktionen ved 60°C. På den anden side antages det, at da GP med forbedret termostabilitet stabilt bevarede enzymaktivitet også ved 60°C, blev der i tilstrækkelig grad udført en amylosesyntetiserende reaktion. Når GP med forbedret termostabilitet blev anvendt ved hver temperatur på 37°C, 50°C, 55°C og 60°C, var mængden af syntetiseret amylose desuden større, end når der blev anvendt naturlig 20 kartoffel type L GP. Det antages, at mængden af syntetiseret amylose, når der anvendes GP med forbedret termostabilitet, forøges yderligere, efterhånden som reaktionstiden forlænges. Som beskrevet ovenfor blev det fundet, at GP med forbedret termostabilitet ifølge den foreliggende opfindelse kan syntetisere en glucan ved 60°C, ved hvilken temperatur naturlig kartoffel type L GP ikke kan reagere.

25 (Eksempel 7: Syntese af glucan ud fra glucose-1-phosphat under anvendelse af GP med forbedret termostabilitet ved 65°C og 70°C)

Under anvendelse af GP med forbedret termostabilitet (trippelmutant F39L+N135S+T706I) som fremstillet i eksempel 3-1 (1) som i eksempel 6 blev der 30 syntetiseret en glucan ud fra glucose-1-phosphat under yderligere højtemperaturbetingelser. Som kontrol anvendtes naturlig kartoffel type L GP.

94 DK 177092 B1

Ved at holde en reaktionsopløsning indeholdende G-1-P 15,2 g/l, maltotetraose (G4) 2,7 g/l og GP 200 U/l ved 37°C, 65°C eller 70°C i 4 timer blev der udført en amy-losesyntetiserende reaktion. Mængden af syntetiseret amylose blev beregnet som i eksempel 6. Efter en reaktionstid på 4 timer blev der, når naturlig kartoffel type L GP 5 blev anvendt, overhovedet ikke syntetiseret amylose ved 65°C og 70°C, men når der blev anvendt GP med forbedret termostabilitet, blev der syntetiseret ca. 5,6 g/l amylose ud fra 15,2 g G-1-P ved 65°C, og ca. 0,3 g/l amylose blev syntetiseret ud fra 15,2 g G-1-P ved 70°C. Som et resultat heraf blev det fundet, at naturlig kartoffel type L GP ikke kan syntetisere amylose ved 65°C til 70°C, men GP med forbedret termostabilitet beva-10 rer GP-aktivitet ved en høj temperatur såsom 70°C og har amylosesyntetiserende evne.

Baseret på resultaterne i eksempel 6 og 7 blev det fundet, at GP med forbedret termostabilitet ifølge den foreliggende opfindelse har amylosesyntetiserende evne ved høje temperaturbetingelser, under hvilke naturlig kartoffel type L GP overhovedet ikke 15 kan reagere.

(Eksempel 8: Bekræftelse af fjernelse af kontaminerende protein ved varmebehandling)

Det blev bekræftet, at følgende fremgangsmåde kan anvendes til let at oprense a-20 glucanphosphorylase med forbedret termostabilitet under anvendelse af varmebehandling.

Et Escherichia coli-gen (TG-1), der udtrykker GP med forbedret termostabilitet (trippelmutant (F39L+N135S+T706I)) som fremstillet i eksempel 2-1A, blev dyrket i et LB-medium som i eksempel 2-1A. Som kontrol blev Escherichia coli (TG-1), der ud-25 trykker naturlig kartoffel type L α-glucanphosphorylase, dyrket i et LB-medium som i eksempel 2-1A. Bakterieceller blev opsamlet ved at centrifugere dyrkningsopløsningen, bakterieceller blev suspenderet i en buffer, og denne blev sonikeret for at opnå en bakteriecelleekstrakt. Denne bakteriecelleekstrakt blev opvarmet i et vandbad ved 60°C i 0 til 60 minutter og centrifugeret for at fjerne uopløselige proteiner, hvilket gav en super-30 natant. Denne supernatants GP-aktivitet og proteinindhold blev målt, og et GP-enzyms specifikke aktivitet blev opnået. GP-aktivitet blev målt under anvendelse af den i eksempel 3-1 (2) beskrevne aktivitetsmålemetode, og proteinindholdet blev målt under anvendelse af Bradford-metoden (Bradford, M., Anal. Biochem., 72, 248-254 (1976).

Bradford-metoden er en kolorimetrisk metode, ved hvilken et kromogent substrat bin-35 des til alle de proteiner, der er indeholdt i en opløsning. I den foreliggende beskrivelse 95 DK 177092 B1 blev måling udført under anvendelse af et proteinassaykit (Nippon Bio-Rad Laboratories, Inc.), og bovint globulin blev anvendt som standard.

Den specifikke aktivitet af et GP-enzym blev beregnet ved følgende metode.

5 Specifik aktivitet (U/ml) = (a-glucanphosphorylaseaktivitet) / (masse mg protein indeholdt i supernatant)

Figur 6 viser ændringen i specifik aktivitet med tiden af et GP-enzym med forbedret termostabilitet (betegnet GP med forbedret termostabilitet (F39L+N135S+T706I i figur 10 6)) og naturlig kartoffel type L GP-enzym.

Som vist i figur 6 blev den specifikke aktivitet af GP med forbedret termostabilitet forøget ca. 10 gange efter opvarmning ved 60°C. Kontaminerende proteiner blev næsten fuldstændigt varmedenatureret og fjernet. I modsætning hertil blev den specifikke aktivitet af naturlig kartoffel type L GP reduceret med tiden. Det antages, at dette skyl-15 des, at ikke blot kontaminerende proteiner, men også GP-proteinet blev denatureret.

På denne måde blev det fundet, at GP med forbedret termostabilitet på enkel måde kan oprenses ved varmebehandling.

(Eksempel 9: Bekræftelse af fjernelse af kontaminerende proteiner ved varmebehand-20 ling)

Som i eksempel 8 blev Escherichia coli (TG-1), der udtrykker et gen af GP med forbedret termostabilitet (trippelmutant (F39L+N135S+T706I)), dyrket, og en bakteriecelleekstrakt blev fremstillet. Under anvendelse af denne bakteriecelleekstrakt blev det bekræftet, at amylaseaktivitet og phosphataseaktivitet kan reduceres til et niveau, som 25 kan anvendes i industriel produktion af amylose eller G-1-P, ved varmebehandling ved 60°C.

Som i eksempel 8 blev en bakteriecelleekstrakt opvarmet i et vandbad ved 60°C i 30 minutter, og uopløselige proteiner blev fjernet ved centrifugering til opnåelse af en supernatant. Denne supernatants phosphataseaktivitet og amylaseaktivitet blev målt.

30 Phosphataseaktivitet blev målt ved at holde en reaktionsopløsning, der indeholdt 100 μΙ af denne supernatant og 100 μΙ 50 mM glucose-1-phosphat, ved 37°C i 60 minutter og kvantificere fri uorganisk phosphorsyre, der blev produceret ud fra glucose-1-phosphat, i en reaktionsopløsning ved en fremgangsmåde som beskrevet i (1. Målemetode og beregningsmetode). Den mængde af et enzym, som producerede 1 pmol uor-35 ganisk phosphorsyre i ét minut, blev defineret som én enhed (U). Amylaseaktivitet blev 96 DK 177092 B1 opnået ved at holde en reaktionsopløsning indeholdende 25 μΙ af supernatanten og 25 μΙ 0,5% amylose (vægtgennemsnitlig molekylvægt ca. 50 kDa) ved 37°C i 60 minutter, tilsætte 1 ml afen iodopløsning (0,1% kaliumiodid, 0,01%) og måle reduktionsgraden af iodfarveudvikling ledsaget af omdannelse af amylose i en reaktionsopløsning til lav-5 molekylær amylose. Den aktivitet, der var i stand til at reducere absorbansen ved A660 med 10% i ét minut, blev defineret som 1 U.

Amylaseaktivitet (U/min) = (absorbans ved A660 nm før reaktion - absorbans ved A660 nm efter reaktion) + 10 (absorbans ved A660 nm før reaktion) x 100 10 + (tid (min)) Følgende tabel 15 viser den resterende mængde phosphataseaktivitet og amylaseaktivitet i en bakteriecelleekstrakt.

Som vist i tabel 15, når aktiviteten af en bakteriecelleekstrakt før opvarmning tages 15 til at være 100%, var phosphataseaktivitet og amylaseaktivitet en sådan, at phosphataseaktivitet var ca. 3%, og amylaseaktivitet var ca. 0,3% efter opvarmning ved 60°C, og disse to kontaminerende proteiner var næsten inaktiveret.

Tabel 15___ __Phosphataseaktivitet (%) Amylaseaktivitet (%) Før opvarmning__100__100_

Efter opvarmning ved _ . _ „ 60°C i 30 minutter__|__|_ 20 På denne måde er a-glucanphosphorylase med forbedret termostabilitet ifølge den foreliggende opfindelse et plante-GP-enzym, som ikke mister aktivitet selv efter varmebehandling ved 60°C, og det blev fundet, at ved at udføre varmebehandling ved 60°C er det muligt let at producere udmærket GP, som kun indeholder lidt amylaseaktivitet 25 og phosphataseaktivitet.

(Eksempel 10: Stabilitet af GP-protein)

Det er beskrevet, at naturlig kartoffel type L GP-proteiner let nedbrydes. Selv når disse GP’er afkøles efter oprensning, nedbrydes de gradvist under lagring. Når et en-30 zym nedbrydes, optræder der generelt en ændring i struktur, en ændring i enzymets beskaffenhed, reduktion i aktivitet og lignende. Hvis et GP-proteins stabilitet kan forøges, vil ovennævnte faktorers indflydelse blive reduceret, og dette er fordelagtigt med hensyn til lagring og anvendelse af et enzym.

97 DK 177092 B1

Et naturligt kartoffel type L GP-protein og syv typer GP-proteiner med forbedret termostabilitet (enkeltmutant F39L, enkeltmutant N135S, enkeltmutant T706I, dobbeltmutant F39L+N135S, dobbeltmutant F39L+T706I, dobbeltmutant N135S+T706I, trip-pelmutant F39L+N135S+T706I) fremstillet i eksempel 3-1 (1) blev lagret ved 4°C, og 5 GP-proteinets molekylvægt blev undersøgt med tiden i 5 måneder. Desuden blev molekylvægten af et GP-protein, der blev lagret ved 37°C i 10 dage, undersøgt på lignende måde. Umiddelbart efter oprensning og efter lagring ved 4°C i 5 måneder blev molekylvægten undersøgt ved polyacrylamid-gelelektroforese (nativ PAGE), og resultaterne er vist i figur 13. Den mængde protein, der blev sat på en gel, var lige stor for alle 10 GP-proteiner.

Som et resultat heraf udviste naturlig kartoffel type L GP og syv typer GP med forbedret termostabilitet alle et bånd ved en position for en molekylvægt på ca. 210 kDa (en monomer af GP har en molekylvægt på ca. 104 kDa og danner en dimer) umiddelbart efter oprensning. På den anden side havde naturlig kartoffel type L GP og en 15 N135S-mutant efter lagring ved 4°C i 5 måneder en molekylvægt på ca. 140 kDa, hvilket var mindre end umiddelbart efter oprensning. Dette viser, at naturlig kartoffel type L GP og en enkeltmutant 135S blev nedbrudt under lagring. Naturlig kartoffel type L GP og en N135S-mutant, også ved lagring ved 37°C i 10 dage, blev nedbrudt under lagring. De andre seks typer GP'er med forbedret termostabilitet (enkeltmutant F39L, en-20 keltmutant T706I, dobbeltmutant F39L+N135S, dobbeltmutant F39L+T706I, dobbelt mutant N135S+T706I, trippelmutant F39L+N135S+T706I) havde efter lagring ved 4°C i 5 måneder en molekylvægt på ca. 210 kDa, hvilket er den samme som umiddelbart efter oprensning, og nedbrydning af proteinerne blev ikke erkendt. Desuden havde disse seks typer GP’er med forbedret termostabilitet, også efter lagring ved 37°C i 10 25 dage, ingen ændring i molekylvægt, og nedbrydning af GP-proteinet blev ikke erkendt.

Dette viser, at disse GP’er med forbedret termostabilitet har udmærket nedbrydningsresistens og har højere stabilitet end naturlig kartoffel type L GP ved mellem 4°C og 37°C. Ud fra dette blev det fundet, at substitution i en F39-position og substitution i en T706-position ikke blot giver den virkning, at det forbedrer termostabilitetsvirkningen, 30 men også den virkning, at det undertrykker nedbrydning af et GP-protein.

(Eksempel 11: Syntese af glucose-1-phosphat)

(1) Syntese af G-1-P under anvendelse af GP med forbedret termostabilitet ved 65°C

Under anvendelse af en α-glucanphosphorylase med forbedret termostabilitet ifølge 35 den foreliggende opfindelse og under anvendelse af en glucan og uorganisk phosphor- 98 DK 177092 B1 syre som råmateriale blev G-1-P syntetiseret ved 65°C. GP med forbedret termostabilitet (trippelmutant (F39L+N135S+T706I)) som fremstillet i eksempel 3-1 (1) blev anvendt, og som kontrol anvendtes naturlig kartoffel type L GP, der var oprenset ved samme fremgangsmåde. En reaktionsopløsning indeholdende 300 mM 5 phosphatbuffer (pH 7,0), 10 g/l dextrin og 1000 U/l af en hvilken som helst af GP’erne blev holdt ved 37°C eller 65°C i 18 timer, og en G-1-P-syntesereaktion blev udført.

Mængden af syntetiseret G-1-P blev beregnet ved at multiplicere G-1-P-koncentrationen (mM), der var opnået ved fremgangsmåden til kvantificering af glucose-1-phosphat som beskrevet under 1.3 af ”1. Målemetode og 10 beregningsmetode” ovenfor, med 260, hvilket er molekylvægten af G-1-P. Mængden af syntetiseret G-1-P efter reaktionen er vist i følgende tabel 16.

Tabel 16 Mængde syntetiseret glucose-1-phosphat (g/l) _

Reaktions- Naturlig kartoffel type L GP GP med forbedret temperatur___termostabilitet_ 37°C__315__42_ 65°C 0,0 3,7 15 Når naturlig kartoffel type L GP blev anvendt, blev G-1-P ikke syntetiseret ved 65°C. Når GP med forbedret termostabilitet blev anvendt, var det imidlertid muligt at producere G-1-P selv ved 65°C.

20 (2) Syntese af G-1-P under anvendelse af GP med forbedret termostabilitet ved 70°C

Som i eksempel 11 (1) ovenfor blev der under anvendelse af GP med forbedret termostabilitet ifølge den foreliggende opfindelse og naturlig kartoffel type L GP og under anvendelse af en glucan og uorganisk phosphorsyre som råmaterialer syntetiseret G-1-P ved 70°C. En reaktionsopløsning indeholdende en 300 mM 25 phosphatbuffer (pH 7,0), 10 g/l dextrin og 10.000 U/l af en hvilken som helst af GP’erne blev inkuberet ved 70°C i 4 timer, og G-1-P blev syntetiseret. Mængden af syntetiseret G-1-P blev beregnet som i ovenstående eksempel.

Når naturlig kartoffel type L GP blev anvendt, blev G-1-P overhovedet ikke syntetiseret ved 70°C, men når der blev anvendt GP med forbedret termostabilitet, blev 30 der syntetiseret ca. 1 g G-1-P.

Som beskrevet ovenfor blev den foreliggende opfindelse eksemplificeret under anvendelse af foretrukne udførelsesformer for den foreliggende opfindelse, men dette skal ikke opfattes som en begrænsning af den foreliggende opfindelse til disse udførel- 99 DK 177092 B1 sesformer. Det er klart, at omfanget af den foreliggende opfindelse kun skal fortolkes af kravene. Det er klart, at fagmanden på området kan udøve et ækvivalent omfang baseret på beskrivelsen af den foreliggende opfindelse og almindelig teknisk viden ud fra den specifikke beskrivelse af foretrukne udførelsesformer for den foreliggende opfin-5 delse. Det er klart, at selve indholdet af patenter, patentansøgninger og referencer, der er citeret i den foreliggende beskrivelse, skal inkorporeres som reference, som om indholdet deraf specifikt er beskrevet i den foreliggende beskrivelse.

INDUSTRIEL ANVENDELIGHED

10 Ifølge den foreliggende opfindelse opnås der et planteafledt GP-enzym med ud mærket termostabilitet ved høje temperaturer (fx 60°C eller højere), a-glucanphospho-rylase med forbedret termostabilitet ifølge den foreliggende opfindelse kan anvendes i en glucansyntetiserende reaktion under høje temperaturbetingelser (fx 60°C eller højere), under hvilke et naturligt GP-enzym ikke kan reagere.

15 Når et gen, der koder for α-glucanphosphorylase med forbedret termostabilitet iføl ge den foreliggende opfindelse (fx et gen, der koder for GP med forbedret termostabilitet, som er opnået ved at forbedre termostabiliteten af kartoffel GP), højudtrykkes under anvendelse af en mesofil bakterie såsom Escherichia coli som vært ved at opvarme en bakteriecelleekstrakt, som indeholder et enzym med forbedret termostabilitet, 20 ved 60°C, kan kontaminerende enzymer stammende fra en værtsbakterie fjernes på enkel måde. Især kan amylaseaktivitet og phosphataseaktivitet, som er et stort problem, især under industriel udnyttelse af et GP-enzym, i betragtelig grad reduceres ved varmebehandling. Derfor er enzymet ifølge den foreliggende opfindelse særligt nyttigt til enzymoprensning.

25 Fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse er ikke blot effektiv med kar toffel GP og Arabidopsis thaliana GP, men kan også fortrinsvis anvendes til at forbedre termostabiliteten af andre gruppe A GP’er, der udviser høj homologi med en amino-syresekvens af kartoffel GP eller Arabidopsis thaliana GP. Ved at anvende fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse kan der fremstilles GP med forbedret 30 termostabilitet, der stammende fra en anden organismeart end kartoffel og Arabidopsis thaliana.

Ifølge den foreliggende opfindelse tilvejebringes GP med forbedret termostabilitet, i hvilken nedbrydning af et enzymprotein er undertrykt, og lagerstabilitet er forbedret.

100 DK 177092 B1 (Forklaring af sekvensliste) SEQ ID NO: 1: basesekvens, som koder for kartoffel type L a-glucanphosphory-lase; SEQ ID NO: 2: aminosyresekvens af kartoffel type L a-glucanphosphorylase; 5 SEQ ID NO: 3: basesekvens, som koder for sød kartoffel type L a-glucan- phosphorylase; SEQ ID NO: 4: aminosyresekvens af sød kartoffel type L a-glucanphosphorylase; SEQ ID NO: 5: basesekvens, som koder for kartoffel anden type L a-glucanphosphorylase; 10 SEQ ID NO: 6: aminosyresekvens af kartoffel anden type L a-glucanphosphory- lase; SEQ ID NO: 7: basesekvens, som koder for favabønne type L a-glucanphosphorylase; SEQ ID NO: 8: aminosyresekvens af favabønne type L a-glucanphosphorylase; 15 SEQ ID NO: 9: basesekvens, som koder for Arabidopsis thaliana type L a-glucan- phosphorylase; SEQ ID NO: 10: aminosyresekvens af Arabidopsis thaliana type L a-glucan-phosphorylase; SEQ ID NO: 11: basesekvens, som koder for spinat type L a-glucanphosphorylase; 20 SEQ ID NO: 12: aminosyresekvens af spinat type L a-glucanphosphorylase; SEQ ID NO: 13: basesekvens, som koder for majs type L a-glucanphosphorylase; SEQ ID NO: 14: aminosyresekvens af majs type L a-glucanphosphorylase; SEQ ID NO: 15: basesekvens, som koder for ris type L a-glucanphosphorylase; SEQ ID NO: 16: aminosyresekvens af ris type L a-glucanphosphorylase; 25 SEQ ID NO: 17: basesekvens, som koder for ris anden type L a-glucanphospho rylase; SEQ ID NO: 18: aminosyresekvens af ris anden type L a-glucanphosphorylase; SEQ ID NO: 19: basesekvens, som koder for hvede type H a-glucanphospho-rylase; 30 SEQ ID NO: 20: aminosyresekvens af hvede type H a-glucanphosphorylase; SEQ ID NO: 21: basesekvens, som koder for Citrus hybrid kultivartype H a-glucanphosphorylase; SEQ ID NO: 22: aminosyresekvens af Citrus hybrid kultivartype H a-glucanphosphorylase; 101 DK 177092 B1 SEQ ID NO: 23: basesekvens, som koder for ris type H a-glucanphosphorylase; SEQ ID NO: 24: aminosyresekvens af ris type H a-glucanphosphorylase; SEQ ID NO: 25: basesekvens, som koder for favabønne type H a-glucanphosphorylase; 5 SEQ ID NO: 26: aminosyresekvens af favabønne type H a-glucanphosphorylase; SEQ ID NO: 27: basesekvens, som koder for Arabidopsis thaliana type H a-glucan-phosphorylase; SEQ ID NO: 28: aminosyresekvens af Arabidopsis thaliana type H a-glucanphosphorylase; 10 SEQ ID NO: 29: basesekvens, som koder for kartoffel type H a-glucanphosphory lase; SEQ ID NO: 30: aminosyresekvens af kartoffel type H a-glucanphosphorylase; SEQ ID NO: 31: en partiel sekvens af en basesekvens, som koder for sød kartoffel type H a-glucanphosphorylase; 15 SEQ ID NO: 32: aminosyresekvens af sød kartoffel type H a-glucanphosphorylase; SEQ ID NO: 33: basesekvens, som koder for kartoffel type L a-glucanphosphorylase med forbedret termostabilitet; SEQ ID NO: 34: aminosyresekvens af kartoffel type L α-glucanphosphorylase med forbedret termostabilitet; 20 SEQ ID NO: 35: aminosyresekvens af Escherichia coli-maltodextrinphosphorylase; SEQ ID NOS: 36 and 37: basesekvens omkring et bindingssted med et plasmid pMW118 som vist i figur 2; SEQ ID NO: 38: basesekvens af PCR-primer 1; SEQ ID NO: 39: basesekvens af PCR-primer 2; 25 SEQ ID NO: 40: basesekvens af PCR-primer 3; SEQ ID NO: 41: basesekvens af PCR-primer 4; SEQ ID NO: 42: basesekvens af PCR-primer 5; SEQ ID NO: 43: basesekvens af PCR-primer 6; SEQ ID NO: 44: aminosyresekvens af motivsekvens 1L; 30 SEQ ID NO: 45: aminosyresekvens af motivsekvens 1H; SEQ ID NO: 46: aminosyresekvens af motivsekvens 2; SEQ ID NO: 47: aminosyresekvens af motivsekvens 3L; SEQ ID NO: 48: aminosyresekvens af motivsekvens 3H.

-1 - DK 177092 B1

SEKVENSLISTE

<110> EZAKI GLICO CO., LTD.

<120> FREMGANGSMÅDE TIL FORBEDRING AF TERMOSTABILITETEN AF ALFA-GLUCANPHOSPHORYLASE (GP)

<130> EG012PCT

<140> PCT/JP2004/008362 <141> 2004-06-15 <150> JP 2003-173972 <151> 2003-06-18 <160> 48 <170> Patentln version 3.3 <210> 1 <211> 3101

<212> DNA

<213> Solanum tuberosum <220>

<221> CDS

<222> (44)..(2941) <220> <221> mat_peptid <222> (194)..(2941) <400> 1 atcactctca ttcgaaaagc tagatttgca tagagagcac aaa atg gcg act gca 55

Met Ala Thr Ala -50 aat gga gca cac ttg ttc aac cat tac age tee aat tee aga tte atc 103

Asn Gly Ala His Leu Phe Asn His Tyr Ser Ser Asn Ser Arg Phe Ile -45 -40 -35 cat ttc act tet aga aac aca age tee aaa ttg tte ett acc aaa acc 151

His Phe Thr Ser Arg Asn Thr Ser Ser Lys Leu Phe Leu Thr Lys Thr -30 -25 -20 -15 tee cat ttt egg aga ccc aaa ege tgt ttc cat gtc aac aat acc ttg 199

Ser His Phe Arg Arg Pro Lys Arg Cys Phe His Val Asn Asn Thr Leu -10 -5 -1 1 agt gag aaa att cac cat ccc att act gaa caa ggt ggt gag age gac 247

Ser Glu Lys Ile His His Pro Ile Thr Glu Gin Gly Gly Glu Ser Asp 5 10 15 ctg agt tet ttt get eet gat gee gca tet att acc tea agt atc aaa 295

Leu Ser Ser Phe Ala Pro Asp Ala Ala Ser Ile Thr Ser Ser Ile Lys 20 25 30 tac cat gca gaa ttc aca eet gta ttc tet eet gaa agg ttt gag etc 343 -2- DK 177092 B1

Tyr His Ala Glu Phe Thr Pro Val Phe Ser Pro Glu Arg Phe Glu Leu 35 40 45 50 cct aag gca ttc ttt gca aca get caa agt gtt egt gat teg etc ett 391

Pro Lys Ala Phe Phe Ala Thr Ala Gin Ser Val Arg Asp Ser Leu Leu 55 60 65 att aat tgg aat get aeg tat gat att tat gaa aag ctg aac atg aag 439

Ile Asn Trp Asn Ala Thr Tyr Asp Ile Tyr Glu Lys Leu Asn Met Lys 70 75 80 caa gcg tac tat eta tee atg gaa ttt ctg cag ggt aga gca ttg tta 487

Gin Ala Tyr Tyr Leu Ser Met Glu Phe Leu Gin Gly Arg Ala Leu Leu 85 90 95 aat gca att ggt aat ctg gag ett act ggt gca ttt geg gaa get ttg 535

Asn Ala Ile Gly Asn Leu Glu Leu Thr Gly Ala Phe Ala Glu Ala Leu 100 105 110 aaa aac ett ggc cac aat eta gaa aat gtg get tet cag gaa cca gat 583

Lys Asn Leu Gly His Asn Leu Glu Asn Val Ala Ser Gin Glu Pro Asp 115 120 125 130 get get ett gga aat ggg ggt ttg gga egg ett get tee tgt ttt ctg 631

Ala Ala Leu Gly Asn Gly Gly Leu Gly Arg Leu Ala Ser Cys Phe Leu 135 140 145 gac tet ttg gca aca eta aac tac cca gca tgg ggc tat gga ett agg 679

Asp Ser Leu Ala Thr Leu Asn Tyr Pro Ala Trp Gly Tyr Gly Leu Arg 150 155 160 tac aag tat ggt tta ttt aag caa egg att aca aaa gat ggt cag gag 727

Tyr Lys Tyr Gly Leu Phe Lys Gin Arg Ile Thr Lys Asp Gly Gin Glu 165 170 175 gag gtg get gaa gat tgg ett gaa att ggc agt cca tgg gaa gtt gtg 775

Glu Val Ala Glu Asp Trp Leu Glu Ile Gly Ser Pro Trp Glu Val Val 180 185 190 agg aat gat gtt tea tat cct atc aaa tte tat gga aaa gtc tet aca 823

Arg Asn Asp Val Ser Tyr Pro Ile Lys Phe Tyr Gly Lys Val Ser Thr 195 200 205 210 gga tea gat gga aag agg tat tgg att ggt gga gag gat ata aag gca 871

Gly Ser Asp Gly Lys Arg Tyr Trp Ile Gly Gly Glu Asp Ile Lys Ala 215 220 225 gtt geg tat gat gtt ccc ata cca ggg tat aag acc aga acc aca atc 919

Val Ala Tyr Asp Val Pro Ile Pro Gly Tyr Lys Thr Arg Thr Thr Ile 230 235 240 age ett ega ctg tgg tet aca cag gtt cca tea geg gat ttt gat tta 967

Ser Leu Arg Leu Trp Ser Thr Gin Val Pro Ser Ala Asp Phe Asp Leu 245 250 255 tet get tte aat get gga gag cac acc aaa gca tgt gaa gcc caa gca 1015

Ser Ala Phe Asn Ala Gly Glu His Thr Lys Ala Cys Glu Ala Gin Ala 260 265 270 -3 - DK 177092 B1 aac get gag aag ata tgt tac ata etc tac eet ggg gat gaa tea gag 1063

Asn Ala Glu Lys Ile Cys Tyr Ile Leu Tyr Pro Gly Asp Glu Ser Glu 275 280 285 290 gag gga aag ate ett egg ttg aag caa caa tat ace tta tgc teg get 1111

Glu Gly Lys Ile Leu Arg Leu Lys Gin Gin Tyr Thr Leu Cys Ser Ala 295 300 305 tet etc caa gat att att tet ega ttt gag agg aga tea ggt gat egt 1159

Ser Leu Gin Asp Ile Ile Ser Arg Phe Glu Arg Arg Ser Gly Asp Arg 310 315 320 att aag tgg gaa gag ttt eet gaa aaa gtt get gtg cag atg aat gac 1207

Ile Lys Trp Glu Glu Phe Pro Glu Lys Val Ala Val Gin Met Asn Asp 325 330 335 act cac eet aca ett tgt atc eet gag ctg atg aga ata ttg ata gat 1255

Thr His Pro Thr Leu Cys Ile Pro Glu Leu Met Arg Ile Leu Ile Asp 340 345 350 ctg aag ggc ttg aat tgg aat gaa get tgg aat att act caa aga act 1303

Leu Lys Gly Leu Asn Trp Asn Glu Ala Trp Asn Ile Thr Gin Arg Thr 355 360 365 370 gtg gee tac aca aac cat act gtt ttg eet gag gea ctg gag aaa tgg 1351

Val Ala Tyr Thr Asn His Thr Val Leu Pro Glu Ala Leu Glu Lys Trp 375 380 385 agt tat gaa ttg atg cag aaa etc ett ccc aga cat gtc gaa atc att 1399

Ser Tyr Glu Leu Met Gin Lys Leu Leu Pro Arg His Val Glu Ile Ile 390 395 400 gag geg att gac gag gag ctg gta cat gaa att gta tta aaa tat ggt 1447

Glu Ala Ile Asp Glu Glu Leu Val His Glu Ile Val Leu Lys Tyr Gly 405 410 415 tea atg gat ctg aac aaa ttg gag gaa aag ttg act aca atg aga atc 1495

Ser Met Asp Leu Asn Lys Leu Glu Glu Lys Leu Thr Thr Met Arg Ile 420 425 430 tta gaa aat ttt gat ett ccc agt tet gtt get gaa tta ttt att aag 1543

Leu Glu Asn Phe Asp Leu Pro Ser Ser Val Ala Glu Leu Phe Ile Lys 435 440 445 450 eet gaa ate tea gtt gat gat gat act gaa aca gta gaa gtc cat gac 1591

Pro Glu Ile Ser Val Asp Asp Asp Thr Glu Thr Val Glu Val His Asp 455 460 465 aaa gtt gaa get tee gat aaa gtt gtg act aat gat gaa gat gac act 1639

Lys Val Glu Ala Ser Asp Lys Val Val Thr Asn Asp Glu Asp Asp Thr 470 475 480 ggt aag aaa act agt gtg aag ata gaa gea get gea gaa aaa gac att 1687

Gly Lys Lys Thr Ser Val Lys Ile Glu Ala Ala Ala Glu Lys Asp Ile 485 490 495 gac aag aaa act ccc gtg agt ccg gaa cca get gtt ata cca eet aag 1735

Asp Lys Lys Thr Pro Val Ser Pro Glu Pro Ala Val Ile Pro Pro Lys 500 505 510 -4- DK 177092 B1 aag gta cgc atg gcc aac ttg tgt gtt gtg ggc ggc cat get gtt aat 1783

Lys Val Arg Met Ala Asn Len Cys Val Val Gly Gly His Ala Val Asn 515 520 525 530 gga gtt get gag ate cat agt gaa att gtg aag gag gag gtt tte aat 1831

Gly Val Ala Glu Ile His Ser Glu Ile Val Lys Glu Glu Val Phe Asn 535 540 545 gac ttc tat gag ctc tgg ccg gaa aag ttc caa aac aaa aca aat gga 1879

Asp Phe Tyr Glu Leu Trp Pro Glu Lys Phe Gin Asn Lys Thr Asn Gly 550 555 560 gtg act cca aga aga tgg att egt ttc tgc aat cct eet ett agt gcc 1927

Val Thr Pro Arg Arg Trp Ile Arg Phe Cys Asn Pro Pro Leu Ser Ala 565 570 575 ate ata act aag tgg act ggt aca gag gat tgg gtc ctg aaa act gaa 1975

Ile Ile Thr Lys Trp Thr Gly Thr Glu Asp Trp Val Leu Lys Thr Glu 580 585 590 aag ttg gea gaa ttg cag aag ttt get gat aat gaa gat ett caa aat 2023

Lys Leu Ala Glu Leu Gin Lys Phe Ala Asp Asn Glu Asp Leu Gin Asn 595 600 605 610 gag tgg agg gaa gea aaa agg age aac aag att aaa gtt gtc tee ttt 2071

Glu Trp Arg Glu Ala Lys Arg Ser Asn Lys Ile Lys Val Val Ser Phe 615 620 625 etc aaa gaa aag aca ggg tat tet gtt gtc cca gat gea atg ttt gat 2119

Leu Lys Glu Lys Thr Gly Tyr Ser Val Val Pro Asp Ala Met Phe Asp 630 635 640 att cag gta aaa cgc att cat gag tac aag ega caa ctg tta aat atc 2167

Ile Gin Val Lys Arg Ile His Glu Tyr Lys Arg Gin Leu Leu Asn Ile 645 650 655 ttc ggc ate gtt tat egg tat aag aag atg aaa gaa atg aca get gea 2215

Phe Gly Ile Val Tyr Arg Tyr Lys Lys Met Lys Glu Met Thr Ala Ala 660 665 670 gaa aga aag act aac ttc gtt cct ega gta tgc ata ttt ggg gga aaa 2263

Glu Arg Lys Thr Asn Phe Val Pro Arg Val Cys Ile Phe Gly Gly Lys 675 680 685 690 get ttt gcc aca tat gtg caa gcc aag agg att gta aaa ttt atc aca 2311

Ala Phe Ala Thr Tyr Val Gin Ala Lys Arg Ile Val Lys Phe Ile Thr 695 700 705 gat gtt ggt get act ata aat cat gat cca gaa atc ggt gat ctg ttg 2359

Asp Val Gly Ala Thr Ile Asn His Asp Pro Glu Ile Gly Asp Leu Leu 710 715 720 aag gta gtc ttt gtg cca gat tac aat gtc agt gtt get gaa ttg eta 2407

Lys Val Val Phe Val Pro Asp Tyr Asn Val Ser Val Ala Glu Leu Leu 725 730 735 att cct get age gat eta tea gaa cat atc agt aeg get gga atg gag 2455

Ile Pro Ala Ser Asp Leu Ser Glu His Ile Ser Thr Ala Gly Met Glu -5- DK 177092 B1 740 745 750 gcc agt gga acc agt aat atg aag ttt gca atg aat ggt tgt atc caa 2503

Ala Ser Gly Thr Ser Asn Met Lys Phe Ala Met Asn Gly Cys Ile Gin 755 760 765 770 att ggt aca ttg gat ggc get aat gtt gaa ata agg gaa gag gtt gga 2551

Ile Gly Thr Leu Asp Gly Ala Asn Val Glu Ile Arg Glu Glu Val Gly 775 780 785 gaa gaa aac ttc ttt etc ttt ggt get caa get cat gaa att gca ggg 2599

Glu Glu Asn Phe Phe Leu Phe Gly Ala Gin Ala His Glu Ile Ala Gly 790 795 800 ett aga aaa gaa aga get gac gga aag ttt gta cct gat gaa egt ttt 2647

Leu Arg Lys Glu Arg Ala Asp Gly Lys Phe Val Pro Asp Glu Arg Phe 805 810 815 gaa gag gtg aag gaa ttt gtt aga age ggt get ttt ggc tet tat aac 2695

Glu Glu Val Lys Glu Phe Val Arg Ser Gly Ala Phe Gly Ser Tyr Asn 820 825 830 tat gat gac eta att gga teg ttg gaa gga aat gaa ggt ttt ggc egt 2743

Tyr Asp Asp Leu Ile Gly Ser Leu Glu Gly Asn Glu Gly Phe Gly Arg 835 840 845 850 get gac tat ttc ett gtg ggc aag gac ttc ccc agt tac ata gaa tgc 2791

Ala Asp Tyr Phe Leu Val Gly Lys Asp Phe Pro Ser Tyr Ile Glu Cys 855 860 865 caa gag aaa gtt gat gag gca tat cgc gac cag aaa agg tgg aca aeg 2839

Gin Glu Lys Val Asp Glu Ala Tyr Arg Asp Gin Lys Arg Trp Thr Thr 870 875 880 atg tea atc ttg aat aca gcg gga teg tac aag ttc age agt gac aga 2887

Met Ser Ile Leu Asn Thr Ala Gly Ser Tyr Lys Phe Ser Ser Asp Arg 885 890 895 aca atc cat gaa tat gcc aaa gac att tgg aac att gaa get gtg gaa 2935

Thr Ile His Glu Tyr Ala Lys Asp Ile Trp Asn Ile Glu Ala Val Glu 900 905 910 ata gca taagaggggg aagtgaatga aaaataacaa aggeaeagta agtagtttet 2991

Ile Ala 915 etttttatea tgtgatgaag gtatataatg tatgtgtaag aggatgatgt tattaccaca 3051 taataagaga tgaagagtet cattttgctt caaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3101 <210> 2 <211> 966

<212> PRT

<213> Solanum tuberosum <400> 2

Met Ala Thr Ala Asn Gly Ala His Leu Phe Asn His Tyr Ser Ser Asn ί -6- DK 177092 B1 -50 -45 -40 -35

Ser Arg Phe Ile His Phe Thr Ser Arg Asn Thr Ser Ser Lys Leu Phe -30 -25 -20

Leu Thr Lys Thr Ser His Phe Arg Arg Pro Lys Arg Cys Phe His Val -15 -10 -5

Asn Asn Thr Leu Ser Glu Lys Ile His His Pro Ile Thr Glu Gin Gly -11 5 10

Gly Glu Ser Asp Leu Ser Ser Phe Ala Pro Asp Ala Ala Ser Ile Thr 15 20 25 30

Ser Ser Ile Lys Tyr His Ala Glu Phe Thr Pro Val Phe Ser Pro Glu 35 40 45

Arg Phe Glu Leu Pro Lys Ala Phe Phe Ala Thr Ala Gin Ser Val Arg 50 55 60

Asp Ser Leu Leu Ile Asn Trp Asn Ala Thr Tyr Asp Ile Tyr Glu Lys 65 70 75

Leu Asn Met Lys Gin Ala Tyr Tyr Leu Ser Met Glu Phe Leu Gin Gly 80 85 90

Arg Ala Leu Leu Asn Ala Ile Gly Asn Leu Glu Leu Thr Gly Ala Phe 95 100 105 110

Ala Glu Ala Leu Lys Asn Leu Gly His Asn Leu Glu Asn Val Ala Ser 115 120 125

Gin Glu Pro Asp Ala Ala Leu Gly Asn Gly Gly Leu Gly Arg Leu Ala 130 135 140

Ser Cys Phe Leu Asp Ser Leu Ala Thr Leu Asn Tyr Pro Ala Trp Gly 145 150 155

Tyr Gly Leu Arg Tyr Lys Tyr Gly Leu Phe Lys Gin Arg Ile Thr Lys 160 165 170

Asp Gly Gin Glu Glu Val Ala Glu Asp Trp Leu Glu Ile Gly Ser Pro 175 180 185 190 -7- DK 177092 B1

Trp Glu Val Val Arg Asn Asp Val Ser Tyr Pro Ile Lys Phe Tyr Gly 195 200 205

Lys Val Ser Thr Gly Ser Asp Gly Lys Arg Tyr Trp Ile Gly Gly Glu 210 215 220

Asp Ile Lys Ala Val Ala Tyr Asp Val Pro Ile Pro Gly Tyr Lys Thr 225 230 235

Arg Thr Thr Ile Ser Leu Arg Leu Trp Ser Thr Gin Val Pro Ser Ala 240 245 250

Asp Phe Asp Leu Ser Ala Phe Asn Ala Gly Glu His Thr Lys Ala Cys 255 260 265 270

Glu Ala Gin Ala Asn Ala Glu Lys Ile Cys Tyr Ile Leu Tyr Pro Gly 275 280 285

Asp Glu Ser Glu Glu Gly Lys Ile Leu Arg Leu Lys Gin Gin Tyr Thr 290 295 300

Leu Cys Ser Ala Ser Leu Gin Asp Ile Ile Ser Arg Phe Glu Arg Arg 305 310 315

Ser Gly Asp Arg Ile Lys Trp Glu Glu Phe Pro Glu Lys Val Ala Val 320 325 330

Gin Met Asn Asp Thr His Pro Thr Leu Cys Ile Pro Glu Leu Met Arg 335 340 345 350

Ile Leu Ile Asp Leu Lys Gly Leu Asn Trp Asn Glu Ala Trp Asn Ile 355 360 365

Thr Gin Arg Thr Val Ala Tyr Thr Asn His Thr Val Leu Pro Glu Ala 370 375 380

Leu Glu Lys Trp Ser Tyr Glu Leu Met Gin Lys Leu Leu Pro Arg His 385 390 395

Val Glu Ile Ile Glu Ala Ile Asp Glu Glu Leu Val His Glu Ile Val 400 405 410

Leu Lys Tyr Gly Ser Met Asp Leu Asn Lys Leu Glu Glu Lys Leu Thr 415 420 425 430 -8- DK 177092 B1

Thr Met Arg Ile Leu Glu Asn Phe Asp Leu Pro Ser Ser Val Ala Glu 435 440 445

Leu Phe Ile Lys Pro Glu Ile Ser Val Asp Asp Asp Thr Glu Thr Val 450 455 460

Glu Val His Asp Lys Val Glu Ala Ser Asp Lys Val Val Thr Asn Asp 465 470 475

Glu Asp Asp Thr Gly Lys Lys Thr Ser Val Lys Ile Glu Ala Ala Ala 480 485 490

Glu Lys Asp Ile Asp Lys Lys Thr Pro Val Ser Pro Glu Pro Ala Val 495 500 505 510

Ile Pro Pro Lys Lys Val Arg Met Ala Asn Leu Cys Val Val Gly Gly 515 520 525

His Ala Val Asn Gly Val Ala Glu Ile His Ser Glu Ile Val Lys Glu 530 535 540

Glu Val Phe Asn Asp Phe Tyr Glu Leu Trp Pro Glu Lys Phe Gin Asn 545 550 555

Lys Thr Asn Gly Val Thr Pro Arg Arg Trp Ile Arg Phe Cys Asn Pro 560 565 570

Pro Leu Ser Ala Ile Ile Thr Lys Trp Thr Gly Thr Glu Asp Trp Val 575 580 585 590

Leu Lys Thr Glu Lys Leu Ala Glu Leu Gin Lys Phe Ala Asp Asn Glu 595 600 605

Asp Leu Gin Asn Glu Trp Arg Glu Ala Lys Arg Ser Asn Lys Ile Lys 610 615 620

Val Val Ser Phe Leu Lys Glu Lys Thr Gly Tyr Ser Val Val Pro Asp 625 630 635

Ala Met Phe Asp Ile Gin Val Lys Arg Ile His Glu Tyr Lys Arg Gin 640 645 650

Leu Leu Asn Ile Phe Gly Ile Val Tyr Arg Tyr Lys Lys Met Lys Glu 655 660 665 670 a -9- DK 177092 B1

Met Thr Ala Ala Glu Arg Lys Thr Asn Phe Val Pro Arg Val Cys Ile 675 680 685

Phe Gly Gly Lys Ala Phe Ala Thr Tyr Val Gin Ala Lys Arg Ile Val 690 695 700

Lys Phe Ile Thr Asp Val Gly Ala Thr Ile Asn His Asp Pro Glu Ile 705 710 715

Gly Asp Leu Leu Lys Val Val Phe Val Pro Asp Tyr Asn Val Ser Val 720 725 730

Ala Glu Leu Leu Ile Pro Ala Ser Asp Leu Ser Glu His Ile Ser Thr 735 740 745 750

Ala Gly Met Glu Ala Ser Gly Thr Ser Asn Met Lys Phe Ala Met Asn 755 760 765

Gly Cys Ile Gin Ile Gly Thr Leu Asp Gly Ala Asn Val Glu Ile Arg 770 775 780

Glu Glu Val Gly Glu Glu Asn Phe Phe Leu Phe Gly Ala Gin Ala His 785 790 795

Glu Ile Ala Gly Leu Arg Lys Glu Arg Ala Asp Gly Lys Phe Val Pro 800 805 810

Asp Glu Arg Phe Glu Glu Val Lys Glu Phe Val Arg Ser Gly Ala Phe 815 820 825 830

Gly Ser Tyr Asn Tyr Asp Asp Leu Ile Gly Ser Leu Glu Gly Asn Glu 835 840 845

Gly Phe Gly Arg Ala Asp Tyr Phe Leu Val Gly Lys Asp Phe Pro Ser 850 855 860

Tyr Ile Glu Cys Gin Glu Lys Val Asp Glu Ala Tyr Arg Asp Gin Lys 865 870 875

Arg Trp Thr Thr Met Ser Ile Leu Asn Thr Ala Gly Ser Tyr Lys Phe 880 885 890

Ser Ser Asp Arg Thr Ile His Glu Tyr Ala Lys Asp Ile Trp Asn Ile -10- DK 177092 B1 895 900 905 910

Glu Ala Val Glu Ile Ala 915 <210> 3 <211> 3292

<212> DNA

<213> Ipomoea batatas <220>

<221> CDS

<222> (86)..(2950) <220> <221> mat_peptid <222> (215)..(2950) <400> 3 gaattccgct tagctaatat cgcaccgata gagagagacc gacagagagc aatggcagct 60 tcaccgtact ccgtttctcg gagea atg teg agg ett tee ggc att aeg eet 112

Met Ser Arg Leu Ser Gly Ile Thr Pro -40 -35 ega get ega gat gat ega tet caa tte cag aat ccg agg etc gaa att 160

Arg Ala Arg Asp Asp Arg Ser Gin Phe Gin Asn Pro Arg Leu Glu Ile -30 -25 -20 gcg gtt eet gac ega aeg gee ggc tta cag aga aeg aaa egg act etc 208

Ala Val Pro Asp Arg Thr Ala Gly Leu Gin Arg Thr Lys Arg Thr Leu -15 -10 -5 ett gtc aag tgc gtg ttg gat gag aeg aaa caa aeg att cag cat gtg 256

Leu Val Lys Cys Val Leu Asp Glu Thr Lys Gin Thr Ile Gin His Val -11 5 10 gtt act gaa aaa aat gaa ggt acc tta ett gat get gea tet att get 304

Val Thr Glu Lys Asn Glu Gly Thr Leu Leu Asp Ala Ala Ser Ile Ala 15 20 25 30 tea age ate aaa tac cat gea gaa tte tea cca gea ttt tet ccc gag 352

Ser Ser Ile Lys Tyr His Ala Glu Phe Ser Pro Ala Phe Ser Pro Glu 35 40 45 agg ttt gag ett cca aag get tac ttt gea aca gea caa agt gtt egt 400

Arg Phe Glu Leu Pro Lys Ala Tyr Phe Ala Thr Ala Gin Ser Val Arg 50 55 60 gat gea ctg att gtc aat tgg aat gea aca tac gat tac tat gag aag 448

Asp Ala Leu Ile Val Asn Trp Asn Ala Thr Tyr Asp Tyr Tyr Glu Lys 65 70 75 ttg aat atg aag cag gea tac tat etc tet atg gag ttt eta cag ggt 496

Leu Asn Met Lys Gin Ala Tyr Tyr Leu Ser Met Glu Phe Leu Gin Gly 80 85 90 DK 177092 B1 - π - aga gca ttg tta aat gca att ggt aat ctg gag ctt act ggt gaa tat 544

Arg Ala Leu Leu Asn Ala Ile Gly Asn Leu Glu Leu Thr Gly Glu Tyr 95 100 105 110 get gaa gca ctg aac aag ctt ggc cac aat eta gaa aat gtt get tet 592

Ala Glu Ala Leu Asn Lys Leu Gly His Asn Leu Glu Asn Val Ala Ser 115 120 125 aag gag cca gat get get ctt gga aat gga ggt ttg ggg egg ctt get 640

Lys Glu Pro Asp Ala Ala Leu Gly Asn Gly Gly Leu Gly Arg Leu Ala 130 135 140 tee tgt ttt ctt gac tet ttg gca aca ttg aat tat cca gca tgg ggg 688

Ser Cys Phe Leu Asp Ser Leu Ala Thr Leu Asn Tyr Pro Ala Trp Gly 145 150 155 tat gga etc agg tac aag tat gga tta ttt aag caa ege att aca aaa 736

Tyr Gly Leu Arg Tyr Lys Tyr Gly Leu Phe Lys Gin Arg Ile Thr Lys 160 165 170 gat gga cag gag gag gtg get gaa gat tgg ctt gaa ctt ggc aat eet 784

Asp Gly Gin Glu Glu Val Ala Glu Asp Trp Leu Glu Leu Gly Asn Pro 175 180 185 190 tgg gag ata ate aga atg gat gtt tea tac eet gtg aag tte ttt ggc 832

Trp Glu Ile Ile Arg Met Asp Val Ser Tyr Pro Val Lys Phe phe Gly 195 200 205 aaa gtg ate aca ggg tea gat gga aag aag cac tgg att ggt ggg gag 880

Lys Val Ile Thr Gly Ser Asp Gly Lys Lys His Trp Ile Gly Gly Glu 210 215 220 gac att ctg gca gtt gca tac gat gtt cca att cca gga tat aag act 928

Asp Ile Leu Ala Val Ala Tyr Asp Val Pro Ile Pro Gly Tyr Lys Thr 225 230 235 aga acc aca att age ctt ege eta tgg tet act aag gtt cca tee gag 976

Arg Thr Thr Ile Ser Leu Arg Leu Trp Ser Thr Lys Val Pro Ser Glu 240 245 250 gat ttt gat eta tat tet tte aat gca gga gag cac acc aaa gcg tgt 1024

Asp Phe Asp Leu Tyr Ser Phe Asn Ala Gly Glu His Thr Lys Ala Cys 255 260 265 270 gag gcc caa gca aat get gaa aaa ata tgt tac ata etc tac eet ggg 1072

Glu Ala Gin Ala Asn Ala Glu Lys Ile Cys Tyr Ile Leu Tyr Pro Gly 275 280 285 gat gaa tea att gaa gga aaa att tta ega ctg aag caa caa tac acc 1120

Asp Glu Ser Ile Glu Gly Lys Ile Leu Arg Leu Lys Gin Gin Tyr Thr 290 295 300 ttg tgc tet get tet eta caa gat ata att gcc ega ttt gag agg aga 1168

