CN114736907A

CN114736907A - 扶桑绵粉蚧的蜡质合成基因PsFAR及其应用

Info

Publication number: CN114736907A
Application number: CN202210389769.1A
Authority: CN
Inventors: 童浩杰; 王媛; 李自豪; 李飞; 蒋明星
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2022-04-14
Filing date: 2022-04-14
Publication date: 2022-07-12
Anticipated expiration: 2042-04-14
Also published as: CN114736907B

Abstract

本发明涉及扶桑绵粉蚧的蜡质合成基因PsFAR，基于PsFAR基因，首次构建了可表达dsPsFAR(抑制PsFAR表达的dsRNA)的转基因烟草，具有显著的防治扶桑绵粉蚧作用。

Description

扶桑绵粉蚧的蜡质合成基因PsFAR及其应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，特别是涉及扶桑绵粉蚧的蜡质合成基因PsFAR，以及其在防治扶桑绵粉蚧中的应用。

背景技术

扶桑绵粉蚧Phenacoccus solenopsis Tinsley(半翅目粉蚧科)是一种世界性的入侵性害虫(Wang et al.,2010)。在我国大陆，自2008年首次发现以来(陆永跃等,2008；武三安和张润志,2009)，该粉蚧已扩张至14个省(区、市)122个县(区、市)(农业农村部办公厅，2021)，由于具有体表蜡质(图1)、寄主范围广、繁殖能力强、与蚂蚁存在互惠关系等特点，对环境非生物胁迫的适应性强，可为害100多种作物与园林植物(Nagrare et al.,2019；Tong et al.,2019；彭露等,2020)，防治困难。当前，防治扶桑绵粉蚧的主要方法为喷洒化学农药，即化学防治(陈红松等,2019)，这不仅导致环境污染、农药残留，同时使扶桑绵粉蚧逐渐产生抗药性，防治愈发困难。利用转基因作物来防治扶桑绵粉蚧不存在上述问题，一定程度上还有助于提高产量。

昆虫体表蜡质可保护虫体免受水分散失和外界有害物质的入侵，主要成分为碳氢化合物(Blomquist and Ginzel,2021)。FAR基因编码脂酰辅酶A(fatty acyl-CoAreductase)，该酶是昆虫表皮碳氢化合物合成的关键酶。目前，在果蝇(Jaspers et al.,2014)、褐飞虱(Li et al.,2020；Li et al.,2019)、西方蜜蜂(Teerawanichpan et al.,2010)、扶桑绵粉蚧(Li et al.,2016)、白蜡虫(Hu et al.,2018)及一些鳞翅目昆虫(Antony et al.,2009；Dou et al.,2020；Lienard et al.,2010；Moto et al.,2003)中已有报道。FAR基因虽在很多昆虫中均存在，但至今未将其应用于对应昆虫的生物防治。

双链RNA(double stranded RNA,dsRNA)诱导的RNA干扰技术是研究基因功能的重要方法之一。由于RNA降级机制极其保守(Huvenne and Smagg he,2010；Lim et al.,2020)，因此，尽管显微注射是递送dsRNA的常见方式(Rana et al.,2020)，但是转基因植物表达的靶向昆虫的dsRNA同样可抑制靶标昆虫的基因表达，起到RNA干扰的效果。此种转基因植物诱导的RNA干扰相比显微注射更加经济、方便，且适用于野外条件(Zha et al.,2011；He et al.,2019)。

