CN112813091A

CN112813091A - Nat1基因作为筛选标记在卵菌遗传转化中的应用

Info

Publication number: CN112813091A
Application number: CN202110147090.7A
Authority: CN
Inventors: 王群青; 谭新伟; 邹珅珅
Original assignee: Shandong Agricultural University
Current assignee: Shandong Agricultural University
Priority date: 2021-02-03
Filing date: 2021-02-03
Publication date: 2021-05-18
Also published as: WO2022166433A1

Abstract

本发明公开了Nat1基因作为筛选标记在卵菌遗传转化中的应用。本发明发现了一种可作为卵菌转化筛选标记的抗生素—诺尔丝菌素。本发明通过将可引起卵菌对诺尔丝菌素抗性的编码基因Nat1作为筛选标记，用于大豆疫霉转化时转化子的筛选。该筛选标记的开发解决了卵菌转化时筛选标记单一的问题，为卵菌转化时基因回补、基因多敲除等方面的工作提供了有力保障。

Description

Nat1基因作为筛选标记在卵菌遗传转化中的应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及Nat1基因作为筛选标记在卵菌遗传转化中的应用。

背景技术

卵菌(Oomycetes)是一种真核生物，目前,已发现至少1800种卵菌，大部分卵菌是植物、动物以及其他生物的病原菌，给人类造成了巨大的经济损失。植物病原卵菌主要包括霜霉(Downy mildews)、疫霉(Phytophthora)、腐霉(Pythium)和白锈病(Albugo)。与真菌相比，卵菌具有一些独特的生理生化特征，例如：菌丝没有或有很少的隔膜，营养体为二倍体，细胞壁的主要成分是纤维素等。

疫霉菌(Phytophthora)是指隶属于卵菌门(Oomycota)下的一类微生物，多数是植物病原菌。疫霉菌引起的病害给许多农作物和植物造成毁灭性危害，称为“植物疫病”。目前卵菌病害对农业生产的严重危害逐渐引起全世界的关注。不断释放的卵菌基因组序列信息，极大促进了卵菌的遗传研究，促使研究者开发新的遗传学操作工具，在病原卵菌中敲除和回补目的基因并鉴定其功能。

目前卵菌中可利用的筛选标记非常有限，唯一可靠的筛选标记是NPT II基因，其通过卵菌通用强启动子ham34启动编码的蛋白可使得卵菌对遗传霉素(G418)的抗性，从而使转化子被筛选出来。但是NPT II用于敲除体系时，因携带该标记的转化子具有G418抗性而不能被再次利用进行回补实验，导致对敲除转化子进行基因回补实验存在着没有新的筛选标记可用的问题。因此，开发新型卵菌转化筛选标记，对于卵菌基因功能的研究具有重要意义。

发明内容

针对上述现有技术，本发明的目的是提供Nat1基因作为筛选标记在卵菌遗传转化中的应用，解决了现有卵菌基因回补实验中没有新的筛选标记可用的问题；而且，本发明的筛选标记对卵菌转化子具有较高的筛选效率。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

Nat1基因作为筛选标记在卵菌遗传转化中的应用；所述Nat1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

优选的，所述卵菌遗传转化具体为：以其他筛选标记获得的敲除转化子的卵菌基因回补突变体的筛选。

优选的，所述卵菌为大豆疫霉菌。

上述应用中，利用Nat1基因筛选卵菌基因回补突变体的方法，包括以下步骤：

(1)构建包含Nat1基因和目的基因的回补载体；

(2)利用PEG介导的原生质体转化系统将步骤(1)构建的回补载体转化到目的基因被敲除的卵菌原生质体，得到转化子；

(3)将转化子置于含有诺尔丝菌素(Nourseothricin，NTC)的培养基中进行培养，筛选能够正常生长的转化子作为回补转化子。

优选的，步骤(1)中，所述回补载体的构建方法为：将pTOR载体线性化，利用同源重组酶将Nat1基因连接于pTOR载体；将连接Nat1基因的pTOR载体使用ClaI、EcoRI内切酶将载体线性化，利用T4连接酶将目的基因连接于pTOR载体。

