KR100783287B1 - 텔로미어 전사 비활성화에 관여하는 화합물의 동정을 위한균주의 제조 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 텔로미어 부위에 텔로미어 전사 비활성화(transcriptional silencing)를 표지하는 마커 유전자가 도입된 텔로미어 형질전환 효모 균주 및 상기 균주의 제조방법, 상기 균주를 시험 화합물이 함유된 배지에서 배양하여 마커 유전자의 발현을 탐색함으로써 유기화합물군(chemical library) 중 텔로미어 전사 비활성화에 관여하는 화합물을 스크리닝하는 방법 및 상기 균주를 함유하는 용기를 포함하는 텔로미어 전사 비활성화 관여 화합물을 스크리닝하기 위한 키트를 제공한다. 또한, 본 발명은 텔로미어 부위에 텔로미어 전사 비활성화를 표지하는 마커 유전자가 도입된 텔로미어 형질전환 효모 균주의 염색체에 추가로 텔로미어 전사 비활성화의 교란을 통해 마커 유전자를 발현시키는 돌연변이 유전자가 도입된 효모 균주 및 상기 균주의 제조방법, 상기 균주를 시험 화합물이 함유된 배지에서 배양하여 마커 유전자의 발현을 탐색함으로써 유기화합물군 중 텔로미어 전사 비활성화에 관여하는 화합물을 스크리닝하는 방법 및 상기 균주를 함유하는 용기를 포함하는 텔로미어 전사 비활성화 관여 화합물을 스크리닝하기 위한 키트를 제공한다. 본 발명에 따른 형질전환 효모균주 및 이를 이용한 스크리닝 방법은 전사 비활성화에 관여하는 물질, 특히 노화와 암 관련 물질을 발굴할 수 있는 쉽고 빠르며 효율적인 HTS 시스템(High Throughput Screening system)을 제공한다.
Description
도 1a는 헤테로크로마틴 전사 비활성화(heterochromatin silencing)와 연관된 텔로미어 주위의 염색체 상에 Ura4 유전자를 삽입하기 위해 텔로미어의 일정 부위를 증폭시키기 위한 N 말단과 C 말단 프라이머, Ura4 유전자의 개방 해독 판독틀(open reading frame)을 증폭시키기 위한 프라이머의 위치 및 상기 프라이머를 이용하여 각 유전자 단편을 증폭하기 위한 1차 PCR 반응의 모식도이고, 도 1b는 상기 세 개의 유전자 단편을 모두 포함하는 DNA 단편을 증폭하기 위한 2차 PCR 반응의 모식도이다. 각 모식도에는 각 DNA 절편을 증폭할 수 있는 프라이머의 서열번호를 기재하였다.
도 2는 도 1에서 증폭한 Ura4 유전자(레인 1), 텔로미어 영역 A - N 말단 (레인 2), 텔로미어 영역 A - C 말단 (레인 3), Ura4 유전자 (레인 4), 텔로미어 영역 B - N 말단 (레인 5), 텔로미어 영역 B - C 말단을 포함하는 DNA 절편(레인 6), 텔로미어 영역 A - N 말단, Ura4 유전자, 텔로미어 영역 A - C 말단을 포함하는 DNA 절편(레인 7) 및 텔로미어 영역 B - N 말단, Ura4 유전자, 텔로미어 영역 B - C 말단을 포함하는 DNA 절편(레인 8)을 나타낸 PCR 전기영동 사진이다.
도 3a은 도 2를 통하여 만들어진 DNA 절편을 효모 균주에 형질도입시켜 얻은 형질전환 효모균주 KSTU201과 KSTU202의 염색체상의 Ura4 유전자 삽입 모식도이며, 도 3b는 도 3a의 형질전환 효모균주의 텔로미어상의 Ura4 유전자의 발현정도를 우라실이 없는 배지에서 측정한 결과를 보여준다. 대조군으로서 Ura4+ 972균주와 Ura4- ED665균주를 이용하였다.
도 4는 상기 형질전환 효모균주 KSTU201, KSTU202 균주에 텔로미어의 전사 비활성화를 방해하는 clr4-W31G 돌연변이를 도입한 KSTU203, KSTU204 균주에서 텔로미어 전사 비활성화가 교란되었음을 보여주는 결과이다.
도 5a는 KSTU201균주를 clr4-W31G 돌연변이만을 가진 균주와 교잡하여 우라실이 없는 배지에서 배양한 결과를 보여주는 것으로, 텔로미어 전사 비활성화에 대한 저해를 보이는 콜로니와 그렇지 않은 콜로니가 다 같이 형성됨을 보여준다. 도 5b는 KSTU202에 clr4-W31G 돌연변이를 유도한 균주를 우라실이 없는 배지에서 배지에서 배양한 결과를 보여주는 것으로, clr4-W31G 돌연변이에 의한 텔로미어 전사 비활성화에 대한 저해가 나타나는 균주만이 콜로니를 형성함을 알 수 있다.
도 6은 실제 텔로미어 관련 약물 스크리닝에 KSTU 균주들에 대한 유전자형을 검정하고, 배지에 따른 성장 정도의 차이를 검정하였으며, Ura4유전자가 전사 비활성화 기작의 혼란으로 인해 발현되었을 때 5-FOA(5-fluoroorotic acid)가 첨가된 배지에서 성장저해를 보이는지, 성장저해의 강도는 어떠한지를 나타낸 결과이다.
도 7은 KSTU202 균주를 이용하여 실제 NCI (National Cancer Institute, USA) 화합물 중 텔로미어의 전사 비활성화에 영향을 주는 후보 화합물을 C 배지(complete medium)와 C+FOA 배지를 이용하여 스크리닝한 결과를 보여준다.
도 8a는 도 7과 같은 과정을 거쳐서 스크리닝된 후보 화합물을 함유하는 C 배지, C+FOA 배지, C-Ura 배지에서 KSTU202 균주를 배양함으로써 음성 선택(negative selection)과 양성 선택(positive selection)을 동시에 하여 선별된 화합물의 효능을 정확히 검증한 예를 보여준다. 또한 도 8b는 KSTU204 균주를 이용한 저해된 텔로미어의 전사 비활성화를 복원시키는 후보 화합물의 효능을 정확히 검증한 예를 보여준다.
본 발명은 텔로미어 부위에 텔로미어 전사 비활성화(transcriptional silencing)를 표지하는 마커 유전자가 도입된 텔로미어 형질전환 효모 균주 및 상기 균주의 제조방법, 상기 균주를 시험 화합물이 함유된 배지에서 배양하여 마커 유전자의 발현을 탐색함으로써 유기화합물군(chemical library) 중 텔로미어 전사 비활성화에 관여하는 화합물을 스크리닝하는 방법 및 상기 균주를 함유하는 용기를 포함하는 텔로미어 전사 비활성화 관여 화합물을 스크리닝하기 위한 키트에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 텔로미어 부위에 텔로미어 전사 비활성화를 표지하는 마커 유전자가 도입된 텔로미어 형질전환 효모 균주의 염색체에 추가로 텔로미어 전 사 비활성화의 교란을 통해 마커 유전자를 발현시키는 돌연변이 유전자가 도입된 효모 균주 및 상기 균주의 제조방법, 상기 균주를 시험 화합물이 함유된 배지에서 배양하여 마커 유전자의 발현을 탐색함으로써 유기화합물군 중 텔로미어 전사 비활성화에 관여하는 화합물을 스크리닝하는 방법 및 상기 균주를 함유하는 용기를 포함하는 텔로미어 전사 비활성화 관여 화합물을 스크리닝하기 위한 키트에 관한 것이다.
최근, 진핵세포생물 게놈(eukaryote genome)의 센트로미어(centromere), 텔로미어(telomere)와 같은 헤테로크로마틴 구조가 히스톤의 아세틸화와 메틸화 정도에 따라 변형되어 특정 유전자들의 발현이 억제되는 전사 비활성화 현상에 의해 유전적 질병, 퇴행성 신경장애, 암 등이 발생하는 것으로 보고되고 있다. 특히, 히스톤 아세틸트랜스퍼레이즈(histone acetyltransferase)와 히스톤 디아세틸트랜스퍼레이즈(histone deacetyltransferase)와 같은 전사 비활성화 조절인자는 전사(transcription), 유전자 전사 비활성화(gene silencing), 분화(differentiation), DNA 복제(DNA replication), 유전자독성 반응(genotoxic responses)과 깊은 관계가 있으며 암 생성 기작에 매우 중요한 역할을 하는 것으로 보고되고 있다. 따라서 크로마틴의 구조를 조절하는 전사 비활성화 조절 유전자와 조절 기작에 관심이 모아지고 있으며, 이에 대한 연구는 유전적 질병 및 다양한 암의 생성 기작 연구에 중요한 자료를 제공하여 줄 뿐 아니라 관련 질병의 약물 표적 및 후보 약물개발에 기여할 수 있을 것으로 예상된다.
이에 따라, 암이나 노화 등의 텔로미어 전사 비활성화의 교란으로 인해 발생하는 다양한 질환들의 원인 규명 및 이들 질환의 치료제 개발이 요구되고 있으며 텔로미어의 전사 비활성화에 관여하는 물질을 스크리닝하는데 필요한 효율적이며 간편한 시스템이 절실히 요구되고 있다.
