KR20000034279A - 고초균 유래 엔도자일라나제의 신호서열 유전자를 포함한재조합 플라스미드 및 그를 이용한 외래 단백질의 제조방법 - Google Patents

고초균 유래 엔도자일라나제의 신호서열 유전자를 포함한재조합 플라스미드 및 그를 이용한 외래 단백질의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 고초균(Bacillus subtilis) 유래 엔도자일라나제(endoxylanase)의 분비 신호서열(secretion signal sequence) 유전자를 포함한 재조합 플라스미드 및 전기 플라스미드에 원하는 외래 단백질의 유전자를 삽입하고 그를 대장균에 도입하여 형질전환체를 배양하고 발현을 유도함으로써, 재조합 대장균의 세포질 밖으로 효율적으로 분비된 외래 단백질의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명의 재조합 플라스미드는 여러 대장균 및 여러 발현시스템에서 매우 높은 단백질 분비효율을 나타내는 바, 이러한 점을 이용하여 특정 외래 단백질을 대량생산한다면, 주변 세포질(periplasm)로의 분비가 가능하기 때문에 분리 및 정제 과정에서의 경비와 시간을 상당히 줄이는 효과를 얻을 수 있어, 산업적인 측면에서 재조합 단백질의 경제적인 생산을 가능케 한다.

Description

고초균 유래 엔도자일라나제의 신호서열 유전자를 포함한 재조합 플라스미드 및 그를 이용한 외래 단백질의 제조방법
본 발명은 고초균(Bacillus subtilis) 유래 엔도자일라나제(endoxylanase)의 분비 신호서열(secretion signal sequence) 유전자를 포함한 재조합 플라스미드 및 그를 이용한 외래 단백질의 제조방법에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 전술한 재조합 플라스미드 및 전기 플라스미드에 원하는 외래 단백질의 유전자를 삽입하고 그를 대장균에 도입하여 형질전환체를 배양하고 발현을 유도함으로써, 재조합 대장균의 세포질 밖으로 효율적으로 분비된 외래 단백질의 제조방법에 관한 것이다.
유전자조작 기술이 발전하면서 박테리아 또는 여러 동·식물들을 숙주세포로 이용한 유용 단백질의 대량생산 연구도 많이 이뤄지고 있다. 현재까지 대장균은 여러 유용 단백질을 대량 생산하는데 가장 널리 이용되고 있는 숙주세포이며, 이에 관한 연구도 가장 많이 이뤄지고 있는 실정이다(참조: Hodgson, J., Bio/Technology, 11:887-8932(1993); Lee, S.Y., Trends Biotechnol., 14:98-105 (1996)).
그러나, 최근들어 생산하고자 하는 유용 단백질이 재조합 대장균의 세포질내에서 생산되는 경우, 다음과 같은 많은 문제점들이 노출되고 있다: ① 세포질내에서 생산된 단백질은 상당히 복잡하고 고비용의 분리·정제과정을 거쳐야 하고, ② 세포질내에서 생산된 단백질은 세포질내에 존재하는 여러 가지 프로테아제(protease)에 의해 쉽게 분해되기 때문에 그의 수율이 낮아지며, ③ 세포질내에 과다 발현된 단백질은 완전한 접힘(folding)을 이루지 못하고 단백질 활성을 잃은 상태의 불용성 봉입체(inclusion body)를 형성하는 경우가 대부분이어서, 이 불용성 단백질로부터 생물학적 활성을 가진 수용성 단백질을 얻기 위하여서는 복잡하고도 비용이 많이 소요되는 변성(denaturation)과 재접힘(refolding) 과정이 필요하다(참조: Kane and Hartley, Trends Biotechnol., 6:95-1014(1988)).
전술한 문제점들을 해결하기 위한 방법 중의 한가지로서, 재조합 대장균의 세포질내에서 생산된 유용 단백질을 주변 세포질(periplasm)이나 배양액으로 분비(secretion)시키는 방법이 개발되었다. 따라서, 이 방법은 다음과 같은 여러 가지 장점을 가지고 있다: ① 주변 세포질이나 배지내에는 세포질내에 비해 상당히 적은 단백질이 존재하기 때문에, 원하는 유용 단백질은 고순도로 분리 및 정제될 수 있고(참조: Nossal, N.G. et al., J. Biol. Chem., 241:3055-3062(1966)), ② 주변 세포질이나 배양액으로 분비된 유용 단백질은 대부분의 프로테아제가 존재하는 세포질로부터 분리되기 때문에, 세포질내 프로테아제에 의한 분해를 사전에 막을 수 있어, 유용 단백질의 수율을 증진시킬 수 있으며(참조: Meerman, H.J., and Georgiou, G., Ann. N. Y. Acad. Sci., 721:292-302(1994)), ③ 주변 세포질은 세포질 내보다 더욱 산화된 환경이기 때문에 다이설파이드(disulfide) 결합이 훨씬 용이하게 이루어지고, 결국 생산된 단백질의 올바른 접힘(folding)이 형성됨으로써 불용성 봉입체의 형성이 현저히 줄어든다(참조: Hockney, TIBTECH, 12:456-463 (1994)).
대장균에서 주변 세포질 혹은 세포 밖으로 분비되는 단백질은 특정 N-말단(N-terminal) 서열을 가지고 있는데, 이 특정 서열을 분비 신호서열(secretion signal sequence)이라고 명명한다. 세포질 밖으로 수송 가능한 모든 단백질은 모두 이 신호서열을 가지고 있으며, 이 신호서열은 주변 세포질에서 시그널 펩티데이즈(signal peptidase)에 의해 잘려지게 된다. 따라서, 이 특정 신호서열은 대장균에서 단백질을 분비하는데 있어 필수적인 것이다.
이에, 대장균에서 분비되지 않는 외래 단백질은 공지된 분비 신호서열(OmpA, OmpF, PhoA, SpA 등)을 외래 단백질의 N-말단에 연결하거나 혹은 이들 신호서열을 약간 변형시켜 연결하여 발현시킴으로써, 주변 세포질이나 배양액으로 분비시키고있다(참조: Abrahmsen, L. et al., EMBO J., 4:3901-3906(1985); Jobling, M.G. et al., Plasmid, 38:158-173(1997); Klein, B.K. et al., Protein Eng., 5:511-517(1992); Utsumi, S. et al., Gene, 71:349-358(1988)).
그러나, 단백질의 분비 효율은 선택된 신호서열이나 유용 단백질의 종류에 따라 많은 차이를 나타내며, 분비가 전혀 이뤄지지 않는 경우도 흔히 있다. 이는 아직까지 신호서열과 발현대상 단백질과의 상호관계에 대해서 정확하게 규명되지 않았기 때문에 발생되는 현상이다. 따라서, 대상 단백질을 좀 더 효율적으로 분비시킬 수 있는 새로운 신호서열에 대한 연구가 지금도 전세계적으로 진행되고 있다.