优选的，步骤(3)中，所述筛选具体为：

将转化子置于含有30μg/ml诺尔丝菌素的PM培养基，25℃黑暗培养3-4d；

观察培养基表面菌丝生长状况，在有菌丝长出的PM培养基上用含50μg/ml诺尔丝菌素的V8培养基覆盖，于25℃黑暗中培养3-4天；

观察培养基表面菌丝生长状况，将再生的菌株转接到含50μg/ml诺尔丝菌素的V8培养基上。

优选的，所述卵菌为大豆疫霉菌。

本发明的有益效果：

本发明利用PEG介导的原生质体转化技术将构建质粒转化，通过使用诺尔丝菌素进行筛选，可有效筛选到基因回补菌株，弥补了卵菌遗传转化中缺少筛选性标记基因的问题，并且筛选效率可已达到50％以上，可极大的减少工作量。

筛选效率的计算方式为：通过含有诺尔丝菌素的培养基筛选后的转化子为“候选转化子”，对“候选转化子”进一步提取DNA、RNA等方式验证确定“转化成功转化子”，筛选效率是“转化成功转化子”占“候选转化子”的比率。

附图说明：

图1：Avh109回补转化子在诺尔丝菌素培养基上的生长情况。

图2：提取转化子的DNA，检测抗性基因Nat1；图中，M：Marker，WT：野生型菌株，1、2表示转化子。

图3：提取转化子的RNA，检测回补基因表达情况。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

正如背景技术部分所介绍的，目前卵菌中可利用的筛选标记非常有限，导致对敲除转化子进行基因回补实验存在着没有新的筛选标记可用的问题。

对于新型卵菌转化筛选标记的开发，现有技术中有少量报道，例如：专利CN108373497A公开了一种氟噻唑吡乙酮抗性基因及其作为卵菌转化筛选标记的应用，其将可引起卵菌对氟噻唑吡乙酮产生500倍以上抗性的突变蛋白的编码基因作为筛选标记，用于大豆疫霉菌转化时转化子的筛选；专利CN108060173A公开了羧酸酰胺类杀菌剂抗性基因作为卵菌转化筛选标记的应用，其将可引起卵菌对羧酸酰胺类杀菌剂产生100倍以上抗性的突变蛋白的编码基因作为筛选标记，用于辣椒疫霉菌转化时的转化子筛选。

虽然羧酸酰胺类化合物与氟噻唑吡乙酮都是防治卵菌病害的农药，但是，农业生产中大量使用该两种农药会造成菌株产生抗药性。因此，上述两种新的卵菌转化筛选标记在实际应该过程中可能会存在抗药性的问题。

疫霉菌在分类上与真菌相去甚远，疫霉菌属于卵菌门、卵菌纲，其细胞壁主要成分为β-葡聚糖和纤维素，菌丝是无隔多核的菌丝体，且细胞核为二倍体，而真菌属于真菌门，细胞壁成分主要为几丁质，细胞核为单倍体。因此，大多数可用于真菌菌株筛选的抗生素都不能够应用于卵菌。

诺尔丝菌素是一种抑制蛋白质合成的抗生素，能广泛地有效地抑制许多原核生物生长，并也被用于抑制真核生物的生长。但目前还未应用于农业生产。本发明意外的发现，将Nat1基因作为筛选标记，利用诺尔丝菌素能够进行卵菌菌株的筛选，由此提出了本发明。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。

本发明实施例中所用的试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。其中：

酶解缓冲液：Lsing enzyme 0.15g、Celluse 0.06g、0.8M mannitol 10ml、ddH₂O8ml、0.5M KCl 800μl、0.5M MES 800μl、0.5M CaCl₂ 400μl。