发明内容

发明要解决的问题

针对上述扶桑绵粉蚧中存在的问题，提供一种扶桑绵粉蚧的蜡质合成基因PsFAR，以及其在防治扶桑绵粉蚧中的应用。

用于解决问题的方案

一方面，本申请提供一种扶桑绵粉蚧蜡质合成基因PsFAR。

在一些实施方式中，所述PsFAR的开放阅读框(ORF)为1671个碱基对(bp)，此外含177bp的上游非编码区(UTR)和78bp的下游UTR。

在一些实施方式中，所述PsFAR包括SEQ ID NO:1的核苷酸序列或由所述核苷酸序列组成。

在一些实施方式中，所述PsFAR编码556个氨基酸，预测的分子量为64.2千道尔顿(Kd)，等电点为8.6。

在一些实施方式中，所述PsFAR作为本申请所述dsRNA的靶标序列。

另一方面，本申请提供一种扶桑绵粉蚧蜡质合成基因dsPsFAR片段。

在一些实施方式中，所述dsPsFAR片段包括SEQ ID NO:2的核苷酸序列或由所述核苷酸序列组成。

在一些实施方式中，所述dsPsFAR片段作为本申请所述dsRNA的靶标序列。

在一些实施方式中，所述dsPsFAR片段编码本申请所述dsRNA。

另一方面，本申请提供一种表达载体、表达盒或重组细胞。

在一些实施方式中，所述表达载体、表达盒或重组细胞包括本申请任一项所述的PsFAR或dsPsFAR片段。

在一些实施方式中，所述表达载体包含pCAMBIA1301。

另一方面，本申请提供一种dsRNA。

在一些实施方式中，所述dsRNA靶向本申请任一项所述的PsFAR或dsPsFAR片段。

在一些实施方式中，所述dsRNA由本申请任一项所述的扶桑绵粉蚧蜡质合成基因dsPsFAR片段编码。

在一些实施方式中，所述dsRNA由本申请任一项所述的表达载体、表达盒或重组细胞表达产生。

另一方面，本申请提供一种防治扶桑绵粉蚧药物，包含任一种以下成分：

(1)本申请任一项所述的扶桑绵粉蚧蜡质合成基因dsPsFAR片段；

(2)本申请任一项所述的表达载体、表达盒或重组细胞；

(3)本申请任一项所述的dsRNA。

在一些实施方式中，本申请所述防治扶桑绵粉蚧药物包含本申请任一项所述dsRNA。

在一些实施方式中，本申请所述防治扶桑绵粉蚧药物可以通过饲喂、注射或喷洒的方式给药。

另一方面，本申请提供一种防治扶桑绵粉蚧植物，具有以下特征中的一项或多项：

(1)含有本申请任一项所述的扶桑绵粉蚧蜡质合成基因dsPsFAR片段；

(2)含有本申请任一项所述的表达载体、表达盒或重组细胞；

(3)表达本申请任一项所述的dsRNA。

在一些实施方式中，所述植物选自烟草。

在一些实施方式中，本申请提供所述防治扶桑绵粉蚧植物的制备方法，包括：

将本申请任一项所述扶桑绵粉蚧蜡质合成基因dsPsFAR片段，本申请任一项所述表达载体、表达盒或重组细胞，或本申请任一项所述dsRNA导入植物后得到所述防治扶桑绵粉蚧植物。

