KR100218564B1 - 아르기닌을 이용한 인체 부갑상선 호르몬의 효율적인 생산방법 - Google Patents
아르기닌을 이용한 인체 부갑상선 호르몬의 효율적인 생산방법 Download PDFInfo
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본 발명은 효모로부터 인체 부갑상선 호르몬(human parathyroid gland hormone: hPTH)을 효율적으로 생산하는 방법에 관한 것으로, 본 발명에 따라 인체 부갑상선 호르몬을 발현할 수 있도록 형질전환된 효모 세포주를 아르기닌이 첨가된 배지에서 배양하면, 인체 부갑상선 호르몬의 분해를 최소화하여 완전한 형태의 인체 부갑상선 호르몬을 고수율로 수득할 수 있다.
Description
본 발명은 효모로부터 인체 부갑상선 호르몬(human parathyroid gland hormone; 이하 hPTH라 함)을 효율적으로 생산하는 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 재조합 인체 부갑상선 호르몬을 발현할 수 있는 효모를 아르기닌이 첨가된 배지에서 배양함으로써 프로테아제(protease)에 의해 절단되지 않는 완전한 인체 부갑상선 호르몬을 효율적으로 생산하는 방법에 관한 것이다.
인체 부갑상선 호르몬은 인체의 부갑상선에서 생산되는, 84개의 아미노산으로 이루어진 펩타이드 호르몬으로서 신장과 뼈에서 칼슘의 항상성을 조절하는 기능을 하며, 인체에 적은 양만을 투여하여도 신진대사나 뼈형성에 영향을 미친다. 따라서 이러한 생물학적 활성 때문에 인체 부갑상선 호르몬은 골다공증 치료제로서 개발되고 있다(Morel F, In Grrep, R. O., Vol. 39, Academic press, 271(1983); Norman, A. W. et al., Endocrinol. Rev., 3, 336(1982)).
사카로마이세스 세레비지애(Sacharomyces cerevisiae)는 현재 숙주-벡터(host-vector)계가 가장 잘 확립되어 있는 효모로써, 생리학적 및 분자생물학적으로 많은 연구가 진행되어 있다. 이는 인체에 대해 병원성이 없고(non-pathogenic), 내독소를 생산하지 않는 GRAS(gernerally recognized as safe) 미생물로, 유전자 재조합 기술을 이용한 이종 단백질 생산용 숙주세포로서 그 중요성이 더욱 커지고 있다. 또한 효모용 분비 시그날을 사용할 경우 발현된 이종 단백질을 균체 외에서 분비시킬 수 있으므로 분리 정제 비용을 절감할 수 있다는 장점도 있다. 이와 같은 사카로마이세스 세레비지애를 이용하여 인체 부갑상선 호르몬을 분리 정제하면 생산 경비는 낮출 수 있는데, 이 경우 사카로마이세스 세레비지애에서 분비단백질로 발현되는 인체 부갑상선 호르몬은 숙주내 프로테아제(protease)에 의해 단백질의 분해가 일어남으로써 84개의 완전한 아미노산으로 구성된 성숙 부갑상선 호르몬을 수득하기 어렵다는 문제점이 있다(Gabrielsen O. S, Gene, 33, 262(1990)). 이러한 프로테아제에 의한 단백질의 절단은 재조합 단백질의 대량생산을 위한 효모의 사용에 있어서, 가장 큰 장애물 중 하나이다.
인체 부갑상선 호르몬이 절단된 형태로 제조되는데 있어 가장 큰 요인은 KEX2 단백질 가수분해 효소의 기작에 의한 것으로 알려져 있다(Gabrielsen, O. S., Gene, 33, 262(1990)). 따라서 인체 부갑상선 호르몬의 단백질 분해반응을 억제하기 위한 많은 연구가 진행되어 왔다. 예를 들어 레빼(Reppe S.) 등은 완전한 인체 부갑상선 호르몬의 아미노산 서열중 26번째 아미노산인 라이신을 글루타민으로 치환함으로써 KEX2에 의한 단백질의 절단에 대해 저항성을 가지며, 생물학적 활성이 완전한 인체 부갑상선 호르몬과 동일한 인체 부갑상선 호르몬 변이체를 제조한 바 있고(Reppe S. et al., J. Biol. Chem., 266, 14198(1991)), 리안(Rian E) 등은 유전자 재조합 기술을 이용하여 효모 유비퀴틴(ubiquitin) 유전자의 3'-말단에 인체 부갑상선 호르몬을 정확하게 직접 연결하여 쉽게 분해되지 않는 안정한 인체 부갑상선 호르몬을 제조한 바 있는데(Rian E. et al., Eur. J. Biochem., 213, 641(1993)), 이들 단백질 변이체는 일반적으로 새로운 의약품으로 간주되기 때문에 이의 안정성을 인정받기 위해 매우 어려운 과정이 요구된다. 또한 유전자 접합기술의 사용은 예상되는 절단반응에 의해 접합부위가 제거되어야 하는 복잡한 공정이 필요할 뿐만 아니라, 원하는 단백질을 고순도로 얻기 위한 공정이 추가로 필요하기 때문에 경제적인 면에서 실용적이지 못하다는 단점을 갖는다.
