RU2238323C2 - Способ получения белков в трансформированных дрожжевых клетках - Google Patents
Способ получения белков в трансформированных дрожжевых клетках Download PDFInfo
- Publication number
- RU2238323C2 RU2238323C2 RU2001104431A RU2001104431A RU2238323C2 RU 2238323 C2 RU2238323 C2 RU 2238323C2 RU 2001104431 A RU2001104431 A RU 2001104431A RU 2001104431 A RU2001104431 A RU 2001104431A RU 2238323 C2 RU2238323 C2 RU 2238323C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- plasmid
- yeast
- gene
- polypeptide
- dna
- Prior art date
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 76
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 28
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 16
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title abstract description 26
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims abstract description 71
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 36
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims abstract description 35
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 claims abstract description 30
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims abstract description 29
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 29
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims abstract description 4
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 68
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 56
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 27
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 claims description 26
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 claims description 26
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 claims description 25
- 239000002243 precursor Substances 0.000 claims description 23
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 claims description 15
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 12
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 claims description 11
- DTHNMHAUYICORS-KTKZVXAJSA-N Glucagon-like peptide 1 Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC=1N=CNC=1)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C(C)C)C1=CC=CC=C1 DTHNMHAUYICORS-KTKZVXAJSA-N 0.000 claims description 7
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims description 7
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims description 7
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 4
- 239000004026 insulin derivative Substances 0.000 claims description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 4
- 101710198884 GATA-type zinc finger protein 1 Proteins 0.000 claims 1
- 102400000322 Glucagon-like peptide 1 Human genes 0.000 claims 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 2
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 59
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 35
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 26
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 23
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 22
- 101150107168 AMP gene Proteins 0.000 description 15
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 13
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 13
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 13
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 12
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 11
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 11
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 11
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 10
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 10
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 10
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 9
- 102100040918 Pro-glucagon Human genes 0.000 description 8
- GCYXWQUSHADNBF-AAEALURTSA-N preproglucagon 78-108 Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC=1N=CNC=1)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C(C)C)C1=CC=CC=C1 GCYXWQUSHADNBF-AAEALURTSA-N 0.000 description 8
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 7
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 7
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 6
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 6
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 6
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 6
- 101800000224 Glucagon-like peptide 1 Proteins 0.000 description 5
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 5
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 5
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 5
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 5
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 5
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 5
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 5
- 239000007222 ypd medium Substances 0.000 description 5
- 241001244729 Apalis Species 0.000 description 4
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 4
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 4
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 4
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 4
- 229940081969 saccharomyces cerevisiae Drugs 0.000 description 4
- 101000976075 Homo sapiens Insulin Proteins 0.000 description 3
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 3
- PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N insulin (human) Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H]1CSSC[C@H]2C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3NC=NC=3)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC1=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O)=O)CSSC[C@@H](C(N2)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)C1=CN=CN1 PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 210000001322 periplasm Anatomy 0.000 description 3
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 3
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 3
- 101710082738 Aspartic protease 3 Proteins 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 241000222120 Candida <Saccharomycetales> Species 0.000 description 2
- 101800000221 Glucagon-like peptide 2 Proteins 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- 101150033985 TPI gene Proteins 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 210000002472 endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- TWSALRJGPBVBQU-PKQQPRCHSA-N glucagon-like peptide 2 Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O)[C@@H](C)CC)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC=1NC=NC=1)[C@@H](C)O)[C@@H](C)CC)C1=CC=CC=C1 TWSALRJGPBVBQU-PKQQPRCHSA-N 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 210000002288 golgi apparatus Anatomy 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 2
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 210000004739 secretory vesicle Anatomy 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 2
- GZCWLCBFPRFLKL-UHFFFAOYSA-N 1-prop-2-ynoxypropan-2-ol Chemical compound CC(O)COCC#C GZCWLCBFPRFLKL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VOUAQYXWVJDEQY-QENPJCQMSA-N 33017-11-7 Chemical class OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)NCC(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N1[C@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O)CCC1 VOUAQYXWVJDEQY-QENPJCQMSA-N 0.000 description 1
- 101000793340 Achromobacter lyticus Protease 1 Proteins 0.000 description 1
- 101710188648 Acid trehalase Proteins 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 239000004382 Amylase Substances 0.000 description 1
- 108010065511 Amylases Proteins 0.000 description 1
- 102000013142 Amylases Human genes 0.000 description 1
- 241000024188 Andala Species 0.000 description 1
- 108010039627 Aprotinin Proteins 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150071434 BAR1 gene Proteins 0.000 description 1
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 description 1
- 102000005367 Carboxypeptidases Human genes 0.000 description 1
- 108010006303 Carboxypeptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000005572 Cathepsin A Human genes 0.000 description 1
- 108010059081 Cathepsin A Proteins 0.000 description 1
- 102100023804 Coagulation factor VII Human genes 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 230000004543 DNA replication Effects 0.000 description 1
- 108090000204 Dipeptidase 1 Proteins 0.000 description 1
- 108010023321 Factor VII Proteins 0.000 description 1
- 102000001690 Factor VIII Human genes 0.000 description 1
- 108010054218 Factor VIII Proteins 0.000 description 1
- 108010071289 Factor XIII Proteins 0.000 description 1
- QGWNDRXFNXRZMB-UUOKFMHZSA-N GDP Chemical compound C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O QGWNDRXFNXRZMB-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 1
- 241000178290 Geotrichum fermentans Species 0.000 description 1
