JP4630067B2 - 活性物質をスクリーニングするために遺伝学的に改変された生物を製造する方法 - Google Patents

Description

試験される物質によって阻害される標的タンパク質を異種発現する遺伝学的に改変された酵母が、薬物スクリーニングに用いられることが知られている。異種発現とは、本発明の範囲において、生物にとって外来の遺伝子の発現、または、生物にとって内因性の遺伝子が発現パターンが変更されて発現されること、特に、増強または減少された発現、および／または、時間および／または場所（例えばその他の区画、より高度な生物では、例えばその他の組織）が変更された発現を意味する。最も簡単な場合において、異種発現は、酵母の検出可能な変化した表現型（通常は成長阻害）を起こす。成長阻害とは、本発明の範囲において、増殖速度の減少および／または成長する大きさの減少を意味し、さらに、細胞死（アポトーシスまたは壊死性）も含まれる。また、発生する成長阻害のタイプは生物に応じて様々である；従って、酵母において、増殖の停止または溶解のいずれかを観察することができるが、元々多細胞生物から得られた真核細胞においては、アポトーシスもしばしば観察することができる。異種発現により、外から見てわかる程度の生物の挙動および／または形態学の変化（すなわち変化した表現型）が生じる場合、その遺伝学的に改変された生物は、薬物スクリーニングに容易に用いることができ、試験される物質の効能を、表現型（例えば成長阻害）を除去または減少させる能力に基づき決定することができる。これは、変化した表現型として成長阻害がある酵母系の例においてはハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）にも適している簡単な成長分析によって行われることが好しい。遺伝学的に改変されていない生物、または、異種タンパク質またはタンパク質フラグメントを発現しない生物と比較した、遺伝学的に改変された生物の外から見てわかるあらゆる変更（形状、大きさなど）、または、その挙動の変更（成長、細胞分裂の速度など）は、変化した表現型といわれる。従って、表現型解析は、このような変化を起こすことを意味する。

しかしながら、この従来技術の方法には、薬物スクリーニングに有用な遺伝学的に改変された生物の表現型を生じる異種発現された遺伝子はわずかしかないという難点がある。すなわち、例えば、全ての異種発現されたキナーゼのうちわずか約２０〜３０％しか、酵母で薬物スクリーニングに利用することができる成長阻害を起こさないと仮定される。残りの７０〜８０％の場合において、成長阻害は、スクリーニングに用いるには低いか（コントロールと比較した場合の差があまりにも小さいため、高いバックグラウンドが生じ、従って偽陽性の数が大きくなりすぎる）、または、全く存在しない。

それゆえに、従来技術の難点を有さない薬物スクリーニングのための遺伝子操作された生物の製造方法、特に、遺伝子が異種発現されている生物において、どのような表現型も生じない異種発現された遺伝子、または、スクリーニング（特にＨＴＳ）に有用などのような表現型も生じない異種発現された遺伝子でも薬物スクリーニングを利用可能にするのに適した前記製造方法が必要である。

本発明によれば、この目的は、薬物スクリーニングのために遺伝学的に改変された生物を製造する方法によって達成され、本方法は、以下の工程を含む：
ａ）生物の遺伝学的改変によって、少なくとも１種のタンパク質またはタンパク質フラグメントの異種発現を起こす工程。
ｂ）好ましくは、それに続いて、遺伝学的に改変された生物の表現型を決定する工程。
ｃ）改変された遺伝子発現パターンを解析し、代償として（compensatingly）差異的に（differetially）調節された遺伝子を同定する工程。
ｄ）前記生物を表現型解析する工程（好ましくは、代償として調節された遺伝子の欠失、変異誘発または過剰発現によって、異種発現されたタンパク質またはタンパク質フラグメントと協同して表現型を増強する、または発生させる）。

本発明は、ほとんどの遺伝子の異種発現についての検出可能な表現型の欠如は、遺伝学的に改変された生物が、異種発現されたタンパク質またはタンパク質フラグメントの発現に応答して数種の遺伝子の発現をアップまたはダウンレギュレートする（すなわち代償として差異的に調節する）事実に基づくという本発明者等による発見に基づいている。この場合、「差異的に調節された」とは、遺伝学的に改変された生物における調節とは異なって調節されること、すなわち、異種発現されたタンパク質またはタンパク質フラグメントが異種発現しないで調節されることを意味する。「代償として」とは、差異的な遺伝子調節が、タンパク質またはタンパク質フラグメントの異種発現に対する反応を意味する。

本発明は、簡単な生化学モデルに対して、細胞モデル（好ましくは酵母）におけるプラットフォーム技術の開発を可能にする。この分析システムを用いて、例えば、化学ライブラリー、コンビケム（ＣｏｍｂｉＣｈｅｍ）ライブラリー、および、天然物質の抽出物から阻害剤を同定することが可能である。この分析システムは、９６−、３８４−もしくは１５３６−ウェルプレート、または、細胞分析に共通のその他のフォーマットに適合させることができる。選択されるフォーマットはまた、ある程度は選択される生物に依存し、その選択は、当業者の能力の範囲内である。