이에 본 발명자들은 유전자 재조합 및 아미노산 변형 등의 경제적으로 비실용적인 유전공학적인 기술 대신에 배양조건을 조절함으로써 재조합 사카로마이세스 세레비지애에서 분비되는 인체 부갑상선 호르몬 단백질의 분해를 감소시키는 방법을 개발함으로써 본 발명의 완성에 이르게 되었다.
본 발명의 목적은 효모로부터 인체 부갑상선 호르몬(human parathyroid gland hormone: hPTH)을 효율적으로 생산하는 방법을 제공하는 것이다.
도 1은 플라스미드 pG10-hPTH1의 제작과정을 나타낸 것이다.
도 2는 아르기닌 첨가량에 따라 효모로부터 발현된 완전한 인체 부갑상선 호르몬 및 절단된 인체 부갑상선 호르몬의 양을 비교하여 나타낸 그래프이다.
상기 목적에 따라, 본 발명에서는 인체 부갑상선 호르몬(human parathyroid gland hormone: hPTH)을 발현할 수 있도록 형질전환된 효모 세포주를 아르기닌이 첨가된 배지에서 배양함으로써, 인체 부갑상선 호르몬의 분해를 최소화하여 완전한 형태의 인체 부갑상선 호르몬을 고수율로 생산하는 방법을 제공한다.
본 발명의 인체 부갑상선 호르몬을 고수율로 생산하는 방법에 있어서, 배지에 첨가되는 아르기닌의 농도는 0.1 내지 0.4M인 것이 바람직하며, 가장 바람직하게는 0.3M이다.
이하, 본 발명을 좀더 상세하게 설명하면, 먼저 hPTH를 발현할 수 있는 형질전환된 세포주, 예를 들어 사카로마이세스 세제비지애 pG10-hPTH1/2805(KCTC 8766P)를 제조한다. 이어서 프로테아제에 의해 절단되지 않는 안정한 형태의 hPTH를 수득하기 위해 형질전환된 세포주를 0.2M 이상의 아르기닌이 포함된 배지에서 인체 부갑상선 호르몬의 발현에 적절한 조건에서 배양함으로써 숙주내 프로테아제에 의해 절단되지 않은 안정된 형태의 hPTH를 얻을 수 있다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의거하여 좀더 상세하게 설명하고자 한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들 만으로 제한되는 것은 아니다.
제 조 예 1 : 인체 부갑상선 호르몬을 발현하는 형질전환된 효모 세포주 제조
(단계 1)
인체 부갑상선 호르몬(hPTH)을 코딩하는 유전자를 합성하기 위하여, 하기 서열들을 갖는 12개의 올리고뉴클레오타이드 N1, N2, N3, N4, N5, N6, C1, C2, C3, C4, C5 및 C6를 DNA 합성기(Takara사(일본) 제품, Model Expedite 8909)로 합성하였다. 올리고뉴클레오타이드들은 발현양을 증가시키기 위하여 효모에 적합한 코돈으로 치환하여 주었다(Herman, A. B. & Rob, A. K., Maximum Gene Expression, In W. Reznikoff ad L. Gold(eds), Butherworths, Boston, 225-286(1986)).
상기 올리고뉴클레오타이드 N1, N2, N3, N4, N5, N6, Cl, C2, C3, C4, C5 및 C6를 각각 폴리뉴클레오타이드 인산화효소(T4 polynucleotide Kinase, 베링거 만하임사)로 37℃에서 30분 동안 인산화시킨 다음, 각 폴리뉴클레오타이드를 동일 몰농도로 혼합하여 회합(annealing) 반응으로 이중쇄를 형성시켰다. 리가제(T4 DNA ligase, 베링거 만하임사)로 각각의 올리고뉴클레오타이드를 연결한 다음 아가로오즈 젤 전기영동하여 젤로부터 인체 부갑상선 호르몬을 코드하는 약 272 염기쌍의 hPTH 유전자 단편을 분리하였다.
