JP2015530089A - 1−ケストースを得る方法 - Google Patents
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Abstract
Description
ピキア・パストリスで生産された植物由来の3種のスクロース:スクロース1−フルクトース転移酵素(1−SST)によって示されるフルクトース転移酵素(FTF)活性レベルの比較試験
上述の3種の酵素FTF活性レベルを比較するために、以前の文献[Vijnら、1998年、The Plant Journal 11:387〜398;Luscherら2000年、Plant Physiology 124:1217〜1227;Avila−Fernandezら2007年、Plant Science 173:478〜486]に記載されたプライマーを使用する逆転写(RT)−ポリメラーゼ連鎖反応法(PCR)によって、オニウシノケグサ(Festuca arundinacea)、タマネギ(Allium cepa)、及びブルーアガベ(Agave tequilana)由来の1−SST酵素をコードするcDNAをその生来の宿主から単離した。
高FTF活性を有する3つの1−sstf単一遺伝子コピークローンの発酵運転中に分析されたパラメータの平均値
ゲノムに組込まれた単一の1−sstfコピーを持つ3つのクローンを、例1に記載した同一の実験条件を使用して発酵槽レベルで比較した。
1−sstf遺伝子発現カセットの多コピーをピキア・パストリスのAOX1遺伝子座に組込むことによる1−SSTrec活性の増大
FOSを生産する経済的な工業生産技術を開発するために、高レベルの1−SSTrec活性がそのために必要とされ、宿主酵母中の遺伝子量を増加させることが求められる。
追加的な6コピーの発現カセットをAOX1遺伝子座に挿入することによる、PF6X多コピークローンの再形質転換による1−SST活性の増大
クローン1−SST PF6Xの酵素活性を増大させるために、pALS223と呼ばれる新たなプラスミドを構築した。この新たな構築物を得るために、プラスミドp1−SSTF6xを構築するのに使用した、6コピーの発現カセットを同じ転写方向に直列に含有する16.92kbの配列を、BamHIで予め消化され、アルカリホスファターゼで脱リン酸化されたベクターpPICHaCのAOX1リンカーに挿入した。
P.パストリスGIGB308株は、発酵槽規模で前躯体PF1X及びPF6Xより高い1−SST酵素活性を有し、高い生産性を示す
P.パストリスのCIGB308クローン、並びにゲノムに組込まれた発現カセットのコピーがそれぞれ1つ及び6つであるそれらの前駆体(PF1X、PF6X)を、5Lの作業容積を有する7.5Lの発酵槽中で、28℃、pH5.5、500〜900rpm、通気1.2vvm、及び20%超に制御された溶存酸素で増殖させた。組込まれた発現カセットのコピー数が異なるにもかかわらず、3つの組換え株は同様の増殖パターンを示した。
スクロースを炭素源として使用してピキア・パストリスCIGB308株を増殖させるための追加培養戦略
グリセロール以外の、スクロース又はグルコースなどのより安価な炭素源を使用することで、P.パストリスCIGB308株の発酵費用が減少する。宿主として使用されるP.パストリスGS115株にはインベルターゼ活性がないので、スクロースを炭素源として使用することができない。しかし、酵母宿主が獲得した新たなFTF活性によって、1−SSTrecがスクロースからトランスフルクトシル化反応を行う結果としてグルコースが放出され、次いでそれが組換え酵母宿主の増殖のために直接代謝される。組換え酵母株のこうした挙動により、生産プロセス中の発酵費用を減少させることができる。
連続培養での1−SSTrec酵素の生産
P.パストリスで高レベルで発現する組換えFTFの連続生産を記載する報告は文献中にない。1−SSTrecの連続生産は、5Lの全作業容積を有する7.5LのINFORS HT発酵槽中で行われた。Iris V 5.0 Softwareによって次のパラメータを確定し、培養期間を通して記録した:温度を28℃に維持し、その間、NH3OH(28%(v/v))及びH3PO4(40%(v/v))を自動的に添加することによってpH値を5.5に制御した。溶存酸素を、撹拌(500〜900rpmの間)、空気流(1〜2vvm)及び圧力(0〜0.7気圧)を自動的に変えることによって培養期間を通して20%より高く維持した。
1−ケストースを合成するために最適な1−SSTrecの反応パラメータの決定
発酵槽の上清に得られた酵素調製物を、Hydrosart膜(0.2μm)を備えたSarticon Slice 200(Sartorius)フィルターを製造業者の指示書に従って使用して、濾過プロセスに供した。続いて、濾過したものを、同じ機器であるがHydrosart限外濾過膜(10kDa)を備えたものを使用して、酢酸ナトリウム緩衝液0.1Mに対するダイアフィルトレーションによって10倍に濃縮して、1000U/mLの最終調製物を得た。任意選択で、濾液を凍結乾燥プロセスに供して、8500U/gより高い活性を有する固体の酵素調製物を得た。
1−SSTrec活性を4〜8の範囲内のpHで調査した。反応を、最終容積0.5mL中に0.87Mスクロース溶液及び10Uの酵素で、1時間30℃で行った。pHの範囲が4.0〜5.5の場合は酢酸ナトリウム緩衝液0.1Mを使用し、pHが6.0〜8.0の間の場合は0.1Mリン酸塩緩衝液を使用した。1−SSTrec酵素活性の最大値は5.5〜6.0の間のpH値に見出された。