이에, 본 발명자들은 외래 단백질을 보다 효과적으로 재조합 대장균의 세포밖으로 분비할 수 있는 신호서열에 대한 탐색을 수행한 결과, 고초균(Bacillus subtilis)에서 생산되는 엔도자일라나제의 분비에 관여하는 신호서열이 대장균에서도 작용함을 알아내어 그 신호서열을 채용한 재조합 플라스미드를 개발하고, 전기 플라스미드에 목적하는 외래 단백질의 유전자를 삽입한 다음, 다양한 대장균 균주를 형질전환시켰을 때, 지금까지 대장균에서 외래 단백질의 분비생산에 이용된 어떤 분비 신호서열보다 다량의 외래 단백질이 세포질 밖으로 효율적으로 분비되는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
결국, 본 발명의 주된 목적은 고초균 유래 엔도자일라나제의 분비 신호서열 유전자를 포함하는 재조합 플라스미드를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 전기 재조합 플라스미드에 원하는 외래 단백질의 유전자를 삽입하고 그를 대장균에 도입한 다음, 전기 형질전환체를 배양하여 발현을 유도하는 공정을 포함하는 외래 단백질의 제조방법을 제공하는 것이다.
도 1은 본 발명에 이용된 고초균 유래 엔도자일라나제 분비 신호서열의 아미노산 서열과 DNA 서열을 나타낸다.
도 2는 플라스미드 pJS101의 유전자 지도이다.
도 3은 플라스미드 pJS101로 형질전환된 재조합 대장균으로부터 분획한 단백질들을 SDS-PAGE 겔 상에서 분석한 결과를 나타내는 전기영동 사진이다.
도 4는 플라스미드 pJS301의 유전자 지도이다.
도 5는 플라스미드 pJS101ΔP의 유전자 지도이다.
도 6은 플라스미드 pTrcS1PhoA의 유전자 지도이다.
도 7은 플라스미드 pTrcS1PhoA로 형질전환된 재조합 대장균 BL21(DE3)로부터 분획한 단백질들을 SDS-PAGE 겔 상에서 분석한 결과를 나타내는 전기영동 사진이다.
도 8은 플라스미드 pTrcS1PhoA로 형질전환된 재조합 대장균 HB101로부터 분획한 단백질들을 SDS-PAGE 겔 상에서 분석한 결과를 나타내는 전기영동 사진이다.
도 9는 플라스미드 pTrcS1PhoA로 형질전환된 재조합 대장균 XL1-Blue로부터 분획한 단백질들을 SDS-PAGE 겔 상에서 분석한 결과를 나타내는 전기영동 사진이다.
이하, 본 발명을 보다 구체적으로 설명하고자 한다.
고초균(Bacillus subtilis) 유래 엔도자일라나제의 분비 신호서열을 가지는 재조합 플라스미드를 구축하고자, 우선 중합효소 연쇄반응에 의해 분비 신호서열을 포함하는 엔도자일라나제 유전자가 삽입된 재조합 플라스미드 pKJX4(참조: Jeong, K.J. et al., Enzyme Microb. Technol. 22:599-605(1998))로부터 엔도자일라나제 분비 신호서열만을 유전자 증폭시켰다. 이렇게 증폭된 약 650 bp 크기의 DNA 절편을 아가로즈 겔 전기영동하여 얻고, 유도가능하고 강력한 trc 프로모터를 갖고 있는 플라스미드 pTrc99A(참조: Amann, E., Gene, 69:301-309(1988))에 삽입하여 재조합 플라스미드 pJS101를 제조하였다.
전기에서 제조된 재조합 플라스미드 pJS101은 엔도자일라나제의 분비 신호 서열과 엔도자일라나제 유전자가 제한 효소 PstI 절단부위에 의해 직접 결합되어 있으며, 엔도자일라나제 유전자의 3'-말단에 제한 효소 BamHI, XbaI, SalI, PstI, HindIII 절단부위를 가진다. 따라서, 재조합 플라스미드 pJS101에서 발현 대상 단백질로 사용된 엔도자일라나제의 유전자 대신에, 다른 외래 단백질을 분비하기 위해서는 엔도자일라나제 분비 신호서열의 3'-말단에 존재하는 제한 효소 PstI 절단부위와 엔도자일라나제 유전자의 3'-말단에 존재하는 제한 효소 BamHI, XbaI, SalI, PstI 또는 HindIII 절단부위 중 하나를 이용하여, 대상 단백질을 제거시키고 분비하고자 하는 다른 단백질의 유전자를 삽입시킬 수 있다.
아울러, 재조합 플라스미드 pJS101은 분비 신호서열의 3'-말단과 대상 단백질의 3'-말단에 각각 1개씩의 PstI 절단부위가 존재하기 때문에, 분비코자 하는 외래 단백질의 유전자를 삽입시키는데 있어 불편한 점을 가지고 있었다.
이에, 엔도자일라나제 유전자의 3'-말단에 존재하는 제한 효소 PstI 절단부위를 제거시켜, 재조합 플라스미드 pJS101ΔP를 제조하였다.
따라서, 재조합 플라스미드 pJS101ΔP에 분비코자 하는 외래 단백질의 유전자를 삽입시키기 위해서는 엔도자일라나제 분비 신호서열의 3'-말단에 존재하는 제한 효소 PstI과 엔도자일라나제 유전자의 3'-말단에 존재하는 제한 효소 BamHI, XbaI 중 하나로 절단하여 엔도자일라나제 유전자를 제거한 다음, 분비하고자 하는 외래 단백질의 유전자를 삽입하면 된다. 결국, 재조합 플라스미드 pJS101ΔP는 분비하고자 하는 외래 단백질의 유전자를 매우 용이하게 삽입시킬 수 있고, 엔도자일라나제 분비 신호서열과 외래 단백질의 유전자 서열에 변화를 초래하지 않고 그들을 직접 연결할 수 있는 벡터이다.
한편, 유도가능하고 강력한 T7 프로모터하에서의 발현 정도를 알아보기 위하여, T7 프로모터를 가진 플라스미드 pET21c(참조: Zhang, G.Q. et al., Microbiol. Immunol., 42:423-428(1998))를 제한효소 NdeI과 BamHI으로 절단하고, 역시 이들 두가지 제한효소로 절단된 재조합 플라스미드 pJS101로부터 수득한 분비 신호서열 함유의 엔도자일라나제 DNA 절편을 클로닝하여, 재조합 플라스미드 pJS301을 제조하였다.
전기에서 제조된 재조합 플라스미드 pJS301에서 발현 대상 단백질로 사용된 엔도자일라나제의 유전자 대신에, 다른 외래 단백질을 분비하기 위해서는 엔도자일라나제 분비 신호서열의 3'-말단에 존재하는 제한 효소 PstI 절단부위와 엔도자일라나제 유전자의 3'-말단에 존재하는 제한 효소 BamHI 절단부위를 이용하여, 대상 단백질을 제거시키고 분비하고자 하는 다른 단백질의 유전자를 삽입시킬 수 있다.