(단계 2)
플라스미드 pBluescript KS+(Strataene)를 제한효소 XbaI 및 SalI으로 처리하여 아가로즈 젤 전기영동한 후 DNA 단편을 분리하였다. 여기에 상기 단계 1에서 합성한 hPTH 유전자를 서브클로닝(subcloning)하여 플라스미드 pB-hPTH를 제작하였다.
한편, 플라스미드 YEGα-HIR525(KCTC 8518P)를 제한효소 BamHI 및 SalI으로 절단하여 약 5,500 염기쌍의 단편 1을 분리하였다. 또한 플라스미드 YEGα-HIR525를 제한효소 BamHI과 XbaI으로 절단하여 GAL10 프로모터 및 ppL을 포함하는 약 830 염기쌍의 단편 2를 분리하였다. 이어서 상기에서 제조한 플라스미드 pB-hPTH를 제한효소 XbaI과 SalI으로 절단하고, 여기에 상기 단편 1 및 단편 2를 연결하여 플라스미드 pG10-hPTH1을 제작하였다.
플라스미드 pG10-hPTH1은 GAL10 프로모터 :: ppL :: hPTH 유전자 :: GAL7 터미네이터를 순서적으로 포함하고 있다. ATG 개시코돈으로 시작되는 ppL은 총 85개의 아미노산으로 이루어져 있으며, C-말단의 84번 및 85번째 아미노산은 각각 라이신 및 아르기닌이며, 이들 라이신-아르기닌 서열 다음에는 hPTH의 N-말단 세린(Ser)을 코드하는 코돈인 TCT로부터 시작되는 완전한 hPTH 유전자가 연결되어 있다. 라이신-아르기닌 배열을 인식하는 프로테아제 yscF(KEX2 유전자의 발현물)는 효모의 트랜스 골지체에 존재하며, 합성된 ppL :: hPTH 유전자의 폴리펩타이드는 트랜스 골지체에서 프로세싱되어 분비 시그날 부분이 떨어져 나가게 된다. 따라서 배지로 분비되는 hPTH의 N-말단은 Ser으로 시작되는 완전한 형태의 인체 부갑상선 호르몬이라 할 수 있다.
도 1은 플라스미드 pG10-hPTH1의 제작과정을 나타낸 것이다.
(단계 3)
이토 등의 방법(Ito et al., J. Bacteriol, 153, 163(1993))에 따라 상기 단계 2에서 제조된 플라스미드 pG10-hPTH1으로 사카로마이세스 세레비지애 2805(MATα pep4: HIS3 prb1 can1 his3-200 ura3-52)를 형질전환시켰다.
즉, 사카로마이세스 세레비지애 2805를 YPD 배지(효모 추출물 1%, 박토 펩톤 2%, 포도당 2%) 10㎖에서 하루밤 동안 30℃에서 진탕 배양하여 얻은 사카로마이세스 세레비지애 배양액 50㎕를 다시 YPD 배지 10㎖에 접종하여 600nm에서 흡광도(O.D.600)가 1.0이 될 때까지 30℃에서 진탕 배양하였다. 수득한 배양액 1㎖을 5,000rpm에서 5 분간 원심분리하여 배지를 제거한 후 TE 완충액(10mM 트리스-Cl, pH 8.0, 1mM EDTA) 500㎕로 균체를 세척하였다. 이어서 50㎕의 TE 완충액과 0.2M 염화리튬(Sigma사) 0.5㎕을 넣어 잘 현탁한 후 30℃에서 1 시간 동안 진탕한 다음, 여기에 상기 단계 2에서 제조된 플라스미드 pG10-hPTH1와 70% 폴리에틸렌글리콜 4,000 용액 150㎕를 첨가하여 30℃에서 30분 동안 진탕한 후 45℃에서 10 분간 열충격을 가하였다. 이어서 15,000rpm에서 1 분간 원심분리하여 상층액을 버리고, 0.8% 식염수로 침전물을 세척하였다. 100㎕의 식염수에 현탁시킨 현탁액을 최소 선택배지(아미노산 부재의 효모 질소기질 0.67%, 포도당 2%, casamino acid 0.5%)에서 30℃로 3 일간 배양하여 형질전환된 사카로마이세스 세레비지애 2805 균주, 즉 사카로마이세스 세제비지애 pG10-hPTH1/2805(KCTC 8766P)를 얻었다.
