KR100620495B1

KR100620495B1 - 재조합 엔도자일라나제를 이용한 자일로올리고당의 제조방법

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Publication number: KR100620495B1
Application number: KR1020040060794A
Authority: KR
Inventors: 남수완; 김영만; 허선연; 김정희
Original assignee: 학교법인 동의학원; (주)오리엔탈 바이오텍
Priority date: 2004-08-02
Filing date: 2004-08-02
Publication date: 2006-09-08
Also published as: KR20060012080A

Abstract

본 발명은 재조합 엔도자일라나제를 이용한 자일로올리고당 제조방법에 관한 것이다.

본 발명은 바실러스 (Bacillus sp.)유래의 엔도자일라나제 (endoxylanase) 유전자를 포함하는 유전자 개열지도를 갖는 것을 특징으로 하는 재조합 발현 벡터 pAEDX-1와; 상기 발현벡터로 형질전환된 미생물과; 상기 미생물을 배양하여 엔도자일라나제를 대량 생산하는 방법; 및 상기 방법으로 생산된 재조합 엔도자일라나제를 자일란(xylan)과 반응시켜 자일로올리고당을 제조하는 방법을 특징으로 한다.

본 발명의 엔도자일라나제는 자일란과 반응하여 자일로올리고당을 특이적으로 생산하면서 온도에 영향을 받지 않고 낮은 기질농도에서 활성을 가지는 우수한 상업적인 효소이기 때문에, 기능성 식품 소재인 자일로올리고당의 생산공정이나 펄프산업의 표백공정에 사용하여 고부가가치인 자일로올리고당의 생산비용을 저렴하게 하고, 환경오염 문제를 발생하는 폐수의 처리비용을 절감할 수 있는 효과가 있다.

자일로올리고당, 엔도자일라나제, 기능성 식품 소재, 효모, 내열성

Description

재조합 엔도자일라나제를 이용한 자일로올리고당의 제조방법{Process for preparing xylooigosaccharide using recombinant endoxylanase}

도 1는 재조합 발현 벡터인 pAEDX-1의 염색지도를 나타낸 것이고,

도 2는 효모 SEY2102/pAEDX-1 균주를 30℃에서 배양시간에 따른 균체 증식과 엔도자일라나제의 활성을 그래프로 나타낸 것이고,

도 3는 본 발명의 재조합 엔도자일라나제를 4%의 자작나무 자일란 기질용액과 60℃에서 반응시킨 후, 최종 분해 산물을 박층크로마토그래피로 나타낸 것이고,

도 4는 본 발명의 재조합 엔도자일라나제를 6%의 자작나무 자일란 기질용액과 70℃와 80℃에서 반응시킨 후, 최종 분해산물을 박층크로마토그래피로 나타낸 것이고,

도 5는 자작나무 자일란 가수분해 시 반응온도에 따른 고체액체크로마토그래피 결과를 나타낸 것이다.

본 발명은 재조합 엔도자일라나제를 이용한 자일로올리고당의 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 바실러스로부터 유래된 엔도자일라나제(endoxylanase) 유전자를 발현벡터에 결찰(ligation)하고, 상기 발현벡터로 효모를 형질전환시킨 다음, 상기 형질전환된 효모를 배양하여 재조합 엔도자일라나제를 대량생산하고, 상기 재조합 엔도자일라나제를 자일란과 반응시켜 자일로올리고당을 생산하는 방법에 관한 것이다.

자일란(xylan)은 농가에서 흔하게 생산되는 농가부산물인 쌀겨나, 옥수수심에 많이 함유되어 있지만 대부분이 그냥 버려지거나 값싼 동물 조사료로만 이용되고 있는 실정이므로 자일란을 산업적으로 활용도가 높은 물질로 변환시키면 그 응용가치는 매우 높다. 이러한 자일란을 자일로올리고당과 같은 유용한 물질로 전환시키는 기술개발이 필요한데, 이를 위해서는 먼저 자일란을 분해해야 하는 바, 고온·고압 조건의 화학적 분해방법보다 경제적, 환경적인 면 등에서 우수한 생물학적 분해방법의 개발이 필수적이다.