本発明の方法は、望ましい生物における異種発現が、遺伝学的に改変されていない生物、またはタンパク質またはタンパク質フラグメントを異種発現しない生物に比べて、検出可能な表現型の変化をまったく生じないような、遺伝子およびタンパク質またはタンパク質フラグメントに特に適している。例えば、タンパク質キナーゼ、同様に、転写反応を起こすその他の遺伝子産物を分析することが可能である。しかしながら、本発明の方法は、特に、変化した表現型が検出可能であるにもかかわらず特定の理由のために薬物スクリーニングでの使用に適切ではない場合に、検出可能な変化した表現型に適用してもよい。薬物スクリーニングに用いることができるこのような方法で、前記表現型は、表現型解析によって増強することができ、または、改変することができる。従って、表現型解析は、本発明の範囲において、タンパク質またはタンパク質フラグメントを異種発現する遺伝学的に改変された生物において、表現型を起こすこと、または、増強することを意味し、このような表現型は、タンパク質またはタンパク質フラグメントを異種発現しない生物、または、遺伝学的に改変されていない生物の表現型と識別することができる。

適切な生物は、好ましくは細胞であり、本発明においては、真核細胞、同様に原核細胞、または、薬物スクリーニングに適した多細胞非ヒト生物、例えばショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）、好ましくは、Ｃ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）である。適切な真核細胞は、好ましくは、多細胞生物由来の培養細胞系であり、例えば３Ｔ３、ＣＨＯ、ＨｅＬａなど、または、真核単細胞生物、特に酵母である。特に適切なものは、酵母のなかでも、Ｓ．セレビジエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株またはＳ．ポンベ（Ｓ．ｐｏｍｂｅ）株である。酵母細胞の適切な実験用株、または、適切な真核細胞系は、十分に当業者周知である。

適切なタンパク質およびタンパク質フラグメントは、原則的には、生物で異種発現されることにより、内因性遺伝子の発現パターンの変更を起こすものであればどれでもよい。新しい活性物質の発見に関して有利であればどのようなタンパク質およびタンパク質フラグメントでも有用であり、キナーゼ、ホスファターゼ、ＧＰＣＲ、（特に小さい）ＧＴＰ
アーゼ、プロテアーゼおよびイオンチャンネルが、本発明の範囲内で特に好ましい。

本発明の範囲内において、用語「薬物スクリーニング」は、少なくとも１種の遺伝学的に改変された生物を用いた、１またはそれ以上の特定の標的遺伝子および／または標的タンパク質の活性に作用する物質の検索のあらゆるタイプを含む。原則的に、本発明において、あらゆるタイプの物質が適切であり、例えば、あらゆるタイプの天然物質（すなわち自然に存在する分子、特に生体分子）、同様に、天然に存在しない合成生産された化学物質、ならびに、天然物質から誘導された物質／誘導体、特に生物学的分子（例えば改変されたペプチドまたはオリゴヌクレオチド）である。

異種発現は、例えば適切な発現ベクターを導入することによる、外来遺伝子の導入、または、生物にとって内因性の遺伝子の改変された発現も含み得る。それに必要な遺伝学的改変は、生物のゲノムの改変に及んでもよく（例えば、安定なベクターをゲノムに統合することによって、または、様々なタイプの変異誘発によって）、エピソーム性でもよく、または、生物中に残存するための１またはそれ以上の選択マーカーによる一定の選択を必要とする適切なベクターを単に導入することを含んでもよい。最も適切なタイプは様々な因子、特に生物のタイプに依存し、有能な当業者であれば容易に決定することができる。

異種発現は、少なくとも１種のタンパク質またはタンパク質フラグメントに関するが、複数のタンパク質またはタンパク質フラグメントに関してもよい。適切な方法（ＰＣＲ、ノーザンブロット、ウェスタンブロットなど）によって異種タンパク質／フラグメントの発現を確かめ、その後に、遺伝学的に改変された生物の遺伝子発現パターンを、前記異種タンパク質の発現がない生物と比較して解析することが好都合であり得る。解析は、当業者によく知られた適切な手段によって行われ、アレイ（好ましくは、ＤＮＡ／ＲＮＡまたはタンパク質マイクロアレイ）、または、チップシステムの使用が特にこの目的に適している。コントロール生物の発現パターン（例えば野生型生物、または、空のベクターのみが導入された生物、または、誘導性系で、異種遺伝子の発現が誘導されていない遺伝学的に改変された生物）と、異種遺伝子を発現する遺伝学的に改変された生物の発現パターンとを比較することによってである。異種遺伝子を発現する遺伝学的に改変された生物の発現パターンにおいて、コントロール生物の発現パターンと比較して、とりわけ／増加して／減少して発現するか、または、全く発現しない、このような遺伝子産物は、したがって代償として差異的に調節された遺伝子とみなされ、そして、前記遺伝学的に改変された生物を表現型解析するのに用いることができる。