另一方面，本申请提供任一项所述PsFAR，任一项所述dsPsFAR片段，任一项所述表达载体、表达盒或重组细胞，或任一项所述dsRNA在以下一项或多项中的用途：

(1)抑制扶桑绵粉蚧蜡质合成基因表达；

(2)抑制扶桑绵粉蚧体表蜡质合成；

(3)防治扶桑绵粉蚧；

(4)筛选或制备本申请任一项所述防治扶桑绵粉蚧药物；

(5)筛选或制备本申请任一项所述防治扶桑绵粉蚧植物，特别是防治扶桑绵粉蚧烟草。

发明的效果

申请人发现PsFAR基因是扶桑绵粉蚧体表蜡质合成的关键基因，干扰该基因将降低虫体保水能力和抵抗农药渗透的能力。

本申请首次扩增获得了扶桑绵粉蚧蜡质合成基因PsFAR(SEQ ID NO:1)。该基因的开放阅读框(ORF)为1671个碱基对(bp)，此外含177bp的上游非编码区(UTR)和78bp的下游UTR。ORF编码556个氨基酸，预测的分子量为64.2千道尔顿(Kd)，等电点为8.6。多序列比对分析发现，PsFAR含FAR基因家族共有的两个保守结构域(domain)，即N-teminal Rossmannfold NAD(P)(+)-binding domain和a sterile alpha motif protein domain，同时含两个模组(motif)，即a cofactor binding motif(TGXXGF),and an active site motif(YXXXK)(图2a)。系统发育分析发现，PsFAR基因与其它昆虫的FAR基因聚在同一分支(图2b)。从不同发育时期的表达量来看，该基因在3龄若虫和雌成虫期高表达，组织特异性表达显示，PsFAR基因在脂肪体中的表达量显著高于其它组织(图2c)。

本申请基于PsFAR基因，首次构建了可表达dsPsFAR(SEQ ID NO:2)(抑制PsFAR表达的dsRNA)的转基因烟草(图3)。扶桑绵粉蚧三龄若虫在取食转dsPsFAR的转基因烟草5天后即可成功抑制PsFAR基因的表达(图4a)，表现出蜡质分泌减少及蜕皮失败等表型(图4b)，同时死亡率显著高于取食野生型烟草(对照组)的扶桑绵粉蚧(图4c)。

附图说明

图1：扶桑绵粉蚧(上)及体表蜡质扫描电镜图(下，放大4000倍)。

图2：PsFAR基因序列及表达谱，(a)扶桑绵粉蚧PsFAR、家蚕BmFAR、麻田豆秆野螟OsFAR、稠李巢蛾YeFAR、西方蜜蜂AmFAR、褐飞虱NlFAR和黑腹果蝇DmFAR的多序列比对结果。黑色示相同的氨基酸残基，灰色示保守的突变。两个保守结构域用黑线标注，两个保守motif用黑框标注。(b)不同物种FAR基因的进化树。名称前有圆圈的为本发明报道的PsFAR。(c)PsFAR在不同龄期(左)和不同组织(右)的表达谱。相对表达量用平均值±标准误标注，含四个生物学重复。经过ANOVA和Trukey多重分析，不同字母代表显著差异(P<0.05)。

图3：转基因烟草和dsPsFAR的表达量。(a)图示转入烟草的pCAMBIA1301-dsPsFAR载体的重要表达元件。两个不同方向的箭头分别代表dsPsFAR的正义和反义链。潮霉素HYG，Nos为终止密码子，β-葡萄糖醛酸酶为GUS。(b)烟草叶盘预培养、培养、分化和生根等过程。WT代表野生型烟草，Transgenic为转dsPsFAR的转基因烟草。(c)PCR扩增hpt基因以筛选阳性转基因烟草。M为marker，#1-#26为26个转化植株，此处26个均为阳性植株。B、N和P分别代表空白对照、阴性对照和阳性对照。(d)从26株T₀代转基因烟草中随机挑选9株检测dsPsFAR的表达量，经过ANOVA和Trukey多重分析，不同字母代表显著差异(P<0.05)，含三个生物学重复。表达量最高的#19号植株用于后续实验。

图4：扶桑绵粉蚧取食烟草后的RNA干扰效果、致死表型和存活率。(a)定量PCR验证扶桑绵粉蚧取食后的RNA干扰效率。总RNA提取自10头取食5天后的雌虫。(b)相比取食野生型烟草，扶桑绵粉蚧取食转基因烟草后会呈现异常体色、蜡质覆盖度降低和无法正常蜕皮等致死表型。(c)扶桑绵粉蚧在取食烟草后14天内的动态存活率。n＝30头虫子。星号代表两组间当天的存活率存在显著差异，检验方法为t检验，含三个生物学重复。*P<0.05,**P<0.01。WT代表扶桑绵粉蚧取食野生型烟草。Transgenic表示扶桑绵粉蚧取食转基因烟草。