자일로올리고당은 자일로즈 및 자일로즈가 2개 내지 수 개로 결합된 것의 혼합물이며 온화한 감미를 갖는 시럽 또는 분말상 물질로서 죽순, 과일, 야채, 우유 및 꿀 등에 천연적으로 포함되어 있다. 또 지질대사 개선, 간 보호 및 해독작용을 갖는 것으로 보고된 바 있고, 인체에 흡수되기 어렵기 때문에 저칼로리 감미료 및 식품소재로 사용할 수 있다. 자일로올리고당은 비피더스, 락토바실러스 등과 같은 장내 유용미생물을 선택적으로 증식시킴으로서 장기능을 개선시키는 기능성 식품으로서 그 효과가 다른 올리고당보다 뛰어나다고 알려져 있다. 또 지질대사 개선, 간 보호 및 해독작용을 갖는 것으로 보고된 바 있고, 인체에 흡수되기 어렵기 때문에 저칼로리 감미료 및 식품소재로 사용할 수 있다. 자일로올리고당은 식품 외에도 의약품, 사료 및 농업 분야를 포함하는 다양한 분야에서 매우 유용하게 사용할 수 있으며, 특히 식품 분야에 사용하는 자일로올리고당은 2당류, 3당류가 장내 유용 미생물 증식에 가장 효과적인 것으로 알려져 있으며 효소적 방법으로 자일란 물질로부터 자일로올리고당을 생산하기 위해서는 엔도자일라나제가 핵심효소로 작용한다.

헤미셀룰로즈의 대부분을 차지하는 자일란은 자일로스의 베타-D-1,4 사슬결합으로 이루어진 고분자 물질로서, 자일란을 완전하게 분해하여 당화하기 위해서는 일반적으로 세가지 종류의 효소 즉 엔도자일라나제(endo-β-xylanase), 엑소자일라나제(exo-β-xylanase) 및 자일로시다제(β-xylosidase)가 함께 작용해야 하는 것으로 알려져 있으며(Trends. Biotechnol. 3, pp286∼290, 1985) 이들을 자일라나제계 효소로 통칭한다. 한편, 본 발명에서는 이들 효소중 첫 번째 엔도자일라나제에 중점을 두었다.

효소의 분리정제 기술과 자일로즈 당화합물의 분리정제 기술도 Suntory 사에서 확립하여 수년 전부터 식품소재로 판매를 시작하여 그 활용도를 확장시켜 가고 있으나, 농업부산물을 활용한 자일로올리고당 생산기술은 개발 중이며, 특히 자일라나제를 이용하는 생물펄핑 및 알코올 발효 기술과 효소생산을 위한 열 안정성이 높은 재조합 균주의 개발이나 발효 최적화에 대한 연구는 최근 수년 간 그 기술이 급속도로 증진되어 일반화되었으나 아직까지 국내에서 산업화 효소 생산에 적용한 예는 많지 않은 실정이다.

자일란의 생물학적 분해기술은 그 분해산물인 자일로즈, 유용 장내세균 증식 에 필요한 자일로올리고당, 대체 감미료 자일리톨 등의 생산 기술로 연계되기 때문에 산업적 응용가치가 매우 크다.

이에, 본 발명자는 자일란 가수분해 반응시 자일란 용해도를 높이기 위해 고온에서 반응시에도 안정된 활성을 유지하는 재조합 엔도자일라나제를 생산하고, 상기 재조합 엔도자일라나제를 자일란과 반응시켜 자일로올리고당을 제조하는 방법을 개발하고자 하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 자일란이라는 물질을 분해할 수 있는 미생물의 존재를 착안하여, 바실러스 유래의 엔도자일라나제 유전자를 재조합하고, 이를 효모에 형질전환하여 발현시키고, 발현된 엔도자일라나제를 이용하여 자일란과 반응시켜 자일로올리고당의 제조방법을 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기와 같이 바실러스 (Bacillus sp.)유래의 엔도자일라나제(endoxylanase) 유전자를 포함하는 유전자 개 열지도를 갖는 것을 특징으로 하는 재조합 발현 벡터 pAEDX-1을 제공한다.