- 241000603729 Geotrichum sp. Species 0.000 description 1
- 101800001226 Glicentin-related polypeptide Proteins 0.000 description 1
- 102000051325 Glucagon Human genes 0.000 description 1
- 108060003199 Glucagon Proteins 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101001076292 Homo sapiens Insulin-like growth factor II Proteins 0.000 description 1
- 108090000723 Insulin-Like Growth Factor I Proteins 0.000 description 1
- 102100037852 Insulin-like growth factor I Human genes 0.000 description 1
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 1
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 1
- 241001138401 Kluyveromyces lactis Species 0.000 description 1
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 description 1
- 241000235087 Lachancea kluyveri Species 0.000 description 1
- 102000004882 Lipase Human genes 0.000 description 1
- 239000004367 Lipase Substances 0.000 description 1
- 108090001060 Lipase Proteins 0.000 description 1
- NPBGTPKLVJEOBE-IUCAKERBSA-N Lys-Arg Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCNC(N)=N NPBGTPKLVJEOBE-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 1
- 241000320412 Ogataea angusta Species 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 description 1
- 101100378536 Ovis aries ADRB1 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000010780 Platelet-Derived Growth Factor Human genes 0.000 description 1
- 108010038512 Platelet-Derived Growth Factor Proteins 0.000 description 1
- 108010005991 Pork Regular Insulin Proteins 0.000 description 1
- 108010076181 Proinsulin Proteins 0.000 description 1
- 108020005091 Replication Origin Proteins 0.000 description 1
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 241000235070 Saccharomyces Species 0.000 description 1
- 241000582914 Saccharomyces uvarum Species 0.000 description 1
- 241000235346 Schizosaccharomyces Species 0.000 description 1
- 241000235347 Schizosaccharomyces pombe Species 0.000 description 1
- 101000733770 Schizosaccharomyces pombe (strain 972 / ATCC 24843) Aminopeptidase 1 Proteins 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- 108010000499 Thromboplastin Proteins 0.000 description 1
- 102000002262 Thromboplastin Human genes 0.000 description 1
- 108090000373 Tissue Plasminogen Activator Proteins 0.000 description 1
- 102000003978 Tissue Plasminogen Activator Human genes 0.000 description 1
- 102000009618 Transforming Growth Factors Human genes 0.000 description 1
- 108010009583 Transforming Growth Factors Proteins 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 101710103041 Vacuolar protease A Proteins 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 235000019418 amylase Nutrition 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 229960004405 aprotinin Drugs 0.000 description 1
- 210000004507 artificial chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 208000022362 bacterial infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 108010051210 beta-Fructofuranosidase Proteins 0.000 description 1
- 102000006635 beta-lactamase Human genes 0.000 description 1
- 108010006025 bovine growth hormone Proteins 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 1
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 238000003912 environmental pollution Methods 0.000 description 1
- 230000006862 enzymatic digestion Effects 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 229940012413 factor vii Drugs 0.000 description 1
- 229960000301 factor viii Drugs 0.000 description 1
- 229940012444 factor xiii Drugs 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- MASNOZXLGMXCHN-ZLPAWPGGSA-N glucagon Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC=1NC=NC=1)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C1=CC=CC=C1 MASNOZXLGMXCHN-ZLPAWPGGSA-N 0.000 description 1
- 229960004666 glucagon Drugs 0.000 description 1
- 102000057877 human IGF2 Human genes 0.000 description 1
- ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N iniprol Chemical compound C([C@H]1C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@H]2CSSC[C@H]3C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@H](C(N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC=4C=CC=CC=4)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC2=O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC=2C=CC=CC=2)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H]2N(CCC2)C(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N3)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@H](C(=O)N1)C(C)C)[C@@H](C)O)[C@@H](C)CC)=O)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 235000019421 lipase Nutrition 0.000 description 1
- 238000010297 mechanical methods and process Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 235000004252 protein component Nutrition 0.000 description 1
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000009962 secretion pathway Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 1
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 1
- 229960000187 tissue plasminogen activator Drugs 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/24—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia
- C07K14/245—Escherichia (G)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
- C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Mycology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой способ экспрессии полипептидов в дрожжах путем культивирования дрожжевого штамма, который не содержит функционального маркерного гена устойчивости к антибиотику. Трансформированные таким образом дрожжевые клетки продуцируют гетерологичный белок с более высоким выходом. 6 ил., 3 табл.
Description
Область техники
Изобретение относится к экспрессии белков в трансформированных дрожжевых клетках, к ДНК-конструкции и векторам для применения в таком способе и дрожжевым клеткам, трансформированным указанными векторами.
Предпосылки изобретения
Трансформированные дрожжевые штаммы широко используются для экспрессии белков. См., например, заявки на европейский патент №№0088632А, 0116201А, 0123294А, 0123544А, 0163529А, 0123289А, 0100561А, 0189998А и 0195986А, РСТ заявки №№ WO 95/01421, 95/02059 и WO 90/10075 и патент США №4546082.
Общей особенностью вышеуказанных методов является то, что дрожжевая плазмида содержит ген-маркер устойчивости к антибиотикам. Такой ген-маркер получают на начальных стадиях клонирования в Е.coli, где он используется для скрининга трансформированных клеток или сохранения плазмид, используемых в качестве векторов. Считается, что гены-маркеры устойчивости к антибиотикам не оказывают вредного влияния на культивирование трансформированной дрожжевой клетки, поэтому такую ДНК, как правило, не удаляют. Кроме того, конструкцию на основе плазмидного вектора обычно исследуют, выделяя плазмиды из трансформированных дрожжевых клеток и трансформируя выделенную плазмиду в Е.coli с последующим отбором антибиотика. Таким образом, в практических целях удобно сохранять ген-маркер устойчивости к антибиотикам.
Хотя условия работы в научно-исследовательских лабораториях и на промышленных предприятиях определяются строгими правилами безопасности, всегда существует небольшая вероятность того, что несколько клеток могут случайно попасть в окружающую среду. Благодаря своей очень сложной природе такие генетически сконструированные микроорганизмы остаются жизнеспособными в течение очень короткого периода времени и вероятность того, что они могут причинить вред окружающей среде, чрезвычайно мала. Именно по этой причине разрешено использовать такие трансформированные микроорганизмы в научно-исследовательских и производственных целях.
Даже если клетки быстро погибают, плазмиды, содержащие ген устойчивости к антибиотикам, могут случайно попасть в окружающую среду, и существует теоретическая вероятность сообщения устойчивости к антибиотикам бактериям в случае случайного поглощения ими такой плазмиды.
Антибиотики имеют важное значение для лечения бактериальных инфекций у людей и животных. Поэтому желательно свести до минимума возможное загрязнение окружающей среды геном, сообщающим устойчивость к антибиотикам.
Необходимы еще более безопасные методы по сравнению с применяемыми в настоящее время, и целью настоящего изобретения является создание таких усовершенствованных методов.
Краткое изложение существа изобретения
Настоящее изобретение относится к способу экспрессии гетерологичных белков или полипептидов в дрожжах, в соответствии с которым штамм дрожжевого трансформанта содержит экспрессирующий вектор, имеющий ген-маркер устойчивости к антибиотикам, используемый на начальных стадиях клонирования, который делают нефункциональным в результате модификации in vitro до трансформации дрожжевой клетки-хозяина. Настоящее изобретение относится также к последовательностям ДНК и экспрессирующим векторам, используемым при осуществлении этого способа, и к трансформированным дрожжевым клеткам.