40％PEG溶液(现用现配)：PEG400 6g、0.8M mannitol 3.75ml、0.5M CaCl₂ 3ml、H₂O 3ml。

W5 solution：KCl 0.186g、CaCl₂-2H₂O 9.2g、NaCl 4.5g、glucose 15.6g，ddH₂O定容至500ml。

0.8M mannitol：mannitol 145.76g，ddH₂O定容至1L。

0.5M CaCl₂-2H₂O：CaCl₂-2H₂O 14.7g，ddH₂O定容至200ml。

0.5M KCl：KCl 7.5g，ddH₂O定容至200ml。

MMg solution：Mannitol 18.22g、MgCl₂-6H₂O 0.76g、0.5M MES 2ml，ddH₂O定容至250ml。

营养豌豆培养基(NPB)：取60g豌豆放入锥形瓶中，加入适量去离子水，121℃，15min灭菌，取滤液，依次加入以下试剂：KH₂PO₄ 0.5g，K₂HPO₄·2H₂O 0.65g，KNO₃ 1.5g，MgSO₄ 0.25g，CaCl₂ 0.04g，CaCO₃ 1.0g，D-sorbitol 2.5g，D-glucose 2.5g，YeastExtract 1g，充分溶解，4000g离心10min，定容到500ml，121℃，15min灭菌。

PM培养基：取60g豌豆放入锥形瓶中，加入适量去离子水，121℃，15min灭菌，取滤液，加入45.5g Mannitol，充分溶解，4000g离心10min，定容到500ml，加入加1.0％的琼脂，混合均匀，121℃，15min灭菌。

V8培养基：向V8蔬菜汁(购买)中加入0.2％的CaCO₃粉末，充分溶解，5000rpm离心20min，取上清液，加上清液9倍体积去离子水稀释，加入1.5-2.0％的琼脂，混合均匀，121℃，15min灭菌。

实施例1：大豆疫霉菌Avh109基因的回补及筛选

1、克隆Nat1基因与目的基因(Avh109基因)片段：

利用下述引物Nat1-F和Nat1-R克隆Nat1基因片段，克隆得到的Nat1基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

Nat1-F：5’-ACACAAGGGCCCCGTTTCGCATGGGTACCACTCTTGACG-3’；(SEQ ID NO.2)

Nat1-R：5’-TTCGAACCCCAGAGTCCCGCTTAGGGGCAGGGCATGCT-3’；(SEQ ID NO.3)

从NCBI数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中搜索PsAvh109基因，下载其CDS以及基因组序列，设计引物G Avh109-F和G Avh109-R，克隆得到Avh109基因片段，其序列如SEQ ID NO.4所示。

G Avh109-F：5’-CCatcgatATGCGTCTCCAGTATGCCG-3’；(SEQ ID NO.5)

G Avh109-R：5’-GgaattcATCAGCGGTTTGTCGCC-3’；(SEQ ID NO.6)

2、将目的基因(Avh109基因)与Nat1基因构建于回补载体pTOR：

用线性化载体引物(pTOR-F和pTOR-R)将pTOR载体线性化，利用同源重组酶将Nat1基因连接于pTOR载体，测序检测载体构建状况。将连接Nat1基因后的pTOR载体使用ClaI、EcoRI内切酶将载体线性化，利用T4连接酶将Avh109基因连接于pTOR载体，测序检测载体构建状况。

PTOR-F：5’-GCGGGACTCTGGGGTTCG-3’；(SEQ ID NO.7)

PTOR-R：5’-GCGAAACGGGGCCCTTGT-3’；(SEQ ID NO.8)

3、用PEG介导的原生质体转化系统将回补载体转化到疫霉菌原生质体，得转化子

(1)实验材料准备：

在营养豌豆培养基(NPB)平板上活化大豆疫霉菌P6497，在25℃下黑暗培养(活化菌丝在一周内使用)。

培养3-4天后，将其切成3*3mm的菌丝块，向每个装有50ml营养豌豆培养基的250ml三角瓶中放入6个菌丝块，共培养3瓶，在25℃黑暗静置培养2.5d-3d。培养期间每天摇晃一次。