또한, 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 발현벡터로 형질전환된 미생물을 제공한다.

또한, 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 미생물을 배양하여 엔도자일라나제를 대량 생산함을 특징으로 하는 재조합 엔도자일라나제의 생산방법을 제공한다.

더 나아가, 본 발명은 효소를 이용하여 자일로올리고당을 생산하는 방법에 있어서, 상기 방법으로 생산된 재조합 엔도자일라나제를 자일란(xylan)과 반응시켜 자일로올리고당을 수득하는 자일로올리고당의 제조방법을 제공한다.

그리고, 본 발명의 재조합 엔도자일라나제는 자일로올리고당의 생산효율적 측면에서 2∼6%의 자일란 용액과 반응시키는 것이 바람직하다. 이는 2% 미만은 효율적 측면에서 종래의 효소의 생산효율과 차이가 없기 때문이고, 6%를 초과하면 자일로올리고당의 생산효율이 오히려 크게 저하되기 때문이다.

또한, 본 발명에 따른 재조합 엔도자일라나제와 자일란의 반응도 자일로올리고당의 생산효율적인 측면에서 40∼80℃의 고온 조건에서 처리하는 것이 바람직하다.

이하, 본 발명을 상세히 설명하기로 한다.

이때, 사용되는 기술 용어 및 과학 용어에 있어서 다른 정의가 없다면, 이 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 통상적으로 이해하고 있는 의미를 가진다.

또한, 종래와 동일한 기술적 구성 및 작용에 대한 반복되는 설명은 생략하기로 한다.

본 발명은 엔도자일라나제를 대량 생산하는 미생물을 제조하기 위하여, 한국과학기술원으로부터 분양받은 플라스미드로부터 엔도자일라나제 유전자를 제한효소로 절단하고, 절단된 엔도자일라나제를 상기 동일한 제한효소로 절단한 발현 벡터에 삽입하여 재조합 발현 벡터를 제조하는 단계와; 상기 단계에서 제조된 재조합 발현 벡터를 미생물(균주)에 도입하여 형질전환시키고, 형질전환된 미생물을 선택배지에서 선택하여 냉동보관하는 단계와; 상기 단계의 미생물을 엔도자일라나제가 대량발현되는 조건에서 배양하는 단계와; 상기 배양이 완료된 배양액을 원심분리하여 엔도자일라나제를 대량으로 함유한 상층액인 조효소액을 수득하고, 상기 조효소액에 황산암모늄을 가하여 엔도자일라나제을 포함하는 수용성 단백질의 침전을 유도하고, 원심분리 및 정제하여 엔도자일라나제가 농축된 조효소액 또는 효소액을 제조하는 단계; 및 상기 단계에서 얻은 조효소액 또는 효소액을 자일란과 반응시켜 자일로올리고당을 생산하는 단계를 포함하여 구성된다.

이때, 본 발명의 재조합 발현 벡터는 pVT103-U 벡터에 바실러스 유래의 엔도자일라나제 유전자를 삽입한 pAEDX-1를 사용하는 것이 바람직하고, 상기 재조합 발현 벡터의 플라스미드 추출을 위해, pAEDX-1을 대장균 DH5α(E. coli DH5α)에 형질전환시켜 플라스미드를 대량 생산하고, 상기 생산된 플라스미드를 추출한 다음, 상기 추출된 플라스미드를 효모(SEY2102)에 형질전환하고 이를 배양하여 엔도자일나제를 대량 생산하게 하는 것이 바람직하다.

그리고, 상기 본 발명에 따라 제조된 형질전환된 효모 중, 생산되는 재조합 자일라나제가 활성을 가지면서 자일라나제를 과발현할 수 있는 우수한 효모를 선택하여 장기간 보존할 수 있게 냉동보관한 후, 상기 냉동보관된 효모를 농업진흥청 농업생명공학연구원 한국농용미생믈 보존센터에 기탁신청하여 2004년 6월 19일일자로 기탁하여 기탁번호 KACC 93014를 부여받았다.