그러나, 기존의 약물 스크리닝 시스템은 복잡하고 장시간이 요구되는 경우가 많았다. 기존에 알려져 있는 고등동물의 인 비트로 텔로머레이즈 어세이 키트(in vitro telomerase assay kit)가 대표적인 예로 볼 수 있는데 이는 비용이 많이 들 뿐 아니라 텔로머레이즈와 직접 관련 없는 다른 신호전달체계가 텔로미어의 전사 비활성화를 조절에 관여할 경우 전혀 관찰할 수 없는 단점이 있다. 또한 한 번에 다룰 수 있는 약물의 개수도 한정되어 있어 HTS 물질 탐색이 용이하지 않다.
따라서, 기능이 알려지지 않은 텔로미어 전사 비활성화와 관련된 유전자의 기능을 새롭게 밝히고, 전사 비활성화에 관여하는 약물을 스크리닝하기 위해서는 고등생물 또는 인 비트로(in vitro) 스크리닝 시스템보다는 모델세포를 기반으로 하는 시스템(cell based system)을 이용한 좀 더 빠르고 쉬운 방법이 필요한데, 이러한 점에서 본 발명에서는 고등생물과 유사한 작용 기작을 가진 효모(yeast)를 이용하고자 하였다.
효모 중에서도 특히 분열효모(fission yeast)는 세포분화, 분열, 세포신호전달 및 대사 등의 중요한 분자생물학적 시스템이 모든 진핵생물에 있어 거의 동일하게 유지되고 있어 진핵생물 중 가장 하위에 위치하고 있으면서도 그들의 유전학적 이용 가능성은 매우 크며, 분열효모에서 실행되는 여러 가지 신호전달 시스템은 고 등생물에서도 충분히 활용될 수 있다. 더욱이, 분열효모는 출아효모(budding yeast)에는 존재하지 않는 전사 비활성화 시스템을 갖추고 있다. 예를 들면, 출아효모의 경우 그들의 센트로미어와 관련된 어떠한 보존된 단백질 군도 검증되지 않았지만 분열효모의 센트로미어는 고등동물의 것과 유사한 구조를 가지며 또한 유사한 조절 작용이 있다. 이는 센트로미어와 결합하는 미세관(microtubule)에서 더 확연한 차이를 보이는데, 출아효모의 경우 하나의 미세관이 센트로미어에 결합하여 염색체를 분리시키는데 비해 분열효모를 비롯한 고등 동물은 여러 개의 다발(bundle)로 된 미세관이 동시에 결합하여 염색체를 분열시키는 매우 세밀하고 복잡한 기작을 보인다.
따라서, 텔로미어 전사 비활성화 관여 약물을 스크리닝하기 위해 분열효모 스크리닝 시스템을 만들었을 때 그 이용범위가 고등생물에까지 이어질 수 있는 많은 가능성을 가지고 있다.
이에, 본 발명자들은 분열효모의 헤테로크로마틴 부위인 텔로미어에 텔로미어 전사 비활성화를 표지하기 위한 마커 유전자로서 영양요구 마커 유전자 또는 항생 마커 유전자를 도입하여 정상적인 상태에서는 전사가 일어나지 않는 비활성화 상태이지만 세포내 변화에 따라 전사가 활성화 되는 전사 비활성화 조절 균주를 제조하였다. 또한, 상기 형질전환 균주의 염색체에 추가로 텔로미어의 전사 비활성화를 교란시켜 상기 마커 유전자를 발현시키는 돌연변이 유전자를 도입하여 텔로미어 및 타 헤테로크로마틴 부위에서 항상 전사가 일어나는 형질전환 균주를 제조하였다. 또한, 이렇게 제조된 균주들을 시험 화합물이 처리된 특정 선발 배지에 서 배양하여 균주의 성장과 성장저해 현상을 조사· 비교함으로써 텔로미어의 전사 비활성화에 관여하는 물질, 특히 노화와 암 관련 물질을 발굴할 수 있는 스크리닝 시스템을 만들어 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 텔로미어 부위에 텔로미어 전사 비활성화(transcriptional silencing)를 표지하는 마커 유전자가 도입된 텔로미어 형질전환 효모 균주 및 상기 균주의 제조방법, 상기 균주를 이용하여 텔로미어 전사 비활성화에 관여하는 화합물을 스크리닝하는 방법 및 상기 균주를 포함하는 스크리닝 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 텔로미어 부위에 텔로미어 전사 비활성화(transcriptional silencing)를 표지하는 마커 유전자가 도입된 텔로미어 형질전환 효모 균주의 염색체에 추가로 텔로미어 전사 비활성화의 교란을 통해 마커 유전자를 발현시키는 돌연변이 유전자가 도입된 효모 균주 및 상기 균주의 제조방법, 상기 균주를 이용하여 텔로미어 전사 비활성화에 관여하는 화합물을 스크리닝하는 방법 및 상기 균주를 포함하는 스크리닝 키트를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 텔로미어 전사 비활성 부위에 텔로미어 전사 비활성화를 표지하기 위한 마커 유전자로서 Ura4 유전자를 도입하여 Ura4 유전자가 발현되지 않는 균주를 만들고, 추가로 전사 비활성화되었던 상기 마커 유전자를 다시 발현시키는 돌연변이 유전자인 clr4 돌연변이 유전자를 도입함으로써 텔로미어의 전사 비활성화의 교란에 의해 마커 유전자가 발현되는 균주를 제조하였다. 텔로미어의 유전자 발현을 억제하는 부위에 마커 유전자를 삽입하여 유전자는 존재하나 그 발현은 볼 수 없는 균주와 그 균주에 특정 돌연변이를 도입하여 항상 억제되어야 하는 텔로미어의 전사 비활성화가 교란되어 마커 유전자의 발현이 풀려져 있는 균주를 제공하는 것이다.
본 발명에서는 상기 균주들을 제조하는 방법뿐만 아니라, 상기 균주를 이용하여 텔로미어 전사 비활성화 관여 화합물을 스크리닝하는 방법 및 상기 균주를 포함하는 스크리닝 키트를 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 텔로미어 부위에 텔로미어 전사 비활성화(transcriptional silencing)를 표지하는 마커 유전자가 도입된 텔로미어 형질전환 효모 균주를 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 마커 유전자는 영양요구 마커(auxotrophic marker) 또는 항생 마커(dominant drug resistance marker) 유전자일 수 있다.
상기 영양요구 마커 유전자는 Ura4, Leu2, His3 및 Trp1 등으로 구성되는 군으로부터 선택될 수 있다. 본원 일 실시예에서는 서열번호 13의 염기서열을 갖는 Ura4 유전자를 마커 유전자로서 이용하였다.
또한 항생 마커 유전자는 NAT(Nourseothricin acetyl transferase), 제네티신(Geneticin 또는 G418) 및 하이그로마이신 B(Hygromycin B) 등으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.
한편, 본 발명의 형질전환 균주는 본 발명의 목적에 따라 텔로미어 전사 비활성화에 관여하는 화합물을 스크리닝하는데 유용하게 이용할 수 있는 것이면 어떤 것이든 가능하다.
본 발명의 바람직한 형질전환 균주는 형질전환 분열 효모이며, 보다 바람직하게는 스키조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe)이다. 다르게는 본 발명의 형질전환 균주로서 사카로마이세스 세레비시에(Saccaromyces cerevisiae) 또는 캔디다 알비칸(Candida Albicans)을 이용할 수도 있다.
본 발명의 실시예에서는 스키조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe)를 형질전환시켜 이용하였다.
본 발명의 형질전환 효모 균주에 있어서, 상기 텔로미어에 마커 유전자가 도입되는 부위는 서열번호 11의 염기서열을 갖는 텔로미어의 비코딩영역(non-coding region) (이하, '비코딩영역 A'라고도 한다) 또는 서열번호 12의 염기서열을 갖는 텔로미어의 비코딩영역 (이하, '비코딩영역 B'라고도 한다)인 것이 바람직하다. 텔로미어의 비코딩영역 A는 도입된 유전자의 50% 정도의 발현이 저해되는 부위이고, 텔로미어의 비코딩영역 B는 도입된 유전자가 완벽하게 발현이 저해되는 부위이다. 상기 헤테로크로마틴 영역은 모두 텔로미어의 전사 비활성화에 관련되며, 이 부위의 변화는 세포의 암화, 노화를 일으키도록 하는데 관여한다.
본 발명의 일 실시예에서는 삽입된 유전자가 전혀 발현되지 않는 텔로미어의 가장 말단 부위인 서열번호 12의 염기서열을 갖는 텔로미어의 비-코딩 영역에 서열번호 13의 염기서열을 갖는 영양요구 마커 유전자인 Ura4 유전자가 도입된 형질전환 스키조사카로마이세스 폼베 균주를 제조하였으며, 이를 KSTU202 (h-/tel2B::Ura4)'라 명명한 뒤, 한국생명공학연구원 유전자은행에 2006년 7월 28일자로 기탁하였다(수탁번호: KCTC10971BP).
