JP4090090B2 - 選択マーカー遺伝子を持たない形質転換体の作製方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、酵母の部位特異的組換えを用いて、選択マーカー遺伝子が欠失した形質転換体を作製する方法に関する。この方法を利用することにより、目的とする遺伝子を酵母に導入した後に、選択マーカー遺伝子を有しない酵母の形質転換体を得ることができる。
【０００２】
【従来の技術】
現在までに多くの遺伝子導入方法が報告されているが、遺伝子導入効率が低いため、それらのいずれの方法も組換え体を選択するマーカーが必要である。選択マーカーとしては酵母などで用いられている栄養要求性の回復などがあるが、一般的には抗生物質などの薬剤に対する抵抗性遺伝子が用いられる。しかしながら、形質転換体を選択した後は組換え体の実用化における安全性の面などから、選択マーカー遺伝子を取り除くことが望ましい。また、効率良く利用できる選択マーカー遺伝子の種類が少ないことから同一個体を繰り返し形質転換するためにはマーカー遺伝子の再利用を行うことが望まれる。
【０００３】
これらの問題を解決するために形質転換体から選択マーカー遺伝子を除くいくつかの方法が開発されている。例えば、コトランスフォーメーションの様に導入したい遺伝子と選択マーカー遺伝子を別のプラスミドまたはＤＮＡ断片上にのせ、別々の構成物として同時に細胞に導入する方法がある。この方法ではそれぞれの遺伝子が独立して存在するために、後代をとることにより、導入目的遺伝子を持つが選択マーカー遺伝子を持たない個体を得ることが可能である。また、トランスポゾンを利用する方法も開発されている。
【０００４】
これらは遺伝子導入後、トランスポゾンを働かせることにより、導入目的遺伝子と選択マーカー遺伝子の連鎖をなくし、その後に先ほどの例と同じく後代をとることにより、導入目的遺伝子を持つが選択マーカー遺伝子を持たない個体を得ることが可能である。しかしながらこれらの方法は後代をとる必要があり、操作が煩雑で時間がかかる。また、後代をとることによるばらつきが生じ、実用的ではない。
【０００５】
一方、部位特異的な組換えを利用した方法も開発されている。部位特異的組換えは組換えを行う酵素とその酵素が認識する特異的な塩基配列の２つの要素からなっており、組換え酵素は２個の認識配列間で組換えを引き起こすことが知られている。これらの組換えは認識配列の配置により、欠失、挿入、逆位などの現象を引き起こす。部位特異的な組換えとしてバクテリオファージＰ１由来のＣｒｅ／ｌｏｘ、出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae）由来のＦＬＰ／ＦＲＴ、醤油酵母（Zygosaccharomyces rouxii）由来のＲ／ＲＳ、そして、バクテリオファージＭｕ由来のＧｉｎ／ｇｉｘの４つが知られている。
【０００６】
これらの系を用いた部位特異的組換えは数多く報告されている（Odell, J. T. and Russell, S. H., In : Paszkowski ( ed.) Homologous Recombination and Gene Silencing in Plants, pp 219-270, 1994 、Kluwer Academic Publishers, Netherlands 、Yoder, J. I. and Goldsbrough A. P., Bio/Technology , 12, 263- 267, 1994 ）。例えば、出芽酵母のＦＬＰ／ＦＲＴの系を用いてメタノール酵母（Pichia pastoris ）でマーカー遺伝子の切り出しが行われている（Cregg, J. M. and Madden, K. R. , Mol. Gen. Genet. 219, 320- 323, 1989 ）。
【０００７】
彼らはＡＲＧ４遺伝子を選択マーカーとし、同方向に繰り返し配置したＦＲＴの間にＡＲＧ４遺伝子を組み込み、ａｒｇ４変異株のメタノール酵母を形質転換した。その後、組換え酵素の遺伝子であるＦＬＰを持つプラスミドを同じメタノール酵母に導入し、部位特異的な組換えを誘発し、選択マーカー遺伝子であるＡＲＧ４の切り出しに成功している。この様に部位特異的な組換えをマーカーの切り出しに利用できることは既に報告されているが、Cregg らの例にもみられるように、部位特異的な組換えを誘発するために最初の形質転換体が得られた後、組換え酵素の遺伝子を導入し、部位特異的組換えを誘導するという方法が採られている。
【０００８】
つまり、誘導には２回の形質転換が必要であり、さらにはそのための別の選択マーカーが必要となる。その他に報告されている部位特異的な組換えも組換え酵素遺伝子の導入は最初の形質転換体を得た後に行われており、再度の形質転換か、交雑による組換え酵素遺伝子の導入が必須である。