图5：农药喷洒示意图。

图6：蜡质GC-MS和扫描电镜分析。(a)扶桑绵粉蚧碳氢化合物相对含量。用GC-MS分析总碳氢化合物和不同链烷烃(C₉–C₃₇)含量。正二十一烷(C₂₁)设置为内标。结果以纳克每毫克体重标注，共六个生物学重复。^*和^**分别代表显著性水平为P<0.05和P<0.01(t检验)。(b)扫描电镜观察羽化后24小时存活着的扶桑绵粉蚧雌虫体表蜡质产量。照片拍自背部第三胸节处。WT指取食野生型烟草，Transgenic指取食转dsPsFAR的转基因烟草。

图7：扶桑绵粉蚧在75％和<10％湿度下的成活天数。每个圆圈代表一头雌虫。n＝30–34。^*和^**分别代表显著性水平为P<0.05和P<0.01(t检验)。ns.指无显著差异。

图8：不同浓度的溴氰菊酯乳液对扶桑绵粉蚧成活率的影响。经过ANOVA和Trukey多重分析，不同字母代表显著差异(P<0.05)，含三个生物学重复。

图9：扶桑绵粉蚧的成活率。+Deltamethirin说明喷洒了25mg/L的溴氰菊酯乳液。n＝30。WT指取食野生型烟草，Transgenic指取食转dsPsFAR的转基因烟草。数据计算自三次生物学重复。^*和^**分别代表显著性水平为P<0.05和P<0.01(t检验)。

具体实施方式

为使本发明的技术方案和有益效果能够更加明显易懂，下面通过列举具体实施例的方式进行详细说明。

本发明中所述实施案例中供试虫体为初蜕皮的3龄雌虫，这些雌虫挑取自实验室维持的种群。该种群于2016年采集自浙江金华的芙蓉植株上，继代饲养至今。实验室内长期以番茄为寄主，饲养于27±1℃,75％湿度和14：10(白昼：黑夜)的光周期下。

(1)扶桑绵粉蚧蜡质电镜扫描

供试扶桑绵粉蚧背面朝上，用电离胶粘贴于载物台，随后将样品置于真空容器内(日本日立)干燥喷金，最后在TM-1000扫描电镜(日本日立)下观察。

(2)碳氢化合物提取与定量

蜡质碳氢化合物提取自50头取食烟草9天后的扶桑绵粉蚧雌成虫。主要步骤如下：

1)收集雌虫于一干净的气相瓶，用200μl正己烷溶解；

2)超声3min后，将溶液转移至一新的气相瓶；

3)重复上述步骤2次后，继续超声20min；

4)10,000rpm离心10min去除未溶解的杂质；

5)上清液用高浓度氮气吹干后，复溶于30μl正己烷；

6)在复溶液中加入300ng正二十一烷(C₂₁)作为内标后，进行GC-MS检测。

GC-MS检测参数如下：氦气恒流1mL/min；不分流进样1μl于HP-5MS色谱柱(30m×0.25mm×0.25μm)。温度程序为：50℃4min，10℃/min至310℃，维持10min。注射和检测温度分别设置为270和300℃。质量检测在EI模式下进行，70ev离子化，有效质核比m/z范围为45–650，扫描速度5scan/s。同时，一份C₇–C₄₀的正链烷烃标样也在同样条件下检测作为对照。检测结果通过比对NIST数据库和标样检测结果鉴定化合物。峰面积用安捷伦公司的MassHunter系统计算。各正链烷烃的相对含量用如下公式计算：烷烃峰面积/正二十一烷峰面积*300。处理组和对照组包含六个生物学重复。