본 발명에 따른 텔로미어 부위에 텔로미어 전사 비활성화(transcriptional silencing)를 표지하는 마커 유전자가 도입된 텔로미어 형질전환 효모 균주를 제조하는 방법은 다음 단계를 포함한다:
1) 마커 유전자가 도입되는 텔로미어 부위의 양쪽 염색체 부분에 해당하는 N 말단 절편과 C 말단 절편을 증폭시키고, 텔로미어 전사 비활성화(transcriptional silencing)를 표지하기 위한 마커 유전자를 증폭시키는 단계;
2) 단계 1에서 증폭시킨 N 말단 절편, 마커 유전자 및 C 말단 절편이 순서대로 연결된 DNA 절편을 제조하는 단계;
3) 단계 2에서 제조한 DNA 절편을 효모 균주에 형질도입하는 단계; 및
4) 단계 3을 통해 형질전환된 효모균주를 선별하는 단계.
상기 단계 1 및 단계 2는 마커 유전자를 텔로미어에 도입하는 형질전환의 준비단계에 해당한다. 단계 1은 마커 유전자를 도입하고자 하는 텔로미어 부위의 양쪽 염색체 부분에 해당하는 N 말단 절편과 C 말단 절편을 이에 맞는 프라이머를 이 용하여 증폭시키고, 도입하고자 하는 마커 유전자를 선택하여 마찬가지로 적당한 프라이머를 이용하여 증폭시키는 단계에 해당한다. 단계 2는 이렇게 증폭된 N 말단 절편, 마커 유전자 및 C 말단 절편을 순서대로 연결시켜 형질도입에 사용하는 DNA 절편을 제작하는 단계에 해당한다.
상기 단계 3은 마커 유전자를 텔로미어에 도입하는 형질전환 단계이다. 단계 1 내지 단계 2를 통해 제조한 DNA 절편은 양 말단이 효모의 염색체에 있는 텔로미어의 헤테로크로마틴 영역을 포함하도록 제조한 것이므로, 이것이 효모의 염색체에 존재하는 텔로미어 말단에 상동성 재조합됨으로써 마커 유전자의 개방해독 판독틀(open reading frame)이 삽입되는 과정이다.
상기 단계 4는 단계 3을 거친 균주를 완전 배지(complete medium) 및 선발 배지(selection medium)에서 배양하여 형질전환된 균주를 선별하는 단계에 해당한다. 예컨대, 영양요구 마커 유전자로서 Ura4 유전자가 텔로미어에 도입된 형질전환 효모균주는 완전 배지에서는 생존하나, 우라실이 없는 배지에서는 사멸하게 되므로 이러한 과정을 통해 상기 단계 3을 통해 삽입된 DNA 절편을 가지고 있는 형질전환 효모균주만을 선별할 수 있게 된다.
이렇게 단계 1 내지 단계 4를 거쳐 얻은 텔로미어 전사 비활성화를 표지하는 마커 유전자가 도입된 텔로미어 형질전환 효모 균주는 마커 유전자에 따른 선발 배지의 종류에 따라 사멸 또는 생존함으로써 텔로미어의 전사 비활성화를 표지하게 된다. 따라서, 이러한 성질을 이용하게 되면 이들 균주에 약물을 처리하였을 때 그 약물이 텔로미어의 전사 비활성화에 관여하는 약물인지 여부를 판단할 수 있게 된다.
그러므로, 본 발명은
텔로미어 부위에 텔로미어 전사 비활성화(transcriptional silencing)를 표지하는 마커 유전자가 도입된 텔로미어 형질전환 효모 균주를 제공하고,
상기 균주를 시험 화합물이 함유된 완전 배지(complete medium) 및 선발 배지(selection medium)에서 배양하고,
선발 배지에서 배양된 균주의 마커 유전자의 발현 여부를 탐색하여 완전 배지에서 배양된 균주와 비교하는 것을 포함하는
유기화합물군(chemical library) 중 텔로미어 전사 비활성화에 관여하는 화합물을 스크리닝하는 방법을 제공한다.
본 발명은 텔로미어 형질전환 효모균주를 이용하여 시험 화합물이 텔로미어 전사 비활성화에 관여하는 화합물에 해당하는지 여부를 판단할 수 있도록 해 준다.
상기 방법에서, 상기 텔로미어 형질전환 효모균주는 전사 비활성화를 표지하는 마커 유전자가 도입된 상태이므로 전사 비활성화 상태에서는 마커 유전자가 발현되지 않는다. 만일 시험 화합물을 처리함에 따라 마커 유전자가 발현되었다면, 이는 전사 비활성화가 교란되어 마커 유전자가 발현되었음을 의미하며, 이는 상기 텔로미어 전사 비활성화에 관여하는 화합물이 마커 유전자의 전사 비활성화를 교란시키는 암 또는 노화 관련 물질임을 뜻하는 것이다.
바람직하게는 상기 방법에 있어서 마커 유전자는 Ura4 유전자이고, 선발 배지는 C-Ura 배지이다. 보다 바람직하게는 선발 배지로서 C-Ura 배지와 함께 C+FOA 배지를 추가로 사용할 수 있다. 이 두 가지 배지를 동시에 이용할 경우, 형질전환 효모균주가 C-Ura 배지에서는 생존하고 C+FOA 배지에서는 사멸하는 경우 시험화합물을 암 또는 노화 관련 물질로 판단할 수 있다. 이와 같이 C+FOA 배지를 C-Ura 배지와 함께 사용하게 되면 양성 선택(positive selection)과 음성 선택(negative selection)이 동시에 가능해지므로 실험의 신뢰도를 높일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는 텔로미어에 Ura4 유전자가 삽입된 균주 KSTU202를 배양하여 1 X 105/ml 로 희석한 후 100ul 의 희석된 세포를 HTS를 사용하여 분주하고 이에 조사하고자 하는 화합물군을 또한 HTS를 사용하여 처리한 후 12~24 시간 정도 배양하였다. 이 때 배지는 C-배지(Complete), C+FOA (1g/ml 의 5-FOA가 함유된 배지)를 각각 사용하였다. 대량의 스크리닝을 좀 더 용이하게 하기 위해 1차 스크리닝에서는 C-우라실 배지는 사용하지 않아도 된다. 2차 스크리닝에서는 1차 스크리닝에서 선별된 후보 화합물들의 효능을 좀 더 정확히 검증하고자 C-배지(Complete), C+FOA (1g/ml 의 5-FOA가 함유된 배지)와 함께 C-우라실 배지를 모두 사용하여 양성 선택(positive selection)과 음성 선택(negative selection)이 모두 잘 작용함을 확인하였다.
추가로, 본 발명은 텔로미어 부위에 텔로미어 전사 비활성화(transcriptional silencing)를 표지하는 마커 유전자가 도입된 텔로미어 형질전환 효모 균주, 완전 배지 및 선발 배지를 함유하는 용기 및 텔로미어 전사 비활성 화 관여 화합물의 스크리닝 방법에 대한 설명서를 포함하는 키트를 제공한다.
상기 스크리닝 키트에서 '용기'는 스크리닝 키트에서 일반적으로 사용되는 것이라면 어떠한 것이든 사용가능하며, 바람직하게는 멀티-웰 플레이트(multi-well plate) 또는 마이크로타이터 플레이트(microtitre plate)이다. 보다 바람직하게는 상기 멀티-웰 플레이트는 둥근 바닥 멀티-웰 플레이트(round-bottom multi-well plate)이다.
상기 스크리닝 방법 또는 스크리닝 키트를 이용하여 약물을 스크리닝할 때에는 특히 96웰 둥근 바닥 플레이트에서 배양하는 것이 바람직한데, 이렇게 배양함으로써, 대량으로 균주를 배양할 수 있고, 이로 인해 대량의 화합물 군을 한꺼번에 스크리닝 할 수 있을 뿐만 아니라, 스크리닝의 결과, 즉 세포의 성장과 성장 저해를 둥근바닥 플레이트에 모여진 세포병의 크기로 손쉽게 선별할 수 있기 때문이다.
상기 키트에서, 텔로미어 형질전환 효모 균주에 도입된 마커 유전자는 Ura4 유전자이며, 이 마커 유전자의 발현 여부를 탐지하기 위한 선발 배지는 C-Ura 배지인 것이 바람직하다. 보다 바람직하게는, 상기 키트는 C-Ura 배지와 함께 추가로 C+FOA 배지를 추가로 포함한다. 보다 더 바람직하게는 상기 형질전환 효모균주는 KSTU202(h-/tel2B::Ura4)인 형질전환 스키조사카로마이세스 폼베 균주(수탁번호; KCTC10971BP)이다.
본 발명은 또한 텔로미어 부위에 텔로미어 전사 비활성화를 표지하는 마커 유전자가 도입된 텔로미어 형질전환 효모 균주의 염색체에 추가로 텔로미어 전사 비활성화의 교란을 통해 마커 유전자를 발현시키는 돌연변이 유전자가 도입된 효모 균주를 제공한다.
