CN105002202B - 以淀粉为原料制备葡萄糖‑1‑磷酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种以淀粉为原料制备葡萄糖‑1‑磷酸的方法，包括如下步骤：(1)将编码葡聚糖磷酸化酶的基因经稀有密码子优化后连接到pET‑28a(+)质粒上，构建重组质粒pET‑28a‑GP，再转化到E.coliBL21(DE3)中，构建重组菌，诱导表达所得重组菌；(2)将诱导表达后的重组菌离心、收集菌菌体，制备重组葡聚糖磷酸化酶纯酶液；(3)将所得重组葡聚糖磷酸化酶纯酶液加入淀粉与缓冲液的混合溶液中，75‑90℃下反应，得葡萄糖‑1‑磷酸。采用本发明方法，底物转化率可达67.6％。本发明的特点在于直接利用普通淀粉，与现有的G‑1‑P生产方法相比，本发明使用普通淀粉为原料，大幅降低G‑1‑P生产的原料成本，为G‑1‑P的工业化生产奠定基础。
Description
技术领域
本发明涉及一种磷酸葡萄糖的制备方法，具体涉及一种以淀粉为原料制备葡萄糖-1磷酸的方法。
背景技术
葡萄糖-1-磷酸(G-1-P)广泛存在于动植物以及微生物中，在生物体中起着重要的作用。G-1-P是糖原等多糖降解的第一个产物，可以在葡萄糖磷酸变位酶(EC 5.4.2.2)的作用下生成葡萄糖-6-磷酸，进入EMP途径；也可以在核酸二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶的催化下合成核酸二磷酸葡萄糖(NDP-glucose)，进一步用于各种糖苷的合成等。G-1-P在医药、食品方面应用广泛，它能明显阻止脂肪肝浸润，促进骨骼及牙齿中钙的累积，以及增强钙在哺乳动物小肠内的主动运输。此外，G-1-P还可以用作抗菌剂，其铂螯合物更可用于癌症的治疗；壳聚糖/G-1-P即型水凝胶可以作为创面止血材料及药物缓释材料。
用于生产G-1-P的葡聚糖磷酸化酶可以从土豆中提取，以可溶性淀粉为原料(National Academy Science Letters 2013,36(2):133-137)。微生物是葡聚糖磷酸化酶的最主要来源，微生物产酶具有产量高、易分离等优点。1979年，Werner等人对Physarumpolycephalum中的α-葡聚糖磷酸化酶进行分离纯化并对酶学性质进行表征。该酶为糖原磷酸化酶，最适温度为30℃，最适pH为6.7。在磷酸解方向，G-1-P与鸟苷二磷酸葡萄糖对反应有抑制作用，而5’-AMP则有微弱的促进作用，可以中和G-1-P的抑制作用(EuropeanJournal of Biochemistry.1979,102:345-355)。1998年，Takata等人对嗜热脂肪芽孢杆菌中的葡聚糖磷酸化酶进行研究，发现其最适温度为50℃(Journal of Fermentation andBioengineering 1998,85(2):156-161)。由于耐高温酶具有反应速率高、不易染菌、酶稳定性好等优点，在工业应用中占有极大优势。2005年，Jungdon等人将Thermus caldophilus中编码葡聚糖磷酸化酶的基因进行克隆，在E.coli中表达，将重组葡聚糖磷酸化酶分离纯化，并对酶学性质进行表征。此重组酶的最适pH为7.0，最适温度为70℃，在低于70℃时酶较稳定，而当温度高于80℃时，酶活迅速下降。以可溶性淀粉为原料，在70℃下生产G-1-P，底物转化率达68.78％，是目前报道的以葡聚糖磷酸化酶催化制备G-1-P的最高值(ProcessBiochemistry 2005,40:3707–3713)。