또한, 본 발명의 조효소액 또는 효소액의 제조를 위하여, 형질전환된 미생물을 배양하는 배지는 YP 배지(1% Bacto-yeast extract, 2%Bacto-peptone)에 1% 덱스트로스(dextrose)를 첨가한 YPD 배지(1% Bacto-yeast extract, 2% Bacto-peptone, 2% Dextrose)를 사용하는 것이 바람직하고, 상기 정제의 방법으로는 황산암모늄을 이용한 염석 후, 이를 제거하기 위해 투석하여 조효소액으로 사용하거나, 컬럼을 통해 90% 이상의 정제도를 가진 재조합 자일라나제 효소액을 사용하는 것이 바람직하다.

그리고, 본 발명에 따라 생산된 재조합 엔도자일라나제는 자일란과 반응 시, 바실러스 균주에서 생산된 자일라나제(Jeong, K. J., I. Y. Park, M. S. Kim, and S. C. Kim, Appl. Microbiol. Biotechnol. 50, 113∼118, 1998)와는 달리 다음과 같은 특성을 가진다.

(1) 엔도자일라나제의 내열성

바실러스 균주에서 생산된 야생형 엔도자일라나제가 자일란을 분해하는 반응온도가 45∼50℃인 반면, 본 발명에 따른 엔도자일라나제는 60∼80℃의 높은 온도에서 자일란을 분해할 수 있는 내열성을 가진다.

(2) 고농도의 기질에 대한 반응성

야생형 엔도자일라나제가 통상적으로 1∼2% 자일란 농도에서 최적의 활성도를 갖고 있으나 그 이상의 기질 농도에서는 활성이 급격히 저하되는 반면, 본 발명에 따른 엔도자일라나제는 높은 온도에서도 반응을 할 수 있는 특성으로 4∼6%의 자일란 농도에서도 활성이 저감되지 않는다.

(3) 생성물질

야생형 엔도자일라나제는 자일란을 가수분해 할 시, 자일로바이오즈(xylobiose)를 자일로트리오즈(xylotriose)보다 많이 생성하나, 본 발명에 따른 엔도자일라나제는 자일로즈는 생성하지 않고 자일로바이오즈(xylobiose)과 자일로트리오즈(xylotriose)를 동량으로 생성한다.

따라서, 본 발명의 엔도자일라나제는 바실러스 유래의 야생형 자일라나제와는 달리, 고온 및 고농도의 기질에서 활성도가 저하되지 않기 때문에 자일로올리고당의 생산성이 매우 우수하면서, 균형있는 자일로올리고당을 생산하는 특징을 가지 게 된다.

이때, 상기의 유전자 조작 등과 관련되는 일반적인 분자생물학적 실험방법은 공지의 방법(Sambrook, J. 등,1989; Molecular cloning. A laboratory Manual. 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory. Cold Spring Harbor. New York.; Ausubel, F. 등, 1995.; Short Protocols in Molecular Biology. 3rd. John & Wiley Sons, Inc.)을 따랐다.

이하, 본 발명의 구체적인 방법을 실시예를 상세히 설명하고자 하지만 본 발명의 권리범위는 이들 실시예에만 한정되는 것은 아니다.

[실시예 1] 재조합 발현 벡터 및 형질전환 미생물 제조

본 실시예에서는 유전자 조작 등과 관련된 공지의 분자생물학적 실험방법(Sambrook, J. 등, 1989; Molecular cloning. A laboratory Manual. 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory. Cold Spring Harbor. New York.; Ausubel, F. 등, 1995.; Short Protocols in Molecular Biology. 3rd. John & Wiley Sons, Inc.)에 따라 효모에서 엔도자일라나제(endoxylanase) 유전자를 발현시키고자 하였다.

먼저, 바실러스 발현 벡터인 pJHKJ4로부터 Sau3AI 으로 절단된 엔도자일라나제 유전자 단편을 BamHI으로 절단한 플라스미드 pVT103-U에 삽입시켜 플라스미드 pAEDX-1(7,630bp)을 제작하였다.