이는 앞서 언급한 "텔로미어 부위에 텔로미어 전사 비활성화를 표지하는 마커 유전자가 도입된 텔로미어 형질전환 효모 균주"에 추가적으로 텔로미어 전사 비활성화의 교란을 통해 마커 유전자를 발현시키는 돌연변이 유전자를 도입함으로써 전사가 비활성화 되었던 마커 유전자가 다시 발현하도록 제조한 것으로서, 교란된 텔로미어 전사 비활성화를 시험 화합물이 정상화시키는지 여부를 알 수 있도록 해 주는 균주이다.
상기 균주에서, 마커 유전자, 형질전환 균주 등 '텔로미어 부위에 텔로미어 전사 비활성화를 표지하는 마커 유전자가 도입된 텔로미어 형질전환 효모 균주'와 관련한 설명은 앞서 언급한 바와 같다.
상기 균주에서, '텔로미어 전사 비활성화의 교란을 통해 마커 유전자를 발현시키는 돌연변이 유전자'는 텔로미어 내로의 도입을 통해 전사가 비활성되었던 마커 유전자를 다시 발현시키는 돌연변이 유전자라면 어떠한 것이든 가능하며, 바람직하게는 clr4 돌연변이 유전자이다.
본 발명의 일 실시예에서는 상기 KSTU202 (h-/tel2B::Ura4)(수탁번호: KCTC10971BP) 균주에 '텔로미어 전사 비활성화의 교란을 통해 마커 유전자를 발현시키는 돌연변이 유전자'로서 31번 아미노산 트립토판이 글라이신으로 바뀌어진 서열번호 14의 서열을 갖는 돌연변이 clr4 유전자가 도입된 균주를 제조하였으며, 이를 'KSTU204(h-/tel2B::Ura4, clr4-W31G)'라 명명한 뒤, 한국생명공학연구원 유전 자은행에 2006년 7월 28일자로 기탁하였다(수탁번호: KCTC10972BP).
본 발명에 따른 텔로미어 부위에 텔로미어 전사 비활성화를 표지하는 마커 유전자가 도입된 텔로미어 형질전환 효모 균주의 염색체에 추가로 텔로미어 전사 비활성화의 교란을 통해 마커 유전자를 발현시키는 돌연변이 유전자가 도입된 효모 균주를 제조하는 방법은 다음 단계를 포함한다:
1) 마커 유전자가 도입되는 텔로미어 부위의 양쪽 염색체 부분에 해당하는 N 말단 절편과 C 말단 절편을 증폭시키고, 텔로미어 전사 비활성화를 표지하기 위한 마커 유전자를 증폭시키는 단계;
2) 단계 1에서 증폭시킨 N 말단 절편, 마커 유전자 및 C 말단 절편이 순서대로 연결된 DNA 절편을 제조하는 단계;
3) 단계 2에서 제조한 DNA 절편을 효모 균주에 형질도입하는 단계;
4) 단계 3을 통해 형질전환된 효모균주를 선별하는 단계;
5) 단계 4에서 제조된 형질전환 균주에 텔로미어 전사 비활성화의 교란을 통해 텔로미어 중에 도입된 마커 유전자를 발현시키는 돌연변이 유전자를 도입하는 단계 및
6) 단계 5)를 통해 돌연변이 유전자가 도입된 형질전환 균주를 선별하는 단계.
여기에서, 상기 단계 1) 내지 단계 4)는 앞서 설명한 바와 같다.
상기 단계 5)는 돌연변이가 일어날 경우 텔로미어 전사 비활성화를 교란시킬 가능성이 있는 특정 유전자를 선택하여 돌연변이를 도입하는 것으로서, 이 과정에 의해 전사 비활성화의 교란이 일어나 상기 단계 3)을 통해 텔로미어 중에 도입되어 전사가 비활성화되었던 마커 유전자가 항시 발현되도록 만드는 것이다.
상기 단계 6)은 단계 5)를 거친 균주를 완전 배지(complete medium) 및 선발 배지(selection medium)에서 배양하여 형질전환된 균주를 선별하는 단계에 해당한다. 예컨대, 영양요구 마커 유전자로서 Ura4 유전자가 텔로미어에 도입되어 있고, 추가로 clr4 점 돌연변이가 도입된 형질전환 효모균주는 clr4 점 돌연변이가 도입되지 않은 Ura4 유전자 도입 형질전환 효모균주와는 달리, 우라실이 없는 배지에서도 생존하므로 이러한 과정을 통해 상기 단계 5)을 통해 돌연변이된 형질전환 효모균주만을 선별할 수 있게 된다.
본 발명의 일 실시예에서는 단계 5)에서, 단계 1) 내지 4)를 거쳐 얻은 Ura4 도입 균주에 교배(mating)를 통하여 clr4 점 돌연변이를 도입함으로써 텔로미어의 전사 비활성화를 근본적으로 교란시켰다. 이 돌연변이는 텔로미어뿐만 아니라 교배 유형 유전자좌(mating type locus)에도 영향을 주는 것으로 이 돌연변이가 도입되면 세포는 스포어(spore)를 만들기 시작하고 이는 요오드기체에 노출시켜 콜로니의 색이 변하는 것으로 검증되었다. 상기 실시예에서는 또한 단계 6)에서, 단계 5)를 통해 얻은 균주들이 -Ura 배지와 +5-FOA 배지에서 실제 성장과 성장 저해가 일어나는지를 검증하여 돌연변이가 도입된 균주만을 선별하였다.
만일 마커 유전자로서 Ura4 유전자가 아닌 항생제 마커 유전자를 사용할 경우 5-FOA 배지는 사용하지 않고 항생제 마커가 들어간 하나의 배지에서의 성장과 성장 저해를 판단하게 된다. 그러므로 실험의 신뢰도를 높이기 위해서는 Ura4 유전자를 이용하여 양성 선택(positive selection)과 음성 선택(negative selection)을 동시에 하는 것이 더 바람직하다.
앞서 살펴본 바와 같이, 텔로미어 전사 비활성화를 표지하는 마커 유전자가 도입된 텔로미어 형질전환 효모 균주는 배양되는 선발 배지의 종류에 따라 사멸 또는 생존함으로써 시험 화합물이 텔로미어의 전사 비활성화에 관여하는 약물인지 여부를 표지하게 된다. 이와는 달리, 텔로미어 부위에 텔로미어 전사 비활성화를 표지하는 마커 유전자가 도입된 텔로미어 형질전환 효모 균주의 염색체에 추가로 텔로미어 전사 비활성화의 교란을 통해 마커 유전자를 발현시키는 돌연변이 유전자가 도입된 효모 균주는 동일한 선발 배지에서 그와는 정반대의 결과를 나타냄으로써 시험 화합물이 텔로미어의 전사 비활성화에 관여하는 약물인지 여부를 표지하게 된다.
그러므로, 본 발명은
텔로미어 부위에 텔로미어 전사 비활성화를 표지하는 마커 유전자가 도입된 텔로미어 형질전환 효모 균주의 염색체에 추가로 텔로미어 전사 비활성화의 교란을 통해 마커 유전자를 발현시키는 돌연변이 유전자가 도입된 효모 균주를 제공하고,
상기 균주를 시험 화합물이 함유된 완전 배지(complete medium) 및 선발 배지(selection medium)에서 배양하고,
선발 배지에서 배양된 균주의 마커 유전자의 발현 여부를 탐색하여 완전 배 지에서 배양된 균주와 비교하는 것을 포함하는
유기화합물군(chemical library) 중 텔로미어 전사 비활성화에 관여하는 화합물을 스크리닝하는 방법을 제공한다.
본 발명은 텔로미어 형질전환 효모균주를 이용하여 시험 화합물이 텔로미어 전사 비활성화에 관여하는 화합물에 해당하는지 여부를 판단할 수 있도록 해 준다.
상기 방법에서, 전사 비활성화 되었던 마커 유전자를 다시 발현시키는 돌연변이 유전자가 도입된 텔로미어 형질전환 효모균주는 마커 유전자의 전사 비활성화가 교란된 상태이므로 항시 마커 유전자가 발현된다. 만일 시험 화합물을 처리함에 따라 마커 유전자가 발현되지 않는다면, 이는 마커 유전자의 전사 비활성화 교란이 다시 정상화되었음을 의미하며, 이는 상기 텔로미어 전사 비활성화에 관여하는 화합물이 마커 유전자의 전사 비활성화 교란을 정상화시키는 항암제 또는 항노화제임을 뜻하는 것이다.