(2)原生质体制备：

①超净工作台紫外灭菌30min，用灭菌的50ml烧杯称量裂解酶和40％PEG(称量操作严格规范、减少污染)。

②用事先包扎有纱布的200ml烧杯(灭菌后)来收集菌丝(3瓶)，将菌丝放入50ml离心管中，用镊子将菌丝放入含有40ml 0.8M Mannitol的50ml离心管漂洗一次，再用包扎有纱布的200ml烧杯收集菌丝，用镊子将菌丝移入35ml 0.8M Mannitol缓冲液的50ml离心管中，室温下混匀60rpm摇洗10min(准备封口膜)。

③配制酶解缓冲液，在灭菌的50ml烧杯中加入指定体积的各组分，用枪头搅拌充分溶解，用细菌过滤器将酶解缓冲液过滤于50ml离心管中。

④菌丝在0.8M Mannitol中漂洗，收集菌丝置于酶解缓冲液中(加入菌丝不可过多)，25℃60rpm进行酶解反应，此过程1-1.5h。

⑤配置40％PEG溶液，加入指定体积的各组分，充分溶解后用细菌过滤器过滤后冰上备用。

⑥启动低温离心机，500rpm离心3min预冷4℃。

⑦酶解结束后，用2层mira-cloth(进口的过滤布)过滤菌丝收集原生质体，显微镜观察原生质体裂解情况，将收集好的原生质体转移到50ml离心管中，4℃1500rpm离心3min。(之后的操作原生质体要始终保持低温)

⑧弃上清，加入10ml左右的W5 solution轻轻重悬原生质体，加W5 solution至35ml，4℃、1500rpm离心4min，镜检原生质体质量。

⑨弃上清，加10ml左右W5 solution轻轻重悬原生质体，使用血球计数板计算原生质体浓度，然后于冰上放置30min，4℃1500rpm离心4min。

⑩弃上清，加入预冷的MMg solution重悬原生质体，调整原生质体浓度为2×10⁶/ml，室温放置10min。

(3)原生质体转化：

①取50ml离心管置于冰上，加入30μg转化质粒。

②向离心管中加入1ml原生质体，轻轻混匀，冰上放置5-10min。

③向离心管中分3次加入1.74ml PEG溶液，轻轻混匀，冰上放置20min。

④向预冷的PM培养基中加入氨苄抗生素备用。

⑤向离心管中加入2ml步骤④中的加入氨苄抗生素后的PM培养基，轻轻混匀，冰上放置2min。

⑥向离心管中加入8ml步骤④中的加入氨苄抗生素后的PM培养基，轻轻混匀，冰上放置2min。

⑦25℃静置培养12-14h(要斜放，增大与氧气的接触面积)。

(4)对疫霉菌基因回补突变体进行筛选：

(1)取培养物5μl于显微镜下观察原生质体再生情况，2000rpm离心5min，沉淀再生菌丝。

(2)弃上清，向离心管中加入5ml PM培养基，将再生菌丝重新悬浮，加入35ml含有30μg/ml诺尔丝菌素的PM培养基，混匀后倒入培养皿中，吹干水汽，25℃黑暗培养3-4d。

(3)观察培养基表面菌丝生长状况，用10ml含50μg/ml诺尔丝菌素的V8培养基覆盖并吹干水汽，于25℃黑暗中培养3-4天。

(4)观察培养基表面菌丝生长状况，将再生的菌株转接到含50μg/ml诺尔丝菌素的V8培养基上，培养获得的再生菌丝初步认为是转化子，用于后续鉴定。

5、突变体的验证：

(1)用含有诺尔丝菌素的培养基验证转化子：

把筛选到的转化子转接到含有50μg/mL诺尔丝菌素的V8培养基上再次观察是否能够生长。结果显示筛选得到的转化子能够在含有50μg/mL诺尔丝菌素的V8培养基上，而对照菌株不能够生长(图1)。

(2)提取转化子的DNA用于PCR验证：

使用CTAB法提取野生型菌株及回补转化子菌株基因组，PCR扩增Nat1基因，结果显示，野生型菌株中不含有Nat1基因，而筛选的到的回补转化子基因组中含有Nat1基因(图2，PsACT是大豆疫霉菌中的保守基因，目的是证明基因组提取没有问题)。