Leu Cys Ser Ala Ser Leu Gin Asp Ile Ile Ala Arg Phe Glu Arg Arg 305 310 315 tet ggt gaa tat gtt aaa tgg gag gag ttt eet gaa aaa gtt get gtc 1216

Ser Gly Glu Tyr Val Lys Trp Glu Glu Phe Pro Glu Lys Val Ala Val - 12- DK 177092 B1 320 325 330 cag atg aat gac acc cac cca act eta tgt atc eet gaa ctg att aga 1264

Gin Met Asn Asp Thr His Pro Thr Leu Cys Ile Pro Glu Leu Ile Arg 335 340 345 350 ata ttg ata gat ttg aag ggc ttg agt tgg aag gaa get tgg aat atc 1312

Ile Leu Ile Asp Leu Lys Gly Leu Ser Trp Lys Glu Ala Trp Asn Ile 355 360 365 act caa agg act gtg get tac aca aat cat act gtt ctg cct gag gea 1360

Thr Gin Arg Thr Val Ala Tyr Thr Asn His Thr Val Leu Pro Glu Ala 370 375 380 ctg gag aaa tgg agt tat gag ctg atg gag aag ctg etc cct aga cat 1408

Leu Glu Lys Trp Ser Tyr Glu Leu Met Glu Lys Leu Leu Pro Arg His 385 390 395 ata gag att ata gag atg ata gac gag cag ctg ata aat gaa ata gta 1456

Ile Glu Ile Ile Glu Met Ile Asp Glu Gin Leu Ile Asn Glu Ile Val 400 405 410 tea gaa tat ggc aeg tea gat ett gac atg tta gaa aaa aag ttg aat 1504

Ser Glu Tyr Gly Thr Ser Asp Leu Asp Met Leu Glu Lys Lys Leu Asn 415 420 425 430 gat atg aga att ttg gag aat ttt gat att ccc age tet att gcc aac 1552

Asp Met Arg Ile Leu Glu Asn Phe Asp Ile Pro Ser Ser Ile Ala Asn 435 440 445 ttg ttt acc aaa cca aag gaa act tet att gtt gat cct agt gaa gaa 1600

Leu Phe Thr Lys Pro Lys Glu Thr Ser Ile Val Asp Pro Ser Glu Glu 450 455 460 gtt gaa gtt tet ggt aaa gtg gtg act gag agt gtt gaa gtt tet gat 1648

Val Glu Val Ser Gly Lys Val Val Thr Glu Ser Val Glu Val Ser Asp 465 470 475 aaa gtg gtg act gag agt gaa aaa gat gaa ett gaa gaa aaa gac aca 1696

Lys Val Val Thr Glu Ser Glu Lys Asp Glu Leu Glu Glu Lys Asp Thr 480 485 490 gaa ctg gag aaa gat gag gac cca gta cca get cct ata cca ccc aag 1744

Glu Leu Glu Lys Asp Glu Asp Pro Val Pro Ala Pro Ile Pro Pro Lys 495 500 505 510 atg gtc ege atg get aat etc tgc gtt gtt ggt ggt cat get gta aat 1792

Met Val Arg Met Ala Asn Leu Cys Val Val Gly Gly His Ala Val Asn 515 520 525 gga gtt gcc gag att cat agt gat ata gtg aag gaa gat gtt ttt aat 1840

Gly Val Ala Glu Ile His Ser Asp Ile Val Lys Glu Asp Val Phe Asn 530 535 540 gac ttt tac cag ett tgg cct gag aaa ttt caa aac aaa aca aat ggt 1888

Asp Phe Tyr Gin Leu Trp Pro Glu Lys Phe Gin Asn Lys Thr Asn Gly 545 550 555 gtg aca cca aga aga tgg atc ega ttt tgt aat cct get eta agt aat 1936 - 13- DK 177092 B1

Val Thr Pro Arg Arg Trp Ile Arg Phe Cys Asn Pro Ala Leu Ser Asn 560 565 570 ate att act aag tgg att ggt aca gag gac tgg gtc eta aac aca gaa 1984

Ile Ile Thr Lys Trp Ile Gly Thr Glu Asp Trp Val Leu Asn Thr Glu 575 580 585 590 aag ttg gea gaa ctg cgc aag ttt gea gat aat gaa gat ett caa ata 2032

Lys Leu Ala Glu Leu Arg Lys Phe Ala Asp Asn Glu Asp Leu Gin Ile 595 600 605 gag tgg agg get gea aaa aga age aac aaa gtt aag gtt gee tea ttc 2080

Glu Trp Arg Ala Ala Lys Arg Ser Asn Lys Val Lys Val Ala Ser Phe 610 615 620 eta aaa gaa agg aca ggg tat teg gtc age ccc aat gea atg ttt gat 2128

Leu Lys Glu Arg Thr Gly Tyr Ser Val Ser Pro Asn Ala Met Phe Asp 625 630 635 ate cag gta aaa ega att cat gaa tac aag cgc caa ctc ttg aat atc 2176

Ile Gin Val Lys Arg Ile His Glu Tyr Lys Arg Gin Leu Leu Asn Ile 640 645 650 ttg gga att gtt tat cgc tac aag cag atg aaa gaa atg age gea ega 2224

Leu Gly Ile Val Tyr Arg Tyr Lys Gin Met Lys Glu Met Ser Ala Arg 655 660 665 670 gaa aga gaa get aag ttt gtt cct ega gta tgc ata ttt gga gga aaa 2272

Glu Arg Glu Ala Lys Phe Val Pro Arg Val Cys Ile Phe Gly Gly Lys 675 680 685 get ttt get aca tat gtt caa get aaa agg atc gea aaa ttc ata aca 2320

Ala Phe Ala Thr Tyr Val Gin Ala Lys Arg Ile Ala Lys Phe Ile Thr 690 695 700 gat gtt gga gcc acc ata aac cat gat cct gag ata ggt gat ttg ttg 2368

Asp Val Gly Ala Thr Ile Asn His Asp Pro Glu Ile Gly Asp Leu Leu 705 710 715 aag gtt att ttt gtc cca gat tac aat gtc agt get gea gaa ctg ctg 2416

Lys Val Ile Phe Val Pro Asp Tyr Asn Val Ser Ala Ala Glu Leu Leu 720 725 730 att cca get agt gga ett tea caa cat atc agt act gcc gga atg gag 2464

Ile Pro Ala Ser Gly Leu Ser Gin His Ile Ser Thr Ala Gly Met Glu 735 740 745 750 gcc agt gga caa age aat atg aaa ttt gcc atg aat ggt tgc atc tta 2512

Ala Ser Gly Gin Ser Asn Met Lys Phe Ala Met Asn Gly Cys Ile Leu 755 760 765 att ggg acc ttg gat gga gcc aat gtt gag ata agg caa gag gtt gga 2560

Ile Gly Thr Leu Asp Gly Ala Asn Val Glu Ile Arg Gin Glu Val Gly 770 775 780 gag gaa aac ttc ttt etc ttt ggg get gaa get cat gag att gea ggg 2608

Glu Glu Asn Phe Phe Leu Phe Gly Ala Glu Ala His Glu Ile Ala Gly 785 790 795 - 14- DK 177092 B1 ctt egg aaa gaa aga get gag gga aag ttt gta cca gat gaa egt ttt 2656

Leu Arg Lys Glu Arg Ala Glu Gly Lys Phe Val Pro Asp Glu Arg Phe 800 805 810 gag gaa gtc aag gaa tte ata aag egt ggt gtt ttt ggc tee aat acc 2704

Glu Glu Val Lys Glu Phe Ile Lys Arg Gly Val Phe Gly Ser Asn Thr 815 820 825 830 tat gat gag ett ett gga tet ttg gag gga aat gaa ggc ttt ggt egt 2752

Tyr Asp Glu Leu Leu Gly Ser Leu Glu Gly Asn Glu Gly Phe Gly Arg 835 840 845 gga gac tat tte ett gtg ggc aag gac tte eet agt tac ata gaa tgc 2800

Gly Asp Tyr Phe Leu Val Gly Lys Asp Phe Pro Ser Tyr Ile Glu Cys 850 855 860 caa gag aag gtt gat gag gea tat ega gac caa aag ata tgg act aga 2848

Gin Glu Lys Val Asp Glu Ala Tyr Arg Asp Gin Lys Ile Trp Thr Arg 865 870 875 atg tea ate ttg aac aca gcc gga agt tac aaa tte age agt gat aga 2896

Met Ser Ile Leu Asn Thr Ala Gly Ser Tyr Lys Phe Ser Ser Asp Arg 880 885 890 aca att cat gaa tat gee aag gac ata tgg aac atc cag cca gtt gtg 2944

Thr Ile His Glu Tyr Ala Lys Asp Ile Trp Asn Ile Gin Pro Val Val 895 900 905 910 ttt ccc tagaaattaa agaatgaacc aattttctga geageagtaa taaaatgtcg 3000

Phe Pro tcttaggtcc tatgttcttg tttatgtaca tgtaggtgca agatcctgtg atgatctaat 3060 aaatcttgct teettetatt atgcagatcc ttttataagg gtcatgtact tctgatcatc 3120 cttaataatc aatattttag tttcacatcg gacataagaa gttgattgca gtaagaaatc 3180 atgagttttt actactgtaa attctacaac ttggaataca aggatgacta ttccagaggc 3240 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aa 3292 <210> 4 <211> 955

<212> PRT

<213> Ipomoea batatas <400> 4

Met Ser Arg Leu Ser Gly Ile Thr Pro Arg Ala Arg Asp Asp Arg Ser -40 -35 -30

Gin Phe Gin Asn Pro Arg Leu Glu Ile Ala Val Pro Asp Arg Thr Ala -25 -20 -15

Gly Leu Gin Arg Thr Lys Arg Thr Leu Leu Val Lys Cys Val Leu Asp -10 -5 -11 5 - 15- DK 177092 B1

Glu Thr Lys Gin Thr Ile Gin His Val Val Thr Glu Lys Asn Glu Gly 10 15 20

Thr Leu Leu Asp Ala Ala Ser Ile Ala Ser Ser Ile Lys Tyr His Ala 25 30 35

Glu Phe Ser Pro Ala Phe Ser Pro Glu Arg Phe Glu Leu Pro Lys Ala 40 45 50

Tyr Phe Ala Thr Ala Gin Ser Val Arg Asp Ala Leu Ile Val Asn Trp 55 60 65

Asn Ala Thr Tyr Asp Tyr Tyr Glu Lys Leu Asn Met Lys Gin Ala Tyr 70 75 80 85

Tyr Leu Ser Met Glu Phe Leu Gin Gly Arg Ala Leu Leu Asn Ala Ile 90 95 100

Gly Asn Leu Glu Leu Thr Gly Glu Tyr Ala Glu Ala Leu Asn Lys Leu 105 110 115

Gly His Asn Leu Glu Asn Val Ala Ser Lys Glu Pro Asp Ala Ala Leu 120 125 130

Gly Asn Gly Gly Leu Gly Arg Leu Ala Ser Cys Phe Leu Asp Ser Leu 135 140 145

Ala Thr Leu Asn Tyr Pro Ala Trp Gly Tyr Gly Leu Arg Tyr Lys Tyr 150 155 160 165

Gly Leu Phe Lys Gin Arg Ile Thr Lys Asp Gly Gin Glu Glu Val Ala 170 175 180

Glu Asp Trp Leu Glu Leu Gly Asn Pro Trp Glu Ile Ile Arg Met Asp 185 190 195

Val Ser Tyr Pro Val Lys Phe Phe Gly Lys Val Ile Thr Gly Ser Asp 200 205 210

Gly Lys Lys His Trp Ile Gly Gly Glu Asp Ile Leu Ala Val Ala Tyr 215 220 225 - 16- DK 177092 B1

Asp Val Pro Ile Pro Gly Tyr Lys Thr Arg Thr Thr Ile Ser Leu Arg 230 235 240 245

Leu Trp Ser Thr Lys Val Pro Ser Glu Asp Phe Asp Leu Tyr Ser Phe 250 255 260

Asn Ala Gly Glu His Thr Lys Ala Cys Glu Ala Gin Ala Asn Ala Glu 265 270 275

Lys Ile Cys Tyr Ile Leu Tyr Pro Gly Asp Glu Ser Ile Glu Gly Lys 280 285 290

Ile Leu Arg Leu Lys Gin Gin Tyr Thr Leu Cys Ser Ala Ser Leu Gin 295 300 305

Asp Ile Ile Ala Arg Phe Glu Arg Arg Ser Gly Glu Tyr Val Lys Trp 310 315 320 325

Glu Glu Phe Pro Glu Lys Val Ala Val Gin Met Asn Asp Thr His Pro 330 335 340

Thr Leu Cys Ile Pro Glu Leu Ile Arg Ile Leu Ile Asp Leu Lys Gly 345 350 355

Leu Ser Trp Lys Glu Ala Trp Asn Ile Thr Gin Arg Thr Val Ala Tyr 360 365 370

Thr Asn His Thr Val Leu Pro Glu Ala Leu Glu Lys Trp Ser Tyr Glu 375 380 385

Leu Met Glu Lys Leu Leu Pro Arg His Ile Glu Ile Ile Glu Met Ile 390 395 400 405

Asp Glu Gin Leu Ile Asn Glu Ile Val Ser Glu Tyr Gly Thr Ser Asp 410 415 420

Leu Asp Met Leu Glu Lys Lys Leu Asn Asp Met Arg Ile Leu Glu Asn 425 430 435

Phe Asp Ile Pro Ser Ser Ile Ala Asn Leu Phe Thr Lys Pro Lys Glu 440 445 450

Thr Ser Ile Val Asp Pro Ser Glu Glu Val Glu Val Ser Gly Lys Val 455 460 465 -17- DK 177092 B1

Val Thr Glu Ser Val Glu Val Ser Asp Lys Val Val Thr Glu Ser Glu 470 475 480 485

Lys Asp Glu Leu Glu Glu Lys Asp Thr Glu Leu Glu Lys Asp Glu Asp 490 495 500

Pro Val Pro Ala Pro Ile Pro Pro Lys Met Val Arg Met Ala Asn Leu 505 510 515

Cys Val Val Gly Gly His Ala Val Asn Gly Val Ala Glu Ile His Ser 520 525 530

Asp Ile Val Lys Glu Asp Val phe Asn Asp Phe Tyr Gin Leu Trp Pro 535 540 545

Glu Lys Phe Gin Asn Lys Thr Asn Gly Val Thr Pro Arg Arg Trp Ile 550 555 560 565

Arg Phe Cys Asn Pro Ala Leu Ser Asn Ile Ile Thr Lys Trp Ile Gly 570 575 580

Thr Glu Asp Trp Val Leu Asn Thr Glu Lys Leu Ala Glu Leu Arg Lys 585 590 595

Phe Ala Asp Asn Glu Asp Leu Gin Ile Glu Trp Arg Ala Ala Lys Arg 600 605 610

Ser Asn Lys Val Lys Val Ala Ser Phe Leu Lys Glu Arg Thr Gly Tyr 615 620 625

Ser Val Ser Pro Asn Ala Met Phe Asp Ile Gin Val Lys Arg Ile His 630 635 640 645

Glu Tyr Lys Arg Gin Leu Leu Asn Ile Leu Gly Ile Val Tyr Arg Tyr 650 655 660

Lys Gin Met Lys Glu Met Ser Ala Arg Glu Arg Glu Ala Lys Phe Val 665 670 675

Pro Arg Val Cys Ile Phe Gly Gly Lys Ala Phe Ala Thr Tyr Val Gin 680 685 690

Ala Lys Arg Ile Ala Lys Phe Ile Thr Asp Val Gly Ala Thr Ile Asn 695 700 705 -18- DK 177092 B1

His Asp Pro Glu Ile Gly Asp Leu Leu Lys Val Ile Phe Val Pro Asp 710 715 720 725

Tyr Asn Val Ser Ala Ala Glu Leu Leu Ile Pro Ala Ser Gly Leu Ser 730 735 740

Gin His Ile Ser Thr Ala Gly Met Glu Ala Ser Gly Gin Ser Asn Met 745 750 755

Lys Phe Ala Met Asn Gly Cys Ile Leu Ile Gly Thr Leu Asp Gly Ala 760 765 770

Asn Val Glu Ile Arg Gin Glu Val Gly Glu Glu Asn Phe Phe Leu Phe 775 780 785

Gly Ala Glu Ala His Glu Ile Ala Gly Leu Arg Lys Glu Arg Ala Glu 790 795 800 805

Gly Lys Phe Val Pro Asp Glu Arg Phe Glu Glu Val Lys Glu Phe Ile 810 815 820

Lys Arg Gly Val Phe Gly Ser Asn Thr Tyr Asp Glu Leu Leu Gly Ser 825 830 835

Leu Glu Gly Asn Glu Gly Phe Gly Arg Gly Asp Tyr Phe Leu Val Gly 840 845 850

Lys Asp Phe Pro Ser Tyr Ile Glu Cys Gin Glu Lys Val Asp Glu Ala 855 860 865

Tyr Arg Asp Gin Lys Ile Trp Thr Arg Met Ser Ile Leu Asn Thr Ala 870 875 880 885

Gly Ser Tyr Lys Phe Ser Ser Asp Arg Thr Ile His Glu Tyr Ala Lys 890 895 900

Asp Ile Trp Asn Ile Gin Pro Val Val Phe Pro 905 910 <210> 5 <211> 3171

<212> DNA

<213> Solanum tuberosum - 19- DK 177092 B1 <220>

<221> CDS

<222> (87)..(3008) <220> <221> mat_peptid <222> (330)..(3008) <400> 5 tttttttttt caacatgcac aacaattatt ttgattaaat tttgtatcta aaaatttagc 60 attttgaaat tcagttcaga gacatc atg gca act ttt get gtc tet gga ttg 113

Met Ala Thr Phe Ala Val Ser Gly Leu -80 -75 aac tea att tea agt att tet agt ttt aat aac aat tte aga age aaa 161

Asn Ser Ile Ser Ser Ile Ser Ser Phe Asn Asn Asn Phe Arg Ser Lys -70 -65 -60 aac tea aac att ttg ttg agt aga agg agg att tta ttg ttc agt ttt 209

Asn Ser Asn Ile Leu Leu Ser Arg Arg Arg Ile Leu Leu Phe Ser Phe -55 -50 -45 aga aga aga aga aga agt ttc tet gtt age agt gtt get agt gat caa 257

Arg Arg Arg Arg Arg Ser Phe Ser Val Ser Ser Val Ala Ser Asp Gin -40 -35 -30 -25 aag cag aag aca aag gat tet tee tet gat gaa gga ttt aca tta gat 305

Lys Gin Lys Thr Lys Asp Ser Ser Ser Asp Glu Gly Phe Thr Leu Asp -20 -15 -10 gtt ttt cag ccg gac tec aeg tet gtt tta tea agt ata aag tat cac 353

Val Phe Gin Pro Asp Ser Thr Ser Val Leu Ser Ser Ile Lys Tyr His -5 -11 5 get gag ttc aca cca tea ttt tet eet gag aag ttt gaa ett ccc aag 401

Ala Glu Phe Thr Pro Ser Phe Ser Pro Glu Lys Phe Glu Leu Pro Lys 10 15 20 gca tac tat gca act gca gag agt gtt ega gat aeg etc att ata aat 449

Ala Tyr Tyr Ala Thr Ala Glu Ser Val Arg Asp Thr Leu Ile Ile Asn 25 30 35 40 tgg aat gcc aca tac gaa ttc tat gaa aag atg aat gta aag cag gca 497

Trp Asn Ala Thr Tyr Glu Phe Tyr Glu Lys Met Asn Val Lys Gin Ala 45 50 55 tat tac ttg tet atg gaa ttt ett cag gga aga get tta ctc aat get 545

Tyr Tyr Leu Ser Met Glu Phe Leu Gin Gly Arg Ala Leu Leu Asn Ala 60 65 70 att ggt aac ttg ggg eta acc gga cct tat gca gat get tta act aag 593

Ile Gly Asn Leu Gly Leu Thr Gly Pro Tyr Ala Asp Ala Leu Thr Lys 75 80 85 ctc gga tac agt tta gag gat gta gcc agg cag gaa ccg gat gca get 641

Leu Gly Tyr Ser Leu Glu Asp Val Ala Arg Gin Glu Pro Asp Ala Ala 90 95 100 -20- DK 177092 B1 tta ggt aat gga ggt tta gga aga ctt get tet tgc ttt ctg gac tea 689

Leu Gly Asn Gly Gly Leu Gly Arg Leu Ala Ser Cys Phe Leu Asp Ser 105 110 115 120 atg gcg aca eta aac tac eet gea tgg ggc tat gga ctt aga tac caa 737

Met Ala Thr Leu Asn Tyr Pro Ala Trp Gly Tyr Gly Leu Arg Tyr Gin 125 130 135 tat ggc ctt tte aaa cag ctt att aca aaa gat gga cag gag gaa gtt 785

Tyr Gly Leu Phe Lys Gin Leu Ile Thr Lys Asp Gly Gin Glu Glu Val 140 145 150 get gaa aat tgg etc gag atg gga aat cca tgg gaa att gtg agg aat 833

Ala Glu Asn Trp Leu Glu Met Gly Asn Pro Trp Glu Ile Val Arg Asn 155 160 165 gat att teg tat ccc gta aaa tte tat ggg aag gtc att gaa gga get 881

Asp Ile Ser Tyr Pro Val Lys Phe Tyr Gly Lys Val Ile Glu Gly Ala 170 175 180 gat ggg agg aag gaa tgg get ggc gga gaa gat ata act get gtt gee 929

Asp Gly Arg Lys Glu Trp Ala Gly Gly Glu Asp Ile Thr Ala Val Ala 185 190 195 200 tat gat gtc cca ata cca gga tat aaa aca aaa aca aeg att aac ctt 977

Tyr Asp Val Pro Ile Pro Gly Tyr Lys Thr Lys Thr Thr Ile Asn Leu 205 210 215 ega ttg tgg aca aca aag eta get gea gaa get ttt gat tta tat get 1025

Arg Leu Trp Thr Thr Lys Leu Ala Ala Glu Ala Phe Asp Leu Tyr Ala 220 225 230 ttt aac aat gga gac cat gee aaa gea tat gag gee cag aaa aag get 1073

Phe Asn Asn Gly Asp His Ala Lys Ala Tyr Glu Ala Gin Lys Lys Ala 235 240 245 gaa aag att tgc tat gtc tta tat cca ggt gac gaa teg ctt gaa gga 1121

Glu Lys Ile Cys Tyr Val Leu Tyr Pro Gly Asp Glu Ser Leu Glu Gly 250 255 260 aag aeg ctt agg tta aag cag caa tac aca eta tgt tet get tet ctt 1169

Lys Thr Leu Arg Leu Lys Gin Gin Tyr Thr Leu Cys Ser Ala Ser Leu 265 270 275 280 cag gac att att gea egg tte gag aag aga tea ggg aat gea gta aac 1217

Gin Asp Ile Ile Ala Arg Phe Glu Lys Arg Ser Gly Asn Ala Val Asn 285 290 295 tgg gat cag tte ccc gaa aag gtt gea gta cag atg aat gac act cat 1265

Trp Asp Gin Phe Pro Glu Lys Val Ala Val Gin Met Asn Asp Thr His 300 305 310 cca aca ctt tgt ata cca gaa ctt tta agg ata ttg atg gat gtt aaa 1313

Pro Thr Leu Cys Ile Pro Glu Leu Leu Arg Ile Leu Met Asp Val Lys 315 320 325 ggt ttg age tgg aag cag gea tgg gaa att act caa aga aeg gtc gea 1361

Gly Leu Ser Trp Lys Gin Ala Trp Glu Ile Thr Gin Arg Thr Val Ala -21 - DK 177092 B1 330 335 340 tac act aac cac act gtt eta eet gag get ett gag aaa tgg age tte 1409

Tyr Thr Asn His Thr Val Leu Pro Glu Ala Leu Glu Lys Trp Ser Phe 345 350 355 360 aca ett ett ggt gaa ctg ett eet egg cac gtg gag atc ata gea atg 1457

Thr Leu Leu Gly Glu Leu Leu Pro Arg His Val Glu Ile Ile Ala Met 365 370 375 ata gat gag gag etc ttg cat act ata ett get gaa tat ggt act gaa 1505

Ile Asp Glu Glu Leu Leu His Thr Ile Leu Ala Glu Tyr Gly Thr Glu 380 385 390 gat ett gac ttg ttg caa gaa aag eta aac caa atg agg att ctg gat 1553

Asp Leu Asp Leu Leu Gin Glu Lys Leu Asn Gin Met Arg Ile Leu Asp 395 400 405 aat gtt gaa ata cca agt tet gtt ttg gag ttg ett ata aaa gcc gaa 1601

Asn Val Glu Ile Pro Ser Ser Val Leu Glu Leu Leu Ile Lys Ala Glu 410 415 420 gaa agt get get gat gtc gaa aag gea gea gat gaa gaa caa gaa gaa 1649

Glu Ser Ala Ala Asp Val Glu Lys Ala Ala Asp Glu Glu Gin Glu Glu 425 430 435 440 gaa ggt aag gat gac agt aaa gat gag gaa act gag get gta aag gea 1697

Glu Gly Lys Asp Asp Ser Lys Asp Glu Glu Thr Glu Ala Val Lys Ala 445 450 455 gaa act aeg aac gaa gag gag gaa act gag gtt aag aag gtt gag gtg 1745

Glu Thr Thr Asn Glu Glu Glu Glu Thr Glu Val Lys Lys Val Glu Val 460 465 470 gag gat agt caa gea aaa ata aaa egt ata tte ggg cca cat cca aat 1793

Glu Asp Ser Gin Ala Lys Ile Lys Arg Ile Phe Gly Pro His Pro Asn 475 480 485 aaa cca cag gtg gtt cac atg gea aat eta tgt gta gtt age ggg cat 1841

Lys Pro Gin Val Val His Met Ala Asn Leu Cys Val Val Ser Gly His 490 495 500 gea gtt aac ggt gtt get gag att cat agt gaa ata gtt aag gat gaa 1889

Ala Val Asn Gly Val Ala Glu Ile His Ser Glu Ile Val Lys Asp Glu 505 510 515 520 gtt tte aat gaa ttt tac aag tta tgg cca gag aaa tte caa aac aag 1937

Val Phe Asn Glu Phe Tyr Lys Leu Trp Pro Glu Lys Phe Gin Asn Lys 525 530 535 aca aat ggt gtg aca cca aga aga tgg eta agt tte tgt aat cca gag 1985

Thr Asn Gly Val Thr Pro Arg Arg Trp Leu Ser Phe Cys Asn Pro Glu 540 545 550 ttg agt gaa att ata acc aag tgg aca gga tet gat gat tgg tta gta 2033

Leu Ser Glu Ile Ile Thr Lys Trp Thr Gly Ser Asp Asp Trp Leu Val 555 560 565 aac act gaa aaa ttg gea gag ett ega aag ttt get gat aac gaa gaa 2081 -22- DK 177092 B1

Asn Thr Glu Lys Leu Ala Glu Leu Arg Lys Phe Ala Asp Asn Glu Glu 570 575 580 ctc cag tct gag tgg agg aag gca aaa gga aat aac aaa atg aag att 2129

Leu Gin Ser Glu Trp Arg Lys Ala Lys Gly Asn Asn Lys Met Lys Ile 585 590 595 600 gtc tct ctc att aaa gaa aaa aca gga tac gtg gtc agt ccc gat gca 2177

Val Ser Leu Ile Lys Glu Lys Thr Gly Tyr Val Val Ser Pro Asp Ala 605 610 615 atg ttt gat gtt cag ate aag cgc ate cat gag tat aaa agg cag eta 2225

Met Phe Asp Val Gin Ile Lys Arg Ile His Glu Tyr Lys Arg Gin Leu 620 625 630 tta aat ata ttt gga atc gtt tat cgc tat aag aag atg aaa gaa atg 2273

Leu Asn Ile Phe Gly Ile Val Tyr Arg Tyr Lys Lys Met Lys Glu Met 635 640 645 age cct gaa gaa ega aaa gaa aag ttt gtc cct ega gtt tgc ata ttt 2321

Ser Pro Glu Glu Arg Lys Glu Lys Phe Val Pro Arg Val Cys Ile Phe 650 655 660 gga gga aaa gca ttt get aca tat gtt cag gcc aag aga att gta aaa 2369

Gly Gly Lys Ala Phe Ala Thr Tyr Val Gin Ala Lys Arg Ile Val Lys 665 670 675 680 ttt atc act gat gta ggg gaa aca gtc aac cat gat ccc gag att ggt 2417

Phe Ile Thr Asp Val Gly Glu Thr Val Asn His Asp Pro Glu Ile Gly 685 690 695 gat ett ttg aag gtt gta ttt gtt cct gat tac aat gtc agt gta gca 2465

Asp Leu Leu Lys Val Val Phe Val Pro Asp Tyr Asn Val Ser Val Ala 700 705 710 gaa gtg eta att cct ggt agt gag ttg tee cag cat att agt act get 2513

Glu Val Leu Ile Pro Gly Ser Glu Leu Ser Gin His Ile Ser Thr Ala 715 720 725 ggt atg gag get agt gga acc age aac atg aaa ttt tea atg aat ggc 2561

Gly Met Glu Ala Ser Gly Thr Ser Asn Met Lys Phe Ser Met Asn Gly 730 735 740 tgc ctc ctc atc ggg aca tta gat ggt gcc aat gtt gag ata aga gag 2609

Cys Leu Leu Ile Gly Thr Leu Asp Gly Ala Asn Val Glu Ile Arg Glu 745 750 755 760 gaa gtt gga gag gac aat ttc ttt ett ttc gga get cag get cat gaa 2657

Glu Val Gly Glu Asp Asn Phe Phe Leu Phe Gly Ala Gin Ala His Glu 765 770 775 att get ggc eta ega aag gaa aga gcc gag gga aag ttt gtc ccg gac 2705

Ile Ala Gly Leu Arg Lys Glu Arg Ala Glu Gly Lys Phe Val Pro Asp 780 785 790 cca aga ttt gaa gaa gta aag gcg ttc att agg aca ggc gtc ttt ggc 2753

Pro Arg Phe Glu Glu Val Lys Ala Phe Ile Arg Thr Gly Val Phe Gly 795 800 805 -23- DK 177092 B1 acc tac aac tat gaa gaa ctc atg gga tcc ttg gaa gga aac gaa ggc 2801

Thr Tyr Asn Tyr Glu Glu Leu Met Gly Ser Leu Glu Gly Asn Glu Gly 810 815 820 tat ggt cgt get gac tat ttt ett gta gga aag gat ttc ccc gat tat 2849

Tyr Gly Arg Ala Asp Tyr Phe Leu Val Gly Lys Asp Phe Pro Asp Tyr 825 830 835 840 ata gag tgc caa gat aaa gtt gat gaa gea tat ega gac cag aag aaa 2897

Ile Glu Cys Gin Asp Lys Val Asp Glu Ala Tyr Arg Asp Gin Lys Lys 845 850 855 tgg acc aaa atg teg ate tta aac aca get gga teg tte aaa ttt age 2945

Trp Thr Lys Met Ser Ile Leu Asn Thr Ala Gly Ser Phe Lys Phe Ser 860 865 870 agt gat ega aca att cat caa tat gea aga gat ata tgg aga att gaa 2993

Ser Asp Arg Thr Ile His Gin Tyr Ala Arg Asp Ile Trp Arg Ile Glu 875 880 885 eet gtt gaa tta eet taaaagttag ccagttaaag gatgaaagcc aattttttcc 3048 Pro Val Glu Leu Pro 890 ccctgaggtt ctcccatact gtttattagt acatatattg tcaattgttg ctactgaaat 3108 gatagaagtt ttgaatattt actgtcaata aaatacagtt gattccattt gaaaaaaaaa 3168 aaa 3171 <210> 6 <2ll> 974

<212> PRT

<213> Solanum tuberosum <400> 6

Met Ala Thr Phe Ala Val Ser Gly Leu Asn Ser Ile Ser Ser Ile Ser -80 -75 -70

Ser Phe Asn Asn Asn Phe Arg Ser Lys Asn Ser Asn Ile Leu Leu Ser -65 -60 -55 -50

Arg Arg Arg Ile Leu Leu Phe Ser Phe Arg Arg Arg Arg Arg Ser Phe -45 -40 -35

Ser Val Ser Ser Val Ala Ser Asp Gin Lys Gin Lys Thr Lys Asp Ser -30 -25 -20

Ser Ser Asp Glu Gly Phe Thr Leu Asp Val Phe Gin Pro Asp Ser Thr -15 -10 -5

Ser Val Leu Ser Ser Ile Lys Tyr His Ala Glu Phe Thr Pro Ser Phe -11 5 10 15 -24- DK 177092 B1

Ser Pro Glu Lys Phe Glu Leu Pro Lys Ala Tyr Tyr Ala Thr Ala Glu 20 25 30

Ser Val Arg Asp Thr Leu Ile Ile Asn Trp Asn Ala Thr Tyr Glu Phe 35 40 45

Tyr Glu Lys Met Asn Val Lys Gin Ala Tyr Tyr Leu Ser Met Glu Phe 50 55 60

Leu Gin Gly Arg Ala Leu Leu Asn Ala Ile Gly Asn Leu Gly Leu Thr 65 70 75

Gly Pro Tyr Ala Asp Ala Leu Thr Lys Leu Gly Tyr Ser Leu Glu Asp 80 85 90 95

Val Ala Arg Gin Glu Pro Asp Ala Ala Leu Gly Asn Gly Gly Leu Gly 100 105 110

Arg Leu Ala Ser Cys Phe Leu Asp Ser Met Ala Thr Leu Asn Tyr Pro 115 120 125

Ala Trp Gly Tyr Gly Leu Arg Tyr Gin Tyr Gly Leu Phe Lys Gin Leu 130 135 140

Ile Thr Lys Asp Gly Gin Glu Glu Val Ala Glu Asn Trp Leu Glu Met 145 150 155

Gly Asn Pro Trp Glu Ile Val Arg Asn Asp Ile Ser Tyr Pro Val Lys 160 165 170 175

Phe Tyr Gly Lys Val Ile Glu Gly Ala Asp Gly Arg Lys Glu Trp Ala 180 185 190

Gly Gly Glu Asp Ile Thr Ala Val Ala Tyr Asp Val Pro Ile Pro Gly 195 200 205

Tyr Lys Thr Lys Thr Thr Ile Asn Leu Arg Leu Trp Thr Thr Lys Leu 210 215 220

Ala Ala Glu Ala Phe Asp Leu Tyr Ala Phe Asn Asn Gly Asp His Ala 225 230 235 -25- DK 177092 B1

Lys Ala Tyr Glu Ala Gin Lys Lys Ala Glu Lys Ile Cys Tyr Val Leu 240 245 250 255

Tyr Pro Gly Asp Glu Ser Leu Glu Gly Lys Thr Leu Arg Leu Lys Gin 260 265 270

Gin Tyr Thr Leu Cys Ser Ala Ser Leu Gin Asp Ile Ile Ala Arg Phe 275 280 285

Glu Lys Arg Ser Gly Asn Ala Val Asn Trp Asp Gin Phe Pro Glu Lys 290 295 300

Val Ala Val Gin Met Asn Asp Thr His Pro Thr Leu Cys Ile Pro Glu 305 310 315

Leu Leu Arg Ile Leu Met Asp Val Lys Gly Leu Ser Trp Lys Gin Ala 320 325 330 335

Trp Glu Ile Thr Gin Arg Thr Val Ala Tyr Thr Asn His Thr Val Leu 340 345 350

Pro Glu Ala Leu Glu Lys Trp Ser Phe Thr Leu Leu Gly Glu Leu Leu 355 360 365

Pro Arg His Val Glu Ile Ile Ala Met Ile Asp Glu Glu Leu Leu His 370 375 380

Thr Ile Leu Ala Glu Tyr Gly Thr Glu Asp Leu Asp Leu Leu Gin Glu 385 390 395

Lys Leu Asn Gin Met Arg Ile Leu Asp Asn Val Glu Ile Pro Ser Ser 400 405 410 415

Val Leu Glu Leu Leu Ile Lys Ala Glu Glu Ser Ala Ala Asp Val Glu 420 425 430

Lys Ala Ala Asp Glu Glu Gin Glu Glu Glu Gly Lys Asp Asp Ser Lys 435 440 445

Asp Glu Glu Thr Glu Ala Val Lys Ala Glu Thr Thr Asn Glu Glu Glu 450 455 460

Glu Thr Glu Val Lys Lys Val Glu Val Glu Asp Ser Gin Ala Lys Ile 465 470 475 -26- DK 177092 B1

Lys Arg Ile Phe Gly Pro His Pro Asn Lys Pro Gin Val Val His Met 480 485 490 495

Ala Asn Leu Cys Val Val Ser Gly His Ala Val Asn Gly Val Ala Glu 500 505 510

Ile His Ser Glu Ile Val Lys Asp Glu Val Phe Asn Glu Phe Tyr Lys 515 520 525

Leu Trp Pro Glu Lys Phe Gin Asn Lys Thr Asn Gly Val Thr Pro Arg 530 535 540

Arg Trp Leu Ser Phe Cys Asn Pro Glu Leu Ser Glu Ile Ile Thr Lys 545 550 555

Trp Thr Gly Ser Asp Asp Trp Leu Val Asn Thr Glu Lys Leu Ala Glu 560 565 570 575

Leu Arg Lys Phe Ala Asp Asn Glu Glu Leu Gin Ser Glu Trp Arg Lys 580 585 590

Ala Lys Gly Asn Asn Lys Met Lys Ile Val Ser Leu Ile Lys Glu Lys 595 600 605

Thr Gly Tyr Val Val Ser Pro Asp Ala Met Phe Asp Val Gin Ile Lys 610 615 620

Arg Ile His Glu Tyr Lys Arg Gin Leu Leu Asn Ile Phe Gly Ile Val 625 630 635

Tyr Arg Tyr Lys Lys Met Lys Glu Met Ser Pro Glu Glu Arg Lys Glu 640 645 650 655

Lys Phe Val Pro Arg Val Cys Ile Phe Gly Gly Lys Ala Phe Ala Thr 660 665 670

Tyr Val Gin Ala Lys Arg Ile Val Lys Phe Ile Thr Asp Val Gly Glu 675 680 685

Thr Val Asn His Asp Pro Glu Ile Gly Asp Leu Leu Lys Val Val Phe 690 695 700

Val Pro Asp Tyr Asn Val Ser Val Ala Glu Val Leu Ile Pro Gly Ser 705 710 715 -27- DK 177092 B1

Glu Leu Ser Gin His Ile Ser Thr Ala Gly Met Glu Ala Ser Gly Thr 720 725 730 735

Ser Asn Met Lys Phe Ser Met Asn Gly Cys Leu Leu Ile Gly Thr Leu 740 745 750

Asp Gly Ala Asn Val Glu Ile Arg Glu Glu Val Gly Glu Asp Asn Phe 755 760 765

Phe Leu Phe Gly Ala Gin Ala His Glu Ile Ala Gly Leu Arg Lys Glu 770 775 780

Arg Ala Glu Gly Lys Phe Val Pro Asp Pro Arg Phe Glu Glu Val Lys 785 790 795

Ala Phe Ile Arg Thr Gly Val Phe Gly Thr Tyr Asn Tyr Glu Glu Leu 800 805 810 815

Met Gly Ser Leu Glu Gly Asn Glu Gly Tyr Gly Arg Ala Asp Tyr Phe 820 825 830

Leu Val Gly Lys Asp Phe Pro Asp Tyr Ile Glu Cys Gin Asp Lys val 835 840 845

Asp Glu Ala Tyr Arg Asp Gin Lys Lys Trp Thr Lys Met Ser Ile Leu 850 855 860

Asn Thr Ala Gly Ser Phe Lys Phe Ser Ser Asp Arg Thr Ile His Gin 865 870 875

Tyr Ala Arg Asp Ile Trp Arg Ile Glu Pro Val Glu Leu Pro 880 885 890 <210> 7 <211> 3283 <212> DNA <213> Vicia faba <220>

<221> CDS

<222> (58)..(3066) <220> <221> mat_peptid <222> (250)..(3066) -28- DK 177092 B1 <400> 7 acaatacaaa caatcaaagc tctgtgagtg tgtgagtgag tgagagaaat tccaatt 57 atg get tee atg aca atg egg ttt cat cca aat tee ace gee gta ace 105

Met Ala Ser Met Thr Met Arg Phe His Pro Asn Ser Thr Ala Val Thr -60 -55 -50 gaa tee gtt eet ege cgt ggc tee gtt tac gga ttc ate ggt tac aga 153

Glu Ser Val Pro Arg Arg Gly Ser Val Tyr Gly Phe Ile Gly Tyr Arg -45 -40 -35 tee teg teg ttg ttc gtc ega aeg aac gtt ate aag tat cgt tet gtt 201

Ser Ser Ser Leu Phe Val Arg Thr Asn Val Ile Lys Tyr Arg Ser Val -30 -25 -20 aag cgt aat ctg gaa ttt agg agg aga age get ttc tet gtg aag tgt 249

Lys Arg Asn Leu Glu Phe Arg Arg Arg Ser Ala Phe Ser Val Lys Cys -15 -10 -5 -1 ggt tet ggt aat gaa geg aaa cag aaa gtc aag gat cag gaa gtt caa 297

Gly Ser Gly Asn Glu Ala Lys Gin Lys Val Lys Asp Gin Glu Val Gin 15 10 15 caa gaa get aaa act tet ccg age tea ttt gca cca gat act act tee 345

Gin Glu Ala Lys Thr Ser Pro Ser Ser Phe Ala Pro Asp Thr Thr Ser 20 25 30 att gtg tea agt att aag tac cat gca gag ttc aca cca ctg ttt tet 393 lie Val Ser Ser He Lys Tyr His Ala Glu Phe Thr Pro Leu Phe Ser 35 40 45 ccg gaa aaa ttt gag ett cca caa get ttc att gca act gca cag agt 441

Pro Glu Lys Phe Glu Leu Pro Gin Ala Phe He Ala Thr Ala Gin Ser 50 55 60 gtt cgt gat get etc ata ata aac tgg aat get act tat gat tac tat 489

Val Arg Asp Ala Leu He He Asn Trp Asn Ala Thr Tyr Asp Tyr Tyr 65 70 75 80 gag aag ctg aat gtt aag cag gca tat tac ett tea atg gaa ttt tta 537

Glu Lys Leu Asn Val Lys Gin Ala Tyr Tyr Leu Ser Met Glu Phe Leu 85 90 95 cag gga aga gca tta ttg aat gca att ggc aat tta gag eta act ggt 585

Gin Gly Arg Ala Leu Leu Asn Ala lie Gly Asn Leu Glu Leu Thr Gly 100 105 110 ccc tat gca gag get ttg age cag ett agt tat aaa tta gaa gac gtg 633

Pro Tyr Ala Glu Ala Leu Ser Gin Leu Ser Tyr Lys Leu Glu Asp Val 115 120 125 gca cac cag gag ccg gat get gca ett gga aat ggg ggt ett gga ega 681

Ala His Gin Glu Pro Asp Ala Ala Leu Gly Asn Gly Gly Leu Gly Arg 130 135 140 ett get tea tgt ttc ttg gac tet ttg get acc ttg aat tat ccg gca 729

Leu Ala Ser Cys Phe Leu Asp Ser Leu Ala Thr Leu Asn Tyr Pro Ala 145 150 155 160 -29- DK 177092 B1 tgg ggt tat gga ctg aga tac aag tat ggc tta ttc aaa caa cga atc 777

Trp Gly Tyr Gly Leu Arg Tyr Lys Tyr Gly Leu Phe Lys Gin Arg Ile 165 170 175 acc aaa gat ggg caa gag gaa gtt get gaa gat tgg ctc gag atg ggc 825

Thr Lys Asp Gly Gin Glu Glu Val Ala Glu Asp Trp Leu Glu Met Gly 180 185 190 aat cct tgg gag atc gtt aga aat gac gtc tea tac cct gta agg tte 873

Asn Pro Trp Glu Ile Val Arg Asn Asp Val Ser Tyr Pro Val Arg Phe 195 200 205 tat ggc aaa gtt gtt tea ggc tea gat ggt aaa aaa cat tgg gtt gga 921

Tyr Gly Lys Val Val Ser Gly Ser Asp Gly Lys Lys His Trp Val Gly 210 215 220 gga gaa gat ate aaa get gtt gea cae gat gtc ccc ata ccc gga tat 969

Gly Glu Asp Ile Lys Ala Val Ala His Asp Val Pro Ile Pro Gly Tyr 225 230 235 240 aag acc aga age aca att aac ctg aga ett tgg tet aca aaa get gea 1017

Lys Thr Arg Ser Thr Ile Asn Leu Arg Leu Trp Ser Thr Lys Ala Ala 245 250 255 tee gaa gaa ttt gat tta aat get ttt aat tet gga agg cac acc gaa 1065

Ser Glu Glu Phe Asp Leu Asn Ala Phe Asn Ser Gly Arg His Thr Glu 260 265 270 gea tet gag get eta gea aat get gaa aag att tgc tat ata ett tac 1113

Ala Ser Glu Ala Leu Ala Asn Ala Glu Lys Ile Cys Tyr Ile Leu Tyr 275 280 285 ccc ggg gat gaa tet ata gag gga aaa acc ett ege etc aag caa caa 1161

Pro Gly Asp Glu Ser Ile Glu Gly Lys Thr Leu Arg Leu Lys Gin Gin 290 295 300 tat act tta tgt teg get tet ett caa gat ate att get egt ttt gag 1209

Tyr Thr Leu Cys Ser Ala Ser Leu Gin Asp Ile Ile Ala Arg Phe Glu 305 310 315 320 aga aga tea ggg gea agt gtg aat tgg gaa gac ttt cct gaa aag gtt 1257

Arg Arg Ser Gly Ala Ser Val Asn Trp Glu Asp Phe Pro Glu Lys Val 325 330 335 gea gtg cag atg aat gat act cac cca act ttg tgc atc cca gag ctg 1305

Ala Val Gin Met Asn Asp Thr His Pro Thr Leu Cys Ile Pro Glu Leu 340 345 350 atg aga ate ctg ata gat ata aag ggt tta age tgg aag gat get tgg 1353

Met Arg Ile Leu Ile Asp Ile Lys Gly Leu Ser Trp Lys Asp Ala Trp 355 360 365 aat ate acc caa egg act gta gea tac aca aac cat act gtt ett ccg 1401

Asn Ile Thr Gin Arg Thr Val Ala Tyr Thr Asn His Thr Val Leu Pro 370 375 380 gag gea tta gag aaa tgg age atg gac ett atg gag aaa ttg ett cca 1449

Glu Ala Leu Glu Lys Trp Ser Met Asp Leu Met Glu Lys Leu Leu Pro -30- DK 177092 B1 385 390 395 400 cgc cat gtt gag att ata gaa atg att gat gag gag ctg att cgg acc 1497

Arg His Val Glu Ile Ile Glu Met Ile Asp Glu Glu Leu Ile Arg Thr 405 410 415 ata ate gca gaa tat ggc aca gca gat tea gac tta ett gat aag aaa 1545

Ile Ile Ala Glu Tyr Gly Thr Ala Asp Ser Asp Leu Leu Asp Lys Lys 420 425 430 ttg aag gaa atg aga ata eta gaa aat gtt gaa ttg cct gca gaa ttt 1593

Leu Lys Glu Met Arg Ile Leu Glu Asn Val Glu Leu Pro Ala Glu Phe 435 440 445 gca gat ata eta gtt aaa acc aag gag gcc act gat att tet agt gag 1641

Ala Asp Ile Leu Val Lys Thr Lys Glu Ala Thr Asp Ile Ser Ser Glu 450 455 460 gaa gtg caa att tet aaa gaa ggg gga gaa gaa gaa gaa act tet aaa 1689

Glu Val Gin Ile Ser Lys Glu Gly Gly Glu Glu Glu Glu Thr Ser Lys 465 470 475 480 gaa ggg gga gaa gaa gaa gaa gaa aaa gaa gta gga gga gga aga gaa 1737

Glu Gly Gly Glu Glu Glu Glu Glu Lys Glu Val Gly Gly Gly Arg Glu 485 490 495 gaa ggc gat gat ggt aag gaa gat gaa gtg gaa aaa gca att get gaa 1785

Glu Gly Asp Asp Gly Lys Glu Asp Glu Val Glu Lys Ala Ile Ala Glu 500 505 510 aag gat gga aeg gtt aaa age tee att ggg gat aag aaa aag aag ttg 1833

Lys Asp Gly Thr Val Lys Ser Ser Ile Gly Asp Lys Lys Lys Lys Leu 515 520 525 cct gag cca gta cca gta ccg cca aaa ttg gtt egt atg gcc aat ett 1881

Pro Glu Pro Val Pro Val Pro Pro Lys Leu Val Arg Met Ala Asn Leu 530 535 540 tgt gtt gtg ggt ggt cat gca gtg aat ggg gtt gca gag ata cat agt 1929

Cys Val Val Gly Gly His Ala Val Asn Gly Val Ala Glu Ile His Ser 545 550 555 560 gaa att gtc aag gat gac gtg ttc aat gca ttt tat aag ttg tgg cct 1977

Glu Ile Val Lys Asp Asp Val Phe Asn Ala Phe Tyr Lys Leu Trp Pro 565 570 575 gag aaa ttc cag aac aaa aca aat ggc gtg aeg cct agg aga tgg att 2025

Glu Lys Phe Gin Asn Lys Thr Asn Gly Val Thr Pro Arg Arg Trp Ile 580 585 590 agg ttc tgc aat cca gat ttg agt aaa ata ata act cag tgg ata ggc 2073

Arg Phe Cys Asn Pro Asp Leu Ser Lys Ile Ile Thr Gin Trp Ile Gly 595 600 605 aca gaa gac tgg atc eta aat act gag aaa ctg get gaa ctg cgg aag 2121

Thr Glu Asp Trp Ile Leu Asn Thr Glu Lys Leu Ala Glu Leu Arg Lys 610 615 620 ttt gca gat aat gag gat ctg caa aca caa tgg agg gaa gca aaa agg 2169 -31 - DK 177092 B1

Phe Ala Asp Asn Glu Asp Leu Gin Thr Gin Trp Arg Glu Ala Lys Arg 625 630 635 640 aat aac aag gtg aaa gtt gca gca ttc etc aga gaa aga aca gga tat 2217

Asn Asn Lys Val Lys Val Ala Ala Phe Leu Arg Glu Arg Thr Gly Tyr 645 650 655 tet gtc agt cct gat tea atg ttt gac ate cag gtg aaa aga ate cat 2265

Ser Val Ser Pro Asp Ser Met Phe Asp Ile Gin Val Lys Arg lie His 660 665 670 gaa tat aaa ega caa tta tta aat ata ttt gga att gtt tat ege tac 2313