Одним объектом настоящего изобретения является рекомбинантный дрожжевой экспрессирующий вектор, не способный сообщать устойчивость к антибиотикам бактериальным клеткам и имеющий ген, кодирующий гетерологичный ген и ген-маркер устойчивости к антибиотикам, который делают нефункциональным в результате модификации in vitro.
Другим объектом настоящего изобретения является способ получения целевого полипептида или белка, включающий культивирование дрожжевого штамма, содержащего вектор, не способный сообщать устойчивость к антибиотикам бактериальным клеткам и имеющий ген, кодирующий гетерологичный ген и ген-маркер устойчивости к антибиотикам, который делают нефункциональным в результате модификации in vitro до трансформации дрожжевой клетки-хозяина, и выделение целевого продукта из культуральной среды.
Способ по этому изобретению обычно включает культивирование дрожжевого штамма, содержащего дрожжевую экспрессирующую плазмиду, имеющую функциональный ген-маркер устойчивости к антибиотикам, используемый на начальных стадиях клонирования в бактериях, который делают нефункциональным в результате делеции in vitro части или всего гена-маркера до введения в дрожжевую клетку-хозяина, используемую для экспрессии и секреции целевого полипептида или белка.
Ген-маркер устойчивости к антибиотикам предпочтительно удаляют путем введения приемлемых сайтов рестрикции с обеих сторон гена-маркера устойчивости к антибиотикам, после чего ген-маркер удаляют путем обработки in vitro приемлемыми рестрикционными ферментами.
Настоящее изобретение относится также к трансформированным дрожжевым штаммам, содержащим вектор, не способный сообщать устойчивость к антибиотикам бактериальным клеткам и имеющий ген, кодирующий гетерологичный ген и ген-маркер устойчивости к антибиотикам, который делают нефункциональным в результате модификации in vitro до трансформации дрожжевой клетки-хозяина.
Дрожжевой штамм предпочтительно является штаммом Saccharomyces, в частности штаммом Saccharomyces cerevisiae.
В используемом здесь значении термин "ген-маркер устойчивости к антибиотикам" означает ген, который позволяет производить фенотипический отбор трансформированных бактериальных клеток и амплификацию плазмиды.
Обычно используемыми генами-маркерами устойчивости к антибиотикам в Е.coli являются гены-маркеры, сообщающие устойчивость к ампициллину (ДМР), хлорамфениколу, неомицину, канамицину и тетрацилину.
В используемом здесь значении термин "нефункциональный ген-маркер" означает, что ген-маркер удален или утратил функциональность в результате делеции части гена. Желательно, чтобы ген был удален полностью.
В используемом здесь значении термин "модификация in vitro" означает стадии модификации вектора, выполняемые вне клеточной среды.
В используемом здесь значении выражение "не способен сообщать устойчивость к антибиотикам бактериальным клеткам" означает, что гены-маркеры устойчивости к антибиотикам не могут функционировать ни в одном организме в результате вышеописанной обработки гена.
В используемом здесь значении термин "дрожжевая клетка-хозяин" означает дрожжевой организм, трансформированный или трансфицированный экспрессирующей плазмидой или вектором.
Краткое описание чертежей
Настоящее изобретение далее иллюстрировано прилагаемыми чертежами.
На фиг.1 показана экспрессирующая плазмида рАК729, которая содержит ген, экспрессирующий предшественник инсулина под контролем последовательности промотора TPI и терминатора TPI из S. cerevisiae и сигнальной лидерной последовательности, содержащей сигнальный пептид YAP3 и синтетический лидерный пептид LA19. Конструкция рАК729 описана в заявке на патент WO 97/22706. Эта плазмида содержит также последовательность AMP-R из pBR322/pUC13, включающую ген устойчивости к ампициллину и точку начала репликации ДНК в Е.coli.
На фиг.2 показана плазмидная карта плазмиды рАК729.5, используемой для генерации штамма NN729.5, не имеющего гена АМР, до делеции гена Amp.
На фиг.3 показана плазмидная карта плазмиды рАК729.6, используемой для генерации штамма NN729.6, не имеющего гена АМР, до делеции гена Amp.
На фиг.4 показана плазмидная карта плазмиды рАК729.6-Δаmр, у которой удален ген АМР.
На фиг.5 показана плазмидная карта плазмиды рАК729.7, используемой для генерации штамма NN729.7, не имеющего гена АМР, до делеции гена Аmр.
На фиг.6 показана плазмидная карта плазмиды pKV228, модифицированной заменой кодирующей последовательности EcoRI (940) - Xbal (1403) в рАК729 (фиг.1) кодирующей последовательностью MFalpha*-Arq34GLP-1(7-37).
Подробное описание изобретения
Ген-маркер устойчивости к антибиотикам удаляют in vitro, для чего используют имеющиеся сайты рестрикции или вводят приемлемые сайты рестрикции при помощи PCR, сайтспецифического мутагенеза или других хорошо известных методов манипуляции последовательностями ДНК с последующей обработкой приемлемыми рестрикционными ферментами.
Конструируют четыре модифицированных штамма NN729, чтобы определить, могут ли разные делеции в плазмиде влиять на выход ферментации предшественника инсулина или стабильность штамма во время длительной ферментации (таблица I). Эти штаммы сравнивают с исходным штаммом NN729 в отношении выхода и стабильности ферментации (таблица II). Помимо этого конструируют три модифицированных дрожжевых штамма, продуцирующих вариант GLP-1 Arq34GLP-1(7-37), чтобы определить, могут ли разные делении в плазмиде pKV228, содержащей ген АМР, влиять на выход ферментации Arg37GLP-1(7-37) (таблица III).
Плазмиды и штаммы, в которых удален ген АМР и, возможно, окружающие последовательности, обозначены "ΔАМР".
Модифицированные дрожжевые штаммы получают, трансформируя модифицированные плазмиды рАК729 или pKV228, в которых удален ген-маркер АМР и, возможно, другие последовательности ДНК исходной плазмиды, в штамме S. cerevisiae МТ663 (Е2-7В ХЕ11-36 а/α ΔtpiΔtpi, pep 4-3/pep 4-3) или МЕ1719 (МАТа/αΔуар3::ura3/Δyap3::URA3pep4-3/pep4-3Δtpi::LEU2/-Δtpi::LEU2 leu2/leu2Δurа3/Δurа3).