目前所有的葡聚糖磷酸化酶研究中均采用可溶性淀粉为底物，而可溶性淀粉生产工艺较复杂，价格是普通淀粉的3-4倍，不适合G-1-P的大规模生产。如果能以廉价的普通淀粉代替可溶性淀粉直接用作酶催化产G-1-P的原料，则有望显著降低原料成本。目前，国内外未见有关普通淀粉制备G-1-P的报道，主要原因可能是普通淀粉在常温下不能完全糊化，很难直接利用。而目前已报道的用于合成G-1-P的葡聚糖磷酸化酶中，最高温度为70℃。一般而言，常见淀粉的糊化温度为60-70℃，完全糊化温度为65-75℃，若反应温度为70℃，不能保证淀粉完全糊化。且70℃时各淀粉的粘度较高，如5％玉米淀粉及马铃薯淀粉粘度分别为420cp及880cp。在70℃下反应，则造成底物与酶接触不充分，不利于反应进行。所以若要有效地利用淀粉，需要寻找一种反应温度更高的酶，使淀粉完全糊化，体系粘度降低。
发明内容
本发明的目的是针对G-1-P现有的生产原料价格昂贵的问题，提供一种利用廉价易得的普通淀粉生产G-1-P的方法，本发明具有原料成本低、转化率高、G-1-P产量高等优点。
一种以淀粉为原料制备葡萄糖-1-磷酸的方法，包括如下步骤：
(1)将编码葡聚糖磷酸化酶的基因经稀有密码子优化后连接到质粒上构建重组质粒，再将重组质粒转化到宿主菌中构建重组菌；诱导表达所得重组菌；
(2)将诱导表达后的重组菌离心、收集菌体，制备重组葡聚糖磷酸化酶纯酶液；
(3)将所得重组葡聚糖磷酸化酶纯酶液加入淀粉与缓冲液的混合溶液中，85-90℃下反应，得葡萄糖-1-磷酸；所述淀粉为木薯淀粉、玉米淀粉、马铃薯淀粉或小麦淀粉。
步骤(1)中所述质粒为pET-28a(+)；所述宿主菌为E.coli BL21(DE3)；因此步骤(1)进一步优选为：
将编码葡聚糖磷酸化酶的基因经稀有密码子优化后连接到pET-28a(+)质粒上，构建重组质粒pET-28a-GP，再转化到E.coli BL21(DE3)中，构建重组菌，诱导表达所得重组菌。
优选地，所述编码葡聚糖磷酸化酶的基因来源于最适温度为75℃及以上极端嗜热菌；进一步优选地，所述极端嗜热菌为硫化叶菌(Sulfolobus tokodaii)或嗜热古生菌(Pyrococcus furiosus)；最优选为嗜热古生菌(Pyrococcus furiosus)。
本发明Pyrococcus furiosus中编码葡聚糖磷酸化酶的基因在E.coli中重组表达，得到的重组酶最适温度为85-90℃，高于此前报道的其他葡聚糖磷酸化酶。本发明分别考察了5％的玉米淀粉和马铃薯淀粉在85℃保温下2h后的糊化效果，结果表明，在85℃下淀粉可以完全糊化，两者处理后的粘度分别为150cp及390cp，有利于底物与酶的充分接触，提高反应速率。
由于Pyrococcus furiosus是古生菌，培养困难、生长速率和产酶量均很低，故拟将其基因在常见的表达体系E.coli中重组表达。但由于作为古生菌的Pyrococcusfuriosus与E.coli的密码子偏爱性差异显著，若直接将其基因在E.coli中表达，会导致蛋白表达量较低。为此，本发明中对Pyrococcus furiosus中编码葡聚糖磷酸化酶的基因进行稀有密码子优化，在E.coli中重组表达，以提高酶的表达量及活力。
编码葡聚糖磷酸化酶的基因经稀有密码子优化后的碱基序列如SEQ ID NO.2所示。优化前的碱基序列如SEQ ID NO.1所示。
步骤(1)中的诱导表达在常规诱导表达培养基上进行，优选地，步骤(1)中诱导表达重组菌时的诱导条件为：在37℃下培养2-4.5h，然后加入诱导剂，25-37℃继续培养6-10小时。
进一步优选地，所述诱导剂为异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)；诱导剂的浓度为0.05-0.4mM。