바람직하게는 상기 방법에 있어서 마커 유전자는 Ura4 유전자이고, 선발 배지는 C-Ura 배지이다. 보다 바람직하게는 선발 배지로서 C-Ura 배지와 함께 C+FOA 배지를 추가로 사용할 수 있다. 이 두 가지 배지를 동시에 이용할 경우, 형질전환 효모균주가 C-Ura 배지에서는 생존하고 C+FOA 배지에서는 사멸하는 경우 시험화합물을 항암제 또는 항노화제로 판단할 수 있다. 이와 같이 C+FOA 배지를 C-Ura 배지와 함께 사용하게 되면 양성 선택(positive selection)과 음성 선택(negative selection)이 동시에 가능해지므로 실험의 신뢰도를 높일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는 텔로미어에 Ura4 유전자가 삽입되고, clr4 돌연 변이 유전자가 도입된 균주 KSTU204를 배양하여 1 X 105/ml 로 희석한 후 100ul 의 희석된 세포를 HTS를 사용하여 분주하고 이에 조사하고자 하는 화합물군을 또한 HTS를 사용하여 처리한 후 12~24 시간 정도 배양하였다. 이 때 배지는 C-배지(Complete), C+FOA (1g/ml 의 5-FOA가 함유된 배지)를 각각 사용하였다. 대량의 스크리닝을 좀 더 용이하게 하기 위해 1차 스크리닝에서는 C-우라실 배지는 사용하지 않아도 된다. 2차 스크리닝에서는 1차 스크리닝에서 선별된 후보 화합물들의 효능을 좀 더 정확히 검증하고자 C-배지(Complete), C+FOA (1g/ml 의 5-FOA가 함유된 배지)와 함께 C-우라실 배지를 모두 사용하여 양성 선택(positive selection)과 음성 선택(negative selection)이 모두 잘 작용함을 확인하였다.
또한, 본 발명은 텔로미어 부위에 텔로미어 전사 비활성화를 표지하는 마커 유전자가 도입된 텔로미어 형질전환 효모 균주의 염색체에 추가로 텔로미어 전사 비활성화의 교란을 통해 마커 유전자를 발현시키는 돌연변이 유전자가 도입된 효모 균주, 완전 배지 및 선발 배지를 함유하는 용기 및 텔로미어 전사 비활성화 관여 화합물의 스크리닝 방법에 대한 설명서를 키트를 제공한다.
상기 스크리닝 키트에서 '용기'는 스크리닝 키트에서 일반적으로 사용되는 것이라면 어떠한 것이든 사용가능하며, 바람직하게는 멀티-웰 플레이트(multi-well plate) 또는 마이크로타이터 플레이트(microtitre plate)이다. 보다 바람직하게는 상기 멀티-웰 플레이트는 둥근 바닥 멀티-웰 플레이트(round-bottom multi-well plate)이다.
상기 스크리닝 방법 또는 스크리닝 키트를 이용하여 약물을 스크리닝할 때에는 특히 96웰 둥근 바닥 플레이트에서 배양하는 것이 바람직한데, 이렇게 배양함으로써, 대량으로 균주를 배양할 수 있고, 이로 인해 대량의 화합물 군을 한꺼번에 스크리닝 할 수 있을 뿐만 아니라, 스크리닝의 결과, 즉 세포의 성장과 성장 저해를 둥근바닥 플레이트에 모여진 세포병의 크기로 손쉽게 선별할 수 있기 때문이다.
상기 키트에서, 텔로미어 형질전환 효모 균주에 도입된 마커 유전자는 Ura4 유전자이며, 이 마커 유전자의 발현 여부를 탐지하기 위한 선발 배지는 C-Ura 배지인 것이 바람직하다. 보다 바람직하게는, 상기 키트는 C-Ura 배지와 함께 추가로 C+FOA 배지를 추가로 포함한다. 보다 더 바람직하게는 상기 형질전환 효모균주는 KSTU204(h-/tel2B::Ura4, clr4-W31G)인 형질전환 스키조사카로마이세스 폼베 균주(수탁번호; KCTC10972BP)이다.
본 발명에 있어서 사용된 서열에 대한 설명은 다음과 같다.
서열번호 1: S. pombe 2번 염색체의 텔로미어에 Ura4 유전자를 삽입시키기 위한 N-말단 증폭용 정방향 PCR 프라이머 (도 1의 Box B 참조)
서열번호 2: S. pombe 2번 염색체의 텔로미어에 Ura4 유전자를 삽입시키기 위한 N-말단 증폭용 역방향 PCR 프라이머 (도 1의 Box B 참조)
서열번호 3: S. pombe 2번 염색체의 텔로미어에 Ura4 유전자를 삽입시키기 위한 C-말단 증폭용 정방향 PCR 프라이머 (도 1의 Box B 참조)
서열번호 4: S. pombe 2번 염색체의 텔로미어에 Ura4 유전자를 삽입시키기 위한 C-말단 증폭용 역방향 PCR 프라이머 (도 1의 Box B 참조)
서열번호 5: S. pombe 2번 염색체의 최말단에서 15kb 떨어진 텔로미어에 Ura4 유전자를 삽입시키기 위한 N-말단 증폭용 정방향 PCR 프라이머 (도 1의 Box A 참조)
서열번호 6 : S. pombe 2번 염색체의 최말단에서 15kb 떨어진 텔로미어에 Ura4 유전자를 삽입시키기 위한 N-말단 증폭용 역방향 PCR 프라이머 (도 1의 Box A 참조)
서열번호 7: S. pombe 2번 염색체의 최말단에서 15kb 떨어진 텔로미어에 Ura4 유전자를 삽입시키기 위한 C-말단 증폭용 정방향 PCR 프라이머 (도 1의 Box A 참조)
서열번호 8: S. pombe 2번 염색체의 최말단에서 15kb 떨어진 텔로미어에 Ura4 유전자를 삽입시키기 위한 C-말단 증폭용 역방향 PCR 프라이머 (도 1의 Box A 참조)
서열번호 9: S.pombe의 Ura4 유전자를 PCR로 증폭시키기 위한 정방향 프라이머
서열번호 10: S.pombe의 Ura4 유전자를 PCR로 증폭시키기 위한 역방향 프라이머
서열번호 11: KSTU201 균주제조를 위한 Ura4 삽입 위치의 텔로미어 순열, 서열번호 5의 프라이머와 서열번호 8의 프라이머 사이의 염색체상의 순열
서열번호 12 : KSTU202 균주제조를 위한 Ura4 삽입 위치의 텔로미어 순열, 서열번호 1의 프라이머와 서열번호 4의 프라이머 사이의 염색체 상의 순열
서열번호 13 : S.pombe의 Ura4 유전자의 프로모터 부분과 ORF를 포함하는 순열
서열번호 14 : 31번 아미노산이 트립토판(TGG)에서 글라이신(GGT)로 돌연변이가 일어난 S. pombe의 clr4 유전자의 ORF
서열번호 15 : S. pombe 2번 염색체에서 서열번호 5의 프라이머와 서열번호 6의 프라이머를 이용하여 증폭한 N-말단 단편
서열번호 16: S. pombe 2번 염색체에서 에서 서열번호 7의 프라이머와 서열번호 8의 프라이머를 이용하여 증폭한 C-말단 단편
서열번호 17: S. pombe 2번 염색체에서 서열번호 1의 프라이머와 서열번호 2의 프라이머를 이용하여 증폭한 N-말단 단편
서열번호 18 : S. pombe 2번 염색체에서 서열번호 3의 프라이머와 서열번호 4의 프라이머를 이용하여 증폭한 C-말단 단편
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 텔로미어 부위에 Ura4 유전자가 도입된 형질전환 균주의 제조
(1) Ura4 유전자의 삽입을 위한 프라이머의 제작
텔로미어 부위에 텔로미어 전사 비활성화를 표지하는 마커 유전자를 도입하기 위한 텔로미어 부위의 특정 부분으로서 서열번호 11의 염기서열을 가지는 비코딩영역 A(non-coding region A)와 서열번호 12를 가지는 비코딩영역 B를 선택하였다(도 1a의 영역 A와 영역 B 참조). 다음으로 상기 각각의 텔로미어 부위의 순열을 증폭하기 위해 정방향 및 역방향 프라이머를 작성하였다(도 1a 및 표 1의 서열번호 1 내지 8의 프라이머 서열 참조). 또한, 텔로미어 전사 비활성화를 표지하는 마커 유전자로서 영양요구 마커 유전자인 Ura4 유전자를 선택하고, 서열번호 13의 염기서열을 갖는 Ura4 유전자를 증폭시키기 위해 정방향 및 역방향 프라이머를 작성하였다(도 1a 및 표 1의 서열번호 9 내지 10의 프라이머 서열 참조). 이 때 마커 유전자를 도입하기 위한 텔로미어 부위의 특정 부분으로서 상기 비코딩영역 A 및 B 외의 다른 5개 부위에 대해서도 유전자 삽입을 실시하였으나 상기 비코딩영역 A 및 B에서 더 바람직한 결과를 얻었으므로 이를 이용하였다.