Модифицированные плазмиды получают, используя приемлемые сайты рестрикции фермента, имеющиеся в плазмиде, или вставляя приемлемые сайты рестрикции фермента так, чтобы можно было удалить ген АМР. Модифицированные плазмиды можно обрабатывать in vitro до трансформации в S. cerevisiae (штамм МТ663) так, чтобы удалить ген АМР или сделать его нефункциональным, в результате чего в полученном дрожжевом штамме отсутствует ген АМР. Таким образом, вероятность загрязнения окружающей среды геном АМР в процессе уничтожения дрожжевых клеток полностью устраняется.
Модифицированные плазмиды рАК729 или pKV228 расщепляют соответствующими рестрикционными ферментами, подвергают электрофорезу в агарозном геле, выделяют, повторно лигируют и трансформируют в компетентных клетках МТ663 и МЕ1719 S. cerevisiae, как это описано в заявке на патент WO 98/01535.
Способом по этому изобретению можно получить любой гетерологичный белок или полипептид, который можно успешно продуцировать в дрожжевой клетке. Примерами таких белков являются апротинин, ингибитор тканевого фактора или ингибиторы других протеаз, инсулин, предшественники или аналоги инсулина, инсулиноподобный фактор роста I или II, гормон роста человека или быка, интерлейкин, активатор плазминогена ткани, трансформирующий фактор роста а или b, глюкагон, глюкагоноподобный пептид 1 (GLP-1), глюкагоноподобный пептид 2 (GLP-2), GRPP, фактор VII, фактор VIII, фактор XIII, тромбоцитарный фактор роста и ферменты, такие как липазы.
Термин "предшественник инсулина" или "предшественник аналога инсулина" означает одноцепочечный полипептид, включая проинсулин, который при помощи одного или нескольких последующих химических и/или ферментативных процессов можно превратить в двухцепочечную молекулу инсулина или аналога инсулина с правильным расположением трех дисульфидных мостиков, имеющихся в натуральном инсулине человека. Предшественники инсулина обычно содержат модифицированный С-пептид, связанный мостиком с А- и В-цепью инсулина. Кроме того, у предпочтительных предшественников инсулина отсутствует аминокислотный остаток В(30). Наиболее предпочтительные предшественники инсулина описаны, например, в европейском патенте №163529 и в заявках на патент РСТ №№95/00550 и 95/07931. В качестве примеров инсулинов можно привести человеческий инсулин, предпочтительно человеческий инсулин des(B30) и свиной инсулин. Предпочтительными аналогами инсулина являются вещества, в которых один или несколько природных аминокислотных остатков, предпочтительно один, два или три, заменены другим кодируемым аминокислотным остатком. Так в положении А21 исходный инсулин может вместо Asn иметь аминокислотный остаток, выбираемый из группы, включающей Ala, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Met, Ser, Thr, Trp, Туr или Val, в частности аминокислотный остаток, выбираемый из группы, включающей Gly, Ala, Ser и Thr. Аналогичным образом в положении В28 исходный инсулин может вместо Pro иметь аминокислотный остаток, выбираемый из группы, включающей Asp, Lys и т.д., и в положении В29 исходный инсулин может вместо Lys иметь аминокислоту Pro.
Термин "кодируемый аминокислотный остаток" в используемом здесь значении означает аминокислотный остаток, который может быть закодирован генетическим кодом, то есть триплетом ("кодоном") нуклеотидов.
Используемые векторные ДНК можно получить синтетическим путем при помощи стандартных методов, например метода на основе фосфоамидита, описанного S.L. Beaucage and М.Н.Caruthers, Tetrahedron Letters 22, 1981, pp.1859-1869, или метода, описанного Matthes et al., EMBO Journal 3, 1984, pp.801-805. В соответствии с методом на основе фосфоамидита синтезируют олигонуклеотиды, например, в автоматическом синтезаторе ДНК, которые затем очищают, дуплецируют и лигируют с получением синтетической векторной ДНК. Предпочтительным методом получения векторной ДНК в настоящее время является полимеразная цепная реакция (PCR), например, описанная в справочнике Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY, 1089).
ДНК, кодирующая целевый белок, может быть геномной ДНК или кДНК, например, полученной путем создания библиотеки геномных ДНК или кДНК и скрининга последовательностей ДНК, кодирующих весь полипептид или его часть, либо при помощи гибридизации с использованием синтетических олиго-нуклеотидных зондов в соответствии с известными методами (см. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, 1989).
И наконец, ДНК, кодирующая целевый белок, может представлять собой смесь синтетической и геномной ДНК, смесь синтетической ДНК и кДНК или смесь геномной ДНК и кДНК, которые получают гибридизацией фрагментов синтетической ДНК, геномной ДНК или кДНК (если это необходимо) в соответствии с известными методами, причем эти фрагменты соответствуют разным частям всей векторной ДНК.
Рекомбинантный экспрессирующий вектор может быть автономно реплицирующимся вектором, то есть вектором, который существует в виде внехромосомного элемента, репликация которого не зависит от репликации хромосомы, например, плазмидой, внехромосомным элементом, минихромосомой или искусственной хромосомой. Вектор может иметь любой механизм, обеспечивающий ауторепликацию. Альтернативно можно использовать вектор, который при введении в клетку-хозяина, внедряется в геном и реплицируется вместе с хромосомой (хромосомами), в которую он внедрился. Векторная система может представлять собой один вектор или плазмиду либо два или больше векторов или плазмид, которые вместе содержат полную ДНК, вводимую в геном клетки-хозяина или транспозон.
Рекомбинантный экспрессирующий вектор может содержать последовательность ДНК, кодирующую целевой пептид или полипептид, которая функционально связана с последовательностью приемлемого промотора. Промотор может представлять собой любую последовательность ДНК, которая обладает транскрипционной активностью в дрожжах и может быть получена из генов, кодирующих белки гомологично или гетерологично дрожжам. Промотор предпочтительно получают из гена, кодирующего белок гомологично дрожжам. В качестве примеров приемлемых промоторов можно привести промоторы Sac-charomyces cerevisiae Mα1, TPI, ADH или PGK.
