KR102097749B1

KR102097749B1 - 1-케스토스를 얻기 위한 방법

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Publication number: KR102097749B1
Application number: KR1020157008228A
Authority: KR
Inventors: 엔리큐 로센도 페레즈 크루즈; 라자로 헤르난데스 가르시아; 더니스키 마르티네즈 가르시아; 루이스 엔리큐 트루지로 토레도; 카르멘 메넨데즈 로드리게스; 알리나 소브리노 레곤; 리카르도 라미레즈 이바네즈; 구머르신도 페이주 코스타; 주안 마누엘 레마 로디시오
Original assignee: 센트로 데 인제니에리아 제네티카 와이 바이오테크놀로지아
Priority date: 2012-09-18
Filing date: 2013-09-18
Publication date: 2020-04-06
Also published as: MX363716B; BR112015005852B1; EA028094B1; WO2014044230A1; JP2015530089A; CN104781414A; BR122021021803B1; AU2017221776B2; US10131927B2; CA2885116A1; MX2015003497A; AU2013317358A1; EP2899282A1; JP2019047797A; JP6994449B2; CN104781414B; EA201590599A1; IN2015DN02234A; CU20120138A7; US20190085364A1

Abstract

본 발명은 페스투카 아룬디나세아로부터 분리되어 비-당분해 효모에서 구성적으로 발현되는 재조합 프룩토실트랜스퍼라아제(FTF)를 사용하여 1-케스토스를 얻기 위한 산업적 규모의 방법을 개시하고 있다. 본 발명에서, 재조합 FTF 타입 수크로오스:수크로오스 1-프룩토실트랜스퍼라아제(1-SSTrec)는 숙주 피키아 파스토리스의 배양 상등액과 원상태의 세포 모두에서 구성적으로 안정하면서 고수율로 생산된다. 따라서 추가로 본 발명은 산업적 규모로 1-SST를 생산하기 위한 방법을 제공한다. 이때, 상기 재조합 효소는 수크로오스로부터 단쇄 프룩토올리고당(FOS), 구체적으로는 1-케스토스를 양산하기 위해 사용된다. 본 발명의 방법은 합성된 FOS가 반응 혼합물 중 총 당의 55%(w/w)를 넘게 차지하고 1-케스토스 함량이 총 FOS 분율의 90%(w/w) 보다 높은 값에 달하는 전환율을 가능하게 하는 조건을 확립한다.

Description

1-케스토스를 얻기 위한 방법{METHOD FOR OBTAINING 1-KESTOSE}

본 발명은 식품업과 제당업에 관한 것으로, 특히 자당/첨채당 또는 봉밀, 당밀, 식물 추출물, 시럽 등과 같이 다른 수크로오스-함유 원료로부터 프룩토올리고당(FOS)의 합성에 관한 것이다.

FOS는 β2→1 결합에 의해 수크로오스 분자에 연결된 1-9개의 프룩토오스 잔기를 가진 선형 사슬로 구성되어 있다(Yun, 1996, Enzyme Microb. Technol. 19:107-117). 이들 화합물의 중요성은 이들이 결장 친화적인 1종 이상의 미생물의 성장 또는 활성을 선택적으로 촉진함으로써 건강상의 이점을 만들어 주기 때문에 인간과 동물에 있어 전생물적 효과를 가진 식이의 불소화성 성분으로서 이들의 용도에 있다. 이들 미생물 중에는 락토바실루스와 비피도박테리움 속의 종들이 있다(Gibson and Roberfroid., 1995, J. Nutr. 125 (6): 1401-1412). 자연계에서 FOS는 식물, 진균, 박테리아와 몇몇 효모에서 소위 프룩토실트랜스퍼라아제(FTF, EC 2.4.1.9)와 β-프룩토푸라노시다아제(EC 3.2.1.26)라고 하는 효소의 작용에 생산되고 있다(Guetal., 2009; Recent Patents on Food, Nutrition & Agriculture 1 (3): 221-30).

FOS의 산업적 생산은 현재 다음 2가지 전략에 따라 수행되고 있다: - 이눌린의 부분 분해(Yun., 1996; Enzyme Microb. Technol. 19:107-117; Franck., 2002; British Journal of Nutrition 87 (2): S287-S291) 또는 트랜스프룩토실라아제 활성이 높은 β-프룩토푸라노시다아제 또는 주로 진균(아스페르길루스 니게르, A. 자포니쿠스, A. 오리자에, A. 아쿨레아투스 및 아우레오바시디움 풀루란스)에 의해 생산되는 FTF를 사용함으로써 수크로오스로부터 생산하는 효소 합성(Yun., 1996; Enzyme Microb. Technol. 19:107-117; Vankova et al., 2008; Chemical Papers 62 (4) 375381). 상기 2가지 기술은 중합도(DP)가 2 내지 10으로 가변적이고 주성분이 1-케스토스(GF₂), 니스토스(GF₃), 프룩토실니스토스(GF₄), 비푸르코오스(GF₃), 이눌로비오스(F₂), 이눌로트리오스(F₃)와 이눌로테트라오스(F₄)인 FOS 혼합물을 생산한다. 상업적 관점에서, 삼당류 1-케스토스는 천연의 전생물적 감미제이면서 당뇨 환자를 위한 당 대체물로서 유용한 저칼로리 감미제로서 두 가지 중요성으로 인해 가장 가치가 있는 FOS이다(Vega and Zuniga-Hansen., 2011; Bioresource Technology 102 (22), 10180-10186).

수크로오스로부터 FOS 생산에 관한 기술과 특허문헌은 진균인 아우레오바시디움 풀루란스(Smith and Luenser, 1980. 특허 US4309505), 아스페르길루스 포에니시스(Van Dooren et al., 1988. 특허 US4849356), 아스페르길루스 니게르(Hidaka et al., 1988, Agric. Biol Chem 1181), 아스페르길루스 아쿨레아투스(Fernandez-Arrojo et al., 2009. 특허출원 WO 2010/103150 A1), 효모인 로도토룰라 속(Aguiar de Oliveira et al., 2007. BRPI0705359 특허출원 A2-2)과 박테리아인 마이크로박테리움 라에바니포르만스(Hatcher et al., 1988. 특허 US4927757), 라넬라 아쿠아틸리스(Ohtsuka, K. et al. Biosci. Biotech. BioChem. 56(9), 1373-1377, 1992), 자이모모나스 모빌리스(Hatcher et al., 1988. 특허 US4797360))와 같은 서로 다른 야생형 미생물로부터 분리한 세포와 효소(유리형 또는 고정화)를 사용하는 것을 기반으로 하고 있다. 이들 생산 공정은 불연속 또는 연속적으로 작동하는 서로 다른 종류의 반응기, 주로 교반 탱크와 고정상의 반응기에서 실시된다. 불연속 공정에서는 방출된 글루코오스가 축적되어 FOS 합성 반응을 저해할 수 있다. 한편, 서로 다른 담체에 고정된 세포 또는 효소를 사용하는 연속 공정은 생체촉매의 재사용을 가능하게 하지만 기질이 고정화 효소에 접근하는 내부 확산이 제한되어 높은 유량으로 조작될 수 없다. 반응시간을 조정하여 합성된 프룩탄의 가수분해를 방지할 필요가 있다. 1-케스토스, 니스토스와 프룩토실니스토스의 혼합물을 합성할 때 배양시간은 기질 1g 당 효소의 초기 활성량에 따라 8에서 24시간으로 변한다.

20-25%의 글루코오스, 10-15%의 수크로오스, 5%의 프룩토오스와 55-60%의 총 FOS로 구성된 대부분의 일반적인 반응 혼합물과 1-케스토스가 40% 내지 60%인 FOS로부터 출발하여 순수한 1-케스토스 결정 또는 순도가 90%를 넘는 1-케스토스 제제를 생산(Tetsuhiro et al., 1995. 특허 US5463038; Koichiro et al., 2010. 특허출원 JP2010273580-A)하는 것은 극히 복잡한 공정이다. 상기 공정은 식품 용도로는 경제적으로 실행할 수 없다. 1-케스토스의 함량이 총 FOS 분율 중 80%를 초과하는 양에 상당할 때에만 1-케스토스의 크로마토그래피 분리가 경제적으로 가능하다(Nishizawa et al., 1996. 특허 US6479657).

FOS의 함량 중 대부분이 1-케스토스인 반응 혼합물(혼합물 중 당이 80%를 넘는)은 흔하지 않다. 아스페르길루스 아쿨레아투스(Hang and Woodams, 1995, Biotechnology Letters 17: 295-298)와 아스페르길루스 자포니쿠스 ATCC 20236와 같은 진균 유래의 FTF 효소에 의해 227 g/L 미만의 수크로오스 농도에서 고농도의 1-케스토스를 합성하여 왔다(Mussatto et al., 2009, Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic 59: 76-81). 상기 2개의 보고에서 1-케스토스 함량은 혼합물에 존재하는 총 FOS 분율 중 약 71%이었지만, 500 g/L가 넘는 수크로오스 농도에서 시험할 때에는 1-케스토스의 비율이 60%에 근접하거나 미만의 값으로 감소하였다(Ghazi et al., 2005, Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic 35:19-27). 아스페르길루스 니게르 ATCC 20611, 페니실리움 로퀘포르티 및 스코풀라리옵시스 브레비카울리스 유래의 β-프룩토푸라노시다아제는 500 g/L의 수크로오스 농도에서 1-케스토스를 각각 76.7%, 86.7%와 91.3%까지 생산할 수 있다(Nishizawa et al., 2002. 특허 US6479657 B1). 이들 비율은 P. 로퀘포르티와 S. 브레비카울리스 유래의 효소가 1-케스토스 수율면에서 A. 니게르의 효소보다 뛰어나다는 것을 나타내지만 생산성과 안정성 면에서는 상황이 변한다. 또한 이들 유기체 중 어느 것도 식품에서 사용하기에는 안전하다(안전하다고 일반적으로 인정되거나 안정성이 조건부로 추정되는 GRAS 또는 QPS급)고 인정되지 않고 있다(EFSA Panel on Biological Hazards., 2009; EFSA Journal 7 (12): 1431; Cuenca-Estrella et al., 2003, Antimicrob Agents Chemother 47 (7): 2339-2341).

사상 진균의 성장은 이들의 사상체가 프로펠러 날을 둘러싸고 종종 발효기의 통기 구멍을 막아 버리기 때문에 산업적 발효에 있어서 또 다른 큰 생산 제한 요인이다(Ahmad et al., 2010, Bioprocess Eng Biosyst 33, 599-606).