| 서열번호 | 증폭 부위 |
| 1 | 텔로미어 가장 끝 부위의 N-말단의 정방향 |
| 2 | 텔로미어 가장 끝 부위의 N-말단의 역방향 |
| 3 | 텔로미어 가장 끝 부위의 C-말단의 정방향 |
| 4 | 텔로미어 가장 끝 부위의 C-말단의 역방향 |
| 5 | 텔로미어 끝 부위에서 15kb 부위의 N-말단의 정방향 |
| 6 | 텔로미어 끝 부위에서 15kb 부위의 N-말단의 역방향 |
| 7 | 텔로미어 끝 부위에서 15kb 부위의 C-말단의 정방향 |
| 8 | 텔로미어 끝 부위에서 15kb 부위의 C-말단의 역방향 |
| 9 | Ura4 유전자의 정방향 |
| 10 | Ura4 유전자의 역방향 |
(2) Ura4 유전자의 분리 및 증폭
다음으로 분열효모 스키조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe)로부터 염색체를 분리하였다. 상기 분리된 염색체 DNA 200 ng을 PCR 반응의 주형으로 사용하고, 상기 표 1에 있는 프라이머를 사용하여 PCR 증폭하였다. PCR 증폭은 94℃에서 5분 동안 열 변성(denaturation)하고, 94℃에서 1분 동안 열 변성 반응, 48 내지 60℃에서 90초 동안 프라이머 결합반응(annealing), 72℃에서 45초 동안 길이연장 반응(extension)을 3회 수행하고, 94℃에서 45초 동안 열변성 반응, 48 내지 60℃에서 45초 동안 프라이머 결합반응, 72℃에서 45초 동안 길이연장 반응을 12회 수행한 뒤, 72℃에서 5분 동안 최종 길이연장 반응을 수행하였다(1차 PCT 반응). 1차 PCR 반응 후 증폭된 산물을 전기영동하였다. 그 결과, 도 2에서 보는 바와 같이 서열번호 13의 Ura4 유전자(레인 1,4), 서열번호 15의 염기서열을 갖는 텔로미어 영역 A-N말단 (레인 2), 서열번호 16의 염기서열을 갖는 텔로미어 영역 A-C말단 (레인 3), 서열번호 17의 염기서열을 갖는 텔로미어 영역 B-N말단 (레인 5), 서열번호 18의 염기서열을 갖는 텔로미어 영역 B-C말단 (레인 6) 증폭산물을 얻을 수 있었다.
(3) Ura4 유전자의 삽입을 위한 DNA 절편의 제작
다음으로, 상기 증폭된 텔로미어 영역 A 및 B의 N 말단과 C 말단 부위 및 Ura4 유전자 산물을 정제하여 각각 100 ng씩 혼합하고, 서열번호 1 및 서열번호 4, 혹은 서열번호 5 및 서열번호 8로 기재되는 프라이머를 사용하여 블락(block) PCR 반응을 수행하였다(2차 PCR 반응). 블락 PCR 반응은 94℃에서 1분 동안 열변성하고, 48℃ 내지 60℃에서 90초 동안 프라이머 결합하며, 72℃에서 3분 동안 길이 연장하는 반응을 20 내지 25회 수행하였다.
2차 PCR 반응 후 증폭된 산물을 전기영동한 결과, 도 2의 레인 7 및 레인 8과 같은 증폭산물을 얻을 수 있었다(도 1b의 도식 참조).
(4) 마커 유전자의 삽입을 통한 형질 전환 및 형질 전환된 균주의 확인
상기 실시예 1에서 증폭한 DNA 산물을 분열효모에 형질 전환시켰다. 우선 분열효모를 배지에서 키운 후 원심분리하여 0.1 M 리튬 클로라이드(lithium chloride) 용액에 현탁시켰다. 이 세포를 다시 원심분리하여 원래의 세포분량의 1/100 정도의 0.1 M 리튬 클로라이드에 현탁시키고 그 중 100 ㎕의 세포에 형질전환 시키고자 하는 상기 실시예 1에서 증폭한 DNA 절편을 각각 1 ㎍ 넣고 30분간 30℃에서 배양하였다. 40% PEG (polyethylene Glycol) 용액 290 ㎕를 넣어 잘 섞어 준 후 다시 30분간 30℃에서 배양하고 42℃에서 15분간 열 충격(heat shock)을 가하였다. 이 세포를 얼음에서 식힌 후 YEPD 배지를 넣어 1시간 동안 배양한 후 우라실 이 들어 있지 않은 MM 고체 배지(Minimal Media) 에 도말하여 수일간 30℃에서 배양하였다. 30℃에서 배양하여 형성된 콜로니의 염색체 구조를 조사하여 Ura4 유전자의 삽입을 확인하였다. 이 형질 전환 균주의 경우 Ura4 유전자가 전사 비활성화 부위에 삽입되므로 Ura4 유전자가 발현이 되질 않아 우라실이 없는 배지에서 콜로니형성을 할 수 없다. 다만 Ura4 유전자가 염색체 상에 존재하지 않거나 일정부위가 제거되어 유전자의 기능을 하지 못하는 균주에 비하여 우라실이 없는 배지에서의 생존이 오래 지속이 된다. 이러한 성질을 이용하여 Ura4가 삽입되지 않은 균주를 우라실이 없는 배지에서 모두 죽인 후 콜로니는 형성하지 않았으나 생존하고 있을 Ura4 유전자가 삽입되었을 균주를 우라실이 있는 배지에 레플리카(replica)를 하여 자라는 균주의 염색체상의 Ura4 유전자 삽입을 조사하였다. 이를 통해 텔로미어의 비코딩영역 A와 비코딩영역 B 부위에 Ura4 유전자가 삽입된 분열효모 형질전환체를 각각 'KSTU201/h- Tel2A::Ura4', 'KSTU202/h- Tel2B::Ura4' 라 명명하였다. 이 중에서 텔로미어 전사 비활성화가 좀 더 강력한 부위인 'KSTU202/h- Tel2B::Ura4' 를 2006년 7월 28일자로 한국생명공학연구소 유전자은행에 기탁하였다(수탁번호:KCTC10971BP)(도 3a 및 도 3b 참조).
<실시예 2>
형질전환체 'KSTU201/Tel2A::Ura4', 'KSTU202/Tel2B::Ura4' 균주에 텔로미어 전사 비활성화를 저해할 수 있는 돌연변이 clr4-W31G가 도입된 균주의 제조
형질전환체 'KSTU201/h-/Tel2A::Ura4', 'KSTU202/h-/Tel2B::Ura4' 균주와 'h+/clr4-W31G' 균주 (Nat Genet. 1998 Jun;19(2):192-5. The chromo and SET domains of the Clr4 protein are essential for silencing in fission yeast.
Ivanova AV, Bonaduce MJ, Ivanov SV, Klar AJ. )와 각각 잘 섞어 2 내지 3일간 30℃에서 배양함으로서 교배(mating)시켰다. 상기 교배된 세포를 SCE 완충액(1.2 M 솔비톨/ 50 mM 시트레이트 포스페이트/ 10 mM EDTA)에 현탁시켜 용해효소(lysing enzyme) 20 Unit과 라이티카제(lyticase) 20 ㎍을 섞어 30℃에서 2일간 보관함으로서 포자를 제외한 다른 세포들을 제거하였다. 이들 남은 포자를 잘 분리시켜 1대 4의 비율로 희석하여 우라실이 없는 배지에 깔아 형성된 콜로니의 포자 형성여부를 관찰하고 염색체의 구조를 확인하여 균주 'KSTU203/Tel2A::Ura4, clr4-W31G', 'KSTU204 /Tel2B::Ura4, clr4-W31G' 를 완성하였다. 이 배지에서는 전사 비활성화 부위에 삽입된 Ura4 유전자가 발현되지 않은 균주는 살 수가 없으므로 대부분의 -Ura 배지에서 자란 콜로니는 clr4-W31G 돌연변이를 가지게 된다. 완성된 균주는 도 4와 같이 5-FOA가 들어간 배지(C+FOA 배지)에서 자라지 않음을 확인하였다. 또한 -Ura 배지에서의 성장과 clr4-W31G 돌연변이의 상관관계를 알아보기 위하여 상기 두 균주의 단성포자형성을 조사하였다. 먼저 KSTU201균주에 clr4-W31G 돌연변이를 주입함에 있어서 KSTU201균주와 clr4-W31G 돌연변이만을 가진 균주를 교잡하여 단성포자를 만든 후 우라실이 없는 배지에 도말하였다. 이 경우 콜로니를 형성하기 위해서는 Ura4 유전자가 반드시 균주에 삽입되어 있어야 하며 또한 발현이 일어나야 함을 전제로 한다. 도 5a에서는 텔로미어 전사 비활성화에 대한 저해를 보이는 콜로니와 그렇지 않은 콜로니가 다 같이 형성됨을 알 수 있다. 이는 KSTU201균주의 Ura4 유전자에 대한 전사 비활성화가 완전하지 않음과 KSTU201 균주에 clr4-W31G 돌연변이의 유도가 텔로미어 전사 비활성화에 대한 저해를 일으켰음을 알 수 있다. 도 5b의 경우는 KSTU202에 clr4-W31G 돌연변이를 유도한 것으로 우라실이 없는 배지에서 clr4-W31G 돌연변이에 의한 텔로미어 전사 비활성화에 대한 저해가 나타나는 균주만이 콜로니를 형성함을 알 수 있었고 이는 KSTU202균주의 경우 Ura4 유전자에 대한 완벽한 전사 비활성화를 보임을 의미한다. 상기 실험의 결과, KSTU203 균주는 65%의 유의성을 보였고 KSTU204균주는 100%의 유의성을 보였다 (도 5). 따라서, 유의성이 좋은 'KSTU204 /Tel2B::Ura4, clr4-W31G' 균주를 2006년 7월 28일자로 한국생명공학연구소 유전자은행에 기탁하고 (수탁번호:KCTC10972BP), 다음 실험을 위해 이를 이용하였다.