最优选的诱导条件为：于37℃下培养4h后加入0.2mM IPTG，继续于28℃下诱导培养8h。此时重组葡聚糖磷酸化酶表达量最高。
步骤(2)中制备重组葡聚糖磷酸化酶纯酶液的方法为：将收集到的菌体破胞得粗酶液，将所得粗酶液在85-90℃保温20-40min使宿主菌中蛋白失活沉淀，然后离心、其沉淀，所得上清液即为重组葡聚糖磷酸化酶纯酶液。
进一步地，将收集到的菌体破胞得粗酶液，将所得粗酶液在85℃保温30min使宿主菌中蛋白失活沉淀，然后离心、其沉淀，所得上清液即为重组葡聚糖磷酸化酶纯酶液，利用此纯化方法所得纯酶酶活达27140U，酶活回收率达85.31％。
步骤(3)中在加入重组葡聚糖磷酸化酶纯酶液前对淀粉与缓冲液的混合溶液进行预处理，即：将淀粉与缓冲液的混合溶液在95-105℃下保温1.5-2.5h。进一步优选地，将淀粉与缓冲液的混合溶液在100℃下保温2h后加入重组葡聚糖磷酸化酶纯酶液开始反应，可明显提高整个反应速率，缩短反应时间。
步骤(3)中温度以80-90℃为佳，尤以85℃-90℃为宜，最优选为85℃。
优选地，步骤(3)中所加重组葡聚糖磷酸化酶纯酶液的终浓度为4500-5500U/L。
优选地，步骤(3)中85-90℃下反应时间为20-50小时。进一步优选为在85℃-90℃下反应24小时。
优选地，混合溶液中的淀粉分两次投加，一部分反应开始时投加，余下部分反应中补加。
更进一步地，混合溶液中淀粉的总质量浓度为10％，先将缓冲液和占混合液重量浓度7.5％的淀粉混合，预处理后加入酶液进行反应，85℃反应16h后补入余下的2.5％的淀粉。进行补料反应有利于提高产品的浓度。
本发明以普通淀粉为原料制备葡萄糖-1-磷酸，例如木薯淀粉、玉米淀粉、马铃薯淀粉或小麦淀粉。除以淀粉为原料外，还可以采用麦芽糊精、糖原、淀粉、可溶性淀粉等为原料。这些原料均廉价易得，大大降低生产成本。
所述缓冲液为磷酸钾缓冲液(1M)，磷酸钾缓冲液的pH值为6.0-8.0，最优选为6.6。
本发明的方法中，以玉米淀粉为原料时，最优选的技术方案为：
按照步骤(1)制备重组菌并诱导表达，将玉米淀粉加入1M磷酸钾缓冲液中(pH6.6)，100℃保温2h，同时将经过诱导的重组菌菌液离心收集菌体，破胞得粗酶液；将粗酶液在85℃保温30min，使宿主菌中蛋白失活沉淀，离心，弃沉淀，上清即为重组葡聚糖磷酸化酶纯酶液；加入到玉米淀粉/磷酸钾缓冲液中，重组酶的终浓度为5000U/L，85℃反应24h。该反应条件下最终G-1-P产量为32.52g/L，底物转化率为65％。
以马铃薯淀粉为原料时，最优选的技术方案为：
按照步骤(1)制备重组菌并诱导表达，将马铃薯淀粉加入1M磷酸钾缓冲液中(pH6.6)，100℃保温2h，同时将经过诱导的重组菌菌液离心收集菌体，破胞得粗酶液；将粗酶液在85℃保温30min，使宿主菌中蛋白失活沉淀，离心，弃沉淀，上清即为重组葡聚糖磷酸化酶纯酶液；加入到马铃薯淀粉/磷酸钾缓冲液中，重组酶的终浓度为5000U/L，85℃反应24h。该反应条件下最终G-1-P产量为33.5g/L，底物转化率为66.1％。
采用本发明方法，底物转化率可达67.6％。本发明的特点在于直接利用普通淀粉，与现有的G-1-P生产方法相比，本发明使用普通淀粉为原料，大幅降低G-1-P生产的原料成本，为G-1-P的工业化生产奠定基础。
附图说明
图1是GPase在不同温度下的比酶活。
具体实施方式
实施例1重组菌的构建
将嗜热古生菌Pyrococcus furiosus(DSM 3638)中编码葡聚糖磷酸化酶的基因根据已报道的序列(GenBank:1469411)对其中相对E.coli的稀有密码子序列进行优化，利用DNA Works完成此优化。原基因序列中约65％为稀有密码子并得到优化。优化前核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，优化后核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