A. 니게르 β-프룩토푸라노시다아제의 돌연변이체는 단백질 공학에 의해 생성되었다. 상기 돌연변이 유전자는 동일한 상기 진균의 β-프룩토푸라노시다아제-결핍 균주에서 발현되었다. 상기 효소는 550 g/L 농도의 수크로오스와 반응하였을 때 총 FOS의 93.5%에 상당하는 1-케스토스를 합성하였다(Nakamuraetal., 2010. 특허 US7655449).

그러나 FOS의 산업적 생산을 위해 이러한 효소의 막대한 양을 사용할 수 있는 기술적으로 실행 가능한 FTF 생산 시스템은 없다(Vega and Zuniga-Hansen, 2011; Bioresource Technology 102 (22): 10180-10186). 진균 배양과 후속 추출 및/또는 내생 FTF의 정제는 주요 제한 인자이다. 선택된 FTF 효소의 고농도 생산과 분비에 더욱 적절한 다른 천연 또는 재조합 숙주의 사용을 연구할 필요가 있다.

주로 식물에서 프룩탄 합성 메커니즘을 개시하기 위해 수행한 기초 연구 결과, 서로 다른 논문들이 기질로서 수크로오스에 작용할 수 있는 FTF 효소를 코딩하는 유전자의 분리를 기술하였다. 이러한 유전자는 시코리움 인티부스(de Halleux and van Cutsem, 1997, Plant Physiol 113:1003), 호르데움 불가레(H°Chstrasser et al., 1998, FEBS Letters 440: 356-360), 헬리안투스 투베로수스(Van der Meer et al., 1998, Plant J. 15:489-500), 페스투카 아룬디나세아(Luscher et al., 2000, Plant Physiology 124 (3):1217-1227, 아가베 테퀼라나(Avila-Fernandez et al., 2007, Plant Science 173: 478-486), 알리움 세파(Vijn et al., 1998, Plant Physiology 117:1507-1513), 룰리움 페렌네(Lasseur et al., 2009, Journal of Experimental Botany 57 (11):2719-2734)와 트리티쿰 아에스티붐(Schroeven et al., 2008, New Phytologist 180:822-831)과 같은 서로 다른 종으로부터 분리하였다. 이들 유전자 중 일부는 주로 실험실 규모로 실시된 시험관내 실험에서 효소의 기질 특이성, 작용 방식과 산물 프로필의 특성 규명을 겨냥한 기초 연구를 위해 피키아 파스토리스에서 발현되었다(Altenbach et al., 2004, FEBS Letters 567: 214-218). 상기 보고 모두에서, P. 파스토리스에서 도입 유전자 발현을 유도하기 위해 알코올 옥시다아제 I 프로모터(pAOXI)를 사용하였다. 상기 메탄올-유도성 프로모터의 선정은 효모 발효 중에 필요한 막대한 양의 메탄올로 인해 산업적 규모의 공정에 대해서는 불리하다. 메탄올은 가연성이면서 독성이 높아 식품 가공 또는 식품 성분에서 사용하는 것이 금지되어 있다. 이들 연구에서는 1-케스토스를 합성하는 효소인 수크로오스:수크로오스 1-프룩토실트랜스퍼라아제(1-SST)의 능력을 0.1 내지 0.15 M(34.2 내지 51.3 g/L) 범위의 상대적으로 낮은 수크로오스 농도에서만 연구하였다. 이 효소는 또한 1-케스토스를 가수분해하거나 추가로 중합할 수 있는 것으로 밝혀졌다(Luscher et al., 2000; Plant Physiology 124 (3):1217-1227; Avila-Fernandez et al.; 2007 Plant Science 173:478-486). 피키아-생산 1-SST 효소는 분해와 불안정성 문제로 인해 극히 낮은 수율로 얻어졌다.

지금까지 수크로오스로부터 산업적 규모로 1-케스토스를 생산하기 위해 천연 또는 재조합 식물 효소 사용을 다루고 있는 보고는 없다.

1-케스토스가 주성분이 아닌 서로 다른 DP의 FOS 혼합물로 구성된 식물 시코리움 인티부스와 폴림니아 손키폴리아의 즙만이 산업적 규모로 사용되어 왔다(Guio et al., 2009, Recent Patents on Food, Nutrition & Agriculture Vol. 1 No. 3). 저수율, 세포외 매질로의 낮은 분비와 재조합 데옥시리보핵산(DNA) 기술에 의한 발현 중에 프로테아제에 의한 분해와 같은 인자는 효소의 불안정성과 결합하여 FOS의 산업적 생산에 있어서 진균 또는 이들에 의해 생산된 효소 FTF를 사용하는 것이 선호되어 왔다.

P. 파스토리스에서 식물 FTF를 생산하기 위한 구성 프로모터의 사용은 보고되지 않았다. 이는 식품 산업용으로 재조합 효소를 산업적 규모로 생산하기 위한 가장 적절한 선택이다.

막 생물반응기(MBR)는 건물에서 물의 재활용, 소규모 지역사회용 폐수처리, 산업 용수 처리, 매립지 침출액 처리 등을 위해 광범위하게 이용되고 있다(Judd S., 2008, Trends in Biotechnology 25 (2): 109-116). 2건의 보고만이 FOS 생산을 위한 직접 접촉식 MBR의 이용을 기술하고 있다(Sanchez et al., 2008; Food and bioproducts processing 86, 109115). 이들 보고 중 하나에서는 1-케스토스가 주요 산물인 아닌 FOS 함유 반응 혼합물로부터 미생물을 분리하기 위해 막을 이용하고 있다. 초기 수크로오스 농도가 단지 300 g/L이고 산물인 1-케스토스가 총 FOS 분율의 38.7%에 상당하는 양에 이르는 회분 반응에서 비-고정화 A. 니게르 ATCC 20611 β-프룩토푸라노시다아제에 의해 방출되는 글루코오스(FOS 합성을 저해하는)를 나노여과막을 통해 제거하기 위해 유사한 생물반응기가 이용되었다(Nishizawa et al., 2001; Food Sci Tech res. 7.1 39-44). 이들 조건에서는 1-케스토스의 산업적 생산이 경제적으로 가능하지 않을 것이다. 기원이 어떻든 용해성 프룩토실트랜스퍼라아제를 재사용하여 수크로오스로부터 1-케스토스를 연속 생산하기 위한 MBR의 이용을 보고하고 있는 논문이나 특허는 없다. 1-케스토스를 산업적 규모로 비용 효율적으로 생산하기 위한 방법과 기술을 개발하는 것은 여전히 큰 관심사이다.

본 발명은 단순하고 저렴하면서 효율적이며 산업적으로 규모를 확장할 수 있는 기술에 의해 수크로오스로부터 1-케스토스를 산업적 규모로 생산하기 위한 방법을 제공함으로써 위에서 언급한 문제를 해결한다.

본 발명의 방법은 F. 아룬디나세아로부터 분리되어 재조합 숙주로서 비-당분해 효모에서 구성적으로 발현되는 재조합 FTF 효소를 사용하는 생물반응기에서 수크로오스를 1-케스토스로 전환하는 것을 특징으로 한다.

상기 방법은 본 발명에서 최초로 기술하는 것으로, 수크로오스로부터 FOS를 생산하는 공정에 존재하는 주요 기술적 제한 요인, 특히 1-케스토스의 생산 관련 제한 요인의 해결을 포괄적으로 다루고 있다. 기재되어 있는 과정은 다음 2개의 중요 공정단계로 나타난다: 1) 효소 또는 생체촉매의 생산 및 2) 1-케스토스의 생산,

본 발명의 목적을 위해, 산업적 규모라 함은 수득 산물의 전체 또는 일부 부피를 상업적으로 이용하는 1-케스토스 생산 규모로서 정의된다. 이들 목적을 위해 시장에서 현재 입수할 수 있는 고안된 장비를 이용될 수 있다.

본 발명의 문맥상, 비-당분해 효모라 함은 수크로오스를 가수분해하거나 중합하는 내재적 활성이 없는 야생형 또는 변이 효모로서 정의된다. 이들 효모의 몇몇 예로는 메탄올 자화 효모 P. 파스토리스, 한세눌라 폴리모파 및 사카로마이세스 세레비시아에 효모 변이체 YSH 2.64-1A가 있다(Rehm et al., 1998, Journal of Bacteriology 180 (5): 1305-1310).

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 FTF는 수크로오스:수크로오스 1-프룩토실트랜스퍼라아제(1-SST)이다. 본 발명에서, 재조합 DNA 기술에 의해 얻어진 1-SST는 소위 1-SSTrec이다. 상기 효소의 생산 단계를 최적화하기 위해서 본 발명은 톨 페스큐(F. 아룬디나세아), 양파(A. cepa)와 블루 용설란(A. tequilana)으로부터 각각 분리한 1-SST 타입의 식물 FTF를 선택 및 동정하는 공정으로부터 출발하였다. 이 접근법은 FOS의 산업적 생산과 관련한 이전 문헌에는 없었다. 상기 효소 각각을 코딩하는 유전자를 효모 P. 파스토리스의 유전자 변형을 위한 발현 카세트에서 클로닝하였다. 산업적 생산을 위한 숙주로서 상기 효모의 생산 제한 요인, 예를 들면 상기 효모의 성장 중에 용존 산소의 제한에도 불구하고, 상기 효모는 수크로오스 또는 프룩탄에 반응할 수 있는 내재성 효소의 결여 요건을 달성하고 생물공학적 목적을 위한 숙주로서 적절한 것으로 여겨진다. P. 파스토리스는 발효기 내 제어된 조건에서 성장할 때 높은 바이오매스 산출량에 이를 수 있고 이종 단백질을 고농도로 생산하고 배양 배지로 분비할 수 있는 것으로 널리 알려져 있다. 상기 효모는 식품 가공을 위한 생물학적 안전 규정 관점에서 GRAS급이다. 따라서 이전에 언급한 비-당분해 효모가 P. 파스토리스 균주인 1-케스토스 생산 방법은 본 발명의 일부이다.

본 연구의 제1 단계에서는 알코올 옥시다아제 I 프로모터(pAOXI)를 사용하여 1-SSTrec의 도입 유전자 발현을 성공적으로 유도하였다. 그러나 이 메탄올-유도성 프로모터의 사용은 효모 발효 중에 막대한 양의 메탄올을 필요로 하기 때문에 산업적 규모의 공정이 가능하지 않다. 메탄올은 가연성이면서 휘발성이기도 하다. 한편, 메탄올은 식품 가공 또는 식품 성분에서 사용이 금지되어 있다. 놀랍게도, 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나아제 프로모터(pGAP)의 전사 조절하에서 F. 아룬디나세아 1-SST 유전자의 발현은 세포 독성을 유발하지 않았고 바이오매스의 양산과 본 발명에서 연구된 다른 2개의 FTF보다 세포외 매질로 분비되는 효소의 고수준 발현을 가능하게 하였다. 이는 식물 FTF 유전자를 발현하기 위해 상기 구성적 프로모터를 사용하는 것에 관한 최초 보고이다.