Glu Tyr Lys Arg Gin Leu Leu Asn lie Phe Gly lie Val Tyr Arg Tyr 675 680 685 aag aag atg aaa gaa atg aat get get gaa aga aaa gaa aat ttt gtt 2361

Lys Lys Met Lys Glu Met Asn Ala Ala Glu Arg Lys Glu Asn Phe Val 690 695 700 cca aga gtt tgt ata ttt ggg gga aaa gca ttt get act tat gtg caa 2409

Pro Arg Val Cys lie Phe Gly Gly Lys Ala Phe Ala Thr Tyr Val Gin 705 710 715 720 gcc aaa aga att gtg aaa ttt att aca gat gtt gga get act gta aat 2457

Ala Lys Arg lie Val Lys Phe lie Thr Asp Val Gly Ala Thr Val Asn 725 730 735 cat gat cca gaa ata gga gat ett ett aag gtt att ttt gtc cct gac 2505

His Asp Pro Glu lie Gly Asp Leu Leu Lys Val lie Phe Val Pro Asp 740 745 750 tac aat gtt agt gtt geg gag atg ett att cct get agt gaa ttg tea 2553

Tyr Asn Val Ser Val Ala Glu Met Leu lie Pro Ala Ser Glu Leu Ser 755 760 765 caa cat ate agt act get gga atg gag gca agt gga act age aac atg 2601

Gin His lie Ser Thr Ala Gly Met Glu Ala Ser Gly Thr Ser Asn Met 770 775 780 aaa ttt gca atg aat gga tgc tta cag att gga act ttg gat ggg gcc 2649

Lys Phe Ala Met Asn Gly Cys Leu Gin lie Gly Thr Leu Asp Gly Ala 785 790 795 800 aat gtt gaa ata agg gaa gag gtt ggt get gac aac ttc ttc ett ttt 2697

Asn Val Glu lie Arg Glu Glu Val Gly Ala Asp Asn Phe Phe Leu Phe 805 810 815 ggt get aag get cgt gaa att gtt ggg etc agg aaa gaa aga gca aga 2745

Gly Ala Lys Ala Arg Glu lie Val Gly Leu Arg Lys Glu Arg Ala Arg 820 825 830 ggg aag ttt gtc cct gat cca ega ttc gaa gaa gtt aaa aaa ttt gtc 2793

Gly Lys Phe Val Pro Asp Pro Arg Phe Glu Glu Val Lys Lys Phe Val 835 840 845 aga agt ggt gtc ttt ggg tet tac aac tat gat gaa ctg att gga tcc 2841

Arg Ser Gly Val Phe Gly Ser Tyr Asn Tyr Asp Glu Leu lie Gly Ser 850 855 860 -32- DK 177092 B1 tta gaa gga aat gaa ggt ttt ggt cga gca gat tat ttt ctt gtg ggc 2889

Leu Glu Gly Asn Glu Gly Phe Gly Arg Ala Asp Tyr Phe Leu Val Gly 865 870 875 880 cag gac ttc cct age tat tta gaa tgc cag gag gag gtc gac aaa get 2937

Gin Asp Phe Pro Ser Tyr Leu Glu Cys Gin Glu Glu Val Asp Lys Ala 885 890 895 tat cgc gac caa aaa aaa tgg aca aga atg tea ata ttg aac aca gca 2985

Tyr Arg Asp Gin Lys Lys Trp Thr Arg Met Ser Ile Leu Asn Thr Ala 900 905 910 ggc tea tee aaa tte age agt gac egt ace att cat gaa tat gca cga 3033

Gly Ser Ser Lys Phe Ser Ser Asp Arg Thr Ile His Glu Tyr Ala Arg 915 920 925 gaa ata tgg aac att gag cca gtc aaa ttg gag tagaggggta atctatacta 3086

Glu Ile Trp Asn Ile Glu Pro Val Lys Leu Glu 930 935 tacccttggt aatageagag aatcggtgcc aegtegtaat atgatcacta ctttaccaag 3146 tacccattag tgaaaaataa actaagtttt gtaaaattaa aataagggtc tggttttaca 3206 tactgaaata aaeagaagtt ttgtaaaatt aaaataaggg tctggctgtt gtcctccaaa 3266 acaagcctac atteetg 3283 <21Q> 8 <211> 1003 <212> PRT <213> Vicia faba <400> 8

Met Ala Ser Met Thr Met Arg Phe His Pro Asn Ser Thr Ala Val Thr -60 -55 -50

Glu Ser Val Pro Arg Arg Gly Ser Val Tyr Gly Phe Ile Gly Tyr Arg -45 -40 -35

Ser Ser Ser Leu Phe Val Arg Thr Asn Val Ile Lys Tyr Arg Ser Val -30 -25 -20

Lys Arg Asn Leu Glu Phe Arg Arg Arg Ser Ala Phe Ser Val Lys Cys -15 -10 -5 -1

Gly Ser Gly Asn Glu Ala Lys Gin Lys Val Lys Asp Gin Glu Val Gin 15 10 15

Gin Glu Ala Lys Thr Ser Pro Ser Ser Phe Ala Pro Asp Thr Thr Ser 20 25 30 -33- DK 177092 B1

Ile Val Ser Ser Ile Lys Tyr His Ala Glu Phe Thr Pro Leu Phe Ser 35 40 45

Pro Glu Lys Phe Glu Leu Pro Gin Ala Phe Ile Ala Thr Ala Gin Ser 50 55 60

Val Arg Asp Ala Leu Ile Ile Asn Trp Asn Ala Thr Tyr Asp Tyr Tyr 65 70 75 80

Glu Lys Leu Asn Val Lys Gin Ala Tyr Tyr Leu Ser Met Glu Phe Leu 85 90 95

Gin Gly Arg Ala Leu Leu Asn Ala Ile Gly Asn Leu Glu Leu Thr Gly 100 105 110

Pro Tyr Ala Glu Ala Leu Ser Gin Leu Ser Tyr Lys Leu Glu Asp Val 115 120 125

Ala His Gin Glu Pro Asp Ala Ala Leu Gly Asn Gly Gly Leu Gly Arg 130 135 140

Leu Ala Ser Cys Phe Leu Asp Ser Leu Ala Thr Leu Asn Tyr Pro Ala 145 150 155 160

Trp Gly Tyr Gly Leu Arg Tyr Lys Tyr Gly Leu Phe Lys Gin Arg Ile 165 170 175

Thr Lys Asp Gly Gin Glu Glu Val Ala Glu Asp Trp Leu Glu Met Gly 180 185 190

Asn Pro Trp Glu Ile Val Arg Asn Asp Val Ser Tyr Pro Val Arg Phe 195 200 205

Tyr Gly Lys Val Val Ser Gly Ser Asp Gly Lys Lys His Trp Val Gly 210 215 220

Gly Glu Asp Ile Lys Ala Val Ala His Asp Val Pro Ile Pro Gly Tyr 225 230 235 240

Lys Thr Arg Ser Thr Ile Asn Leu Arg Leu Trp Ser Thr Lys Ala Ala 245 250 255

Ser Glu Glu Phe Asp Leu Asn Ala Phe Asn Ser Gly Arg His Thr Glu 260 265 270 -34- DK 177092 B1

Ala Ser Glu Ala Leu Ala Asn Ala Glu Lys Ile Cys Tyr Ile Leu Tyr 275 280 285

Pro Gly Asp Glu Ser Ile Glu Gly Lys Thr Leu Arg Leu Lys Gin Gin 290 295 300

Tyr Thr Leu Cys Ser Ala Ser Leu Gin Asp Ile Ile Ala Arg Phe Glu 305 310 315 320

Arg Arg Ser Gly Ala Ser Val Asn Trp Glu Asp Phe Pro Glu Lys Val 325 330 335

Ala Val Gin Met Asn Asp Thr His Pro Thr Leu Cys Ile Pro Glu Leu 340 345 350

Met Arg Ile Leu Ile Asp Ile Lys Gly Leu Ser Trp Lys Asp Ala Trp 355 360 365

Asn Ile Thr Gin Arg Thr Val Ala Tyr Thr Asn His Thr Val Leu Pro 370 375 380

Glu Ala Leu Glu Lys Trp Ser Met Asp Leu Met Glu Lys Leu Leu Pro 385 390 395 400

Arg His Val Glu Ile Ile Glu Met Ile Asp Glu Glu Leu Ile Arg Thr 405 410 415

Ile Ile Ala Glu Tyr Gly Thr Ala Asp Ser Asp Leu Leu Asp Lys Lys 420 425 430

Leu Lys Glu Met Arg Ile Leu Glu Asn Val Glu Leu Pro Ala Glu Phe 435 440 445

Ala Asp Ile Leu Val Lys Thr Lys Glu Ala Thr Asp Ile Ser Ser Glu 450 455 460

Glu Val Gin Ile Ser Lys Glu Gly Gly Glu Glu Glu Glu Thr Ser Lys 465 470 475 480

Glu Gly Gly Glu Glu Glu Glu Glu Lys Glu Val Gly Gly Gly Arg Glu 485 490 495

Glu Gly Asp Asp Gly Lys Glu Asp Glu Val Glu Lys Ala Ile Ala Glu -35- DK 177092 B1 500 505 510

Lys Asp Gly Thr Val Lys Ser Ser Ile Gly Asp Lys Lys Lys Lys Leu 515 520 525

Pro Glu Pro Val Pro Val Pro Pro Lys Leu Val Arg Met Ala Asn Leu 530 535 540

Cys Val val Gly Gly His Ala Val Asn Gly Val Ala Glu Ile His Ser 545 550 555 560

Glu Ile Val Lys Asp Asp Val Phe Asn Ala Phe Tyr Lys Leu Trp Pro 565 570 575

Glu Lys Phe Gin Asn Lys Thr Asn Gly Val Thr Pro Arg Arg Trp Ile 580 585 590

Arg Phe Cys Asn Pro Asp Leu Ser Lys Ile Ile Thr Gin Trp Ile Gly 595 600 605

Thr Glu Asp Trp Ile Leu Asn Thr Glu Lys Leu Ala Glu Leu Arg Lys 610 615 620

Phe Ala Asp Asn Glu Asp Leu Gin Thr Gin Trp Arg Glu Ala Lys Arg 625 630 635 640

Asn Asn Lys Val Lys Val Ala Ala Phe Leu Arg Glu Arg Thr Gly Tyr 645 650 655

Ser Val Ser Pro Asp Ser Met Phe Asp Ile Gin Val Lys Arg Ile His 660 665 670

Glu Tyr Lys Arg Gin Leu Leu Asn Ile Phe Gly Ile Val Tyr Arg Tyr 675 680 685

Lys Lys Met Lys Glu Met Asn Ala Ala Glu Arg Lys Glu Asn Phe Val 690 695 700

Pro Arg Val Cys Ile Phe Gly Gly Lys Ala Phe Ala Thr Tyr Val Gin 705 710 715 720

Ala Lys Arg Ile Val Lys Phe Ile Thr Asp Val Gly Ala Thr Val Asn 725 730 735 -36- DK 177092 B1

His Asp Pro Glu Ile Gly Asp Leu Leu Lys Val Ile Phe Val Pro Asp 740 745 750

Tyr Asn Val Ser Val Ala Glu Met Leu ile Pro Ala Ser Glu Leu Ser 755 760 765

Gin His Ile Ser Thr Ala Gly Met Glu Ala Ser Gly Thr Ser Asn Met 770 775 780

Lys Phe Ala Met Asn Gly Cys Leu Gin Ile Gly Thr Leu Asp Gly Ala 785 790 795 800

Asn Val Glu Ile Arg Glu Glu Val Gly Ala Asp Asn Phe Phe Leu Phe 805 810 815

Gly Ala Lys Ala Arg Glu Ile Val Gly Leu Arg Lys Glu Arg Ala Arg 820 825 830

Gly Lys Phe Val Pro Asp Pro Arg Phe Glu Glu Val Lys Lys Phe Val 835 840 845

Arg Ser Gly Val Phe Gly Ser Tyr Asn Tyr Asp Glu Leu Ile Gly Ser 850 855 860

Leu Glu Gly Asn Glu Gly Phe Gly Arg Ala Asp Tyr Phe Leu Val Gly 865 870 875 880

Gin Asp Phe Pro Ser Tyr Leu Glu Cys Gin Glu Glu Val Asp Lys Ala 885 890 895

Tyr Arg Asp Gin Lys Lys Trp Thr Arg Met Ser Ile Leu Asn Thr Ala 900 905 910

Gly Ser Ser Lys Phe Ser Ser Asp Arg Thr Ile His Glu Tyr Ala Arg 915 920 925

Glu Ile Trp Asn Ile Glu Pro Val Lys Leu Glu 930 935 <210> 9 <211> 2889

<212> DNA

<213> Arabidopsis thaliana <220> -37- DK 177092 B1 <221> CDS <222> (1) . . (2889) <400> 9 atg gat acg atg cga ate tcc ggt gta tea acc gga get gag gtt tta 48

Met Asp Thr Met Arg Ile Ser Gly Val Ser Thr Gly Ala Glu Val Leu 15 10 15 ata caa tgc aat tcc tta tea age etc gtt tet egt egt tgc gac gac 96

Ile Gin Cys Asn Ser Leu Ser Ser Leu Val Ser Arg Arg Cys Asp Asp 20 25 30 gga aaa tgg cga acg aga atg ttt ccg gcg aga aac aga gac ttg egt 144

Gly Lys Trp Arg Thr Arg Met Phe Pro Ala Arg Asn Arg Asp Leu Arg 35 40 45 cca teg ccg acg aga aga tee ttt ttg teg gtg aaa tet atc tet age 192

Pro Ser Pro Thr Arg Arg Ser Phe Leu Ser Val Lys Ser Ile Ser Ser 50 55 60 gaa ccg aaa gee aaa gta acc gac gea gtt etc gat tcc gaa caa gaa 240

Glu Pro Lys Ala Lys Val Thr Asp Ala Val Leu Asp Ser Glu Gin Glu 65 70 75 80 gtg ttt att age teg atg aat ccg ttt gcg cca gat get get teg gta 288

Val Phe Ile Ser Ser Met Asn Pro Phe Ala Pro Asp Ala Ala Ser Val 85 90 95 get teg agt ate aag tac cac gcg gag ttt acg cca ttg ttt tea ccg 336

Ala Ser Ser Ile Lys Tyr His Ala Glu Phe Thr Pro Leu Phe Ser Pro 100 105 110 gag aag ttt gag ttg cca aag gcg tte ttt gcg act gcg caa agt gtt 384

Glu Lys Phe Glu Leu Pro Lys Ala Phe Phe Ala Thr Ala Gin Ser Val 115 120 125 aga gat get ttg atc atg aat tgg aat gea act tat gag tat tac aac 432

Arg Asp Ala Leu Ile Met Asn Trp Asn Ala Thr Tyr Glu Tyr Tyr Asn 130 135 140 aga gtg aat gtg aaa caa gcg tat tat ttg tea atg gag ttt ttg cag 480

Arg Val Asn Val Lys Gin Ala Tyr Tyr Leu Ser Met Glu Phe Leu Gin 145 150 155 160 ggt aga gcc tta teg aat gcc gtg ggt aac ett ggg ett aat age get 528

Gly Arg Ala Leu Ser Asn Ala Val Gly Asn Leu Gly Leu Asn Ser Ala 155 170 175 tat ggt gat get ttg aag agg ett ggt ttt gat ttg gaa age gtg get 576

Tyr Gly Asp Ala Leu Lys Arg Leu Gly Phe Asp Leu Glu Ser Val Ala 180 185 190 agt cag gag cca gat eet gea ett ggg aat ggt gga etc ggg aga ett 624

Ser Gin Glu Pro Asp Pro Ala Leu Gly Asn Gly Gly Leu Gly Arg Leu 195 200 205 gcc teg tgt ttt ttg gat tcc atg gea act ttg aat tat ccg get tgg 672

Ala Ser Cys Phe Leu Asp Ser Met Ala Thr Leu Asn Tyr Pro Ala Trp 210 215 220 -38 - DK 177092 B1 ggt tat gga ctt aga tac aag tat ggc ttg ttc aaa cag aga att aca 720

Gly Tyr Gly Leu Arg Tyr Lys Tyr Gly Leu Phe Lys Gin Arg Ile Thr 225 230 235 240 aaa gat gga cag gag gaa get gea gaa gat tgg ctt gag eta age aat 768

Lys Asp Gly Gin Glu Glu Ala Ala Glu Asp Trp Leu Glu Leu Ser Asn 245 250 255 eet tgg gaa ata gtc aga aat gat gtc tea tat eet att aag tte tat 816

Pro Trp Glu Ile Val Arg Asn Asp Val Ser Tyr Pro Ile Lys Phe Tyr 260 265 270 ggg aaa gtg gtt ttt gga tea gat ggt aag aaa egg tgg att ggt gga 864

Gly Lys Val Val Phe Gly Ser Asp Gly Lys Lys Arg Trp Ile Gly Gly 275 280 285 gaa gac att gtt get gtt get tat gat gtt eet ata eet ggt tat aaa 912

Glu Asp Ile Val Ala Val Ala Tyr Asp Val Pro Ile Pro Gly Tyr Lys 290 295 300 act aag aca act ate aat ctg egg etc tgg tea aca aaa get eet tee 960

Thr Lys Thr Thr Ile Asn Leu Arg Leu Trp Ser Thr Lys Ala Pro Ser 305 310 315 320 gaa gat ttt gat tta tet tea tat aac tet ggg aag cat act gag gea 1008

Glu Asp Phe Asp Leu Ser Ser Tyr Asn Ser Gly Lys His Thr Glu Ala 325 330 335 gea gaa get eta tte aac get gaa aag att tgc tte gtg ctt tac ccc 1056

Ala Glu Ala Leu Phe Asn Ala Glu Lys Ile Cys Phe Val Leu Tyr Pro 340 345 350 gga gat gag tea act gaa gga aag get ctt egt ctg aag caa caa tac 1104

Gly Asp Glu Ser Thr Glu Gly Lys Ala Leu Arg Leu Lys Gin Gin Tyr 355 360 365 act ctg tgc tea gee teg eta caa gat atc gta gea egt ttt gag aca 1152

Thr Leu Cys Ser Ala Ser Leu Gin Asp Ile Val Ala Arg Phe Glu Thr 370 375 380 agg tet gga gga aac gtc aac tgg gaa gaa ttt cca gag aag gtt gea 1200

Arg Ser Gly Gly Asn Val Asn Trp Glu Glu Phe Pro Glu Lys Val Ala 385 390 395 400 gtg cag atg aat gac act cac eet acc eta tgc att eet gag eta atg 1248

Val Gin Met Asn Asp Thr His Pro Thr Leu Cys Ile Pro Glu Leu Met 405 410 415 agg att eta atg gat tta aaa gga eta age tgg gaa gac get tgg aaa 1296

Arg Ile Leu Met Asp Leu Lys Gly Leu Ser Trp Glu Asp Ala Trp Lys 420 425 430 ate aca caa agg act gtg gea tac aca aac cat aca gtc ttg eet gag 1344

Ile Thr Gin Arg Thr Val Ala Tyr Thr Asn His Thr Val Leu Pro Glu 435 440 445 gea ctg gag aag tgg agt tta gaa etc atg gag aaa ttg ctt eet egt 1392

Ala Leu Glu Lys Trp Ser Leu Glu Leu Met Glu Lys Leu Leu Pro Arg -39- DK 177092 B1 450 455 460 cat gtg gag att atc gaa aag att gat gag gag eta gtt ege aca att 1440

His Val Glu Ile Ile Glu Lys Ile Asp Glu Glu Leu Val Arg Thr Ile 465 470 475 480 gtt tea gag tat ggc acc gcg gat eet gac tta ett gaa gaa aaa ctg 1488

Val Ser Glu Tyr Gly Thr Ala Asp Pro Asp Leu Leu Glu Glu Lys Leu 485 490 495 aag gea atg agg atc ttg gaa aat gtc gag ttg eet tet gcc ttt gea 1536

Lys Ala Met Arg Ile Leu Glu Asn Val Glu Leu Pro Ser Ala Phe Ala 500 505 510 gat gtg ate gtg aag ccg gtg aac aaa cca gtt act gea aaa gat get 1584

Asp Val Ile Val Lys Pro Val Asn Lys Pro Val Thr Ala Lys Asp Ala 515 520 525 caa aat ggc gtg aaa aeg gaa caa gaa gag gaa aaa act get gga gag 1632

Gin Asn Gly Val Lys Thr Glu Gin Glu Glu Glu Lys Thr Ala Gly Glu 530 535 540 gaa gag gaa gac gaa gtt atc cca gaa cca aca gta gaa ccc ccc aag 1680

Glu Glu Glu Asp Glu Val Ile Pro Glu Pro Thr Val Glu Pro Pro Lys 545 550 555 560 atg gtc egt atg gee aac ett get gtt gtg ggt ggt cat get gta aat 1728

Met Val Arg Met Ala Asn Leu Ala Val Val Gly Gly His Ala Val Asn 565 570 575 ggc gtt gea gag ata cac agt gaa ata gtg aag cag gac gtg ttt aat 1776

Gly Val Ala Glu Ile His Ser Glu Ile Val Lys Gin Asp Val Phe Asn 580 585 590 gat tte gta cag ttg tgg cca gaa aaa ttt cag aac aaa aca aat gga 1824

Asp Phe Val Gin Leu Trp Pro Glu Lys Phe Gin Asn Lys Thr Asn Gly 595 600 605 gta aca cca agg ega tgg att egt ttt tgc aac cca tat tta agt gat 1872

Val Thr Pro Arg Arg Trp Ile Arg phe Cys Asn Pro Tyr Leu Ser Asp 610 615 620 att ata act aac tgg ata ggc aca gaa gac tgg gtc tta aat acc gaa 1920

Ile Ile Thr Asn Trp Ile Gly Thr Glu Asp Trp Val Leu Asn Thr Glu 625 630 635 640 aag gtt gcg gaa eta aga aag ttt gea gat aat gaa gat etc caa tet 1968

Lys Val Ala Glu Leu Arg Lys Phe Ala Asp Asn Glu Asp Leu Gin Ser 645 650 655 gag tgg agg gea gea aag aag aag aac aag ttg aag gtt gta tea ett 2016

Glu Trp Arg Ala Ala Lys Lys Lys Asn Lys Leu Lys Val Val Ser Leu 660 665 670 ate aag gaa aga act gga tat act gtc age ccc gat gea atg tte gac 2064

Ile Lys Glu Arg Thr Gly Tyr Thr Val Ser Pro Asp Ala Met Phe Asp 675 680 685 att cag atc aag egt ata cat gag tac aag ega caa ctg eta aat atc 2112 -40- DK 177092 B1

Ile Gin Ile Lys Arg Ile His Glu Tyr Lys Arg Gin Leu Leu Asn Ile 690 695 700 ttg gga att gtt tac cgc tac aaa aag atg aag gaa atg agt get agt 2160

Leu Gly Ile Val Tyr Arg Tyr Lys Lys Met Lys Glu Met Ser Ala Ser 705 710 715 720 gag aga gag aaa gea ttt gtt cca aga gtt tgc ata ttt ggg gga aaa 2208

Glu Arg Glu Lys Ala Phe Val Pro Arg Val Cys Ile Phe Gly Gly Lys 725 730 735 gea ttt gcc aca tat gtg caa get aag aga att gtt aaa ttt atc aca 2256

Ala Phe Ala Thr Tyr Val Gin Ala Lys Arg Ile Val Lys Phe Ile Thr 740 745 750 gat gtt geg tet aca att aac cat gat cca gaa ata ggt gac ctc ett 2304

Asp Val Ala Ser Thr Ile Asn His Asp Pro Glu Ile Gly Asp Leu Leu 755 760 765 aag gtt atc ttt gtt cct gat tac aat gtc agt gtt get gaa ttg ctc 2352

Lys Val Ile Phe Val Pro Asp Tyr Asn Val Ser Val Ala Glu Leu Leu 770 775 780 att cca gea agt gag ett tet cag cae atc agt act get ggg atg gaa 2400

Ile Pro Ala Ser Glu Leu Ser Gin His Ile Ser Thr Ala Gly Met Glu 785 790 795 800 get agt ggg aca age aac atg aaa ttt teg atg aac ggt tgc gtt ttg 2448

Ala Ser Gly Thr Ser Asn Met Lys Phe Ser Met Asn Gly Cys Val Leu 805 810 815 att gga acc ttg gat ggg gcg aat gtc gag att aga gaa gaa gtt gga 2496

Ile Gly Thr Leu Asp Gly Ala Asn Val Glu Ile Arg Glu Glu Val Gly 820 825 830 gaa gaa aat ttc ttc etc ttt ggt gcc aaa get gat cag att gtg aac 2544

Glu Glu Asn Phe Phe Leu Phe Gly Ala Lys Ala Asp Gin Ile Val Asn 835 840 845 etc agg aag gag aga gea gag gga aag ttt gtt ccc gat cct act ttt 2592

Leu Arg Lys Glu Arg Ala Glu Gly Lys Phe Val Pro Asp Pro Thr Phe 850 855 860 gaa gaa gtc aag aag ttc gtt gga age ggc gtc ttt ggc tea aat age 2640

Glu Glu Val Lys Lys Phe Val Gly Ser Gly Val Phe Gly Ser Asn Ser 865 870 875 880 tat gat gaa eta atc ggc tet ttg gaa gga aac gaa ggc ttt gga ega 2688

Tyr Asp Glu Leu Ile Gly Ser Leu Glu Gly Asn Glu Gly Phe Gly Arg 885 890 895 gcg gat tac ttc eta gtt ggc aaa gac ttt cct agt tac atc gaa tgc 2736

Ala Asp Tyr Phe Leu Val Gly Lys Asp Phe Pro Ser Tyr Ile Glu Cys 900 905 910 caa gaa aaa gtc gac gag gea tac ega gac cag aaa aga tgg aeg aga 2784

Gin Glu Lys Val Asp Glu Ala Tyr Arg Asp Gin Lys Arg Trp Thr Arg 915 920 925 -41 - DK 177092 B1 atg tea ata atg aac aca gea ggt tea tte aag ttt age agt gac egg 2832

Met Ser Ile Met Asn Thr Ala Gly Ser Phe Lys Phe Ser Ser Asp Arg 930 935 940 aeg ate cac gaa tac gcc aaa gac ata tgg aat att aag caa gtg gaa 2880

Thr Ile His Glu Tyr Ala Lys Asp Ile Trp Asn Ile Lys Gin Val Glu 945 950 955 960 ett cca tga 2889

Leu Pro <210> 10 <211> 962

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana <400> 10

Met Asp Thr Met Arg Ile Ser Gly Val Ser Thr Gly Ala Glu Val Leu 15 10 15

Ile Gin Cys Asn Ser Leu Ser Ser Leu Val Ser Arg Arg Cys Asp Asp 20 25 30

Gly Lys Trp Arg Thr Arg Met Phe Pro Ala Arg Asn Arg Asp Leu Arg 35 40 45

Pro Ser Pro Thr Arg Arg Ser Phe Leu Ser Val Lys Ser Ile Ser Ser 50 55 60

Glu Pro Lys Ala Lys Val Thr Asp Ala Val Leu Asp Ser Glu Gin Glu 65 70 75 80

Val Phe Ile Ser Ser Met Asn Pro Phe Ala Pro Asp Ala Ala Ser Val 85 90 95

Ala Ser Ser Ile Lys Tyr His Ala Glu Phe Thr Pro Leu Phe Ser Pro 100 105 110

Glu Lys Phe Glu Leu Pro Lys Ala Phe Phe Ala Thr Ala Gin Ser Val 115 120 125

Arg Asp Ala Leu Ile Met Asn Trp Asn Ala Thr Tyr Glu Tyr Tyr Asn 130 135 140

Arg Val Asn Val Lys Gin Ala Tyr Tyr Leu Ser Met Glu Phe Leu Gin 145 150 155 160 -42 - DK 177092 B1

Gly Arg Ala Leu Ser Asn Ala Val Gly Asn Leu Gly Leu Asn Ser Ala 165 170 175

Tyr Gly Asp Ala Leu Lys Arg Leu Gly Phe Asp Leu Glu Ser Val Ala 180 185 190

Ser Gin Glu Pro Asp Pro Ala Leu Gly Asn Gly Gly Leu Gly Arg Leu 195 200 205

Ala Ser Cys Phe Leu Asp Ser Met Ala Thr Leu Asn Tyr Pro Ala Trp 210 215 220

Gly Tyr Gly Leu Arg Tyr Lys Tyr Gly Leu Phe Lys Gin Arg Ile Thr 225 230 235 240

Lys Asp Gly Gin Glu Glu Ala Ala Glu Asp Trp Leu Glu Leu Ser Asn 245 250 255

Pro Trp Glu Ile Val Arg Asn Asp Val Ser Tyr Pro Ile Lys Phe Tyr 260 265 270

Gly Lys Val Val Phe Gly Ser Asp Gly Lys Lys Arg Trp ile Gly Gly 275 280 285

Glu Asp Ile Val Ala Val Ala Tyr Asp Val Pro Ile Pro Gly Tyr Lys 290 295 300

Thr Lys Thr Thr Ile Asn Leu Arg Leu Trp Ser Thr Lys Ala Pro Ser 305 310 315 320

Glu Asp Phe Asp Leu Ser Ser Tyr Asn Ser Gly Lys His Thr Glu Ala 325 330 335

Ala Glu Ala Leu Phe Asn Ala Glu Lys Ile Cys Phe Val Leu Tyr Pro 340 345 350

Gly Asp Glu Ser Thr Glu Gly Lys Ala Leu Arg Leu Lys Gin Gin Tyr 355 360 365

Thr Leu cys Ser Ala Ser Leu Gin Asp Ile Val Ala Arg Phe Glu Thr 370 375 380

Arg Ser Gly Gly Asn Val Asn Trp Glu Glu Phe Pro Glu Lys Val Ala 385 390 395 400 -43 - DK 177092 B1

Val Gin Met Asn Asp Thr His Pro Thr Leu Cys Ile Pro Glu Len Met 405 410 415

Arg Ile Leu Met Asp Leu Lys Gly Leu Ser Trp Glu Asp Ala Trp Lys 420 425 430

Ile Thr Gin Arg Thr Val Ala Tyr Thr Asn His Thr Val Leu Pro Glu 435 440 445

Ala Leu Glu Lys Trp Ser Leu Glu Leu Met Glu Lys Leu Leu Pro Arg 450 455 460

His Val Glu Ile Ile Glu Lys Ile Asp Glu Glu Leu Val Arg Thr Ile 465 470 475 480

Val Ser Glu Tyr Gly Thr Ala Asp Pro Asp Leu Leu Glu Glu Lys Leu 485 490 495

Lys Ala Met Arg Ile Leu Glu Asn Val Glu Leu Pro Ser Ala Phe Ala 500 505 510

Asp Val Ile Val Lys Pro Val Asn Lys Pro Val Thr Ala Lys Asp Ala 515 520 525

Gin Asn Gly Val Lys Thr Glu Gin Glu Glu Glu Lys Thr Ala Gly Glu 530 535 540

Glu Glu Glu Asp Glu Val Ile Pro Glu Pro Thr Val Glu Pro Pro Lys 545 550 555 560

Met Val Arg Met Ala Asn Leu Ala Val Val Gly Gly His Ala Val Asn 565 570 575

Gly Val Ala Glu Ile His Ser Glu Ile Val Lys Gin Asp Val Phe Asn 580 585 590

Asp Phe Val Gin Leu Trp Pro Glu Lys Phe Gin Asn Lys Thr Asn Gly 595 600 605

Val Thr Pro Arg Arg Trp Ile Arg Phe Cys Asn Pro Tyr Leu Ser Asp 610 615 620

Ile Ile Thr Asn Trp Ile Gly Thr Glu Asp Trp Val Leu Asn Thr Glu -44 - DK 177092 B1 625 630 635 640

Lys Val Ala Glu Leu Arg Lys Phe Ala Asp Asn Glu Asp Leu Gin Ser 645 650 655

Glu Trp Arg Ala Ala Lys Lys Lys Asn Lys Leu Lys Val Val Ser Leu 660 665 670

Ile Lys Glu Arg Thr Gly Tyr Thr Val Ser Pro Asp Ala Met Phe Asp 675 680 685

Ile Gin Ile Lys Arg Ile His Glu Tyr Lys Arg Gin Leu Leu Asn Ile 690 695 700

Leu Gly Ile Val Tyr Arg Tyr Lys Lys Met Lys Glu Met Ser Ala Ser 705 710 715 720

Glu Arg Glu Lys Ala Phe Val Pro Arg Val Cys Ile Phe Gly Gly Lys 725 730 735

Ala Phe Ala Thr Tyr Val Gin Ala Lys Arg Ile Val Lys Phe Ile Thr 740 745 750

Asp Val Ala Ser Thr Ile Asn His Asp Pro Glu Ile Gly Asp Leu Leu 755 760 765

Lys Val Ile Phe Val Pro Asp Tyr Asn Val Ser Val Ala Glu Leu Leu 770 775 780

Ile Pro Ala Ser Glu Leu Ser Gin His Ile Ser Thr Ala Gly Met Glu 785 790 795 800

Ala Ser Gly Thr Ser Asn Met Lys Phe Ser Met Asn Gly Cys Val Leu 805 810 815

Ile Gly Thr Leu Asp Gly Ala Asn Val Glu Ile Arg Glu Glu Val Gly 820 825 830

Glu Glu Asn Phe Phe Leu Phe Gly Ala Lys Ala Asp Gin Ile Val Asn 835 840 845

Leu Arg Lys Glu Arg Ala Glu Gly Lys Phe Val Pro Asp Pro Thr Phe 850 855 860 -45- DK 177092 B1

Glu Glu Val Lys Lys phe Val Gly Ser Gly Val Phe Gly Ser Asn Ser 865 870 875 880

Tyr Asp Glu Leu Ile Gly Ser Leu Glu Gly Asn Glu Gly Phe Gly Arg 885 890 895

Ala Asp Tyr Phe Leu Val Gly Lys Asp Phe Pro Ser Tyr Ile Glu Cys 900 905 910

Gin Glu Lys Val Asp Glu Ala Tyr Arg Asp Gin Lys Arg Trp Thr Arg 915 920 925

Met Ser Ile Met Asn Thr Ala Gly Ser Phe Lys Phe Ser Ser Asp Arg 930 935 940

Thr Ile His Glu Tyr Ala Lys Asp Ile Trp Asn Ile Lys Gin Val Glu 945 950 955 960

Leu Pro <210> 11 <211> 3088

<212> DNA

<213> Spinacia oleracea <220>

<221> CDS

<222> (57) . . (2972) <400> 11 ggcacgaggt gtatcggagt cactcagagt cagagagatt attcaagaga tcaaca atg 59

Met gcg aca ttg cca tta tea tea aca aca cct tea ace gga aga aca gag 107

Ala Thr Leu Pro Leu Ser Ser Thr Thr Pro Ser Thr Gly Arg Thr Glu 5 10 15 aat tgt ttc tet teg tac tat tea teg tea att tea ega gtt atg gaa 155

Asn Cys Phe Ser Ser Tyr Tyr Ser Ser Ser Ile Ser Arg Val Met Glu 20 25 30 ttt ggg tta aaa aac ggc tgt aat tec aag ctg ttg ttt tet tet gtc 203

Phe Gly Leu Lys Asn Gly Cys Asn Ser Lys Leu Leu Phe Ser Ser Val 35 40 45 aat tat aaa cct atg att atg aga ggt tea aga agg tgt ate gta att 251

Asn Tyr Lys Pro Met lie Met Arg Gly Ser Arg Arg Cys lie Val lie 50 55 60 65 -46- DK 177092 B1 aga aat gtg ttc agt gaa tcg aag ccg aaa tcg gag gaa ccg atc att 299

Arg Asn Val Phe Ser Glu Ser Lys Pro Lys Ser Glu Glu Pro Ile Ile 70 75 80 gaa caa gaa act cca age att ttg aac ccg ttg agt aac ttg agt cca 347

Glu Gin Glu Thr Pro Ser Ile Leu Asn Pro Leu Ser Asn Leu Ser Pro 85 90 95 gat tet get tea agg caa tea agt att aaa tac cat geg gag ttc act 395

Asp Ser Ala Ser Arg Gin Ser Ser Ile Lys Tyr His Ala Glu Phe Thr 100 105 110 ccg ttg ttt get cca aat gac ttt tet ett ccc aag get ttc ttc gcc 443

Pro Leu Phe Ala Pro Asn Asp Phe Ser Leu Pro Lys Ala Phe Phe Ala 115 120 125 get gea cag agt gtt aga gat tea ett att att aac tgg aat get act 491

Ala Ala Gin Ser Val Arg Asp Ser Leu Ile Ile Asn Trp Asn Ala Thr 130 135 140 145 tat gcc cat tat gag aag atg aac atg aag caa get tat tat ttg tee 539

Tyr Ala His Tyr Glu Lys Met Asn Met Lys Gin Ala Tyr Tyr Leu Ser 150 155 160 atg gaa ttt ctc cag ggt aga gea ctg ttg aat geg att ggg aat ttg 587

Met Glu Phe Leu Gin Gly Arg Ala Leu Leu Asn Ala Ile Gly Asn Leu 165 170 175 gaa eta acc gat get tat gga gat get ttg aaa aag ett gga cac aat 635

Glu Leu Thr Asp Ala Tyr Gly Asp Ala Leu Lys Lys Leu Gly His Asn 180 185 190 ctg gaa get gta get tgt cag gaa ega gat get gea ett gga aat ggg 683

Leu Glu Ala Val Ala Cys Gin Glu Arg Asp Ala Ala Leu Gly Asn Gly 195 200 205 ggt etc ggg agg etc get tcg tgc ttt ett gac tet etc get aca ttg 731

Gly Leu Gly Arg Leu Ala Ser Cys Phe Leu Asp Ser Leu Ala Thr Leu 210 215 220 225 aat tat eet gea tgg ggt tat gga eta aga tac aag tat ggg tta ttc 779

Asn Tyr Pro Ala Trp Gly Tyr Gly Leu Arg Tyr Lys Tyr Gly Leu Phe 230 235 240 aag caa atg att acc aag gat ggt caa gaa gaa gtt get gag aat tgg 827

Lys Gin Met Ile Thr Lys Asp Gly Gin Glu Glu Val Ala Glu Asn Trp 245 250 255 ett gag att get aat cca tgg gaa ett gtg aga aat gat gtt tee tat 875

Leu Glu Ile Ala Asn Pro Trp Glu Leu Val Arg Asn Asp Val Ser Tyr 260 265 270 tea ata aaa ttt tat gga aag gtg gtt tet gga tcg gat ggc aga agt 923

Ser Ile Lys Phe Tyr Gly Lys Val Val Ser Gly Ser Asp Gly Arg Ser 275 280 285 cat tgg act ggg gga gag gat ate agg get gtt gcc tat gat gtt eet 971

His Trp Thr Gly Gly Glu Asp Ile Arg Ala Val Ala Tyr Asp Val Pro 290 295 300 305 -47- DK 177092 B1 att cct ggg tat caa act aaa acc act att aat ctt cga ttg tgg tgt 1019

Ile Pro Gly Tyr Gin Thr Lys Thr Thr Ile Asn Leu Arg Leu Trp Cys 310 315 320 act act gta tea tet gaa gac ttt gac tta tet get ttt aat gcg ggg 1067

Thr Thr Val Ser Ser Glu Asp Phe Asp Leu Ser Ala Phe Asn Ala Gly 325 330 335 gaa cac gcc aaa gea aat gag get egt gcg aat gcg gaa aag atc tgt 1115

Glu His Ala Lys Ala Asn Glu Ala Arg Ala Asn Ala Glu Lys Ile Cys 340 345 350 age gta eta tac ccc ggg gat gaa tet atg gaa gga aag atc etc egt 1163

Ser Val Leu Tyr Pro Gly Asp Glu Ser Met Glu Gly Lys Ile Leu Arg 355 360 365 ctg aag caa caa tac acc eta tgt teg get tet ttg caa gac atc att 1211

Leu Lys Gin Gin Tyr Thr Leu Cys Ser Ala Ser Leu Gin Asp Ile Ile 370 375 380 385 tea caa ttt gaa agg aga tea ggg gaa cat gta aat tgg gaa gaa ttt 1259

Ser Gin Phe Glu Arg Arg Ser Gly Glu His Val Asn Trp Glu Glu Phe 390 395 400 cca gag aag gtg get gtg cag atg aat gac act cat cca aca ttg tgt 1307

Pro Glu Lys Val Ala Val Gin Met Asn Asp Thr His Pro Thr Leu Cys 405 410 415 ata cca gaa ctg atg agg ata eta ata gat gta aaa gga ctt gcc tgg 1355

Ile Pro Glu Leu Met Arg Ile Leu Ile Asp Val Lys Gly Leu Ala Trp 420 425 430 aag gaa get tgg aat ata acc caa aga act gtt gcg tat aca aat cat 1403

Lys Glu Ala Trp Asn Ile Thr Gin Arg Thr Val Ala Tyr Thr Asn His 435 440 445 act gtt ttg ccg gag gea ttg gag aaa tgg agt ttt gaa ctt atg caa 1451

Thr Val Leu Pro Glu Ala Leu Glu Lys Trp Ser Phe Glu Leu Met Gin 450 455 460 465 tee ttg ctt cct cga cat gtt gag att ata gag aaa ata gac gag gag 1499

Ser Leu Leu Pro Arg His Val Glu Ile Ile Glu Lys Ile Asp Glu Glu 470 475 480 eta gtt gat acc atc gtt tet gag tat ggt act gat gac ccc aaa ttg 1547

Leu Val Asp Thr Ile Val Ser Glu Tyr Gly Thr Asp Asp Pro Lys Leu 485 490 495 ctg atg gga aaa ctg aat gag ttg aga ata ctg gag aat ttt cat ctt 1595

Leu Met Gly Lys Leu Asn Glu Leu Arg Ile Leu Glu Asn Phe His Leu 500 505 510 ccc agt teg gtt gcc agt ata atc aag gat aaa att acc tgt caa gtc 1643

Pro Ser Ser Val Ala Ser Ile Ile Lys Asp Lys Ile Thr Cys Gin Val 515 520 525 gac gag gat aaa aaa att gaa att tet gat gaa gta gat gga eta gtt 1691

Asp Glu Asp Lys Lys Ile Glu Ile Ser Asp Glu Val Asp Gly Leu Val 530 535 540 545 -48- DK 177092 B1 gtt gta gag gaa agt gaa gaa ggt gat ata gag aaa cag gca gtg gaa 1739

Val Val Glu Glu Ser Glu Glu Gly Asp Ile Glu Lys Gin Ala Val Glu 550 555 560 gag cca gtt cca aaa cca gca aag ttg gtt egg atg get aac ett tgc 1787

Glu Pro Val Pro Lys Pro Ala Lys Leu Val Arg Met Ala Asn Leu Cys 565 570 575 ata gtt ggg ggt cat gca gta aat ggg gtt gec gag att cat age caa 1835

Ile Val Gly Gly His Ala Val Asn Gly Val Ala Glu Ile His Ser Gin 580 585 590 atc gtg aag gaa caa gtt ttc egt gac ttc ttc gag ttg tgg cca gag 1883

Ile Val Lys Glu Gin Val Phe Arg Asp Phe Phe Glu Leu Trp Pro Glu 595 600 605 aaa ttt cag aac aaa aca aat ggg gtg act cca aga aga tgg atc egg 1931

Lys Phe Gin Asn Lys Thr Asn Gly Val Thr Pro Arg Arg Trp Ile Arg 610 615 620 625 ttt tgc aat cca gaa eta age agt atc tta aca aaa tgg att ggg tet 1979

Phe Cys Asn Pro Glu Leu Ser Ser Ile Leu Thr Lys Trp Ile Gly Ser 630 635 640 gac gac tgg gtt ett aac acc gaa aaa ett gca gaa ctg ega aag ttt 2027

Asp Asp Trp Val Leu Asn Thr Glu Lys Leu Ala Glu Leu Arg Lys Phe 645 650 655 gca gat aat aaa gat ett cac act gaa tgg atg gaa gca aaa egg aac 2075

Ala Asp Asn Lys Asp Leu His Thr Glu Trp Met Glu Ala Lys Arg Asn 660 665 670 aac aaa cag aag gtt gtt teg tta atc aaa gag aga aca ggt tac aeg 2123

Asn Lys Gin Lys Val Val Ser Leu Ile Lys Glu Arg Thr Gly Tyr Thr 675 680 685 gtc age cca gat gca atg ttt gat att cag ate aag egt att cat gaa 2171

Val Ser Pro Asp Ala Met Phe Asp Ile Gin Ile Lys Arg Ile His Glu 690 695 700 705 tac aag egg caa ett atg aac ata ttg gga att gta tac cgc tac aaa 2219

Tyr Lys Arg Gin Leu Met Asn Ile Leu Gly Ile Val Tyr Arg Tyr Lys 710 715 720 aaa atg aaa gaa atg agt get gca gag agg aag gaa aaa tat gtt cca 2267

Lys Met Lys Glu Met Ser Ala Ala Glu Arg Lys Glu Lys Tyr Val Pro 725 730 735 aga gtt tgt ata ttc gga gga aaa get ttt gcc aca tat gtg cag get 2315

Arg Val Cys Ile Phe Gly Gly Lys Ala Phe Ala Thr Tyr Val Gin Ala 740 745 750 aaa aga ata gtg aaa ttt atc act gat gta gga get aca att aat cac 2363

Lys Arg Ile Val Lys Phe Ile Thr Asp Val Gly Ala Thr Ile Asn His 755 760 765 gat cct gaa att ggt gat eta ctg aag gtt gtg ttc atc ccc gat tac 2411 -49- DK 177092 B1

Asp Pro Glu Ile Gly Asp Len Leu Lys Val Val Phe Ile Pro Asp Tyr 770 775 780 785 aaC gtt agt gtg get gag tta ttg atc cct gea agt gaa ett tea cag 2459

Asn Val Ser Val Ala Glu Leu Leu Ile Pro Ala Ser Glu Leu Ser Gin 790 795 800 cat ata age act get ggg atg gag gea agt gga aca age aat atg aag 2507

His Ile Ser Thr Ala Gly Met Glu Ala Ser Gly Thr Ser Asn Met Lys 805 810 815 ttt tea atg aat gga tgt atc tta att ggg acc eta gat ggt gcc aat 2555

Phe Ser Met Asn Gly Cys Ile Leu Ile Gly Thr Leu Asp Gly Ala Asn 820 825 830 gtt gag att aga gaa gaa gtc gga gaa gat aac ttc ttt ctg ttt ggc 2603

Val Glu Ile Arg Glu Glu Val Gly Glu Asp Asn Phe Phe Leu Phe Gly 835 840 845 get ega gea cat gat att get ggc tta agg aag gaa aga get gag ggc 2651

Ala Arg Ala His Asp Ile Ala Gly Leu Arg Lys Glu Arg Ala Glu Gly 850 855 860 865 aag tat gtg ccg gac cca tgt ttt gaa gaa gta aag gag tat gtt aga 2699

Lys Tyr Val Pro Asp Pro Cys Phe Glu Glu Val Lys Glu Tyr Val Arg 870 875 880 agt ggt gtc ttt ggt tea aac agt tat gat gaa ctg tta ggg tet tta 2747

Ser Gly Val Phe Gly Ser Asn Ser Tyr Asp Glu Leu Leu Gly Ser Leu 885 890 895 gag gga aat gaa gga ttt gga egt get gat tat ttc ett gtg ggc aaa 2795

Glu Gly Asn Glu Gly Phe Gly Arg Ala Asp Tyr Phe Leu Val Gly Lys 900 905 910 gac ttc cct agt tat gta gaa tgc caa gaa caa gtt gac caa gea tat 2843

Asp Phe Pro Ser Tyr Val Glu Cys Gin Glu Gin Val Asp Gin Ala Tyr 915 920 925 aga gat caa cag aaa tgg aca aga atg tea atc eta aat aca get ggt 2891

Arg Asp Gin Gin Lys Trp Thr Arg Met Ser Ile Leu Asn Thr Ala Gly 930 935 940 945 tea ttc aag ttt age age gac ega aeg att cat caa tat get aag gat 2939

Ser Phe Lys Phe Ser Ser Asp Arg Thr Ile His Gin Tyr Ala Lys Asp 950 955 960 ata tgg aat atc cat cca gta aat ctg cca tga aattgaaaac aactggatgg 2992

Ile Trp Asn Ile His Pro Val Asn Leu Pro 965 970 ctcgccagag taaccatcat gctagaactc ttaaaagcgc ctctctctat atttttttta 3052 atgaataatt ttggtcaaaa aaaaaaaaaa aaaaaa 3088 <210> 12 <211> 971

<212> PRT

-50- DK 177092 B1 <213> Spinacia oleracea <400> 12

Met Ala Thr Leu Pro Leu Ser Ser Thr Thr Pro Ser Thr Gly Arg Thr 15 10 15

Glu Asn Cys Phe Ser Ser Tyr Tyr Ser Ser Ser Ile Ser Arg Val Met 20 25 30

Glu Phe Gly Leu Lys Asn Gly Cys Asn Ser Lys Leu Leu Phe Ser Ser 35 40 45

Val Asn Tyr Lys Pro Met Ile Met Arg Gly Ser Arg Arg Cys Ile Val 50 55 60

Ile Arg Asn Val Phe Ser Glu Ser Lys Pro Lys Ser Glu Glu Pro Ile 65 70 75 80

Ile Glu Gin Glu Thr Pro Ser Ile Leu Asn Pro Leu Ser Asn Leu Ser 85 90 95

Pro Asp Ser Ala Ser Arg Gin Ser Ser Ile Lys Tyr His Ala Glu Phe 100 105 110

Thr Pro Leu Phe Ala Pro Asn Asp Phe Ser Leu Pro Lys Ala Phe Phe 115 120 125

Ala Ala Ala Gin Ser Val Arg Asp Ser Leu Ile Ile Asn Trp Asn Ala 130 135 140

Thr Tyr Ala His Tyr Glu Lys Met Asn Met Lys Gin Ala Tyr Tyr Leu 145 150 155 160

Ser Met Glu Phe Leu Gin Gly Arg Ala Leu Leu Asn Ala Ile Gly Asn 165 170 175

Leu Glu Leu Thr Asp Ala Tyr Gly Asp Ala Leu Lys Lys Leu Gly His 180 185 190

Asn Leu Glu Ala Val Ala Cys Gin Glu Arg Asp Ala Ala Leu Gly Asn 195 200 205

Gly Gly Leu Gly Arg Leu Ala Ser Cys Phe Leu Asp Ser Leu Ala Thr 210 215 220 -51 - DK 177092 B1