<실시예 3>
형질전환체 KSTU201, 202, 203, 204 균주의 유전자형 재확인 및 이를 이용한 시험 화합물의 1차 스크리닝
도 6에서 볼 수 있는 바와 같이, 상기 완성된 균주 4개와 그들의 대조군 균주 972(Ura4+), 2030(Ura4-) (from Gerald R. Smith, Fred Hutchinson Cancer Research Center) 두 개에 대하여 라이신, 류신, 아데닌, 히스티딘, 아르기닌 영양요구 마커 및 C-Ura 배지에서의 성장을 조사하여 유전자형을 확정지었다.
또한 이들 균주의 C-Ura, C+FOA 배지에서의 성장에 의한 세포병의 크기를 조사하고 약물을 처리하였을 때 24~32시간 배양 후 그들 두 배지 간의 세포병의 차이가 확연히 드러남을 알 수 있었고 둥근 바닥 96웰 플레이트의 사용이 O.D 리더기를 이용한 세포 현탁도를 이용하는 것 보다 약물 스크리닝을 좀 더 쉽고 빠르게 대량으로 진행하는데 도움이 됨을 알 수 있었다.
위에서 검정한 실험 방법과 체계도에 따라 대량의 약물을 이용한 실험을 수행하였다 (도 7). 도 7은 KSTU202 균주를 이용한 실험인데 좀 더 많은 양의 약물을 스크리닝하기 위해 1차 스크리닝에는 C배지와 C+FOA 배지만을 이용하였다. 그 결과 세포에 독성을 주는 약물 (노란 동그라미)과 텔로미어 전사 비활성화에 영향을 주는 약물 (빨간 동그라미), 전혀 관계가 없는 약물 (나머지)으로 구분할 수 있었다.
기 실험을 KSTU204 균주를 이용하여서도 실행하였고 상기와 같이 유의성이 있는 결과를 얻었다.
<실시예 4>
1차 스크리닝을 통해 선별된 텔로미어 전사 비활성화 관여 후보 약물의 다양한 농도에서의 재검정
선별된 텔로미어 전사 비활성화 관여 후보 약물을 적절한 농도로 순차적으로 희석하여 이들의 작용 농도도 측정하고 C, C-Ura 배지와 C+FOA를 모두 사용하여 선별된 약물의 작용 유의성을 더욱 확실히 하였다.
도 8a 에서는 C+FOA 배지에서 자라야 하는 KSTU202(Tel2B::Ura4) 균주가 약물 #105를 처리함에 의해서 자라지 않음을 볼 수 있고 반대로 C-Ura 배지에서는 잘 자람을 볼 수 있다. 이는 약물 #105가 텔로미어 전사 비활성화를 저해하여 그곳에 삽입된 Ura4 유전자가 발현하게 되었음을 의미한다.
도 8b의 경우 KSTU204(Tel2B::Ura4, clr4-W31G)를 사용하였음으로 C+FOA 배지에서는 자라지 않고 C-Ura4 배지에서 자라야 하나 약물 #203을 처리함으로 인해 이와는 반대로 C+FOA 배지에서는 자라고 C-Ura 배지에서 자라지 않는 성질을 보였다. 이는 약물 #203이 clr4 돌연변이에 작용하여 텔로미어 전사 비활성화가 정상적으로 돌아오게 했음을 의미한다.
따라서, 본 발명에 따른 텔로미어 전사 비활성화에 관여하는 새로운 약물을 스크리닝하는 신규한 96 웰 약물 스크리닝 시스템은 빠르고도 손쉽게 HTS를 이용하여 대량의 시험 화합물들을 스크리닝 할 수 있는 좋은 방법임을 알 수 있다.
본 발명에 따른 형질전환 효모균주 및 이를 이용한 스크리닝 방법은 전사 비활성화 관여 물질, 특히 노화와 암 관련 물질을 발굴할 수 있는 쉽고 빠른 효율적인 HTS 시스템을 제공한다.
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Claims (50)
- 텔로미어 부위에 텔로미어 전사 비활성화(transcriptional silencing)를 표지하는 마커 유전자가 도입된 텔로미어 형질전환 효모 균주로서,상기 마커 유전자는 Ura4, Leu2, His3 및 Trp1 유전자로 구성되는 군으로부터 선택되는 영양요구 마커(auxotrophic marker) 또는 NAT(Nourseothricin acethy transferase), 제네티신(Geneticin) 및 하이그로마이신 B(Hygromycin B)로부터 선택되는 항생제에 저항성을 나타내는 항생 마커(dominant drug resistance marker) 유전자이고, 상기 텔로미어 형질전환 효모 균주는 텔로미어 형질전환 스키조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe)인 균주.
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- 제1항에 있어서, 상기 영양요구 마커 유전자가 Ura4 유전자인 균주.
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- 제1항에 있어서, 상기 영양요구 마커 유전자가 서열번호 13의 염기서열을 갖는 Ura4 유전자인 균주.
- 제8항에 있어서, 마커 유전자가 도입되는 텔로미어 부위가 서열번호 11의 염기서열을 갖는 텔로미어의 비-코딩 영역인 균주.
- 제8항에 있어서, 마커 유전자가 도입되는 텔로미어 부위가 서열번호 12의 염기서열을 갖는 텔로미어의 비-코딩 영역인 균주.
- 제10항에 있어서, 상기 균주는 KSTU202(h-/tel2B::Ura4)인 형질전환 스키조사카로마이세스 폼베(수탁번호; KCTC10971BP)인 균주.
- 1) 마커 유전자가 도입되는 텔로미어 부위의 양쪽 염색체 부분에 해당하는 N 말단 절편과 C 말단 절편을 증폭시키고, 텔로미어 전사 비활성화(transcriptional silencing)를 표지하기 위한 마커 유전자를 증폭시키는 단계;2) 단계 1에서 증폭시킨 N 말단 절편, 마커 유전자 및 C 말단 절편이 순서대로 연결된 DNA 절편을 제조하는 단계;3) 단계 2에서 제조한 DNA 절편을 효모 균주에 형질도입하는 단계; 및4) 단계 3을 통해 형질전환된 효모균주를 선별하는 단계를 포함하는 텔로미어 형질전환 효모 균주를 제조하는 방법으로서,상기 마커 유전자는 Ura4, Leu2, His3 및 Trp1 유전자로 구성되는 군으로부터 선택되는 영양요구 마커(auxotrophic marker) 또는 NAT(Nourseothricin acethy transferase), 제네티신(Geneticin) 및 하이그로마이신 B(Hygromycin B)로부터 선택되는 항생제에 저항성을 나타내는 항생 마커(dominant drug resistance marker) 유전자이고, 상기 텔로미어 형질전환 효모 균주는 텔로미어 형질전환 스키조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe)인 방법.
- 텔로미어 부위에 텔로미어 전사 비활성화(transcriptional silencing)를 표지하는 마커 유전자가 도입된 텔로미어 형질전환 효모 균주를 제공하고,상기 균주를 시험 화합물이 함유된 완전 배지(complete medium) 및 선발 배지(selection medium)에서 배양하고,선발 배지에서 배양된 균주의 마커 유전자의 발현 여부를 탐색하여 완전 배지에서 배양된 균주와 비교하는 것을 포함하는유기화합물군(chemical library) 중 텔로미어 전사 비활성화에 관여하는 화합물을 스크리닝하는 방법으로서,상기 마커 유전자는 Ura4, Leu2, His3 및 Trp1 유전자로 구성되는 군으로부터 선택되는 영양요구 마커(auxotrophic marker) 또는 NAT(Nourseothricin acethy transferase), 제네티신(Geneticin) 및 하이그로마이신 B(Hygromycin B)로부터 선택되는 항생제에 저항성을 나타내는 항생 마커(dominant drug resistance marker) 유전자이고, 상기 텔로미어 형질전환 효모 균주는 텔로미어 형질전환 스키조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe)인 방법.
- 제13항에 있어서, 상기 텔로미어 전사 비활성화에 관여하는 화합물이 마커 유전자의 전사 비활성화를 교란시키는 발암 물질 또는 노화 촉진 물질인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제13항 또는 제14항에 있어서, 마커 유전자는 Ura4 유전자이고, 선발 배지는 C-Ura 배지인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제15항에 있어서, 선발 배지로서 C+FOA 배지를 추가로 사용하는 것을 특징으 로 하는 방법.
- 제16항에 있어서, 형질전환 효모균주가 C-Ura 배지에서 생존하고 C+FOA 배지에서 사멸하는 경우 시험화합물을 발암 물질 또는 노화 촉진 물질로 판단하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 텔로미어 부위에 텔로미어 전사 비활성화(transcriptional silencing)를 표지하는 마커 유전자가 도입된 텔로미어 형질전환 효모 균주, 완전 배지 및 선발 배지를 함유하는 용기 및 텔로미어 전사 비활성화 관여 화합물 스크리닝 방법에 대한 설명서를 포함하는 키트로서,상기 마커 유전자는 Ura4, Leu2, His3 및 Trp1 유전자로 구성되는 군으로부터 선택되는 영양요구 마커(auxotrophic marker) 또는 NAT(Nourseothricin acethy transferase), 제네티신(Geneticin) 및 하이그로마이신 B(Hygromycin B)로부터 선택되는 항생제에 저항성을 나타내는 항생 마커(dominant drug resistance marker) 유전자이고, 상기 텔로미어 형질전환 효모 균주는 텔로미어 형질전환 스키조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe)인 키트.