위에서 언급한 구성체 각각으로부터 유래된 3개의 P. 파스토리스 형질전환체를 유가식 발효에 있어서 바이오매스 생산과 프룩토실트랜스퍼라아제 활성에 대해 평가하였다. 72시간 동안 5 리터 발효기에서 효모를 성장시킨 후, 배양액을 원심분리하여 다음 2개의 분획물을 얻었다: 원상태의 세포 또는 바이오매스의 분획물 및 배양 상등액의 분획물. 상기 2개의 분획물을 pH 5.5의 0.02 M 초산나트륨 완충액에서 0.87 M 수크로오스 용액(300 g/L)과 함께 30℃에서 30분간 배양하여 효소활성을 분석하였다. 상기 조건에서 F. 아룬디나세아 1-SST 유전자를 보유한 3개의 형질전환 유전자 효모 클론은 세포내 및 세포외 분획물 모두에서 가장 높은 수준의 활성을 보였는데, 이는 분석된 효소의 나머지에 대해 관찰된 활성보다 높은 활성을 의미한다. F. 아룬디나세아로부터 분리한 1-SSTrec는 놀랍게도 양파와 용설란으로부터 분리한 그의 상동체보다 안정하여 1-케스토스의 대규모 생산을 가능하게 한다.

1-SSTrec의 수율을 증가시키기 위한 시도로서, F. 아룬디나세아 1-SST 발현 카세트의 다수 카피를 FTF 활성을 위해 클론의 연속 재형질전환 단계와 대규모 스크리닝 후 이중 및 단일 상동적 재조합 현상에 의해 숙조 효모의 게놈에 혼입하였다. 도입 유전자 투여를 점차 증가시켰더니 세포 성장 저해 없이 1-SSTrec 수율에 대한 상가 효과가 나타났다. CIGB 308로 명명된 엘리트 클론은 1-SST 코딩 유전자와 혼성화 탐침으로서 상재 AOX1 유전자좌의 5' 영역을 이용한 서던 블롯 실험에서 측정했을 때 게놈에 안정적으로 통합된 적어도 9개의 유전자 카피를 함유하고 있다. 관찰된 혼성화 패턴을 통해 엘리트 클론 CIGB 308을 포함하는 다수 카피 P. 파스토리스 균주를 정확하게 동정할 수 있다. 따라서 P. 파스토리스의 균주가 게놈에 통합된 1-SST를 코딩하는 유전자의 다수 카피를 함유하는, 1-케스토스를 산업적 규모로 생산하기 위한 방법 또한 본 발명의 목적이다.

P. 파스토리스 균주 CIGB 308는 발효기에서 배양될 때 1-SSTrec 효소를 생산한다. 이는 효모 추출물, 미량 원소와 비타민이 첨가되어 있고 탄소원으로서 글리세롤 또는 글루코오스를 사용하는 배양 배지를 이용하여 불연속, 연속 또는 유가식 공정으로 발효기를 이용할 때 일어난다. 그러나 상기 기질을 이용하면 더 높은 생산 수율이 얻어지기 때문에 수크로오스 또는 이를 함유하는 원료를 사용하는 것이 바람직하다.

따라서 본 발명의 일 요지에 있어서, 산업적 규모로 1-케스토스의 생산에 이용되는 FTF는 P. 파스토리스의 배양 상등액 및/또는 세포 펠렛에서 얻어진다. 본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 FTF는 불연속, 연속 또는 유가식 공정으로 이용되는 발효기에서 재조합 효모 숙주를 배양함으로써 생산된다. 특정 구현예에 있어서, 상기 효모 배양을 위한 탄소원은 소정 순도의 글리세롤, 글루코오스와 수크로오스 중에서 선택되는 화합물이다.

본 발명에서 달성된 세포외 1-SSTrec 활성(~100.0 U/mL의 무세포 배양 상등액)은 진균 효소에 대해 보고된 평균 수준과 약간 비슷하고(Driouch et al., 2010, Appl Microbiol Biotechnol 87:2011-2024) 효모에서 발현된 기원이 서로 다른 FTF에 대해 기술된 값보다는 훨씬 높다(Trujillo et al., 2002; Affinity 59 (500): 365-370; Rehm et al., 1998, Journal of Bacteriology 180 (5): 1305-1310). 세포내 분획물 중 활성에 대해서 높은 활성을 높은 세포 밀도와 조합하면 진균 효소에 대해 문헌에 보고된 가장 높은 값보다 6 또는 7배인 세포 1 리터 당 38 000 U가 넘는 바이오매스 산출량으로 나타난다(Dorta et al., 2006; Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology. 33(12): 1003-1009).

이미 언급한 P. 파스토리스의 생산 제한 요인에도 불구하고, 1-SSTrec의 재조합 발현을 위한 숙주로서 P. 파스토리스를 선택하면 천연 FTF 공급원으로서 진균의 사용과 관련하여 상술한 기술적 제한 요인이 극복된다. 한편, 생물학적 안정성 규정 관점에서 P. 파스토리스는 식품 가공을 위한 GRAS급 유기체이다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 400 g/L보다 높은 기질 농도를 이용하여 수크로오스를 1-케스토스로 산업적 규모로 전환한다. 본 발명의 특정 구현예에 있어서, 유리형 또는 고정화 1-SST에 의해 수크로오스를 1-케스토스로 전환한다.

본 발명의 일 요지에 있어서, 막, 고정상 또는 교반 탱크 생물반응기에서 수크로오스를 1-케스토스로 전환한다. 특정 구현예에 있어서, 상기 막 생물반응기는 연속 또는 반연속식으로 작동한다.

F. 아룬디나세아로부터 분리되어 비-당분해 효모에서 구성적으로 발현되는 1-SST를 포함하여 수크로오스를 1-케스토스로 산업적으로 전환하기 위한 효소 제제 또한 본 발명의 목적이다.

본 발명의 목적을 위해서 효소 제제라 함은 효소 활성을 갖고 특이적 기질과 반응하여 산물로 형질전환시킬 수 있는 액체 또는 고체 제형으로서 정의된다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 1-SSTrec를 얻기 위해 사용한 상기 당분해 효모는 P. 파스토리스 균주이다. 특정 구현예에 있어서, 상기 P. 파스토리스 균주는 그의 게놈에 통합된 1-SST 코딩 유전자의 다수 카피를 함유한다. 상기 효모 배양물로부터 1-SSTrec는 배양 상등액 및/또는 세포 펠렛에서 얻어진다. 본 발명의 목적에 따라, 상기 1-SST는 유리형 또는 고정화 효소로서 액상 또는 고상으로 사용될 수 있다. 본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 1-SST를 포함하는 효소 제제를 사용함으로써 1-케스토스의 산업적 생산에서 사용되는 수크로오스의 농도는 400 g/L보다 높다.

본 출원의 실시예에서 입증된 바와 같이, 정제, 동결건조 또는 단백질 고정화를 위한 종래의 공정을 통해 P. 파스토리스 CIGB 308 균주의 배양 상등액 또는 세포 바이오매스로부터 얻은 상기 유리형 또는 고정화 형태의 액상 또는 고상의 1-SSTrec 제제는 냉장할 필요 없이 저장 및 판매하기에 충분한 열안정성을 나타내었다. 상기 특성에 의해, 이러한 제제는 최종적으로 FOS의 산업적 생산을 위한 생체촉매로서 사용하여 본 발명의 1-케스토스 생산 방법의 제2 단계로 도입될 수 있다. 본 발명의 서로 다른 형태의 효소 제제는 기질로서 수크로오스가 존재하는 상태에서 55%보다 높은 전환율로 FOS를 생산하되 구체적으로 1-케스토스가 총 FOS 분율의 90%를 넘게 차지하는 FOS를 생산할 수 있다는 공통점이 있다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 1-케스토스 합성 반응은 다음과 같은 조건에서 일어난다: 200-800 g/L, 바람직하게는 600 g/L의 수크로오스; pH 4.0 내지 7.0, 최적으로는 5.5; 온도 30-50 ℃, 바람직하게는 40 ℃; 반응시간이 1 내지 24시간인 경우 효소/기질 비율 2-40 U/g, 바람직하게는 반응 시간이 3시간인 경우에는 15 U/g. 이들 조건은 FOS를 생산하기 위해 이용된 생물반응기의 유형과 작동 방식과 관계없이 액체 또는 고체 1-SSTrec 제제에 적용할 수 있다.

본 발명의 방법은 FOS, 특히 1-케스토스의 산업적 생산을 위한 공정에 관해 종래기술에서 인식되고 있는 제한 요인들을 극복한다. 진균 또는 진균 FTF를 사용하는 대신에, 뜻밖에도 다른 식물 유래의 FTF에 비해 수크로오스에 대한 작용 결과로서 P. 파스토리스에서 고농도로 안정적으로 분비되고 1-케스토스를 효율적으로 생산하는 재조합 식물 효소를 사용한다. 본 발명 이전에는 FOS 산업적 생산을 위해 재조합 식물 효소를 사용하지 않았다. 한편, 산업적 효소 반응을 위해 일반적으로 이용되고 있는 교반 탱크 반응기 기술에 있어서 효소는 단 1회 사용되는데, 이는 낮은 생산성과 산물 품질의 차이(제품간 불균일에 의해) 등으로 이해된다. 본 발명의 일 구현예에 있어서, 회분, 연속 또는 순차적 방식(바람직하게는 후자)으로 작동하는 막 생물반응기를 이용하면 55%가 넘는 수크로오스가 FOS로 전환되고 1-케스토스가 FOS 함량의 90%를 넘게 차지하는 교반 탱크 반응기에서 얻어지는 전환율과 비슷한 전환율이 더 적은 시간에 달성되기 때문에 생산성을 증가시킬 수 있다. 이들 결과는 이전의 보고를 뛰어넘는 것으로, 모두 사상 진균의 사용을 토대로 FOS를 산업적으로 생산하기 위한 기존 기술의 제한 요인들을 해결한다. 한편, 본 발명의 방법은 더욱 낮은 투자비용과 에너지 소비를 필요로 하고 1-케스토스의 생산량 대비 효소의 소비량을 줄이며 최종 산물의 정제 공정수를 줄인다.

전술한 바와 같이, 본 발명의 방법을 적용하면 임의의 미생물과 임의의 반응기 유형에 대해 상술한 FOS 생산공정에 존재하는 제한 요인들이 극복된다.