表現型解析は、遺伝学的に改変された生物において野生型生物と識別可能な表現型（または、誘導性システムで、タンパク質またはタンパク質フラグメントの異種発現がある遺伝学的に改変された生物においてのみ生じた表現型、および、タンパク質またはタンパク質フラグメントが発現されていない場合に、前記生物の誘導されていない状態では生じない表現型）を起こすこと、または、増強することを意味し、このような表現型は、好ましくは、ＨＴＳ薬物スクリーニングでの評価に適している。本発明において、上述の起こすこと、または、増強することは、例えば、１またはそれ以上の代償としてアップレギュレートされた遺伝子の発現を減少または除去させる際に生じ得る（これは、例えば、１またはそれ以上の代償として差異的に調節された遺伝子のゲノムのノックアウトによって、または、変異誘発によって行うことができる）。または、１またはそれ以上の代償としてダウンレギュレートされた遺伝子の発現を増強させる際に生じ得る（これは、例えば、適切な発現ベクターを用いて、１またはそれ以上の代償として差異的にダウンレギュレートされた遺伝子を異種発現させることによって行うことができる）。この方法において、生物にとって内因性で、異種発現された遺伝子によって引き起こされた表現型を生じさせてもよく、その表現型は、１またはそれ以上の遺伝子の代償として差異的な調節によって妨害されている（好ましくは成長阻害だが、特に、多細胞生物においては、その他の表現型も可能である）。

また、適切なマーカー／タグ（例えば、遺伝子産物に結合しているもの）によって、または、代償としてアップレギュレートされた遺伝子のエンハンサーおよび／またはプロモーターの制御下であり、生物に導入されているレポーターによって、１またはそれ以上の代償としてアップレギュレートされた遺伝子を標識することも可能である。適切なレポーターは、当業者既知であり、本発明において適切なものは、特に、あらゆるタイプの発光タンパク質（例えばＧＦＰ、ＢＦＰなど）、あるいは検出可能なシグナルを製造することができるその他のレポーター（例えばルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ）、および、栄養要求株のための成長マーカー（例えばＨＩＳ３、ＵＲＡ３、ＬＥＵ２、ＴＲＰ１）、および、抗生物質耐性遺伝子（例えば、カナマイシンまたはＧ４１８に対する）である。その他のタイプの表現型解析も考えられる。

表現型解析の後、適切な方法（例えば増殖の速度の測定、細胞の計数、または、大きさまたは形態などの測定、および生じていない異種発現の表現型との比較）によって前記表現型解析が成功しているかどうかを調べることが好都合である。

本発明の方法を実行する好ましい形態によれば、表現型解析は、少なくとも１つの代償として調節された遺伝子の欠失、変異誘発または過剰発現によって行われる。

好ましい実施形態によれば、表現型解析は、代償として差異的な発現を減少／除去させること、または、少なくとも１つの代償として差異的に調節された遺伝子を標識することによって行われる。

これに関して、異種発現は、生物にとって内因性の少なくとも１つの遺伝子の相殺的なアップレギュレート、およびまた、ダウンレギュレートを起こす可能性があるが、１またはそれ以上の遺伝子のアップレギュレート、および、１またはそれ以上のその他の遺伝子のダウンレギュレートを起こす可能性もある。

また、タンパク質またはタンパク質フラグメントの異種発現が誘導性の場合も特に便利である。適切な系が有能な当業者に知られており、適切な例としては、ガラクトースまたは銅で調節されるプロモーター、Ｔｅｔ−オンＴｅｔ−オフ系などが挙げられる。これは、生物にとって外来または内因性の遺伝子の発現を誘導によってスイッチオンすること（誘導性ノックイン）、または、生物にとって内因性の遺伝子の発現を誘導によって減少させる、または、完全にスイッチオフすること（誘導性ノックアウト）のいずれかを含み得る。この目的のために、好都合には、遺伝学的改変は、タンパク質またはタンパク質フラグメントの誘導性発現を可能にするベクターを導入することを含み、このようなベクターとして好ましくは、ガラクトース−（ＧＡＬ１／ＧＡＬ１０）、または、銅（ＣＵＰ１）調節プロモーター、テトラサイクリン誘導性ベクター、または、組織特異的な誘導性プロモーター（例えばｈｓｐ１６−２、ｕｎｃ−１１９、ｕｎｃ−５４、ｍｅｃ−７、または、Ｃ．エレガンスにおいてはｍｙｏ−３）を有するベクターである。

好ましい実施形態によれば、生物は、Ｃ．エレガンス、原核細胞または真核細胞であり、特に好ましくは酵母細胞であり、好ましくは、Ｓ．セレビジエ株の酵母細胞である。

改変された遺伝子発現は、好ましくは、ｃＤＮＡまたはオリゴヌクレオチドマイクロアレイを用いたＤＮＡ／ＲＮＡのプロファイリングによって解析されるが、解析は、原則的に、ｍＲＮＡまたはタンパク質の安定状態のあらゆる改変（転写、翻訳、安定化など）を含んでもよく、従って、タンパク質のプロファイリングによって、同様に、補助タンパク質アレイを用いて行ってもよい。