상기에서 제조된 재조합 플라스미드 pJS101, pJS101ΔP 또는 pJS301는 대장균 XL1-Blue, 대장균 MC4100, 대장균 BL21(DE3) 또는 대장균 HB101 등의 대장균 균주에 도입하고, 이 형질전환체를 배양하여, 발현유도인자, 예를 들면 IPTG(isopropyl-β-thiogalactoside)를 첨가하여 발현을 유도한 다음, 배양액을 일정량 채취하여 전체 단백질, 주변세포질 단백질 및 세포질 단백질로 각각 분획하였다. 분획한 단백질들은 SDS-PAGE(sodium-dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis) 겔 전기영동으로 분석한 결과, 엔도자일라나제 분비 신호서열을 이용하여 외래 단백질을 분비 생산할 경우 전체적으로 그 분비 효율이 최저 6% 이상으로서 매우 우수하였다.
종래의 분비 신호서열을 가진 외래 단백질을 강한 프로모터를 사용하여 다량 발현시킬 경우, 일반적으로 분비 신호서열과 외래 단백질의 유전자 사이에 링커(linker)를 두어 전기 두가지를 서로 연결시킨다. 그러나, 전술한 본 발명의 재조합 플라스미드는 엔도자일라나제 분비 신호서열의 3'-말단에 존재하는 제한 효소 PstI 절단부위에 분비코자 하는 외래 단백질의 유전자를 링커(linker)없이 직접 연결시킴으로써, 엔도자일라나제 분비 신호서열과 외래 단백질의 유전자 서열에 변화를 초래하지 않는다. 이때, 분비 신호서열과 외래 단백질의 유전자를 연결시킬 경우, 외래 단백질 유전자의 5'-말단은 엔도자일라나제 분비 신호서열의 3'-말단에 존재하는 제한 효소 PstI 절단부위와 직접 연결되도록 하는 PstI 절단부위 이외에도, 또 다른 제한 효소 BsaI, BbsI, BbvI, BsmAI, BsmBI, BsmFI, BspMI, SfaNI 등을 사용하여도 유전자 서열의 변화없이 엔도자일라나제 분비 신호서열의 3'-말단에 바로 연결가능하도록 유전자 조작을 할 수 있다. 따라서, 본 발명의 재조합 플라스미드는 분비하고자 하는 단백질의 N-말단에 링커에 해당하는 아미노산의 첨가없이, 도입한 외래 단백질만을 분비할 수 있는 장점이 있는 바, 이는 산업적으로 유용한 단백질의 생산에 매우 유효하다.
두 번째 발현 대상 단백질로서는 대장균에서 유래한 알칼라인 포스파타제(alkaline phosphatase)를 이용하였다. 알칼라인 포스파타제는 450개의 아미노산으로 구성된 약 50 kDa의 분자량을 가지고, 대장균에서 발현되어 주변 세포질로 분비될 때에만 효소 활성을 갖는 것으로 알려졌다(참조: Manoil, C. et al., Science, 233:1403-1408(1986)). 알칼라인 포스파타제의 유전자를 두가지 제한효소 PstI과 BamHI으로 절단하고, 이와는 별도로 재조합 플라스미드 pJS101ΔP를 PstI과 BamHI으로 절단하여, 이들을 연결시켜 재조합 플라스미드 pTrcS1PhoA를 제조하였다.
상기에서 제조된 재조합 플라스미드 pTrcS1PhoA는 대장균에 도입하고, 이 형질전환체를 배양하여, IPTG를 첨가하여 발현을 유도한 다음, 배양액을 일정량 채취하여 전체 단백질, 주변세포질 단백질, 세포질 단백질, 불용성 봉입체(inclusion ody)와 수용성 단백질로 각각 분획하였다. 분획한 단백질들은 SDS-PAGE 겔 전기영동하여 단백질 생성정도 및 분비정도를 확인하였는 바, 플라스미드 pTrcS1PhoA를 갖고 있는 재조합 대장균에서의 알칼라인 포스파타제의 분비정도를 알아보면, 유도발현 후 4시간에 분비된 알칼라인 포스파타제가 전체단백질에서 차지하는 비율은 약 6.9% 이상으로서, 상당히 좋은 효율의 분비능을 보여주었다. 또한, 플라스미드 pTrcS1PhoA로 형질전환된 재조합 대장균에서 생산된 알칼라인 포스파타제의 활성도를 측정해 본 결과, 약 4400(U/mL) 이상의 매우 높은 활성도를 나타내었다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다. 특히, 본 발명의 플라스미드 pJS101, pJS301 및 pJS101ΔP는 외부 유전자로서 하기 실시예에서 기술하고 있는 엔도자일라나제 유전자 또는 알칼라인 포스파타제 유전자 뿐만 아니라, 각종 외래 단백질의 유전자를 도입하여 그의 발현에 이용될 수 있다. 따라서, 외래 단백질의 유전자로서 엔도자일라나제 유전자가 삽입된 재조합 플라스미드 pJS101, pJS301 및 pJS101ΔP, 알칼라인 포스파타제 유전자가 삽입된 재조합 플라스미드 pTrcS1PhoA 뿐만 아니라, 재조합 플라스미드 pJS101, pJS301 또는 pJS101ΔP에 각종 유전자가 삽입된 재조합 플라스미드도 본 발명의 범주에 속한다고 보아야 할 것이다.
실시예 1 : 재조합 플라스미드 pJS101의 제조
고초균에서 분리된 엔도자일라나제 유전자로부터 분비 신호서열만을 유전자 증폭시키기 위하여, 5' 말단의 84 bp 분비 신호서열(참조: 도 1)을 포함하는 639 bp의 엔도자일라나제 유전자가 삽입된 재조합 플라스미드 pKJX4를 주형 DNA(template DNA)로, 서열번호 1 및 서열번호 2의 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 사용하여 중합효소 연쇄반응을 수행하였다. 엔도자일라나제의 분비 신호서열은 제 1도에 나타내었다.
상기의 중합효소 연쇄반응에서, 첫 번째 변성(denaturation)은 94℃에서 5분간 1회 수행하였고; 이후 두 번째 변성은 94℃에서 45초간, 교잡(annealing)은 48℃에서 45초간, 연장(extension)은 72℃에서 50초간 수행하였으며, 이를 30회 반복하였고; 이후 72℃에서 7분간 마지막 연장을 1회 수행하였다. 이와 같은 중합효소 연쇄반응 방법으로 얻어진 DNA를 아가로즈 겔 전기영동하여 약 650 bp 크기의 DNA 절편을 분리하였으며, 이를 두가지의 제한효소 BsaI과 BamHI으로 절단하여 약 495 bp DNA와 155 bp DNA 절편을 얻었다. 이와는 별도로, 유도가능하고 강력한 trc 프로모터를 갖고 있는 플라스미드 pTrc99A는 두가지의 제한효소 NcoI과 BamHI으로 절단하였다.
상기에서 절단된 플라스미드 pTrc99A에 상기의 두가지 DNA 절편들(495 bp DNA 절편과 155 bp DNA 절편)을 클로닝하여, 재조합 플라스미드 pJS101를 제조하고, 전기 재조합 플라스미드를 일렉트로포레이션(electroporation) 방법을 이용하여 대장균 XL1-Blue에 도입하였다. 이렇게 형질전환된 대장균 균주는 항생제 엠피실린(ampicillin, 50μg/L)이 첨가된 LB 평판배지에서 선별되었고, 이로부터 pJS101 재조합 플라스미드를 수득하였다. 이 재조합 플라스미드 pJS101의 유전자 지도는 도 2에 나타내었다.