F. 아룬디나세아의 1-SST는 1-케스토스의 산업적 생산을 위해 최초로 사용된다. 재조합 식물 FTF를 이용한 FOS의 산업적 생산에 대한 보고는 없다. 다른 시험 식물 FTF로부터 기대치 않게 또한 이들과는 달리, 상기 효소는 고농도로 안정적으로 생산되고 숙주 효모 P. 파스토리스의 배양 배지로 분비된다. 이들 기술적 장점 이외에, 본 발명의 재조합 효소는 400 g/L보다 높은 농도의 수크로오스에 대해 작용한 결과로서 주로 1-케스토스를 생산한다.

상기 진균 효소는 또한 상기 삼당류를 합성하지만 상기 삼당류를 거의 반응 시작부터 기질로서 사용하여 1-케스토스의 최종 수율에 불리한 1-니스토스와 프룩토실니스토스를 생산한다.

한편, 현재 국제시장에서는 FOS를 대량 생산하기 위해 FTF를 공급하는 회사가 없다. 본 발명의 방법은 막대한 양의 1-케스토스를 생산하는 재조합 식물의 산업적 생산을 위한 저비용의 새로운 과정을 창출하여 이러한 유형의 효소를 상업적으로 용이하게 사용할 수 있도록 한다. 놀라운 것은, F. 아룬디나세아의 재조합 FTF를 사용하면 다른 FOS 생산 기술을 포함하여 지금까지 기술된 생산 기술들에 비해 FOS, 특히 1-케스토스를 얻기 위한 공정을 더욱 저렴하게 하는 추가 이점으로서 갖는다는 점이다.

따라서 본 발명은 발효기에서 성장한 미생물이 게놈에 통합된 F. 아룬디나세아 1-SST를 코딩하는 유전자의 다수 카피를 함유하는 비-당분해 효모인 사실을 특징으로 하는, 1-SST를 산업적 규모로 생산하기 위한 방법을 제공한다. 상기 재조합 효모는 1-SST 코딩 유전자를 구성적으로 발현한다. 본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 1-SST 코딩 유전자를 구성적으로 발현하는 비-당분해 효모는 P. 파스토리스 균주이다. 본 발명의 목적을 위해서 상기 재조합 1-SST는 P. 파스토리스 배양 상등액 및/또는 세포 펠렛으로부터 회수된다.

본 발명의 목적을 위해서 1-SST의 산업적 규모 생산이라 함은 전체 또는 일부 부피가 10 000 U의 효소를 초과하는 1-SST를 생산하는 재조합 균주를 발효기에서 배양하는 것을 포함하는 규모이다.

전문 문헌에 나타난 보고와 상반되게, 본 발명의 일 구현예에서는 최초로 상기 식물 FTF를 막 생물반응기의 이용과 조합하여 사용한다. 이 조합은 FOS와 1-케스토스를 고수율로 얻는 공정을 최적화한다. 상기 조합으로 얻은 결과는 수학적 모델에 의해 이론적으로 계산된 수율값보다 더 높은 놀랄만한 것이었다. 추가로, 이 공정은 다른 유형의 반응기를 이용할 때 발견되는 제품간 불균일과 산물의 변동성을 제거한다. 상기 공정은 용해성 FTF를 재사용하도록 함으로써 기술-경제적 관점으로부터 교반 탱크에서 사용된 것보다 10배 높은 효소-기질 비가 가능하다. 이들 2가지 이점은 반응 시간을 3시간으로 줄여 교반 탱크에 비해 1일 생산성을 적어도 5배 증가시키고 그 결과 생산비용을 절감하는 것으로 해석된다. 게다가 조작 단계가 줄어들고 생산 공정을 위해 필요한 물리적 면적이 더 적게 된다.

본 발명의 또 다른 요지는 F. 아룬디나세아로부터 분리되어 비-당분해 효모 숙주에서 구성적으로 발현되는 재조합 FTF를 사용함으로써 생물반응기에서 수크로오스를 1-케스토스로 전환하는 것을 특징으로 하는, 본 발명의 방법에 의해 얻어지는 1-케스토스를 포함하는 인간 또는 동물 급이용 산물이다. 특정 구현예에 있어서, 상기 인간 또는 동물 급이용 산물은 프로바이오틱 제제와 기능 식품으로서 이용할 공생 제제로 제형화된다.

도 1은 벡터 pGAPZαA,B,C에서 톨 페스큐(1-sstf), 양파(1-sstc)와 블루 용설란(1-ssta) 유래의 1-SST 효소 각각을 코딩하는 유전자의 삽입으로 나타나는 발현 카세트의 그래프이다. 해당 플라스미드를 각각 p1-SSTF(톨 페스큐 1-SST), p1-SSTC(양파 1-SST)와 p1-SSTA(블루 용설란 1-SST)로서 명명하였다. P _GAP : GAP 프로모터, SP: 사카로마이세스 세레비시아에의 α-인자 신호 펩티드, His ₆ : 폴리히스티딘 표지, TT: 피키아 파스토리스의 AOX1 전사 종결인자.
도 2는 피키아 파스토리스 균주 GS115에서 1-sstf 유전자의 구성적 고수준 발현을 위한 발현 카세트의 플라스미드 p1SSTF6x + 6개의 추가 카피 구성에 이용된 전략이다. A. 하나의 유전자 카피를 가진 구성. B. 6개의 유전자 카피를 가진 구성, 히스티딘4 유전자 상보성에 의한 선택. C. 9개의 유전자를 가진 구성 및 하이그로마이신 내성. P _GAP : GAP 프로모터, 5'AOX1 :알코올 옥시다아제의 프로모터, SP : S. 세레비시아에의 α-인자 신호 펩티드, His ₆ : 폴리히스티딘 표지, TT : AOX1 전사 종결인자, His4: 비-돌연변이 히스티딘4 유전자.
도 3은 회분식 교반 탱크 반응기에서 효소 1-SSTrec에 의한 FOS 합성의 경시 변화이다. 반응 조건: 1-SSTrec 9000 U/L, 0.1 M 초산나트륨 완충액(pH 5.5) 중 수크로오스 600 g/L; 온도 40℃, 교반속도 250 rpm, 반응 시간 6시간. 범례: 1-케스토스(GF₂); 니스토스(GF₃), 총 FOS(FOS = GF₂와 GF₃의 합); 수크로오스(GF); 글루코오스(G); 프룩토오스(F).
도 4는 서로 다른 반응시간(t_r)에서 회수한 시료 중 산물 프로필을 보여주는 HPLC 크로마토그램이다. A. 표준물질인 니스토스(GF₃), 1-케스토스(GF₂), 수크로오스(GF), 글루코오스(G)와 프룩토오스(F)의 혼합물. B. 반응시간 t_r= 0에서 1-SSTrec에 의한 FOS 합성. C. t_r= 18분. D. t_r= 360분.
도 5는 막 생물반응기에서 FOS 생산을 위해 고안된 시스템의 개략도이다.
도 6은 반연속 공정의 3회 연속 사이클 중에 막 생물반응기에서 효소 1-SSTrec에 의한 1-케스토스 합성의 경시변화이다. 반응조건: 1-SSTrec 9000 U/L, 0.1 M 초산나트륨 완충액(pH 5.5) 중 수크로오스 600 g/L; 온도 40℃, 교반속도 250 rpm. 공정 순서: 사이클 번호 1, 3시간 연속 합성 반응과 30분 배출(D), 사이클 번호 2-3, 2.5시간 연속 합성 반응과 30분 배출(D).
도 7은 막 생물반응기에서 반연속 공정으로 FOS를 합성하는 각각의 연속 사이클 후에 회수한 시료 중 산물 프로필을 보여주는 HPLC 크로마토그램이다. A 사이클 번호 1, B 사이클 번호 2 및 C 사이클 번호 3. 범례: 니스토스(GF₃), 케스토스(GF₂), 수크로오스(GF), 글루코오스(G), 프룩토오스(F).

실시예

실시예 1. 피키아 파스토리스 에서 생산된 식물 유래의 3개의 수크로오스:수크로오스 1-프룩토실트랜스퍼라아제(1-SST)가 나타내는 프룩토실트랜스퍼라아제 (FTF) 활성 수준의 비교 연구

위에서 언급한 3개의 효소의 FTF 활성 수준을 비교하기 위해서 톨 페스큐(페스투카 아룬디나세아), 양파(알리움 세파)와 블루 용설란(아가베 테퀼라나) 유래의 1-SST 효소를 코딩하는 cDNA를 문헌에 이미 기재되어 있는 프라이머를 이용하는 역전사(RT)-폴리머라아제 연쇄반응(PCR)을 통해 상기 효소의 천연 숙주로부터 분리하였다[Vijn et al. 1998, The Plant Journal 11:387-398; Luscher et al. 2000, Plant Physiology 124:1217-1227; Avila-Fernandez et al. 2007, Plant Science 173:478-486].

성숙 효소를 코딩하는 DNA에 상응하는 증폭 PCR 산물들(크기: 1-SST 페스큐: 1668 bp, 1-SST 양파: 1668 bp와 1-SST 용설란: 2026 bp)을 정확한 리딩 프레임에 따라 5' 말단에서 S. 세레비시아에 α-인자 신호 펩티드에 접합시켰고 3' 말단에서는 시판 벡터 pGAPZ a C(Invitrogen, 리크, 네덜란드)에 존재하는 myc 에피토프와 6개의 히스티딘 잔기 표지 모두를 코딩하는 서열에 접합시켰다. 이 시판 벡터를 통해 항생제 지오신에 대한 내성에 의해 얻어진 형질전환체를 선택할 수 있다.

p1-SSTF(페스큐 1-SST), p1-1SSTC(양파 1-SST)와 p1-SSTA(1-SST 용설란)로 명명된 3개의 얻어진 구성체에서, 도 1에 나타낸 바와 같이 3개의 1-SST를 코딩하는 키메라 유전자를 GAP 프로모터와 전사 알코올 옥시다아제 1 종결인자(AOX1TT)의 전사 조절 상태에서 유지하였다.

상기 3개의 구성체를 GAP 프로모터 중 단일 AvrII 제한 부위에서 분해하고 전기천공법에 의해 X-33 숙주 효모 균주의 게놈에 도입하였다. 그 결과, 2% 글리세롤과 지오신 100 mg/mL가 첨가된 YP 배지에서 성장시킨 후 각 구성체에 대해 약 20개의 형질전환체가 얻어졌다. 비교 연구를 위해서 3개의 변이체 각각의 지오신 내성 클론 3개를 세포 정지기에 도달할 때까지 5 리터(유효 용적) 발효기에서 성장시켰다.

진탕기에서 미리 성장시킨 접종균 200 mL를 각 발효기에 접종하였다.

발효의 제1단계에서 20%가 넘는 용존 산소 수치를 유지하기 위해서 500에서 900 rpm까지 교반을 자동 증가시키고 통기량을 1 vvm(공기 부피/배지 부피/분)에서 유지하였다. 글리세롤 고갈의 지표인 용존 산소 수치가 증가했을 때, 제2 주입 단계를 시작하였다.