Последовательность ДНК, кодирующая целевой белок или полипептид, может быть также функционально связана с приемлемым терминатором, например, с терминатором TPI (см. Т.Alber and G.Kawasaki, J. Mol. Appl. Genet, 1, 1982, pp.419-434).
Рекомбинантный экспрессирующий вектор по этому изобретению может также содержать последовательность ДНК, позволяющую вектору реплицироваться в дрожжах. Примерами таких последовательностей являются гены репликации REP 1-3 дрожжевой плазмиды 2μ и точка начала репликации. Этот вектор может также включать селектируемый маркер, например ген TPI Schizosaccharomyces pompe, описанный P.R.Russell, Gene 40, 1985, pp.125-130.
И наконец, экспрессирующий вектор предпочтительно содержит сигнальную/лидерную последовательность, обеспечивающую секрецию целевого белка или полипептида в культуральную среду. Сигнальная последовательность представляет собой последовательность ДНК, кодирующую полипептид ("секреторный пептид"), который, являясь компонентом более крупного полипептида, направляет более крупный полипептид по пути секреции клетки, в которой он синтезирован. Более крупный полипептид обычно расщепляют, чтобы удалить секреторный пептид во время передвижения по пути секреции.
Секреторная сигнальная последовательность может кодировать любой сигнальный пептид, который обеспечивает эффективное перемещение экспрессированного полипептида по пути секреции клетки. Сигнальный пептид может быть естественным сигнальным пептидом или его функциональной частью либо он может быть синтетическим пептидом. Полезные сигнальные пептиды для дрожжевых клеток-хозяев получают из генов а-фактора и инвертазы Saccharomyces cerevisiae, сигнального пептида амилазы слюны мыши (см. О.Hagenbuchle et al., Nature 289, 1981, pp.643-646), сигнального пептида модифицированной карбоксипептидазы (см. L.A.Valls et al., Cell 48, 1987, pp.887-897), сигнального пептида дрожжей BAR1 (см. WO 87/02670) или сигнального пептида аспарагиновой протеазы 3 (YAP3) дрожжей (см. М. Egel-Mitani et al., Yeast 6, 1990, pp.127-137).
Для эффективной секреции в дрожжах последовательность, кодирующую лидерный пептид, можно также вставить внизу от сигнальной последовательности и вверху от последовательности ДНК, кодирующей полипептид. Функция лидерного пептида заключается в том, чтобы направлять экспрессированный полипептид из эндоплазматического ретикулюма в аппарат Гольджи и далее в секреторный пузырек для секреции в культуральную среду (то есть осуществлять перенос полипептида через оболочку клетки или по крайней мере через клеточную мембрану в периплазматическое пространство дрожжевой клетки). Лидерный пептид может быть лидерной последовательностью а-фактора дрожжей (использование которой описано, например, в патенте США №4546082, европейских патентах №№16201, 123294, 123544 и 163529). Альтернативно лидерный пептид может быть синтетическим лидерным пептидом, то есть лидерным пептидом, не существующим в природе. Синтетические лидерные пептиды можно сконструировать, как это описано в заявках на патент WO 89/02463 или WO 92/11378, и в научной работе Kjeldsen et al., "Protein Expression and Purification" 9, 331-336 (1997).
Термин "лидерный пептид" означает пептид в виде пропептидной последовательности, функция которой заключается в том, чтобы направлять секрецию гетерологичного белка из эндоплазматического ретикулюма в аппарат Гольджи и далее в секреторный пузырек для выделения в среду (то есть осуществлять перенос экспрессированного белка или полипептида через клеточную мембрану и оболочку клетки, если она имеется, или по крайней мере через клеточную мембрану в периплазматическое пространство клетки, имеющей оболочку).
Методы, используемые для лигирования последовательностей ДНК, кодирующих соответственно целевой белок или полипептид, промотор и терминатор, и их введения в приемлемые дрожжевые векторы, содержащие информацию, необходимую для репликации в дрожжах, хорошо известны специалистам в этой области (см., например, Sambrook et al., в цитируемой работе). Совершенно очевидно, что вектор можно сконструировать, получив сначала векторную ДНК, содержащую всю последовательность ДНК, кодирующую полипептид по этому изобретению, с последующим введением этого фрагмента в приемлемый экспрессирующий вектор или с последующим введением фрагментов ДНК, содержащих генетическую информацию для отдельных элементов (таких как сигнальная последовательность, лидерная последовательность или гетерологичный белок), и лигированием.
При осуществлении способа по этому изобретению используют любой приемлемый дрожжевой организм, который в процессе культивирования продуцирует целевой белок или полипептид в достаточных количествах. Примерами приемлемых дрожжевых организмов могут служить штаммы, выбираемые из видов дрожжей Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces kluyveri, Schizosaccharomyces pombe, Saccharomyces uvarum, Kluyveromyces lactis, Hansenula polymorpha, Pichia pastoris, Pichia methanolica, Pichia kluyveri, Yarrowia lipolytica, Candida sp., Candida utilis, Candida cacaoi, Geotrichum sp. и Geotrichum fermentans, причем предпочтительным видом дрожжей является Saccharomyces cerevisiae.
Дрожжевые клетки можно трансформировать путем получения протопласта с последующей трансформацией известным методом. Для культивирования клеток можно использовать любую известную среду, приемлемую для выращивания дрожжей. Секретированный гетерологичный белок, значительная часть которого присутствует в среде в правильно процессированной форме, можно выделить из среды известными методами, включая отделение дрожжевых клеток от среды центрифугированием или фильтрованием, осаждение белковых компонентов супернатанта или фильтрата при помощи соли, например сульфата аммония, и последующую очистку разными хроматографическими методами, например, при помощи ионообменной хроматографии, аффинной хроматографии и тому подобных. После секреции белка в периплазматическое пространство клетки разрушают ферментативными или механическими методами.
Целевой белок или полипептид можно экспрессировать и секретировать в виде слитого белка с N-концевым удлиняющим сегментом, описанного в заявке на патент WO 97/22706. N-концевой удлиняющий сегмент затем можно удалить из выделенного белка in vitro при помощи химического или ферментативного расщепления, как это хорошо известно в этой области. Расщепление предпочтительно осуществляют при помощи фермента. Примерами таких ферментов являются трипсин или протеаза I Achromobacter lyticus.