제작이 완성된 재조합 발현 벡터인 플라스미드 pAEDX-1의 염색지도는 도 1에 나타내었다.

그런다음, 상기의 제작된 플라스미드 pAEDX-1을 대장균 DH5α(E. coli DH5 α)에 형질전환시켜 배양하고, 상기 배양하여 증식된 대장균으로부터 다량의 플라스미드를 추출한 후, 상기 추출된 플라스미드를 효모(SEY2102)에 형질전환시키고, 이를 냉동보관하고, 상기 냉동보관된 효모를 농업진흥청 농업생명공학연구원 한국농용미생물 보존센터에 기탁신청하여 2004년 6월 19일자로 기탁번호 KACC 93014를 부여받았다.

[실시예 2] 재조합 엔도자일라나제의 발현

본 실시예에서는 상기 실시예 1에서 제작한 효모 SEY2102/pAEDX-1 균주(S. cerevisiae SEY2102/pAEDX-1; 기탁번호 KACC93014)가 생산하는 엔도자일라나제의 활성 수준을 확인하기 위하여 아래와 같이 실험을 수행하였다.

이때, 균주의 생장은 배양액을 기준으로 흡광도(OD₆₀₀)에서 비교하여 활성을 측정하였으며, 엔도자일라나제 효소 활성을 유니트(unit/㎖)로 표시하고, 1 유니트는 60℃에서 1분간 1 마이크로몰(μ mole)의 환원당을 방출하는 효소의 량으로 결정하였으며, 이때 효소활성의 측정은 흡광도 550 nm에서 측정하였다.

우선, 상기 확보한 형질전환체 사카라마이세스 세레비지애 SEY2102/pAEDX-1(S. cerevisiae SEY2102/pAEDX-1)균주를 10㎖의 YNBCAD 배지[0.67% 아미노산이 없이 질소만 있는 효모 추출물(yeast nitrogen base without amino acids), 2% 포도당, 0.5% 카사미노산(casamino acid)]에 접종(inoculation)하여 전배양한 후, 상기 균주 배양액을 새로운 50㎖의 YPD 배지 (1% 효모 추출물, 2% 폴리펩톤, 2% 덱스트 로스)에 1% 접종하고 시간별로 균주의 생장과 엔도자일라나제의 활성을 측정하였다.

이의 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, 엔도자일라나제의 발현은 6시간 이후부터 발현되어 균체증식과 비례하여 12시간까지 높게 발현되었고 12시간 이후의 낮은 증식속도구간에서는 느리게 발현되는 것을 알 수 있었으며, 그 활성은 ㎖당 약 6.7 유니트임을 알 수 있었다.

실시예 3. 재조합 엔도자일라나제에 의한 자일란 가수분해 산물 조사

본 실시예에서는 본 발명의 엔도자일라나제에 의한 자일란 최종반응 산물을 분석하기 위해 귀리 자일란을 기질로 하여 최적 반응조건하에서 가수분해 반응을 실시하고 최종 가수분해 산물을 박층 크로마토그래피(TLC; Thin layer chromatography)로 분석하여 바람직한 반응조건을 찾고자 하였다.

이때, 기질 용액은 20 mM 인산완충액(pH 6.5)에 자일란의 농도를 조절하여 사용하였다.

(1) 4%의 기질(자작나무 자일란) 용액에 재조합 엔도자일라나제를 60℃에서 반응시킨 결과

도 3에 나타난 바와 같이 본 발명에 의해 제조된 엔도자일라나제는 최종산물로 바실러스 속 균주 유래의 자일라나제에 의한 자일란 가수분해 산물 (Jeong, K. J., I. Y. Park, M. S. Kim, and S. C. Kim, Appl. Microbiol. Biotechnol. 50, 113-118, 1998., 미도시)과는 달리, 자일로즈는 생산하지 않고 자일로바이오즈와 자일로트리오즈 등을 생산하며, 60℃이상에서도 생산물 감소가 일어나지 않으며, 높은 기질 농도에서 가수분해 반응이 가능하다는 점에서 큰 차이가 있음을 알 수 있었다.