제2 단계를 시작하기 위해서, 공기 유량을 2 vvm까지 증가시키고 배양물에 용존 산소 수치의 변화에 의해 제어되는 1.5 L의 증량액(동일한 초기 탄소원을 가진)을 5 내지 7 mL/L/h의 유량으로 주입하였다. 유사한 조건에서 성장시킨 재조합 또는 야생형 균주의 경우에는 72시간 배양 중에 독성 효과가 관찰되지 않았다.

다음, 최종 배양물을 원심분리에 의해 분리하여 2개의 분획물로서 세포 펠렛(또는 바이오매스)과 배양 상등액을 얻었다. 상기 2개의 분획물 0.2 mL 시료를 수크로오스 용액과 30분 동안 300 g/L(0.87M)가 되도록 반응시켰다. 수크로오스에 대한 트랜스풀록토실화 반응 결과 방출된 글루코오스의 농도를 재조합 클론 FTF의 활성 수준의 지표로서 이용하였다.

상기 트랜스프룩토실화 반응의 세기는 시료에서 색상 변화를 소정량의 글루코오스에 연관시키는 검량선으로부터 정하였다. 원상태의 세포와 톨 페스큐 1-SST 유전자를 발현하는 3개의 클론으로부터 취한 배양 상등액 시료의 30분 반응에서 상대적으로 높은 활성(5.5 mM가 넘는 글루코오스 농도에 상응하는 세기에 의해 시료는 적색으로 변색됨)이 관찰되었다. 대조적으로, 양파 1-SST 유전자나 블루 용설란 1-SST 유전자를 보유한 클론 중 어느 것도 30분 반응에서 검출될만한 활성을 보이지 않았다. 3시간과 5시간 더 긴 시간 동안 배양한 후에야 약간의 활성이 인지되었다(시료 색깔은 0.5-5.5 mM 범위의 글루코오스 농도에 해당하는 옅은 분홍색으로 변색됨).

실시예 2. FTF 활성이 높은 3개의 단일 1-sstf 카피 클론의 발효 진행 중에 분석한 파라미터의 평균값

게놈에 혼입된 단일 1-sstf 카피를 보유한 3개의 클론을 실시예 1에 기재된 동일한 실험조건을 이용하여 발효기 수준에서 비교하였다.

1-SSTrec 활성이 높은 3개의 클론의 발효 중에 얻은 평가 파라미터의 비교

파라미터	값
바이오매스 산출량(배양물의 g/L)	366±4
1-SSTrec 세포내 활성(습윤 바이오매스의 U/g)	4.3±0.2
1-SSTrec 세포외 활성(배양 상등액의 U/L)	3.7±0.1
배양시간(시간)	69
총 1-SSTrec 활성(배양물의 U/L)	3955±211
바이오매스 내 총 1-SSTrec 활성(배양물의 U/L)	1573.8±25.6
바이오매스 활성의 생산성(U/L/h)	22.8

1-SSTrec 단위(U)는 30분 동안 30℃에서 0.1 M 초산나트륨 완충액(pH 5.5) 중 50%(1.46 M) 수크로오스 용액과 반응시 분 당 글루코오스 1 마이크로몰을 방출하는 효소의 양을 의미한다. 표 1에 나타낸 데이터는 각 시험 클론에 해당하는 3회 발효에서 얻은 평가 파라미터 값의 평균±표준편차를 나타낸다.

구성적 발현 시스템을 이용할 때 이들 3개의 클론의 생산성은 더 짧은 배양시간(69 시간)에 더 높은 세포 농도(366 g/L)에 도달하였기 때문에 메탄올 유도성 시스템을 이용하여 얻은 것보다 2배 높았다.

실시예 3. 피키아 파스토리스 AOX1 유전자좌에 1-sstf 유전자 발현 카세트의 다수 카피 통합에 의한 1-SSTrec 활성 증가

FOS를 생산하는 경제적인 생산 기술을 개발하기 위해서 높은 수준의 1-SSTrec 활성이 필요하고, 따라서 숙주 효모에서 유전자 투여를 증가시킬 필요가 있다.

발현 카세트의 다수 카피를 직렬로 얻기 위해서 게놈에 유전자 1-sstf를 함유하는 발현 카세트의 하나의 카피 만을 함유하는 플라스미드 p1-SSTF를 제한 효소 BamHI와 BglII로 분해하였다. 얻어진 발현 카세트 함유 2.82 kb의 밴드를 아가로오스 겔로부터 분리하고 T4 리가아제를 이용하여 다시 결찰하였다.

T4 리가아제에 의해 BamHI(G-GATCC)와 BglII(A-GATCT) 제한 부위를 접합시키면 이들 2개의 효소 중 어느 것에 의해서도 인식되지 않는 GGATCT 서열을 가진 혼성 부위가 생성된다. 상기 결찰 반응 중에 이들 2개의 효소 BamHI와 BglI를 첨가하여 서로 다른 말단의 연결을 용이하게 하였다. 발현 카세트의 2개의 카피를 함유하는 5.64 kb 밴드를 분리하고 BamHI와 BglII 효소로 재차 처리하여 발현 카세트가 동일한 전사 방향으로 접합되도록 하였다.

이 서열을 BamHI에 의해 분해되고 알칼리성 포스파타아제에 의해 탈인산화된 동일한 플라스미드 p1-SSTF에 삽입하였다. 발현 카세트의 3개의 카피를 직렬로 보유한 새로운 구성체(p1-SSTF3x)를 제작하였다. p1-SSTF3x를 효소 BamHI과 BglII에 의해 분해하였고, 이전 단계에서 기재한 대로 분리 및 재결찰하여 8.46 kb 밴드를 얻었다. 16.92 kb 서열을 BamHI에 의해 분해되고 알칼리성 포스파타아제에 의해 탈인산화된 pAO815 벡터에 삽입하였다.

이 벡터는 his4 자가영양의 상보성에 의해 P. 파스토리스 GS115 형질전환체 선택을 가능하게 한다. 얻어진 플라스미드(p1SSTF6x)는 동일한 전사 방향으로 직렬 배치되고 AOX1 프로모터와 (도 2)의 AOX1 유전자좌 종결인자 영역의 3' 단편 사이에 삽입된 발현 카세트의 6개의 카피를 함유하고 있다.

이 플라스미드는 P. 파스토리스 GS115 균주의 전기천공법에 의해 형질전환을 위해 BglII로 분해하였다. 이 분해에 의해 2개의 단편 중 하나는 중앙에는 6개의 직렬 발현 카세트를, 5' 말단에는 his4에 의해 생성된 자가영양을 상보하는 유전자인 AOX1 프로모터를, 3' 말단에는 AOX1 유전자좌의 종결인자 영역의 3' 단편을 보유한 22.23 kb 밴드를 생산한다.

이 전략을 이용하면, AOX1 유전자좌를 대체하는 이중 상동적 재조합이 유리하다. 2% 글루코오스가 첨가된 최소 YNB 배지에서 플라스미드 p1-SSTF6x를 이용하여 형질전환된 GS115 균주의 군체를 선택하였다. 탄소원으로서 수크로오스를 사용하는 형질전환체의 능력을 평가하기 위해서 93개 군체 His4+를 5% 수크로오스와 pH 지시약인 브로모티몰 블루 0.025%가 첨가된 100-웰 YP 한천 플레이트(pH 5.5)에서 개별적으로 성장시켰다.

단일 1-sst 유전자 카피(PF1x)와 함께 GS115/p1-SSTF 클론을 본 실험을 위한 양성 대조군으로서 사용하였다. PF6Xb와 PF6Xa로 명명된 2개의 클론은 수크로오스로부터 방출된 글루코오스의 미생물에 의한 소비에 의해 젖산을 생산하는 수크로오스에 대한 1-SSTrec 트랜스프룩토실화 반응으로 인해 배지 색깔을 초기 녹색(pH 5.5)에서 황색(pH ≤ 6.0)으로 변색시켰다. 배지의 이러한 변색은 단일 유전자를 보유한 균주에 비해 다수 카피 균주에서 보다 빨리 일어났다. 이 사실은 다수 카피 클론이 단일 유전자 카피를 보유한 것들보다 더 큰 효소 활성을 나타낸다는 것을 시사한다.

이 결과를 입증하기 위해서 PF6Xb와 PF6Xa 다수 카피 클론과 단일 카피 PF1x를 오비탈 진탕기 내 2% 글리세롤이 첨가된 액체 YP 배지 10 mL에서 24시간 동안 28℃에서 성장시켰다. 펠렛(바이오매스 또는 세포)과 단일 카피 클론 뿐 아니라 다수 카피 클론 모두의 세포 상등액에 해당하는 분획물에서 재조합 효소의 FTF 활성에 의해 방출된 글루코오스를 실시예 1에서 설명한 동일한 방법으로 옥시다아제/퍼옥시다아제/글루코오스 발색 효소 복합체의 비색 반응을 이용하는 "glucose-Trinder"(Sigma) 키트에 의해 측정하였다.

상기 2개의 다수 카피 클론은 단일 카피에 의해 나타난 효소 활성보다 더 높은 효소 활성을 보였는데(표 2), 이는 P. 파스토리스 게놈에 통합된 1-sstf 유전자의 증가된 카피가 이들 2개의 재조합 균주에서 1-SSTrec 활성을 증가시켰음을 입증하는 것이다. 배양 상등액에서 클론 PF6Xb는 PF6Xa 클론보다 31.4% 더 크고 단일 카피 클론보다는 64.2% 더 큰 1-SSTrec 활성을 보였다. 바이오매스에서 클론 PF6Xb는 PF6Xa 클론보다 18% 더 크고 단일 카피 클론보다는 36% 더 큰 효소활성을 가졌다.

표 2는 다수 카피 P. 파스토리스 클론의 효소 활성에 대한 1-sstf 유전자 카피 수의 효과를 보여주고 있다. 대조군으로서 균주 GS115와 단일 카피 클론을 사용하였다. 데이터 우측에 있는 서로 다른 문자는 통계 패키지 StatGraph3를 이용하는 단순한 Classification ANOVA에 의해 결정된 유의차를 의미한다. 효소 활성의 평균값(n = 3)은 Tukey HSD 검정법을 이용하여 비교하였다(p<0.01).