Leu Asn Tyr Pro Ala Trp Gly Tyr Gly Leu Arg Tyr Lys Tyr Gly Leu 225 230 235 240

Phe Lys Gin Met Ile Thr Lys Asp Gly Gin Glu Glu Val Ala Glu Asn 245 250 255

Trp Leu Glu Ile Ala Asn Pro Trp Glu Leu Val Arg Asn Asp Val Ser 260 265 270

Tyr Ser Ile Lys Phe Tyr Gly Lys Val Val Ser Gly Ser Asp Gly Arg 275 280 285

Ser His Trp Thr Gly Gly Glu Asp Ile Arg Ala Val Ala Tyr Asp Val 290 295 300

Pro Ile Pro Gly Tyr Gin Thr Lys Thr Thr Ile Asn Leu Arg Leu Trp 305 310 315 320

Cys Thr Thr Val Ser Ser Glu Asp Phe Asp Leu Ser Ala Phe Asn Ala 325 330 335

Gly Glu His Ala Lys Ala Asn Glu Ala Arg Ala Asn Ala Glu Lys Ile 340 345 350

Cys Ser Val Leu Tyr Pro Gly Asp Glu Ser Met Glu Gly Lys Ile Leu 355 360 365

Arg Leu Lys Gin Gin Tyr Thr Leu Cys Ser Ala Ser Leu Gin Asp Ile 370 375 380

Ile Ser Gin Phe Glu Arg Arg Ser Gly Glu His Val Asn Trp Glu Glu 385 390 395 400

Phe Pro Glu Lys Val Ala Val Gin Met Asn Asp Thr His Pro Thr Leu 405 410 415

Cys Ile Pro Glu Leu Met Arg Ile Leu Ile Asp Val Lys Gly Leu Ala 420 425 430

Trp Lys Glu Ala Trp Asn Ile Thr Gin Arg Thr Val Ala Tyr Thr Asn 435 440 445

His Thr Val Leu Pro Glu Ala Leu Glu Lys Trp Ser Phe Glu Leu Met 450 455 460 -52- DK 177092 B1

Gln Ser Leu Leu Pro Arg His Val Glu Ile Ile Glu Lys Ile Asp Glu 465 470 475 4S0

Glu Leu Val Asp Thr Ile Val Ser Glu Tyr Gly Thr Asp Asp Pro Lys 485 490 495

Leu Leu Met Gly Lys Leu Asn Glu Leu Arg Ile Leu Glu Asn Phe His 500 505 510

Leu Pro Ser Ser Val Ala Ser Ile Ile Lys Asp Lys Ile Thr Cys Gin 515 520 525

Val Asp Glu Asp Lys Lys Ile Glu Ile Ser Asp Glu Val Asp Gly Leu 530 535 540

Val Val Val Glu Glu Ser Glu Glu Gly Asp Ile Glu Lys Gin Ala Val 545 550 555 560

Glu Glu Pro Val Pro Lys Pro Ala Lys Leu Val Arg Met Ala Asn Leu 565 570 575

Cys Ile Val Gly Gly His Ala Val Asn Gly Val Ala Glu Ile His Ser 580 585 590

Gin Ile Val Lys Glu Gin Val Phe Arg Asp Phe Phe Glu Leu Trp Pro 595 600 605

Glu Lys Phe Gin Asn Lys Thr Asn Gly Val Thr Pro Arg Arg Trp Ile 610 615 620

Arg Phe Cys Asn Pro Glu Leu Ser Ser Ile Leu Thr Lys Trp Ile Gly 625 630 635 640

Ser Asp Asp Trp Val Leu Asn Thr Glu Lys Leu Ala Glu Leu Arg Lys 645 650 655

Phe Ala Asp Asn Lys Asp Leu His Thr Glu Trp Met Glu Ala Lys Arg 660 665 670

Asn Asn Lys Gin Lys Val Val Ser Leu Ile Lys Glu Arg Thr Gly Tyr 675 680 685

Thr Val Ser Pro Asp Ala Met Phe Asp Ile Gin Ile Lys Arg Ile His -53- DK 177092 B1 690 695 700

Glu Tyr Lys Arg Gin Leu Met Asn Ile Leu Gly Ile Val Tyr Arg Tyr 705 710 715 720

Lys Lys Met Lys Glu Met Ser Ala Ala Glu Arg Lys Glu Lys Tyr Val 725 730 735

Pro Arg Val Cys Ile Phe Gly Gly Lys Ala Phe Ala Thr Tyr Val Gin 740 745 750

Ala Lys Arg Ile Val Lys Phe Ile Thr Asp Val Gly Ala Thr Ile Asn 755 760 765

His Asp Pro Glu Ile Gly Asp Leu Leu Lys Val Val Phe Ile Pro Asp 770 775 780

Tyr Asn Val Ser Val Ala Glu Leu Leu Ile Pro Ala Ser Glu Leu Ser 785 790 795 800

Gin His Ile Ser Thr Ala Gly Met Glu Ala Ser Gly Thr Ser Asn Met 805 810 815

Lys Phe Ser Met Asn Gly Cys Ile Leu Ile Gly Thr Leu Asp Gly Ala 820 825 830

Asn Val Glu Ile Arg Glu Glu Val Gly Glu Asp Asn Phe Phe Leu Phe 835 840 845

Gly Ala Arg Ala His Asp Ile Ala Gly Leu Arg Lys Glu Arg Ala Glu 850 855 860

Gly Lys Tyr Val Pro Asp Pro Cys Phe Glu Glu Val Lys Glu Tyr Val 865 870 875 880

Arg Ser Gly Val Phe Gly Ser Asn Ser Tyr Asp Glu Leu Leu Gly Ser 885 890 895

Leu Glu Gly Asn Glu Gly Phe Gly Arg Ala Asp Tyr Phe Leu Val Gly 900 905 910

Lys Asp Phe Pro Ser Tyr Val Glu Cys Gin Glu Gin Val Asp Gin Ala 915 920 925 -54- DK 177092 B1

Tyr Arg Asp Gin Gin Lys Trp Thr Arg Met Ser Ile Leu Asn Thr Ala 930 935 940

Gly Ser Phe Lys Phe Ser Ser Asp Arg Thr Ile His Gin Tyr Ala Lys 945 950 955 960

Asp Ile Trp Asn Ile His Pro Val Asn Leu Pro 965 970 <210> 13 <211> 2952 <212> DNA <213> Zea mays <220> <221> CDS <222> (1)..(2952) <400> 13 ggc gac gac cac etc gcc gcc get gea get ege cac ege etc ccg ccc 48

Gly Asp Asp His Leu Ala Ala Ala Ala Ala Arg His Arg Leu Pro Pro 15 10 15 gea ege etc etc etc egg egg tgg egg ggt tet eet ccg egg gcg gtt 96

Ala Arg Leu Leu Leu Arg Arg Trp Arg Gly Ser Pro Pro Arg Ala Val 20 25 30 ccg gag gtg ggg teg egc egg gtc ggg gtc ggg gtc gag ggg ega ttg 144

Pro Glu Val Gly Ser Arg Arg Val Gly Val Gly Val Glu Gly Arg Leu 35 40 45 cag egg egg gtg teg gcg cgc age gtg gcg age gat egg gac gtg caa 192

Gin Arg Arg Val Ser Ala Arg Ser Val Ala Ser Asp Arg Asp Val Gin 50 55 60 ggc ccc gtc teg ccc gcg gaa ggg ett cca aat gtg eta aac tee atc 240

Gly Pro Val Ser Pro Ala Glu Gly Leu Pro Asn Val Leu Asn Ser Ile 65 70 75 80 ggc tea tet gcc att gea tea aac ate aag cac cat gea gag tte get 288

Gly Ser Ser Ala Ile Ala Ser Asn Ile Lys His His Ala Glu Phe Ala 85 90 95 ccc ttg tte tet cca gat cac ttt tet ccc ctg aaa get tac cat gcg 336

Pro Leu Phe Ser Pro Asp His Phe Ser Pro Leu Lys Ala Tyr His Ala 100 105 110 act get aaa agt gtc ett gat gcg ctg ctg ata aac tgg aat gcg aca 384

Thr Ala Lys Ser Val Leu Asp Ala Leu Leu Ile Asn Trp Asn Ala Thr 115 120 125 tat gat tat tac aac aaa atg aat gta aaa caa gea tat tac ctg tee 432

Tyr Asp Tyr Tyr Asn Lys Met Asn Val Lys Gin Ala Tyr Tyr Leu Ser 130 135 140 -55- DK 177092 B1 atg gag ttt tta cag gga agg get etc aca aat get att ggc aat eta 480

Met Glu Phe Leu Gin Gly Arg Ala Leu Thr Asn Ala Ile Gly Asn Leu 145 150 155 160 gag att act ggt gaa tat gea gaa gea tta aaa caa ett gga caa aac 528

Glu Ile Thr Gly Glu Tyr Ala Glu Ala Leu Lys Gin Leu Gly Gin Asn 165 170 175 ctg gag gat gtc get age cag gaa cca gat get gee ctg ggc aat ggt 576

Leu Glu Asp Val Ala Ser Gin Glu Pro Asp Ala Ala Leu Gly Asn Gly 180 185 190 ggt tta ggc ege ctg get tet tgt ttt ttg gat tet ttg gea aca tta 624

Gly Leu Gly Arg Leu Ala Ser Cys Phe Leu Asp Ser Leu Ala Thr Leu 195 200 205 aat tat cca gea ttg gga tat gga ett ege tat gaa tat ggc etc ttt 672

Asn Tyr Pro Ala Leu Gly Tyr Gly Leu Arg Tyr Glu Tyr Gly Leu Phe 210 215 220 aag cag ate ata aca aag gat ggt cag gag gag att get gag aat tgg 720

Lys Gin Ile Ile Thr Lys Asp Gly Gin Glu Glu Ile Ala Glu Asn Trp 225 230 235 240 ett gag atg gga tat eet tgg gag gtt gta aga aat gat gtc tet tat 768

Leu Glu Met Gly Tyr Pro Trp Glu Val Val Arg Asn Asp Val Ser Tyr 245 250 255 eet gtg aaa tte tat ggt aaa gtg gtg gaa ggc act gat ggt agg aag 816

Pro Val Lys Phe Tyr Gly Lys Val Val Glu Gly Thr Asp Gly Arg Lys 260 265 270 cac tgg att gga gga gaa aat ate aag get gtg gea cat gat gtc eet 864

His Trp Ile Gly Gly Glu Asn Ile Lys Ala Val Ala His Asp Val Pro 275 280 285 att eet ggc tac aaa act aga act acc aat aat ctg egt ett tgg tea 912

Ile Pro Gly Tyr Lys Thr Arg Thr Thr Asn Asn Leu Arg Leu Trp Ser 290 295 300 aca act gta cca gea caa gat ttt gac ttg gea get ttt aat tet gga 960

Thr Thr Val Pro Ala Gin Asp Phe Asp Leu Ala Ala Phe Asn Ser Gly 305 310 315 320 gat cat acc aag gea tat gaa get cat eta aac get aaa aag ata tgc 1008

Asp His Thr Lys Ala Tyr Glu Ala His Leu Asn Ala Lys Lys Ile Cys 325 330 335 cac ata ttg tat eet ggg gat gaa tea eta gag ggg aaa gtt etc ege 1056

His Ile Leu Tyr Pro Gly Asp Glu Ser Leu Glu Gly Lys Val Leu Arg 340 345 350 ttg aag caa caa tat aca ttg tgt tea gee tea eta cag gac atc att 1104

Leu Lys Gin Gin Tyr Thr Leu Cys Ser Ala Ser Leu Gin Asp Ile Ile 355 360 365 get egt ttt gag agt aga get ggc gag tet etc aac tgg gag gac tte 1152

Ala Arg Phe Glu Ser Arg Ala Gly Glu Ser Leu Asn Trp Glu Asp Phe 370 375 380 -56- DK 177092 B1 ccc tcc aaa gtt gca gtg cag atg aat gac act cat cca aca eta tgc 1200

Pro Ser Lys Val Ala Val Gin Met Asn Asp Thr His Pro Thr Leu Cys 385 390 395 400 att cct gag tta atg aga ata ctg atg gat gtt aag gga tta age tgg 1248

Ile Pro Glu Leu Met Arg Ile Leu Met Asp Val Lys Gly Leu Ser Trp 405 410 415 agt gag gca tgg agt att aca gaa aga acc gtg gca tac act aac cat 1296

Ser Glu Ala Trp Ser Ile Thr Glu Arg Thr Val Ala Tyr Thr Asn His 420 425 430 aca gtg ett cct gaa get eta gag aag tgg age ttg gac ata atg cag 1344

Thr Val Leu Pro Glu Ala Leu Glu Lys Trp Ser Leu Asp Ile Met Gin 435 440 445 aaa ett tta cct ega cat gtt gag ata ata gaa aca att gat gaa gag 1392

Lys Leu Leu Pro Arg His Val Glu Ile Ile Glu Thr Ile Asp Glu Glu 450 455 460 ctg ata aac aac ata gtc tea aaa tat gga acc aca gat act gaa ctg 1440

Leu Ile Asn Asn Ile Val Ser Lys Tyr Gly Thr Thr Asp Thr Glu Leu 465 470 475 480 ttg aaa aag aag ctg aaa gag atg aga att ctg gat aat gtt gac ett 1488

Leu Lys Lys Lys Leu Lys Glu Met Arg Ile Leu Asp Asn Val Asp Leu 485 490 495 cca get tcc att tcc caa eta ttt gtt aaa ccc aaa gac aaa aag gaa 1536

Pro Ala Ser Ile Ser Gin Leu Phe Val Lys Pro Lys Asp Lys Lys Glu 500 505 510 tet cct get aaa tea aag caa aag tta ett gtt aaa tet ttg gag act 1584

Ser Pro Ala Lys Ser Lys Gin Lys Leu Leu Val Lys Ser Leu Glu Thr 515 520 525 att gtt gag gtt gag gag aaa act gag ttg gaa gag gag gcg gag gtt 1632

Ile Val Glu Val Glu Glu Lys Thr Glu Leu Glu Glu Glu Ala Glu Val 530 535 540 eta tet gag ata gag gag gaa aaa ett gaa tet gaa gaa gta gag gca 1680

Leu Ser Glu Ile Glu Glu Glu Lys Leu Glu Ser Glu Glu Val Glu Ala 545 550 555 560 gaa gaa gcg agt tet gag gat gag tta gat cca ttt gta aag tet gat 1728

Glu Glu Ala Ser Ser Glu Asp Glu Leu Asp Pro Phe Val Lys Ser Asp 565 570 575 cct aag tta cca aga gtt gtc ega atg gca aac ctc tgt gtt gtt ggt 1776

Pro Lys Leu Pro Arg Val Val Arg Met Ala Asn Leu Cys Val Val Gly 580 585 590 ggg cat tea gta aat ggt gta get gaa att cac agt gaa att gtg aaa 1824

Gly His Ser Val Asn Gly Val Ala Glu Ile His Ser Glu Ile Val Lys 595 600 605 cag gat gtg ttc aac age ttc tat gag atg tgg cca act aaa ttt cag 1872

Gin Asp Val Phe Asn Ser Phe Tyr Glu Met Trp Pro Thr Lys Phe Gin -57- DK 177092 B1 610 615 620 aat aaa aca aat gga gtg act ccc agg cgt tgg atc cgg ttt tgt aat 1920

Asn Lys Thr Asn Gly Val Thr Pro Arg Arg Trp Ile Arg Phe Cys Asn 625 630 635 640 cct gca tta agt gca tta att tea aag tgg att ggt tet gat gac tgg 1968

Pro Ala Leu Ser Ala Leu Ile Ser Lys Trp Ile Gly Ser Asp Asp Trp 645 650 655 gtg ett aat aca gac aaa ctg gca gaa ctg aag aag ttt get gat aat 2016

Val Leu Asn Thr Asp Lys Leu Ala Glu Leu Lys Lys Phe Ala Asp Asn 660 665 670 gaa gat ctg cat tea gag tgg cgt get get aag aag get aac aaa atg 2064

Glu Asp Leu His Ser Glu Trp Arg Ala Ala Lys Lys Ala Asn Lys Met 675 680 685 aag gtt att tet ett ata agg gag aag aca gga tat att gtc agt cca 2112

Lys Val Ile Ser Leu Ile Arg Glu Lys Thr Gly Tyr Ile Val Ser Pro 690 695 700 gat gca atg ttt gat gtg cag gtg aaa agg ata cat gaa tat aag cgg 2160

Asp Ala Met Phe Asp Val Gin Val Lys Arg Ile His Glu Tyr Lys Arg 705 710 715 720 cag ctg eta aat atc ett gga att gtc tac cgc tac aag aag atg aaa 2208

Gin Leu Leu Asn Ile Leu Gly Ile Val Tyr Arg Tyr Lys Lys Met Lys 725 730 735 gaa atg age aca gaa gaa aga gca aag age ttt gtt cca agg gta tgc 2256

Glu Met Ser Thr Glu Glu Arg Ala Lys Ser Phe Val Pro Arg Val Cys 740 745 750 ata ttc ggt ggg aaa gca ttt gcc aca tat ata cag gca aaa agg atc 2304

Ile Phe Gly Gly Lys Ala Phe Ala Thr Tyr Ile Gin Ala Lys Arg Ile 755 760 765 gtt aaa ttt att aca gat gtg gca get acc gtg aac cat gat tea gac 2352

Val Lys Phe Ile Thr Asp Val Ala Ala Thr Val Asn His Asp Ser Asp 770 775 780 att gga gat ttg ttg aag gtc gta ttt gtt cca gac tat aat gtt agt 2400

Ile Gly Asp Leu Leu Lys Val Val Phe Val Pro Asp Tyr Asn Val Ser 785 790 795 800 gtt gcc gag gca eta att cct gcc agt gaa ttg tea cag cat atc agt 2448

Val Ala Glu Ala Leu Ile Pro Ala Ser Glu Leu Ser Gin His Ile Ser 805 810 815 act get gga atg gaa get agt ggg acc agt aac atg aag ttt gca atg 2496

Thr Ala Gly Met Glu Ala Ser Gly Thr Ser Asn Met Lys Phe Ala Met 820 825 830 aac ggt tgc att ett att gga act tta gat ggt gca aat gtg gag atc 2544

Asn Gly Cys Ile Leu Ile Gly Thr Leu Asp Gly Ala Asn Val Glu Ile 835 840 845 aga gag gag gtt gga gaa gaa aac ttt ttc ett ttt ggt gca gag gca 2592 -58- DK 177092 B1

Arg Glu Glu Val Gly Glu Glu Asn Phe Phe Leu Phe Gly Ala Glu Ala 850 855 860 cat gaa att get ggt ttg egg aaa gaa aga gcc gag gga aag ttt gtg 2640

His Glu Ile Ala Gly Leu Arg Lys Glu Arg Ala Glu Gly Lys Phe Val 865 870 875 880 cct gac cca aga ttt gag gag gtt aag gaa ttt gtc cgc agt ggt gtc 2688

Pro Asp Pro Arg Phe Glu Glu Val Lys Glu Phe Val Arg Ser Gly Val 885 890 895 ttt ggg act tac age tat gat gaa ttg atg ggg tet ttg gaa gga aat 2736

Phe Gly Thr Tyr Ser Tyr Asp Glu Leu Met Gly Ser Leu Glu Gly Asn 900 905 910 gaa ggt tac gga egt gea gat tat ttc ett gtt ggc aag gac ttc ccc 2784

Glu Gly Tyr Gly Arg Ala Asp Tyr Phe Leu Val Gly Lys Asp Phe Pro 915 920 925 age tat att gaa tgc caa gaa aaa gtt gat gag gcg tac ega gat cag 2832

Ser Tyr Ile Glu Cys Gin Glu Lys Val Asp Glu Ala Tyr Arg Asp Gin 930 935 940 aag tta tgg aca agg atg tet ate etc aac aeg get ggc tea tee aag 2880

Lys Leu Trp Thr Arg Met Ser Ile Leu Asn Thr Ala Gly Ser Ser Lys 945 950 955 960 ttc age age gat agg aeg att cat gag tac gee aag gat atc tgg gat 2928

Phe Ser Ser Asp Arg Thr Ile His Glu Tyr Ala Lys Asp Ile Trp Asp 965 970 975 ate age cct gee ate ett ccc tag 2952

Ile Ser Pro Ala Ile Leu Pro 980 <210> 14 <211> 983 <212> PRT <213> Zea mays <400> 14

Gly Asp Asp His Leu Ala Ala Ala Ala Ala Arg His Arg Leu Pro Pro 15 10 15

Ala Arg Leu Leu Leu Arg Arg Trp Arg Gly Ser Pro Pro Arg Ala Val 20 25 30

Pro Glu Val Gly Ser Arg Arg Val Gly Val Gly Val Glu Gly Arg Leu 35 40 45

Gin Arg Arg Val Ser Ala Arg Ser Val Ala Ser Asp Arg Asp Val Gin 50 55 60 -59- DK 177092 B1

Gly Pro Val Ser Pro Ala Glu Gly Leu Pro Asn Val Leu Asn Ser Ile 65 70 75 80

Gly Ser Ser Ala Ile Ala Ser Asn Ile Lys His His Ala Glu Phe Ala 85 90 95

Pro Leu Phe Ser Pro Asp His Phe Ser Pro Leu Lys Ala Tyr His Ala 100 105 110

Thr Ala Lys Ser Val Leu Asp Ala Leu Leu Ile Asn Trp Asn Ala Thr 115 120 125

Tyr Asp Tyr Tyr Asn Lys Met Asn Val Lys Gin Ala Tyr Tyr Leu Ser 130 135 140

Met Glu Phe Leu Gin Gly Arg Ala Leu Thr Asn Ala Ile Gly Asn Leu 145 150 155 160

Glu Ile Thr Gly Glu Tyr Ala Glu Ala Leu Lys Gin Leu Gly Gin Asn 165 170 175

Leu Glu Asp Val Ala Ser Gin Glu Pro Asp Ala Ala Leu Gly Asn Gly 180 185 190

Gly Leu Gly Arg Leu Ala Ser Cys Phe Leu Asp Ser Leu Ala Thr Leu 195 200 205

Asn Tyr Pro Ala Leu Gly Tyr Gly Leu Arg Tyr Glu Tyr Gly Leu Phe 210 215 220

Lys Gin Ile Ile Thr Lys Asp Gly Gin Glu Glu Ile Ala Glu Asn Trp 225 230 235 240

Leu Glu Met Gly Tyr Pro Trp Glu Val Val Arg Asn Asp Val Ser Tyr 245 250 255

Pro Val Lys Phe Tyr Gly Lys Val Val Glu Gly Thr Asp Gly Arg Lys 260 265 270

His Trp Ile Gly Gly Glu Asn Ile Lys Ala Val Ala His Asp Val Pro 275 280 285

Ile Pro Gly Tyr Lys Thr Arg Thr Thr Asn Asn Leu Arg Leu Trp Ser 290 295 300 -60- DK 177092 B1

Thr Thr Val Pro Ala Gin Asp Phe Asp Leu Ala Ala Phe Asn Ser Gly 305 310 315 320

Asp His Thr Lys Ala Tyr Glu Ala His Leu Asn Ala Lys Lys Ile Cys 325 330 335

His Ile Leu Tyr Pro Gly Asp Glu Ser Leu Glu Gly Lys Val Leu Arg 340 345 350

Leu Lys Gin Gin Tyr Thr Leu Cys Ser Ala Ser Leu Gin Asp Ile Ile 355 360 365

Ala Arg Phe Glu Ser Arg Ala Gly Glu Ser Leu Asn Trp Glu Asp Phe 370 375 380

Pro Ser Lys Val Ala Val Gin Met Asn Asp Thr His Pro Thr Leu Cys 385 390 395 400

Ile Pro Glu Leu Met Arg Ile Leu Met Asp Val Lys Gly Leu Ser Trp 405 410 415

Ser Glu Ala Trp Ser Ile Thr Glu Arg Thr Val Ala Tyr Thr Asn His 420 425 430

Thr Val Leu Pro Glu Ala Leu Glu Lys Trp Ser Leu Asp Ile Met Gin 435 440 445

Lys Leu Leu Pro Arg His Val Glu Ile Ile Glu Thr Ile Asp Glu Glu 450 455 460

Leu Ile Asn Asn Ile Val Ser Lys Tyr Gly Thr Thr Asp Thr Glu Leu 465 470 475 480

Leu Lys Lys Lys Leu Lys Glu Met Arg Ile Leu Asp Asn Val Asp Leu 485 490 495

Pro Ala Ser Ile Ser Gin Leu phe Val Lys Pro Lys Asp Lys Lys Glu 500 505 510

Ser Pro Ala Lys Ser Lys Gin Lys Leu Leu Val Lys Ser Leu Glu Thr 515 520 525

Ile Val Glu Val Glu Glu Lys Thr Glu Leu Glu Glu Glu Ala Glu Val 530 535 540 -61 - DK 177092 B1

Leu Ser Glu Ile Glu Glu Glu Lys Leu Glu Ser Glu Glu Val Glu Ala 545 550 555 560

Glu Glu Ala Ser Ser Glu Asp Glu Leu Asp Pro Phe Val Lys Ser Asp 565 570 575

Pro Lys Leu Pro Arg Val Val Arg Met Ala Asn Leu Cys Val Val Gly 580 585 590

Gly His Ser Val Asn Gly Val Ala Glu Ile His Ser Glu ile Val Lys 595 600 605

Gin Asp Val Phe Asn Ser Phe Tyr Glu Met Trp Pro Thr Lys Phe Gin 610 615 620

Asn Lys Thr Asn Gly Val Thr Pro Arg Arg Trp Ile Arg Phe Cys Asn 625 630 635 640

Pro Ala Leu Ser Ala Leu Ile Ser Lys Trp Ile Gly Ser Asp Asp Trp 645 650 655

Val Leu Asn Thr Asp Lys Leu Ala Glu Leu Lys Lys Phe Ala Asp Asn 660 665 670

Glu Asp Leu His Ser Glu Trp Arg Ala Ala Lys Lys Ala Asn Lys Met 675 680 685

Lys Val Ile Ser Leu Ile Arg Glu Lys Thr Gly Tyr Ile Val Ser Pro 690 695 700

Asp Ala Met Phe Asp Val Gin Val Lys Arg Ile His Glu Tyr Lys Arg 705 710 715 720

Gin Leu Leu Asn Ile Leu Gly Ile Val Tyr Arg Tyr Lys Lys Met Lys 725 730 735

Glu Met Ser Thr Glu Glu Arg Ala Lys Ser Phe Val Pro Arg Val Cys 740 745 750

Ile Phe Gly Gly Lys Ala Phe Ala Thr Tyr Ile Gin Ala Lys Arg Ile 755 760 765

Val Lys Phe Ile Thr Asp Val Ala Ala Thr Val Asn His Asp Ser Asp -62- DK 177092 B1 770 775 780

Ile Gly Asp Leu Leu Lys Val Val Phe Val Pro Asp Tyr Asn Val Ser 785 790 795 800

Val Ala Glu Ala Leu Ile Pro Ala Ser Glu Leu Ser Gin His Ile Ser 805 810 815

Thr Ala Gly Met Glu Ala Ser Gly Thr Ser Asn Met Lys Phe Ala Met 820 825 830

Asn Gly Cys Ile Leu Ile Gly Thr Leu Asp Gly Ala Asn Val Glu Ile 835 840 845

Arg Glu Glu Val Gly Glu Glu Asn Phe Phe Leu Phe Gly Ala Glu Ala 850 855 860

His Glu Ile Ala Gly Leu Arg Lys Glu Arg Ala Glu Gly Lys Phe Val 865 870 875 880

Pro Asp Pro Arg Phe Glu Glu Val Lys Glu Phe Val Arg Ser Gly Val 885 890 895

Phe Gly Thr Tyr Ser Tyr Asp Glu Leu Met Gly Ser Leu Glu Gly Asn 900 905 910

Glu Gly Tyr Gly Arg Ala Asp Tyr Phe Leu Val Gly Lys Asp Phe Pro 915 920 925

Ser Tyr Ile Glu Cys Gin Glu Lys Val Asp Glu Ala Tyr Arg Asp Gin 930 935 940

Lys Leu Trp Thr Arg Met Ser Ile Leu Asn Thr Ala Gly Ser Ser Lys 945 950 955 960

Phe Ser Ser Asp Arg Thr Ile His Glu Tyr Ala Lys Asp Ile Trp Asp 965 970 975

Ile Ser Pro Ala Ile Leu Pro 980 <210> 15 <211> 3141 <212> DNA <213> Oryza sativa -63 - DK 177092 B1 <220> <221> CDS <222> (2)..(2788) <400> 15 g egg age gtg gcg age gat egg ggc gtg cag ggg teg gtg teg ccc gag 49

Arg Ser Val Ala Ser Asp Arg Gly Val Gin Gly Ser Val Ser Pro Glu 15 10 15 gaa gag att tea agt gtg eta aat tee ate gat tee tet acc att gea 97

Glu Glu Ile Ser Ser Val Leu Asn Ser Ile Asp Ser Ser Thr Ile Ala 20 25 30 tea aac att aag cac cat gcg gag tte aca cca gta tte tet cca gag 145

Ser Asn Ile Lys His His Ala Glu Phe Thr Pro Val Phe Ser Pro Glu 35 40 45 cac ttt tea eet ctg aag get tac cat gea act get aaa agt gtt ett 193

His Phe Ser Pro Leu Lys Ala Tyr His Ala Thr Ala Lys Ser Val Leu 50 55 60 gat act ctg ata atg aac tgg aat gea aca tat gac tat tac gac aga 241

Asp Thr Leu Ile Met Asn Trp Asn Ala Thr Tyr Asp Tyr Tyr Asp Arg 65 70 75 80 aca aat gtg aag caa gcg tat tac ctg tee atg gag ttt tta cag gga 289

Thr Asn Val Lys Gin Ala Tyr Tyr Leu Ser Met Glu Phe Leu Gin Gly 85 90 95 aga get etc act aat gee gtt ggt aac ett gag eta act gga caa tac 337

Arg Ala Leu Thr Asn Ala Val Gly Asn Leu Glu Leu Thr Gly Gin Tyr 100 105 110 gea gaa gea eta caa caa ett gga cac age eta gag gat gtt get acc 385

Ala Glu Ala Leu Gin Gin Leu Gly His Ser Leu Glu Asp Val Ala Thr 115 120 125 cag gag cca gat get gee ett ggg aat ggt ggt eta ggc egg tta get 433

Gin Glu Pro Asp Ala Ala Leu Gly Asn Gly Gly Leu Gly Arg Leu Ala 130 135 140 tee tgt tte ttg gat tet ctg gea acc eta aat tat cca gea tgg gga 481

Ser Cys Phe Leu Asp Ser Leu Ala Thr Leu Asn Tyr Pro Ala Trp Gly 145 150 155 160 tat gga ett ega tac aaa cat ggc etc ttt aag caa atc ata aeg aag 529

Tyr Gly Leu Arg Tyr Lys His Gly Leu Phe Lys Gin Ile Ile Thr Lys 165 170 175 gat ggt cag gag gag gta get gaa aat tgg etc gag atg gga aat eet 577

Asp Gly Gin Glu Glu Val Ala Glu Asn Trp Leu Glu Met Gly Asn Pro 180 185 190 tgg gag att gta aga acc gat gtc tee tat eet gtg aag tte tat ggt 625

Trp Glu Ile Val Arg Thr Asp Val Ser Tyr Pro Val Lys Phe Tyr Gly 195 200 205 -64- DK 177092 B1 aaa gtg gtt gaa ggc act gat ggg agg atg cac tgg att gga gga gaa 673

Lys Val Val Glu Gly Thr Asp Gly Arg Met His Trp Ile Gly Gly Glu 210 215 220 aat ate aag gtt gtt get cat gat atc cct att eet ggc tac aag act 721

Asn Ile Lys Val Val Ala His Asp Ile Pro Ile Pro Gly Tyr Lys Thr 225 230 235 240 aaa act acc aac aat ett egt ett tgg tea aca aca gtg cca tea caa 769

Lys Thr Thr Asn Asn Leu Arg Leu Trp Ser Thr Thr Val Pro Ser Gin 245 250 255 gat tte gat ttg gaa get ttt aat get gga gat cat gea agt gea tat 817

Asp Phe Asp Leu Glu Ala Phe Asn Ala Gly Asp His Ala Ser Ala Tyr 260 265 270 gaa get cat eta aat get gaa aag ata tgt cac gta ctg tat cct ggg 865

Glu Ala His Leu Asn Ala Glu Lys Ile Cys His Val Leu Tyr Pro Gly 275 280 285 gac gaa tea cca gag ggg aaa gtt ett ege ctg aag caa caa tat aca 913

Asp Glu Ser Pro Glu Gly Lys Val Leu Arg Leu Lys Gin Gin Tyr Thr 290 295 300 tta tgc tea gee tea eta cag gat att att get egt tte gag agg aga 961

Leu Cys Ser Ala Ser Leu Gin Asp Ile Ile Ala Arg Phe Glu Arg Arg 305 310 315 320 get ggt gat tet etc age tgg gag gac tte ccc tet aaa gtt gea gtg 1009

Ala Gly Asp Ser Leu Ser Trp Glu Asp Phe Pro Ser Lys Val Ala Val 325 330 335 cag atg aat gac act cac cca aca ctg tgc att cct gag ttg atg aga 1057

Gin Met Asn Asp Thr His Pro Thr Leu Cys Ile Pro Glu Leu Met Arg 340 345 350 ata ttg att gat gtt aaa ggg tta age tgg aat gag get tgg agt atc 1105

Ile Leu Ile Asp Val Lys Gly Leu Ser Trp Asn Glu Ala Trp Ser Ile 355 360 365 aca gaa aga act gtg gea tac aca aac cac aeg gtg ett cct gaa get 1153

Thr Glu Arg Thr Val Ala Tyr Thr Asn His Thr Val Leu Pro Glu Ala 370 375 380 ctg gag aag tgg age ttg gac ata atg cag aaa ett ett cct egg cat 1201

Leu Glu Lys Trp Ser Leu Asp Ile Met Gin Lys Leu Leu Pro Arg His 385 390 395 400 gtt gaa atc ata gaa aaa att gat ggg gag ctg atg aac atc att atc 1249

Val Glu Ile Ile Glu Lys Ile Asp Gly Glu Leu Met Asn Ile Ile Ile 405 410 415 tea aaa tac gga aca gaa gat act tea ctg tta aaa aag aag att aaa 1297

Ser Lys Tyr Gly Thr Glu Asp Thr Ser Leu Leu Lys Lys Lys Ile Lys 420 425 430 gaa atg aga ate tta gac aac att gac eta cca gat tet att gcc aaa 1345

Glu Met Arg Ile Leu Asp Asn Ile Asp Leu Pro Asp Ser Ile Ala Lys 435 440 445 -65- DK 177092 B1 cta ttt gtg aaa cca aaa gag aaa aaa gaa tct cct get aaa ttg aaa 1393

Leu Phe Val Lys Pro Lys Glu Lys Lys Glu Ser Pro Ala Lys Leu Lys 450 455 460 gag aaa ttg ett gtc aaa tct ctg gag cct agt gtt gtg gtt gag gag 1441

Glu Lys Leu Leu Val Lys Ser Leu Glu Pro Ser Val Val Val Glu Glu 465 470 475 480 aaa act gtg tee aaa gta gag ata aac gag gac tct gag gag gtg gag 1489

Lys Thr Val Ser Lys Val Glu Ile Asn Glu Asp Ser Glu Glu Val Glu 485 490 495 gta gac tct gaa gaa gtt gtg gag gea gaa aac gag gac tct gag gat 1537

Val Asp Ser Glu Glu Val Val Glu Ala Glu Asn Glu Asp Ser Glu Asp 500 505 510 gag tta gat cca ttt gta aaa tea gat cct aaa tta cct aga gtt gtc 1585

Glu Leu Asp Pro Phe Val Lys Ser Asp Pro Lys Leu Pro Arg Val Val 515 520 525 ega atg get aac ett tgt gtt gtt ggt ggg cat teg gtt aat ggt gtg 1633

Arg Met Ala Asn Leu Cys Val Val Gly Gly His Ser Val Asn Gly Val 530 535 540 get gcg att cac age gag att gtg aaa gaa gat gta tte aac age ttt 1681

Ala Ala Ile His Ser Glu Ile Val Lys Glu Asp Val Phe Asn Ser Phe 545 550 555 560 tat gag atg tgg ccc get aaa ttt caa aat aaa aca aat gga gtg act 1729

Tyr Glu Met Trp Pro Ala Lys Phe Gin Asn Lys Thr Asn Gly Val Thr 565 570 575 cct aga egt tgg att egg ttt tgt aat cct gaa tta agt gea atc att 1777

Pro Arg Arg Trp Ile Arg Phe Cys Asn Pro Glu Leu Ser Ala ile Ile 580 585 590 tea aaa tgg ata gga tct gat gat tgg gtt ttg aac act gat aaa ett 1825

Ser Lys Trp Ile Gly Ser Asp Asp Trp Val Leu Asn Thr Asp Lys Leu 595 600 605 get gaa tta aag aag ttt get gat gat gag gat ctg caa tea gaa tgg 1873

Ala Glu Leu Lys Lys Phe Ala Asp Asp Glu Asp Leu Gin Ser Glu Trp 610 615 620 egt get get aaa aag get aac aag gtg aag gtt gtt tct etc ata aga 1921

Arg Ala Ala Lys Lys Ala Asn Lys Val Lys Val Val Ser Leu Ile Arg 625 630 635 640 gaa aaa aca gga tat atc gtc agt cca gat gea atg ttt gac gtt cag 1969

Glu Lys Thr Gly Tyr Ile Val Ser Pro Asp Ala Met Phe Asp Val Gin 645 650 655 gtg aaa agg ate cat gag tat aag ega cag ctg eta aat atc ett gga 2017

Val Lys Arg Ile His Glu Tyr Lys Arg Gin Leu Leu Asn Ile Leu Gly 660 665 670 att gtc tac ege tac aag aag atg aaa gaa atg agt gea aaa gac aga 2065

Ile Val Tyr Arg Tyr Lys Lys Met Lys Glu Met Ser Ala Lys Asp Arg -66- DK 177092 B1 675 680 685 ata aat age ttt gtt cca agg gta tgc ata ttt ggt ggg aaa gea ttt 2113

Ile Asn Ser Phe Val Pro Arg Val Cys Ile Phe Gly Gly Lys Ala Phe 690 695 700 gcc act tac gta cag gea aag agg ata gtg aag ttt att aca gat gtt 2161

Ala Thr Tyr Val Gin Ala Lys Arg Ile Val Lys Phe Ile Thr Asp Val 705 710 715 720 gea get act gta aat cat gat cca gaa att gga gat eta ttg aag gtt 2209

Ala Ala Thr Val Asn His Asp Pro Glu Ile Gly Asp Leu Leu Lys Val 725 730 735 gta ttt att cca gat tat aat gtt agt gtt get gag gcg eta atc eet 2257

Val Phe Ile Pro Asp Tyr Asn Val Ser Val Ala Glu Ala Leu Ile Pro 740 745 750 gcc agt gaa ttg tet cag cat atc agt act get gga atg gaa get agt 2305

Ala Ser Glu Leu Ser Gin His Ile Ser Thr Ala Gly Met Glu Ala Ser 755 760 765 gga acc age aac atg aag ttt gea atg aat gga tgt atc ett att gga 2353

Gly Thr Ser Asn Met Lys Phe Ala Met Asn Gly Cys Ile Leu Ile Gly 770 775 780 act ttg gat ggt get aat gtg gaa atc aga gag gag gtt gga gag gaa 2401

Thr Leu Asp Gly Ala Asn Val Glu Ile Arg Glu Glu Val Gly Glu Glu 785 790 795 800 aac ttt ttc ett ttt ggt get gag gea cat gaa att get ggt tta agg 2449

Asn Phe Phe Leu Phe Gly Ala Glu Ala His Glu Ile Ala Gly Leu Arg 805 810 815 aaa gag aga gcc cag gga aag ttt gtg cct gac cca aga tte gaa gag 2497

Lys Glu Arg Ala Gin Gly Lys Phe Val Pro Asp Pro Arg Phe Glu Glu 820 825 830 gtt aag aga ttt gtc ege agt ggg gtc ttt gga act tac aac tac gat 2545

Val Lys Arg Phe val Arg Ser Gly Val Phe Gly Thr Tyr Asn Tyr Asp 835 840 845 gac ttg atg ggt tet ctg gaa gga aat gaa ggt tat ggg egt gea gac 2593

Asp Leu Met Gly Ser Leu Glu Gly Asn Glu Gly Tyr Gly Arg Ala Asp 850 855 860 tat ttt ett gtt ggt aaa gat tte ccc age tac att gaa tgc cag gag 2641

Tyr Phe Leu Val Gly Lys Asp Phe Pro Ser Tyr Ile Glu Cys Gin Glu 865 870 875 880 aag gtt gat aaa gea tac ege gat cag aaa eta tgg aca agg atg tea 2689

Lys Val Asp Lys Ala Tyr Arg Asp Gin Lys Leu Trp Thr Arg Met Ser 885 890 895 atc etc aac aca gcc agt tee tee aag tte aac age gac egg aeg att 2737

Ile Leu Asn Thr Ala Ser Ser Ser Lys Phe Asn Ser Asp Arg Thr Ile 900 905 910 cac gag tac gcc aag gac atc tgg gac atc aag cct gtc atc ctg ccc 2785 -67- DK 177092 B1

His Glu Tyr Ala Lys Asp Ile Trp Asp Ile Lys Pro Val Ile Leu Pro 915 920 925 tag acaggcaagg caageactag ccactccctg ccagcgacct tcagagctaa 2838 ggtgcgcgca accggtgatg cgatgacagc atctgcctcc cagctctcct tggcaggaag 2898 gtttcgcttt gctcccagtt ttgagtagac agaagcaagt tcagttcagg cttcgataaa 2958 acgctggaac tatgcaaatt gtagccgtgt tgcctagcct ggaacaccct tgttttacct 3018 gtaatgtgta gcagcctctg ctgatcagct catgtgctat atggaattct gaagtgaaac 3078 catagttaaa agggatcggt tagtggcaaa aaaaaaaaga aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3138 aaa 3141 <210> 16 <211> 928

<212> PRT

<213> Oryza sativa <400> 16

Arg Ser Val Ala Ser Asp Arg Gly Val Gin Gly Ser Val Ser Pro Glu 15 10 15

Glu Glu Ile Ser Ser Val Leu Asn Ser Ile Asp Ser Ser Thr Ile Ala 20 25 30

Ser Asn Ile Lys His His Ala Glu Phe Thr Pro Val Phe Ser Pro Glu 35 40 45

His Phe Ser Pro Leu Lys Ala Tyr His Ala Thr Ala Lys Ser Val Leu 50 55 60

Asp Thr Leu Ile Met Asn Trp Asn Ala Thr Tyr Asp Tyr Tyr Asp Arg 65 70 75 80

Thr Asn Val Lys Gin Ala Tyr Tyr Leu Ser Met Glu Phe Leu Gin Gly 85 90 95

Arg Ala Leu Thr Asn Ala Val Gly Asn Leu Glu Leu Thr Gly Gin Tyr 100 105 110

Ala Glu Ala Leu Gin Gin Leu Gly His Ser Leu Glu Asp Val Ala Thr 115 120 125

Gin Glu Pro Asp Ala Ala Leu Gly Asn Gly Gly Leu Gly Arg Leu Ala 130 135 140 -68- DK 177092 B1

Ser Cys Phe Leu Asp Ser Leu Ala Thr Leu Asn Tyr Pro Ala Trp Gly 145 150 155 160

Tyr Gly Leu Arg Tyr Lys His Gly Leu Phe Lys Gin Ile Ile Thr Lys 165 170 175

Asp Gly Gin Glu Glu Val Ala Glu Asn Trp Leu Glu Met Gly Asn Pro 180 185 190

Trp Glu Ile Val Arg Thr Asp Val Ser Tyr Pro Val Lys Phe Tyr Gly 195 200 205

Lys Val Val Glu Gly Thr Asp Gly Arg Met His Trp Ile Gly Gly Glu 210 215 220

Asn Ile Lys Val Val Ala His Asp Ile Pro Ile Pro Gly Tyr Lys Thr 225 230 235 240

Lys Thr Thr Asn Asn Leu Arg Leu Trp Ser Thr Thr Val Pro Ser Gin 245 250 255

Asp Phe Asp Leu Glu Ala Phe Asn Ala Gly Asp His Ala Ser Ala Tyr 260 265 270

Glu Ala His Leu Asn Ala Glu Lys Ile Cys His Val Leu Tyr Pro Gly 275 280 285

Asp Glu Ser Pro Glu Gly Lys Val Leu Arg Leu Lys Gin Gin Tyr Thr 290 295 300

Leu Cys Ser Ala Ser Leu Gin Asp Ile Ile Ala Arg Phe Glu Arg Arg 305 310 315 320

Ala Gly Asp Ser Leu Ser Trp Glu Asp Phe Pro Ser Lys Val Ala Val 325 330 335

Gin Met Asn Asp Thr His Pro Thr Leu Cys Ile Pro Glu Leu Met Arg 340 345 350

Ile Leu Ile Asp Val Lys Gly Leu Ser Trp Asn Glu Ala Trp Ser Ile 355 360 365

Thr Glu Arg Thr Val Ala Tyr Thr Asn His Thr Val Leu Pro Glu Ala -69- DK 177092 B1 370 375 380

Leu Glu Lys Trp Ser Leu Asp Ile Met Gin Lys Leu Leu Pro Arg His 385 390 395 400

Val Glu Ile Ile Glu Lys Ile Asp Gly Glu Leu Met Asn Ile Ile Ile 405 410 415

Ser Lys Tyr Gly Thr Glu Asp Thr Ser Leu Leu Lys Lys Lys Ile Lys 420 425 430

Glu Met Arg Ile Leu Asp Asn Ile Asp Leu Pro Asp Ser Ile Ala Lys 435 440 445

Leu Phe Val Lys Pro Lys Glu Lys Lys Glu Ser pro Ala Lys Leu Lys 450 455 460

Glu Lys Leu Leu Val Lys Ser Leu Glu Pro Ser val Val Val Glu Glu 465 470 475 480

Lys Thr Val Ser Lys Val Glu Ile Asn Glu Asp Ser Glu Glu Val Glu 485 490 495

Val Asp Ser Glu Glu Val Val Glu Ala Glu Asn Glu Asp Ser Glu Asp 500 505 510

Glu Leu Asp Pro Phe Val Lys Ser Asp Pro Lys Leu Pro Arg Val Val 515 520 525

Arg Met Ala Asn Leu Cys Val Val Gly Gly His Ser Val Asn Gly Val 530 535 540

Ala Ala ile His Ser Glu Ile Val Lys Glu Asp Val Phe Asn Ser Phe 545 550 555 560

Tyr Glu Met Trp Pro Ala Lys Phe Gin Asn Lys Thr Asn Gly Val Thr 565 570 575

Pro Arg Arg Trp Ile Arg Phe Cys Asn Pro Glu Leu Ser Ala Ile Ile 580 585 590

Ser Lys Trp Ile Gly Ser Asp Asp Trp Val Leu Asn Thr Asp Lys Leu 595 600 605 -70- DK 177092 B1

Ala Glu Leu Lys Lys Phe Ala Asp Asp Glu Asp Leu Gin Ser Glu Trp 610 615 620

Arg Ala Ala Lys Lys Ala Asn Lys Val Lys Val Val Ser Leu Ile Arg 625 630 635 640

Glu Lys Thr Gly Tyr Ile Val Ser Pro Asp Ala Met Phe Asp Val Gin 645 650 655

Val Lys Arg Ile His Glu Tyr Lys Arg Gin Leu Leu Asn Ile Leu Gly 660 665 670

Ile Val Tyr Arg Tyr Lys Lys Met Lys Glu Met Ser Ala Lys Asp Arg 675 680 685

Ile Asn Ser Phe Val Pro Arg Val Cys Ile Phe Gly Gly Lys Ala Phe 690 695 700

Ala Thr Tyr Val Gin Ala Lys Arg Ile Val Lys Phe ile Thr Asp Val 705 710 715 720

Ala Ala Thr Val Asn His Asp Pro Glu Ile Gly Asp Leu Leu Lys Val 725 730 735

Val Phe Ile Pro Asp Tyr Asn Val Ser Val Ala Glu Ala Leu Ile Pro 740 745 750

Ala Ser Glu Leu Ser Gin His Ile Ser Thr Ala Gly Met Glu Ala Ser 755 760 765

Gly Thr Ser Asn Met Lys Phe Ala Met Asn Gly Cys Ile Leu Ile Gly 770 775 780

Thr Leu Asp Gly Ala Asn val Glu Ile Arg Glu Glu Val Gly Glu Glu 785 790 795 800

Asn Phe Phe Leu Phe Gly Ala Glu Ala His Glu Ile Ala Gly Leu Arg 805 810 815

Lys Glu Arg Ala Gin Gly Lys Phe Val Pro Asp Pro Arg Phe Glu Glu 820 825 830

Val Lys Arg Phe Val Arg Ser Gly Val Phe Gly Thr Tyr Asn Tyr Asp 835 840 845 -71 - DK 177092 B1

Asp Leu Met Gly Ser Leu Glu Gly Asn Glu Gly Tyr Gly Arg Ala Asp 850 855 860

Tyr Phe Leu Val Gly Lys Asp Phe Pro Ser Tyr Ile Glu Cys Gin Glu 865 870 875 880

Lys Val Asp Lys Ala Tyr Arg Asp Gin Lys Leu Trp Thr Arg Met Ser 885 890 895

Ile Leu Asn Thr Ala Ser Ser Ser Lys Phe Asn Ser Asp Arg Thr Ile 900 905 910

His Glu Tyr Ala Lys Asp Ile Trp Asp Ile Lys Pro Val Ile Leu Pro 915 920 925 <210> 17 <211> 2856

<212> DNA

<213> Oryza sativa <220> <221> CDS <222> (1)..(2856} <400> 17 atg gcg acc gcc tcg gcg ccg ctg cag ctg gcc acc gcg tcc cgg ccg 48

Met Ala Thr Ala Ser Ala Pro Leu Gin Leu Ala Thr Ala Ser Arg Pro 15 10 15 ctc ccc gtc ggc gtc ggc tgc ggc gga gga gga ggc ggg ggg ctc cac 96

Leu Pro Val Gly Val Gly Cys Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Leu His 20 25 30 gtg ggt ggt gcc cgc ggc ggg ggc gcg gca ccg gcg cgg cgg cgg ctg 144

Val Gly Gly Ala Arg Gly Gly Gly Ala Ala Pro Ala Arg Arg Arg Leu 35 40 45 gcg gtg cgg age gtg gcg age gat cgg ggc gtg cag ggg tcg gtg tcg 192

Ala Val Arg Ser Val Ala Ser Asp Arg Gly Val Gin Gly Ser Val Ser 50 55 60 ccc gag gaa gag att tea agt gtg eta aat tcc atc gat tcc tet acc 240