有利な本方法の設計において、表現型解析は、代償として差異的な調節を減少または除去させることによって行われる。代償として差異的に調節された遺伝子が、コントロール生物での発現より強く発現される場合、前記減少または除去は、増強された発現を完全に、または部分的に阻害することによって行われる。これは、好ましくは、欠失株と交雑し、続いて二重突然変異体を選択すること（特に生物が酵母の場合に適切である）、適切なベクターを用いたゲノムのノックアウト（これらは当業者既知であり、同様に、酵母において極めて適切であり、ここでは特にサッカロミセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）である）、放射および／または変異誘発物質、または、問題の遺伝子のタンパク質生産を阻害するアンチセンスベクターの導入などによる変異誘発によって行われる。この目的のために、代償として差異的に調節された遺伝子のノックアウトが、レポーター遺伝子（例えば、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ）または成長マーカー（ＨＩＳ３、ＡＤＥ２、ＵＲＡ３）または耐性マーカー（例えばカナマイシンに対する）のノックインを含む場合が特に有利である。次に、レポーター遺伝子は、それに続く試験される薬物の効能を検出および定量するための分析におけるシグナルとして用いてもよい。これは、好ましくは、差異的に調節された遺伝子のコード配列の少なくとも一部を、レポーター遺伝子（例えばルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼなど）のコード配列で（また、検出するのに十分な前記配列の一部など）で置き換えることを含む。代償として差異的に調節された遺伝子がコントロール生物における発現よりも弱く発現される場合、減少または除去は、発現を増強することによって、好ましくは、交雑して、選択可能なエピソームの、またはその他の発現ベクターを導入することによって、または、ゲノムのノックインによって（上記の方法は特に、生物として酵母を用いる場合に適している）作用を受ける。好ましくは、代償として差異的な調節を減少または除去させることにより、遺伝学的に改変された生物の成長阻害が起こされるが、その他の表現型も有利であり得る。

その他の本発明の形態は、本発明の方法によって製造された、遺伝学的に改変された、表現型解析された生物に関する。

特に、本発明は、少なくとも１つの内因性または外来遺伝子の遺伝学的に改変された発現を有する遺伝学的に改変された生物（その発現により、前記生物にとって内因性の少なくとも１つのその他の遺伝子の代償として差異的な調節を起こし、このようにして、好ましくは評価可能な／検出可能な／有用な表現型が停止される、またはその出現が阻害される）に関し、および、遺伝子の代償として差異的な発現を減少／除去させることによって、または、代償として差異的に調節された遺伝子産物を標識することによって生じる表現型を有する遺伝学的に改変された生物に関する。

その他の本発明の形態は、異種タンパク質またはタンパク質フラグメントの機能に対して作用する物質をスクリーニングするための、本発明によって製造された遺伝学的に改変された生物の使用、および、異種タンパク質またはタンパク質フラグメントの機能に対して作用する物質を同定する方法に関する。

その他の形態によれば、本発明はまた、本発明の表現型解析された生物を用いた薬物スクリーニングのための分析に関し、本分析は、表現型（例えば、タンパク質の誘導性の異種過剰発現による成長阻害）を決定し、試験される物質と前記生物とを接触させ、前記表現型の起こり得る変化、好ましくは野生型生物の挙動または形態への少なくとも部分的な復帰（すなわち、もとの生物の表現型への少なくとも部分的な回復であり、例えば成長阻害がなくなること）を観察することによる。さらに、本発明の方法または本発明の分析によって有効と同定される物質は、に関する。

以下で、本発明を実施例に基づきより詳細に説明する。

〔実施例〕
実施例１：生物として酵母をベースとした、キナーゼの活性に作用する薬物を同定するためのプラットフォーム技術の開発
この場合において、生じる表現型は、酵母の成長阻害である。従って、本分析の原理は酵母の成長阻害に基づき、酵母は、生きている「試薬チューブ」として用いられる。ここで成長阻害とは、例えば、細胞周期の停止、または、関連する細胞の溶解を意味する。酵母は、遺伝学的な可操作性が理想的に適しているために用いられる。ヒト（またはその他の外因性）キナーゼは、酵母において、ガラクトース誘導性プロモーター（ＧＡＬ１／１０）の制御下で過剰発現される。酵母は、標準的な方法に従って形質転換され、培養される。用いられるベクターの例としては、ｐ４１ｘ−ＧＡＬ１、または、ｐ４２ｘ−ＧＡＬ１１系のベクターが挙げられる。

試験される全キナーゼの約３０％において、酵母における過剰発現により成長阻害が生じている（Ｔｕｇｅｎｄｒｅｉｃｈ等（２００１年））。この方法は、図１で、工程１、３、５に記載されている。その過剰発現により成長阻害を起こすキナーゼは、適切な酵母株に統合され、次に、ハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）に送られる。この実施例は、バックグラウンド株「ＭＡＴａ ｈｉｓ３□１ ｌｅｕ２□０ ｍｅｔ１５□０ ｕｒａ３□０」（ＥＵＲＯＳＣＡＲＦ製のＢＹ４７４１）の酵母株を用いる。