Далее дано более подробное описание настоящего изобретения со ссылкой на нижеследующие примеры, которые не ограничивают объем изобретения, представленного в формуле изобретения.
Пример 1
Дрожжевая плазмида рАК729, сконструированная для экспрессии предшественника инсулина (предшественник инсулина с N-концевым удлиняющим сегментом В(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21), см. заявку на патент WO 97/22706), содержит два сайта рестрикции фермента АраLI, в частности сайты ApaLI (4477) и ApaLI (5723) (см. фиг.1). Эти сайты рестрикции расположены с обеих сторон гена-маркера АМР. Удаление 1246 нуклеотидов между двумя сайтами ApaLI в плазмиде рАК729 позволяет удалить ген-маркер АМР и дополнительную плазмидную ДНК, выделенную из Е.coli.
Плазмиду рАК729 расщепляют рестрикционным ферментом ApaLI, подвергают электрофорезу в агарозном геле, выделяют, повторно лигируют и затем трансформируют в компетентных клетках S. cerevisiae (MT663, см. европейский патент №В 0163529), что дает трансформированный дрожжевой штамм NN729.1-ΔАМР. Модифицированную экспрессирующую плазмиду повторно выделяют из дрожжевого штамма NN729.1-ΔАМР, последовательности ДНК проверяют после выполнения PCR и субклонируют область ДНК, имеющую делецию. Аналогичным образом последовательности ДНК, кодирующие предшественник инсулина, проверяют с использованием плазмидной ДНК, повторно выделенной из дрожжевого штамма NN729.1-ΔАМР.
Дрожжевой штамм NN729.1-ΔАМР культивируют в среде YPD при 30°С в течение 72 часов. Выход ферментации предшественника инсулина определяют при помощи жидкостной хроматографии высокого давления с обращенной фазой (RP-HPLC).
Пример 2
Сайты рестрикции фермента, Xhol (5676) и Xhol (5720), вводят в плазмиду рАК729 при помощи PCR. Затем проверяют отобранные последовательности ДНК полученной плазмиды рАК729.5. Рестриктазная плазмидная карта плазмиды рАК729.5 показана на фиг.2. Фрагмент ДНК, расположенный между сайтами рестрикции фермента Xhol (5676) и Xhol (5720), можно удалить из плазмиды рАК729.5 путем удаления 44 нуклеотидов, расположенных в гене АМР.
Плазмиду рАК729.5 расщепляют рестрикционными ферментами Xhol, подвергают электрофорезу в агарозном геле, выделяют, повторно лигируют и трансформируют в компетентных клетках МТ663 S. cerevisiae, что дает дрожжевой трансформант NN729.5-ΔАМР. Модифицированную экспрессирующую плазмиду повторно выделяют из дрожжевого штамма NN729.5-ΔАМР, последовательности ДНК проверяют после выполнения PCR и субклонируют область ДНК, имеющую делению. Аналогичным бразом последовательности ДНК, кодирующие предшественник инсулина, проверяют с использованием плазмидной ДНК, которую повторно выделяют из дрожжевого штамма NN729.5-ΔАМР. Делеция 44 нуклеотидов в рАК729.5-ΔАМР оказывается такой же эффективной, как и полная делеция гена АМР с точки зрения подавления активности β-лактамазы.
Дрожжевой штамм NN729.5-ΔАМР культивируют в среде YPD при 30°С в течение 72 часов. Выход ферментации предшественника инсулина определяют при помощи RP-HPLC.
Пример 3
Сайт рестрикции фермента, Aatll (4982), вводят в плазмиду рАК729 при помощи PCR. Затем проверяют отобранные последовательности ДНК полученной плазмиды рАК729.6. Рестриктазная плазмидная карта плазмиды рАК729.6 показана на фиг.3. В плазмиде рАК729.6 можно удалить фрагмент ДНК, расположенный между сайтами рестрикции фермента Aatll (4982) и Aatll (5978), удалив из плазмиды 996 нуклеотидов. Это позволит удалить весь ген АМР и промотор.
Плазмиду рАК729.6 расщепляют рекстрикционным ферментом ДНК Aatll, подвергают электрофорезу в агарозном геле, выделяют, повторно лигируют и трансформируют в компетентных клеткам МТ663 S. cerevisiae. Модифицированную экспрессирующую плазмиду повторно выделяют из дрожжевого штамма NN729.6-ΔАМР, последовательности ДНК проверяют после выполнения PCR и субклонируют область ДНК, имеющую делецию. Аналогичным образом последовательности ДНК, кодирующие предшественник инсулина, проверяют с использованием плазмидной ДНК, повторно выделенной из дрожжевого штамма NN729.6-ΔАМР. Плазмида рАК729.6-ΔАМР, у которой отсутствует ген АМР, показана на фиг.4.
Дрожжевой штамм NN729.6-ΔАМР культивируют в среде YPD при 30°С в течение 72 часов. Выход ферментации предшественника инсулина определяют при помощи RP-HPLC.
Пример 4
Новый сайт рестрикции фермента, Aatll (3801), в плазмиде рАК729.7 вводят в исходную плазмиду рАК729 при помощи PCR. Затем проверяют отобранные последовательности ДНК плазмиды рАК729.7. В плазмиде рАК729.7 можно удалить фрагмент ДНК, расположенный между сайтами рестрикции фермента Aatll (3801) и Aatll (5978), удалив 2177 нуклеотидов из экспрессирующей плазмиды. Плазмиду рАК729.7 конструируют таким образом, чтобы можно было удалить ген АМР и точку начала репликации Е.coli. Рестриктазная плазмидная карта плазмиды рАК729.7 показана на фиг.5.
Плазмиду рАК729.7 расщепляют рестрикционным ферментом ДНК Aatll, подвергают электрофорезу в агарозном геле, выделяют и трансформируют в компетентных клетках МТ663 S. cerevisiae. Модифицированную экспрессирующую плазмиду повторно выделяют из дрожжевого штамма NN729.7-ΔАМР, последовательности ДНК проверяют после выполнения PCR и субклонируют область ДНК, имеющую делению. Аналогичным образом последовательности ДНК, кодирующие предшественник инсулина, проверяют с использованием плазмидной ДНК, повторно выделенной из дрожжевого штамма NN729.7-ΔАМР. Дрожжевой штамм NN729.7-ΔАМР культивируют в среде YPD при 30°С в течение 72 часов. Выход ферментации предшественника инсулина определяют при помощи RP-HPLC.