(3)提取转化子的RNA，检测基因表达情况：

使用RNA提取试剂盒提取敲除菌株、野生菌株及回补转化子菌株RNA，去除DNA后反转录得到cDNA，以反转录得到的cDNA为模板，PCR验证基因Avh109表达情况。结果显示，敲除转化子中没有Avh109基因表达，而筛选的到的回补转化子中有Avh109基因表达(图3中的泳道1、2)。

经统计，以Nat1基因作为大豆疫霉菌的基因回补突变体筛选标记，通过使用诺尔丝菌素进行筛选，可有效筛选到基因回补菌株，弥补了卵菌遗传转化中缺少筛选性标记基因的问题，并且筛选效率可已达到50％以上。

以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东农业大学

<120> Nat1基因作为筛选标记在卵菌遗传转化中的应用

<130> 2021

<160> 8

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 573

<212> DNA

<213> Nat1基因

<400> 1

atgggtacca ctcttgacga cacggcttac cggtaccgca ccagtgtccc gggggacgcc 60

gaggccatcg aggcactgga tgggtccttc accaccgaca ccgtcttccg cgtcaccgcc 120

accggggacg gcttcaccct gcgggaggtg ccggtggacc cgcccctgac caaggtgttc 180

cccgacgacg aatcggacga cgaatcggac gacggggagg acggcgaccc ggactctcgg 240

acgttcgtcg cgtacgggga cgacggcgac ctggcgggct tcgtggtcgt ctcgtactcc 300

ggctggaacc gccggctgac cgtcgaggac atcgaggtcg ccccggagca ccgggggcac 360

ggggtcgggc gcgcgttgat ggggctcgcg acggagttcg cccgcgagcg gggtgccggg 420

cacctctggc tggaggtcac caacgtcaac gcaccggcga tccacgcgta ccggcggatg 480

gggttcaccc tctgcggcct ggacaccgcc ctgtacgacg gcaccgcctc ggacggcgag 540

caggcgctct acatgagcat gccctgcccc taa 573

<210> 2

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

acacaagggc cccgtttcgc atgggtacca ctcttgacg 39

<210> 3

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ttcgaacccc agagtcccgc ttaggggcag ggcatgct 38

<210> 4

<211> 504

<212> DNA

<213> Avh109基因

<400> 4

atgcgtctcc agtatgccgt agtcgtggct gctgctgctc tggccgcgag ctccgaagga 60

cttcaggtcc tccccaattc ggccaagtcc acgtcgctgc gagcaagcgc tgaagctcgg 120

tacccgcctt tcgtcgaggg caagggagac cgcttcttgg ttagcgaagg caatcaggaa 180

tggtcgactc agacccagaa gggctacgag ttctcgccgc tgcaggagca ggacgacgtg 240

ctgcagcaga acgacgatga gtacgaagac gacagcgact cgagctcaca gagcgagagc 300

ggcttcgatg acgaggccag gctcttcggg aggaagaaga agaagaagaa aaagaagaaa 360

cacgaagcca ccgagacacc aacgcccaca ccgacggcga ctccagaggg aatgaccgcg 420

actcccaccc cagcgcctac tacggaggag ccaagcggct ggaggaaatt ccttgcctgg 480

tacaggcgac aaaccgctga ttaa 504

<210> 5

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

ccatcgatat gcgtctccag tatgccg 27

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ggaattcatc agcggtttgt cgcc 24

<210> 7

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

gcgggactct ggggttcg 18

<210> 8

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

gcgaaacggg gcccttgt 18

Claims

1.Nat1基因作为筛选标记在卵菌遗传转化中的应用；所述Nat1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述卵菌遗传转化具体为：以其他筛选标记获得的敲除转化子的卵菌基因回补突变体的筛选。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述卵菌为大豆疫霉菌。

4.含有Nat1基因的表达盒和/或重组表达载体在卵菌遗传转化中的应用；所述Nat1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述卵菌为大豆疫霉菌。