(3)干燥实验

干燥实验使用50ml离心管进行，处理组为湿度RH<10％，即在50ml离心管内加入约10g的硅胶颗粒用于吸水；对照组不放颗粒。总计30–34头取食烟草9天后的雌虫被分别置于对照组和处理组的离心管内，且不提供食物。对照组离心管放置于75％的湿度下。湿度用TH40W-EX湿度计监测(妙新科技有限公司)。饲养温度和光照保持不变。每天记录存活的个体数并去除死亡的个体，直至所有个体均死亡。实验重复三次。

(4)农药处理实验

为了确定适合用于此实验的农药浓度，收集饲养于番茄上的雌成虫于塑料盒内(长14cm宽10.5cm高5cm)，塑料盒底部覆盖一吸水滤纸。共设置7组，每组30头雌成虫，用小型喷壶从10cm高处分别喷洒500μl的25g/L,2.5g/L、250mg/L、25mg/L、2.5mg/L和0mg/L的溴氰菊酯乳液(图5)，余下的一组不做处理设为空白对照。为了降低农药的毒喂作用，喷洒完农药后，各组的虫子被立即转移至新的饲养盒内(饲养盒大小与上述塑料盒一致，内置一番茄枝条，枝条根部用棉球包裹以提供水分)饲养。每隔24小时记录盒内存活的个体，每组实验重复三次。

为了评估转基因烟草对扶桑绵粉蚧农药处理后存活率的效果，25mg/L的溴氰菊酯乳液被用于本实验。取食烟草9天后的雌虫被挑入上述塑料盒内，处理组为取食转基因烟草的虫子，对照组为取食野生型烟草的虫子。农药喷洒等步骤同上。虫体成活率在喷洒48小时后统计一次。实验共重复三次。

实施例1：PsFAR靶标序列扩增

按照TAKARA公司RACE试剂盒(SMART^TMRACE cDNA Amplification Kit)步骤扩增PsFAR序列，如SEQ ID NO:1所示。

扩增基因5’端的引物为AAGTATGCGTAATGCCACACGCAC，扩增基因3’端引物为AGTTCTAGTGCGTGTGGCATTACGCA。

PCR反应程序为：94℃3min；94℃30s，72℃3min，5个循环；94℃30s，68℃30s，72℃3min，5个循环；94℃30s，66℃30s，72℃3min，25个循环；72℃，10min。

PCR产物纯化后使用胶回收试剂盒(FastPure Gel DNA Extraction Mini Kit，诺唯赞生物科技有限公司)回收片段，使用克隆试剂盒(pClone007 Simple Vector Kit，擎科生物科技有限公司)将基因克隆至T载体，并进行测序验证。

使用含BamHI和SalI限制性内切酶识别位点的正向引物(CGCggatccgtcgacACGGCTTATTCCTTCTGCC)和含SacI和ApaI限制性内切酶识别位点的反向引物(GGgagctcgggcccGGTTGCTTTAGCCGCACAA)扩增获得PsFAR基因的422bp长的片段(即本申请dsPsFAR片段，如SEQID NO:2所示)。

使用TAKAR的高保真酶(PrimerSTAR Max DNA Polymerase)扩增该片段。

PCR扩增体系为：质粒模板0.5μL，对应的引物各1μL，2×Taq MasterMix 12.5μL，ddH₂O补足至25μL；PCR扩增程序为：95℃，3min；95℃，30s；52℃，30s；72℃，40s，35个循环；72℃，10min。

将扩增的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳(试剂盒同上)，按照凝胶回收试剂盒说明书回收符合预期大小的DNA电泳条带。

实施例2：表达载体构建

本发明所用的植物表达载体为pCAMBIA1301。该载体大小为11849bp。以原核复制起点ori为起点，从5'-3'依次含有pBR322的复制起点，使载体可以在原核细胞，如大肠杆菌，农杆菌中复制；含有卡那霉素抗性基因，用于筛选阳性克隆；T border(L)以及其对应的T border(R)之间是农杆菌转染时能够进入植物细胞的T-DNA区域，在这个T-DNA区域内，还有潮霉素抗性基因，用于筛选阳性的植株或愈伤组织；含有35S组成型表达启动子；MCS多克隆位点下游有LacZ，可能可以进行蓝白斑筛选；启动子下游表达GUS基因，用于组织化学染色。