ＨＴＳのための分析を開発する際に、条件は、上述のバックグラウンド株において様々な「薬物輸送体」の欠失突然変異体を分析することによって最適化される。この実施例で試験される全タンパク質キナーゼに関して、以下の欠失の組合わせを有する株が分析される：１．ＹＲＷＳ２１（ＭＡＴａ ｐｄｒ１□：：ＫａｎＭＸ ｐｄｒ３□：：ＫａｎＭＸ ｈｉｓ３□１ ｌｅｕ２□０ ｍｅｔ１５□０ ｌｙｓ２□０ ｕｒａ３□０）、２．ＹＲＷＳ３９（ＭＡＴａ ｐｄｒ５□：：ＫａｎＭＸ ｙｏｒ１□：：ＫａｎＭＸ ｈｉｓ３□１ ｌｅｕ２□０ ＭＥＴ１５ ｌｙｓ２□０ ｕｒａ３□０）、３．ＹＲＷＳ１４（ＭＡＴａ ｐｄｒ５□：：ＫａｎＭＸ ｓｎｑ２□：：ＫａｎＭＸ ｈｉｓ３□１ ｌｅｕ２□０ ＭＥＴ１５ ｌｙｓ２□０ ｕｒａ３□０）、４．ＹＲＷＳ１３（ＭＡＴａ ｓｎｑ２□：：ＫａｎＭＸ ｙｏｒ１□：：ＫａｎＭＸ ｈｉｓ３□１ ｌｅｕ２□０ ＭＥＴ１５ ｌｙｓ２□０ ｕｒａ３□０）、５．ＹＲＷＳ４４（ＭＡＴａ ｐｄｒ５□：：ＫａｎＭＸ ｓｎｑ２□：：ＫａｎＭＸ ｙｏｒ１□：：ＫａｎＭＸ ｈｉｓ３□１ ｌｅｕ２□０ ｍｅｔ１５□０ ｌｙｓ２□０ ｕｒａ３□０）。

次に、ハイスループットスクリーニングで、成長阻害を減少または除去する、すなわち酵母培養の成長を起こす生物学的分子および化学分子を検索することができる。これまでに説明されている全ての技術は、有能な当業者には既知である。

上述したように、酵母において、全ての外因性キナーゼの約３０％が成長阻害を起こす。それゆえに、過剰発現された約７０％のキナーゼ全ての成長阻害は、起こるとしてもわずかである。全てのタンパク質キナーゼの化合物スクリーニングのためのプラットフォーム技術として酵母の成長阻害の原理を利用するためには、残りの７０％のタンパク質キナーゼも成長阻害を起こさなければならない。この目的のために本発明が必要である。

望ましいタンパク質キナーゼは、選択された酵母発現ベクター、この実施例においてはｐ４１３ＧＡＬ１（Ｄ．Ｍｕｍｂｅｒｇ等（１９９４年），全長、および、Ｃ末端タグ（例えばＭＹＣタグ）を有する）にクローニングされる。標準的なプロトコールによる酢酸リチウム法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓを参照）を用いて形質転換し、適切な培地で培養した後、酵母における外因性キナーゼの過剰発現は、標準的なプロトコールに従ってガラクトースを３０℃で４〜６時間加えることによって（２０ｇ／ｍｌの培地）誘導される。キナーゼの発現は、標準的なプロトコールによる、選択されたタグ（例えば抗ＭＹＣ：ＡＢ１３６４（ケミコン（Ｃｈｅｍｉｋｏｎ））、または、Ｍ５５４６（シグマ（シグマ（Ｓｉｇｍａ）））；抗ＨＡ：ＨＡ−１１−Ａ（バイオトレンド（Ｂｉｏｔｒｅｎｄ））、または、５５１３８（ＩＣＮ））に対する抗体を用いた免疫ブロットによってチェックされる。

酵母における発現を免疫学的に検出した後、酵母における外因性キナーゼの発現によって起こった遺伝子発現における改変（代償として差異的な調節）をＤＮＡマイクロアレイを用いて研究する。ＤＮＡマイクロアレイは、特異的オリゴヌクレオチドを化学的に結合させた支持体材料である。この場合、個々のオリゴヌクレオチドは、それぞれ個々の遺伝子を示す。ＤＮＡマイクロアレイは、酵母ゲノム全体の現状の発現パターンをカバーできるツールとして用いられる。このタイプの実験に関して、キナーゼで形質転換された酵母と、コントロールとしてｍｏｃｋで形質転換された（空のプラスミド）酵母とが比較される。両方の株からトータルＲＮＡが標準的な方法によって製造される。次に、４５℃で１６時間、ＲＮＡを、チップに結合したオリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせる（マイクロアレイ上で）。キナーゼで形質転換された酵母ＲＮＡと、ｍｏｃｋで形質転換された酵母ＲＮＡとの直接的な比較により、過剰発現されたタンパク質キナーゼによって代償として差異的な様式で調節された酵母遺伝子が明らかになる。本発明者等の研究により、例えば外因性タンパク質キナーゼの過剰発現への遺伝学的な関与により、酵母遺伝子に関する特定数のＲＮＡがアップレギュレートされ、特定数のＲＮＡをダウンレギュレートされることが示されている（表１）。これは、ヒトキナーゼＰＡＫ１の例で行われた。

表１：２種の遺伝子がアップレギュレートされ、１１種の遺伝子がダウンレギュレートされる。

さらに、多くのアップレギュレートされた遺伝子は、代償としての理由でアップレギュレートされていることを、本発明者等が初めて示すことができた。この場合、Ｓ．セレビジエ野生株（Ｗ３０３−１ａ（バックグラウンド株、または、供給源））を、サッカロミセス・セレビジエ遺伝子ｃｌａ４（□ｃｌａ４）（ＹＥＬ２５２）が欠失した株と比較した。遺伝子におけるＣＬＡ４の欠失以外は、両方の株は同質、すなわち同一である。２つの異なる株（Ｗ３０３−１ａおよびＹＥＬ２５２）からのＲＮＡ標本を直接比較すると、酵母ゲノムの１１０種の異なるＲＮＡがアップレギュレートされたものとして判明した（表２）。