실시예 2 : 플라스미드 pJS101로 형질전환된 재조합 대장균의 단백질 분비능비교
실시예 1에서 제조된 재조합 플라스미드 pJS101로 형질전환된 대장균XL1-Blue[supE44 hsdR17 recA1 endA1 gyrA96 thi relA1 lacF'(proAB+lacIqlacZΔM15Tn(tetr))], 대장균 HB101[F-hsdS20 (rk -, mk -) recA13 ara-14 proA2 lacY1 galK2 rpsL20(str) xyl1-5 mtl-1 supE44 λ-] 및 대장균 MC4100[F-araD139 Δ(argF-lac)U169 rpsL150(strr) relA1 flbB5301 deoC1 ptsF25 rbsR]에서 엔도자일라나제의 분비능을 조사하기 위하여, 전기 재조합 대장균들을 LB 액체 배지 50 mL가 담긴 250 mL 플라스크에 접종하여 37℃에서 배양하였다. 그런 다음, pJS101 재조합 플라스미드는 trc 프로모터를 가지고 있으므로 IPTG를 첨가하여 유전자 발현을 유도하였는데, 이는 분광광도계로 600nm 파장에서 측정한 광학밀도(O.D.)가 0.7일 때 1 mM의 IPTG를 첨가하여 줌으로써 행하였다.
유도발현 후 4시간 경과한 다음에 배양액 1 mL씩을 채취하여, 전체 단백질, 주변세포질 단백질 및 세포질 단백질로 다음과 같이 각각 분획하였다: 전체 단백질은 배양액 1 mL를 4℃에서 6000 rpm으로 5분 동안 원심분리하여 얻은 침전물을 0.5 mL TE 완충용액(1 mM EDTA를 포함한 10 mM Tris-HCl, pH 8.0)으로 한번 세척한 다음, 다시 4℃에서 6000 rpm으로 5분 동안 원심분리하여 침전물을 수득하고, 그를 0.2 mL TE 완충용액에 현탁하여 초음파 파쇄함으로써 제조하였다.
주변세포질 단백질 및 세포질 단백질을 제조하기 위하여, 배양액 1 mL를 4℃에서 6000 rpm으로 5분 동안 원심분리하여 얻은 침전물에 20% 수크로스를 포함한 30 mM Tris-HCl(pH 8.0) 완충용액을 0.4 mL 넣고 충분히 섞어준 후, 1 mM EDTA를 첨가하여 약 10분 동안 상온에서 교반하였다. 이어, 다시 4℃에서 10,000 rpm으로 10분 동안 원심분리하여 침전물을 수득하고, 차가운 5 mM MgSO4용액를 0.4 mL 넣어 조심스럽게 섞은 후 얼음 속에서 약 10분 동안 교반한 다음, 4℃에서 10,000 rpm으로 10분 동안 원심분리하여 상층액 및 침전물을 각각 취하였다. 이때, 상층액은 세포의 주변 세포질에 있는 단백질로 하였으며, 침전물은 0.2 mL TE 완충용액에 현탁하고 초음파 파쇄하여 세포질 단백질로 하였다(참조: Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology(1989)).
상기에서 얻은 단백질 함유 용액을 64㎕씩 취하여 SDS-PAGE 샘플 버퍼(25% 글리세롤, 2% SDS, 14.4 mM 2-머캅토에탄올 및 0.1% 브로모페놀블루(bromophenol blue)를 포함한 60 mM Tris-HCl) 16㎕와 혼합하고 10분간 끓인 다음, 이를 12% 분리용 겔(separating gel)에서 SDS-PAGE 겔 전기영동하였다. 이어, 겔을 염색 용액(메탄올 40%, 아세트산 10% 및 쿠마시에 브릴리언트 블루 R(Coomassie brilliant blue R) 0.25 g/L으로 구성된 용액)에 2시간 이상 담가두어 염색하고, 다시 탈색 용액(메탄올 40% 및 아세트산 7%로 구성된 용액)에 2시간 이상씩 두 번 담가두어 탈색하였다(참조: 도 3).
도 3에서, 레인 M은 단백질 표준 분자량(200kDa, 97.4kDa, 68kDa, 43kDa, 29kDa, 18.4kDa, 14.3kDa)을 나타내며, 레인 1은 형질전환되지 않은 대장균 XL1-Blue의 전체 단백질을 나타내고, 레인 2 및 3은 pJS101 플라스미드로 형질전환된 대장균 XL1-Blue의 전체 단백질 및 주변세포질 단백질을 각각 나타내며; 레인 4는 형질전환되지 않은 대장균 HB101의 전체 단백질을 나타내고, 레인 5 및 6은 pJS101 플라스미드로 형질전환된 대장균 HB101의 전체 단백질 및 주변세포질 단백질을 각각 나타낸다. 또한, 화살표( ← )는 분비된 엔도자일라나제 단백질을 나타낸다. pJS101 플라스미드로 형질전환된 대장균 MC4100의 전체 단백질 및 주변세포질 단백질에 대한 SDS-PAGE 결과는 도 3에 나타내지 않았다.
상기 SDS-PAGE 겔 전기영동 결과는 덴시토메터(densitometer; ImageMasterTM, Pharmacia Biotech, Sweden)를 이용한 단백질의 정량에 이용하였으며, 그 정량 결과로부터 엔도자일라나제의 분비 정도(분비 신호서열이 절단된 성숙 엔도자일라나제의 함량)를 계산하여 하기 표 1에 나타내었다.
재조합 플라스미드 pJS101로 형질전환된 대장균에서 분비된 엔도자일라나제단백질의 함량
형질전환된 대장균 전체 단백질 중에서 분비된 엔도자일라나제단백질의 함량(%)
XL1-Blue 11.3 %
HB101 9.4 %
MC4100 10.5 %
상기 표 1에서 보듯이, trc 프로모터 조절하에 엔도자일라나제 분비 신호서열을 이용하여 단백질을 분비 생산할 경우, 전체적으로 그 분비 효율이 9.4% 내지11.3%로서, 엔도자일라나제 분비 신호서열을 이용한 외래 단백질의 분비 효율은 매우 우수함을 알 수 있었다.
한편, 주변세포질 분획에 내포된 단백질 함량은 상대적으로 적은 편인데, 이는 주변세포질 분획 방법의 효율에 원인을 둘 수 있다. 본 실험에 사용한 주변세포질 분획방법은 가장 일반적으로 사용되는 방법으로, 이는 목적의 단백질이 주변세포질에 수용성 상태로 존재할 때 이를 쉽게 분획하기 위한 방법이며, 만약 상대적으로 크기가 커진 불용성 봉입체로 존재하는 단백질이라면 본 방법으로 분획하기에는 효율이 매우 떨어진다. 즉, 실제 엔도자일라나제가 분비가 되어 주변 세포질에 존재는 하지만, 이들이 불용성 봉입체를 형성함으로써 본 실험에 사용한 주변세포질 분획방법으로는 분비된 대부분의 엔도자일라나제가 분획되지 않기 때문에, 주변세포질 분획에 내포된 단백질 함량이 적게 나타났다.