이때, 도 3에서 S는 자일로스, 자일로바이오즈, 자일로트리오즈의 표준물질, C는 효소를 첨가하지 않은 기질 반응액을 나타내고, 1 내지 7 래인은 각각 반응 시간이 10분, 30분, 1시간, 2시간, 4시간, 8시간 및 12시간 동안 반응시킨 반응액을 나타낸 것이다.

(2) 6%의 기질(자작나무 자일란) 용액에 재조합 엔도자일라나제를 60℃ 이상의 고온에서 반응시킨 결과

도 4에 나타난 바와 같이, 본 발명에 의해 제조된 엔도자일라나제는 6%의 높은 기질농도와70℃ 내지 80℃의 고온에서 자일로바이오즈와 자일로트리오즈를 생산하는 활성을 가지고 있음을 알 수 있었다.

이때, 도 4에서 S는 자일로스, 자일로바이오즈, 자일로트리오즈의 표준물질이고, C는 효소를 첨가하지 않은 기질 반응액을 나타내고, 1 내지 4 래인은 각각 반응 시간이 10분, 20분, 40분 및 1시간동안 반응시킨 반응액을 나타낸 것이다.

이와같이, 본 발명의 재조합 엔도자일라나제는 고농도 기질, 고온에서 자일란 물질을 분해하여 기능성이 우수한 자일로올리고당을 생산하는 것을 알 수 있었다.

이는 본 발명의 재조합 엔도자일라나제가 종래 엔도자일라나제와는 달리 고온에서 활성을 유지할 수 있기 때문에, 고농도의 기질과 반응할 수 있는 것으로 판 단된다.

따라서, 본 발명의 종래 엔도자일라나제의 자일란 생산 효율보다 2배 내지 3배가 우수한 것을 입증하였다.

또한, 본 발명의 재조합 엔도자일라나제를 기질인 자일란과 50∼80℃의 고온에서 반응시켜, 최종 가수분해산물의 차이를 확인하고자 하였다.

이의 결과, 도 5에서 나타난 바와 같이 본 발명에 따라 제조된 엔도자일라나제는 온도차이에 의한 활성의 변화는 없는 것으로 나타났다.

또한, 자일로올리고당의 고효율 생산과 자일란이 완전 가수분해 되기 위해서는 고온에서 고농도 기질과 반응시 엔도자일라나제의 활성 유지가 필수적인 데, 본 발명의 내열성 엔도자일라나제가 가장 적합하게 이용될 수 있을 것으로 예상된다.

이와 같이, 거의 활용이 되고 있지 않고 폐기되고 있는 식물섬유물질 중 자일란(xylan)으로부터 효소학적 및 선택적으로 분해시켜 산업적으로 고부가가치를 가지면서 응용가치가 높은 자일로올리고당을 생산하기 위해, 본 발명은 자일란과 반응하여 자일로올리고당을 특이적으로 생산하면서 고온에서 최적의 활성을 갖고 있기 때문에, 높은 기질농도에서 자일로올리고당의 생산효율이 저감되지 않는 상업적으로 우수한 재조합 엔도자일라나제를 미생물을 이용하여 양질의 자일로올리고당을 대량으로 제공할 수 있게 되었다.

또한, 상기 대량 생산된 재조합 엔도자일라나제를 기능성 식품 소재인 자일로올리고당의 생산공정이나 펄프산업의 표백공정에 사용하여 고부가가치인 자일로 올리고당의 생산비용을 저렴하게 하고, 환경오염 문제를 발생하는 폐수의 처리비용을 절감할 수 있기 때문에, 동종업계에 진출 시 큰 파급효과가 있을 것으로 예상된다.

Claims

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효소를 이용하여 자일로올리고당을 생산하는 방법에 있어서,

기탁번호 KACC 93014인 효모(Saccharomyces cerevisiae) SEY2102/pAEDX-1 균주를 배양하여 생산한 재조합 엔도자일라나제를 2∼6%의 자일란(xylan)용액과 60∼80℃의 온도에서 반응시켜 자일로올리고당을 수득하는 자일로올리고당의 제조방법.
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