纯化的dsPsFAR片段(SEQ ID NO:2)的正义链和反义链分别被SalI+ApaI和SacI+BamHI双酶切(赛默飞公司)。使用T4连接酶(赛默飞公司)，将两条酶切完成的链分别连上植物表达载体pCAMBIA1301的相应酶切位点处，获得可用于遗传转化的载体pCAMBIA1301-dsPsFAR(图3a)。酶切转化等过程均采用商业化试剂及其步骤。最终构建的载体序列经过生物公司测序验证。

实施例3：遗传转化

通过农杆菌介导的转化将pCAMBIA1301-dsPsFAR载体转入烟草(品种为Nicotianatabacum cv.Petit Havana)，烟草的遗传转化步骤包括培养烟草无菌苗、叶盘预培养、农杆菌侵染叶盘及共培养、叶盘筛选培养和生根等过程，由武汉天问生物科技有限公司完成。转化和培养后，叶盘用蒸馏水洗涤3次，并在吸水纸上干燥。将叶盘转移至卡那霉素培养基中进行分化和生根(图3b)。转基因烟草代际遗传稳定，形态和生长周期与野生型无异(图3b)。

实施例4：阳性转基因植株筛选

采用PCR扩增内标基因(hygromycin B phosphotransferase，Hpt)筛选第一代T₀和第二代T₁中的阳性转基因植株(图3c)，引物序列为：hpt557-F：ACACTACATGGCGTGATTTCAT；hpt557-R：TCCACTATCGGCGAGTACTTCT。所用试剂盒为植物用基因组直扩试剂盒(T5 Direct PCR Kit，擎科生物科技有限公司)。PCR反应体系和程序按照说明书步骤完成。

实施例5：取食转dsPsFAR的转基因烟草后影响扶桑绵粉蚧体表碳氢化合物合成和蜡质的产量

使用GC-MS检测取食烟草9天后粉蚧蜡质的成分和含量。结果显示，蜡质中含有不同长度直链烷烃(图6a)，且对照组(WT)和处理组(Transgenic)粉蚧蜡质的成分无差异。从含量来看，取食转基因烟草后粉蚧蜡质中烷烃总量显著下降了6.3ng/mg。总量的下降涉及各烷烃含量的下降，其中C₁₉和C₂₉的下降最为显著。这些结果说明扶桑绵粉蚧取食转基因烟草后可显著降低体表蜡质中碳氢化合物的含量。

为了更加直观地观察体表蜡质产量的变化，用扫描电镜共观察了30头羽化后24小时的雌虫。从背部第三胸节的扫描结果来看，对照组(WT)雌虫体表均覆盖厚实的蜡质，但处理组(Transgenic)的雌虫体表蜡质明显减少(图6b)。这说明扶桑绵粉蚧取食转基因烟草后可显著降低体表蜡质的产量。

实施例6：扶桑绵粉蚧取食转dsPsFAR的转基因烟草后降低了虫体的保水能力，提升了农药的触杀效力

干燥实验结果显示，饲养于75％湿度下的对照组(WT)和处理组(Transgenic)扶桑绵粉蚧成活率无显著差异。相比之下，饲养于<10％湿度下的处理组虫子的成活率显著低于对照组(图7)。结合实施案例一的结果，说明扶桑绵粉蚧取食转基因烟草后改变了体表蜡质含量，导致其保水能力显著下降。

为了选择合适浓度的农药用于本实验，本案例中首先使用了不同浓度的溴氰菊酯乳液喷洒于扶桑绵粉蚧，观察其成活率。结果表明，随着溴氰菊酯浓度的升高，扶桑绵粉蚧的成活率显著下降(图8)。最终本案例选用25mg/L溴氰菊酯乳液进行后续实验，该浓度下，扶桑绵粉蚧成活率约为72.22±2.94％。