将优化后的基因序列进行全合成(委托生工生物工程股份有限公司完成)，同时在基因两段分别引入Sac I和Hind Ⅲ酶切位点，采用双酶切的方法，将目的基因定向连接至表达载体。即用两种不同的限制性内切酶，Sac I和Hind Ⅲ对基因片段进行酶解，使其两端产生非互补的粘性末端。同时，质粒pET-28a(+)也用这两种限制性内切酶酶解出非互补粘性末端。基因片段与质粒通过互补的粘性末端互补，在DNA连接酶连作用下连接，构建重组质粒pET-28a-GP。参照《分子克隆实验指南(第三版)》中的方法，将重组质粒转化到E.coliBL21(DE3)感受态细胞中，构建重组菌E.coliBL21(DE3)/pET-28a-GP，诱导表达重组葡聚糖磷酸化酶。
实施例2重组葡聚糖磷酸化酶诱导条件优化
将重组菌于TB培养基中37℃下培养，考察诱导时间(2-4.5h)、诱导剂浓度(0.05-0.4mM IPTG)、诱导温度(25-37℃)及诱导后培养时间(6-10h)对重组葡聚糖磷酸化酶表达的影响。最适诱导条件为：当培养4h后加入0.2mM IPTG于28℃下诱导培养8h，此时重组葡聚糖磷酸化酶表达量最高。
TB培养基成分：蛋白胨12g，酵母提取物24g，甘油4mL溶解在0.9L水中高压灭菌。冷却到60℃，再加100mL灭菌的170mmol/LKH2PO4、720mmol/L K2HPO4的溶液。
实施例3重组葡聚糖磷酸化酶的反应条件优化
考察反应温度(60-100℃)、pH(6.0-8.0)、初始底物浓度比例(5％可溶性淀粉/0.5-2M磷酸盐缓冲液)以及常见金属离子(5mM Mg2+、Zn2+、Fe2+、Cu2+、Ca2+、Na+)对重组酶酶活的影响。反应体系为1mL，初始组成为5％可溶性淀粉/磷酸盐缓冲液，5000U/L GPase，反应30min，测定不同反应条件的酶活。
图1是GPase在不同温度下的比酶活。结果表明，温度在80℃-90℃时，酶活较高且变化较小，且85℃-90℃热稳定性较好，48h后仍维持初始酶活的95％及90％。故最适反应温度为85℃-90℃；其他最适反应条件分别为，pH 6.6、5％可溶性淀粉/1M磷酸盐缓冲液及不添加金属离子。
实施例4反应体系预处理
由于淀粉的不完全糊化造成反应体系初始粘度较高，不利于酶与底物充分接触，导致反应速度降低，延长反应时间，为了解决这一问题进行反应体系预处理。将淀粉/磷酸盐缓冲液在100℃下保温2h，并与未预处理的体系比较。结果表明，经过预处理的体系反应速度大幅提高，反应时间由未经预处理的30h缩短至24h。
实施例5以马铃薯淀粉为原料催化制备G-1-P
将5％马铃薯淀粉加入1M磷酸钾缓冲液中(pH 6.6)，100℃保温2h。同时将经过诱导的E.coli BL21(DE3)/pET-28a-GP菌液离心收集菌体，破胞，得粗酶液。将粗酶液在85℃保温30min，使宿主菌中蛋白失活沉淀。离心，弃沉淀，上清即为重组葡聚糖磷酸化酶纯酶液。加入到马铃薯淀粉/磷酸钾缓冲液中，重组酶的终浓度为5000U/L，85℃反应24h，最终G-1-P产量为33.5g/L，底物转化率为66.1％。
实施例6以木薯淀粉为原料催化制备G-1-P
将5％木薯淀粉加入1M磷酸钾缓冲液中(pH 6.6)，100℃保温2h。同时将经过诱导的E.coli BL21(DE3)/pET-28a-GP菌液离心收集菌体，破胞，得粗酶液。将粗酶液在85℃保温30min，使宿主菌中蛋白失活沉淀。离心，弃沉淀，上清即为重组葡聚糖磷酸化酶纯酶液。加入到木薯淀粉/磷酸钾缓冲液中，重组酶的终浓度为5000U/L，85℃反应24h，最终G-1-P产量为32.95g/L，底物转化率为65.9％。