실시예 3 : 재조합 플라스미드 pJS301의 제조
재조합 플라스미드 pJS301을 제조하기 위하여, 우선 유도가능하고 강력한 T7 프로모터를 가진 플라스미드 pET21c는 두가지의 제한효소 NdeI과 BamHI으로 절단하여, 약 4.6 kb 크기의 DNA 절편을 얻었다. 이와는 별도로 재조합 플라스미드 pJS101을 NdeI으로 부분 절단한 후, 다시 BamHI으로 절단하여 약 650 bp 정도의 크기를 가지는 엔도자일라나제 DNA 절편을 분리하였다.
상기 두가지 DNA 절편을 T4 DNA 리가아제로 연결시켜 재조합 플라스미드 pJS301을 제조한 다음, 전기 재조합 플라스미드를 일렉트로포레이션 방법을 이용하여 대장균 XL1-Blue에 도입하였다. 이렇게 형질전환된 대장균 균주는 엠피실린 50μg/L이 첨가된 LB 평판배지에서 선별되었고, 이로부터 재조합 플라스미드pJS301을 수득하였다. 이 재조합 플라스미드 pJS301의 유전자 지도는 제 4도에 나타내었다.
실시예 4 : 플라스미드 pJS301로 형질전환된 재조합 대장균의 단백질 분비능비교
실시예 3에서 제조된 재조합 플라스미드 pJS301로 형질전환된 대장균 BL21(DE3)[F- ompT hsdSB(rB -mB -) gal dcm (DE3) a prophage carrying the T7 RNA polymerase gene]에서 엔도자일라나제의 분비능을 알아보고자 하였다. T7 프로모터를 이용하여 단백질을 발현시킬 경우, 대장균 BL21(DE3)과 같이 T7 RNA 중합효소유전자가 염색체에 삽입되어 있거나, 다른 형태로 발현 가능하도록 존재하는 대장균을 숙주세포로 이용하여야 한다. T7 프로모터 역시 IPTG에 의해서 유전자 발현이 유도되므로, pJS301로 형질전환된 대장균 BL21(DE3)의 경우도 전기 실시예 2와동일한 조건에서 재조합 균주를 배양하여, 분비된 엔도자일라나제 단백질의 함량을 분석하였다(참조: 표 2).
재조합 플라스미드 pJS301로 형질전환된 대장균에서 분비된 엔도자일라나제단백질의 함량
형질전환된 대장균 전체 단백질 중에서 분비된 엔도자일라나제 단백질의 함량
BL21(DE3) 6.4 %
상기 표 2에서 보듯이, pJS301 플라스미드로 형질전환된 대장균 BL21(DE3)의 경우 전체 단백질에서 분비된 엔도자일라나제 단백질의 함량은 약 6.4%로서, trc 프로모터를 이용하는 재조합 플라스미드 pJS101의 분비능보다 다소 떨어지지만, 역시 5% 이상의 높은 비율로 단백질을 분비시킴을 알 수 있었다.
실시예 5 : 재조합 플라스미드 pJS101ΔP의 제조
실시예 1에서 제조한 pJS101 재조합 플라스미드는 엔도자일라나제의 분비 신호 서열과 대상 단백질로서 사용된 엔도자일라나제 유전자가 제한 효소 PstI 절단부위에 의해서 연결되어 있다. 이 재조합 플라스미드 pJS101에서 대상 단백질을 제거시키고 분비하고자 하는 외래 단백질의 유전자를 삽입시키기 위해서는 엔도자일라나제 분비 신호서열의 3'-말단에 존재하는 제한 효소 PstI과 대상 단백질 유전자의 3'-말단에 존재하는 제한 효소 BamHI, XbaI, SalI, PstI, HindIII 중 어느 하나의 제한 효소로 플라스미드를 절단하고 삽입시킬 유전자를 연결시키면 된다. 그러나, 도 2의 유전자 지도에서 보듯이, pJS101 재조합 플라스미드의 경우 분비 신호서열과 대상 단백질 유전자의 3'-말단에 각각 1개씩의 PstI 절단부위가 존재하기 때문에, 분비코자 하는 외래 단백질의 유전자를 삽입시키는데 많은 불편이 초래된다.
이를 보다 간편하게 하기 위해서, 재조합 플라스미드 pJS101은 제한 효소 XbaI과 HindIII로 절단한 후에 DNA 폴리머라제(polymerase) I을 이용하여 평활말단화(blunt end)하고, T4 DNA 리가아제로 연결시켜 재조합 플라스미드 pJS101ΔP를 제조하고, 전기 재조합 플라스미드를 일렉트로포레이션 방법을 이용하여 대장균 XL1-Blue에 도입하였다. 이렇게 형질전환된 대장균 균주는 엠피실린 50μg/L이 첨가된 LB 평판배지에서 선별되었고, 이로부터 재조합 플라스미드 pJS101ΔP를 수득하였다. 이 재조합 플라스미드 pJS101ΔP의 유전자 지도는 도 5에 나타내었다.
상기의 재조합 플라스미드 pJS101ΔP로 형질전환된 대장균 XL1-Blue는 대장균 XL1-Blue/pJS101ΔP(Escherichia coli XL1-Blue/pJS101ΔP)라 명명하고, 그를 1998년 10월 9일 국제기탁기관인 한국과학기술연구원 부설 생명공학연구소 유전자은행(KCTC)에 기탁번호 KCTC 8908P로 기탁하였다.
실시예 6 : 재조합 플라스미드 pTrcS1PhoA의 제조
대장균의 알칼라인 포스파타제 유전자를 분비하고자 하는 외래 단백질의 유전자로 사용하여 발현시키기 위하여, 우선 대장균이 갖고 있는 알칼라인 포스파타제 유전자를 다음과 같이 확보하였다. 즉, 대장균 K-12로부터 유도된(derived) 대장균 W3110(λ-, F-, 원영양균(prototroph))의 염색체(chromosomal DNA)를 주형 DNA로, 서열번호 3 및 서열번호 4의 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 사용하여 중합효소 연쇄반응을 수행하였다.
상기의 중합효소 연쇄반응에서, 첫 번째 변성은 94℃에서 5분간 1회 수행하였고; 이후 두 번째 변성은 94℃에서 45초간, 교잡은 52℃에서 45초간, 연장은 72℃에서 1분 10초간 수행하였으며, 이를 30회 반복하였고; 이후 72℃에서 7분간 마지막 연장을 1회 수행하였다.