使用25mg/L溴氰菊酯乳液喷洒对照组(WT)和处理组(Transgenic)扶桑绵粉蚧48小时后发现，处理组的存活率显著下降22.22％(图9)。上述结果表明，扶桑绵粉蚧取食转基因烟草后可显著提升农药的触杀效果。

应当理解，以上实施例均为示例性的，不用于包含权利要求所包含的所有可能的实施方式。在不脱离本公开的范围的情况下，还可以在以上实施例的基础上做出各种变形和改变。同样的，也可以对以上实施例的各个技术特征进行任意组合，以形成可能没有被明确描述的本发明的另外的实施例。因此，上述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，不对本发明专利的保护范围进行限制。

序列表

<110> 浙江大学

<120> 扶桑绵粉蚧的蜡质合成基因PsFAR及其应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1671

<212> DNA

<213> 扶桑绵粉蚧(Phenacoccus solenopsis Tinsley)

<400> 1

atggcactgg atatgcacag acgaaatgtt ttaaacaaag gattaactaa aaataaagaa 60

gaagatgccg atattctaag aagtattata acaccagagc atccaatcga tcctttagag 120

ttgttaggcg agagaaactt caacggacca cgcgaagtac cagaatatga aatcggtact 180

cctgtgcagg aattttttcg caatgccact gtttttgtta ctggtggtac tggattcatg 240

ggaaaaatac tggtagaaaa attgctcaga tcatgtccgc atattaaacg tatttattta 300

ctggtacgaa ataagaaagg aaaatcgccg gacgaacgaa ttcaagaaat attccaagat 360

aggctcttca aaagacttaa gcatgaagtt cctaattttt atcaaaaagt atctgtgatg 420

aatggcaatc tcgagcaatc tgatctcgga ttgtccgaag aagataaaga caaatttgcc 480

aaagaagtta acgtagtttt tcatggagcc gcaactgttc gtttcgacga aaaattaaaa 540

ttagctgtag ctataaacgt tataggtaca cgagaaatac tcaaattggc taaaacagcc 600

aaacatttaa aggtaatcat gcacgtttca acggcttatt ccttctgccc tctaccaaaa 660

cttgaagaaa aattttacga tatgccagta gactatagag acgtcatgaa taaagttcaa 720

aatatgaatg atgaagaagt taactttgaa acggccaaga ttttgggaga atggcctaac 780

acatacacat ttactaaagc gttagcggaa tgtttactaa aaaatgaaag tcaaggtttg 840

cctgttggcg tgtttcgtcc ttctgtgata atttcaacgt acaaggaacc agttcgagga 900

tggatagaca atgtgtatgg accgattggt gtgattgtgg gagtcggtac cggcatatta 960

catgtgtatg agggaagtgc tgacagaagc agcgcagata tggtaccggt tgatttagtg 1020

gtgaatggtt tgatttgtgc ggctaaagca accgcagaga attacgatgc caaaaataaa 1080

aacgatgtta acactccgat ctatattttt tcgagtggaa ctcaaaatcc aataacttgg 1140

ggaaaaatca tagattattc actgaaatat tcaatggaat ggccaaccat tagagcgata 1200

tggtattact ctttgacttt cacagaaaat aaacacctgt acacagtatt atcttttctg 1260

tttcacacaa tacccggcca cctcatcgac tttcttgctt ctctcttcgg aaaaaaacct 1320

gtactaacaa aaatttattc caagatgaac gatgtgcggg agattttaac atattttaga 1380

caacgagact ggacttttgt aaatacaaac acccaacaaa tgtggcaaaa tttgaccaaa 1440

gaagataaac agctattctt tttcaatatg agcgaaatat cttgggaata ttttctacaa 1500

gcgatgtgct tagggttacg agtatatttg gtaaatgatg atatcgatac aatacctgca 1560

gcgaggaaaa aatggaagag attatattac gctcacattt ttttcaaagc catagtgttc 1620

gcattattca tttatgtgct atggagtttg ctcaaattta ttatatttta a 1671

<210> 2

<211> 422

<212> DNA

<213> 扶桑绵粉蚧(Phenacoccus solenopsis Tinsley)