단일 및 다수 카피 클론에서 1-SSTrec 활성의 비교

	특이적 효소활성(x10 ^-3 UAE/D.O ₆₀₀ )
균주	바이오매스(B)	배양 상등액(S)
GS115	0.1081±0.0015^d	0.1523±0.0017^d
PF1X	2.5813±0.0012^c	4.7830±0.0015^c
PF6Xa	4.9717±0.0020^b	9.1545±0.0021^b
PF6Xb	7.3548±0.0014^a	13.3512±0.0016^a

600 nm의 파장에서 측정한 효소 활성/광학 밀도의 단위(UAE/D.O ₆₀₀ ). 서로 다른 문자는 Tukey HSD 검정법을 이용함으로써 효소 활성을 상호 비교한 유의차를 나타낸다(p<0.01).

위에서 얻은 결과에 따르면, 다수 카피 클론 PF6Xb는 바이오매스와 배양 상등액 모두에서 가장 높은 1-SSTrec 활성을 보이므로 추가 발현 실험을 위해 상기 클론을 선정하였다. 지금부터 상기 선택된 클론을 PF6X로 다시 명명하였다.

실시예 4. AOX1 유전자좌에 발현 카세트의 6개의 추가 카피를 삽입하여 PF6X 다수 카피 클론의 재형질전환에 의해 증가된 1-SST 활성

클론 1-SST PF6X의 효소 활성을 증가시키기 위해서 pALS223으로 명명된 새로운 플라스미드를 제작하였다. 이 새로운 구성체를 얻기 위해서 플라스미드 p1-SSTF6x를 구성하기 위해 이용한 발현 카세트의 6개 카피를 직렬 및 동일한 전사방향으로 함유한 16.92 kb 서열을 미리 BamHI로 분해하고 알칼리성 포스파타아제로 탈인산화시킨 벡터 pPICHaC AOX1-링커에 삽입하였다.

이 벡터는 P. 파스토리스 AOX1 프로모터에서 단일 상동적 재조합 및 항생제 하이그로마이신을 이용한 추가 형질전환체 선택을 가능하게 한다. 이 유전자 구성체를 제한 분석과 DNA 서열분석에 의해 검사한 후, 본 발명자들은 상기 새로운 플라스미드를 효소 Hpa I로 선형화하고 PF6X 세포 전기천공을 통해 상기 신규 구성체로 PF6X 클론을 재형질전환하였다. 이 효소는 AOX1 유전자좌에서 단순 상동적 재조합에 의해 효모 게놈으로 통합을 촉진하는 AOX1 프로모터의 특정 부위를 절단한다.

하이그로마이신 2%와 글리세롤 0.2 g/L가 첨가된 고체 YP 배지에서 숙주 효모 게놈에 삽입된 발현 카세트의 6개가 넘는 카피를 가진 형질전환체를 선택하였다. 바이오매스와 배양 상등액에서 60개가 넘는 하이그로마이신(HigR) 내성 군체에 대한 효소 활성은 효소 복합체인 글루코오스 옥시다아제/퍼옥시다아제/크로모겐 시약 키트 "glucose-Trinder"의 비색반응을 이용하여 측정하였다. 이 분석에서는 PF6x와 PF1x 균주를 대조군으로서 포함시켰다.

CIGB 308이라고 하는 하나의 하이그로마이신 내성 클론은 세포 펠렛과 배양 상등액 모두에서 가장 높은 1-SSTrec 효소 활성을 보였다. 이 새로운 클론은 PF6X 균주보다 상등액(1.87배)과 바이오매스(1.76배)에서 더 높은 효소 활성을 보였다.

상기 단일 카피 균주와 비교할 때, 클론 CIGB 308이 나타내는 1-SST 활성은 상등액에서 3.58배 높았고 바이오매스에서 2.41배 증가하였으므로 숙주에 안정적으로 통합된 1-sstf 유전자의 카피수를 증가시키면 효모 숙주에서 1-SST 활성도 증가한다는 것을 확인해 주고 있다. 서던 블롯 분석을 통해 클론 CIGB 308에는 발현 카세트의 9개의 카피가 안정적으로 통합되었음을 알 수 있었다. 이들 결과를 통해 재형질전환의 경우에 기대한 대로 발현 카세트의 6개 카피 대신에 3개의 카피만이 삽입되었음을 알 수 있다.

실시예 5. P. 파스토리스 GIGB 308 균주는 발효기 규모에서 선조 균주인 PF1X와 PF6X 보다 더 많은 1-SST 효소 활성을 갖고 더 높은 생산성을 나타낸다

각각 게놈 통합된 발현 카세트의 1개와 6개의 카피(PF1X, PF6X)를 가진 P. 파스토리스 CIGB 308 클론과 그의 전구체를 28℃, pH 5.5, 500-900 rpm, 통기량 1.2 vvm과 용존 산소가 20%를 넘도록 제어된 가동 용적이 5 L인 7.5 L 발효기에서 성장시켰다. 발현 카세트의 서로 다른 통합 카피수와 관계없이 상기 3개의 재조합 균주는 유사한 성장 패턴을 보였다.

19시간과 20시간 성장시킨 후에 초기 글리세롤 함량이 고갈되는 반면에 통기량을 500에서 900 rpm로 점차 증가시킴으로써 용존 산소 압력을 20%까지 조절하였다. 글리세롤 고갈과 함께 용존 산소가 빠르게 증가하였고 이후 발효 공정 72시간 동안 50% 글리세롤(v/v) 주입과 함께 배양을 시작하였다.

이들 배양 조건에서 상기 3개의 비교 클론으로부터 얻은 총 바이오매스는 358±8 g/습윤 중량(L)이므로 재조합 효소의 생산과 축적 뿐 아니라 유전자 투여는 성장에 영향을 주지 않았고 효모 숙주에 대한 독성은 없다고 판단할 수 있다.

70-72시간 배양 직후에 GIGB 308 클론은 가장 높은 세포외 및 세포내 1-SST 활성을 보인바, 각각 최대 29.7±0.2 U/배양물(mL)와 배양물의 최대 12.4±0.2 U/배양물(mL)(34 U/습윤 중량(g))에 달하였다. 308 CIGB 성장 후에 검출된 전체 42.1±0.2 U/mL로부터 FTF 활성의 70.6%가 배양 상등액에서 발견되었고 세포에서는 29.4%가 발견되었다. 이 비교 연구에서 얻은 결과로부터 본 발명자들은 1-SSTrec의 양산을 위해 CIGB 308 클론을 선택하기로 결정하였다.

본 발명의 시점에서 다수 카피 P. 파스토리스 클론으로부터 구성적으로 발현된 식물 1-SSTrec를 얻기 위한 발효 전략을 기술하고 있는 보고는 문헌에 없었다.

실시예 6. 탄소원으로서 수크로오스를 사용하여 피키아 파스토리스 CIGB 308 균주 성장을 위한 향상된 배양 전략

글리세롤 이외에 수크로오스 또는 글루코오스와 같은 더 저렴한 탄소원을 사용하여 P. 파스토리스 CIGB 308 균주의 발효 비용을 절감한다. 숙주로서 사용하는 P. 파스토리스 GS115 균주는 인버타아제 활성이 없어 수크로오스를 탄소원으로서 사용할 수 없다. 그러나 효모 숙주에 의해 취득한 새로운 FTF 활성에 의해 1-SSTrec 트랜스프룩토실화 반응의 결과로서 글루코오스가 수크로오스로부터 방출된 후 재조합 효모 숙주의 성장을 위해 직접 대사작용한다. 이러한 재조합 효모균주의 거동에 의해 생산 공정 중에 발효 비용이 절감된다.

회분식으로 증가한 배양물에서 수크로오스 발효를 가동 용적이 50 L인 75 L 용량의 발효기에서 수행하였다. 파라미터는 다음과 같이 조정하였다: 온도 28℃, pH 5.5, 교반속도 600 rpm, 통기량 1.0 vvm, 작동압: 0.2 atm이었다. 정제당, 원당 또는 봉밀에 함유되어 있는 수크로오스 50 g/L를 탄소원으로 사용하였다.

탄소원 고갈과 함께(pH 증가 또는 산소압 증가에 의해 검출됨), 발효 개시 약 20시간에 증량액(500 g/L인 것을 제외하고는 초기에 사용한 동일한 탄소원 용액)을 8 mL/L/시간의 속도로 첨가하여 초기 배양물 부피만큼 증량하였다. 이때 발효 파라미터를 다음과 같이 재조정하였다: 교반속도: 800 rpm, 통기량 1.5 vvm, 산소압: 0.4 atm. 72시간 동안 발효시켰다.

이들 배양 조건에 의해 달성된 바이오매스 산출량은 글리세롤 배지에서 성장시킨 것을 제외하고는 동일한 클론에 의해 달성된 산출량과 비슷하였다. 한편, 총 효소 활성(배양 72시간 내)은 사용한 원료-함유 수크로오스와 상관없이 수크로오스-함유 배지보다 훨씬 우수하였다. 서로 다른 탄소원을 사용한 P. 파스토리스 308 CIGB 균주의 성장 결과를 표 3에 요약하였다.

탄소원으로서 글리세롤 또는 수크로오스를 사용하여 발효기에서 P. 파스토리스 CIGB 308 균주를 성장시킨 후 얻어진 결과 요약

탄소원	세포외 활성 (무세포 상등액의 U/mL)	세포내 활성 (배양물의 U/ml)	배양물 총 U/mL	습윤 중량(g/L)
글리세롤	29.7±0.2(70.6%)	12.4±0.3(29.4%)	42.1±0.4	361±4
정제당	101.6±9.5(62.02%)	38.9±5.4(37.98%)	102.4±11.3	375±9
원당	53.9±3.3(46.3%)	39.9±2.9(53.7%)	74.2±3.1	363±4
봉밀 B	110.7±0.2(58.5%)	49.6±5.1(41.5%)	119.6±6.3	368±14

괄호 안의 수치는 배양 72 시간 후 P. 파스토리스 CIGB 308 균주의 세포내 및 세포외 효소 활성의 비율을 나타낸다. 효소 단위(U)는 30℃에서 pH 5.5의 1.75 M 초산나트륨 완충액 중 0.1 M 수크로오스 용액에서 초기 반응 속도로 분 당 1 마이크로몰의 글루코오스를 방출하는 1-SSTrec의 양을 의미한다. 데이터는 각각의 탄소원을 이용하여 수행한 발효 횟수의 평균±표준편차를 나타낸다.

이들 결과에 따르면, 수크로오스와 봉밀은 모두 상기 재조합 FTF를 산업적으로 생산하기에 적합한 기질이라는 결론이 얻어졌다.