实施例7以小麦淀粉为原料催化制备G-1-P
将5％小麦淀粉加入1M磷酸钾缓冲液中(pH 6.6)，100℃保温2h。同时将经过诱导的E.coli BL21(DE3)/pET-28a-GP菌液离心收集菌体，破胞，得粗酶液。将粗酶液在85℃保温30min，使宿主菌中蛋白失活沉淀。离心，弃沉淀，上清即为重组葡聚糖磷酸化酶纯酶液。加入到小麦淀粉/磷酸钾缓冲液中，重组酶的终浓度为5000U/L，85℃反应24h，最终G-1-P产量为32.53g/L，底物转化率为65.1％。
实施例8以玉米淀粉为原料催化制备G-1-P
将5％玉米淀粉加入1M磷酸钾缓冲液中(pH 6.6)，100℃保温2h。同时将经过诱导的E.coli BL21(DE3)/pET-28a-GP菌液离心收集菌体，破胞，得粗酶液。将粗酶液在85℃保温30min，使宿主菌中蛋白失活沉淀。离心，弃沉淀，上清即为重组葡聚糖磷酸化酶纯酶液。加入到玉米淀粉/磷酸钾缓冲液中，重组酶的终浓度为5000U/L，85℃反应24h，最终G-1-P产量为32.52g/L，底物转化率为65％。
实施例9以玉米淀粉为原料90℃催化制备G-1-P
将5％玉米淀粉加入1M磷酸钾缓冲液中(pH 6.6)，100℃保温2h。同时将经过诱导的E.coli BL21(DE3)/pET-28a-GP菌液离心收集菌体，破胞，得粗酶液。将粗酶液在90℃保温30min，使宿主菌中蛋白失活沉淀。离心，弃沉淀，上清即为重组葡聚糖磷酸化酶纯酶液。加入到玉米淀粉/磷酸钾缓冲液中，重组酶的终浓度为5000U/L，90℃反应24h，最终G-1-P产量为33.1g/L，底物转化率为66.2％。
实施例10以高浓度玉米淀粉为原料催化制备G-1-P
由于5％马铃薯淀粉及木薯淀粉体系初始粘度已较高，分别为420cp及400cp，不利于传质，故不适合高浓度体系催化。小麦淀粉与玉米淀粉体系相比，底物转化率相近，但底物价格较高，故玉米淀粉为最适高浓度催化底物。将10％玉米淀粉加入2M磷酸钾缓冲液中(pH 6.6)，100℃保温2h。同时将经过诱导的E.coli BL21(DE3)/pET-28a-GP菌液离心收集菌体，破胞，得粗酶液。将粗酶液在85℃保温30min，使宿主菌中蛋白失活沉淀。离心，弃沉淀，上清即为重组葡聚糖磷酸化酶纯酶液。加入到玉米淀粉/磷酸钾缓冲液中，重组酶的终浓度为5000U/L，85℃反应48h，最终G-1-P产量为56.2g/L，底物转化率为56.2％。结果表明，当以10％的玉米淀粉为底物时，由于体系粘度较大，不利于底物与酶充分接触，即使延长反应时间，转化率仍较低，有明显的底物抑制。故为了消除底物抑制及提高G-1-P产量，进行补料催化。
实施例11以玉米淀粉为原料补料催化制备G-1-P
将7.5％玉米淀粉加入1.5M磷酸钾缓冲液中(pH 6.6)，100℃保温2h，同时，将经过诱导的E.coli BL21(DE3)/pET-28a-GP菌液离心收集菌体，破胞，得粗酶液。将粗酶液在85℃保温30min，使宿主菌中蛋白失活沉淀。离心，弃沉淀，上清即为重组葡聚糖磷酸化酶纯酶液。加入到玉米淀粉/磷酸钾缓冲液中，重组酶的终浓度为5000U/L，85℃反应16h后，补入2.5％玉米淀粉+0.2M磷酸盐缓冲液，继续反应32h。最终G-1-P产量达67.6g/L，底物转化率达67.6％。
实施例12将实施例11中的G-1-P分离纯化