Pro Glu Glu Glu Ile Ser Ser Val Leu Asn Ser Ile Asp Ser Ser Thr 65 70 75 80 att gca tea aac att aag cac cat gcg gag ttc aca cca gta ttc tet 288

Ile Ala Ser Asn Ile Lys His His Ala Glu Phe Thr Pro Val Phe Ser 85 90 95 cca gag cac ttt tea cct ctg aag get tac cat gca act get aaa agt 336

Pro Glu His Phe Ser Pro Leu Lys Ala Tyr His Ala Thr Ala Lys Ser 100 105 110 -72- DK 177092 B1 gtt ctt gat act ctg ata atg aac tgg aat gca aca tat gac tat tac 384

Val Leu Asp Thr Leu Ile Met Asn Trp Asn Ala Thr Tyr Asp Tyr Tyr 115 120 125 gac aga aca aat gtg aag caa gcg tat tac ctg tcc atg gag ttt tta 432

Asp Arg Thr Asn Val Lys Gin Ala Tyr Tyr Leu Ser Met Glu Phe Leu 130 135 140 cag gga aga get etc act aat gcc gtt ggt aac ctt gag eta act gga 480

Gin Gly Arg Ala Leu Thr Asn Ala Val Gly Asn Leu Glu Leu Thr Gly 145 150 155 160 caa tac gca gaa gca eta caa caa ctt gga cac age eta gag gat gtt 528

Gin Tyr Ala Glu Ala Leu Gin Gin Leu Gly His Ser Leu Glu Asp Val 165 170 175 get acc cag gag cca gat get gcc ctt ggg aat ggt ggt eta ggc egg 576

Ala Thr Gin Glu Pro Asp Ala Ala Leu Gly Asn Gly Gly Leu Gly Arg 180 185 190 tta get tcc tgt tte ttg gat tet ctg gca acc eta aat tat cca gca 624

Leu Ala Ser Cys Phe Leu Asp Ser Leu Ala Thr Leu Asn Tyr Pro Ala 195 200 205 tgg gga tat gga ctt ega tac aaa cat ggc etc ttt aaa gca aat cat 672

Trp Gly Tyr Gly Leu Arg Tyr Lys His Gly Leu Phe Lys Ala Asn His 210 215 220 aeg aag gat ggt cag gag gag gta get gaa aat tgg etc gag atg gga 720

Thr Lys Asp Gly Gin Glu Glu Val Ala Glu Asn Trp Leu Glu Met Gly 225 230 235 240 aat eet tgg gag att gta aga acc gat gtc tcc tat eet gtg aag tte 768

Asn Pro Trp Glu Ile Val Arg Thr Asp Val Ser Tyr Pro Val Lys Phe 245 250 255 tat ggt aaa gtg gtt gaa ggc act gat ggg agg atg cac tgg att gga 816

Tyr Gly Lys Val Val Glu Gly Thr Asp Gly Arg Met His Trp Ile Gly 260 265 270 gga gaa aat ate aag gtt gtt get cat gat ate eet att eet ggc tac 864

Gly Glu Asn Ile Lys Val Val Ala His Asp Ile Pro Ile Pro Gly Tyr 275 280 285 aag act aaa act acc aac aat ctt egt ctt tgg tea aca aca gtg cca 912

Lys Thr Lys Thr Thr Asn Asn Leu Arg Leu Trp Ser Thr Thr Val Pro 290 295 300 tea caa gat tte gat ttg gaa get ttt aat get gga gat cat gca agt 960

Ser Gin Asp Phe Asp Leu Glu Ala Phe Asn Ala Gly Asp His Ala Ser 305 310 315 320 gca tat gaa get cat eta aat get gaa aag eet cac tac agg gat att 1008

Ala Tyr Glu Ala His Leu Asn Ala Glu Lys Pro His Tyr Arg Asp Ile 325 330 335 att get egt tte gag agg aga get ggt gat tet etc age tgg gag gac 1056

Ile Ala Arg Phe Glu Arg Arg Ala Gly Asp Ser Leu Ser Trp Glu Asp -73 - DK 177092 B1 340 345 350 ttc ccc tct aaa gtt gca gtg cag atg aat gac act cac cca aca ctg 1104

Phe Pro Ser Lys Val Ala Val Gin Met Asn Asp Thr His Pro Thr Leu 355 360 365 tgc att cct gag ttg atg aga ata ttg att gat gtt aaa ggg tta age 1152

Cys Ile Pro Glu Leu Met Arg Ile Leu Ile Asp Val Lys Gly Leu Ser 370 375 380 tgg aat gag get tgg agt ate aca gaa aga act gtg gca tac aca aac 1200

Trp Asn Glu Ala Trp Ser Ile Thr Glu Arg Thr Val Ala Tyr Thr Asn 385 390 395 400 cac aeg gtg ett cct gaa get ctg gag aag tgg age ttg gac ata atg 1248

His Thr Val Leu Pro Glu Ala Leu Glu Lys Trp Ser Leu Asp Ile Met 405 410 415 cag aaa ett ett cct egg cat gtt gaa atc ata gaa aaa att gat ggg 1296

Gin Lys Leu Leu Pro Arg His Val Glu Ile Ile Glu Lys Ile Asp Gly 420 425 430 gag ctg atg aac atc att atc tea aaa tac gga aca gaa gat act tea 1344

Glu Leu Met Asn ile Ile Ile Ser Lys Tyr Gly Thr Glu Asp Thr Ser 435 440 445 ctg tta aaa aag aag att aaa gaa atg aga atc tta gac aac att gac 1392

Leu Leu Lys Lys Lys Ile Lys Glu Met Arg Ile Leu Asp Asn Ile Asp 450 455 460 eta cca gat tct att gcc aaa eta ttt gtg aaa cca aaa gag aaa aaa 1440

Leu Pro Asp Ser Ile Ala Lys Leu Phe Val Lys Pro Lys Glu Lys Lys 465 470 475 480 gaa tct cct get aaa ttg aaa gag aaa ttg ett gtc aaa tct ctg gag 1488

Glu Ser Pro Ala Lys Leu Lys Glu Lys Leu Leu Val Lys Ser Leu Glu 485 490 495 cct agt gtt gtg gtt gag gag aaa act gtg tee aaa gta gag ata aac 1536

Pro Ser Val Val Val Glu Glu Lys Thr Val Ser Lys Val Glu Ile Asn 500 505 510 gag gac tct gag gag gtg gag gta gac tct gaa gaa gtt gtg gag gca 1584

Glu Asp Ser Glu Glu Val Glu Val Asp Ser Glu Glu Val Val Glu Ala 515 520 525 gaa aac gag gac tct gag gat gag tta gat cca ttt gta aaa tea gat 1632

Glu Asn Glu Asp Ser Glu Asp Glu Leu Asp Pro Phe Val Lys Ser Asp 530 535 540 cct aaa tta cct aga gtt gtc ega atg get aac ett tgt gtt gtt ggt 1680

Pro Lys Leu Pro Arg Val Val Arg Met Ala Asn Leu Cys Val Val Gly 545 550 555 560 ggg cat teg gtt aat ggt gtg get gcg att cac age gag att gtg aaa 1728

Gly His Ser Val Asn Gly Val Ala Ala Ile His Ser Glu Ile Val Lys 565 570 575 gaa gat gta ttc aac age ttt tat gag atg tgg ccc get aaa ttt caa 1776 -74- DK 177092 B1

Glu Asp Val Phe Asn Ser Phe Tyr Glu Met Trp Pro Ala Lys Phe Gin 580 585 590 aat aaa aca aat gga gtg act cct aga cgt tgg att cgg ttt tgt aat 1824

Asn Lys Thr Asn Gly Val Thr Pro Arg Arg Trp Ile Arg Phe Cys Asn 595 600 605 cct gaa tta agt gca ate att tea aaa tgg ata gga tet gat gat tgg 1872

Pro Glu Leu Ser Ala Ile Ile Ser Lys Trp Ile Gly Ser Asp Asp Trp 610 615 620 gtt ttg aac act gat aaa ett get gaa tta aag aag ttt get gat gat 1920

Val Leu Asn Thr Asp Lys Leu Ala Glu Leu Lys Lys Phe Ala Asp Asp 625 630 635 640 gag gat ctg caa tea gaa tgg cgt get get aaa aag get aac aag gtg 1968

Glu Asp Leu Gin Ser Glu Trp Arg Ala Ala Lys Lys Ala Asn Lys Val 645 650 655 aag gtt gtt tet ctc ata aga gaa aaa aca gga tat atc gtc agt cca 2016

Lys Val Val Ser Leu Ile Arg Glu Lys Thr Gly Tyr Ile Val Ser Pro 660 665 670 gat gca atg ttt gac gtt cag gtg aaa agg ate cat gag tat aag ega 2064

Asp Ala Met Phe Asp Val Gin Val Lys Arg Ile His Glu Tyr Lys Arg 675 680 685 cag ctg eta aat atc ett gga att gtc tac cgc tac aag aag atg aaa 2112

Gin Leu Leu Asn Ile Leu Gly Ile Val Tyr Arg Tyr Lys Lys Met Lys 690 695 700 gaa atg agt gca aaa gac aga ata aat age ttt gtt cca agg gta tgc 2160

Glu Met Ser Ala Lys Asp Arg Ile Asn Ser Phe Val Pro Arg Val Cys 705 710 715 720 ata ttt ggt ggg aaa gca ttt gcc act tac gta cag gca aag agg ata 2208

Ile Phe Gly Gly Lys Ala Phe Ala Thr Tyr Val Gin Ala Lys Arg Ile 725 730 735 gtg aag ttt att aca gat gtt gca get act gta aat cat gat cca gaa 2256

Val Lys Phe Ile Thr Asp Val Ala Ala Thr Val Asn His Asp Pro Glu 740 745 750 att gga gat eta ttg aag gtt gta ttt att cca gat tat aat gtt agt 2304

Ile Gly Asp Leu Leu Lys Val Val Phe Ile Pro Asp Tyr Asn Val Ser 755 760 765 gtt get gag gcg eta atc cct gcc agt gaa ttg tet cag cat atc agt 2352

Val Ala Glu Ala Leu Ile Pro Ala Ser Glu Leu Ser Gin His Ile Ser 770 775 780 act get gga atg gaa get agt gga acc age aac atg aag ttt gca atg 2400

Thr Ala Gly Met Glu Ala Ser Gly Thr Ser Asn Met Lys Phe Ala Met 785 790 795 800 aat gga tgt atc ett att gga act ttg gat ggt get aat gtg gaa atc 2448

Asn Gly Cys Ile Leu Ile Gly Thr Leu Asp Gly Ala Asn Val Glu Ile 805 810 815 -75- DK 177092 B1 aga gag gag gtt gga gag gaa aac ttt ttc ctt ttt ggt get gag gea 2496

Arg Glu Glu Val Gly Glu Glu Asn Phe Phe Leu Phe Gly Ala Glu Ala 820 825 830 cat gaa att get ggt tta agg aaa gag aga gcc cag gga aag ttt gtg 2544

His Glu Ile Ala Gly Leu Arg Lys Glu Arg Ala Gin Gly Lys Phe Val 835 840 845 eet gac cca aga ttc gaa gag gtt aag aga ttt gtc ege agt ggg gtc 2592

Pro Asp Pro Arg Phe Glu Glu Val Lys Arg Phe Val Arg Ser Gly Val 850 855 860 ttt gga act tac aac tac gat gac ttg atg ggt tet ctg gaa gga aat 2640

Phe Gly Thr Tyr Asn Tyr Asp Asp Leu Met Gly Ser Leu Glu Gly Asn 865 870 875 880 gaa ggt tat ggg egt gea gac tat ttt ctt gtt ggt aaa gat ttc ccc 2688

Glu Gly Tyr Gly Arg Ala Asp Tyr Phe Leu Val Gly Lys Asp Phe Pro 885 890 895 age tac att gaa tgc cag gag aag gtt gat aaa gea tac cgc gat cag 2736

Ser Tyr Ile Glu Cys Gin Glu Lys Val Asp Lys Ala Tyr Arg Asp Gin 900 905 910 aaa eta tgg aca agg atg tea atc ctc aac aca gcc agt tee tee aag 2784

Lys Leu Trp Thr Arg Met Ser Ile Leu Asn Thr Ala Ser Ser Ser Lys 915 920 925 ttc aac age gac egg aeg att cac gag tac gcc aag gac atc tgg gac 2832

Phe Asn Ser Asp Arg Thr Ile His Glu Tyr Ala Lys Asp Ile Trp Asp 930 935 940 atc aag cct gtc ate ctg ccc tag 2856

Ile Lys Pro Val Ile Leu Pro 945 950 <210> 18 <211> 951

<212> PRT

<213> Oryza sativa <400> 18

Met Ala Thr Ala Ser Ala Pro Leu Gin Leu Ala Thr Ala Ser Arg Pro 15 10 15

Leu Pro Val Gly Val Gly Cys Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Leu His 20 25 30

Val Gly Gly Ala Arg Gly Gly Gly Ala Ala Pro Ala Arg Arg Arg Leu 35 40 45

Ala Val Arg Ser Val Ala Ser Asp Arg Gly Val Gin Gly Ser Val Ser 50 55 60 -76- DK 177092 B1

Pro Glu Glu Glu Ile Ser Ser Val Leu Asn Ser Ile Asp Ser Ser Thr 65 70 75 80

Ile Ala Ser Asn Ile Lys His His Ala Glu Phe Thr Pro Val Phe Ser 85 90 95

Pro Glu His Phe Ser Pro Leu Lys Ala Tyr His Ala Thr Ala Lys Ser 100 105 110

Val Leu Asp Thr Leu Ile Met Asn Trp Asn Ala Thr Tyr Asp Tyr Tyr 115 120 125

Asp Arg Thr Asn Val Lys Gin Ala Tyr Tyr Leu Ser Met Glu Phe Leu 130 135 140

Gin Gly Arg Ala Leu Thr Asn Ala Val Gly Asn Leu Glu Leu Thr Gly 145 150 155 160

Gin Tyr Ala Glu Ala Leu Gin Gin Leu Gly His Ser Leu Glu Asp Val 165 170 175

Ala Thr Gin Glu Pro Asp Ala Ala Leu Gly Asn Gly Gly Leu Gly Arg 180 185 190

Leu Ala Ser Cys Phe Leu Asp Ser Leu Ala Thr Leu Asn Tyr Pro Ala 195 200 205

Trp Gly Tyr Gly Leu Arg Tyr Lys His Gly Leu Phe Lys Ala Asn His 210 215 220

Thr Lys Asp Gly Gin Glu Glu Val Ala Glu Asn Trp Leu Glu Met Gly 225 230 235 240

Asn Pro Trp Glu Ile Val Arg Thr Asp Val Ser Tyr Pro Val Lys Phe 245 250 255

Tyr Gly Lys Val Val Glu Gly Thr Asp Gly Arg Met His Trp Ile Gly 260 265 270

Gly Glu Asn Ile Lys Val Val Ala His Asp Ile Pro Ile Pro Gly Tyr 275 280 285

Lys Thr Lys Thr Thr Asn Asn Leu Arg Leu Trp Ser Thr Thr Val Pro 290 295 300 -77- DK 177092 B1

Ser Gin Asp Phe Asp Leu Glu Ala Phe Asn Ala Gly Asp His Ala Ser 305 310 315 320

Ala Tyr Glu Ala His Leu Asn Ala Glu Lys Pro His Tyr Arg Asp Ile 325 330 335

Ile Ala Arg Phe Glu Arg Arg Ala Gly Asp Ser Leu Ser Trp Glu Asp 340 345 350

Phe Pro Ser Lys Val Ala Val Gin Met Asn Asp Thr His Pro Thr Leu 355 360 365

Cys Ile Pro Glu Leu Met Arg Ile Leu Ile Asp Val Lys Gly Leu Ser 370 375 380

Trp Asn Glu Ala Trp Ser Ile Thr Glu Arg Thr Val Ala Tyr Thr Asn 385 390 395 400

His Thr Val Leu Pro Glu Ala Leu Glu Lys Trp Ser Leu Asp Ile Met 405 410 415

Gin Lys Leu Leu Pro Arg His Val Glu Ile Ile Glu Lys Ile Asp Gly 420 425 430

Glu Leu Met Asn Ile Ile Ile Ser Lys Tyr Gly Thr Glu Asp Thr Ser 435 440 445

Leu Leu Lys Lys Lys Ile Lys Glu Met Arg Ile Leu Asp Asn Ile Asp 450 455 460

Leu Pro Asp Ser Ile Ala Lys Leu Phe Val Lys Pro Lys Glu Lys Lys 465 470 475 480

Glu Ser Pro Ala Lys Leu Lys Glu Lys Leu Leu Val Lys Ser Leu Glu 485 490 495

Pro Ser Val Val Val Glu Glu Lys Thr Val Ser Lys Val Glu Ile Asn 500 505 510

Glu Asp Ser Glu Glu Val Glu Val Asp Ser Glu Glu Val Val Glu Ala 515 520 525

Glu Asn Glu Asp Ser Glu Asp Glu Leu Asp Pro Phe Val Lys Ser Asp -78- DK 177092 B1 530 535 540

Pro Lys Leu Pro Arg Val Val Arg Met Ala Asn Leu Cys Val Val Gly 545 550 555 560

Gly His Ser Val Asn Gly Val Ala Ala Ile His Ser Glu Ile Val Lys 565 570 · 575

Glu Asp Val Phe Asn Ser Phe Tyr Glu Met Trp Pro Ala Lys Phe Gin 580 585 590

Asn Lys Thr Asn Gly Val Thr Pro Arg Arg Trp Ile Arg Phe Cys Asn 595 600 605

Pro Glu Leu Ser Ala Ile Ile Ser Lys Trp Ile Gly Ser Asp Asp Trp 610 615 620

Val Leu Asn Thr Asp Lys Leu Ala Glu Leu Lys Lys Phe Ala Asp Asp 625 630 635 640

Glu Asp Leu Gin Ser Glu Trp Arg Ala Ala Lys Lys Ala Asn Lys Val 645 650 655

Lys Val Val Ser Leu Ile Arg Glu Lys Thr Gly Tyr Ile Val Ser Pro 660 665 670

Asp Ala Met Phe Asp Val Gin Val Lys Arg Ile His Glu Tyr Lys Arg 675 680 685

Gin Leu Leu Asn Ile Leu Gly Ile Val Tyr Arg Tyr Lys Lys Met Lys 690 695 700

Glu Met Ser Ala Lys Asp Arg Ile Asn Ser Phe Val Pro Arg Val Cys 705 710 715 720

Ile Phe Gly Gly Lys Ala Phe Ala Thr Tyr Val Gin Ala Lys Arg Ile 725 730 735

Val Lys Phe Ile Thr Asp Val Ala Ala Thr Val Asn His Asp Pro Glu 740 745 750

Ile Gly Asp Leu Leu Lys Val Val Phe Ile Pro Asp Tyr Asn Val Ser 755 760 765 -79- DK 177092 B1

Val Ala Glu Ala Leu Ile Pro Ala Ser Glu Leu Ser Gin His Ile Ser 770 775 780

Thr Ala Gly Met Glu Ala Ser Gly Thr Ser Asn Met Lys Phe Ala Met 785 790 795 800

Asn Gly Cys Ile Leu Ile Gly Thr Leu Asp Gly Ala Asn Val Glu Ile 805 810 815

Arg Glu Glu Val Gly Glu Glu Asn Phe Phe Leu Phe Gly Ala Glu Ala 820 825 830

His Glu Ile Ala Gly Leu Arg Lys Glu Arg Ala Gin Gly Lys Phe Val 835 840 845

Pro Asp Pro Arg Phe Glu Glu Val Lys Arg Phe Val Arg Ser Gly Val 850 855 860

Phe Gly Thr Tyr Asn Tyr Asp Asp Leu Met Gly Ser Leu Glu Gly Asn 865 870 875 880

Glu Gly Tyr Gly Arg Ala Asp Tyr Phe Leu Val Gly Lys Asp Phe Pro 885 890 895

Ser Tyr Ile Glu Cys Gin Glu Lys Val Asp Lys Ala Tyr Arg Asp Gin 900 905 910

Lys Leu Trp Thr Arg Met Ser Ile Leu Asn Thr Ala Ser Ser Ser Lys 915 920 925

Phe Asn Ser Asp Arg Thr Ile His Glu Tyr Ala Lys Asp Ile Trp Asp 930 935 940

Ile Lys Pro Val Ile Leu Pro 945 950 <210> 19 <211> 2856

<212> DNA

<213> Triticum aestivum <220>

<221> CDS

<222> (58)--(2556) <400> 19 -80- DK 177092 B1 cgccacctcc cccgcacaca ccgagtgctc gtgctcgacg caattcccca ccccgcg 57 atg agt gcg gcg gac aag gtg aag ccg gcg gcc age ccc gcg teg gag 105

Met Ser Ala Ala Asp Lys Val Lys Pro Ala Ala Ser Pro Ala Ser Glu 15 10 15 gac ccc tee gee ate gee ggc aac ate tee tac cac gcg cag tac age 153

Asp Pro Ser Ala Ile Ala Gly Asn Ile Ser Tyr His Ala Gin Tyr Ser 20 25 30 ccc cac tte teg ccg etc gcc tte ggc ccc gag cag gcc tte tac gcc 201

Pro His Phe Ser Pro Leu Ala Phe Gly Pro Glu Gin Ala Phe Tyr Ala 35 40 45 acc gcc gag age gtc ege gac cac etc etc cag aga tgg aac gac acc 249

Thr Ala Glu Ser Val Arg Asp His Leu Leu Gin Arg Trp Asn Asp Thr 50 55 60 tac ctg cat tte cac aag aeg gat ccc aag cag acc tac tac etc tee 297

Tyr Leu His Phe His Lys Thr Asp Pro Lys Gin Thr Tyr Tyr Leu Ser 65 70 75 80 atg gag tac ctg cag ggc ege gcg etc acc aac gee gtc ggc aac etc 345

Met Glu Tyr Leu Gin Gly Arg Ala Leu Thr Asn Ala Val Gly Asn Leu 85 90 95 gee ate acc ggc gee tac get gac gcc ctg aag aag tte ggc tac gag 393

Ala Ile Thr Gly Ala Tyr Ala Asp Ala Leu Lys Lys Phe Gly Tyr Glu 100 105 110 etc gag gee ate get gga cag gag aga gat gcg get ctg gga aat ggt 441

Leu Glu Ala Ile Ala Gly Gin Glu Arg Asp Ala Ala Leu Gly Asn Gly 115 120 125 ggc ttg ggc agg ett gea tet tgc ttt ttg gat tea atg gea aeg ctg 489

Gly Leu Gly Arg Leu Ala Ser Cys Phe Leu Asp Ser Met Ala Thr Leu 130 135 140 aac ttg eet tet tgg ggc tat ggc ett egt tac egt tat ggc ctg tte 537

Asn Leu Pro Ser Trp Gly Tyr Gly Leu Arg Tyr Arg Tyr Gly Leu Phe 145 150 155 160 aag cag ege att gee aag gaa gga caa gaa gaa ate get gaa gat tgg 585

Lys Gin Arg Ile Ala Lys Glu Gly Gin Glu Glu Ile Ala Glu Asp Trp 165 170 175 ett gat aag ttt age cca tgg gag att gtc agg cat gat gtt gta tac 633

Leu Asp Lys Phe Ser Pro Trp Glu Ile Val Arg His Asp Val Val Tyr 180 185 190 cca atc aga ttt tte ggc cat gtc gag att teg cca gat gga aag egg 681

Pro Ile Arg Phe Phe Gly His Val Glu Ile Ser Pro Asp Gly Lys Arg 195 200 205 aaa tgg gee ggt gga gaa gtt ctg aac get tta gcc tat gat gtg cca 729

Lys Trp Ala Gly Gly Glu Val Leu Asn Ala Leu Ala Tyr Asp Val Pro 210 215 220 att eet ggg tac aag aca aaa aat gea atc agt ett ege ett tgg gat 777 -81 - DK 177092 B1

Ile Pro Gly Tyr Lys Thr Lys Asn Ala Ile Ser Leu Arg Leu Trp Asp 225 230 235 240 gca aca get act get gag gat ttc aac tta ttt cag ttc aat gat ggc 825

Ala Thr Ala Thr Ala Glu Asp Phe Asn Leu Phe Gin Phe Asn Asp Gly 245 250 255 cag tat gag tea get get caa ett cac teg agg gca cag cag ata tgt 873

Gin Tyr Glu Ser Ala Ala Gin Leu His Ser Arg Ala Gin Gin lie Cys 260 265 270 get gtt etc tat ccc ggt gat get aca gaa gaa ggg aag ett ctg aga 921

Ala Val Leu Tyr Pro Gly Asp Ala Thr Glu Glu Gly Lys Leu Leu Arg 275 280 285 tta aag cag cag tat ttc ett tgc age gca tea ett cag gat att att 969

Leu Lys Gin Gin Tyr Phe Leu Cys Ser Ala Ser Leu Gin Asp lie lie 290 295 300 ttc aga ttt aaa gaa aga aaa get gac aga gtt tea ggg aag tgg agt 1017

Phe Arg Phe Lys Glu Arg Lys Ala Asp Arg Val Ser Gly Lys Trp Ser 305 310 315 320 gag ttc cct tee aaa gtt get gtt caa atg aat gac act cat cca act 1065

Glu Phe Pro Ser Lys Val Ala Val Gin Met Asn Asp Thr His Pro Thr 325 330 335 ett gcc att cct gag eta atg agg ttg ett atg gac gtg gag gga ett 1113

Leu Ala lie Pro Glu Leu Met Arg Leu Leu Met Asp Val Glu Gly Leu 340 345 350 ggt tgg gac gaa gcc tgg get gtc aca aat aag aeg gtt get tac acc 1161

Gly Trp Asp Glu Ala Trp Ala Val Thr Asn Lys Thr Val Ala Tyr Thr 355 360 365 aat cac aeg gtt ett cct gaa get ett gag aaa tgg tea cag get gta 1209

Asn His Thr Val Leu Pro Glu Ala Leu Glu Lys Trp Ser Gin Ala Val 370 375 380 atg aag aaa ttg ett cca cgt cac atg gaa ate att gag gaa att gac 1257

Met Lys Lys Leu Leu Pro Arg His Met Glu lie lie Glu Glu lie Asp 385 390 395 400 aag egg ttt aga gaa atg gta ate tee acc egg aag gat atg gag gga 1305

Lys Arg Phe Arg Glu Met Val lie Ser Thr Arg Lys Asp Met Glu Gly 405 410 415 aag ate gaa teg atg agg gtt tta gat aac aat ccc gag aag cca gta 1353

Lys lie Glu Ser Met Arg Val Leu Asp Asn Asn Pro Glu Lys Pro Val 420 425 430 gtg egg atg geg aat ttg tgt gtt gtg get ggg cat aeg gtg aat gga 1401

Val Arg Met Ala Asn Leu Cys Val Val Ala Gly His Thr Val Asn Gly 435 440 445 gtg gcc gag ttg cac age aac ate ttg aaa caa gag ctg ttt gca gat 1449

Val Ala Glu Leu His Ser Asn lie Leu Lys Gin Glu Leu Phe Ala Asp 450 455 460 -82- DK 177092 B1 tat gtc tct att tgg cct aac aaa ttc cag aac aaa act aat gga att 1497

Tyr Val Ser Ile Trp Pro Asn Lys Phe Gin Asn Lys Thr Asn Gly Ile 465 470 475 480 aca cca cgt aga tgg ctc cgt ttt tgc aac cct gag ttg agt gaa ata 1545

Thr Pro Arg Arg Trp Leu Arg Phe Cys Asn Pro Glu Leu Ser Glu Ile 485 490 495 gtc act aaa tgg eta aaa aca gat cag tgg aca age aac ett gat ett 1593

Val Thr Lys Trp Leu Lys Thr Asp Gin Trp Thr Ser Asn Leu Asp Leu 500 505 510 etc acc ggg ett egg aaa ttc gea gat gat gaa aaa eta cat get gag 1641

Leu Thr Gly Leu Arg Lys Phe Ala Asp Asp Glu Lys Leu His Ala Glu 515 520 525 tgg gea gea gee aag ctg gcc age aaa aag ege eta gee aag cat gta 1689

Trp Ala Ala Ala Lys Leu Ala Ser Lys Lys Arg Leu Ala Lys His Val 530 535 540 ttg gat gtg act ggt gtt aca att gac cca gat age ett ttt gat ata 1737

Leu Asp Val Thr Gly Val Thr Ile Asp Pro Asp Ser Leu Phe Asp Ile 545 550 555 560 caa att aaa ege atc cac gaa tac aag aga cag ctg atg aac att ttg 1785

Gin Ile Lys Arg Ile His Glu Tyr Lys Arg Gin Leu Met Asn Ile Leu 565 570 575 gga get gtg tac aga tac aag aag tta aag gaa atg age gea gea gac 1833

Gly Ala Val Tyr Arg Tyr Lys Lys Leu Lys Glu Met Ser Ala Ala Asp 580 585 590 agg cag aag gtt aca ccg ege act gtc atg gta gga ggg aaa gea ttt 1881

Arg Gin Lys Val Thr Pro Arg Thr Val Met Val Gly Gly Lys Ala Phe 595 600 605 gea aca tac acc aac gcc aaa aga ata gtg aaa ttg gta aat gat gtt 1929

Ala Thr Tyr Thr Asn Ala Lys Arg Ile Val Lys Leu Val Asn Asp Val 610 615 620 ggt get gtg gtg aac aac gat get gac gtc aac aaa tat ctg aag gtg 1977

Gly Ala Val Val Asn Asn Asp Ala Asp Val Asn Lys Tyr Leu Lys Val 625 630 635 640 gtg ttc att cca aac tac aat gta tea gtg get gaa gtg etc att cct 2025

Val Phe Ile Pro Asn Tyr Asn Val Ser Val Ala Glu Val Leu Ile Pro 645 650 655 ggc agt gaa ctg tea cag cac atc agt act gea ggc atg gaa gea agt 2073

Gly Ser Glu Leu Ser Gin His Ile Ser Thr Ala Gly Met Glu Ala Ser 660 665 670 gga aca agt aac atg aag ttc tct ctg aat ggc tgt gtt atc att gga 2121

Gly Thr Ser Asn Met Lys Phe Ser Leu Asn Gly Cys Val Ile Ile Gly 675 680 685 act etc gat gga gcc aat gtt gaa atc aga gaa gaa gtg gga caa gac 2169

Thr Leu Asp Gly Ala Asn Val Glu Ile Arg Glu Glu Val Gly Gin Asp 690 695 700 -83 - DK 177092 B1 aac ttc ttc ctt ttc ggt gcc aaa gca gat cag gtt get ggt ctg agg 2217

Asn Phe Phe Leu Phe Gly Ala Lys Ala Asp Gin Val Ala Gly Leu Arg 705 710 715 720 aag gat aga gaa aat ggc ttg ttc aag cca gac cca cgc ttc gaa gaa 2265

Lys Asp Arg Glu Asn Gly Leu Phe Lys Pro Asp Pro Arg Phe Glu Glu 725 730 735 gcc aag cag ttt atc agg agt ggt get ttc ggc acc tac gac tac act 2313

Ala Lys Gin Phe Ile Arg Ser Gly Ala Phe Gly Thr Tyr Asp Tyr Thr 740 745 750 cct etc ttg gat tee ctt gaa ggg aac act gga ttt ggg egt ggt gac 2361

Pro Leu Leu Asp Ser Leu Glu Gly Asn Thr Gly Phe Gly Arg Gly Asp 755 760 765 tac ttc ctt gtt ggc tat gac ttt cca age tac att gat gca cag gcc 2409

Tyr Phe Leu Val Gly Tyr Asp Phe Pro Ser Tyr Ile Asp Ala Gin Ala 770 775 780 egg gtt gat gaa gcc tac aag gac aag aag aaa tgg gtc aag atg tee 2457

Arg Val Asp Glu Ala Tyr Lys Asp Lys Lys Lys Trp Val Lys Met Ser 785 790 795 800 atc ttg aac aeg get gga age ggc aag ttc age age gac cgc acc atc 2505

Ile Leu Asn Thr Ala Gly Ser Gly Lys Phe Ser Ser Asp Arg Thr Ile 805 810 815 gac caa tat geg aag gag atc tgg ggc att teg get tgc cct gtt cca 2553

Asp Gin Tyr Ala Lys Glu Ile Trp Gly Ile Ser Ala Cys Pro Val Pro 820 825 830 tga agaggagaeg tgatcaagag gtgatggatg atgatgcgtg gcagtaataa 2606 ggaccttata ctggtccatg gtgaataacc cctgcttccg ttgtagctga gaagaatgaa 2666 geaaegtaeg aagcctgttg tgttgtgtat tctgctgcac ttttgaagtg catagaggat 2726 gegaetttte ttttgttctt tttctttttt ggtctgtaac catactattt tgatcctgaa 2786 ccggaatggc ggaatcatcc aggttctcaa taaaatagtt caagttttga ttaaaaaaaa 2846 aaaaaaaaaa 2856 <210> 20 <211> 832

<212> PRT

<213> Tritieum aestivum <400> 20

Met Ser Ala Ala Asp Lys Val Lys Pro Ala Ala Ser Pro Ala Ser Glu 15 10 15

Asp Pro Ser Ala Ile Ala Gly Asn Ile Ser Tyr His Ala Gin Tyr Ser 20 25 30 -84- DK 177092 B1

Pro His Phe Ser Pro Leu Ala Phe Gly Pro Glu Gin Ala Phe Tyr Ala 35 40 45

Thr Ala Glu Ser Val Arg Asp His Leu Leu Gin Arg Trp Asn Asp Thr 50 55 60

Tyr Leu His Phe His Lys Thr Asp Pro Lys Gin Thr Tyr Tyr Leu Ser 65 70 75 80

Met Glu Tyr Leu Gin Gly Arg Ala Leu Thr Asn Ala Val Gly Asn Leu 85 90 95

Ala Ile Thr Gly Ala Tyr Ala Asp Ala Leu Lys Lys Phe Gly Tyr Glu 100 105 110

Leu Glu Ala Ile Ala Gly Gin Glu Arg Asp Ala Ala Leu Gly Asn Gly 115 120 125

Gly Leu Gly Arg Leu Ala Ser Cys Phe Leu Asp Ser Met Ala Thr Leu 130 135 140

Asn Leu Pro Ser Trp Gly Tyr Gly Leu Arg Tyr Arg Tyr Gly Leu Phe 145 150 155 160

Lys Gin Arg Ile Ala Lys Glu Gly Gin Glu Glu Ile Ala Glu Asp Trp 165 170 175

Leu Asp Lys Phe Ser Pro Trp Glu Ile Val Arg His Asp Val Val Tyr 180 185 190

Pro Ile Arg Phe Phe Gly His Val Glu Ile Ser Pro Asp Gly Lys Arg 195 200 205

Lys Trp Ala Gly Gly Glu Val Leu Asn Ala Leu Ala Tyr Asp Val Pro 210 215 220

Ile Pro Gly Tyr Lys Thr Lys Asn Ala Ile Ser Leu Arg Leu Trp Asp 225 230 235 240

Ala Thr Ala Thr Ala Glu Asp Phe Asn Leu Phe Gin Phe Asn Asp Gly 245 250 255

Gin Tyr Glu Ser Ala Ala Gin Leu His Ser Arg Ala Gin Gin Ile Cys -85- DK 177092 B1 260 265 270

Ala Val Leu Tyr Pro Gly Asp Ala Thr Glu Glu Gly Lys Leu Leu Arg 275 280 285

Leu Lys Gin Gin Tyr Phe Leu Cys Ser Ala Ser Leu Gin Asp Ile Ile 290 295 300

Phe Arg Phe Lys Glu Arg Lys Ala Asp Arg Val Ser Gly Lys Trp Ser 305 310 315 320

Glu Phe Pro Ser Lys Val Ala Val Gin Met Asn Asp Thr His Pro Thr 325 330 335

Leu Ala Ile Pro Glu Leu Met Arg Leu Leu Met Asp Val Glu Gly Leu 340 345 350

Gly Trp Asp Glu Ala Trp Ala Val Thr Asn Lys Thr Val Ala Tyr Thr 355 360 365

Asn His Thr Val Leu Pro Glu Ala Leu Glu Lys Trp Ser Gin Ala Val 370 375 380

Met Lys Lys Leu Leu Pro Arg His Met Glu Ile Ile Glu Glu Ile Asp 385 390 395 400

Lys Arg Phe Arg Glu Met Val Ile Ser Thr Arg Lys Asp Met Glu Gly 405 410 415

Lys Ile Glu Ser Met Arg Val Leu Asp Asn Asn Pro Glu Lys Pro Val 420 425 430

Val Arg Met Ala Asn Leu Cys Val Val Ala Gly His Thr Val Asn Gly 435 440 445

Val Ala Glu Leu His Ser Asn Ile Leu Lys Gin Glu Leu Phe Ala Asp 450 455 460

Tyr Val Ser Ile Trp Pro Asn Lys Phe Gin Asn Lys Thr Asn Gly Ile 465 470 475 480

Thr Pro Arg Arg Trp Leu Arg Phe Cys Asn Pro Glu Leu Ser Glu Ile 485 490 495 -86- DK 177092 B1

Val Thr Lys Trp Leu Lys Thr Asp Gin Trp Thr Ser Asn Leu Asp Leu 500 505 510

Leu Thr Gly Leu Arg Lys Phe Ala Asp Asp Glu Lys Leu His Ala Glu 515 520 525

Trp Ala Ala Ala Lys Leu Ala Ser Lys Lys Arg Leu Ala Lys His Val 530 535 540

Leu Asp Val Thr Gly Val Thr Ile Asp Pro Asp Ser Leu Phe Asp Ile 545 550 555 560

Gin Ile Lys Arg Ile His Glu Tyr Lys Arg Gin Leu Met Asn Ile Leu 565 570 575

Gly Ala Val Tyr Arg Tyr Lys Lys Leu Lys Glu Met Ser Ala Ala Asp 580 585 590

Arg Gin Lys Val Thr Pro Arg Thr Val Met Val Gly Gly Lys Ala Phe 595 600 605

Ala Thr Tyr Thr Asn Ala Lys Arg Ile Val Lys Leu Val Asn Asp Val 610 615 620

Gly Ala Val Val Asn Asn Asp Ala Asp Val Asn Lys Tyr Leu Lys Val 625 630 635 640

Val Phe Ile Pro Asn Tyr Asn Val Ser Val Ala Glu Val Leu Ile Pro 645 650 655

Gly Ser Glu Leu Ser Gin His Ile Ser Thr Ala Gly Met Glu Ala Ser 660 665 670

Gly Thr Ser Asn Met Lys Phe Ser Leu Asn Gly Cys Val Ile Ile Gly 675 680 685

Thr Leu Asp Gly Ala Asn Val Glu Ile Arg Glu Glu Val Gly Gin Asp 690 695 700

Asn Phe Phe Leu Phe Gly Ala Lys Ala Asp Gin Val Ala Gly Leu Arg 705 710 715 720

Lys Asp Arg Glu Asn Gly Leu Phe Lys Pro Asp Pro Arg Phe Glu Glu 725 730 735 -87- DK 177092 B1

Ala Lys Gin Phe Ile Arg Ser Gly Ala Phe Gly Thr Tyr Asp Tyr Thr 740 745 750

Pro Leu Leu Asp Ser Leu Glu Gly Asn Thr Gly Phe Gly Arg Gly Asp 755 760 765

Tyr Phe Leu Val Gly Tyr Asp Phe Pro Ser Tyr Ile Asp Ala Gin Ala 770 775 780

Arg Val Asp Glu Ala Tyr Lys Asp Lys Lys Lys Trp Val Lys Met Ser 785 790 795 800

Ile Leu Asn Thr Ala Gly Ser Gly Lys Phe Ser Ser Asp Arg Thr Ile 805 810 815

Asp Gin Tyr Ala Lys Glu Ile Trp Gly Ile Ser Ala Cys Pro Val Pro 820 825 830 <210> 21 <211> 2884

<212> DNA

<213> Citrus hybrid kultivar <220>

<221> CDS

<222> (48)..(2570) <400> 21 cggcacgagc tgaaacaagc aagtaattcg gtaatttgtg gaatcaa atg gcg gat 56

Met Ala Asp gcg aaa gca aac gga aag aat gag gcg gcc aaa ctg gcg aaa att ccg 104

Ala Lys Ala Asn Gly Lys Asn Glu Ala Ala Lys Leu Ala Lys Ile Pro 5 10 15 gcg get gcg aat cca ttg get aat gaa cca teg gcg att gca tea aat 152

Ala Ala Ala Asn Pro Leu Ala Asn Glu Pro Ser Ala Ile Ala Ser Asn 20 25 30 35 ata agt tac cac gtg cag tac agt cct cat ttc teg ccg act aag ttc 200

Ile Ser Tyr His Val Gin Tyr Ser Pro His Phe Ser Pro Thr Lys Phe 40 45 50 gag ccg gag caa get ttc ttt gcc aeg gcg gag gtt gtc cgc gat egt 248

Glu Pro Glu Gin Ala Phe phe Ala Thr Ala Glu Val Val Arg Asp Arg 55 60 65 ett att caa caa tgg aat gag aca tac cac cat ttt aat aaa gtt gat 296

Leu Ile Gin Gin Trp Asn Glu Thr Tyr His His Phe Asn Lys Val Asp 70 75 80 -88- DK 177092 B1 ccg aag caa aca tac tac eta tea atg gaa ttt ett caa gga agg act 344

Pro Lys Gin Thr Tyr Tyr Leu Ser Met Glu Phe Leu Gin Gly Arg Thr 85 90 95 ttg act aat gea att ggc agt ttg gac att cag aat gea tat get gat 392

Leu Thr Asn Ala Ile Gly Ser Leu Asp Ile Gin Asn Ala Tyr Ala Asp 100 105 110 115 get tta aat aat ttg ggg cat gtc ett gag gag ata get gaa cag gaa 440

Ala Leu Asn Asn Leu Gly His Val Leu Glu Glu Ile Ala Glu Gin Glu 120 125 130 aaa gat get gea eta gga aat ggt ggg ctg ggc agg eta get tea tgc 488

Lys Asp Ala Ala Leu Gly Asn Gly Gly Leu Gly Arg Leu Ala Ser Cys 135 140 145 tte tta gac tee atg gea aca ttg aat ttg eet gea tgg ggt tat ggt 536

Phe Leu Asp Ser Met Ala Thr Leu Asn Leu Pro Ala Trp Gly Tyr Gly 150 155 160 ttg aga tac egg tat ggg ctg tte aag cag aag atc acc aag cag ggt 584

Leu Arg Tyr Arg Tyr Gly Leu Phe Lys Gin Lys Ile Thr Lys Gin Gly 165 170 175 caa gaa gaa gtt get gaa gat tgg ett gag aaa ttt agt eet tgg gaa 632

Gin Glu Glu Val Ala Glu Asp Trp Leu Glu Lys Phe Ser Pro Trp Glu 180 185 190 195 gtt gtc.agg cat gat gtg gta ttt ccg gtc aga ttt ttt ggg agt gtt 680

Val Val Arg His Asp Val Val Phe Pro Val Arg Phe Phe Gly Ser Val 200 205 210 atg gtt aat cca aat gga aeg aga aaa tgg gtt ggg ggt gaa gtt gtc 728

Met Val Asn Pro Asn Gly Thr Arg Lys Trp Val Gly Gly Glu Val Val 215 220 225 caa gee gta get tat gat ata cca att cca ggg tac aaa acc aag aac 776

Gin Ala Val Ala Tyr Asp Ile Pro Ile Pro Gly Tyr Lys Thr Lys Asn 230 235 240 act atc agt ett egt etc tgg gac get aaa get age get gag gat tte 824

Thr Ile Ser Leu Arg Leu Trp Asp Ala Lys Ala Ser Ala Glu Asp Phe 245 250 255 aat tta ttt cag ttt aat gat gga caa tac gaa tet get gea cag ett 872

Asn Leu Phe Gin Phe Asn Asp Gly Gin Tyr Glu Ser Ala Ala Gin Leu 260 265 270 275 cat tet ega get caa cag att tgt get gtg etc tac ccc ggg gat tet 920

His Ser Arg Ala Gin Gin Ile Cys Ala Val Leu Tyr Pro Gly Asp Ser 280 285 290 act gaa gaa ggg aag ett tta agg ctg aaa caa caa tte ttt etc tgc 968

Thr Glu Glu Gly Lys Leu Leu Arg Leu Lys Gin Gin Phe Phe Leu Cys 295 300 305 agt get tea ett cag gat atg att ett aga tte aag gag agg aaa agt 1016

Ser Ala Ser Leu Gin Asp Met Ile Leu Arg Phe Lys Glu Arg Lys Ser -89- DK 177092 B1 310 315 320 gga agg cag tgg tct gaa ttt ccc age aag gta get gta caa ctg aat 1064

Gly Arg Gin Trp Ser Glu Phe Pro Ser Lys Val Ala Val Gin Leu Asn 325 330 335 gat act cat cca aca ett gea att cca gag ttg atg ega ttg eta atg 1112

Asp Thr His Pro Thr Leu Ala Ile Pro Glu Leu Met Arg Leu Leu Met 340 345 350 355 gat gag gaa gga ett gga tgg gat gaa gea tgg gat ata aca aca agg 1160

Asp Glu Glu Gly Leu Gly Trp Asp Glu Ala Trp Asp Ile Thr Thr Arg 360 365 370 act gtt get tat acc aat cac aca gta ett eet gaa gea ett gag aag 1208

Thr Val Ala Tyr Thr Asn His Thr Val Leu Pro Glu Ala Leu Glu Lys 375 380 385 tgg tea caa gea gta atg tgg aag ett ett eet ege cat atg gaa ata 1256

Trp Ser Gin Ala Val Met Trp Lys Leu Leu Pro Arg His Met Glu Ile 390 395 400 att gaa gag att gac aag aga tte att gea atg gtc ege tee aca agg 1304

Ile Glu Glu Ile Asp Lys Arg Phe Ile Ala Met Val Arg Ser Thr Arg 405 410 415 agt gac ett gag agt aag att ccc age atg tgc atc ttg gat aat aat 1352

Ser Asp Leu Glu Ser Lys Ile Pro Ser Met Cys Ile Leu Asp Asn Asn 420 425 430 435 ccc aaa aag ccg gtt gtt agg atg gea aac tta tgt gta gta tct gcg 1400

Pro Lys Lys Pro Val Val Arg Met Ala Asn Leu Cys Val Val Ser Ala 440 445 450 cat aeg gta aat ggt gtt get cag ttg cac agt gat ate tta aag gcc 1448

His Thr Val Asn Gly Val Ala Gin Leu His Ser Asp Ile Leu Lys Ala 455 460 465 gac ttg tte get gac tat gtt tct eta tgg cca aac aaa etc caa aat 1496

Asp Leu Phe Ala Asp Tyr Val Ser Leu Trp Pro Asn Lys Leu Gin Asn 470 475 480 aaa act aat ggc att act eet egt ega tgg etc egg ttt tgc aat eet 1544

Lys Thr Asn Gly Ile Thr Pro Arg Arg Trp Leu Arg Phe Cys Asn Pro 485 490 495 gag etc age aaa att atc aca aaa tgg tta aaa acc gat cag tgg gtt 1592

Glu Leu Ser Lys Ile Ile Thr Lys Trp Leu Lys Thr Asp Gin Trp Val 500 505 510 515 aeg aac ett gac ctg ett gta ggt ett egt cag ttt get gac aac aca 1640

Thr Asn Leu Asp Leu Leu Val Gly Leu Arg Gin Phe Ala Asp Asn Thr 520 525 530 gaa etc caa get gaa tgg gaa tct get aag atg gcc agt aag aaa cat 1688

Glu Leu Gin Ala Glu Trp Glu Ser Ala Lys Met Ala Ser Lys Lys His 535 540 545 ttg gea gac tac ata tgg ega gta acc ggt gta aeg att gat eet aat 1736 -90- DK 177092 B1

Leu Ala Asp Tyr Ile Trp Arg Val Thr Gly Val Thr Ile Asp Pro Asn 550 555 560 age tta ttt gac ata caa gtc aag ege att cat gaa tac aag aga caa 1784

Ser Len phe Asp Ile Gin Val Lys Arg Ile His Glu Tyr Lys Arg Gin 565 570 575 ctg eta aat att ttg ggc gea atc tac aga tac aag aag ttg aag gag 1832

Leu Leu Asn Ile Leu Gly Ala Ile Tyr Arg Tyr Lys Lys Leu Lys Glu 580 585 590 595 atg age eet cag gag egg aag aaa act act cca cgc acc att atg ttt 1880

Met Ser Pro Gin Glu Arg Lys Lys Thr Thr Pro Arg Thr Ile Met Phe 600 605 610 gga ggg aaa gea ttt gea aca tat aca aac gea aaa aga ata gta aag 1928

Gly Gly Lys Ala Phe Ala Thr Tyr Thr Asn Ala Lys Arg Ile Val Lys 615 620 625 ttg gtt aat gat gtt ggt gaa gtc gtc aac acc gat cct gag gtc aat 1976

Leu Val Asn Asp Val Gly Glu Val Val Asn Thr Asp Pro Glu Val Asn 630 635 640 agt tat ttg aag gtg gta ttt gtt cca aat tac aat gtc tet gtt gcg 2024

Ser Tyr Leu Lys Val Val Phe Val Pro Asn Tyr Asn Val Ser Val Ala 645 650 655 gag ttg ett att cca gga agt gag eta tet cag cat att age aca gea 2072

Glu Leu Leu Ile Pro Gly Ser Glu Leu Ser Gin His Ile Ser Thr Ala 660 665 670 675 ggc atg gag gea agt ggc aca age aac atg aaa ttt tet eta aat ggt 2120

Gly Met Glu Ala Ser Gly Thr Ser Asn Met Lys Phe Ser Leu Asn Gly 680 685 690 tgc etc att ata gga aca ttg gat gga get aat gtg gaa atc agg cag 2168

Cys Leu Ile Ile Gly Thr Leu Asp Gly Ala Asn Val Glu Ile Arg Gin 695 700 705 gag ata gga gag gag aat fcte ttt ctc ttt ggt gea gga gea gac caa 2216

Glu Ile Gly Glu Glu Asn Phe Phe Leu Phe Gly Ala Gly Ala Asp Gin 710 715 720 gtc cct aag ctg egg aag gaa aga gaa gat gga ttg ttc aaa cca gat 2264

Val Pro Lys Leu Arg Lys Glu Arg Glu Asp Gly Leu Phe Lys Pro Asp 725 730 735 cct egg ttt gaa gag gcc aag caa ttt ata aga agt gga gea ttt gga 2312