실시예 7. 연속 배양에서 1-SSTrec 효소 생산

P. 파스토리스에서 고수준으로 발현되는 재조합 FTF의 연속 생산을 기술하고 있는 보고는 문헌에 없다. 총 가동 용적이 5 L인 7.5 L INFORS HT에서 1-SSTrec을 연속적으로 생산하였다. 다음과 같은 파라미터를 확립하고 Iris V 5.0 소프트웨어를 통해 배양 중에 지속적으로 기록하였다; 온도는 28℃에서 유지하는 한편, NH₃OH(28%(v/v))와 H₃PO₄(40%(v/v))를 자동 첨가하여 pH 값을 5.5로 조절하였다. 용존 산소는 교반속도(500 내지 900 rpm), 유량(1-2 vvm)과 압력(0-0.7 atm)이 자동적으로 변화되도록 하여 배양 내내 20% 넘게 유지하였다.

초기 부피는 22 g/L의 NH₄SO₄, 18.2 g/L의 K₂HPO₄, 7.5 g/L의 MgSO₄7H₂O, 0.5 g/L의 CaCl₂2H₂O; 효모 추출물 5 g/L, 미량의 염과 충분량의 비타민과 수크로오스 50 g/L를 함유하는 3 L 발효 배지이었다. 불연속 증량 단계를 위해서 수크로오스 500 g/L의 용액 1.5 L를 사용하였다. 연속 배양 단계에서는 200 g/L의 수크로오스, 효모 추출물 2.5 g/L, 11 g/L의 NH₄SO₄, 9.1 g/L의 K₂HPO₄, 3.75 g/L의 MgSO₄7H₂O, 0.25 g/L의 CaCl₂2H₂O; 미량의 염과 비타민을 함유하는 배지를 사용하였다.

진탕기에서 미리 성장시킨 접종균 200 mL를 발효기에 접종하였다. 탄소원이 고갈되었을 때, 불연속 증량 단계를 시작하고 배양물을 7 내지 30 mL/L-h 범위의 유량으로 주입하였다. 증량액 고갈과 함께, 생물반응기에 1일-1회 희석 속도(D)로 주입하여 연속 배양을 시작하였다. 정상 상태에 도달한 후, 배양 공정을 45일 동안 유지하여 평균 활성 수율 70±5 U/mL와 세포 농도 352±11 g/습윤 중량(L)을 얻었다.

실시예 8. 1-케스토스의 합성을 위한 1-SSTrec의 최적 반응 파라미터 결정

발효기 상등액에서 얻은 효소 제제를 제작사 지침에 따라 Hydrosart 막(0.2 ㎛)을 구비한 Sarticon Slice 200(Sartorius) 필터를 이용하여 여과 처리하였다. 이어서, 상기 여과물을 0.1 M 초산나트륨 완충액에 대한 Hydrosart 한외여과막(10 kDa)을 구비한 것을 제외하고는 동일한 장비를 이용한 정용 여과법에 의해 10배 농축하여 1000 U/mL의 최종 제제를 수득하였다. 경우에 따라, 상기 여액을 동결건조 처리하여 활성이 8500 U/g를 넘는 고체 효소 제제를 얻었다.

a) 1-SSTrec 활성에 대한 최적의 pH 결정:

4 내지 8의 pH 범위에서 1-SSTrec 활성을 조사하였다. 0.87 M 수크로오스 용액과 10 U의 효소의 최종 부피 0.5 mL 중에서 1시간 동안 30℃에서 반응시켰다. pH 범위가 4.0 내지 5.5인 경우에는 0.1 M 초산나트륨 완충액을 사용하였고 pH 범위가 6.0 내지 8.0인 경우에는 0.1 M 포스페이트 완충액을 사용하였다. 1-SSTrec 효소 활성의 최대값은 5.5 내지 6.0의 pH 값에서 발견되었다.

b) FOS 합성을 위한 온도와 최적의 기질 농도:

이들 파라미터를 결정하기 위해서 60 U의 1-SSTrec를 pH 5.5의 0.1 M 초산나트륨 완충액에서 200 내지 600 g/L 농도 범위의 기질과 최종 반응 부피 10 mL로 각각 30, 40과 50℃에서 250 rpm로 반응시켰다. 반응 1시간 후에 반응 혼합물 중 당의 조성을 HPLC에 의해 측정하였다. 상기 크로마토그래피를 위해서 시료 20 ㎕를 가동 유량 0.6 mL/분, 압력 약 52 bar 및 가동 온도 81℃인 Aminex HPX 42-C(BioRad, 리치몬드) 칼럼에 가하였다. 이동상으로 물을 사용하였고 Knauer 시차 굴절계를 굴절율 검출기로 이용하였다. BioCrom 소프트웨어 패키지, 버전 3.0, IGBC, 1996-1997를 이용하여 당을 정량 분석하였다.

표 4는 서로 다른 반응 조건에서 측정한 당의 조성과 함량(%), 1-케스토스 합성 속도 및 트랜스트랜스프룩토실화와 가수분해 활성 간 관계를 보여주고 있다. 40℃와 수크로오스 농도 600 g/L에서 가수분해 활성이 없는 1-케스토스의 합성 속도가 최대값에 도달하였다.

1-SST 주변세포질 활성을 가진 원상태의 세포 또는 알긴산 칼슘 고정 세포 또는 Eupergit(Sigma)에 공유결합된 고정화 효소를 수크로오스를 1-케스토스로 전환시키기 위한 효소 제제로서 사용할 때 유사한 결과가 얻어졌다.

FOS 합성에 있어서 온도와 기질 농도의 영향

	200 g/L
온도	G	F	GF	GF₂	GF₃	r_(GF2)	R_T/H
30℃	16.0	0.5	39.6	45.8	0.8	1.0	88
40℃	13.1	0.9	41.2	43.7	1.l1	1.0	50
50℃	1.5	0.0	91.2	6.7	0.0	0.1	-
	400 g/L
온도	G	F	GF	GF₂	GF₃	r_(GF2)	R_T/H
30℃	11.8	0.1	58.0	29.9	0.3	1.3	585
40℃	11.0	0.4	48.6	39.3	0.8	1.8	111
50℃	2.4	0.0	86.3	11.1	0.0	0.5	-
	600 g/L
온도	G	F	GF	GF₂	GF₃	r_(GF2)	R_T/H
30℃	6.9	0.0	67.5	25.5	0.0	1.8	-
40℃	9.9	0.0	54.7	34.7	0.8	2.4	-
50℃	7.3	0.0	64.8	27.9	0.0	1.9	-

반응 1시간 후 반응 혼합물의 조성. 글루코오스(G), 프룩토오스(F), 수크로오스 글루코오스(GF), 1-케스토스(GF ₂ ), 니스토스(GF ₃ ). 반응 파라미터: g/분으로 주어진 1-케스토스의 합성 속도(r(GF ₂ )), 1-케스토스와 프룩토오스의 조성비로 주어진 트랜스프룩토실화와 가수분해 활성 비(RT/H).

c) 유리형 및 고정화 1-SSTrec의 반감기:

유리형 및 Eupergit 고정 효소와 알긴산 칼슘 고정 P. 파스토리스 CIGB 308 세포에 대해 열안정성을 평가하였다. 유리형 또는 고정화 형태 모두를 30, 35와 40℃에서 pH 5.5의 0.1 M 아세테이트 완충액 중에 배양하였다. 30℃의 경우에는 24시간 간격으로, 35℃의 경우에는 1시간 간격으로, 40℃의 경우에는 20분 간격으로 각 반응으로부터 시료를 각각 취하여 잔류 활성을 시험하였다. 이어서, 분석한 효소 제제 각각이 초기 활성의 50%를 상실한 시간으로 반감기를 정의하였다. 표 5의 결과는 유리형 1-SSTrec를 함유하는 효소 제제가 알긴산 칼슘에 고정된 1-SST 활성이 있는 세포보다 훨씬 더 안정하다는 것을 보여주고 있다.

게다가, 뜻밖에도 비-반응성 조건하 30℃에서 1-SSTrec 용액 중 조 추출물의 평균 반감기는 1432 시간이다. 이 시간은 식물 효소 1-SST 타입에 대해 지금까지 보고된 반감기의 100배를 넘는다.

비-반응성 조건에서 서로 다른 1-SSTrec 제제의 반감기

효소 제제	반감기(시간)
효소 제제	30℃	35℃	40℃
유리형 1-SSTrec(조 추출물)	1432.0	6.1	0.7
알긴산 칼슘 고정 P. 파스토리스 CIGB 308 세포	36.0	4.2	0.3
Eupergit 고정된 1-SSTrec	1856.0	12.9	1.6

동결건조한 효소 제제에 대해 열안정성 시험을 수행하였다. 그 결과, 상기 고체 제제는 30℃에서 3년보다 긴 반감기를 가졌다.

실시예 9. 교반 탱크 반응기를 이용한 회분 반응으로 1-SSTrec에 의해 촉매화된 수크로오스에서 FOS로의 변형

수크로오스 농도 600 g/L에서 1-SSTrec에 의해 촉매화된 FOS 합성을 250 rpm의 1 L 반응기에서 pH 5.5의 0.1 M 초산나트륨 완충액 중 15 U/g의 효소-기질 중량비로 40℃에서 6시간 동안 첨가하면서 수행하여 경시 변화를 관찰하였다. 생산된 당의 함량과 조성을 실시예 8과 유사하게 HPLC에 의해 20분마다 취한 시료에서 측정하였다.

1-케스토스의 생산량은 혼합물 중 총 탄수화물의 53.4%와 총 FOS의 90.4%에 해당하는 최대 320.8 g/L이었다. 도 3은 1-케스토스의 생산량이 초기 수크로오스의 70%를 넘는 양이 소비된 반응시간 2.7 내지 3시간 사이에 최대값에 도달하였음을 보여주고 있다. 이때, 1-케스토스의 최대 농도는 사당류인 니스토스가 나타나기 시작한 때와 일치한다.

이 사실은 도 4에서 볼 수 있는 바와 같이 초기 수크로오스의 50%가 소비될 때까지 수크로오스의 변형 반응에서는 니스토스가 합성되지 않기 때문에 1-SSTrec를 1-케스토스의 대규모 생산에 사용하는 것에 대해 유리하다. 대조적으로, 진균 FTF는 최초 1-케스토스 분자의 합성과 함께 반응 시작부터 니스토스를 축적하고 또한 오당류인 프룩토실니스토스를 합성한다.

유사한 반응조건에서 주변원형질 1-SSTrec 활성을 가진 세포, 유리형 세포 또는 알긴산 칼슘 고정 세포 또는 Eupergit(Sigma)에 공유결합으로 고정된 1-SSTrec를 사용하였을 때 수크로오스에서 1-케스토스로의 변형 과정에서 유사한 값과 거동이 얻어졌다. 표 6은 서로 다른 효소 제제에 의해 얻어진 FOS 농도를 보여주고 있다.