이와 같은 중합효소 연쇄반응 방법으로 얻어진 DNA를 아가로즈 겔 전기영동하여, 알칼라인 포스파타제 유전자를 포함한 약 1360 bp 크기의 DNA 절편을 분리하였으며, 이를 두가지의 제한효소 PstI과 BamHI으로 절단하였다. 이어, 실시예 5에서 제조된 플라스미드 pJS101ΔP를 두가지의 제한효소 PstI과 BamHI으로 절단하여 엔도자일라나제 유전자를 제거한 다음, 전기에서 절단된 알칼라인 포스파타제 유전자 함유의 DNA 절편을 T4 DNA 리가아제로 연결시켜 재조합 플라스미드 pTrcS1PhoA를 제조하였다. 이 재조합 플라스미드 pTrcS1PhoA의 유전자 지도는 도 6에 나타내었다.
실시예 7 : 플라스미드 pTrcS1PhoA로 형질전환된 재조합 대장균에서의 알칼라인 포스파타제의 분비능 비교
실시예 6에서 제조된 재조합 플라스미드 pTrcS1PhoA로 형질전환된 각각의 대장균 HB101, BL21(DE3), XL1-Blue에서 알칼라인 포스파타제의 분비능을 후술하는 바와 같이 알아보고자 하였다.
즉, 재조합 플라스미드 pTrcS1PhoA를 일렉트로포레이션 방법을 이용하여 전기의 3가지 대장균에 도입한 다음, 형질전환된 대장균 균주는 엠피실린 50μg/L이 첨가된 LB 평판배지에서 선별되었다. 이어, 각각의 형질전환 균주에서 알칼라인 포스파타제의 분비능이 우수한 균주를 선별하기 위하여, BCIP (5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate)(10 mg/mL)가 첨가된 LB 평판배지에 각 균주를 도말한 다음, 37 ℃ 항온 배양기에서 14시간 배양하였다. 이때, 만약 알칼라인 포스파타제가 발현되고 주변 세포질로 분비되었다면 효소활성을 갖게 되며, 이는 평판배지에 포함되어 있는 BCIP를 분해하여 푸른색을 띄게 된다. 즉, 분비능이 우수한 균주일수록 푸른색이 더 진하게 나타나게 되므로, 각 형질전환 균주에서 분비능이 우수한 균주만을 선별할 수가 있었다. 이 방법을 이용하여 각 형질전환 균주에서 분비능이 우수한 균주 2개씩을 선별하였으며, 각각을 다시 LB 액체배지에 접종하여 알칼라인 포스파타제의 분비정도를 알아보았다. 액체배지에 접종한 후 분광광도계로 600nm 파장에서 측정한 광학밀도(O.D.)가 0.7일 때, 1 mM의 IPTG를 첨가하여 줌으로써 유전자 발현을 유도하였다. 유도발현 후 4시간 경과한 다음에 배양액 0.1 mL씩을 채취하여 알칼라인 포스파타제의 활성을 측정하였으며, 동시에 배양액 1 mL씩을 채취하여 실시예 2에서와 동일한 방법으로 전체 단백질, 주변세포질 단백질 및 세포질 단백질로 각각 분획하였다.
도 7은 재조합 플라스미드 pTrcS1PhoA로 형질전환된 재조합 대장균 BL21(DE3)로부터 수득한 단백질들을 SDS-PAGE 겔 상에서 분석한 결과를 나타내는 전기영동 사진이다. 도 7에서, 레인 M은 단백질 표준 분자량(66kDa, 45kDa, 36kDa, 29kDa, 24kDa, 20.1kDa, 14.2kDa)을 나타내며, 레인 1은 형질전환되지 않은 대장균 BL21(DE3)의 전체 단백질을 나타내고, 레인 2 내지 5는 유도발현 후 4시간 경과한 다음에 형질전환 균주로부터 수득한 전체 단백질, 주변세포질 단백질, 불용성 봉입체 및 세포질 단백질을 각각 나타낸다. 또한, 화살표( ← )는 분비된 알칼라인 포스파타제 단백질을 나타낸다.
도 7에서 보듯이, 대장균 내에서 분비작용이 일어난 후 분비 신호서열이 절단된 크기에 해당하는 약 50 kDa의 알칼라인 포스파타제의 대부분은 불용성 봉입체 형태로 존재하고 있어, 주변세포질 단백질에 내포된 수용성 알칼라인 포스파타제의 양은 상대적으로 낮음을 알 수 있었다. 후술하는 실시예 9에서 보듯이, 불용성 봉입체는 주변세포질에 위치하는 것으로 입증되었다. 아울러, 상기 SDS-PAGE 겔 전기영동 결과는 덴시토메터를 이용한 단백질의 정량에 이용하여, 전체 단백질 중에서 분비된 알칼라인 포스파타제가 차지하는 비율을 결정하였는 바, 그 비율은 약 13.5 %로서 매우 높은 분비효율을 나타내었다.
주변세포질 분획에 내포된 수용성 알칼라인 포스파타제 함량은 그리 많지 않은 편이데, 이는 상기의 실시예 2에서 언급한 엔도자일라나제의 경우와 동일한 이유에서 비롯된 것으로 추측된다.
도 8은 재조합 플라스미드 pTrcS1PhoA로 형질전환된 재조합 대장균 HB101로부터 수득한 단백질들을 SDS-PAGE 겔 상에서 분석한 결과를 나타내는 전기영동 사진이다. 도 8에서, 레인 M은 단백질 표준 분자량(66kDa, 45kDa, 36kDa, 29kDa, 24kDa, 20.1kDa, 14.2kDa)을 나타내며, 레인 1은 형질전환되지 않은 대장균 HB101의 전체 단백질을 나타내고, 레인 2 내지 5는 유도발현 후 4시간 경과한 다음에 형질전환 균주로부터 수득한 전체 단백질, 주변세포질 단백질, 불용성 봉입체 및 세포질 단백질을 각각 나타낸다. 또한, 화살표( ← )는 분비된 알칼라인 포스파타제 단백질을 나타낸다.
도 8에서 보듯이, 약 50 kDa의 알칼라인 포스파타제의 대부분은 불용성 봉입체 형태로 존재하고 있어, 주변세포질 단백질에 내포된 수용성 알칼라인 포스파타제의 양은 상대적으로 낮음을 알 수 있었다. 아울러, 전체 단백질 중에서 분비된 알칼라인 포스파타제가 차지하는 비율은 덴시토메터를 이용하여 결정하였는 바, 그 비율은 약 6.9 %이었다.
도 9는 재조합 플라스미드 pTrcS1PhoA로 형질전환된 재조합 대장균 XL1-Blue로부터 수득한 단백질들을 SDS-PAGE 겔 상에서 분석한 결과를 나타내는 전기영동 사진이다. 도 9에서, 레인 M은 단백질 표준 분자량(66kDa, 45kDa, 36kDa, 29kDa, 24kDa, 20.1kDa, 14.2kDa)을 나타내며, 레인 1은 형질전환되지 않은 대장균 XL1-Blue의 전체 단백질을 나타내고, 레인 2 내지 5는 유도발현 후 4시간 경과한 다음에 형질전환 균주로부터 수득한 전체 단백질, 주변세포질 단백질, 세포질 단백질 및 불용성 봉입체를 각각 나타낸다. 또한, 화살표( ← )는 분비된 알칼라인 포스파타제 단백질을 나타낸다.