Pro Arg phe Glu Glu Ala Lys Gin Phe Ile Arg Ser Gly Ala Phe Gly 740 745 750 755 age tat gac tac aac ccg ett ett gat tee ctg gag ggg aac act ggt 2360

Ser Tyr Asp Tyr Asn Pro Leu Leu Asp Ser Leu Glu Gly Asn Thr Gly 760 765 770 tat ggt egt ggt gat tat ttt eta gtt ggt tat gac ttc cca agt tac 2408

Tyr Gly Arg Gly Asp Tyr Phe Leu Val Gly Tyr Asp Phe Pro Ser Tyr 775 780 785 -91 - DK 177092 B1 tta gag get cag gac aga gtt gac caa get tac aag gac egg aag aag 2456

Leu Glu Ala Gin Asp Arg Val Asp Gin Ala Tyr Lys Asp Arg Lys Lys 790 795 800 tgg ctg aag atg tet ata tta agt aca get ggc agt ggg aaa tte age 2504

Trp Leu Lys Met Ser Ile Leu Ser Thr Ala Gly Ser Gly Lys Phe Ser 805 810 815 agt gat ege aca att gea cag tat get aag gaa atc tgg aac ata aca 2552

Ser Asp Arg Thr Ile Ala Gin Tyr Ala Lys Glu Ile Trp Asn Ile Thr 820 825 830 835 gaa tgc egt aca tea tga ttcaagtgca aaaaaatttc atgtgcaata 2600

Glu Cys Arg Thr Ser 840 ggttatataa tttcttggaa ggatgtatta agatgggaag aaaatgaaag gaaatccaca 2660 atctgtgggg atcattaaat aaacctgtct ctccgtctta accatcattt gtttactcaa 2720 acatcgctct gtcagataag ttttaagttg taatttctta aacaattcta tetttataag 2780 aatttccagg ttttgaagaa ttacatcatt tgtcattact gataatagta egaaggaatt 2840 atgatacacc attttttttt tgttttaaaa aaaaaaaaaa aaaa 2884 <210> 22 <211> 840

<212> PRT

<213> Citrus hybrid cultivar <400> 22

Met Ala Asp Ala Lys Ala Asn Gly Lys Asn Glu Ala Ala Lys Leu Ala 15 10 15

Lys Ile Pro Ala Ala Ala Asn Pro Leu Ala Asn Glu Pro Ser Ala Ile 20 25 30

Ala Ser Asn Ile Ser Tyr His Val Gin Tyr Ser Pro His Phe Ser Pro 35 40 45

Thr Lys Phe Glu Pro Glu Gin Ala Phe Phe Ala Thr Ala Glu Val Val 50 55 60

Arg Asp Arg Leu Ile Gin Gin Trp Asn Glu Thr Tyr His His Phe Asn 65 70 75 80

Lys Val Asp Pro Lys Gin Thr Tyr Tyr Leu Ser Met Glu Phe Leu Gin 85 90 95

Gly Arg Thr Leu Thr Asn Ala Ile Gly Ser Leu Asp Ile Gin Asn Ala g -92- DK 177092 B1 100 105 110

Tyr Ala Asp Ala Leu Asn Asn Leu Gly His Val Leu Glu Glu Ile Ala 115 120 125

Glu Gin Glu Lys Asp Ala Ala Leu Gly Asn Gly Gly Leu Gly Arg Leu 130 135 140

Ala Ser Cys Phe Leu Asp Ser Met Ala Thr Leu Asn Leu Pro Ala Trp 145 150 155 160

Gly Tyr Gly Leu Arg Tyr Arg Tyr Gly Leu Phe Lys Gin Lys Ile Thr 165 170 175

Lys Gin Gly Gin Glu Glu Val Ala Glu Asp Trp Leu Glu Lys Phe Ser 180 185 190

Pro Trp Glu Val Val Arg His Asp Val Val Phe Pro Val Arg Phe Phe 195 200 205

Gly Ser Val Met Val Asn Pro Asn Gly Thr Arg Lys Trp Val Gly Gly 210 215 220

Glu Val Val Gin Ala Val Ala Tyr Asp Ile Pro Ile Pro Gly Tyr Lys 225 230 235 240

Thr Lys Asn Thr Ile Ser Leu Arg Leu Trp Asp Ala Lys Ala Ser Ala 245 250 255

Glu Asp Phe Asn Leu Phe Gin Phe Asn Asp Gly Gin Tyr Glu Ser Ala 260 265 270

Ala Gin Leu His Ser Arg Ala Gin Gin Ile Cys Ala Val Leu Tyr Pro 275 280 285

Gly Asp Ser Thr Glu Glu Gly Lys Leu Leu Arg Leu Lys Gin Gin Phe 290 295 300

Phe Leu Cys Ser Ala Ser Leu Gin Asp Met Ile Leu Arg Phe Lys Glu 305 310 315 320

Arg Lys Ser Gly Arg Gin Trp Ser Glu Phe Pro Ser Lys Val Ala Val 325 330 335 -93- DK 177092 B1

Gln Leu Asn Asp Thr His Pro Thr Leu Ala Ile Pro Glu Leu Met Arg 340 345 350

Leu Leu Met Asp Glu Glu Gly Leu Gly Trp Asp Glu Ala Trp Asp Ile 355 360 365

Thr Thr Arg Thr Val Ala Tyr Thr Asn His Thr Val Leu Pro Glu Ala 370 375 380

Leu Glu Lys Trp Ser Gin Ala Val Met Trp Lys Leu Leu Pro Arg His 385 390 395 400

Met Glu Ile Ile Glu Glu Ile Asp Lys Arg Phe Ile Ala Met Val Arg 405 410 415

Ser Thr Arg Ser Asp Leu Glu Ser Lys Ile Pro Ser Met Cys Ile Leu 420 425 430

Asp Asn Asn Pro Lys Lys Pro Val Val Arg Met Ala Asn Leu Cys Val 435 440 445

Val Ser Ala His Thr val Asn Gly Val Ala Gin Leu His Ser Asp Ile 450 455 460

Leu Lys Ala Asp Leu Phe Ala Asp Tyr Val Ser Leu Trp Pro Asn Lys 465 470 475 480

Leu Gin Asn Lys Thr Asn Gly Ile Thr Pro Arg Arg Trp Leu Arg Phe 485 490 495

Cys Asn Pro Glu Leu Ser Lys Ile Ile Thr Lys Trp Leu Lys Thr Asp 500 505 510

Gin Trp Val Thr Asn Leu Asp Leu Leu Val Gly Leu Arg Gin Phe Ala 515 520 525

Asp Asn Thr Glu Leu Gin Ala Glu Trp Glu Ser Ala Lys Met Ala Ser 530 535 540

Lys Lys His Leu Ala Asp Tyr Ile Trp Arg Val Thr Gly Val Thr Ile 545 550 555 560

Asp Pro Asn Ser Leu Phe Asp Ile Gin Val Lys Arg Ile His Glu Tyr 565 570 575 -94- DK 177092 B1

Lys Arg Gin Leu Leu Asn Ile Leu Gly Ala Ile Tyr Arg Tyr Lys Lys 580 585 590

Leu Lys Glu Met Ser Pro Gin Glu Arg Lys Lys Thr Thr Pro Arg Thr 595 600 605

Ile Met Phe Gly Gly Lys Ala Phe Ala Thr Tyr Thr Asn Ala Lys Arg 610 615 620

Ile Val Lys Leu Val Asn Asp Val Gly Glu Val Val Asn Thr Asp Pro 625 630 635 640

Glu Val Asn Ser Tyr Leu Lys Val Val Phe Val Pro Asn Tyr Asn Val 645 650 655

Ser Val Ala Glu Leu Leu Ile Pro Gly Ser Glu Leu Ser Gin His Ile 660 665 670

Ser Thr Ala Gly Met Glu Ala Ser Gly Thr Ser Asn Met Lys Phe Ser 675 680 685

Leu Asn Gly Cys Leu Ile Ile Gly Thr Leu Asp Gly Ala Asn Val Glu 690 695 700

Ile Arg Gin Glu Ile Gly Glu Glu Asn Phe Phe Leu Phe Gly Ala Gly 705 710 715 720

Ala Asp Gin Val Pro Lys Leu Arg Lys Glu Arg Glu Asp Gly Leu Phe 725 730 735

Lys Pro Asp Pro Arg Phe Glu Glu Ala Lys Gin Phe Ile Arg Ser Gly 740 745 750

Ala Phe Gly Ser Tyr Asp Tyr Asn Pro Leu Leu Asp Ser Leu Glu Gly 755 760 765

Asn Thr Gly Tyr Gly Arg Gly Asp Tyr Phe Leu Val Gly Tyr Asp Phe 770 775 780

Pro Ser Tyr Leu Glu Ala Gin Asp Arg Val Asp Gin Ala Tyr Lys Asp 785 790 795 800

Arg Lys Lys Trp Leu Lys Met Ser Ile Leu Ser Thr Ala Gly Ser Gly 805 810 815 -95- DK 177092 B1

Lys Phe Ser Ser Asp Arg Thr Ile Ala Gin Tyr Ala Lys Glu Ile Trp 820 825 830

Asn Ile Thr Glu Cys Arg Thr Ser 835 840 <210> 23 <211> 2526 <212> DNA <213> Oryza sativa <220> <221> CDS <222> (1)..(2526) <400> 23 atg ccg gag age aac ggc gcc gcg tgc ggc gcg gcg gag aag gtg aag 48

Met Pro Glu Ser Asn Gly Ala Ala Cys Gly Ala Ala Glu Lys Val Lys 15 10 15 ccg gcg gcc age ccc gcg teg gag gag ccg gcc gcc atc gcc ggt aac 96

Pro Ala Ala Ser Pro Ala Ser Glu Glu Pro Ala Ala Ile Ala Gly Asn 20 25 30 atc tee ttc cac gcg cag tac age ccc cae tte teg ccg etc gcg tte 144

Ile Ser Phe His Ala Gin Tyr Ser Pro His Phe Ser Pro Leu Ala Phe 35 40 45 ggc ccc gag cag gcc tte tac tee acc gcc gag age gtc ege gat cac 192

Gly Pro Glu Gin Ala Phe Tyr Ser Thr Ala Glu Ser Val Arg Asp His 50 55 60 etc gtc cag aga tgg aac gag aeg tac ttg cat tte cac aag aeg gat 240

Leu Val Gin Arg Trp Asn Glu Thr Tyr Leu His Phe His Lys Thr Asp 65 70 75 80 ccg aag cag aeg tac tac etc tee atg gag tac ctg cag ggc ege gcg 288

Pro Lys Gin Thr Tyr Tyr Leu Ser Met Glu Tyr Leu Gin Gly Arg Ala 85 90 95 etc acc aac gee gtc ggc aac etc ggc atc acc ggc gcc tac gcg gag 336

Leu Thr Asn Ala Val Gly Asn Leu Gly Ile Thr Gly Ala Tyr Ala Glu 100 105 110 gee gtg aag aag tte ggg tac gag etc gag gcc etc gtc ggg cag gaa 384

Ala Val Lys Lys Phe Gly Tyr Glu Leu Glu Ala Leu Val Gly Gin Glu 115 120 125 aaa gat gea get ctg gga aat ggt ggc ttg ggt agg etc gea tet tgc 432

Lys Asp Ala Ala Leu Gly Asn Gly Gly Leu Gly Arg Leu Ala Ser Cys 130 135 140 ttt ttg gat teg atg gea aca eta aat ttg eet get tgg gga tat ggt 480

Phe Leu Asp Ser Met Ala Thr Leu Asn Leu Pro Ala Trp Gly Tyr Gly 145 150 155 160 -96- DK 177092 B1 ctg cgg tac cga tat ggt eta tte aaa caa tgc atc acc aag gaa ggc 528

Leu Arg Tyr Arg Tyr Gly Leu Phe Lys Gin Cys Ile Thr Lys Glu Gly 165 170 175 cag gaa gaa att get gaa gat tgg ett gag aag tte age cca tgg gaa 576

Gin Glu Glu Ile Ala Glu Asp Trp Leu Glu Lys Phe Ser Pro Trp Glu 180 185 190 att gtc agg cat gac att gta tac cca atc aga ttt ttt ggc cac gtt 624

Ile Val Arg His Asp Ile Val Tyr Pro Ile Arg Phe Phe Gly His Val 195 200 205 gag att ttg cca gat gga tet egt aaa tgg gtg ggg gga gaa gtt etc 672

Glu Ile Leu Pro Asp Gly Ser Arg Lys Trp Val Gly Gly Glu Val Leu 210 215 220 aat get tta gea tat gat gtg cca att eet ggg tac aag aca aaa aat 720

Asn Ala Leu Ala Tyr Asp Val Pro Ile Pro Gly Tyr Lys Thr Lys Asn 225 230 235 240 gea atc agt ett egt ett tgg gac gea aaa get agt gcg gag gat ttt 768

Ala Ile Ser Leu Arg Leu Trp Asp Ala Lys Ala Ser Ala Glu Asp Phe 245 250 255 aac tta ttt caa tte aat gat ggc cag tat gag tee get get caa ett 816

Asn Leu Phe Gin Phe Asn Asp Gly Gin Tyr Glu Ser Ala Ala Gin Leu 260 265 270 cat get agg gea caa cag ata tgt gee gtt etc tat ccc ggt gat get 864

His Ala Arg Ala Gin Gin Ile Cys Ala Val Leu Tyr Pro Gly Asp Ala 275 280 285 aca gaa gaa gga aag ett etc aga ctg aag caa cag tat tte ett tgc 912

Thr Glu Glu Gly Lys Leu Leu Arg Leu Lys Gin Gin Tyr Phe Leu Cys 290 295 300 agt gea teg ett cag gat att ttt tte agg ttt aaa gaa agg aaa get 960

Ser Ala Ser Leu Gin Asp Ile Phe Phe Arg Phe Lys Glu Arg Lys Ala 305 310 315 320 gac aga gtt tet ggg aaa tgg agt gag tte eet gea aaa gtt get gtt 1008

Asp Arg Val Ser Gly Lys Trp Ser Glu Phe Pro Ala Lys Val Ala Val 325 330 335 caa ttg aat gac act cac cca act ett gcg att eet gag ctg atg agg 1056

Gin Leu Asn Asp Thr His Pro Thr Leu Ala Ile Pro Glu Leu Met Arg 340 345 350 eta etc atg gat gtg gag gga ett ggt tgg gat gaa gea tgg gat atc 1104

Leu Leu Met Asp Val Glu Gly Leu Gly Trp Asp Glu Ala Trp Asp Ile 355 360 365 aca aat aaa aca att gcc tac acc aat cac act gtt ett eet gaa gcc 1152

Thr Asn Lys Thr Ile Ala Tyr Thr Asn His Thr Val Leu Pro Glu Ala 370 375 380 ett gag aaa tgg teg cag att gta atg agg aaa tta ett cca cga cac 1200 -97- DK 177092 B1

Leu Glu Lys Trp Ser Gin Ile Val Met Arg Lys Leu Leu Pro Arg His 385 390 395 400 atg gaa att atc gag gaa att gac aag cgg ttc aag gaa atg gta atc 1248

Met Glu Ile Ile Glu Glu Ile Asp Lys Arg Phe Lys Glu Met Val Ile 405 410 415 tcc acc cgg aag gaa atg gag gga aag att gac tcc atg aga atc tta 1296

Ser Thr Arg Lys Glu Met Glu Gly Lys Ile Asp Ser Met Arg Ile Leu 420 425 430 gac aac tea aat cct cag aag cca gta gtg cgc atg gea aat ttg tgc 1344

Asp Asn Ser Asn Pro Gin Lys Pro Val Val Arg Met Ala Asn Leu Cys 435 440 445 gta gtg tet gcc cat aeg gtg aat gga gtg get gag tta cac age aac 1392

Val Val Ser Ala His Thr Val Asn Gly Val Ala Glu Leu His Ser Asn 450 455 460 att ttg aag gaa gag ett ttt gea gac tat ctc tet ata tgg ccc aac 1440

Ile Leu Lys Glu Glu Leu Phe Ala Asp Tyr Leu Ser Ile Trp Pro Asn 465 470 475 480 aaa ttt cag aac aaa aca aat gga att aca cct egt aga tgg ctc egt 1488

Lys Phe Gin Asn Lys Thr Asn Gly Ile Thr Pro Arg Arg Trp Leu Arg 485 490 495 ttc tgc aac cca gag ttg agt gaa ata gta aca aaa tgg eta aaa aca 1536

Phe Cys Asn Pro Glu Leu Ser Glu Ile Val Thr Lys Trp Leu Lys Thr 500 505 510 gat cag tgg aca age aac ett gat ett ett acc gga ett cgg aaa ttt 1584

Asp Gin Trp Thr Ser Asn Leu Asp Leu Leu Thr Gly Leu Arg Lys Phe 515 520 525 gea gat gat gaa aag ett cat get gag tgg gea tea get aag ttg get 1632

Ala Asp Asp Glu Lys Leu His Ala Glu Trp Ala Ser Ala Lys Leu Ala 530 535 540 age aaa aaa cgc eta gee aag cat gtg ttg gat gtg aca ggt gtt aca 1680

Ser Lys Lys Arg Leu Ala Lys His Val Leu Asp Val Thr Gly Val Thr 545 550 555 560 atc gac cca aat age ett ttt gat ata caa att aaa cgc att cat gag 1728

Ile Asp Pro Asn Ser Leu Phe Asp Ile Gin Ile Lys Arg Ile His Glu 565 570 575 tac aag aga cag ctg eta aac att ttg gga get gtt tac aga tac aag 1776

Tyr Lys Arg Gin Leu Leu Asn Ile Leu Gly Ala Val Tyr Arg Tyr Lys 580 585 590 aag tta aag gga atg agt gea gag gag aga caa aaa gtt aeg cca cgc 1824

Lys Leu Lys Gly Met Ser Ala Glu Glu Arg Gin Lys Val Thr Pro Arg 595 600 605 act gtc atg ata ggg gga aaa gea ttc geg act tac acc aat gcc aaa 1872

Thr Val Met Ile Gly Gly Lys Ala Phe Ala Thr Tyr Thr Asn Ala Lys 610 615 620 -98- DK 177092 B1 aga ata gta aaa ttg gta aat gat gtt ggt get gtg gtg aac aat gat 1920

Arg Ile Val Lys Leu Val Asn Asp Val Gly Ala Val Val Asn Asn Asp 625 630 635 640 eet gat gtt aat aaa tac eta aag gtg gtg tte att ccc aac tac aat 1968

Pro Asp Val Asn Lys Tyr Leu Lys Val Val Phe Ile Pro Asn Tyr Asn 645 650 655 gta tet gtg gee gag gtg etc att eet ggg agt gaa ctg tea cag cac 2016

Val Ser Val Ala Glu Val Leu Ile Pro Gly Ser Glu Leu Ser Gin His 660 665 670 atc agt aec gea ggc atg gaa gea agt gga aeg agt aat atg aaa tte 2064

Ile Ser Thr Ala Gly Met Glu Ala Ser Gly Thr Ser Asn Met Lys Phe 675 680 685 tet ctg aat ggt tgt gtt ate att ggt act ett gat gga get aat gtt 2112

Ser Leu Asn Gly Cys Val Ile Ile Gly Thr Leu Asp Gly Ala Asn Val 690 695 700 gag ata aga gag gaa gtg gga caa gaa aat tte tte ett ttt ggt gcc 2160

Glu Ile Arg Glu Glu Val Gly Gin Glu Asn Phe Phe Leu Phe Gly Ala 705 710 715 720 aag gea gat caa gtt get ggg ctg agg aag gat aga gag aat ggc ttg 2208

Lys Ala Asp Gin Val Ala Gly Leu Arg Lys Asp Arg Glu Asn Gly Leu 725 730 735 tte aaa cca gac cca egt ttt gaa gaa gcc aag cag ett ata agg agt 2256

Phe Lys Pro Asp Pro Arg Phe Glu Glu Ala Lys Gin Leu Ile Arg Ser 740 745 750 ggt get ttt ggc ace tat gac tat get ccc etc ttg gat tet ett gaa 2304

Gly Ala Phe Gly Thr Tyr Asp Tyr Ala Pro Leu Leu Asp Ser Leu Glu 755 760 765 gga aat tet gga ttt ggt egt ggt gat tat tte etc gtt ggc tat gat 2352

Gly Asn Ser Gly Phe Gly Arg Gly Asp Tyr Phe Leu Val Gly Tyr Asp 770 775 780 tte cca age tat att gat gea cag gcc cag gtt gat gaa gcc tac aag 2400

Phe Pro Ser Tyr Ile Asp Ala Gin Ala Gin Val Asp Glu Ala Tyr Lys 785 790 795 800 gat aag aaa aaa tgg ate aag atg tet ata ctg aac aca get gga agt 2448

Asp Lys Lys Lys Trp Ile Lys Met Ser Ile Leu Asn Thr Ala Gly Ser 805 810 815 ggc aaa tte age age gac egt act ate get cag tat gea aag gaa ata 2496

Gly Lys Phe Ser Ser Asp Arg Thr Ile Ala Gin Tyr Ala Lys Glu Ile 820 825 830 tgg ggc att act get age eet gtc tee taa 2526

Trp Gly Ile Thr Ala Ser Pro Val Ser 835 840 <210> 24 <211> 841 -99- DK 177092 B1

<212> PRT

<213> Oryza sativa <400> 24

Met Pro Glu Ser Asn Gly Ala Ala Cys Gly Ala Ala Gin Lys Val Lys 15 10 15

Pro Ala Ala Ser Pro Ala Ser Glu Glu Pro Ala Ala Ile Ala Gly Asn 20 25 30

Ile Ser Phe His Ala Gin Tyr Ser Pro His Phe Ser Pro Leu Ala Phe 35 ' 40 45

Gly Pro Glu Gin Ala Phe Tyr Ser Thr Ala Glu Ser Val Arg Asp His 50 55 60

Leu Val Gin Arg Trp Asn Glu Thr Tyr Leu His Phe His Lys Thr Asp 65 70 75 80

Pro Lys Gin Thr Tyr Tyr Leu Ser Met Glu Tyr Leu Gin Gly Arg Ala 85 90 95

Leu Thr Asn Ala Val Gly Asn Leu Gly Ile Thr Gly Ala Tyr Ala Glu 100 105 110

Ala Val Lys Lys Phe Gly Tyr Glu Leu Glu Ala Leu Val Gly Gin Glu 115 120 125

Lys Asp Ala Ala Leu Gly Asn Gly Gly Leu Gly Arg Leu Ala Ser Cys 130 135 140

Phe Leu Asp Ser Met Ala Thr Leu Asn Leu Pro Ala Trp Gly Tyr Gly 145 150 155 160

Leu Arg Tyr Arg Tyr Gly Leu Phe Lys Gin Cys Ile Thr Lys Glu Gly 165 170 175

Gin Glu Glu Ile Ala Glu Asp Trp Leu Glu Lys Phe Ser Pro Trp Glu 180 185 190

Ile Val Arg His Asp Ile Val Tyr Pro Ile Arg Phe Phe Gly His Val 195 200 205

Glu Ile Leu Pro Asp Gly Ser Arg Lys Trp Val Gly Gly Glu Val Leu 210 215 220 - 100- DK 177092 B1

Asn Ala Leu Ala Tyr Asp Val Pro Ile Pro Gly Tyr Lys Thr Lys Asn 225 230 235 240

Ala Ile Ser Leu Arg Leu Trp Asp Ala Lys Ala Ser Ala Glu Asp Phe 245 250 255

Asn Leu Phe Gin Phe Asn Asp Gly Gin Tyr Glu Ser Ala Ala Gin Leu 260 265 270

His Ala Arg Ala Gin Gin Ile Cys Ala Val Leu Tyr Pro Gly Asp Ala 275 280 285

Thr Glu Glu Gly Lys Leu Leu Arg Leu Lys Gin Gin Tyr Phe Leu Cys 290 295 300

Ser Ala Ser Leu Gin Asp Ile Phe Phe Arg Phe Lys Glu Arg Lys Ala 305 310 315 320

Asp Arg Val Ser Gly Lys Trp Ser Glu Phe Pro Ala Lys Val Ala Val 325 330 335

Gin Leu Asn Asp' Thr His Pro Thr Leu Ala Ile Pro Glu Leu Met Arg 340 345 350

Leu Leu Met Asp Val Glu Gly Leu Gly Trp Asp Glu Ala Trp Asp Ile 355 360 365

Thr Asn Lys Thr Ile Ala Tyr Thr Asn His Thr Val Leu Pro Glu Ala 370 375 380

Leu Glu Lys Trp Ser Gin Ile Val Met Arg Lys Leu Leu Pro Arg His 385 390 395 400

Met Glu Ile Ile Glu Glu Ile Asp Lys Arg Phe Lys Glu Met Val Ile 405 410 415

Ser Thr Arg Lys Glu Met Glu Gly Lys Ile Asp Ser Met Arg Ile Leu 420 425 430

Asp Asn Ser Asn Pro Gin Lys Pro Val Val Arg Met Ala Asn Leu Cys 435 440 445

Val Val Ser Ala His Thr Val Asn Gly Val Ala Glu Leu His Ser Asn -]01 - DK 177092 B1 450 455 460

Ile Leu Lys Glu Glu Leu Phe Ala Asp Tyr Leu Ser Ile Trp Pro Asn 465 470 475 480

Lys Phe Gin Asn Lys Thr Asn Gly Ile Thr Pro Arg Arg Trp Leu Arg 485 490 495

Phe Cys Asn Pro Glu Leu Ser Glu Ile Val Thr Lys Trp Leu Lys Thr 500 505 510

Asp Gin Trp Thr Ser Asn Leu Asp Leu Leu Thr Gly Leu Arg Lys Phe 515 520 525

Ala Asp Asp Glu Lys Leu His Ala Glu Trp Ala Ser Ala Lys Leu Ala 530 535 540

Ser Lys Lys Arg Leu Ala Lys His Val Leu Asp Val Thr Gly Val Thr 545 550 555 560

Ile Asp Pro Asn Ser Leu Phe Asp Ile Gin Ile Lys Arg Ile His Glu 565 570 575

Tyr Lys Arg Gin Leu Leu Asn Ile Leu Gly Ala Val Tyr Arg Tyr Lys 580 585 590

Lys Leu Lys Gly Met Ser Ala Glu Glu Arg Gin Lys Val Thr Pro Arg 595 600 605

Thr Val Met ile Gly Gly Lys Ala Phe Ala Thr Tyr Thr Asn Ala Lys 610 615 620

Arg Ile Val Lys Leu Val Asn Asp Val Gly Ala Val Val Asn Asn Asp 625 630 635 640

Pro Asp Val Asn Lys Tyr Leu Lys Val Val Phe Ile Pro Asn Tyr Asn 645 650 655

Val Ser Val Ala Glu Val Leu Ile Pro Gly Ser Glu Leu Ser Gin His 660 665 670

Ile Ser Thr Ala Gly Met Glu Ala Ser Gly Thr Ser Asn Met Lys Phe 675 680 685 - 102 - DK 177092 B1

Ser Leu Asn Gly Cys Val Ile Ile Gly Thr Leu Asp Gly Ala Asn Val 690 695 700

Glu Ile Arg Glu Glu Val Gly Gin Glu Asn Phe Phe Leu Phe Gly Ala 705 710 715 720

Lys Ala Asp Gin Val Ala Gly Leu Arg Lys Asp Arg Glu Asn Gly Leu 725 730 735

Phe Lys Pro Asp Pro Arg Phe Glu Glu Ala Lys Gin Leu Ile Arg Ser 740 745 750

Gly Ala Phe Gly Thr Tyr Asp Tyr Ala Pro Leu Leu Asp Ser Leu Glu 755 760 765

Gly Asn Ser Gly Phe Gly Arg Gly Asp Tyr Phe Leu Val Gly Tyr Asp 770 775 780

Phe Pro Ser Tyr Ile Asp Ala Gin Ala Gin Val Asp Glu Ala Tyr Lys 785 790 795 800

Asp Lys Lys Lys Trp ile Lys Met Ser Ile Leu Asn Thr Ala Gly Ser 805 810 815

Gly Lys Phe Ser Ser Asp Arg Thr Ile Ala Gin Tyr Ala Lys Glu Ile 820 825 830

Trp Gly Ile Thr Ala Ser Pro Val Ser 835 840 <210> 25 <211> 2910 <212> DNA <213> Vicia faba <220>

<221> CDS

<222> (155)..(2683) <400> 25 tcatctcaca ctcacatgag gtagcaattc cattccttca aatatcttca catatgcttc 60 caaatccaga ttctttttaa tctctttttt tttccatttc ttcaaacaac tcgtttcgtt 120 gctacctttc tttactctca taaggatttg aaaa atg ggt ttt aaa gta gaa act 175

Met Gly Phe Lys Val Glu Thr 1 5 -103- DK 177092 B1 aat ggt ggt gat ggt tct tta gtt tct get aaa gtt cca eet ctg get 223

Asn Gly Gly Asp Gly Ser Leu Val Ser Ala Lys Val Pro Pro Leu Ala 10 15 20 aat cca ttg get gaa aaa eet gat gag att get tct aac atc agt tat 271

Asn Pro Leu Ala Glu Lys Pro Asp Glu Ile Ala Ser Asn Ile Ser Tyr 25 30 35 cat get cag tat act eet cat ttt tea cct ttc aaa ttt cag ett caa 319

His Ala Gin Tyr Thr Pro His Phe Ser Pro Phe Lys Phe Gin Leu Gin 40 45 50 55 caa get tac tat gca act gca gag agt gtt cgt gat cgt etc att cag 367

Gin Ala Tyr Tyr Ala Thr Ala Glu Ser Val Arg Asp Arg Leu lie Gin 60 65 70 caa tgg aat gaa aca tac tta cat ttt cac aaa gtt gat ccc aag caa 415

Gin Trp Asn Glu Thr Tyr Leu His Phe His Lys Val Asp Pro Lys Gin 75 80 85 aca tac tac tta tea atg gag ttc ett caa ggt ega get ttg acc aat 463

Thr Tyr Tyr Leu Ser Met Glu Phe Leu Gin Gly Arg Ala Leu Thr Asn 90 95 100 gee att gga aat etc aat atc caa gat gca tat get gat get ttg ege 511

Ala lie Gly Asn Leu Asn lie Gin Asp Ala Tyr Ala Asp Ala Leu Arg 105 110 115 aaa ttt gga ett gaa ett gaa gaa ata aca gag cag gag aag gat gca 559

Lys Phe Gly Leu Glu Leu Glu Glu lie Thr Glu Gin Glu Lys Asp Ala 120 125 130 135 gca eta gga aat ggt ggt ett ggt agg ett get tct tgc ttt ctg gat 607

Ala Leu Gly Asn Gly Gly Leu Gly Arg Leu Ala Ser Cys Phe Leu Asp 140 145 150 tee atg gca aca ett aat ttg cct get tgg ggg tac ggt ttg agg tat 655

Ser Met Ala Thr Leu Asn Leu Pro Ala Trp Gly Tyr Gly Leu Arg Tyr 155 160 165 egg tac gga eta ttt aag cag ata atc aca aaa gaa ggt cag gag gaa 703

Arg Tyr Gly Leu Phe Lys Gin lie lie Thr Lys Glu Gly Gin Glu Glu 170 175 180 gtt get gag gac tgg ett gag aag ttt age cct tgg gaa att gtg agg 751

Val Ala Glu Asp Trp Leu Glu Lys Phe Ser Pro Trp Glu lie Val Arg 185 190 195 cat gac gtt ttg tac ccg atc aga ttc ttt ggc cag gtt gag gtt aac 799

His Asp Val Leu Tyr Pro lie Arg Phe Phe Gly Gin Val Glu Val Asn 200 205 210 215 cct gat gga age ega caa tgg ata ggc gga gaa gtt att caa gca eta 847

Pro Asp Gly Ser Arg Gin Trp lie Gly Gly Glu Val lie Gin Ala Leu 220 225 230 get tat gat gtg ccg att cct gga tac cag acc aag aac acc atc agt 895

Ala Tyr Asp Val Pro lie Pro Gly Tyr Gin Thr Lys Asn Thr lie Ser 235 240 245 -104- DK 177092 B1 ctt cgc etc tgg gaa gcg aaa gca tgc get gat gat tte gat ttg ttt 943

Leu Arg Leu Trp Glu Ala Lys Ala Cys Ala Asp Asp Phe Asp Leu Phe 250 255 260 tta ttc aac gat ggg caa ett gaa tet get tea gtt ett cac tea ega 991

Leu Phe Asn Asp Gly Gin Leu Glu Ser Ala Ser Val Leu His Ser Arg 265 270 275 gcg caa cag att tgc teg gtt ttg tat eet ggt gat gcc aca gaa ggt 1039

Ala Gin Gin Ile Cys Ser Val Leu Tyr Pro Gly Asp Ala Thr Glu Gly 280 285 290 295 ggg aaa etc eta egg ctg aag cag cag tac ttt etc tgc agt gca tea 1087

Gly Lys Leu Leu Arg Leu Lys Gin Gin Tyr Phe Leu Cys Ser Ala Ser 300 305 310 etc caa gac ata att tee ega tte aag gag agg agg caa gga eet tgg 1135

Leu Gin Asp Ile Ile Ser Arg Phe Lys Glu Arg Arg Gin Gly Pro Trp 315 320 325 aac tgg tet gag tte cca aca aag gtt get gta caa ttg aac gat acc 1183

Asn Trp Ser Glu Phe Pro Thr Lys Val Ala Val Gin Leu Asn Asp Thr 330 335 340 cac cca acc ett tea ata ccg gag ttg atg ega tta eta atg gat gat 1231

His Pro Thr Leu Ser Ile Pro Glu Leu Met Arg Leu Leu Met Asp Asp 345 350 355 gaa ggg ett gga tgg gat gaa gca tgg get gtg aca tea aag aca gtt 1279

Glu Gly Leu Gly Trp Asp Glu Ala Trp Ala Val Thr Ser Lys Thr Val 360 365 370 375 get tac act aat cac act gtc etc eet gaa gcg ctg gag aaa tgg tet 1327

Ala Tyr Thr Asn His Thr Val Leu Pro Glu Ala Leu Glu Lys Trp Ser 380 385 390 caa eet gtt atg tgg aaa ctg ett eet egt cac atg gaa atc ata gag 1375

Gin Pro Val Met Trp Lys Leu Leu Pro Arg His Met Glu Ile Ile Glu 395 400 405 gaa atc gac aga ega tte gtt gca ttg ata agt aaa acc egt ttg gac 1423

Glu Ile Asp Arg Arg Phe Val Ala Leu Ile Ser Lys Thr Arg Leu Asp 410 415 420 ett gag gac gaa gtt tee aac atg cgc att tta gac aat aat ett cag 1471

Leu Glu Asp Glu Val Ser Asn Met Arg Ile Leu Asp Asn Asn Leu Gin 425 430 435 aaa cca gta gtt egg atg gcg aat ttg tgt gtt gtt tet tet cat act 1519

Lys Pro Val Val Arg Met Ala Asn Leu Cys Val Val Ser Ser His Thr 440 445 450 455 gtg aat ggt gtt gcc cag tta cac agt gat ata ttg aag tea gaa tta 1567

Val Asn Gly Val Ala Gin Leu His Ser Asp Ile Leu Lys Ser Glu Leu 460 465 470 ttt gca agt tat gtt tea ata tgg cca aca aaa tte caa aat aaa act 1615

Phe Ala Ser Tyr Val Ser Ile Trp Pro Thr Lys Phe Gin Asn Lys Thr -105- DK 177092 B1 475 480 485 aat ggc att acg cct cga aga tgg atc aat ttc tgc agt cct gag eta 1663

Asn Gly Ile Thr Pro Arg Arg Trp Ile Asn Phe Cys Ser Pro Glu Leu 490 495 500 age agg ata atc aca aag tgg tta aaa act gat aaa tgg gta acc aat 1711

Ser Arg Ile Ile Thr Lys Trp Leu Lys Thr Asp Lys Trp Val Thr Asn 505 510 515 ett gac eta tta aca ggt ett egt gag ttt get gac aac gaa gat eta 1759

Leu Asp Leu Leu Thr Gly Leu Arg Glu Phe Ala Asp Asn Glu Asp Leu 520 525 530 535 caa gea gag tgg ctg tet gea aag agg get aat aag cag ege tta gea 1807

Gin Ala Glu Trp Leu Ser Ala Lys Arg Ala Asn Lys Gin Arg Leu Ala 540 545 550 cag tat gtt ctg caa gtg aca ggg gag aac att gac cct gat agt eta 1855

Gin Tyr Val Leu Gin Val Thr Gly Glu Asn Ile Asp Pro Asp Ser Leu 555 560 565 ttt gac att caa gtc aag egt atc cac gaa tac aag agg cag ctg eta 1903

Phe Asp Ile Gin Val Lys Arg Ile His Glu Tyr Lys Arg Gin Leu Leu 570 575 580 aac att ett ggt gtg atc tat aga tat aaa aag tta aag gag atg age 1951

Asn Ile Leu Gly Val Ile Tyr Arg Tyr Lys Lys Leu Lys Glu Met Ser 585 590 595 cct gaa gaa egg aaa agt aca act gea ege acg gtc atg att gga gga 1999

Pro Glu Glu Arg Lys Ser Thr Thr Ala Arg Thr Val Met Ile Gly Gly 600 605 610 615 aag gea ttt gea acg tac aca aat get aaa egg ata gtc aag ett gtc 2047

Lys Ala Phe Ala Thr Tyr Thr Asn Ala Lys Arg Ile Val Lys Leu Val 620 625 630 gat gat gtt ggt tet gtt gta aac agt gat cct gaa gtc aat age tac 2095

Asp Asp Val Gly Ser Val Val Asn Ser Asp Pro Glu Val Asn Ser Tyr 635 640 645 ttg aag gtt gtg ttt gtg cca aat tac aac gta tea gtg gcg gag gtg 2143

Leu Lys Val Val Phe Val Pro Asn Tyr Asn Val Ser Val Ala Glu Val 650 655 660 ett ate cca ggg age gag eta teg cag cat ate age act gea gga atg 2191

Leu Ile Pro Gly Ser Glu Leu Ser Gin His Ile Ser Thr Ala Gly Met 665 670 675 gaa gea agt ggc acg age aac atg aaa ttt get ttg aac egg gtg ett 2239

Glu Ala Ser Gly Thr Ser Asn Met Lys Phe Ala Leu Asn Arg Val Leu 680 685 690 695 ata ata ggt aca tta gat gga get aat gtc gaa atc egg gag gag att 2287

Ile Ile Gly Thr Leu Asp Gly Ala Asn Val Glu Ile Arg Glu Glu Ile 700 705 710 ggt gag gag aat ttt tte ctg ttt ggt gea aca gcg gat gaa gtc cct 2335 -106 - DK 177092 B1

Gly Glu Glu Asn Phe Phe Leu Phe Gly Ala Thr Ala Asp Glu Val Pro 715 720 725 cga ctc agg aag gaa aga gag aat gga ctg ttc aag ccg gat cct cga 2383

Arg Leu Arg Lys Glu Arg Glu Asn Gly Leu Phe Lys Pro Asp Pro Arg 730 735 740 ttc gaa gag gca aag aag ttt ata agg agt ggg gtg ttt gga age tac 2431

Phe Glu Glu Ala Lys Lys Phe Ile Arg Ser Gly Val Phe Gly Ser Tyr 745 750 755 gac tac aac cca ttg etc gat tea ttg gaa gga aat tet ggt tat ggt 2479

Asp Tyr Asn Pro Leu Leu Asp Ser Leu Glu Gly Asn Ser Gly Tyr Gly 760 765 770 775 cgc gga gat tac ttt ett gtt ggt tat gac ttc cca age tac atg gat 2527

Arg Gly Asp Tyr Phe Leu Val Gly Tyr Asp Phe Pro Ser Tyr Met Asp 780 785 790 get cag gaa aaa gta gac gaa gca tat egt gat aag aaa agg tgg eta 2575

Ala Gin Glu Lys Val Asp Glu Ala Tyr Arg Asp Lys Lys Arg Trp Leu 795 800 805 aaa atg tet att tta age act get ggg agt ggg aag ttc age agt gac 2623

Lys Met Ser Ile Leu Ser Thr Ala Gly Ser Gly Lys Phe Ser Ser Asp 810 815 820 agg aca att get cag tat get aag gaa att tgg aac atc gaa gaa tgc 2671

Arg Thr Ile Ala Gin Tyr Ala Lys Glu Ile Trp Asn Ile Glu Glu Cys 825 830 835 egg gta cca taa tttcaaggct ctgtatagta etagageatt gaaattaatg 2723

Arg Val Pro 840 aeagtatata gtcatgaata aaaaagaaca taattttcta tatttgattt tagtatgcca 2783 tateaggttt caactgtatt attattatag taagtgtcgt ttetetegat geatetgett 2843 ctacattatg aaaatatatt tgtatcatga tattttttat attggtttaa tttcaattca 2903 atcttcc 2910 <210> 26 <211> 842 <212> PRT <213> Vicia faba <400> 26

Met Gly Phe Lys Val Glu Thr Asn Gly Gly Asp Gly Ser Leu Val Ser 15 10 15

Ala Lys Val Pro Pro Leu Ala Asn Pro Leu Ala Glu Lys Pro Asp Glu 20 25 30 -107 - DK 177092 B1

Ile Ala Ser Asn Ile Ser Tyr His Ala Gin Tyr Thr Pro His Phe Ser 35 40 45

Pro Phe Lys Phe Gin Leu Gin Gin Ala Tyr Tyr Ala Thr Ala Glu Ser 50 55 60

Val Arg Asp Arg Leu Ile Gin Gin Trp Asn Glu Thr Tyr Leu His Phe 65 70 75 80

His Lys Val Asp Pro Lys Gin Thr Tyr Tyr Leu Ser Met Glu Phe Leu 85 90 95

Gin Gly Arg Ala Leu Thr Asn Ala Ile Gly Asn Leu Asn Ile Gin Asp 100 105 110

Ala Tyr Ala Asp Ala Leu Arg Lys Phe Gly Leu Glu Leu Glu Glu Ile 115 120 125

Thr Glu Gin Glu Lys Asp Ala Ala Leu Gly Asn Gly Gly Leu Gly Arg 130 135 140

Leu Ala Ser Cys Phe Leu Asp Ser Met Ala Thr Leu Asn Leu Pro Ala 145 150 155 160

Trp Gly Tyr Gly Leu Arg Tyr Arg Tyr Gly Leu Phe Lys Gin Ile Ile 165 170 175

Thr Lys Glu Gly Gin Glu Glu Val Ala Glu Asp Trp Leu Glu Lys Phe 180 185 190

Ser Pro Trp Glu Ile Val Arg His Asp Val Leu Tyr Pro Ile Arg Phe 195 200 205

Phe Gly Gin Val Glu Val Asn Pro Asp Gly Ser Arg Gin Trp Ile Gly 210 215 220

Gly Glu Val Ile Gin Ala Leu Ala Tyr Asp Val Pro Ile Pro Gly Tyr 225 230 235 240

Gin Thr Lys Asn Thr Ile Ser Leu Arg Leu Trp Glu Ala Lys Ala Cys 245 250 255

Ala Asp Asp Phe Asp Leu Phe Leu Phe Asn Asp Gly Gin Leu Glu Ser 260 265 270 -108- DK 177092 B1

Ala Ser Val Leu His Ser Arg Ala Gin Gin Ile Cys Ser Val Leu Tyr 275 280 285

Pro Gly Asp Ala Thr Glu Gly Gly Lys Leu Leu Arg Leu Lys Gin Gin 290 295 300

Tyr Phe Leu Cys Ser Ala Ser Leu Gin Asp Ile Ile Ser Arg Phe Lys 305 310 315 320

Glu Arg Arg Gin Gly Pro Trp Asn Trp Ser Glu Phe Pro Thr Lys Val 325 330 335

Ala Val Gin Leu Asn Asp Thr His Pro Thr Leu Ser Ile Pro Glu Leu 340 345 350

Met Arg Leu Leu Met Asp Asp Glu Gly Leu Gly Trp Asp Glu Ala Trp 355 360 365

Ala Val Thr Ser Lys Thr Val Ala Tyr Thr Asn His Thr Val Leu Pro 370 375 380

Glu Ala Leu Glu Lys Trp Ser Gin Pro Val Met Trp Lys Leu Leu Pro 385 390 395 400

Arg His Met Glu Ile Ile Glu Glu Ile Asp Arg Arg Phe Val Ala Leu 405 410 415

Ile Ser Lys Thr Arg Leu Asp Leu Glu Asp Glu Val Ser Asn Met Arg 420 425 430

Ile Leu Asp Asn Asn Leu Gin Lys Pro Val Val Arg Met Ala Asn Leu 435 440 445

Cys Val Val Ser Ser His Thr Val Asn Gly Val Ala Gin Leu His Ser 450 455 460

Asp Ile Leu Lys Ser Glu Leu Phe Ala Ser Tyr Val Ser Ile Trp Pro 465 470 475 480

Thr Lys Phe Gin Asn Lys Thr Asn Gly Ile Thr Pro Arg Arg Trp Ile 485 490 495

Asn Phe Cys Ser Pro Glu Leu Ser Arg Ile Ile Thr Lys Trp Leu Lys 500 505 510 -109 - DK 177092 B1

Thr Asp Lys Trp Val Thr Asn Leu Asp Leu Leu Thr Gly Leu Arg Glu 515 520 525

Phe Ala Asp Asn Glu Asp Leu Gin Ala Glu Trp Leu Ser Ala Lys Arg 530 535 540

Ala Asn Lys Gin Arg Leu Ala Gin Tyr Val Leu Gin Val Thr Gly Glu 545 550 555 560

Asn Ile Asp Pro Asp Ser Leu Phe Asp Ile Gin Val Lys Arg Ile His 565 570 575

Glu Tyr Lys Arg Gin Leu Leu Asn Ile Leu Gly Val Ile Tyr Arg Tyr 580 585 590

Lys Lys Leu Lys Glu Met Ser Pro Glu Glu Arg Lys Ser Thr Thr Ala 595 600 605

Arg Thr Val Met Ile Gly Gly Lys Ala Phe Ala Thr Tyr Thr Asn Ala 610 615 620

Lys Arg Ile Val Lys Leu Val Asp Asp Val Gly Ser Val Val Asn Ser 625 630 635 640

Asp Pro Glu Val Asn Ser Tyr Leu Lys Val Val Phe Val Pro Asn Tyr 645 650 655

Asn Val Ser Val Ala Glu Val Leu Ile Pro Gly Ser Glu Leu Ser Gin 660 665 670

His Ile Ser Thr Ala Gly Met Glu Ala Ser Gly Thr Ser Asn Met Lys 675 680 685

Phe Ala Leu Asn Arg Val Leu Ile Ile Gly Thr Leu Asp Gly Ala Asn 690 695 700

Val Glu Ile Arg Glu Glu Ile Gly Glu Glu Asn Phe Phe Leu Phe Gly 705 710 715 720

Ala Thr Ala Asp Glu Val Pro Arg Leu Arg Lys Glu Arg Glu Asn Gly 725 730 735

Leu Phe Lys Pro Asp Pro Arg Phe Glu Glu Ala Lys Lys Phe Ile Arg - 110- DK 177092 B1 740 745 750

Ser Gly Val Phe Gly Ser Tyr Asp Tyr Asn Pro Leu Leu Asp Ser Leu 755 760 765

Glu Gly Asn Ser Gly Tyr Gly Arg Gly Asp Tyr Phe Leu Val Gly Tyr 770 775 780

Asp Phe Pro Ser Tyr Met Asp Ala Gin Glu Lys Val Asp Glu Ala Tyr 785 790 795 800

Arg Asp Lys Lys Arg Trp Leu Lys Met Ser Ile Leu Ser Thr Ala Gly 805 810 815

Ser Gly Lys Phe Ser Ser Asp Arg Thr Ile Ala Gin Tyr Ala Lys Glu 820 825 830

Ile Trp Asn Ile Glu Glu Cys Arg Val Pro 835 840 <210> 27 <211> 2526

<212> DNA

<213> Arabidopsis thaliana <220> <221> CDS <222> (1)..(2526) <400> 27 atg gca aac gcc aat gga aaa get geg act agt tta ccg gag aaa atc 48

Met Ala Asn Ala Asn Gly Lys Ala Ala Thr Ser Leu Pro Glu Lys Ile 15 10 15 teg get aag gcg aat ccg gag gcc gat gat get aeg gag atc get ggg 96

Ser Ala Lys Ala Asn Pro Glu Ala Asp Asp Ala Thr Glu Ile Ala Gly 20 25 30 aat atc gtc tac cac gcc aag tac agt cca cat ttc tet cca ttg aag 144

Asn Ile Val Tyr His Ala Lys Tyr Ser Pro His Phe Ser Pro Leu Lys 35 40 45 ttc ggg cct gag caa get etc tac get acc gca gag agt ett cgc gat 192

Phe Gly Pro Glu Gin Ala Leu Tyr Ala Thr Ala Glu Ser Leu Arg Asp 50 55 60 egt ctc att cag ctg tgg aat gag act tat gtt cat ttt aac aaa gtt 240

Arg Leu Ile Gin Leu Trp Asn Glu Thr Tyr Val His Phe Asn Lys Val 65 70 75 80 gat cca aaa caa act tat tac ttg tea atg gag tat ctc caa ggt egt 288 - Ill - DK 177092 B1

Asp Pro Lys Gin Thr Tyr Tyr Leu Ser Met Glu Tyr Leu Gin Gly Arg 85 90 95 get ttg acc aat gcc att ggg aat ttg aac ett caa ggt cca tat get 336

Ala Leu Thr Asn Ala Ile Gly Asn Leu Asn Leu Gin Gly Pro Tyr Ala 100 105 110 gat gea ctg egt aeg ctg ggt tat gag ett gag gag ata get gag cag 384

Asp Ala Leu Arg Thr Leu Gly Tyr Glu Leu Glu Glu Ile Ala Glu Gin 115 120 125 gag aaa gat gea get eta gga aat ggt ggg tta ggg aga ett gcc teg 432

Glu Lys Asp Ala Ala Leu Gly Asn Gly Gly Leu Gly Arg Leu Ala Ser 130 135 140 tgt tte ttg gat teg atg gcc acc eta aat ctg eet get tgg ggt tat 480

Cys Phe Leu Asp Ser Met Ala Thr Leu Asn Leu Pro Ala Trp Gly Tyr 145 150 155 160 ggt ttg agg tac aga cat ggg ttg ttt aag caa ata atc aca aag aaa 528

Gly Leu Arg Tyr Arg His Gly Leu Phe Lys Gin Ile Ile Thr Lys Lys 165 170 175 ggt caa gaa gag att cca gag gac tgg ett gag aaa tte age cca tgg 576

Gly Gin Glu Glu Ile Pro Glu Asp Trp Leu Glu Lys Phe Ser Pro Trp 180 185 190 gaa att gtg agg cac gac gtg gta tte eet gtc aga ttt tte ggc aag 624