Новые штаммы NN729-AAMP сравнивают с исходным штаммом NN729 в отношении выхода ферментации предшественника инсулина (таблица II).
Из вышеизложенного следует, что дрожжевые штаммы, содержащие экспрессирующую плазмиду с частично или полностью удаленным геном-маркером АМР, экспрессируют на 10-20% больше предшественника инсулина по сравнению с исходным дрожжевым штаммом, содержащим экспрессирующую плазмиду с геном АМР.
Пример 5
Экспрессия Arq34GLP-1(7-37) в дрожжах с использованием плазмид с нефункциональным или удаленным геном устойчивости к антибиотикам АМР
Последовательность EcoRI (940) - Xbal (1403) в конструкциях рАК729, кодирующих LA19 Х5 MI3, которые показаны на фигурах 1-5, заменяют кодирующей последовательностью MFalpha*-Arg34GLP-1(7-37) для данного примера (фиг.6). В этой конструкции модифицируют препролидерный пептид MFα1 (Kurjan & Hershowitz, Cell 30, 1982, pp.933), в котором Leu в положении 82 и Asp в положении 83 заменяют соответственно Met и Аlа, вводя в последовательность ДНК расщепляющий сайт Ncol. Лидерную последовательность обозначают MFαl* (Kjeldsen Т. et а1., 1996). Лидерная пептидная последовательность MFαl* сигнальной последовательности MFαl включает двухосновный мотив узнавания Кех2р (Lys-Arg), отделяющий лидерную последовательность от кодирующей последовательности Arg34GLP-1(7-37). Пептид Arg34GLP-1(7-37) является человеческим вариантом GLP-1(7-37) (S.Mojsov, et а1., J. Biol. Chem. 261, 1986, pp.11880-11889), в котором природный аминокислотный остаток в положении 34 заменен остатком Аrg.
Конструируют три экспрессирующие плазмиды Arg34GLP-1(7-37) с удаленным геном устойчивости к антибиотикам АМР, как описано для NN729.1 (пример 1), NN729.5 (пример 2) и NN729.6 (пример 3), и трансформируют их в компетентных клетках МЕ1719 S. cerevisiae (см. заявку на патент WO 98/01535), что дает соответственно дрожжевые трансформанты YES2076, YES2079 и YES2085.
Штамм-хозяин, который используют для экспрессии Arg34GLP-1(7-37), является диплоидным штаммом и имеет фенотипы, у которых отсутствуют аспарагиновые протеазы, то есть (1) дрожжевая аспарагиновая протеаза 3 (YAP3), которая расщепляет С-концевую часть моно- и двухосновных аминокислотных остатков (Egel-Mitani, et al., YEAST 6: 127-137, 1990) и (2) вакуолярная протеаза А, активирующая другие протеазы, такие как протеаза В, карбоксипептидаза Y, аминопептидаза I, РНКаза, щелочная фосфатаза, кислая трегалаза и экзополифосфатаза. Кроме того, удаляют ген триозофосфатизомеразы (TPI), фенотип которого позволяет использовать глюкозу в трансформантах, выращенных на содержащей глюкозу среде. Генетическая среда МЕ1719 представляет собой МАТа/а Dyap3::ura3/Dyap3::URA3 рер4-3/рер4-3 tpi::LEU2/Dtpi::LEU2 leu2/leu2 Dura3/Dura3.
Модифицированные экспрессирующие плазмиды pKV301, pKV307 и pKV304 повторно выделяют из дрожжевых штаммов, последовательности ДНК проверяют после выполнения PCR и субклонируют область ДНК, имеющую делецию. Аналогичным образом последовательности ДНК, кодирующие Arg34GLP-1(7-37), проверяют с использованием плазмидной ДНК, повторно выделенной из дрожжевых штаммов. В таблице III показаны результаты сравнения модифицированных и немодифицированных штаммов.
Выходы сравнивают с 5 мл лабораторными ферментациями в среде YPD в течение 72 часов при 30°С. Выходы определяют при помощи HPLC.
Claims (5)
1. Способ получения интересующего полипептида дрожжевого штамма, стабильно трансформированного экстрахромосомной дрожжевой экспрессирующей плазмидой, предусматривающий (i) получение выделенной первой дрожжевой экспрессирующей плазмиды, содержащей функциональный маркерный ген устойчивости к антибиотику и последовательность ДНК, кодирующую интересующий полипептид; (ii) модификацию маркерного гена устойчивости к антибиотику in vitro с получением второй дрожжевой экспрессирующей плазмиды, где вторая плазмида либо (а) содержит инактивированный маркерный ген устойчивости к антибиотику, либо (б) не содержит маркерный ген устойчивости к антибиотику, содержащийся в первой плазмиде; (iii) введение указанной второй плазмиды в реципиентную дрожжевую клетку с получением дрожжевого штамма, трансформированного указанной второй плазмидой; и (iv) культивирование указанного трансформированного дрожжевого штамма в условиях, обеспечивающих экспрессию указанного полипептида указанным дрожжевым штаммом.
2. Способ по п.1, где указанная модификация in vitro состоит в расщеплении указанной первой плазмиды одной или несколькими рестриктазами, где указанные одна или несколько рестриктаз распознают последовательности, содержащиеся в указанном маркерном гене устойчивости к антибиотику или фланкирующие его.
3. Способ по п.1, где экспрессируемый полипептид секретируется в культуральную среду указанного дрожжевого штамма.
4. Способ по п.1, где экспрессируемый полипептид представляет собой предшественник инсулина или предшественник аналога инсулина.
5. Способ по п.1, где экспрессируемый полипептид представляет собой предшественник GLP-1.