表２：５６種の遺伝子がダウンレギュレートされた（データは示さず）。この場合、特定の遺伝子に関するＲＮＡコピー数の増加は、代償としての理由で起こるものと考えられる。この特定の実施例において、「代償としての」とは、ＣＬＡ４の機能を完全に、または部分的に補うことができる遺伝子の発現を増加させることによって、ＣＬＡ４遺伝子の欠失によって起こった遺伝学的に改変された株における異常を少なくすることを意味する。この命題を証明するために、いくつかのアップレギュレートされた遺伝子をさらなる実験のために選択した（表３の「第二の欠失」を参照）。

表３：この目的のために、それぞれの場合においてアップレギュレートされた遺伝子に欠失を有するＭＡＴ□酵母株（これは、例えばＥＵＲＯＳＣＡＲＦまたはＲｅｓｅａｒｃｈ Ｇｅｎｅｔｉｃｓから得ることができる）を選択した。これらの欠失は、マーカー遺伝子によってマークされており、すなわち例えば抗生物質耐性または必要な成長因子（例えば特定のアミノ酸）に関するマーカー遺伝子は、特定の酵母ゲノムに統合されている。標準的な酵母の遺伝学的方法に従って、選択された欠失株をＣＬＡ４欠失株（ＹＥＬ２５２，ＭＡＴａ）と交雑した（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ：Ａ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｃｏｕｒｓｅ Ｍａｎｕａｌ（１９９４年））。

交雑の後、二倍体酵母を選択し、次にこれらを誘導して胞子を形成させた。これは、１つの二倍体酵母細胞からの４つの一倍体胞子の生成を含み、これらは、発芽のために４つの一倍体酵母クローンに分割することができる。従って、二倍体株の遺伝子が、新たに分配される。全ての場合の２５％において、新しい一倍体クローンに、異なる開始株由来の２種の欠失が融合されることとなる。これは、様々な選択マーカーによって容易にモニターすることができる。

この標準的な方法を用いて、１３種の異なる二重欠失の作製を試みた。１０のケースにおいてのみ二重欠失が確立されたが、３のケースにおいては二重欠失は全く起こらなかった（表３の「致死性」）。３のケース全てにおいて、４０個の子嚢を試験した。従って、両方の欠失の組合わせにより、影響を受けた胞子が致死性になることは明らかである。また、これらは、人工的に致死性でもある。１３のケース全てにおいて、二重欠失は、人工的に致死性であるか、または、その他の人工的な表現型を示すかのいずれかであることが実証された（表３）。この研究により、ＣＬＡ４の欠落によって起こる異常を相殺するために、影響を受けた遺伝子がアップレギュレートされるという命題が確認される。研究されたケースにおいて（１３種の二重欠失）、３つの組合わせ、従って全ての可能な二重欠失の２３％が、人工的な致死性を示した、ということが本発明にとって重要である（表３）。

□ｃｌａ４株を用いた実験において、１１０種の遺伝子が、アップレギュレートされた（表２）。同じ方法で、上述のアプローチでのヒトＰＡＫ１の過剰発現により、２種の遺伝子のｍＲＮＡがアップレギュレートされた（表１）。その結果、これらの遺伝子も相殺的な理由でアップレギュレートされる。アップレギュレートされた遺伝子が少数であり、それと関連して、人工的に致死性の組合わせの成功率が低いことから、我々は、アップレギュレートされた遺伝子における欠失の組合わせにおいて、人工的に致死性の表現型を示す株（表１のＹＭＲ０９６ＷまたはＨＩＳ３と）を同定し、ヒトＰＡＫ１の発現を同定する追跡実験を省略した。その代わりに、ヒトＰＡＫ１の極度に活性な突然変異体（すなわちヒトＰＡＫ１□ＣＲＩＢ）を作製した。標準的な方法を用いて、この突然変異体を酵母に再度形質転換させた。高いキナーゼ活性のために、このタンパク質は、酵母で成長阻害を起こした。低分子量の物質を分析するための適切な株が同定された。目的は達成された。それでもなお本発明の確実性を裏付けるために、この場合においてもＤＮＡマイクロアレイを用いた差異的な発現プロファイルを記録した（表４）。

表４：高いキナーゼ活性のために、５５種の異なる酵母遺伝子が、代償としてアップレギュレートされ、３種の遺伝子がダウンレギュレートされた（示さず）。ＰＡＫ１突然変異体の高い活性が、酵母における成長阻害を起こには不十分であった場合、欠失株をアップレギュレートされた遺伝子に関して分析することが可能となる。ＰＡＫ１突然変異体は、特定の欠失株で発現されたはずである。人工的な表現型における成功の２３％の変化の値に基づき、次に、ヒトＰＡＫ１突然変異体の発現は、約１３種の酵母株で成長阻害を起こすと考えられる。従って、可能性のあるキナーゼ阻害剤を分析するための株が同定され得る。