도 9에서 보듯이, 분비된 약 50 kDa의 알칼라인 포스파타제의 대부분은 불용성 봉입체 형태로 존재하고 있어, 주변세포질 단백질에 내포된 수용성 알칼라인 포스파타제의 양은 상대적으로 낮음을 알 수 있었다. 아울러, 전체 단백질 중에서 분비된 알칼라인 포스파타제가 차지하는 비율은 덴시토메터를 이용하여 결정하였는 바, 그 비율은 약 12.4 %로서 높은 분비효율을 나타내었다.
상기의 재조합 플라스미드 pTrcS1PhoA로 형질전환된 대장균 XL1-Blue는 대장균 XL1-Blue/pTrcS1PhoA(Escherichia coli XL1-Blue/pTrcS1PhoA)라 명명하고, 그를 1998년 10월 9일 국제기탁기관인 한국과학기술연구원 부설 생명공학연구소 유전자은행(KCTC)에 기탁번호 KCTC 8909P로 기탁하였다.
실시예 8 : 재조합 대장균에서 생산된 알칼라인 포스파타제의 활성도 측정
상기 실시예 7에서 분비된 알칼라인 포스파타제의 활성은 다음과 같은 방법으로 측정하였다(참조: E. Brickman and J. Beckwith, J. Mol. Biol., 96:307-316 (1975)).
즉, 플라스미드 pTrcS1PhoA로 형질전환된 재조합 대장균 BL21(DE3), HB101, XL1-Blue 각각을 50 mL LB 액체 배지가 담겨있는 250 mL 플라스크에 접종하여 37℃에서 배양하였다. 그런 다음, 분광광도계로 600nm 파장에서 측정한 광학밀도(O.D.)가 0.7일 때, 1 mM의 IPTG를 첨가하여 줌으로써 유전자 발현을 유도하였으며, 유도 발현 후 4시간 경과한 다음에 배양액 0.1 mL씩을 채취하고, 4℃ 및 6,000 rpm의 조건에서 10분간 원심분리하여 상층액은 버리고 균주만을 취하였다.
전기에서 수득한 대장균은 50 mM Tris-HCl(pH 7.5) 완충용액 1 mL에 현탁시키고, 여기에 클로로포름 0.1 mL를 가하여 37℃에서 5분간 반응시켰다. 이어, 0.4 % PNPP(p-nitrophenyl phosphate) 0.1 mL를 첨가하고 다시 37℃에서 5분간 반응시킨 다음, 1M K2HPO4용액 0.1 mL로 반응을 정지시키고 12,000 rpm에서 5분간 원심분리하여 상층액만을 취하였다. 이 상층액은 50 mM Tris-HCl 용액으로 희석시키고 분광광도계로 420nm와 550nm의 두 파장에서 흡광도를 측정하였다. 알칼라인 포스파타제의 활성도(U/mL)는 다음과 같은 계산식에 의해 산출하여, 그 결과를 하기 표 3에 나타내었다:
상기에서, 대조구는 플라스미드 pTrcS1PhoA로 형질전환되지 않은 대장균 BL21(DE3), HB101, XL1-Blue의 배양액을 전술한 바와 같은 방법으로 처리하여 측정한 알칼라인 포스파타제의 활성으로 하였다.
각 재조합 대장균에서 알칼라인 포스파타제의 활성도
재조합 대장균 알칼라인 포스파타제 활성도 (U/mL)
대장균 HB101 0.04
pTrcS1PhoA로 형질전환된 대장균 HB101 5105.4
대장균 XL1-Blue 0.03
pTrcS1PhoA로 형질전환된 대장균 XL1-Blue 4945.5
대장균 BL21(DE3) 0.03
pTrcS1PhoA로 형질전환된 대장균 BL21(DE3) 4459.9
상기 표 3에서 보듯이, 플라스미드 pTrcS1PhoA로 형질전환된 재조합 대장균에서 생산된 알칼라인 포스파타제들은 모두 높은 활성을 나타냈으며, 형질전환되지 않은 대장균들은 거의 활성을 나타내지 않았다. 따라서, 알칼라인 포스파타제는 세포내에서는 활성을 갖지 못하고 반드시 주변 세포질로 분비되어야만 활성을 갖게 되는 점을 감안하여 볼 때, 형질전환된 재조합 대장균에서 생산된 알칼라인 포스파타제는 주변 세포질로의 분비가 성공적으로 일어났음을 알 수 있었다.
실시예 9 : 플라스미드 pTrcS1PhoA로 형질전환된 재조합 대장균에서 생성된불용성 봉입체의 위치 확인
알칼라인 포스파타제의 불용성 봉입체가 세포내에 존재하는 위치를 확인하기 위하여, 플라스미드 pTrcS1PhoA로 형질전환된 재조합 대장균 XL1-Blue의 배양액 50 mL를 원심분리하여 대장균만을 수득하고, 2% 글루타르알데하이드(glutaraldhyde)와 2.5% 파라포름알데하이드(paraformaldehyde)를 포함한 포스페이트 완충용액(pH 7.2)으로 4℃에서 24시간 전고정하였다. 이어, 포스페이트 완충용액으로 30분씩 3번 세척하고, 1% 오스뮴 테라옥사이드(osmium teraoxide)로 상온에서 1시간 동안 후고정한 다음, 다시 포스페이트 완충용액으로 30분씩 3번 세척하고, 50%, 70%, 80%, 95% 및 100% 에탄올을 각각 10분씩 순차적으로 사용하여 탈수하였다.
다시 2:1, 1:1 및 1:2의 부피비로 혼합된 에탄올과 프로필렌 옥사이드(propylen oxide)의 혼합액 각각에 10분씩 순차적으로 침윤(infiltration)하고, 2:1, 1:1 및 1:2의 부피비로 혼합된 프로필렌 옥사이드와 Epon 812(Pelco, USA)의 혼합액 각각을 이용하여 4시간씩 대장균을 포매(embedding)하고, 마지막에는 Epon 812만을 사용하여 4시간씩 2번 수행하여 70℃에서 2일 동안 방치함으로써 포매를 완성하였다. 포매된 조직으로부터 마이크로 톱(Reichert Ultracut E. Leica, Austria)을 이용하여 100 nm 이하 두께의 초박 절편을 제작하고, 우라실 아세테이트(uracyl acetate)와 레드시트레이트(lead citrate)로 이중 염색하여 전자현미경(Philips CM20, Netherland)으로 관찰하였다. 이때, 촬영 가속전압은 120 kV이었다.
상기 전자현미경 결과로부터, 알칼라인 포스파타제가 생성되어 형성된 불용성 봉입체는 주변세포질에 존재하고 있음을 확인할 수 있었다. 따라서, 엔도자일라나제의 분비 신호서열을 이용하여 대장균에서 알칼라인 포스파타제가 성공적으로 분비되었음을 알 수 있었다.