Glu Ile Val Arg His Asp Val Val Phe Pro Val Arg Phe Phe Gly Lys 195 200 205 gtg caa gta aat ccg gat gga tea agg aaa tgg gta gat ggt gat gtt 672

Val Gin Val Asn Pro Asp Gly Ser Arg Lys Trp Val Asp Gly Asp Val 210 215 220 gta caa get ett get tat gac gtg cca atc ccg gga tat ggc aca aag 720

Val Gin Ala Leu Ala Tyr Asp Val Pro Ile Pro Gly Tyr Gly Thr Lys 225 230 235 240 aac aca atc agt etc egt etc tgg gaa gea aaa get aga get gag gat 768

Asn Thr Ile Ser Leu Arg Leu Trp Glu Ala Lys Ala Arg Ala Glu Asp 245 250 255 ett gat ett ttt cag tte aac gaa gga gaa tat gaa ttg get gea cag 816

Leu Asp Leu Phe Gin Phe Asn Glu Gly Glu Tyr Glu Leu Ala Ala Gin 260 265 270 ett cat tet ega get caa cag att tgc act gtt tta tat cca gga gat 864

Leu His Ser Arg Ala Gin Gin Ile Cys Thr Val Leu Tyr Pro Gly Asp 275 280 285 get acc gag aat ggg aag tta tta egg tta aaa cag cag tte ttt etc 912

Ala Thr Glu Asn Gly Lys Leu Leu Arg Leu Lys Gin Gin Phe Phe Leu 290 295 300 tgc agt get teg ett cag gat att ata tea aga ttt cac gag agg age 960

Cys Ser Ala Ser Leu Gin Asp Ile Ile Ser Arg Phe His Glu Arg Ser 305 310 315 320 -112- DK 177092 B1 acc act gaa ggc age egg aaa tgg tea gag ttt cca agt aaa gtt get 1008

Thr Thr Glu Gly Ser Arg Lys Trp Ser Glu Phe Pro Ser Lys Val Ala 325 330 335 gtt caa atg aat gac aca cac cca act ett gea ata eet gag etc atg 1056

Val Gin Met Asn Asp Thr His Pro Thr Leu Ala Ile Pro Glu Leu Met 340 345 350 ega ttg eta atg gat gac aat gga ett gga tgg gat gag get tgg gat 1104

Arg Leu Leu Met Asp Asp Asn Gly Leu Gly Trp Asp Glu Ala Trp Asp 355 360 365 gtg aca tea aag acc gtt get tac acc aat cac act gtc ett eet gaa 1152

Val Thr Ser Lys Thr Val Ala Tyr Thr Asn His Thr Val Leu Pro Glu 370 375 380 geg ttg gag aaa tgg tea caa tet ttg atg tgg aag ett ett eet egt 1200

Ala Leu Glu Lys Trp Ser Gin Ser Leu Met Trp Lys Leu Leu Pro Arg 385 390 395 400 cat atg gaa ata ata gaa gag att gac aag agg ttt gtt caa acc att 1248

His Met Glu Ile Ile Glu Glu Ile Asp Lys Arg Phe Val Gin Thr Ile 405 410 415 ege gat aca aga gtt gat ctg gag gat aag att tea agt ttg age atc 1296

Arg Asp Thr Arg Val Asp Leu Glu Asp Lys Ile Ser Ser Leu Ser Ile 420 425 430 tta gat aac aat cca caa aag eet gtg gtg aga atg get aac tta tgt 1344

Leu Asp Asn Asn Pro Gin Lys Pro Val Val Arg Met Ala Asn Leu Cys 435 440 445 gtt gta tee teg cat aeg gtg aat ggc gtt get cag tta cac agt gat 1392

Val Val Ser Ser His Thr Val Asn Gly Val Ala Gin Leu His Ser Asp 450 455 460 ate ttg aag get gag tta tte gea gac tat gtc tet ata tgg cca aac 1440

Ile Leu Lys Ala Glu Leu Phe Ala Asp Tyr Val Ser Ile Trp Pro Asn 465 470 475 480 aag ttt caa aac aag act aat ggc atc aca eet ega agg tgg tta egt 1488

Lys Phe Gin Asn Lys Thr Asn Gly Ile Thr Pro Arg Arg Trp Leu Arg 485 490 495 tte tgc age eet gag etc agt gat ata ate aca aag tgg tta aag act 1536

Phe Cys Ser Pro Glu Leu Ser Asp Ile Ile Thr Lys Trp Leu Lys Thr 500 505 510 gac aaa tgg att acc gat ett gac eta ett acc ggt ett ege cag ttt 1584

Asp Lys Trp Ile Thr Asp Leu Asp Leu Leu Thr Gly Leu Arg Gin Phe 515 520 525 geg gac aat gaa gaa etc caa tet gaa tgg get tet gea aag aca gcc 1632

Ala Asp Asn Glu Glu Leu Gin Ser Glu Trp Ala Ser Ala Lys Thr Ala 530 535 540 aat aag aaa egt ttg get caa tat ata gag egt gtg act ggt gtg agt 1680

Asn Lys Lys Arg Leu Ala Gin Tyr Ile Glu Arg Val Thr Gly Val Ser 545 550 555 560 -113- DK 177092 B1 atc gat cca aca age tta ttt gac ata caa gtt aag egt atc cac gaa 1728

Ile Asp Pro Thr Ser Leu Phe Asp Ile Gin Val Lys Arg Ile His Glu 565 570 575 tac aag agg cag ctg atg aac att ett gga gta gta tac aga tte aag 1776

Tyr Lys Arg Gin Leu Met Asn Ile Leu Gly Val Val Tyr Arg Phe Lys 580 585 590 aaa eta aag gag atg aag eet gag gag agg aag aaa aca gtt eet egt 1824

Lys Leu Lys Glu Met Lys Pro Glu Glu Arg Lys Lys Thr Val Pro Arg 595 600 605 act gtc atg att ggg ggt aaa gea ttt gcc acc tat aca aat gea aaa 1872

Thr Val Met Ile Gly Gly Lys Ala Phe Ala Thr Tyr Thr Asn Ala Lys 610 615 620 egg ata gtg aag ctg gtg aat gat gtt ggt gat gtt gtt aac age gat 1920

Arg Ile Val Lys Leu Val Asn Asp Val Gly Asp Val Val Asn Ser Asp 625 630 635 640 cca gag gtc aac gaa tac eta aag gtg gta ttt gtt cca aac tac aat 1968

Pro Glu Val Asn Glu Tyr Leu Lys Val Val Phe Val Pro Asn Tyr Asn 645 650 655 gtc act gta gcg gag atg eta ata ccc gga agt gag eta tet caa cac 2016

Val Thr Val Ala Glu Met Leu Ile Pro Gly Ser Glu Leu Ser Gin His 660 665 670 atc age aca gea ggc atg gag gea agt ggt acc age aat atg aaa tte 2064

Ile Ser Thr Ala Gly Met Glu Ala Ser Gly Thr Ser Asn Met Lys Phe 675 680 685 get etc aac ggt tgt ett att ata gga acc ett gat ggg get aat gtt 2112

Ala Leu Asn Gly Cys Leu Ile Ile Gly Thr Leu Asp Gly Ala Asn Val 690 695 700 gag ata aga gag gag gtt ggc gaa gaa aat tte ttt ett ttt ggt gea 2160

Glu Ile Arg Glu Glu Val Gly Glu Glu Asn Phe Phe Leu Phe Gly Ala 705 710 715 720 aeg gcc gat cag gtc eet ega ctg egt aaa gaa ega gaa gac gga ctg 2208

Thr Ala Asp Gin Val Pro Arg Leu Arg Lys Glu Arg Glu Asp Gly Leu 725 730 735 tte aaa ccc gat eet egg tte gaa gag gea aag cag ttt gtc aaa agt 2256

Phe Lys Pro Asp Pro Arg Phe Glu Glu Ala Lys Gin Phe Val Lys Ser 740 745 750 gga gtg ttt ggg age tac gat tat ggt cca etc ett gat tet ett gag 2304

Gly Val Phe Gly Ser Tyr Asp Tyr Gly Pro Leu Leu Asp Ser Leu Glu 755 760 765 ggt aac aca ggt ttt gga egt ggt gat tac tte ctg gtt ggg tat gac 2352

Gly Asn Thr Gly Phe Gly Arg Gly Asp Tyr Phe Leu Val Gly Tyr Asp 770 775 780 tte ccc age tac atg gac get cag gee aaa gtt gac gaa get tat aag 2400

Phe Pro Ser Tyr Met Asp Ala Gin Ala Lys Val Asp Glu Ala Tyr Lys - 114- DK 177092 B1 785 790 795 800 gac egg aag ggg tgg ctg aaa atg teg ata ttg age aca gee ggg tea 2448

Asp Arg Lys Gly Trp Leu Lys Met Ser Ile Leu Ser Thr Ala Gly Ser 805 810 815 gga aag ttc age agt gac egt aca ata get cag tat gcc aaa gag att 2496

Gly Lys Phe Ser Ser Asp Arg Thr Ile Ala Gin Tyr Ala Lys Glu Ile 820 825 830 tgg aac att gag get tgt eet gtt ccc taa 2526

Trp Asn Ile Glu Ala Cys Pro Val Pro 835 840 <210> 28 <211> 841

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana <400> 28

Met Ala Asn Ala Asn Gly Lys Ala Ala Thr Ser Leu Pro Glu Lys Ile 15 10 15

Ser Ala Lys Ala Asn Pro Glu Ala Asp Asp Ala Thr Glu Ile Ala Gly 20 25 30

Asn Ile Val Tyr His Ala Lys Tyr Ser Pro His Phe Ser Pro Leu Lys 35 40 45

Phe Gly Pro Glu Gin Ala Leu Tyr Ala Thr Ala Glu Ser Leu Arg Asp 50 55 60

Arg Leu Ile Gin Leu Trp Asn Glu Thr Tyr Val His Phe Asn Lys Val 65 70 75 80

Asp Pro Lys Gin Thr Tyr Tyr Leu Ser Met Glu Tyr Leu Gin Gly Arg 85 90 95

Ala Leu Thr Asn Ala Ile Gly Asn Leu Asn Leu Gin Gly Pro Tyr Ala 100 105 110

Asp Ala Leu Arg Thr Leu Gly Tyr Glu Leu Glu Glu Ile Ala Glu Gin 115 120 125

Glu Lys Asp Ala Ala Leu Gly Asn Gly Gly Leu Gly Arg Leu Ala Ser 130 135 140

Cys Phe Leu Asp Ser Met Ala Thr Leu Asn Leu Pro Ala Trp Gly Tyr - 115- DK 177092 B1 145 150 155 160

Gly Leu Arg Tyr Arg His Gly Leu Phe Lys Gin Ile Ile Thr Lys Lys 165 170 175

Gly Gin Glu Glu Ile Pro Glu Asp Trp Leu Glu Lys Phe Ser Pro Trp 180 185 190

Glu Ile Val Arg His Asp Val Val Phe Pro Val Arg Phe Phe Gly Lys 195 200 205

Val Gin Val Asn Pro Asp Gly Ser Arg Lys Trp Val Asp Gly Asp Val 210 215 220

Val Gin Ala Leu Ala Tyr Asp Val Pro Ile Pro Gly Tyr Gly Thr Lys 225 230 235 240

Asn Thr Ile Ser Leu Arg Leu Trp Glu Ala Lys Ala Arg Ala Glu Asp 245 250 255

Leu Asp Leu Phe Gin Phe Asn Glu Gly Glu Tyr Glu Leu Ala Ala Gin 260 265 270

Leu His Ser Arg Ala Gin Gin Ile Cys Thr Val Leu Tyr Pro Gly Asp 275 280 285

Ala Thr Glu Asn Gly Lys Leu Leu Arg Leu Lys Gin Gin Phe Phe Leu 290 295 300

Cys Ser Ala Ser Leu Gin Asp Ile Ile Ser Arg Phe His Glu Arg Ser 305 310 315 320

Thr Thr Glu Gly Ser Arg Lys Trp Ser Glu Phe Pro Ser Lys Val Ala 325 330 335

Val Gin Met Asn Asp Thr His Pro Thr Leu Ala Ile Pro Glu Leu Met 340 345 350

Arg Leu Leu Met Asp Asp Asn Gly Leu Gly Trp Asp Glu Ala Trp Asp 355 360 365

Val Thr Ser Lys Thr Val Ala Tyr Thr Asn His Thr Val Leu Pro Glu 370 375 380 - 116- DK 177092 B1

Ala Leu Glu Lys Trp Ser Gin Ser Leu Met Trp Lys Leu Leu Pro Arg 385 390 395 400

His Met Glu Ile Ile Glu Glu Ile Asp Lys Arg Phe Val Gin Thr Ile 405 410 415

Arg Asp Thr Arg Val Asp Leu Glu Asp Lys ile Ser Ser Leu Ser Ile 420 425 430

Leu Asp Asn Asn Pro Gin Lys Pro Val Val Arg Met Ala Asn Leu Cys 435 440 445

Val Val Ser Ser His Thr Val Asn Gly Val Ala Gin Leu His Ser Asp 450 455 460

Ile Leu Lys Ala Glu Leu Phe Ala Asp Tyr Val Ser Ile Trp Pro Asn 465 470 475 480

Lys Phe Gin Asn Lys Thr Asn Gly Ile Thr Pro Arg Arg Trp Leu Arg 485 490 495

Phe Cys Ser Pro Glu Leu Ser Asp Ile Ile Thr Lys Trp Leu Lys Thr 500 505 510

Asp Lys Trp Ile Thr Asp Leu Asp Leu Leu Thr Gly Leu Arg Gin Phe 515 520 525

Ala Asp Asn Glu Glu Leu Gin Ser Glu Trp Ala Ser Ala Lys Thr Ala 530 535 540

Asn Lys Lys Arg Leu Ala Gin Tyr Ile Glu Arg Val Thr Gly Val Ser 545 550 555 560

Ile Asp Pro Thr Ser Leu Phe Asp Ile Gin Val Lys Arg Ile His Glu 565 570 575

Tyr Lys Arg Gin Leu Met Asn Ile Leu Gly Val Val Tyr Arg Phe Lys 580 585 590

Lys Leu Lys Glu Met Lys Pro Glu Glu Arg Lys Lys Thr Val Pro Arg 595 600 605

Thr Val Met Ile Gly Gly Lys Ala Phe Ala Thr Tyr Thr Asn Ala Lys 610 615 620 - 117 - DK 177092 B1

Arg Ile Val Lys Leu Val Asn Asp Val Gly Asp Val Val Asn Ser Asp 625 630 635 640

Pro Glu Val Asn Glu Tyr Leu Lys Val Val Phe Val Pro Asn Tyr Asn 645 650 655

Val Thr Val Ala Glu Met Leu Ile Pro Gly Ser Glu Leu Ser Gin His 660 665 670

Ile Ser Thr Ala Gly Met Glu Ala Ser Gly Thr Ser Asn Met Lys Phe 675 680 685

Ala Leu Asn Gly Cys Leu Ile Ile Gly Thr Leu Asp Gly Ala Asn Val 690 695 700

Glu Ile Arg Glu Glu Val Gly Glu Glu Asn Phe Phe Leu Phe Gly Ala 705 710 715 720

Thr Ala Asp Gin Val Pro Arg Leu Arg Lys Glu Arg Glu Asp Gly Leu 725 730 735

Phe Lys Pro Asp Pro Arg Phe Glu Glu Ala Lys Gin Phe Val Lys Ser 740 745 750

Gly Val Phe Gly Ser Tyr Asp Tyr Gly Pro Leu Leu Asp Ser Leu Glu 755 760 765

Gly Asn Thr Gly Phe Gly Arg Gly Asp Tyr Phe Leu Val Gly Tyr Asp 770 775 780

Phe Pro Ser Tyr Met Asp Ala Gin Ala Lys Val Asp Glu Ala Tyr Lys 785 790 795 800

Asp Arg Lys Gly Trp Leu Lys Met Ser Ile Leu Ser Thr Ala Gly Ser 805 810 815

Gly Lys Phe Ser Ser Asp Arg Thr Ile Ala Gin Tyr Ala Lys Glu Ile 820 825 830

Trp Asn Ile Glu Ala Cys Pro Val Pro 835 840 <210> 29 <211> 2655 -118- DK 177092 B1

<212> DNA

<213> Solanum tuberosum <220>

<221> CDS

<222> (12)..(2528) <400> 29 gtttattttc c atg gaa ggt ggt gca aaa tcg aat gat gta tea gea gea 50

Met Glu Gly Gly Ala Lys Ser Asn Asp Val Ser Ala Ala 15 10 eet att get caa cca ett tet gaa gac eet act gac att gea tet aat 98

Pro Ile Ala Gin Pro Leu Ser Glu Asp Pro Thr Asp Ile Ala Ser Asn 15 20 25 ate aag tat cat get caa tat act eet cat ttt tet eet tte aag ttt 146

Ile Lys Tyr His Ala Gin Tyr Thr Pro His Phe Ser Pro Phe Lys Phe 30 35 40 45 gag cca eta caa gea tac tat get get act get gac agt gtt cgt gat 194

Glu Pro Leu Gin Ala Tyr Tyr Ala Ala Thr Ala Asp Ser Val Arg Asp 50 55 60 ege ttg ate aaa caa tgg aat gac ace tat ett cat tat gac aaa gtt 242

Arg Leu Ile Lys Gin Trp Asn Asp Thr Tyr Leu His Tyr Asp Lys Val 65 70 75 aat cca aag caa aca tac tac tta tea atg gag tat etc cag ggg ega 290

Asn Pro Lys Gin Thr Tyr Tyr Leu Ser Met Glu Tyr Leu Gin Gly Arg 80 85 90 get ttg aca aat gca gtt gga aac tta gac ate cac aat gca tat get 338

Ala Leu Thr Asn Ala Val Gly Asn Leu Asp lie His Asn Ala Tyr Ala 95 100 105 gat get tta aac aaa ctg ggt cag cag ett gag gag gtc gtt gag cag 386

Asp Ala Leu Asn Lys Leu Gly Gin Gin Leu Glu Glu Val Val Glu Gin 110 115 120 125 gaa aaa gat gca gca tta gga aat ggt ggt tta gga agg etc get tea 434

Glu Lys Asp Ala Ala Leu Gly Asn Gly Gly Leu Gly Arg Leu Ala Ser 130 135 140 tgc ttt ett gat tee atg gee aca ttg aac ett cca gca tgg ggt tat 482

Cys Phe Leu Asp Ser Met Ala Thr Leu Asn Leu Pro Ala Trp Gly Tyr 145 150 155 ggc ttg agg tac aga tat gga ett ttt aag cag ett ate aca aag get 530

Gly Leu Arg Tyr Arg Tyr Gly Leu Phe Lys Gin Leu He Thr Lys Ala ' 160 165 170 ggg caa gaa gaa gtt eet gaa gat tgg ttg gag aaa ttt agt ccc tgg 578

Gly Gin Glu Glu Val Pro Glu Asp Trp Leu Glu Lys Phe Ser Pro Trp 175 180 185 gaa att gta agg cat gat gtt gtc ttt cct ate agg ttt ttt ggt cat 626

Glu lie Val Arg His Asp Val Val Phe Pro lie Arg Phe Phe Gly His -119- DK 177092 B1 190 195 200 205 gtt gaa gtc ctc cct tct ggc tcg cga aaa tgg gtt ggt gga gag gtc 674

Val Glu Val Leu Pro Ser Gly Ser Arg Lys Trp Val Gly Gly Glu Val 210 215 220 eta cag get ett gea tat gat gtg cca att cca gga tac aga act aaa 722

Leu Gin Ala Leu Ala Tyr Asp Val Pro Ile Pro Gly Tyr Arg Thr Lys 225 230 235 aac act aat agt ett egt etc tgg gaa gcc aaa gea age tct gag gat 770

Asn Thr Asn Ser Leu Arg Leu Trp Glu Ala Lys Ala Ser Ser Glu Asp 240 245 250 tte aac ttg ttt ctg ttt aat gat gga cag tat gat get get gea cag 818

Phe Asn Leu Phe Leu Phe Asn Asp Gly Gin Tyr Asp Ala Ala Ala Gin 255 260 265 ett cat tct agg get cag cag att tgt get gtt etc tac cct ggg gat 866

Leu His Ser Arg Ala Gin Gin Ile Cys Ala Val Leu Tyr Pro Gly Asp 270 275 280 285 get aca gag aat gga aaa etc tta egg eta aag caa caa ttt ttt ctg 914

Ala Thr Glu Asn Gly Lys Leu Leu Arg Leu Lys Gin Gin Phe Phe Leu 290 295 300 tgc agt gea teg ett cag gat att att gcc aga tte aaa gag aga gaa 962

Cys Ser Ala Ser Leu Gin Asp Ile Ile Ala Arg Phe Lys Glu Arg Glu 305 310 315 gat gga aag ggt tct cac cag tgg tct gaa tte ccc aag aag gtt gcg 1010

Asp Gly Lys Gly Ser His Gin Trp Ser Glu Phe Pro Lys Lys Val Ala 320 325 330 ata caa eta aat gac aca cat cca act ett aeg att cca gag ctg atg 1058

Ile Gin Leu Asn Asp Thr His Pro Thr Leu Thr Ile Pro Glu Leu Met 335 340 345 egg ttg eta atg gat gat gaa gga ett ggg tgg gat gaa tct tgg aat 1106

Arg Leu Leu Met Asp Asp Glu Gly Leu Gly Trp Asp Glu Ser Trp Asn 350 355 360 365 ate act act agg aca att gcc tat aeg aat cat aca gtc eta cct gaa 1154

Ile Thr Thr Arg Thr Ile Ala Tyr Thr Asn His Thr val Leu Pro Glu 370 375 380 gea ett gaa aaa tgg tct cag gea gtc atg tgg aag etc ett cct aga 1202

Ala Leu Glu Lys Trp Ser Gin Ala Val Met Trp Lys Leu Leu Pro Arg 385 390 395 cat atg gaa ate att gaa gaa att gac aaa egg ttt gtt get aca ata 1250

His Met Glu Ile Ile Glu Glu Ile Asp Lys Arg Phe val Ala Thr Ile 400 405 410 atg tea gaa aga cct gat ett gag aat aag atg cct age atg ege att 1298

Met Ser Glu Arg Pro Asp Leu Glu Asn Lys Met Pro Ser Met Arg Ile 415 420 425 ttg gat cac aac gee aca aaa cct gtt gtg cat atg get aac ttg tgt 1346 - 120 - DK 177092 B1

Leu Asp His Asn Ala Thr Lys Pro Val Val His Met Ala Asn Leu Cys 430 435 440 445 gtt gtc tct tea cat aeg gta aat ggt gtt gee cag ctg cat agt gac 1394

Val Val Ser Ser His Thr Val Asn Gly Val Ala Gin Leu His Ser Asp 450 455 460 ate ctg aag get gag tta ttt get gat tat gtc tct gta tgg ccc acc 1442

Ile Leu Lys Ala Glu Leu Phe Ala Asp Tyr Val Ser Val Trp Pro Thr 465 470 475 aag ttc cag aat aag acc aat ggt ata act cct egt agg tgg atc ega 1490

Lys Phe Gin Asn Lys Thr Asn Gly Ile Thr Pro Arg Arg Trp Ile Arg 480 485 490 ttt tgt agt cct gag ctg agt cat ata att acc aag tgg tta aaa aca 1538

Phe Cys Ser Pro Glu Leu Ser His Ile Ile Thr Lys Trp Leu Lys Thr 495 500 505 gat caa tgg gtg aeg aac etc gaa ctg ett get aat ett egg gag ttt 1586

Asp Gin Trp Val Thr Asn Leu Glu Leu Leu Ala Asn Leu Arg Glu Phe 510 515 520 525 get gat aat teg gag etc cat get gaa tgg gaa tea gee aag atg gcc 1634

Ala Asp Asn Ser Glu Leu His Ala Glu Trp Glu Ser Ala Lys Met Ala 530 535 540 aac aag cag egt ttg gea cag tat ata ctg cat gtg aca ggt gtg age 1682

Asn Lys Gin Arg Leu Ala Gin Tyr Ile Leu His Val Thr Gly Val Ser 545 550 555 atc gat cca aat tee ett ttt gac ata caa gtc aaa egt ate cat gaa 1730

Ile Asp Pro Asn Ser Leu Phe Asp Ile Gin Val Lys Arg Ile His Glu 560 565 570 tac aaa agg cag ett eta aat att ctg ggc gtc atc tat aga tac aag 1778

Tyr Lys Arg Gin Leu Leu Asn Ile Leu Gly Val Ile Tyr Arg Tyr Lys 575 580 585 aag ett aag gga atg age cct gaa gaa agg aaa aat aca act cct ege 1826

Lys Leu Lys Gly Met Ser Pro Glu Glu Arg Lys Asn Thr Thr Pro Arg 590 595 600 605 aca gtc atg att gga gga aaa gea ttt gea aca tac aca aat gea aaa 1874

Thr Val Met Ile Gly Gly Lys Ala Phe Ala Thr Tyr Thr Asn Ala Lys 610 615 620 ega att gtc aag etc gtg act gat gtt ggc gac gtt gtc aat agt gac 1922

Arg Ile Val Lys Leu Val Thr Asp Val Gly Asp Val Val Asn Ser Asp 625 630 635 cct gac gtc aat gac tat ttg aag gtg gtt ttt gtt ccc aac tac aat 1970

Pro Asp Val Asn Asp Tyr Leu Lys Val Val Phe Val Pro Asn Tyr Asn 640 645 650 gta tct gtg gea gag atg ett att ccg gga agt gag eta tea caa cac 2018

Val Ser Val Ala Glu Met Leu Ile Pro Gly Ser Glu Leu Ser Gin His 655 660 665 * 121 - DK 177092 B1 atc agt act gca ggc atg gaa gca agt gga aca age aac atg aaa ttt 2066

Ile Ser Thr Ala Gly Met Glu Ala Ser Gly Thr Ser Asn Met Lys Phe 670 675 680 685 gcc ett aat gga tgc ett atc att ggg aca eta gat ggg gcc aat gtg 2114

Ala Leu Asn Gly Cys Leu Ile Ile Gly Thr Leu Asp Gly Ala Asn Val 690 695 700 gaa att agg gag gaa att gga gaa gat aac ttc ttt ett ttt ggt gca 2162

Glu Ile Arg Glu Glu Ile Gly Glu Asp Asn Phe Phe Leu Phe Gly Ala 705 710 715 aca get gat gaa gtt cct caa ctg cgc aaa gat ega gag aat gga ctg 2210

Thr Ala Asp Glu Val Pro Gin Leu Arg Lys Asp Arg Glu Asn Gly Leu 720 725 730 ttc aaa cct gat cct egg ttt gaa gag gca aaa caa ttt att agg tet 2258

Phe Lys Pro Asp Pro Arg Phe Glu Glu Ala Lys Gin Phe Ile Arg Ser 735 740 745 gga gca ttt ggg aeg tat gat tat aat ccc etc ett gaa tea ctg gaa 2306

Gly Ala Phe Gly Thr Tyr Asp Tyr Asn Pro Leu Leu Glu Ser Leu Glu 750 755 760 765 ggg aac teg gga tat ggt egt gga gac tat ttt ett gtt ggt cat gat 2354

Gly Asn Ser Gly Tyr Gly Arg Gly Asp Tyr Phe Leu Val Gly His Asp 770 775 780 ttt ccg age tac atg gat get cag gca agg gtt gat gaa get tac aag 2402

Phe Pro Ser Tyr Met Asp Ala Gin Ala Arg Val Asp Glu Ala Tyr Lys 785 790 795 gac agg aaa aga tgg ata aag atg tet ata ctg age act agt ggg agt 2450

Asp Arg Lys Arg Trp Ile Lys Met Ser Ile Leu Ser Thr Ser Gly Ser 800 805 810 ggc aaa ttt agt agt gac egt aca att tet caa tat gca aaa gag atc 2498

Gly Lys Phe Ser Ser Asp Arg Thr Ile Ser Gin Tyr Ala Lys Glu Ile 815 820 825 tgg aac att gcc gag tgt cgc gtg cct tga gcacacttct gaacctggta 2548

Trp Asn Ile Ala Glu Cys Arg Val Pro 830 835 tctaataagg atctaatgtt cattgtttac tageatatga ataatgtaag ttcaagcaca 2608 aeatgettte ttatttccta ctgctctcaa gaageagtta tttgttg 2655 <210> 30 <211> 838

<212> PRT

<213> Solanum tuberosum <400> 30

Met Glu Gly Gly Ala Lys Ser Asn Asp Val Ser Ala Ala Pro Ile Ala 15 10 15 - 122 - DK 177092 B1

Gin Pro Leu Ser Glu Asp Pro Thr Asp Ile Ala Ser Asn Ile Lys Tyr 20 25 30

His Ala Gin Tyr Thr Pro His Phe Ser Pro Phe Lys Phe Glu Pro Leu 35 40 45

Gin Ala Tyr Tyr Ala Ala Thr Ala Asp Ser Val Arg Asp Arg Leu Ile 50 55 60

Lys Gin Trp Asn Asp Thr Tyr Leu His Tyr Asp Lys Val Asn Pro Lys 65 70 75 80

Gin Thr Tyr Tyr Leu Ser Met Glu Tyr Leu Gin Gly Arg Ala Leu Thr 85 90 95

Asn Ala Val Gly Asn Leu Asp Ile His Asn Ala Tyr Ala Asp Ala Leu 100 105 110

Asn Lys Leu Gly Gin Gin Leu Glu Glu Val Val Glu Gin Glu Lys Asp 115 120 125

Ala Ala Leu Gly Asn Gly Gly Leu Gly Arg Leu Ala Ser Cys Phe Leu 130 135 140

Asp Ser Met Ala Thr Leu Asn Leu Pro Ala Trp Gly Tyr Gly Leu Arg 145 150 155 160

Tyr Arg Tyr Gly Leu Phe Lys Gin Leu Ile Thr Lys Ala Gly Gin Glu 165 170 175

Glu Val Pro Glu Asp Trp Leu Glu Lys Phe Ser Pro Trp Glu Ile Val 180 185 190

Arg His Asp Val Val Phe Pro Ile Arg Phe Phe Gly His Val Glu Val 195 200 205

Leu Pro Ser Gly Ser Arg Lys Trp Val Gly Gly Glu Val Leu Gin Ala 210 215 220

Leu Ala Tyr Asp Val Pro Ile Pro Gly Tyr Arg Thr Lys Asn Thr Asn 225 230 235 240

Ser Leu Arg Leu Trp Glu Ala Lys Ala Ser Ser Glu Asp Phe Asn Leu 245 250 255 -123 - DK 177092 B1

Phe Leu Phe Asn Asp Gly Gin Tyr Asp Ala Ala Ala Gin Leu His Ser 260 265 270

Arg Ala Gin Gin Ile Cys Ala Val Leu Tyr Pro Gly Asp Ala Thr Glu 275 280 285

Asn Gly Lys Leu Leu Arg Leu Lys Gin Gin Phe Phe Leu Cys Ser Ala 290 295 300

Ser Leu Gin Asp Ile Ile Ala Arg Phe Lys Glu Arg Glu Asp Gly Lys 305 310 315 320

Gly Ser His Gin Trp Ser Glu Phe Pro Lys Lys Val Ala Ile Gin Leu 325 330 335

Asn Asp Thr His Pro Thr Leu Thr Ile Pro Glu Leu Met Arg Leu Leu 340 345 350

Met Asp Asp Glu Gly Leu Gly Trp Asp Glu Ser Trp Asn Ile Thr Thr 355 360 365

Arg Thr Ile Ala Tyr Thr Asn His Thr Val Leu Pro Glu Ala Leu Glu 370 375 380

Lys Trp Ser Gin Ala Val Met Trp Lys Leu Leu Pro Arg His Met Glu 385 390 395 400

Ile Ile Glu Glu Ile Asp Lys Arg Phe Val Ala Thr Ile Met Ser Glu 405 410 415

Arg Pro Asp Leu Glu Asn Lys Met Pro Ser Met Arg Ile Leu Asp His 420 425 430

Asn Ala Thr Lys Pro Val Val His Met Ala Asn Leu Cys Val Val Ser 435 440 445

Ser His Thr Val Asn Gly Val Ala Gin Leu His Ser Asp Ile Leu Lys 450 455 460

Ala Glu Leu Phe Ala Asp Tyr Val Ser Val Trp Pro Thr Lys Phe Gin 465 470 475 480

Asn Lys Thr Asn Gly Ile Thr Pro Arg Arg Trp Ile Arg Phe Cys Ser -124- DK 177092 B1 485 490 495

Pro Glu Leu Ser His Ile Ile Thr Lys Trp Leu Lys Thr Asp Gin Trp 500 505 510

Val Thr Asn Leu Glu Leu Leu Ala Asn Leu Arg Glu Phe Ala Asp Asn 515 520 525

Ser Glu Leu His Ala Glu Trp Glu Ser Ala Lys Met Ala Asn Lys Gin 530 535 540

Arg Leu Ala Gin Tyr Ile Leu His Val Thr Gly Val Ser Ile Asp Pro 545 550 555 560

Asn Ser Leu Phe Asp Ile Gin Val Lys Arg Ile His Glu Tyr Lys Arg 565 570 575

Gin Leu Leu Asn Ile Leu Gly Val Ile Tyr Arg Tyr Lys Lys Leu Lys 580 585 590

Gly Met Ser Pro Glu Glu Arg Lys Asn Thr Thr Pro Arg Thr Val Met 595 600 605

Ile Gly Gly Lys Ala Phe Ala Thr Tyr Thr Asn Ala Lys Arg Ile Val 610 615 620

Lys Leu Val Thr Asp Val Gly Asp Val Val Asn Ser Asp Pro Asp Val 625 630 635 640

Asn Asp Tyr Leu Lys Val Val Phe Val Pro Asn Tyr Asn Val Ser Val 645 650 655

Ala Glu Met Leu Ile Pro Gly Ser Glu Leu Ser Gin His Ile Ser Thr 660 665 670

Ala Gly Met Glu Ala Ser Gly Thr Ser Asn Met Lys Phe Ala Leu Asn 675 680 685

Gly Cys Leu Ile Ile Gly Thr Leu Asp Gly Ala Asn Val Glu Ile Arg 690 695 700

Glu Glu Ile Gly Glu Asp Asn Phe Phe Leu Phe Gly Ala Thr Ala Asp 705 710 715 720 -125- DK 177092 B1

Glu Val Pro Gin Leu Arg Lys Asp Arg Glu Asn Gly Leu Phe Lys Pro 725 730 735

Asp Pro Arg Phe Glu Glu Ala Lys Gin Phe Ile Arg Ser Gly Ala Phe 740 745 750

Gly Thr Tyr Asp Tyr Asn Pro Leu Leu Glu Ser Leu Glu Gly Asn Ser 755 760 765

Gly Tyr Gly Arg Gly Asp Tyr Phe Leu Val Gly His Asp Phe Pro Ser 770 775 780

Tyr Met Asp Ala Gin Ala Arg Val Asp Glu Ala Tyr Lys Asp Arg Lys 785 790 795 800

Arg Trp Ile Lys Met Ser Ile Leu Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Phe 805 810 815

Ser Ser Asp Arg Thr Ile Ser Gin Tyr Ala Lys Glu Ile Trp Asn Ile 820 825 830

Ala Glu Cys Arg Val Pro 835 <210> 31

<211> 1618 <212> DNA

<213> Ipomoea batatas <220> <221> CDS <222> (2)..(1618) <400> 31 c ttg gga agg ctt get tet tgc ttt ett gat tee atg gea aca tta aac 49

Leu Gly Arg Leu Ala Ser Cys Phe Leu Asp Ser Met Ala Thr Leu Asn 15 10 15 ttg cca gcc tgg ggt tat gga ttg agg tac aaa cat gga ctg ttc aag 97

Leu Pro Ala Trp Gly Tyr Gly Leu Arg Tyr Lys His Gly Leu Phe Lys 20 25 30 caa egt ate acc aaa gea gga caa gag gag att get gaa gat tgg ctg 145

Gin Arg Ile Thr Lys Ala Gly Gin Glu Glu Ile Ala Glu Asp Trp Leu 35 40 45 gag aaa ttc agt ccc tgg gaa gtt gea agg cat gac att gtc ttc ccc 193

Glu Lys Phe Ser Pro Trp Glu Val Ala Arg His Asp Ile Val Phe Pro 50 55 60 - 126- DK 177092 B1 atc aga ttt ttt ggt cac gtt gag gtt gat cct agt ggc tcc cgg aaa 241

Ile Arg Phe Phe Gly His Val Glu Val Asp Pro Ser Gly Ser Arg Lys 65 70 75 80 tgg gtt ggt ggt gag gtc ata cag get gtt gea tat gat gtt cct att 289

Trp Val Gly Gly Glu Val Ile Gin Ala Val Ala Tyr Asp Val Pro Ile 85 90 95 cct ggg tat aaa aca aag aat act att agt ett ega eta tgg gaa gcc 337

Pro Gly Tyr Lys Thr Lys Asn Thr Ile Ser Leu Arg Leu Trp Glu Ala 100 105 110 aaa gcc agt gea gag gac tta aac tta tet caa ttt aat gat ggg caa 385

Lys Ala Ser Ala Glu Asp Leu Asn Leu Ser Gin Phe Asn Asp Gly Gin 115 120 125 tat gaa tet get aca ctg ett cat tet egg get cat cag att tgt get 433

Tyr Glu Ser Ala Thr Leu Leu His Ser Arg Ala His Gin Ile Cys Ala 130 135 140 gtc ett tac cct ggg gat gea aeg gaa agt gga aaa ett tta ega ett 481

Val Leu Tyr Pro Gly Asp Ala Thr Glu Ser Gly Lys Leu Leu Arg Leu 145 150 155 160 aaa caa caa ttt ttg ctg tgt agt gea tet ett cag gac atc ata tte 529

Lys Gin Gin Phe Leu Leu Cys Ser Ala Ser Leu Gin Asp Ile Ile Phe 165 170 175 aga ttt aag gag agg aat gat ggg aag ggc act ett gat tgg tcc aca 577

Arg Phe Lys Glu Arg Asn Asp Gly Lys Gly Thr Leu Asp Trp Ser Thr 180 185 190 tte ccc aca aaa gtt gea gta caa ctg aat gac aca cat cct aeg etc 625

Phe Pro Thr Lys Val Ala Val Gin Leu Asn Asp Thr His Pro Thr Leu 195 200 205 teg att ccg gag ctg atg cgg tta ttg atg gat gat gaa gga ett gga 673

Ser Ile Pro Glu Leu Met Arg Leu Leu Met Asp Asp Glu Gly Leu Gly 210 215 220 tgg gat gaa gea tgg gat ata acc act agg aca ate get tat aca aat 721

Trp Asp Glu Ala Trp Asp Ile Thr Thr Arg Thr Ile Ala Tyr Thr Asn 225 230 235 240 cat acc gtc eta eet gaa gea eta gaa aaa tgg tea caa gea gtc atg 769

His Thr Val Leu Pro Glu Ala Leu Glu Lys Trp Ser Gin Ala Val Met 245 250 255 tgg aaa ett ett cca egg cat atg gaa atc att gag gaa atc gac aag 817

Trp Lys Leu Leu Pro Arg His Met Glu Ile Ile Glu Glu Ile Asp Lys 260 265 270 cgg ttt att gea atg ata caa tea aag ata cct aat ett gag agt aag 865

Arg Phe Ile Ala Met Ile Gin Ser Lys Ile Pro Asn Leu Glu Ser Lys 275 280 285 atc tet gcc ata tgc att ttg gat cac aat ccc cag aag cct gtt gtg 913

Ile Ser Ala Ile Cys Ile Leu Asp His Asn Pro Gin Lys Pro Val Val 290 295 300 -127- DK 177092 B1 cgt atg get aat ttg tgt gtc ate tet teg cat aeg gtg aat ggt gtt 961

Arg Met Ala Asn Leu Cys Val Ile Ser Ser His Thr Val Asn Gly Val 305 310 315 320 gcc cag eta cac agt gat atc ttg aag gat gaa tta tte atc gac tat 1009

Ala Gin Leu His Ser Asp Ile Leu Lys Asp Glu Leu Phe Ile Asp Tyr 325 330 335 gtc tet atc tgg ccc acc aaa tte cag aac aaa acc aac ggc ata aca 1057

Val Ser Ile Trp Pro Thr Lys Phe Gin Asn Lys Thr Asn Gly Ile Thr 340 345 350 cca egg egg tgg ett agg ttt tgc aat ccc gag ctg agt gat ata atc 1105

Pro Arg Arg Trp Leu Arg Phe Cys Asn Pro Glu Leu Ser Asp Ile Ile 355 360 365 acc aag tgg tta aaa act gat gaa tgg gtg act aat ett gat ttg ett 1153

Thr Lys Trp Leu Lys Thr Asp Glu Trp Val Thr Asn Leu Asp Leu Leu 370 375 380 act aat ctg egg aag ttt get gac gat gaa caa etc cat get caa tgg 1201

Thr Asn Leu Arg Lys Phe Ala Asp Asp Glu Gin Leu His Ala Gin Trp 385 390 395 400 gag tet gcc aag atg gea age aag caa ega ttg gcg cag tac ata ctg 1249

Glu Ser Ala Lys Met Ala Ser Lys Gin Arg Leu Ala Gin Tyr Ile Leu 405 410 415 ega gta acc ggt gtg egt gtt gac cca aat aca eta ttt gac ata caa 1297

Arg Val Thr Gly Val Arg Val Asp Pro Asn Thr Leu Phe Asp Ile Gin 420 425 430 gtc aag ege att cac gaa tac aaa agg cag ctg eta aat gta ttg ggt 1345

Val Lys Arg Ile His Glu Tyr Lys Arg Gin Leu Leu Asn Val Leu Gly 435 440 445 gta gtc tac egg tac aag aaa ctg aag gag atg aaa ccc gaa gag egt 1393

Val Val Tyr Arg Tyr Lys Lys Leu Lys Glu Met Lys Pro Glu Glu Arg 450 455 460 aag aat aca aca gea ege act gtc atg etc ggg gga aaa gea ttt gcg 1441

Lys Asn Thr Thr Ala Arg Thr Val Met Leu Gly Gly Lys Ala Phe Ala 465 470 475 480 acc tat aca aat gea aaa agg atc atc aag ett gtg aeg gat gtt ggg 1489

Thr Tyr Thr Asn Ala Lys Arg Ile Ile Lys Leu Val Thr Asp Val Gly 485 490 495 gat gtt gtc aat agt gat eet gag gtc aat age tat ttg aag gta gtc 1537

Asp Val Val Asn Ser Asp Pro Glu Val Asn Ser Tyr Leu Lys Val Val 500 505 510 ttt gta ccc aat tac aac gta tet gtg gea gaa gtg ett att ccg gga 1585

Phe Val Pro Asn Tyr Asn Val Ser Val Ala Glu Val Leu Ile Pro Gly 515 520 525 agt gag ett tea cag cac ate age aca get ggc 1618

Ser Glu Leu Ser Gin His Ile Ser Thr Ala Gly DK 177092 B1 - 128 - 530 535 <210> 32 <211> 539

<212> PRT

<213> Ipomoea batatas <400> 32

Leu Gly Arg Leu Ala Ser Cys Phe Leu Asp Ser Met Ala Thr Leu Asn 15 10 15

Leu Pro Ala Trp Gly Tyr Gly Leu Arg Tyr Lys His Gly Leu Phe Lys 20 25 30

Gin Arg Ile Thr Lys Ala Gly Gin Glu Glu Ile Ala Glu Asp Trp Leu 35 40 45

Glu Lys Phe Ser Pro Trp Glu Val Ala Arg His Asp Ile Val Phe Pro 50 55 60

Ile Arg Phe Phe Gly His Val Glu Val Asp Pro Ser Gly Ser Arg Lys 65 70 75 80

Trp Val Gly Gly Glu Val Ile Gin Ala Val Ala Tyr Asp Val Pro Ile 85 90 95

Pro Gly Tyr Lys Thr Lys Asn Thr Ile Ser Leu Arg Leu Trp Glu Ala 100 105 110

Lys Ala Ser Ala Glu Asp Leu Asn Leu Ser Gin Phe Asn Asp Gly Gin 115 120 125

Tyr Glu Ser Ala Thr Leu Leu His Ser Arg Ala His Gin Ile Cys Ala 130 135 140

Val Leu Tyr Pro Gly Asp Ala Thr Glu Ser Gly Lys Leu Leu Arg Leu 145 150 155 160

Lys Gin Gin Phe Leu Leu Cys Ser Ala Ser Leu Gin Asp Ile Ile Phe 165 170 175

Arg Phe Lys Glu Arg Asn Asp Gly Lys Gly Thr Leu Asp Trp Ser Thr 180 185 190

Phe Pro Thr Lys Val Ala Val Gin Leu Asn Asp Thr His Pro Thr Leu - 129- DK 177092 B1 195 200 205

Ser Ile Pro Glu Leu Met Arg Leu Leu Met Asp Asp Glu Gly Leu Gly 210 215 220

Trp Asp Glu Ala Trp Asp Ile Thr Thr Arg Thr Ile Ala Tyr Thr Asn 225 230 235 240

His Thr Val Leu Pro Glu Ala Leu Glu Lys Trp Ser Gin Ala Val Met 245 250 255

Trp Lys Leu Leu Pro Arg His Met Glu Ile Ile Glu Glu Ile Asp Lys 260 265 270

Arg Phe Ile Ala Met Ile Gin Ser Lys Ile Pro Asn Leu Glu Ser Lys 275 280 285

Ile Ser Ala Ile Cys Ile Leu Asp His Asn Pro Gin Lys Pro Val Val 290 295 300

Arg Met Ala Asn Leu Cys Val Ile Ser Ser His Thr Val Asn Gly Val 305 310 315 320

Ala Gin Leu His Ser Asp Ile Leu Lys Asp Glu Leu Phe Ile Asp Tyr 325 330 335

Val Ser Ile Trp Pro Thr Lys Phe Gin Asn Lys Thr Asn Gly Ile Thr 340 345 350

Pro Arg Arg Trp Leu Arg Phe Cys Asn Pro Glu Leu Ser Asp Ile Ile 355 360 365

Thr Lys Trp Leu Lys Thr Asp Glu Trp Val Thr Asn Leu Asp Leu Leu 370 375 380

Thr Asn Leu Arg Lys Phe Ala Asp Asp Glu Gin Leu His Ala Gin Trp 385 390 395 400

Glu Ser Ala Lys Met Ala Ser Lys Gin Arg Leu Ala Gin Tyr Ile Leu 405 410 415

Arg Val Thr Gly Val Arg Val Asp Pro Asn Thr Leu Phe Asp Ile Gin 420 425 430 - 130 - DK 177092 B1

Val Lys Arg Ile His Glu Tyr Lys Arg Gin Leu Leu Asn Val Leu Gly 435 440 445

Val Val Tyr Arg Tyr Lys Lys Leu Lys Glu Met Lys Pro Glu Glu Arg 450 455 460

Lys Asn Thr Thr Ala Arg Thr Val Met Leu Gly Gly Lys Ala Phe Ala 465 470 475 480

Thr Tyr Thr Asn Ala Lys Arg Ile Ile Lys Leu Val Thr Asp Val Gly 485 490 495

Asp Val Val Asn Ser Asp Pro Glu Val Asn Ser Tyr Leu Lys Val Val 500 505 510

Phe Val Pro Asn Tyr Asn Val Ser Val Ala Glu Val Leu Ile Pro Gly 515 520 525

Ser Glu Leu Ser Gin His Ile Ser Thr Ala Gly 530 535 <210> 33 <211> 2754

<212> DNA

<213> Kunstig sekvens <220> <223> en mutant af en kartoffel type L alfa-glucanphosphorylase <220> <221> CDS <222> (1)..(2751) <220> <221> mat_peptid <222> (4)..(2751) <400> 33 atg acc ttg agt gag aaa att cac cat ccc att act gaa caa ggt ggt 48

Met Thr Leu Ser Glu Lys Ile His His Pro Ile Thr Glu Gin Gly Gly -11 5 10 15 gag age gac ctg agt tet ttt get cct gat gcc gea tet att acc tea 96

Glu Ser Asp Leu Ser Ser Phe Ala Pro Asp Ala Ala Ser Ile Thr Ser 20 25 30 agt ate aaa tac cat gea gaa ctc aca cct gta ttc tet cct gaa agg 144

Ser Ile Lys Tyr His Ala Glu Leu Thr Pro Val Phe Ser Pro Glu Arg 35 40 45 ttt gag etc cct aag gea ttc ttt gea aca get caa agt gtt egt gat 192 -131 - DK 177092 B1

Phe Glu Leu Pro Lys Ala Phe Phe Ala Thr Ala Gin Ser Val Arg Asp 50 55 60 tcg ctc ctt att aat tgg aat get aeg tat gat att tat gaa aag ctg 240

Ser Leu Leu Ile Asn Trp Asn Ala Thr Tyr Asp Ile Tyr Glu Lys Leu 65 70 75 aac atg aag caa gcg tac tat eta tee atg gaa ttt ctg cag ggt aga 288

Asn Met Lys Gin Ala Tyr Tyr Leu Ser Met Glu Phe Leu Gin Gly Arg 80 85 90 95 gea ttg tta aat gea att ggt aat ctg gag ctt act ggt gea ttt gcg 336

Ala Leu Leu Asn Ala Ile Gly Asn Leu Glu Leu Thr Gly Ala Phe Ala 100 105 110 gaa get ttg aaa aac ctt ggt cac aat eta gaa aat gtg get tet cag 384

Glu Ala Leu Lys Asn Leu Gly His Asn Leu Glu Asn Val Ala Ser Gin 115 120 125 gaa cca gat get get ctt gga agt ggg ggt ttg gga egg ctt get tee 432

Glu Pro Asp Ala Ala Leu Gly Ser Gly Gly Leu Gly Arg Leu Ala Ser 130 135 140 tgt ttt ctg gac tet ttg gea aca eta aac tac cca gea tgg ggc tat 480

Cys Phe Leu Asp Ser Leu Ala Thr Leu Asn Tyr Pro Ala Trp Gly Tyr 145 150 155 gga ctt agg tac aag tat ggt tta ttt aag caa egg att aca aaa gat 528

Gly Leu Arg Tyr Lys Tyr Gly Leu Phe Lys Gin Arg Ile Thr Lys Asp 160 165 170 175 ggt cag gag gag gtg get gaa gat tgg ctt gaa att ggc agt cca tgg 576

Gly Gin Glu Glu Val Ala Glu Asp Trp Leu Glu Ile Gly Ser Pro Trp 180 185 190 gaa gtt gtg agg aat gat gtt tea tat eet atc aaa tte tat gga aaa 624