酵母におけるヒトキナーゼを分析する場合、ヒトキナーゼは、ガラクトース依存性な様式でプラスミドから発現されるため、開始株は交雑していなくてもよい。前記プラスミドは、特定の欠失株に形質転換されていればよく、キナーゼの発現は誘導が必要である。分析される株の全てのケースの２３％において、成長阻害（致死性）を観察できると思われる。成長阻害された株は、特定の欠失のために、プラスミドでコードされたタンパク質キ
ナーゼを代償として発現しなくなる。それゆえに、これらの系をＨＴＳに送ることができる。

ＤＮＡマイクロアレイ実験と組合わせた、特定の野生型キナーゼの過剰発現は、成長阻害を起こすには不十分のはずであり（野生型ＰＡＫ１について上述した通り，表２を参照）、続いて、特定のキナーゼの突然変異体が製造され、前記野生型キナーゼの代わりに用いられる（または、ＤＮＡマイクロアレイを用いる遺伝子発現実験のために）。これらの突然変異体は、極度に活性な突然変異体を得ることによるランダム変異誘発の原理に従って製造することができる。変異誘発について、Ｔｕｇｅｎｄｒｅｉｃｈ等（２００１年）の方法に従って、Ｃ末端タグを含むキナーゼコンストラクトが用いられる。

従って、初めて、かつ驚くべきことに、本発明者等の研究により、代償として差異的に調節された遺伝子の欠失は、成長阻害を起こすことができ、それに関連した、タンパク質キナーゼのための標準化したプラットフォーム分析の設計を見出すことを可能にすることが示された。実際の実験において、２３％の頻度で成長阻害が検出された。次に、プラスミドでコードされたタンパク質キナーゼで形質転換した後に成長阻害を示す欠失株は、上述したように、最適化することによってＨＴＳに送ることができる（様々な薬物輸送体ノックアウトの試験）。一例として図１のポイント１、４、６〜１０に基づき、本発明を説明する。

代償として差異的に調節された遺伝子の欠失における交雑とは別に、それらの欠失はまた、その他の方法（例えば、キナーゼを発現する酵母それ自体のゲノムのノックアウト）を用いて行われた。しかしながら、酵母において、欠失における交雑またはゲノムのノックアウトによる、代償として差異的に調節された遺伝子の除去が、手順が簡便であるために特に有利である。それに対して、その他の生物では、その他の方法がより適切な場合もある。従って、真核細胞系の例で、および、多細胞生物の場合において（例えばショウジョウバエおよびＣ．エレガンス）、ＲＮＡｉのようなアンチセンス法の適用がより適切である。個々の生物それぞれの場合において適切な手段の選択は、当業者の能力の範囲内である。

本発明のプラットフォーム分析は、ホモジニアスな全てのタンパク質キナーゼのＨＴＳを可能にし（ヒトＰＡＫ１に基づき説明した通り）、従って費用効率の高い分析系である。このシステムはまた、化合物スクリーニングにおいてＩＣ₅₀値を決定するのにも適している。

実施例で説明した通り、遺伝子発現実験によって、外因性キナーゼの発現によって抑制された遺伝子のＲＮＡも同定される。前記抑制された遺伝子のプロモーターは、ＨＴＳにおいてレポーターとして作用する。この目的のために、酵母プロモーターを、「レポーター遺伝子」、例えばβ−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、成長マーカー、例えばＨＩＳ３、ＵＲＡ３、ＬＥＵ２またはＴＲＰ１等と融合させる。これらのコンストラクトは、ＨＴＳのために酵母株に形質転換される。それにより、これらは、影響を受けた株における成長阻害を除去する化合物に関する成長マーカーとして作用する。

実施例２：本プラットフォーム分析はまた、「複合系」として用いることができる。複合系は、様々なタンパク質またはタンパク質フラグメント（例えばキナーゼ）を、同じ分析で、１つの反応混合物で同時に分析することを意味する。この目的のために、まず、個々の表現型解析された酵母株を構築する。外因性タンパク質キナーゼは、標準的な方法を用いて統合される（上記を参照）。次に、これらの酵母株を混合して、ホモジニアスな培養物を得る。ホモジニアスな酵母株混合物においてタンパク質キナーゼが発現されることにより、成長阻害が起こるが、これは、表現型解析された酵母株において、それぞれ個々のキナーゼの発現それ自体により成長阻害が起こるためである。ＨＴＳは、少なくとも１つの酵母株の成長を起こす化合物を同定する。次に、前記化合物に関連するキナーゼを選定することが必須である。これは、「コロニーＰＣＲ」方法（Ａ．Ｊ．Ｐ．ＢｒｏｗｎおよびＭ．Ｔｕｉｔｅ（１９９８年））によって達成される。この目的のために、説明に従って、成長中の酵母培養物から数μｌを溶解させ（Ａ．Ｊ．Ｐ．ＢｒｏｗｎおよびＭ．Ｔｕｉｔｅ（１９９８年））。様々なタンパク質キナーゼに特異的なプライマーを用いた定量ＲＴ−ＰＣＲにより、ゲノムＤＮＡ（の混合物）由来の関連する阻害されたキナーゼ（統合されたタンパク質キナーゼを含む）が疑いの余地なく同定される。従って、１回のスクリーニングで、等量の様々な酵母株を混合することによって様々なキナーゼを分析することが可能である。その利点は、費用と時間を莫大に節約できることである。