Applications Claiming Priority (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DKPA199800945 | 1998-07-16 | ||
DKPA199800945 | 1998-07-16 | ||
DKPA199900754 | 1999-05-28 | ||
DKPA199900754 | 1999-05-28 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2001104431A RU2001104431A (ru) | 2003-03-10 |
RU2238323C2 true RU2238323C2 (ru) | 2004-10-20 |
Family
ID=26064588
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2001104431A RU2238323C2 (ru) | 1998-07-16 | 1999-07-02 | Способ получения белков в трансформированных дрожжевых клетках |
Country Status (16)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP1097228B1 (ru) |
JP (1) | JP4668414B2 (ru) |
KR (1) | KR20010071929A (ru) |
CN (1) | CN1187451C (ru) |
AT (1) | ATE318919T1 (ru) |
AU (1) | AU4499399A (ru) |
BR (1) | BR9912106B1 (ru) |
CA (1) | CA2337635A1 (ru) |
DE (1) | DE69930118T2 (ru) |
ES (1) | ES2260917T3 (ru) |
HU (1) | HUP0102697A3 (ru) |
IL (1) | IL140403A0 (ru) |
NO (1) | NO20010246L (ru) |
PL (1) | PL201350B1 (ru) |
RU (1) | RU2238323C2 (ru) |
WO (1) | WO2000004172A1 (ru) |
Families Citing this family (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR100783287B1 (ko) * | 2006-08-09 | 2007-12-06 | 한국생명공학연구원 | 텔로미어 전사 비활성화에 관여하는 화합물의 동정을 위한균주의 제조 |
CN105308067B (zh) | 2013-06-07 | 2020-07-24 | 诺和诺德股份有限公司 | 制备成熟胰岛素多肽的方法 |
US20220002738A1 (en) * | 2018-11-19 | 2022-01-06 | Jingping Zhong | Recombinant yeast cell |
Family Cites Families (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
ATE238425T1 (de) * | 1993-07-23 | 2003-05-15 | Dsm Nv | Selektionmarker-genfreie rekombinante stämme: verfahren zur ihrer herstellung und die verwendung dieser stämme |
DE4428402A1 (de) * | 1994-08-11 | 1996-02-15 | Boehringer Mannheim Gmbh | Gentherapeutisches Verfahren unter Verwendung von DNA-Vektoren ohne Selektionsmarker-Gen |
DK0814165T3 (da) * | 1996-06-21 | 2003-07-21 | Suntory Ltd | Fremgangsmåde til konstruktion af transformerede gærceller, der ikke indeholder et selekterbart markørgen |
JP4090090B2 (ja) * | 1996-06-21 | 2008-05-28 | サントリー株式会社 | 選択マーカー遺伝子を持たない形質転換体の作製方法 |
-
1999
- 1999-07-02 AU AU44993/99A patent/AU4499399A/en not_active Abandoned
- 1999-07-02 EP EP99927739A patent/EP1097228B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1999-07-02 ES ES99927739T patent/ES2260917T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1999-07-02 CN CNB998087068A patent/CN1187451C/zh not_active Expired - Lifetime
- 1999-07-02 BR BRPI9912106-9A patent/BR9912106B1/pt not_active IP Right Cessation
- 1999-07-02 CA CA002337635A patent/CA2337635A1/en not_active Withdrawn
- 1999-07-02 PL PL345584A patent/PL201350B1/pl unknown
- 1999-07-02 DE DE69930118T patent/DE69930118T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1999-07-02 JP JP2000560269A patent/JP4668414B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1999-07-02 WO PCT/DK1999/000380 patent/WO2000004172A1/en not_active Application Discontinuation
- 1999-07-02 IL IL14040399A patent/IL140403A0/xx unknown
- 1999-07-02 AT AT99927739T patent/ATE318919T1/de not_active IP Right Cessation
- 1999-07-02 RU RU2001104431A patent/RU2238323C2/ru not_active IP Right Cessation
- 1999-07-02 HU HU0102697A patent/HUP0102697A3/hu unknown
- 1999-07-02 KR KR1020017000677A patent/KR20010071929A/ko not_active Application Discontinuation
-
2001
- 2001-01-15 NO NO20010246A patent/NO20010246L/no unknown
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
KR20010071929A (ko) | 2001-07-31 |
AU4499399A (en) | 2000-02-07 |
EP1097228A1 (en) | 2001-05-09 |
BR9912106A (pt) | 2001-05-02 |
ATE318919T1 (de) | 2006-03-15 |
CA2337635A1 (en) | 2000-01-27 |
JP4668414B2 (ja) | 2011-04-13 |
NO20010246D0 (no) | 2001-01-15 |
DE69930118D1 (de) | 2006-04-27 |
PL201350B1 (pl) | 2009-04-30 |
CN1187451C (zh) | 2005-02-02 |
IL140403A0 (en) | 2002-02-10 |
DE69930118T2 (de) | 2006-11-02 |
ES2260917T3 (es) | 2006-11-01 |
HUP0102697A3 (en) | 2003-09-29 |
NO20010246L (no) | 2001-01-15 |
BR9912106B1 (pt) | 2012-09-04 |
HUP0102697A2 (hu) | 2001-11-28 |
EP1097228B1 (en) | 2006-03-01 |
JP2002520061A (ja) | 2002-07-09 |
PL345584A1 (en) | 2001-12-17 |
CN1309712A (zh) | 2001-08-22 |
WO2000004172A1 (en) | 2000-01-27 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US6214547B1 (en) | Synthetic leader peptide sequences | |
JP3730255B2 (ja) | イーストにおいて発現されたn末端に伸長した蛋白質 | |
KR100251054B1 (ko) | 합성 리더 펩티드 서열 | |
AU624694B2 (en) | Yeast processing system comprising a negatively charged amino acid adjacent to the processing site | |
US6861237B2 (en) | Production of heterologous polypeptides in yeast | |
US6358705B1 (en) | Method of making proteins in transformed yeast cells | |
JP4187796B2 (ja) | 酵母で発現されたn末端伸長タンパク質 | |
ES2242969T3 (es) | Vector para la expresion de proteinas con prolongacion n-terminal en celulas de levadura. | |
RU2238323C2 (ru) | Способ получения белков в трансформированных дрожжевых клетках | |
KR20010034305A (ko) | 효모에서 원하는 폴리펩티드를 만드는 방법 | |
KR100246932B1 (ko) | Yap3 유전자가 결손된 신규한 효모균주 및 그를 이용한 재조합 인체 부갑상선호르몬의 생산 | |
RU2167939C2 (ru) | Способ продуцирования полипептида в дрожжах | |
MXPA01000516A (en) | Method of making proteins in transformed yeast cells | |
CZ20015A3 (cs) | Rekombinantní exprimovaný kvasinkový vektor, způsob jeho získávání a transformovaná kvasinková buňka | |
JP2004514450A (ja) | 酵母における異種ポリペチドの産生 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20170703 |