서로 다른 1-SSTrec 효소 제제를 사용하여 반응 3시간 후 합성된 FOS의 농도

합성된 FOS	유리형 1-SSTrec	알긴산 칼슘 고정 세포	Eupergit 고정 1-SSTrec
총 FOS	354.7 g/L	330.5 g/L	342.2 g/L
1-케스토스	320.8 g/L(90.5%)	322.1 g/L(97.4%)	318.3 g/L(93.0%)
니스토스	33.9 g/L(9.5%)	8.4 g/L(2.6%)	23.9 g/L(7.0%)

합성 3시간 후에 얻어진 트랜스프룩토실화 반응 혼합물을 저온살균 처리하여 효소를 불활성화하였다. 이어서, 상기 시럽을 여과와 함께 시작하는 연마 공정으로 처리한 후, 탈염, 탈색하고, 마지막으로 모사 이동상(SMB)용 크로마토그래피를 이용하여 분리한 후, 용리하여 1-케스토스가 90% 넘게 풍부한 FOS 흐름을 수득하였다. 이 사실은 상기 과정이 가장 높은 전생물적 효과를 갖고 있어 가장 상업적인 FOS인 1-케스토스가 풍부한 시럽을 생산하는 기술적 가능성이 있음을 입증하는 것이다.

산업적 규모에서 이 과정의 기술적 가능성은 각각 30과 100 L 용량의 반응기에서 수크로오스로부터 1-케스토스로의 변형 반응의 규모를 확대하여 확인하였다. 이 공정의 규모 확대는 1 L 모델 반응기에서 수행한 시험에서 얻은 정보로부터 유사성 원리(Principle of Similarity)에 입각한 방법에 의해 수행하였다. 상기 2개의 새로운 규모에서 얻은 1-케스토스의 농도는 평균 322±7 g/L이었다. 이 결과는 모델 반응기에서 얻은 결과와 유의적인 차이가 없음을 보여주고 있다. 이 사실은 또한 교반 탱크 반응기에서 1-SSTrec에 의해 촉매화된 수크로오스에서 1-케스토스로의 전환반응이 더 큰 규모에서 재현성이 있음을 입증하였다.

실시예 10. 반연속식으로 작동하는 막 생물반응기에서 수크로오스로부터 1-케스토스의 합성

실시예 9에 기재된 과정을 따라 교반 탱크 생물반응기에서 유리형 1-SSTrec를 사용하여 수크로오스로부터 1-케스토스를 합성하였다. 이를 위해, 도 5에 나타낸 바와 같이 1 L(가동 용적) 교반 탱크 생물반응기를 배출구 쪽에서 카트리지형 한외여과막(Prep/Scale TFF-1 30kDa, Millipore, 정격 필터 면적 0.09 m²)과 결합하여 반응 산물과 효소를 분리하도록 하였다.

다음과 같은 파라미터를 이용하였다: 초기 효소 농도 9000 U/L, 0.1 M 아세테이트 완충액 중 초기 수크로오스 농도 600 g/L, pH 5.5, 온도 40℃, 교반속도 250 rpm, 생물반응기에서 막으로 주입되는 배출물 유량 40 mL/분.

합성 단계 중에는 막의 배출구 있는 농축물과 투과액 흐름은 모두 효소 생물반응기로 반송된다. 실시예 8과 9에 기재된 바와 같이 수크로오스로부터 1-케스토스의 전환율을 측정하기 위해 30분마다 투과액 흐름의 시료를 HPLC에 의해 분석하였다.

반응 3시간 후에 생물반응기로 가는 투과액 재순환 밸브를 잠그고 미리 잠근 상태에 있는 FOS 수집조로 가는 밸브를 열었다. 상기 농축물 흐름에 해당하는 밸브를 조절하여 투과액 유량이 30 mL/분이 되도록 하였다.

30분 후에 총 반응 부피의 90%가 배출되므로 수집조로 가는 투과액 배출 밸브를 닫았다. 다음, 생물반응기로 가는 반송 밸브를 열고 유지 밸브를 조절하여 생물반응기로 가는 반송 투과액 유량을 50 mL/분이 되도록 설정하였다. 이 시점에, 생물반응기에 pH 5.5의 0.1 M 아세테이트 완충액 중 90 mL의 수크로오스 600 g/L를 장입하였다. 또한 180 U의 1-SSTrec를 첨가하여 동일한 반응시간과 동일한 1-케스토스 전환율을 유지하여 제2 합성 사이클을 시작하였다.

반응 2시간과 30분 후에, 제1 사이클에서 수행한대로 반응 산물을 배출하였다. 제2 사이클에 해당하는 반응 부피의 90%를 완전히 배출한 후에 제2 사이클에서 수행한 바와 동일한 방법으로 생물반응기를 다시 장입하였다. 이들 반응-배출 단계를 10회의 공정 사이클을 종료할 때까지 순차 반복한 다음, BRM 세정 단계를 실시한다. 도 6은 첫 번째 3번의 사이클 중에 거동을, 도 7은 각각의 순차 사이클 종료시점에서 산물 프로필을 보여주고 있다.

순차식으로 작동되는 BRM을 이용하면 동일한 용량의 교반 탱크 생물반응기의 생산성과 유사한 생산성을 갖지만 생산된 1-케스토스의 양만큼 8배 더 적은 양의 효소가 소비된다.

반연속식으로 작동되는 다른 BRM 작동 조건의 경우에 유사한 1-케스토스 농도가 얻어졌다. 다운로드 시간은 1-케스토스의 생산이 최대에 도달하는 시간의 10 내지 20%인 것을 항상 가정하면, 산물 프로필에 영향을 주지 않고 변경할 수 있는 작동 조건 중에는 효소-기질 비(2-40 U/g의 수크로오스), 수크로오스 농도 400-800 g/L, 온도(30-50℃), pH(5.0-6.5)가 있다.

상기 범위의 다운로드 시간은 1-케스토스로부터 니스토스 합성과 프룩토오스 생산에 유리하다. 본 발명 이전에는 BRM에서 1-케스토스 생산을 기술하고 있는 보고는 문헌에 존재하지 않았다.

Claims

비-당분해 효모에서 유도제가 사용되지 않고, 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나아제 프로모터(pGAP)의 전사 조절하에 구성적으로 발현된 페스투카 아룬디나세아(Festuca arundinacea) 유래의 재조합 수크로오스:수크로오스 1-프룩토실트랜스퍼라아제(1-SST)를 사용하여 생물반응기에서 수크로오스를 1-케스토스로 전환시키는 1-케스토스의 산업적 생산 방법으로서,
상기 비-당분해 효모의 게놈에 통합된 상기 수크로오스:수크로오스 1-프룩토실트랜스퍼라아제(1-SST)를 코딩하는 유전자의 다수 카피를 함유하고,
상기 생물반응기에서 수크로오스의 초기 농도가 500 내지 800 g/L인 것을 특징으로 하는 1-케스토스의 산업적 생산 방법.
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제1항에 있어서, 상기 비-당분해 효모가 피키아 파스토리스(Pichia pastoris) 균주인 것을 특징으로 하는 방법.
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제3항에 있어서, 상기 수크로오스:수크로오스 1-프룩토실트랜스퍼라아제(1-SST)가 피키아 파스토리스(Pichia pastoris) 배양물의 상등액 또는 세포 침강물로부터 회수되는 것을 특징으로 하는 방법.
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제1항에 있어서, 상기 수크로오스:수크로오스 1-프룩토실트랜스퍼라아제(1-SST)가 발효기에서 불연속, 연속 또는 유가식 공정으로 성장시킨 재조합 효모에 의해 생산되는 것을 특징으로 하는 방법.
제3항에 있어서, 상기 효모 성장을 위해 사용되는 탄소원이 소정 순도의 글리세롤, 글루코오스와 수크로오스로부터 선택되는 화합물인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 수크로오스로부터 1-케스토스로 전환이 유리형 또는 고정화 1-SST에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 수크로오스로부터 1-케스토스로 전환이 교반 탱크, 고정상 또는 막 생물반응기에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
제10항에 있어서, 상기 막 생물반응기가 연속 또는 반연속 방식으로 작동되는 것을 특징으로 하는 방법.
비-당분해 효모에서 유도제가 사용되지 않고, 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나아제 프로모터(pGAP)의 전사 조절하에 구성적으로 발현된 페스투카 아룬디나세아(Festuca arundinacea) 유래 수크로오스:수크로오스 1-프룩토실트랜스퍼라아제(1-SST)를 포함하는, 수크로오스를 1-케스토스로 산업적으로 전환하기 위한 조 효소 제제로서,
상기 비-당분해 효모가 피키아 파스토리스(Pichia pastoris) 균주이고,
상기 피키아 파스토리스(Pichia pastoris) 균주의 게놈에 통합된 상기 수크로오스:수크로오스 1-프룩토실트랜스퍼라아제(1-SST)를 코딩하는 유전자의 다수 카피를 함유하는 것을 특징으로 하는 조 효소 제제.
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제12항에 있어서, 상기 수크로오스:수크로오스 1-프룩토실트랜스퍼라아제(1-SST)가 고체 또는 액체 상태이고 유리형 또는 고정화 형태인 것을 특징으로 하는 조 효소 제제.
제12항에 있어서, 상기 수크로오스:수크로오스 1-프룩토실트랜스퍼라아제(1-SST)가 피키아 파스토리스(Pichia pastoris) 배양물의 상등액 또는 세포 침강물로부터 회수되는 것을 특징으로 하는 조 효소 제제.
제12항에 있어서, 상기 수크로오스를 1-케스토스로 산업적으로 전환하기 위한 조 효소 제제가 적용되는 수크로오스의 초기 농도가 500 내지 800 g/L인 것을 특징으로 하는 조 효소 제제.
게놈에 통합된 페스투카 아룬디나세아(Festuca arundinacea)로부터 분리된 수크로오스:수크로오스 1-프룩토실트랜스퍼라아제(1-SST)를 코딩하는 유전자의 다수 카피를 유도제가 사용되지 않고, 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나아제 프로모터(pGAP)의 전사 조절하에 구성적으로 발현하는 비-당분해 효모를 발효시키는 수크로오스:수크로오스 1-프룩토실트랜스퍼라아제(1-SST)의 산업적 생산 방법으로서,
상기 비-당분해 효모의 게놈에 통합된 상기 수크로오스:수크로오스 1-프룩토실트랜스퍼라아제(1-SST)를 코딩하는 유전자의 다수 카피를 함유하는 것을 특징으로 하는 방법.
제18항에 있어서, 상기 비-당분해 효모가 피키아 파스토리스(Pichia pastoris) 균주인 것을 특징으로 하는 방법.
제19항에 있어서, 상기 수크로오스:수크로오스 1-프룩토실트랜스퍼라아제(1-SST)가 피키아 파스토리스(Pichia pastoris) 배양물의 상등액 또는 세포 침강물로부터 회수되는 것을 특징으로 하는 방법.
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