<400> 2

acggcttatt ccttctgccc tctaccaaaa cttgaagaaa aattttacga tatgccagta 60

gactatagag acgtcatgaa taaagttcaa aatatgaatg atgaagaagt taactttgaa 120

acggccaaga ttttgggaga atggcctaac acatacacat ttactaaagc gttagcggaa 180

tgtttactaa aaaatgaaag tcaaggtttg cctgttggcg tgtttcgtcc ttctgtgata 240

atttcaacgt acaaggaacc agttcgagga tggatagaca atgtgtatgg accgattggt 300

gtgattgtgg gagtcggtac cggcatatta catgtgtatg agggaagtgc tgacagaagc 360

agcgcagata tggtaccggt tgatttagtg gtgaatggtt tgatttgtgc ggctaaagca 420

ac 422

Claims

1.一种扶桑绵粉蚧蜡质合成基因PsFAR，其特征在于，包括SEQ ID NO:1的核苷酸序列或由所述核苷酸序列组成。

2.一种扶桑绵粉蚧蜡质合成基因dsPsFAR片段，其特征在于，包括SEQ ID NO:2的核苷酸序列或由所述核苷酸序列组成。

3.包含权利要求1-2任一项所述PsFAR或dsPsFAR片段的表达载体、表达盒或重组细胞。

4.一种dsRNA，具有以下特征中的一项或多项：

(1)所述dsRNA靶向权利要求1所述扶桑绵粉蚧蜡质合成基因PsFAR；

(2)所述dsRNA靶向权利要求2所述扶桑绵粉蚧蜡质合成基因dsPsFAR片段；

(3)所述dsRNA由权利要求2所述扶桑绵粉蚧蜡质合成基因dsPsFAR片段编码；

(4)所述dsRNA由权利要求3所述表达载体、表达盒或重组细胞表达产生。

5.权利要求1所述PsFAR，权利要求2所述dsPsFAR片段，权利要求3所述表达载体、表达盒或重组细胞，或权利要求4所述dsRNA在以下一项或多项中的用途：

(1)抑制扶桑绵粉蚧蜡质合成基因表达；

(2)抑制扶桑绵粉蚧体表蜡质合成；

(3)防治扶桑绵粉蚧；

(4)筛选或制备防治扶桑绵粉蚧药物；

(5)筛选或制备防治扶桑绵粉蚧植物，特别是防治扶桑绵粉蚧烟草。

6.一种防治扶桑绵粉蚧药物，其特征在于，包含任一种以下成分：

(1)权利要求2所述扶桑绵粉蚧蜡质合成基因dsPsFAR片段；

(2)权利要求3所述表达载体、表达盒或重组细胞；

(3)权利要求4所述dsRNA。

7.一种防治扶桑绵粉蚧植物，具有以下特征中的一项或多项：

(1)含有权利要求2所述扶桑绵粉蚧蜡质合成基因dsPsFAR片段；

(2)含有权利要求3所述表达载体、表达盒或重组细胞；

(3)表达权利要求4所述dsRNA。

8.如权利要求7所述防治扶桑绵粉蚧植物的制备方法，其特征在于，包含以下制备步骤：

将权利要求2所述扶桑绵粉蚧蜡质合成基因dsPsFAR片段，权利要求3所述表达载体、表达盒或重组细胞，或权利要求4所述dsRNA导入植物后得到所述防治扶桑绵粉蚧植物。

9.根据权利要求7-8任一项所述的防治扶桑绵粉蚧植物，其特征在于，所述植物选自烟草。