실 시 예 1 : 아르기닌이 첨가된 배지에서 형질전환된 효모 세포주의 배양 및 발현확인
상기 제조예에서 얻은 형질전환된 세포주, 사카로마이세스 세레비지애 pG10-hPTH1/2805를 L-아르기닌(arginin)이 각각 0.1M, 0.2M, 0.3M 및 0.4M의 농도로 첨가된 YPDG 배지(효모 추출물 1%, 박토 펩톤 2%, 포도당 1%, 갈락토스 1%)에 접종하여 30℃에서 72 시간 동안 배양하였다.
이어서 수득된 각 배양액 1.5㎖를 5,000rpm에서 각각 5 분간 원심분리하여 배양 상층액과 균체를 회수하였다. 각 배양 상층액에 TCA(trichloacetic acid) 용액을 배양액의 1/10 부피로 넣어 배지내에 존재하는 단백질들을 0℃에서 30분 동안 침전시킨 후 12,000rpm에서 10 분간 원심분리하였다. 침전된 단백질에 잔존하는 TCA 용액을 제거하기 위하여 아세톤으로 세척한 후 용해 완충액(12mM 트리스-Cl, pH 6.8, 5% 글리세롤, 2.88mM 머캅토에탄올, 0.4% SDS, 0.02% 브로모페놀 블루) 30㎕에 녹이고 100℃에서 5 분간 가열하여 배양액 단백질 분획을 수득하였다. 각 10㎕의 배양액 단백질 분획을 0.75mm 두께로 15% 분리 젤(separating gel; pH 6.8, 가로 20cm, 세로 10cm) 위에 5% 저장 젤(stocking gel; pH 6.8, 가로 20cm, 세로 3.0cm)을 덮은 폴리아크릴아미드 젤로 로딩한 후 100 내지 300V, 25mA로 3 시간 동안 전기영동하고 쿠마시 염색법으로 염색하였다.
번틀의 방법(Burnetle, Anal. Biochem., 112, 195(1981))에 따라 상기 분리된 단백질들을 쿠마시 염색하지 않은 채 전기영동 전사장치(Hoefer사, Tank Transfer unit, 모델 TR-22)를 이용하여 200mA, 100 내지 80V로 1 시간 동안 니트로셀룰로즈 막에 전사하였다. 막에 전사된 단백질들을 1,000 배로 희석된 토끼의 항-소 부갑상선 호르몬-폴리클로날 항체(CalBioChem사)와 1 시간 동안 반응시키고 hPTH 밴드를 웨스턴 블로팅 AP 시스템(2차 항체: 토끼의 항 토끼 IgG(Fc)-알칼리 포스페이트 결합체, Promega사)으로 확인하였다.
비 교 예 : 아르기닌을 첨가하지 않은 배지에서 형질전환된 효모 세포주의 배양 및 발현확인
배지에 아르기닌을 첨가하지 않는 것을 제외하고, 상기 실시예 1과 동일한 조건으로 사카로마이세스 세레비지애 pG10-hPTH1/2805를 배양한 다음, 실시예 1과 동일한 방법으로 전기영동 및 웨스턴 블롯팅 분석하였다.
도 2는 아르기닌 첨가량에 따라 효모로부터 발현된 완전한 인체 부갑상선 호르몬 및 절단된 인체 부갑상선 호르몬의 양을 비교하여 나타낸 그래프이다. 여기에서 보듯이, 아르기닌을 첨가하지 않은 배지에서 배양한 비교예의 경우에는 절단된 hPTH가 많이 나타났고, 실시예의 경우 아르기닌의 첨가농도가 클수록 절단된 hPTH는 줄어들고 완전한 형태의 hPTH가 나타났으며, 아르기닌의 농도가 0.4M 이상이 될 때부터 조금씩 분해된 형태의 hPTH가 나타남을 알 수 있다.
본 발명에 따라, hPTH에 의해 감염된 효모 세포주의 배양시 아르기닌을 첨가하여 배양하면 프로테아제에 의한 hPTH의 절단을 최소화함으로써 완전한 형태의 hPTH를 높은 수율로 얻을 수 있다.
Claims (2)
- 인체 부갑상선 호르몬(human parathyroid gland hormone: hPTH)을 발현할 수 있도록 형질전환된 효모 세포주를 아르기닌이 첨가된 배지에서 배양함으로써, 인체 부갑상선 호르몬의 분해를 최소화하여 완전한 형태의 인체 부갑상선 호르몬을 고수율로 생산하는 방법.
- 제 1 항에 있어서,상기 아르기닌이 0.1M 내지 0.4M으로 첨가되는 것을 특징으로 하는 방법.
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