これらのパラメータを決定するために、60Uの1−SSTrecを、0.1M酢酸ナトリウム、pH5.5の緩衝液中、200〜600g/Lの範囲内の基質濃度で、それぞれ30、40及び50℃で、最終反応容量10mL中で、250rpmで反応させた。1時間の反応後に、HPLCによって反応混合物中の糖類の組成を決定した。このクロマトグラフィーのために、20μlの試料を、Aminex HPX 42−C(BioRad、リッチモンド)カラム中に、作業流量0.6mL/分、圧力約52bar及び作業温度81℃で加えた。使用した移動相は水であり、示差屈折率検出器−Knauer Differential Refractometerを用いた。糖類を、Biocromソフトウェアパッケージ、バージョン3.0、IGBC、1996〜1997を使用して定量化した。
遊離及びEupergit固定化酵素並びにアルギン酸カルシウム中に固定化されたP.パストリスCIGB308細胞について熱安定性を評価した。遊離又は固定化形態の両方を、pH5.5の0.1M酢酸塩緩衝液中、30、35及び40℃でインキュベートした。30℃の場合は24時間間隔、35℃の場合は1時間間隔、及び40℃の場合は20分間隔で、各反応物からそれぞれ試料を採取して、残留する活性を試験した。続いて、半減期を、アッセイした酵素調製物のそれぞれがその当初の活性の50%を失った時間として定義した。表5の結果から、遊離1−SSTrecを含有する酵素調製物は、アルギン酸カルシウム中に固定化された1−SST活性を有する細胞よりもはるかに安定であることが示される。
撹拌槽型反応器を使用するバッチ反応における、1−SSTrecによって触媒されるスクロースのFOSへの転移
1−SSTrecに触媒されるFOS合成の経時変化を、スクロース濃度600g/LでpH5.5の0.1M酢酸ナトリウム緩衝液中に酵素−基質重量比15U/gで酵素を添加して、40℃で6時間、1Lの反応器中、250rpmで試験した。生産された糖類の定量及び組成を、20分毎に取った試料でHPLCによって例8と同様に決定した。
半連続的に運転される膜型バイオリアクター中でのスクロースからの1−ケストース合成
撹拌槽型バイオリアクター中で遊離の1−SSTrecを用いることによってスクロースから1−ケストースを合成する、例9に記載の手順に従った。この目的のために、図5に示すように、1L(作業容積)の撹拌槽型バイオリアクターの出力部にカートリッジ型の限外濾過膜(Prep/Scale TFF−1 30kDa、Millipore、0.09m2の公称フィルター面積を有する)を結合し、反応生成物と酵素を分離できるようにした。
Claims (22)
- 1−ケストースを工業規模で生産する方法であって、糖非分解性酵母で構成的に発現された、オニウシノケグサ(Festuca arundinacea)由来の組換えフルクトース転移酵素(FTF)を使用して、バイオリアクター中でスクロースを1−ケストースに転換することを特徴とする方法。
- 前記FTFがスクロース:スクロース1−フルクトース転移酵素(1−SST)である、請求項1に記載の方法。
- 前記糖非分解性酵母がピキア・パストリス(Pichia pastoris)株である、請求項1に記載の方法。
- 前記ピキア・パストリス(Pichia pastoris)株が、ゲノムに組込まれた1−SSTコード遺伝子の多コピーを含有する、請求項3に記載の方法。
- 前記FTFが、ピキア・パストリス(Pichia pastoris)培養物の上清及び/又は細胞沈殿物から回収される、請求項3に記載の方法。
- スクロース濃度が400g/Lを超える、請求項1に記載の方法。
- 前記FTFが、不連続、連続又は流加培養運転で発酵槽中で増殖させた前記組換え酵母によって生産される、請求項1に記載の方法。
- 前記酵母の増殖に使用される炭素源が、任意の純度のグリセロール、グルコース及びスクロースから選択される化合物である、請求項7に記載の方法。
- 前記スクロースの1−ケストースへの転換が、遊離又は固定化1−SSTによって行われる、請求項2に記載の方法。
- 前記スクロースの1−ケストースへの転換が、撹拌槽、固定床又は膜型のバイオリアクター中で行われる、請求項2に記載の方法。
- 前記膜型バイオリアクターが、連続又は半連続様式で運転される、請求項10に記載の方法。
- 糖非分解性酵母で構成的に発現されたオニウシノケグサ(F.arundinacea)1−SSTを含む、スクロースを1−ケストースに工業規模で変換するための粗酵素調製物。
- 前記糖非分解性酵母がピキア・パストリス(Pichia pastoris)株である、請求項12に記載の粗酵素調製物。
- 前記ピキア・パストリス(Pichia pastoris)株が、ゲノムに組込まれた、1−SSTコード遺伝子の多コピーを含有する、請求項13に記載の粗酵素調製物。
- 1−SSTが、固体又は液体状態であり、遊離又は固定化形態である、請求項12に記載の粗酵素調製物。
- 1−SSTが、ピキア・パストリス(Pichia pastoris)培養物の上清及び/又は細胞沈殿物から回収される、請求項13に記載の粗酵素調製物。
- スクロース濃度が400g/Lを超える、請求項12に記載の粗酵素調製物。
- オニウシノケグサ(Festuca arundinacea)から単離されてゲノムに組込まれた1−SSTコード遺伝子の多コピーを構成的に発現する、糖非分解性酵母の発酵を特徴とする、1−SSTを工業規模で生産する方法。
- 前記糖非分解性酵母がピキア・パストリス(Pichia pastoris)株である、請求項18に記載の方法。
- 前記1−SSTが、ピキア・パストリス(Pichia pastoris)培養物の上清及び/又は細胞沈殿物から回収される、請求項19に記載の方法。
- 請求項1から11までに記載の方法によって生産された1−ケストースを含む、ヒト又は動物に摂食させるための製品。
- 栄養補助食品として使用するためのシンバイオテックスを構成する、プロバイオティック調製物に追加的に配合される、請求項21に記載の製品。
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