この技術は、タンパク質キナーゼだけでなく、酵母において転写反応を起こすあらゆるタンパク質または物質に対しても適用することができる。

このプラットフォーム分析は、従来技術の分析用の被検体において、例えば、ホモジニアスな全てのタンパク質キナーゼ（異種発現によりすでに表現型をすぐ生じるものに加えて）のＨＴＳを可能にし、従って費用効率の高い分析系である。この系はまた、化合物スクリーニングにおいてＩＣ₅₀値を決定するのに適している。

この技術は、タンパク質キナーゼだけでなく、酵母において転写反応を起こす全てのタンパク質または物質に対しても適用可能である。

方法：
遺伝子操作については、Ｓａｍｂｒｏｏｋ等（１９８９年）の、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第二版（コールドスプリングハーバーラボラトリープレス（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ），コールドスプリングハーバー，ニューヨーク州，第５４５頁）による標準的な方法を用いた。

酵母（サッカロミセス・セレビジエ）に関する成長条件、交雑条件および遺伝子操作は、Ｇｕｔｈｒｉｅ，Ｃ．およびＧ．Ｒ．Ｆｉｎｋ（１９９１年）の、Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，第１９４巻，Ｊ．Ｎ．ＡｂｅｌｓｏｎおよびＭ．Ｉ．Ｓｉｍｏｎ編（サンディエゴ，カリフォルニア州：アカデミックプレス社）に従って行った。アフィメトリックス実験（「遺伝子発現解析」）は、Ｋｌｅｂｌ等（２００１年）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２８６，７１４〜７２０に正確に従って行った。

参考文献：
Brown, A.J.P. and M. Tuite (1998), PCR-Based Gene Targeting in Saccharomyces cerevisiae. Methods Microbiol. 26, 67-81.
Methods in Yeast Genetics; A Cold Spring Harbor Course Manual; 1994 Edition; Kaiser, C., Michaelis, S., and A. Mitchell; Cold Spring Harbor Laboratory Press.
Mumberg, D., Mueler, R. and M. Funk (1994). Regulatable promoters of Saccharomyces cerevisiae: comparison of transcriptional activity and their use for heterologous expresson. Nucl. Acids Res. 22, 5767-5768.
Tugendreich, S., Perkins, E., Couto, J., Barthmaier, P., Sun, D., Tang, S., Tulac, S., Nguyen, A., Yeh, E., Mays, A., Wallace, E., Lila, T., Shivak, D., Prichard, M., Andrejka, L., Kim. R. and T. Melese (2001). A streamlined process to phenotypically profile heterologous cDNAs in parallel using yeast cell-based assays. Genome Res. 11, 1899-1912.

キナーゼ阻害のハイスループットスクリーニングのためのＳ．セレビジエの設計を示す。

Claims (13)

1. 薬物スクリーニングのために、遺伝学的に改変された非ヒト生物を製造する方法であって、
   ａ）非ヒト生物の遺伝学的改変によって、少なくとも１種のタンパク質またはタンパク質フラグメントの発現を起こす工程
   ｂ）該非ヒト生物の遺伝子発現パターンを、コントロール生物の遺伝子発現パターンと比較して解析する工程
   ｃ）上記タンパク質またはタンパク質フラグメントの発現による表現型の変化を相殺する遺伝子を同定する工程であって、該遺伝子はその発現をアップまたはダウンレギュレートさせることにより該発現による表現型の変化を相殺するものである、工程
   ｄ）ｃ）において同定された遺伝子の発現がアップレギュレートされている場合は、その発現を減少または除去することにより、または該遺伝子の発現がダウンレギュレートされている場合は、その発現を増強することにより、該遺伝学的に改変された非ヒト生物における表現型の変化を引き起こす工程、
   を含む、上記方法。
2. 遺伝学的改変が、非ヒト生物にとって内因性および／または外来の少なくとも１種のタンパク質またはタンパク質フラグメントの発現を起こす、請求項１に記載の方法。
3. 遺伝学的改変が、非ヒト生物にとって内因性の少なくとも１種のタンパク質の発現の減少または除去を起こす、請求項１または２に記載の方法。
4. 改変された遺伝子の発現が、誘導性である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
5. 遺伝学的改変が、タンパク質またはタンパク質フラグメントを誘導によって発現できるベクターを導入することを含む、請求項４に記載の方法。
6. ベクターが、ガラクトース、銅テトラサイクリン誘導性ベクター、または、その他の同等の誘導性ベクターである、請求項５に記載の方法。
7. 遺伝学的改変が、ノックアウトを含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
8. 非ヒト生物が、ショウジョウバエ、Ｃ．エレガンス、原核細胞または真核細胞である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
9. 細胞が、酵母細胞である、請求項８に記載の方法。
10. 細胞が、Ｓ．セレビジエ株の酵母細胞である、請求項８に記載の方法。
11. 遺伝子発現パターンが、ＤＮＡまたはタンパク質マイクロアレイを用いて解析される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
12. 相殺的に発現された遺伝子のノックアウトが、相殺的に発現された遺伝子のコード配列の少なくとも一部を、レポーター遺伝子のコード配列、または、レポーター遺伝子配列の検出されるのに十分な部分で置き換えることによって行われる、請求項１に記載の方法。
13. 相殺的に発現された遺伝子の減少または除去により、非ヒト生物の成長阻害が起こる、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。

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