Glu Val Val Arg Asn Asp Val Ser Tyr Pro Ile Lys Phe Tyr Gly Lys 195 200 205 gtc tet aca gga tea gat gga aag agg tat tgg att ggt gga gag gat 672

Val Ser Thr Gly Ser Asp Gly Lys Arg Tyr Trp Ile Gly Gly Glu Asp 210 215 220 ata aag gea gtt gcg tat gat gtt ccc ata cca ggg tat aag acc aga 720

Ile Lys Ala Val Ala Tyr Asp Val Pro Ile Pro Gly Tyr Lys Thr Arg 225 230 235 acc aca ate age ctt ega ctg tgg tet aca cag gtt cca tea gcg gat 768

Thr Thr Ile Ser Leu Arg Leu Trp Ser Thr Gin Val Pro Ser Ala Asp 240 245 250 255 ttt gat tta tet get tte aat get gga gag cac acc aaa gea tgt gaa 816

Phe Asp Leu Ser Ala Phe Asn Ala Gly Glu His Thr Lys Ala Cys Glu 260 265 270 gcc caa gea aac get gag aag ata tgt tac ata etc tac eet ggg gat 864

Ala Gin Ala Asn Ala Glu Lys Ile Cys Tyr Ile Leu Tyr Pro Gly Asp 275 280 285 - 132- DK 177092 B1 gaa tea gag gag gga aag ate ett egg ttg aag caa caa tat acc tta 912

Glu Ser Glu Glu Gly Lys Ile Leu Arg Leu Lys Gin Gin Tyr Thr Leu 290 295 300 tgc teg get tet etc caa gat att att tet ega ttt gag agg aga tea 960

Cys Ser Ala Ser Leu Gin Asp Ile Ile Ser Arg Phe Glu Arg Arg Ser 305 310 315 ggt gat egt att aag tgg gaa gag ttt eet gaa aaa gtt get gtg cag 1008

Gly Asp Arg Ile Lys Trp Glu Glu Phe Pro Glu Lys Val Ala Val Gin 320 325 330 335 atg aat gac act cac eet aca ett tgt atc eet gag ctg atg aga ata 1056

Met Asn Asp Thr His Pro Thr Leu Cys Ile Pro Glu Leu Met Arg Ile 340 345 350 ttg ata gat ctg aag ggc ttg aat tgg aat gaa get tgg aat att act 1104

Leu Ile Asp Leu Lys Gly Leu Asn Trp Asn Glu Ala Trp Asn Ile Thr 355 360 365 caa aga act gtg gee tac aca aac cat act gtt ttg eet gag gea ctg 1152

Gin Arg Thr Val Ala Tyr Thr Asn His Thr Val Leu Pro Glu Ala Leu 370 375 380 gag aaa tgg agt tat gaa ttg atg cag aaa ctg ett ccc aga cat gtc 1200

Glu Lys Trp Ser Tyr Glu Leu Met Gin Lys Leu Leu Pro Arg His Val 385 390 395 gaa ate att gag geg att gac gag gag ctg gta cat gaa att gta tta 1248

Glu Ile Ile Glu Ala Ile Asp Glu Glu Leu Val His Glu Ile Val Leu 400 405 410 415 aaa tat ggt tea atg gat ctg aac aaa ttg gag gaa aag ttg act aca 1296

Lys Tyr Gly Ser Met Asp Leu Asn Lys Leu Glu Glu Lys Leu Thr Thr 420 425 430 atg aga atc tta gaa aat ttt gat ett ccc agt eet gtt get gaa tta 1344

Met Arg Ile Leu Glu Asn Phe Asp Leu Pro Ser Pro Val Ala Glu Leu 435 440 445 ttt att aag eet gaa ate tea gtt gat gat gat act gaa aca gta gaa 1392

Phe Ile Lys Pro Glu Ile Ser Val Asp Asp Asp Thr Glu Thr Val Glu 450 455 460 gtc cat gac aaa gtt gaa get tee gat aaa gtt gtg act aat gat gaa 1440

Val His Asp Lys Val Glu Ala Ser Asp Lys Val Val Thr Asn Asp Glu 465 470 475 gat gac act ggt aag aaa act agt gtg aag ata gaa gea get gea gaa 1488

Asp Asp Thr Gly Lys Lys Thr Ser Val Lys Ile Glu Ala Ala Ala Glu 480 485 490 495 aaa gac att gac aag aaa act ccc gtg agt ccg gaa cca get gtt ata 1536

Lys Asp Ile Asp Lys Lys Thr Pro Val Ser Pro Glu Pro Ala Val Ile 500 505 510 cca eet aag aag gta ege atg gee aac ttg tgt gtt gtg ggc ggc cat 1584

Pro Pro Lys Lys Val Arg Met Ala Asn Leu Cys Val Val Gly Gly His 515 520 525 -133 - DK 177092 B1 get gtt aat gga gtt get gag ate cat agt gaa att gtg aag gag gag 1632

Ala Val Asn Gly Val Ala Glu Ile His Ser Glu Ile Val Lys Glu Glu 530 535 540 gtt tte aat gac tte tat gag etc tgg ccg gaa aag tte caa aac aaa 1680

Val Phe Asn Asp Phe Tyr Glu Leu Trp Pro Glu Lys Phe Gin Asn Lys 545 550 555 aca aat gga gtg act cca aga aga tgg att egt tte tgc aat eet eet 1728

Thr Asn Gly Val Thr Pro Arg Arg Trp Ile Arg Phe Cys Asn Pro Pro 560 565 570 575 ett agt gee ate ata act aag tgg act ggt aca gag gat tgg gtc ctg 1776

Leu Ser Ala Ile Ile Thr Lys Trp Thr Gly Thr Glu Asp Trp Val Leu 580 585 590 aaa act gaa aag ttg gea gaa ttg cag aag ttt get gat aat gaa gat 1824

Lys Thr Glu Lys Leu Ala Glu Leu Gin Lys Phe Ala Asp Asn Glu Asp 595 600 605 ett caa aat gag tgg agg gaa gea aaa agg age aac aag att aaa gtt 1872

Leu Gin Asn Glu Trp Arg Glu Ala Lys Arg Ser Asn Lys Ile Lys Val 610 615 620 gtc tee ttt etc aaa gaa aag aca ggg tat tet gtt gtc cca gat gea 1920

Val Ser Phe Leu Lys Glu Lys Thr Gly Tyr Ser Val Val Pro Asp Ala 625 630 635 atg ttt gat att cag gta aaa ege att cat gag tac aag ega caa ctg 1968

Met Phe Asp Ile Gin Val Lys Arg Ile His Glu Tyr Lys Arg Gin Leu 640 645 650 655 tta aat atc tte ggc ate gtt tat egg tat aag aag atg aaa gaa atg 2016

Leu Asn Ile Phe Gly Ile Val Tyr Arg Tyr Lys Lys Met Lys Glu Met 660 665 670 aca get gea gaa aga aag act aac tte gtt eet ega gta tgc ata ttt 2064

Thr Ala Ala Glu Arg Lys Thr Asn Phe Val Pro Arg Val Cys Ile Phe 675 680 685 ggg gga aaa get ttt gee aca tat gtg caa gcc aag agg att gta aaa 2112

Gly Gly Lys Ala Phe Ala Thr Tyr Val Gin Ala Lys Arg Ile Val Lys 690 695 700 ttt ate ata gat gtt ggt get act ata aat cat gat cca gaa atc ggt 2160

Phe Ile Ile Asp Val Gly Ala Thr Ile Asn His Asp Pro Glu Ile Gly 705 710 715 gat ctg ttg aag gta gtc ttt gtg cca gat tac aat gtc agt gtt get 2208

Asp Leu Leu Lys Val Val Phe Val Pro Asp Tyr Asn Val Ser Val Ala 720 725 730 735 gaa ttg eta att eet get age gat eta tea gaa cat atc agt aeg get 2256

Glu Leu Leu Ile Pro Ala Ser Asp Leu Ser Glu His Ile Ser Thr Ala 740 745 750 gga atg gag gcc agt gga acc agt aat atg aag ttt gea atg aat ggt 2304

Gly Met Glu Ala Ser Gly Thr Ser Asn Met Lys Phe Ala Met Asn Gly - 134 - DK 177092 B1 755 760 765 tgt ate caa att ggt aca ttg gat ggc get aat gtt gaa ata agg gaa 2352

Cys Ile Gin Ile Gly Thr Leu Asp Gly Ala Asn Val Glu Ile Arg Glu 770 775 780 gag gtt gga gaa gaa aac ttc ttt etc ttt ggt get caa get cat gaa 2400

Glu Val Gly Glu Glu Asn Phe Phe Leu Phe Gly Ala Gin Ala His Glu 785 790 795 att gea ggg ett aga aaa gaa aga get gac gga aag ttt gta eet gat 2448

Ile Ala Gly Leu Arg Lys Glu Arg Ala Asp Gly Lys Phe Val Pro Asp 800 805 810 815 gaa egt ttt gaa gag gtg aag gaa ttt gtt aga age ggt get ttt ggc 2496

Glu Arg Phe Glu Glu Val Lys Glu Phe Val Arg Ser Gly Ala Phe Gly 820 825 830 tet tat aac tat gat gac eta att gga teg ttg gaa gga aat gaa ggt 2544

Ser Tyr Asn Tyr Asp Asp Leu Ile Gly Ser Leu Glu Gly Asn Glu Gly 835 840 845 ttt ggc egt get gac tat ttc ett gtg ggc aag gac ttc ccc agt tac 2592

Phe Gly Arg Ala Asp Tyr Phe Leu Val Gly Lys Asp Phe Pro Ser Tyr 850 855 860 ata gaa tgc caa gag aaa gtt gat gag gea tat cgc gac cag aaa agg 2640

Ile Glu Cys Gin Glu Lys Val Asp Glu Ala Tyr Arg Asp Gin Lys Arg 865 870 875 tgg aca aeg atg tea atc ttg aat aca gcg gga teg tac aag ttc age 2688

Trp Thr Thr Met Ser Ile Leu Asn Thr Ala Gly Ser Tyr Lys Phe Ser 880 885 890 895 agt gac aga aca atc cat gaa tat gcc aaa gac att tgg aac att gaa 2736

Ser Asp Arg Thr Ile His Glu Tyr Ala Lys Asp Ile Trp Asn Ile Glu 900 905 910 get gtg gaa ata gea taa 2754

Ala Val Glu Ile Ala 915 <210> 34 <211> 917

<212> PRT

<213> Kunstig sekvens <22 0> <223> Syntetisk konstrukt <400> 34

Met Thr Leu Ser Glu Lys Ile His His Pro Ile Thr Glu Gin Gly Gly -11 5 10 15

Glu Ser Asp Leu Ser Ser Phe Ala Pro Asp Ala Ala Ser Ile Thr Ser 20 25 30 - 135 - DK 177092 B1

Ser Ile Lys Tyr His Ala Glu Leu Thr Pro Val Phe Ser Pro Glu Arg 35 40 45

Phe Glu Leu Pro Lys Ala Phe Phe Ala Thr Ala Gin Ser Val Arg Asp 50 55 60

Ser Leu Leu Ile Asn Trp Asn Ala Thr Tyr Asp Ile Tyr Glu Lys Leu 65 70 75

Asn Met Lys Gin Ala Tyr Tyr Leu Ser Met Glu Phe Leu Gin Gly Arg 80 85 90 95

Ala Leu Leu Asn Ala Ile Gly Asn Leu Glu Leu Thr Gly Ala Phe Ala 100 105 110

Glu Ala Leu Lys Asn Leu Gly His Asn Leu Glu Asn Val Ala Ser Gin 115 120 125

Glu Pro Asp Ala Ala Leu Gly Ser Gly Gly Leu Gly Arg Leu Ala Ser 130 135 140

Cys Phe Leu Asp Ser Leu Ala Thr Leu Asn Tyr Pro Ala Trp Gly Tyr 145 150 155

Gly Leu Arg Tyr Lys Tyr Gly Leu Phe Lys Gin Arg Ile Thr Lys Asp 160 165 170 175

Gly Gin Glu Glu Val Ala Glu Asp Trp Leu Glu Ile Gly Ser Pro Trp 180 185 190

Glu Val Val Arg Asn Asp Val Ser Tyr Pro Ile Lys Phe Tyr Gly Lys 195 200 205

Val Ser Thr Gly Ser Asp Gly Lys Arg Tyr Trp Ile Gly Gly Glu Asp 210 215 220

Ile Lys Ala Val Ala Tyr Asp Val Pro Ile Pro Gly Tyr Lys Thr Arg 225 230 235

Thr Thr Ile Ser Leu Arg Leu Trp Ser Thr Gin Val Pro Ser Ala Asp 240 245 250 255

Phe Asp Leu Ser Ala Phe Asn Ala Gly Glu His Thr Lys Ala Cys Glu -136- DK 177092 B1 260 265 270

Ala Gin Ala Asn Ala Glu Lys Ile Cys Tyr Ile Len Tyr Pro Gly Asp 275 280 285

Glu Ser Glu Glu Gly Lys Ile Leu Arg Leu Lys Gin Gin Tyr Thr Leu 290 295 300

Cys Ser Ala Ser Leu Gin Asp Ile Ile Ser Arg Phe Glu Arg Arg Ser 305 310 315

Gly Asp Arg Ile Lys Trp Glu Glu Phe Pro Glu Lys Val Ala Val Gin 320 325 330 335

Met Asn Asp Thr His Pro Thr Leu Cys Ile Pro Glu Leu Met Arg Ile 340 345 350

Leu Ile Asp Leu Lys Gly Leu Asn Trp Asn Glu Ala Trp Asn Ile Thr 355 360 365

Gin Arg Thr Val Ala Tyr Thr Asn His Thr Val Leu Pro Glu Ala Leu 370 375 380

Glu Lys Trp Ser Tyr Glu Leu Met Gin Lys Leu Leu Pro Arg His Val 385 390 395

Glu Ile Ile Glu Ala Ile Asp Glu Glu Leu Val His Glu Ile Val Leu 400 405 410 415

Lys Tyr Gly Ser Met Asp Leu Asn Lys Leu Glu Glu Lys Leu Thr Thr 420 425 430

Met Arg Ile Leu Glu Asn phe Asp Leu Pro Ser Pro Val Ala Glu Leu 435 440 445

Phe Ile Lys Pro Glu Ile Ser Val Asp Asp Asp Thr Glu Thr Val Glu 450 455 460

Val His Asp Lys Val Glu Ala Ser Asp Lys Val Val Thr Asn Asp Glu 465 470 475

Asp Asp Thr Gly Lys Lys Thr Ser Val Lys Ile Glu Ala Ala Ala Glu 480 485 490 495 -137 - DK 177092 B1

Lys Asp Ile Asp Lys Lys Thr Pro Val Ser Pro Glu Pro Ala Val Ile 500 505 510

Pro Pro Lys Lys Val Arg Met Ala Asn Leu Cys Val Val Gly Gly His 515 520 525

Ala Val Asn Gly Val Ala Glu Ile His Ser Glu Ile Val Lys Glu Glu 530 535 540

Val Phe Asn Asp Phe Tyr Glu Leu Trp Pro Glu Lys Phe Gin Asn Lys 545 550 555

Thr Asn Gly Val Thr Pro Arg Arg Trp Ile Arg Phe Cys Asn Pro Pro 560 565 570 575

Leu Ser Ala Ile Ile Thr Lys Trp Thr Gly Thr Glu Asp Trp Val Leu 580 585 590

Lys Thr Glu Lys Leu Ala Glu Leu Gin Lys Phe Ala Asp Asn Glu Asp 595 600 605

Leu Gin Asn Glu Trp Arg Glu Ala Lys Arg Ser Asn Lys Ile Lys Val 610 615 620

Val Ser Phe Leu Lys Glu Lys Thr Gly Tyr Ser Val Val Pro Asp Ala 625 630 635

Met Phe Asp Ile Gin Val Lys Arg Ile His Glu Tyr Lys Arg Gin Leu 640 645 650 655

Leu Asn Ile Phe Gly Ile Val Tyr Arg Tyr Lys Lys Met Lys Glu Met 660 665 670

Thr Ala Ala Glu Arg Lys Thr Asn Phe Val Pro Arg Val Cys Ile Phe 675 680 685

Gly Gly Lys Ala Phe Ala Thr Tyr Val Gin Ala Lys Arg Ile Val Lys 690 695 700

Phe Ile Ile Asp Val Gly Ala Thr Ile Asn His Asp Pro Glu Ile Gly 705 710 715

Asp Leu Leu Lys Val Val Phe Val Pro Asp Tyr Asn Val Ser Val Ala 720 725 730 735 - 138 - DK 177092 B1

Glu Leu Leu Ile Pro Ala Ser Asp Leu Ser Glu His Ile Ser Thr Ala 740 745 750

Gly Met Glu Ala Ser Gly Thr Ser Asn Met Lys Phe Ala Met Asn Gly 755 760 765

Cys ile Gin Ile Gly Thr Leu Asp Gly Ala Asn Val Glu Ile Arg Glu 770 775 780

Glu Val Gly Glu Glu Asn Phe Phe Leu Phe Gly Ala Gin Ala His Glu 785 790 795

Ile Ala Gly Leu Arg Lys Glu Arg Ala Asp Gly Lys Phe Val Pro Asp 800 805 810 815

Glu Arg phe Glu Glu Val Lys Glu Phe Val Arg Ser Gly Ala Phe Gly 820 825 830

Ser Tyr Asn Tyr Asp Asp Leu Ile Gly Ser Leu Glu Gly Asn Glu Gly 835 840 845

Phe Gly Arg Ala Asp Tyr Phe Leu Val Gly Lys Asp Phe Pro Ser Tyr 850 855 860

Ile Glu Cys Gin Glu Lys Val Asp Glu Ala Tyr Arg Asp Gin Lys Arg 865 870 875

Trp Thr Thr Met Ser Ile Leu Asn Thr Ala Gly Ser Tyr Lys Phe Ser 880 885 890 895

Ser Asp Arg Thr Ile His Glu Tyr Ala Lys Asp Ile Trp Asn Ile Glu 900 905 910

Ala Val Glu Ile Ala 915 <210> 35 <211> 797

<212> PRT

<213> Escherichia coli <400> 35

Met Ser Gin Pro Ile Phe Asn Asp Lys Gin Phe Gin Glu Ala Leu Ser 15 10 15 -139 - DK 177092 B1

Arg Gin Trp Gin Arg Tyr Gly Leu Asn Ser Ala Ala Glu Met Thr Pro 20 25 30

Arg Gin Trp Trp Leu Ala Val Ser Glu Ala Leu Ala Glu Met Leu Arg 35 40 45

Ala Gin Pro Phe Ala Lys Pro Val Ala Asn Gin Arg His Val Asn Tyr 50 55 60

Ile Ser Met Glu Phe Leu Ile Gly Arg Leu Thr Gly Asn Asn Leu Leu 65 70 75 80

Asn Leu Gly Trp Tyr Gin Asp Val Gin Asp Ser Leu Lys Ala Tyr Asp 85 90 95

Ile Asn Leu Thr Asp Leu Leu Glu Glu Glu Ile Asp Pro Ala Leu Gly 100 105 110

Asn Gly Gly Leu Gly Arg Leu Ala Ala Cys Phe Leu Asp Ser Met Ala 115 120 125

Thr Val Gly Gin Ser Ala Thr Gly Tyr Gly Leu Asn Tyr Gin Tyr Gly 130 135 140

Leu Phe Arg Gin Ser Phe Val Asp Gly Lys Gin Val Glu Ala Pro Asp 145 150 155 160

Asp Trp His Arg Ser Asn Tyr Pro Trp Phe Arg His Asn Glu Ala Leu 165 170 175

Asp Val Gin Val Gly Ile Gly Gly Lys Val Thr Lys Asp Gly Arg Trp 180 185 190

Glu Pro Glu Phe Thr Ile Thr Gly Gin Ala Trp Asp Leu Pro Val Val 195 200 205

Gly Tyr Arg Asn Gly Val Ala Gin Pro Leu Arg Leu Trp Gin Ala Thr 210 215 220

His Ala His Pro Phe Asp Leu Thr Lys Phe Asn Asp Gly Asp Phe Leu 225 230 235 240

Arg Ala Glu Gin Gin Gly Ile Asn Ala Glu Lys Leu Thr Lys Val Leu 245 250 255 -140 - DK 177092 B1

Tyr Pro Asn Asp Asn His Thr Ala Gly Lys Lys Leu Arg Leu Met Gin 260 265 270

Gin Tyr Phe Gin Cys Ala Cys Ser Val Ala Asp Ile Leu Arg Arg His 275 280 285

His Leu Ala Gly Arg Glu Leu His Glu Leu Ala Asp Tyr Glu Val Ile 290 295 300

Gin Leu Asn Asp Thr His Pro Thr Ile Ala ile Pro Glu Leu Leu Arg 305 310 315 320

Val Leu Ile Asp Glu His Gin Met Ser Trp Asp Asp Ala Trp Ala Ile 325 330 335

Thr Ser Lys Thr Phe Ala Tyr Thr Asn His Thr Leu Met Pro Glu Ala 340 345 350

Leu Glu Arg Trp Asp val Lys Leu Val Lys Gly Leu Leu Pro Arg His 355 360 365

Met Gin Ile Ile Asn Glu Ile Asn Thr Arg Phe Lys Thr Leu Val Glu 370 375 380

Lys Thr Trp Pro Gly Asp Glu Lys Val Trp Ala Lys Leu Ala Val Val 385 390 395 400

His Asp Lys Gin Val His Met Ala Asn Leu Cys Val Val Gly Gly Phe 405 410 415

Ala Val Asn Gly Val Ala Ala Leu His Ser Asp Leu Val Val Lys Asp 420 425 430

Leu Phe Pro Glu Tyr His Gin Leu Trp Pro Asn Lys Phe His Asn Val 435 440 445

Thr Asn Gly Ile Thr Pro Arg Arg Trp Ile Lys Gin Cys Asn Pro Ala 450 455 460

Leu Ala Ala Leu Leu Asp Lys Ser Leu Gin Lys Glu Trp Ala Asn Asp 465 470 475 480

Leu Asp Gin Leu Ile Asn Leu Val Lys Leu Ala Asp Asp Ala Lys Phe - 141 - DK 177092 B1 485 490 495

Arg Asp Leu Tyr Arg Val Ile Lys Gin Ala Asn Lys Val Arg Leu Ala 500 505 510

Glu Phe Val Lys Val Arg Thr Gly Ile Asp Ile Asn Pro Gin Ala Ile 515 520 525

Phe Asp Ile Gin Ile Lys Arg Leu His Glu Tyr Lys Arg Gin His Leu 530 535 540

Asn Leu Leu His Ile Leu Ala Leu Tyr Lys Glu Ile Arg Glu Asn Pro 545 550 555 560

Gin Ala Asp Arg Val Pro Arg Val Phe Leu Phe Gly Ala Lys Ala Ala 565 570 575

Pro Gly Tyr Tyr Leu Ala Lys Asn Ile Ile Phe Ala Ile Asn Lys Val 580 585 590

Ala Asp Val Ile Asn Asn Asp Pro Leu Val Gly Asp Lys Leu Lys Val 595 600 605

Val Phe Leu Pro Asp Tyr Cys Val Ser Ala Ala Glu Lys Leu Ile Pro 610 615 620

Ala Ala Asp Ile Ser Glu Gin Ile Ser Thr Ala Gly Lys Glu Ala Ser 625 630 635 640

Gly Thr Gly Asn Met Lys Leu Ala Leu Asn Gly Ala Leu Thr Val Gly 645 650 655

Thr Leu Asp Gly Ala Asn Val Glu Ile Ala Glu Lys Val Gly Glu Glu 660 665 670

Asn Ile Phe Ile Phe Gly His Thr Val Lys Gin Val Lys Ala Ile Leu 675 680 685

Ala Lys Gly Tyr Asp Pro Val Lys Trp Arg Lys Lys Asp Lys Val Leu 690 695 700

Asp Ala Val Leu Lys Glu Leu Glu Ser Gly Lys Tyr Ser Asp Gly Asp 705 710 715 720 - 142 - DK 177092 B1

Lys His Ala Phe Asp Gin Met Leu His Ser Ile Gly Lys Gin Gly Gly 725 730 735

Asp Pro Tyr Leu Val Met Ala Asp Phe Ala Ala Tyr Val Glu Ala Gin 740 745 750

Lys Gin Val Asp Val Leu Tyr Arg Asp Gin Glu Ala Trp Thr Arg Ala 755 760 765

Ala Ile Leu Asn Thr Ala Arg Cys Gly Met Phe Ser Ser Asp Arg Ser 770 775 780

Ile Arg Asp Tyr Gin Ala Arg Ile Trp Gin Ala Lys Arg 785 790 795 <210> 36 <211> 37

<212> DNA

<213> Kunstig sekvens <220> <223> sekvens af forbindelsesportion af plasmid og gen <400> 36 acccaaatcg ataggaggaa aacatatgac cttgagt 37 <210> 37 <211> 38

<212> DNA

<213> Kunstig sekvens <220> <223> sekvens af forbindelsesportion af plasmid og gen <400> 37 gcataagagg gggaagtgaa tgaaaaggta ccttcggg 38 <210> 38 <211> 41

<212> DNA

<213> Kunstig sekvens <220> <223> primersekvens <400> 38 aaatcgatag gaggaaaaca tatgaccttg agtgagaaaa t 41 <210> 39 <211> 29

<212> DNA

- 143 - DK 177092 B1 <213> Kunstig sekvens <220> <223> primersekvens <400> 39 gaaggtacct tttcattcac ttccccctc 29 <210> 40 <211> 32

<212> DNA

<213> Kunstig sekvens <220> <223> primersekvens <400> 40 ttcggatcct caccttgagt gagaaaattc ac 32 <210> 41 <211> 29

<212> DNA

<213> Kunstig sekvens <220> <223> primersekvens <400> 41 ttcggatcct tttcattcac ttccccctc 29 <210> 42 <211> 71

<212> DNA

<213> Kunstig sekvens <220> <223> primersekvens <400> 42 aaatcgatag gaggaaaaca tatggcaaac gccaatggaa aagctgcgac tagtttaccg 60 gagaaaatct c 71 <210> 43 <211> 59

<212> DNA

<213> Kunstig sekvens <220> <223> primersekvens <400> 43 gaaggtacct tagggaacag gacaagcctc aatgttccaa atctctttgg catactgag 59 DK 177092 B1 -144- <210> 44 <211> 9

<212> PRT

<213> Solanum tuberosum <400> 44

His Ala Glu Phe Thr Pro Val Phe Ser 1 5 <210> 45 <211> 9

<212> PRT

<213> Oryza sativa <400> 45

His Ala Gin Tyr Ser Pro His Phe Ser 1 5 <210> 46

<211> 8 <212> PRT

<213> Solanum tuberosum <400> 46

Ala Leu Gly Asn Gly Gly Leu Gly 1 5 <210> 47 <211> 9

<212> PRT

<213> Solanum tuberosum <400> 47

Arg Ile Val Lys Phe Ile Thr Asp Val 1 5 <210> 48 <211> 9

<212> PRT

<213> Oryza sativa <400> 48

Arg Ile Val Lys Leu Val Asn Asp Val 1 5

Claims

1 DK 177092 B1 1. α-glucanphosphorylase med forbedret termostabilitet, som opnås ved at modificere en naturlig a-glucanphosphorylase, 5 hvor den naturlige α-glucanphosphorylase stammer fra en plante, og hvor (I) den naturlige α-glucanphosphorylase inkluderer en motivsekvens 1L: H-A-E-F-T-P-V-F-S, og hvor α-glucanphosphorylasen med forbedret termostabilitet har en aminosyrerest l, L eller V i position 4 i motivsekvensen 1L; 10 (II) den naturlige α-glucanphosphorylase inkludereren motivsekvens 1Ha: H-A- Q-Y-T-P-H-F-S, og hvor α-glucanphosphorylasen med forbedret termostabilitet har en aminosyrerest L i position 4 i motivsekvensen 1Ha; (III) den naturlige α-glucanphosphorylase inkluderer en motivsekvens 1Hb: H-A-K-Y-S-P-H-F-S, og hvor α-glucanphosphorylasen med forbedret 15 termostabilitet har en aminosyrerest L i position 4 i motivsekvensen 1 Hb; (IV) den naturlige α-glucanphosphorylase inkluderer en motivsekvens 2: A-L-G-N-G-G-L-G og hvor α-glucanphosphorylasen med forbedret termostabilitet har en aminosyrerest A, C, D, E, G, Η, I, L, M, F, S, T, V eller Y i position 4 i motivsekvensen 2; 20 (V) den naturlige α-glucanphosphorylase inkluderer en motivsekvens 3L: R-l-V- K-F-l-T-D-V og hvor α-glucanphosphorylasen med forbedret termostabilitet har en aminosyrerest C, I, L, M eller W i position 7 i motivsekvensen 3; (VI) den naturlige α-glucanphosphorylase inkluderer en motivsekvens 3Ha: R-l-V-K-L-V-T-D-V og hvor α-glucanphosphorylasen med forbedret 25 termostabilitet har en aminosyrerest I i position 7 i motivsekvensen 3Ha; eller (Vil) den naturlige α-glucanphosphorylase inkluderer en motivsekvens 3Hb: R-l-V-K-L-V-N-D-V og hvor α-glucanphosphorylasen med forbedret termostabilitet har en aminosyrerest I i position 7 i motivsekvensen 3Hb; 30 hvor α-glucanphosphorylase med forbedret termostabilitet har den samme aminosyresekvens som den naturlige α-glucanphosphorylase med undtagelse af substitutionen som defineret i (l-Vil) eller en aminosyresekvens i hvilken, udover en substitution som defineret i (l-VII), en eller flere aminosyrerester erdeleteret, substitueret eller tilføjet til en aminosyresekvens af en naturlige a-glucanphosphoryla- 35 se;

2 DK 177092 B1 hvor enzymeaktiviteten af α-glucanphosphorylasen med forbedret termostabilitet er ækvivalent med eller bedre end den naturlige α-glucanphosphorylase og hvor enzymaktiviteten af α-glucanphosphorylasen med forbedret termostabilitet ved 37°C efter opvarmning i en 20 mM citratbuffer (pH 6,7) ved 60°C i 10 minutter er 20% 5 eller mere af enzymaktiviteten af α-glucanphosphorylasen med forbedret termostabilitet ved 37°C før opvarmning. 2. α-glucanphosphorylase med forbedret termostabilitet ifølge krav 1, hvor (I) den naturlige α-glucanphosphorylase inkluderer en motivsekvens 1L: H-A-

10 E-F-T-P-V-F-S, og hvor α-glucanphosphorylasen med forbedret termostabilitet har en aminosyrerest I, L eller V i position 4 i motivsekvensen 1L; (II) den naturlige α-glucanphosphorylase inkludereren motivsekvens 1Ha: H-A-Q-Y-T-P-H-F-S, og hvor α-glucanphosphorylasen med forbedret 15 termostabilitet haren aminosyrerest L i position 4 i motivsekvensen 1Ha; (III) den naturlige α-glucanphosphorylase inkluderer en motivsekvens 1Hb: H-A-K-Y-S-P-H-F-S, og hvor α-giucanphosphorylasen med forbedret termostabilitet har en aminosyrerest L i position 4 i motivsekvensen 1Hb; (V) den naturlige α-glucanphosphorylase inkluderer en motivsekvens 3L: R-l-V-

20 K-F-l-T-D-V og hvor α-glucanphosphorylasen med forbedret termostabilitet har en aminosyrerest C, I, L, M eller W i position 7 i motivsekvensen 3; (VI) den naturlige α-glucanphosphorylase inkludereren motivsekvens 3Ha: R-l-V-K-L-V-T-D-V og hvor α-glucanphosphorylasen med forbedret termostabilitet har en aminosyrerest I i position 7 i motivsekvensen 3Ha; 25 eller (VII) den naturlige α-glucanphosphorylase inkludereren motivsekvens 3Hb: R-l· V-K-L-V-N-D-V og hvor α-glucanphosphorylasen med forbedret termostabilitet har en aminosyrerest I i position 7 i motivsekvensen 3Hb. 30 3. α-glucanphosphorylase med forbedret termostabilitet ifølge krav 1, hvor den naturlige α-glucanphosphorylase er en type L α-glucanphosphorylase og (I) den naturlige α-glucanphosphorylase inkluderer en motivsekvens 1L: H-A-E-F-T-P-V-F-S, og hvor α-glucanphosphorylasen med forbedret termostabilitet har en aminosyrerest I, L eller V i position 4 i motivsekvensen 35 1L;

3 DK 177092 B1 (IV) den naturlige α-glucanphosphorylase inkluderer en motivsekvens 2: A-L-G-N-G-G-L-G og hvor α-glucanphosphorylasen med forbedret termostabilitet har en aminosyrerest A, C, D, E, G, Η, I, L, M, F, S, T, V eller Y i position 4 i motivsekvensen 2; eller 5 (V) den naturlige α-glucanphosphorylase inkluderer en motivsekvens 3L: R-l-V- K-F-l-T-D-V og hvor α-glucanphosphorylasen med forbedret termostabilitet har en aminosyrerest C, I, L, M eller W i position 7 i motivsekvensen 3. 4. α-glucanphosphorylase med forbedret termostabilitet ifølge krav 1, hvor den 10 naturlige α-glucanphosphorylase er en type H α-glucanphosphorylase og hvor (II) den naturlige α-glucanphosphorylase inkluderer en motivsekvens 1Ha: H-A-Q-Y-T-P-H-F-S, og hvor α-glucanphosphorylasen med forbedret termostabilitet har en aminosyrerest L i position 4 i motivsekvensen 1 Ha; (III) den naturlige α-glucanphosphorylase inkluderer en motivsekvens 1 Hb; H-A-

15 K-Y-S-P-H-F-S, og hvor α-glucanphosphorylasen med forbedret termostabilitet har en aminosyrerest L i position 4 i motivsekvensen 1 Hb; (IV) den naturlige α-glucanphosphorylase inkluderer en motivsekvens 2: A-L-G-N-G-G-L-G og hvor α-glucanphosphorylasen med forbedret termostabilitet har en aminosyrerest A, C, D, E, G, Η, I, L, M, F, S, T, V eller Y i position 4 i 20 motivsekvensen 2; (VI) den naturlige α-glucanphosphorylase inkluderer en motivsekvens 3Ha: R-l-V-K-L-V-T-D-V og hvor α-glucanphosphorylasen med forbedret termostabilitet har en aminosyrerest I i position 7 i motivsekvensen 3Ha; eller 25 (VII) den naturlige α-glucanphosphorylase inkluderer en motivsekvens 3Hb: R-l-V-K-L-V-N-D-V og hvor α-glucanphosphorylasen med forbedret termostabilitet har en aminosyrerest I i position 7 i motivsekvensen 3Hb. 5. α-glucanphosphorylase med forbedret termostabilitet ifølge krav 1, hvor amino- 30 syresekvensen af den naturlige α-glucanphosphorylase er valgt fra gruppen bestående af: position 1 til position 916 af SEQ ID NO: 2; position 1 til position 912 af SEQ ID NO: 4; position 1 til position 893 af SEQ ID NO: 6; position 1 til position 939 af SEQ ID NO: 8; position 1 til position 962 af SEQ ID NO: 10; position 1 til position 971 af SEQ ID NO: 12; position 1 til position 983 af SEQ ID NO: 14; position 1 til position 928 af SEQ ID 35 NO: 16; position 1 til position 951 af SEQ ID NO: 18; position 1 til position 832 af SEQ

4 DK 177092 B1 ID NO: 20; position 1 til position 840 af SEQ ID NO: 22; position 1 til position 841 af SEQ ID NO: 24; position 1 til position 842 af SEQ ID NO: 26; position 1 til position 841 af SEQ ID NO: 28; og position 1 til position 838 af SEQ ID NO: 30. 6. oglucanphosphorylase med forbedret termostabilitet ifølge Krav 1, hvor den naturlige α-glucanphosphorylase stammer fra kartoffel eller Arabidopsis thaliana. 7. α-glucanphosphorylase med forbedret termostabilitet ifølge krav 1, hvor den naturlige α-glucanphosphorylase inkluderer mindst to motivsekvenser valgt fra 10 mindst to af følgende grupper af motivsekvenser; (i) 1L, 1Ha og 1 Hb, (ii) 2, (iii) 3L, 3Ha og 3Hb. 15 8. α-glucanphosphorylase med forbedret termostabilitet ifølge krav 1, hvor den naturlige α-glucanphosphorylase inkludere en motivsekvens valgt fra hver af følgende grupper af motivsekvenser (i) 1L, 1Ha og 1 Hb, (ii) 2, 20 (iii) 3L, 3Ha og 3Hb. 9. oglucanphosphorylase med forbedret termostabilitet ifølge krav 1, hvor (I) den naturlige α-glucanphosphorylase inkluderer en motivsekvens 1L: H-A- E-F-T-P-V-F-S, og hvor α-glucanphosphorylasen med forbedret 25 termostabilitet har en aminosyrerest I, L eller V i position 4 i motivsekvensen 1L; (II) den naturlige α-glucanphosphorylase inkluderer en motivsekvens 1Ha: H-A- Q-Y-T-P-H-F-S, og hvor oglucanphosphorylasen med forbedret termostabilitet har en aminosyrerest L i position 4 i motivsekvensen 1 Ha; 30 (III) den naturlige α-glucanphosphorylase inkluderer en motivsekvens 1Hb: H-A-K-Y-S-P-H-F-S, og hvor α-glucanphosphorylasen med forbedret termostabilitet har en aminosyrerest L i position 4 i motivsekvensen 1 Hb. 10. oglucanphosphorylase med forbedret termostabilitet ifølge krav 1, hvor

5 DK 177092 B1 (I) den naturlige α-glucanphosphorylase inkluderer en motivsekvens 1L: H-A-E-F-T-P-V-F-S, og hvor α-glucanphosphorylasen med forbedret termostabilitet har en aminosyrerest I eller L i position 4 i motivsekvensen 1L 5 11. α-glucanphosphorylase med forbedret termostabilitet ifølge krav 1, hvor (IV) den naturlige α-glucanphosphorylase inkluderer en motivsekvens 2: A-L-G-N-G-G-L-G og hvor α-glucanphosphorylasen med forbedret termostabilitet har en aminosyrerest A, C, D, E, G, Η, I, L, M, F, S, T, V eller Y i position 4 i 10 motivsekvensen 2. 12. α-glucanphosphorylase med forbedret termostabilitet ifølge krav 1, hvor (IV) den naturlige α-glucanphosphorylase inkluderer en motivsekvens 2: A-L-G-N-G-G-L-G og hvor α-glucanphosphorylasen med forbedret termostabilitet 15 har en aminosyrerest C, G, S eller V i position 4 i motivsekvensen 2. 13. α-glucanphosphorylase med forbedret termostabilitet ifølge krav 1, hvor (V) den naturlige α-glucanphosphorylase inkluderer en motivsekvens 3L: R-l-V-K-F-l-T-D-V og hvor α-glucanphosphorylasen med forbedret termostabilitet 20 har en aminosyrerest C, I, L, M eller W i position 7 i motivsekvensen 3; (VI) den naturlige α-glucanphosphorylase inkluderer en motivsekvens 3Ha: R-l-V-K-L-V-T-D-V og hvor α-glucanphosphorylasen med forbedret termostabilitet har en aminosyrerest I i position 7 i motivsekvensen 3Ha; eller 25 (VII) den naturlige α-glucanphosphorylase inkluderer en motivsekvens 3Hb: R-l-V-K-L-V-N-D-V og hvor α-glucanphosphorylasen med forbedret termostabilitet har en aminosyrerest I i position 7 i motivsekvensen 3Hb. 14. α-glucanphosphorylase med forbedret termostabilitet ifølge krav 1, hvor 30 (V) den naturlige α-glucanphosphorylase inkluderer en motivsekvens 3L: R-l-V- K-F-l-T-D-V og hvor α-glucanphosphorylasen med forbedret termostabilitet har en aminosyrerest C, I, L eller W i position 7 i motivsekvensen 3L. 15. α-glucanphosphorylase med forbedret termostabilitet ifølge krav 1, hvor 35 enzymaktiviteten ved 37°C af α-glucanphosphorylasen med forbedret termostabilitet

6 DK 177092 B1 efter opvarmning i en 20 mM citratbuffer (pH 6,7) ved 60°C i 10 minutter er 30% eller mere af enzymaktiviteten ved 37°C af a-giucanphosphorylasen med forbedret termostabilitet før opvarmningen. 5 16. a-glucanphosphorylase med forbedret termostabilitet ifølge krav 1, hvor enzymaktiviteten af a-giucanphosphorylasen med forbedret termostabilitet ved 37°C efter opvarmning i en 20 mM citratbuffer (pH 6,7) ved 65°C i 2 minutter er 10% eller mere af enzymaktiviteten af α-glucanphosphorylasen med forbedret termostabilitet ved 37°C før opvarmning. 10 17. α-glucanphosphorylase med forbedret termostabilitet ifølge krav 1, hvor lagerstabiliteten deraf er forbedret i sammenligning med den naturlige a-glucanphosphorylase. 15 18. α-glucanphosphorylase med forbedret termostabilitet ifølge krav 1, hvor a-glucan- phosphorylasen med forbedret termostabilitet har evne til at syntetisere en amylose med en vægtgennemsnitlig molekylvægt på 600 kDa eller mere.

19. Fremgangsmåde til fremstilling af α-glucanphosphorylase med forbedret 20 termostabilitet, hvilken fremgangsmåde omfatter, at: et første nukleinsyremolekyle, der omfatter en basesekvens, som koder for en første α-glucanphosphorylase, modificeres for at opnå et andet nukleinsyremolekyle, der omfatter en modificeret basesekvens; der fremstilles en ekspressionsvektor, som omfatter det andet nukleinsyremolekyle; 25 ekspressionsvektoren indføres i en celle for at udtrykke a-glucanphosphorylase med forbedret termostabilitet; og den udtrykte α-glucanphosphorylase med forbedret termostabilitet opsamles, idet den første α-glucanphosphorylase stammer fra en plante; hvor (I) den første α-glucanphosphorylase inkluderer en motivsekvens 1L: H-A-E-F-

30 T-P-V-F-S, og hvor α-glucanphosphorylasen med forbedret termostabilitet har en aminosyrerest I, L eller V i position 4 i motivsekvensen 1L; (II) den første α-glucanphosphorylase inkluderer en motivsekvens 1 Ha: H-A-Q-Y-T-P-H-F-S, og hvor α-glucanphosphorylasen med forbedret termostabilitet har en aminosyrerest L i position 4 i motivsekvensen 1Ha; ί

7 DK 177092 B1 (III) den første α-glucanphosphorylase inkluderer en motivsekvens 1 Hb: H-A-K-Y-S-P-H-F-S, og hvor a-glucanphosphorylasen med forbedret termostabilitet har en aminosyrerest L i position 4 i motivsekvensen 1Hb; (IV) den første α-glucanphosphorylase inkluderer en motivsekvens 2: A-L-G-N-

5 G-G-L-G og hvor α-glucanphosphorylasen med forbedret termostabilitet har en aminosyrerest A, C, D, E, G, Η, I, L, M, F, S, T, V eller Y i position 4 i motivsekvensen 2; (V) den første α-glucanphosphorylase inkluderer en motivsekvens 3L: R-l-V-K-F-l-T-D-V og hvor α-glucanphosphorylasen med forbedret termostabilitet 10 har en aminosyrerest C, I, L, M eller W i position 7 i motivsekvensen 3; (VI) den første α-glucanphosphorylase inkluderer en motivsekvens 3Ha: R-l-V-K-L-V-T-D-V og hvor α-glucanphosphorylasen med forbedret termostabilitet har en aminosyrerest I i position 7 i motivsekvensen 3Ha; eller (VII) den første α-glucanphosphorylase inkluderer en motivsekvens 3Hb: R-l-V-

15 K-L-V-N-D-V og hvor α-glucanphosphorylasen med forbedret termostabilitet har en aminosyrerest I i position 7 i motivsekvensen 3Hb; hvor α-glucanphosphorylasen med forbedret termostabilitet har den samme aminosyresekvens som en første α-glucanphosphorylase med undtagelse af substitutionen som defineret i (l-VII) eller en aminosyresekvens i hvilken, udover en 20 substitution som defineret i (l-VII), en eller flere aminosyrerester er deleteret, substitueret eller tilføjet til en aminosyresekvens af den første a-glucanphosphorylase; hvor enzymeaktiviteten af α-glucanphosphorylasen med forbedret termostabilitet er ækvivalent med eller bedre end den første α-glucanphosphorylase og hvor enzymaktiviteten af α-glucanphosphorylasen med forbedret termostabilitet ved 25 37°C efter opvarmning i en 20 mM citratbuffer (pH 6,7) ved 60°C i 10 minutter er 20% eller mere af enzymaktiviteten af α-glucanphosphorylasen med forbedret termostabilitet ved 37°C før opvarmning.

20. Fremgangsmåde ifølge krav 19, hvor 30 (I) den første α-glucanphosphorylase inkludereren motivsekvens 1L: H-A-E-F- T-P-V-F-S, og hvor α-glucanphosphorylasen med forbedret termostabilitet har en aminosyrerest I, L eller V i position 4 i motivsekvensen 1L; (II) den første α-glucanphosphorylase inkludereren motivsekvens 1Ha: H-A-Q-Y-T-P-H-F-S, og hvor α-glucanphosphorylasen med forbedret termostabilitet 35 har en aminosyrerest L i position 4 i motivsekvensen 1 Ha;

8 DK 177092 B1 (III) den første α-glucanphosphorylase inkluderer en motivsekvens 1 Hb: H-A-K-Y-S-P-H-F-S, og hvor α-glucanphosphorylasen med forbedret termostabilitet har en aminosyrerest L i position 4 i motivsekvensen 1Hb; (V) den første α-glucanphosphorylase inkluderer en motivsekvens 3L: R-l-V-K-

5 F-l-T-D-V og hvor α-glucanphosphorylasen med forbedret termostabilitet har en aminosyrerest C, I, L, M eller W i position 7 i motivsekvensen 3; (VI) den første α-glucanphosphorylase inkluderer en motivsekvens 3Ha: R-l-V-K-L-V-T-D-V og hvor α-glucanphosphorylasen med forbedret termostabilitet har en aminosyrerest I i position 7 i motivsekvensen 3Ha; eller 10 (VII) den første α-glucanphosphorylase inkluderer en motivsekvens 3Hb: R-l-V-K-L-V-N-D-V og hvor α-glucanphosphorylasen med forbedret termostabilitet har en aminosyrerest l i position 7 i motivsekvensen 3Hb.

21. Fremgangsmåde ifølge krav 19, hvor den første α-glucanphosphorylase er en type 15 L α-glucanphosphorylase og hvor (I) den første α-glucanphosphorylase inkludereren motivsekvens 1L: H-A-E-F-T-P-V-F-S, og hvor α-glucanphosphorylasen med forbedret termostabilitet har en aminosyrerest I, L eller V i position 4 i motivsekvensen 1L; (IV) den første α-glucanphosphorylase inkluderer en motivsekvens 2: A-L-G-N-

20 G-G-L-G og hvor α-glucanphosphorylasen med forbedret termostabilitet har en aminosyrerest A, C, D, E, G, Η, I, L, M, F, S, T, V eller Y i position 4 i motivsekvensen 2; (V) den første α-glucanphosphorylase inkluderer en motivsekvens 3L: R-l-V-K-F-l-T-D-V og hvor α-glucanphosphorylasen med forbedret termostabilitet 25 har en aminosyrerest C, I, L, M eller W i position 7 i motivsekvensen 3.

22. Fremgangsmåde ifølge krav 19, hvor den første α-glucanphosphorylase er en type H α-glucanphosphorylase og hvor (II) den første α-glucanphosphorylase inkluderer en motivsekvens 1 Ha: H-A-Q-

30 Y-T-P-H-F-S, og hvor α-glucanphosphorylasen med forbedret termostabilitet har en aminosyrerest L i position 4 i motivsekvensen 1 Ha; (III) den første α-glucanphosphorylase inkluderer en motivsekvens 1Hb: H-A-K-Y-S-P-H-F-S, og hvor α-glucanphosphorylasen med forbedret termostabilitet har en aminosyrerest L i position 4 i motivsekvensen 1 Hb;

9 DK 177092 B1 (IV) den første α-glucanphosphorylase inkluderer en motivsekvens 2: A-L-G-N-G-G-L-G og hvor a-glucanphosphorylasen med forbedret termostabilitet har en aminosyrerest A, C, D, E, G, Η, I, L, M, F, S, T, V eller Y i position 4 i motivsekvensen 2; 5 (VI) den første α-glucanphosphorylase inkluderer en motivsekvens 3Ha: R-l-V-K-L-V-T-D-V og hvor α-glucanphosphorylasen med forbedret termostabilitet har en aminosyrerest I i position 7 i motivsekvensen 3Ha; eller (VII) den første α-glucanphosphorylase inkluderer en motivsekvens 3Hb: R-l-V-K-L-V-N-D-V og hvor α-glucanphosphorylasen med forbedret termostabilitet 10 har en aminosyrerest I i position 7 i motivsekvensen 3Hb.

23. Fremgangsmåde ifølge krav 19, hvor den første α-giucanphosphorylase stammer fra kartoffel eller Arabidopsis thaliana.

24. Nukleinsyremolekyle, der omfatter en basesekvens, som koder for a-glucanphos phorylasen med forbedret termostabilitet ifølge krav 1.

25. Vektor, der omfatter et nukleinsyremolekyle ifølge krav 24.

26. Celle, der omfatter et nukleinsyremolekyle ifølge krav 24.

27. Fremgangsmåde til at syntetisere en glucan, hvilken fremgangsmåde omfatter, at en reaktionsopløsning, der indeholder α-glucanphosphorylasen med forbedret termostabilitet ifølge krav 1, en saccharosephosphorylase, saccharose, en primer og 25 uorganisk phosphorsyre eller glucose-1-phosphat, reageres til fremstilling af en glucan.

28. Fremgangsmåde til at syntetisere en glucan, hvilken fremgangsmåde omfatter, at en reaktionsopløsning, der indeholder α-glucanphosphorylasen med forbedret termostabilitet ifølge krav 1, en primer og glucose-1-phosphat, reageres til fremstilling 30 af en glucan.

29. Fremgangsmåde ifølge krav 27 eller 28, hvor reaktionen udføres ved en temperatur på fra 60°C til 75°C.

10 DK 177092 B1

30. Fremgangsmåde til at syntetisere glucose-1-phosphat, hvilken fremgangsmåde omfatter, at en reaktionsopløsning, der indeholder α-glucanphosphorylasen med forbedret termostabilitet ifølge krav 1, en glucan og uorganisk phosphorsyre, reageres til fremstilling af glucose-1-phosphat. 5

31. Fremgangsmåde ifølge krav 30, hvor reaktionen udføres ved en temperatur på fra 60°C til 75°C.