在实施例11中100mL含6.76g的G-1-P的反应体系中加入等体积的乙醇，使反应中未反应的淀粉沉淀，5000g离心10min，弃沉淀，取上清，调节pH至8.0。碘反应为阴性，表明体系中淀粉已完全去除。测定上清中总糖(以葡萄糖计，下同)及G-1-P含量，分别为4.5g(126.11mM)及5.0g(96.56mM)。在上清中加入5/1000(w/v)的活性炭，100rpm搅拌0.5h，利用活性炭吸附作用除去反应液中的小分子物质，如葡萄糖、麦芽三糖等。过滤除去活性炭，测定澄清液中的总糖及G-1-P含量，分别为3.2g(90mM)及4.31g(86.76mM)。将上清浓缩至50mL，加入20g乙酸镁，用氨水调节pH至8.0，4℃放置12h，充分沉淀未反应的磷酸盐。5000g离心10min，弃沉淀，上清则为G-1-P的水溶液，钼酸蓝反应为阴性，表明体系中的磷酸盐已完全去除，此时溶液中含3.76g G-1-P。在上清中添加两倍体积的乙醇，沉淀G-1-P。用乙醇洗涤沉淀三次，真空冷冻干燥，最终得G-1-P纯品3.51g，纯度为96.3％。
Claims (1)
1.一种以淀粉为原料制备葡萄糖-1-磷酸的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将编码葡聚糖磷酸化酶的基因经稀有密码子优化后连接到质粒上构建重组质粒，再将重组质粒转化到宿主菌中构建重组菌；诱导表达所得重组菌；所述编码葡聚糖磷酸化酶的基因来源于最适温度为75℃及以上极端嗜热菌；编码葡聚糖磷酸化酶的基因经稀有密码子优化后的碱基序列如SEQ ID NO.2所示；诱导表达重组菌时的诱导条件为：在37℃下培养2-4.5h，然后加入诱导剂，25-37℃继续培养6-10小时；
(2)将诱导表达后的重组菌离心、收集菌体，将收集到的菌体破胞得粗酶液，将所得粗酶液在85-90℃保温20-40min使宿主菌中蛋白失活沉淀，然后离心、其沉淀，所得上清液即为重组葡聚糖磷酸化酶纯酶液；
(3)将所得重组葡聚糖磷酸化酶纯酶液加入淀粉与缓冲液的混合溶液中，85-90℃下反应20-50小时，得葡萄糖-1-磷酸；所述淀粉为木薯淀粉、玉米淀粉、马铃薯淀粉或小麦淀粉；在加入重组葡聚糖磷酸化酶纯酶液前将淀粉与缓冲液的混合溶液在95-105℃下保温1.5-2.5h；所加重组葡聚糖磷酸化酶纯酶液的终浓度为4500-5500U/L；淀粉与缓冲液的混合溶液中淀粉的质量浓度为5-10％，混合溶液中的淀粉分两次投加，一部分反应开始时投加，余下部分反应中补加。
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| WO2004113525A1 (ja) * | 2003-06-18 | 2004-12-29 | Ezaki Glico Co., Ltd. | α−グルカンホスホリラーゼ（GP）の耐熱化方法 |
| CN101045931A (zh) * | 2007-03-12 | 2007-10-03 | 山东大学 | 一种嗜热耐高温葡聚糖磷酸化酶及其制备方法与应用 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| Accession NO：AAL81659 ，"alpha-glucan phosphorylase [Pyrococcus furiosus DSM 3638]";Maeder,D.L. et al.;《GenBank》;20140131;ORGANISM，FEATURES部分 * |
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN105002202A (zh) | 2015-10-28 |
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