결국, 도 7 내지 도 9의 주변 세포질 분획에서 알칼라인 포스파타제에 해당하는 단백질이 상대적으로 적게 나타난 이유는 알칼라인 포스파타제가 세포질에 존재하기 때문이 아니라, 주변세포질에 존재함에도 불구하고 주변 세포질 단백질 분획 방법에서의 문제 때문에 분획되지 않은 것이며, 이는 실시예 3의 엔도자일라나제의 경우도 마찬가지이다. 즉, 재조합 대장균에서 생산된 알칼라인 포스파타제는 주변 세포질로 분비된 후, 대부분은 보통의 수용성 단백질에 비해 크기가 매우 큰 불용성 봉입체를 형성한다.
이상에서 상세히 설명하고 입증하였듯이, 본 발명은 고초균 유래 엔도자일라나제의 분비 신호서열 유전자를 포함한 재조합 플라스미드 및 그를 이용한 외래 단백질의 제조방법을 제공한다. 본 발명의 재조합 플라스미드는 여러 대장균 및 여러 발현 시스템에서 매우 높은 단백질 분비효율을 나타내는 바, 이러한 점을 이용하여 특정 외래 단백질을 대량생산한다면, 주변 세포질으로의 분비가 가능하기 때문에 분리 및 정제 과정에서의 경비와 시간을 상당히 줄이는 효과를 얻을 수 있어, 산업적인 측면에서 재조합 단백질의 경제적인 생산이 가능하게 된다.
(서열목록)
＜110KR＞한국과학기술원
＜110＞Korea Advanced Institute of Science and Technology
＜120KR＞고초균 유래 엔도자일라나제의 신호서열 유전자를 포함한 재조합플라스미드 및 그를 이용한 외래 단백질의 제조방법
＜120＞Recombinant Plasmids Containing Endoxylanase Signal Sequencefrom Bacillus subtilis and A Process for Preparing Heterologous Proteins by Employing the Recombinant Plasmids
＜160＞5
＜210＞1
＜211＞36
＜212＞DNA
＜400＞1
GCTCAGCCGG TCTCCCATGT TTAAGTTTAA AAAGAA36
＜210＞2
＜211＞30
＜212＞DNA
＜400＞2
CGCGGATCCG AGCTGTTACC ACACAGTTAC30
＜210＞3
＜211＞32
＜212＞DNA
＜400＞3
GGACTGCAGC ACGGACACCA GAAATGCCTG TT32
＜210＞4
＜211＞33
＜212＞DNA
＜400＞4
GCGGGATCCT TATTATTTCA GCCCCAGAGC CGG33
＜210＞5
＜211＞28
＜212＞PRT
＜213＞Bacillus subtilis
＜220＞
＜221＞sig-peptide
＜400＞5
Met Phe Lys Phe Lys Lys Lys Phe Leu Val Gly Leu Thr Ala Ala
1 5 1015
Phe Met Ser Ile Ser Met Phe Ser Ala Thr Ala Ser Ala
20 25

Claims (15)

  1. 고초균(Bacillus subtilis) 유래 엔도자일라나제(endoxylanase)의 분비 신호서열(secretion signal sequence)(서열번호 5)을 암호화하고 있는 유전자를 포함하는 재조합 플라스미드.
  2. 제 1항에 있어서,
    하기와 같은 유전자 지도를 갖는 것을 특징으로 하는
    재조합 플라스미드 pJS101:
  3. 제 1항에 있어서,
    하기와 같은 유전자 지도를 갖는 것을 특징으로 하는
    재조합 플라스미드 pJS301:
  4. 제 1항에 있어서,
    하기와 같은 유전자 지도를 갖는 것을 특징으로 하는
    재조합 플라스미드 pJS101ΔP:
  5. 제 1항에 있어서,
    하기와 같은 유전자 지도를 갖는 것을 특징으로 하는
    재조합 플라스미드 pTrcS1PhoA:
  6. 제 1항에 있어서,
    재조합 플라스미드 pJS101에서 엔도자일라나제 분비 신호서열의 3'-말단에 존재하는 제한 효소 PstI 절단부위와 엔도자일라나제 유전자의 3'-말단에 존재하는 제한 효소 BamHI, XbaI, SalI, PstI 또는 HindIII 절단부위 중 하나를 이중 절단하여, 엔도자일라나제의 유전자를 제거시키고, 분비하고자 하는 외래 단백질의 유전자를 삽입시킨 것을 특징으로하는
    재조합 플라스미드.
  7. 제 1항에 있어서,
    재조합 플라스미드 pJS301에서 엔도자일라나제 분비 신호서열의 3'-말단에 존재하는 제한 효소 PstI 절단부위와 엔도자일라나제 유전자의 3'-말단에 존재하는 제한 효소 BamHI 절단부위를 이중 절단하여, 엔도자일라나제의 유전자를 제거시키고, 분비하고자 하는 외래 단백질의 유전자를 삽입시킨 것을 특징으로 하는
    재조합 플라스미드.
  8. 제 1항에 있어서,
    재조합 플라스미드 pJS101ΔP에서 엔도자일라나제 분비 신호서열의 3'- 말단에 존재하는 제한 효소 PstI 절단부위와 엔도자일라나제 유전자의3'-말단에 존재하는 제한 효소 BamHI 또는 XbaI 절단부위 중 하나로 이중 절단하여, 엔도자일라나제의 유전자를 제거시키고, 분비하고자 하는외래 단백질의 유전자를 삽입시킨 것을 특징으로 하는
    재조합 플라스미드.
  9. 제 6항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 있어서,
    외래 단백질의 유전자의 5'-말단은 제한효소 PstI, BsaI, BbsI, BbvI,BsmAI, BsmBI, BsmFI, BspMI 및 SfaNI로 구성된 그룹으로부터 선택되는 1종에 의해 절단되도록 유전자 조작되어 있는 것을 특징으로 하는
    재조합 플라스미드.
  10. 제 1항 내지 제 9항 중 어느 한 항의 재조합 플라스미드로 형질전환된 대장균(Escherichia coli).
  11. 재조합 플라스미드 pJS101ΔP로 형질전환된 대장균 XL1-Blue/pJS101ΔP (Escherichia coli XL1-Blue/pJS101ΔP)(KCTC 8908P).
  12. 재조합 플라스미드 pTrcS1PhoA로 형질전환된 대장균 XL1-Blue/pTrcS1PhoA (Escherichia coli XL1-Blue/pTrcS1PhoA)(KCTC 8909P).
  13. 제 1항 내지 제 9항 중 어느 한 항의 재조합 플라스미드를 대장균에 도입하여 형질전환체를 배양하고, 단백질의 발현을 유도하여 재조합 대장균의 세포질 밖으로 분비된 외래 단백질을 수득하는 공정을 포함하는 외래 단백질의 제조방법.
  14. 제 13항에 있어서,
    대장균은 대장균 XL1-Blue(Escherichia coli XL1-Blue), 대장균MC4100, 대장균 BL21(DE3) 및 대장균 HB101로 구성된 그룹으로부터선택되는 1종인 것을 특징으로 하는
    외래 단백질의 제조방법.
  15. 제 13항에 있어서,
    외래 단백질은 엔도자일라나제 또는 알칼라인 포스파타제인 것을 특징으로 하는
    외래 단백질의 제조방법.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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