- 제18항에 있어서, 상기 용기가 멀티-웰 플레이트(multi-well plate)인 키트.
- 제19항에 있어서, 상기 멀티-웰 플레이트가 둥근 바닥 멀티-웰 플레이트(round-bottom multi-well plate)인 키트.
- 제18항에 있어서, 상기 용기가 마이크로타이터 플레이트(microtitre plate)인 키트.
- 제18항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 마커 유전자는 Ura4 유전 자이고, 선발 배지는 C-Ura 배지인 것을 특징으로 하는 키트.
- 제22항에 있어서, 선발 배지로서 C+FOA 배지를 추가로 포함하는 키트.
- 제23항에 있어서, 형질전환 효모균주로서 KSTU202(h-/tel2B::Ura4)인 형질전환 스키조사카로마이세스 폼베 균주(수탁번호; KCTC10971BP)를 포함하는 키트.
- 텔로미어 부위에 텔로미어 전사 비활성화(transcriptional silencing)를 표지하는 마커 유전자가 도입된 텔로미어 형질전환 효모 균주의 염색체에 추가로 텔로미어 전사 비활성화의 교란을 통해 마커 유전자를 발현시키는 돌연변이 유전자가 도입된 효모 균주로서,상기 마커 유전자는 Ura4, Leu2, His3 및 Trp1 유전자로 구성되는 군으로부터 선택되는 영양요구 마커(auxotrophic marker) 또는 NAT(Nourseothricin acethy transferase), 제네티신(Geneticin) 및 하이그로마이신 B(Hygromycin B)로부터 선택되는 항생제에 저항성을 나타내는 항생 마커(dominant drug resistance marker) 유전자이고, 상기 돌연변이 유전자는 clr4 유전자이며, 상기 텔로미어 형질전환 효모 균주는 텔로미어 형질전환 스키조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe)인 균주.
- 삭제
- 삭제
- 제25항에 있어서, 상기 영양요구 마커 유전자가 Ura4 유전자인 균주.
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 제25항에 있어서, 상기 영양요구 마커 유전자가 서열번호 13의 염기서열을 갖는 Ura4 유전자인 균주.
- 제32항에 있어서, 마커 유전자가 도입되는 텔로미어 부위가 서열번호 11의 염기서열을 갖는 텔로미어의 비-코딩 영역인 균주.
- 제32항에 있어서, 마커 유전자가 도입되는 텔로미어 부위가 서열번호 12의 염기서열을 갖는 텔로미어의 비-코딩 영역인 균주.
- 삭제
- 제32항에 있어서, 상기 돌연변이 clr4 유전자가 서열번호 14의 서열을 갖는 것인 균주.
- 제36항에 있어서, 상기 균주는 KSTU204(h-/tel2B::Ura4, clr4-W38G)인 형질전환 스키조사카로마이세스 폼베(수탁번호: KCTC10972BP)인 균주.
- 1) 마커 유전자가 도입되는 텔로미어 부위의 양쪽 염색체 부분에 해당하는 N 말단 절편과 C 말단 절편을 증폭시키고, 텔로미어 전사 비활성화(transcriptional silencing)를 표지하기 위한 마커 유전자를 증폭시키는 단계;2) 단계 1에서 증폭시킨 N 말단 절편, 마커 유전자 및 C 말단 절편이 순서대로 연결된 DNA 절편을 제조하는 단계;3) 단계 2에서 제조한 DNA 절편을 효모 균주에 형질도입하는 단계;4) 단계 3을 통해 형질전환된 효모균주를 선별하는 단계;5) 단계 4에서 제조된 형질전환 균주에 텔로미어 전사 비활성화의 교란을 통해 텔로미어 중에 도입된 마커 유전자를 발현시키는 돌연변이 유전자를 도입하는 단계; 및6) 단계 5)를 통해 돌연변이 유전자가 도입된 형질전환 균주를 선별하는 단계를 포함하는 텔로미어 형질전환 효모 균주를 제조하는 방법으로서,상기 마커 유전자는 Ura4, Leu2, His3 및 Trp1 유전자로 구성되는 군으로부터 선택되는 영양요구 마커(auxotrophic marker) 또는 NAT(Nourseothricin acethy transferase), 제네티신(Geneticin) 및 하이그로마이신 B(Hygromycin B)로부터 선택되는 항생제에 저항성을 나타내는 항생 마커(dominant drug resistance marker) 유전자이고, 상기 돌연변이 유전자는 clr4 유전자이며, 상기 텔로미어 형질전환 효모 균주는 텔로미어 형질전환 스키조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe)인 방법.
- 텔로미어 부위에 텔로미어 전사 비활성화(transcriptional silencing)를 표지하는 마커 유전자가 도입된 텔로미어 형질전환 효모 균주의 염색체에 추가로 텔로미어 전사 비활성화의 교란을 통해 마커 유전자를 발현시키는 돌연변이 유전자가 도입된 효모 균주를 제공하고,상기 균주를 시험 화합물이 함유된 완전 배지(complete medium) 및 선발 배지(selection medium)에서 배양하고,선발 배지에서 배양된 균주의 마커 유전자의 발현 여부를 탐색하여 완전 배지에서 배양된 균주와 비교하는 것을 포함하는유기화합물군(chemical library) 중 텔로미어 전사 비활성화에 관여하는 화합물을 스크리닝하는 방법으로서,상기 마커 유전자는 Ura4, Leu2, His3 및 Trp1 유전자로 구성되는 군으로부터 선택되는 영양요구 마커(auxotrophic marker) 또는 NAT(Nourseothricin acethy transferase), 제네티신(Geneticin) 및 하이그로마이신 B(Hygromycin B)로부터 선택되는 항생제에 저항성을 나타내는 항생 마커(dominant drug resistance marker) 유전자이고, 상기 돌연변이 유전자는 clr4 유전자이며, 상기 텔로미어 형질전환 효모 균주는 텔로미어 형질전환 스키조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe)인 방법.
- 제39항에 있어서, 상기 텔로미어 전사 비활성화에 관여하는 화합물이 마커 유전자의 전사 비활성화 교란을 정상화시키는 항암제 또는 항노화제인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제39항 또는 제40항에 있어서, 마커 유전자는 Ura4 유전자이고, 선발 배지는 C-Ura 배지인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제41항에 있어서, 선발 배지로서 C+FOA 배지를 추가로 사용하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제42항에 있어서, 형질전환 효모균주가 C-Ura 배지에서 사멸하고 C+FOA 배지에서 생존하는 경우 시험화합물을 항암제 또는 항노화제로 판단하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 텔로미어 부위에 텔로미어 전사 비활성화를 표지하는 마커 유전자가 도입된 텔로미어 형질전환 효모 균주의 염색체에 추가로 텔로미어 전사 비활성화의 교란을 통해 마커 유전자를 발현시키는 돌연변이 유전자가 도입된 효모 균주, 완전 배지 및 선발 배지를 함유하는 용기 및 텔로미어 전사 비활성화 관여 화합물의 스크리닝 방법에 대한 설명서를 포함하는 키트로서,상기 마커 유전자는 Ura4, Leu2, His3 및 Trp1 유전자로 구성되는 군으로부터 선택되는 영양요구 마커(auxotrophic marker) 또는 NAT(Nourseothricin acethy transferase), 제네티신(Geneticin) 및 하이그로마이신 B(Hygromycin B)로부터 선택되는 항생제에 저항성을 나타내는 항생 마커(dominant drug resistance marker) 유전자이고, 상기 돌연변이 유전자는 clr4 유전자이며, 상기 텔로미어 형질전환 효모 균주는 텔로미어 형질전환 스키조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe)인 키트.
- 제44항에 있어서, 상기 용기가 멀티-웰 플레이트(multi-well plate)인 키트.
- 제45항에 있어서, 상기 멀티-웰 플레이트가 둥근 바닥 멀티-웰 플레이트(round-bottom multi-well plate)인 키트.
- 제44항에 있어서, 상기 용기가 마이크로타이터 플레이트(microtitre plate)인 키트.
- 제44항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 마커 유전자는 Ura4 유전 자이고, 선발 배지는 C-Ura 배지인 것을 특징으로 하는 키트.
- 제48항에 있어서, 선발 배지로서 C+FOA 배지를 추가로 포함하는 키트.
- 제49항에 있어서, 형질전환 효모균주로서 KSTU204(h-/tel2B::Ura4, clr4-W38G)인 형질전환 스키조사카로마이세스 폼베 균주(수탁번호: KCTC10972BP)를 포함하는 키트.
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-
2006
- 2006-08-09 KR KR1020060075024A patent/KR100783287B1/ko not_active IP Right Cessation
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Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
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