また、Araki らにより醤油酵母のプラスミドｐＳＲ１に部位特異的組換えの機構が存在することが明らかになっている（Araki, H., et al J. Mol. Biol., 182, 191-203, 1985）。
【０００９】
プラスミドｐＳＲ１は、６２５１ｂｐからなる環状プラスミドで、分子中に９５９ｂｐからなる一対の逆向き反復配列を持ち、この逆向き反復配列間で部位特異的組換えを起こすことが知られている。この逆向き反復配列内の組換え部位は、７ｂｐのスペーサー配列を挟む１２ｂｐの短い逆向き反復配列から構成され、さらに、片側には、４個の同じ１２ｂｐ配列の繰り返しが続く。部位特異的組換えは、プラスミド自身にコードされた組換えを行う酵素（Ｒ蛋白質）が、逆向き反復配列内の組換え部位に存在する特異的な塩基配列であるＲ認識配列に結合することによって起こる。
【００１０】
なお、Ｒ認識配列（ＲＳ配列）としては、７ｂｐのスペーサー部分と１２ｂｐの逆向き反復配列からなる３１ｂｐの配列が知られている（Matsuzaki, H., et al. Biosci. Biotech. Biochem., 58, 1632-1637, 1994）。この配列を配列表・配列番号１に示す。しかしながら、３１ｂｐのＲ認識配列を用いて部位特異的組換えを行うと、組換え後の構造として、染色体あるいはプラスミドＤＮＡ中に部位特異的酵素の認識配列が残り、目的としない組換えを誘導する可能性があることから実用的ではない。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
そこで、本発明者らは、部位特異的組換えにより選択マーカー遺伝子を除去した後に残存する配列が、Ｒ遺伝子産物により認識されにくい配列となるＤＮＡ構成物を作製し、該ＤＮＡ構成物を用いて形質転換を行うことにより、選択マーカー遺伝子を欠失した形質転換体を作製する方法を提供することを課題とした。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
上記の課題を解決するため、本発明は、誘導性プロモーターの制御下に配置されたＲ遺伝子と発現可能な選択マーカー遺伝子とを挟む、同方向に配置された１対のＲ認識配列を含んで成るＤＮＡ断片の両端に、酵母染色体ＤＮＡとの間で組換えが可能なＤＮＡ断片が連結されているＤＮＡ構成物において、前記Ｒ認識配列が次の塩基配列：
【００１３】
【化２】
【００１４】
を含んで成るか又はこれと実質的に同一な配列を含んで成り、但し前記Ｒ遺伝子の近傍に位置するＲ認識配列は該Ｒ遺伝子に近接する側とは反対側に存在する逆向き反復配列のスペーサー配列から遠位の側の１０個以下の塩基が欠けており、そして選択マーカー遺伝子の近傍に位置するＲ認識配列は該選択マーカー遺伝子に近接する側とは反対側に存在する逆向き反復配列のスペーサー配列から遠位の側の１０個以下の塩基配列が欠けていることを特徴とするＤＮＡ構成物を提供する。
【００１５】
【発明の実施の形態】
本発明においては、１対のＲ認識配列の内、Ｒ遺伝子（例えば図７におけるＲｇｅｎｅ）の近傍に位置するＲ認識配列（例えば図７におけるＲＳ４）は、該Ｒ遺伝子に近接する側とは反対側に存在する逆向き反復配列（例えば化１における逆向き反復配列（２）；ちなみに図７におけるＲＳ４は左側が３′−末端であり、右側が５′−末端である）において、スペーサー配列から遠位の側の１０個以下の塩基配列が欠けている。
【００１６】
また、他方のＲ認識配列は、選択マーカー遺伝子（例えば、図７における Geneticin耐性遺伝子）の近傍に位置し（例えば、図７においてＲＳ３０４）、該選択マーカー遺伝子に近接する側とは反対側に存在する逆向き反復配列（例えば化１に示す逆向き反復配列（１）；ちなみに、図７におけるＲＳ３０４は左側が３′−末端であり、右側が５′−末端である）において、スペーサー配列から遠位の側の１０個以下の塩基配列が欠けている。
【００１７】
１例として、配列番号：４に示すＲＳ４は、化１（配列番号：１）に示す配列の内、１２個の塩基から成る逆向き反復配列（２）の内の６塩基が欠けている。また、配列番号：１６中の５′−末端の５塩基及び３′−末端の５塩基（これらは制限酵素認識部位であってＲ認識配列の部分ではない）を除く中央の３ブロックの配列が図７におけるＲＳ３０４配列であり、この配列においては、化１（配列番号：１）に示す逆向き反復配列（１）を構成する１２個の塩基の内６個が欠けている。本発明のＲ認識配列において、上記の意味における欠けることができる塩基数は、スペーサー配列に隣接する反復配列を構成する塩基（計１２個）の内の１０個以下であり、例えば８個まで、好ましくは６個までである。塩基が１０個より多く欠けると、ＤＮＡ組換えの可能性が極めて低くなり好ましくない。
【００１８】
上記のごとく、本発明のＲ認識配列は、化１（配列番号：１）に示す配列を含んで成るが、その一方の側の逆向き反復配列において、上記のごとく短縮されている。しかしながら、短縮された逆向き反復配列とは反対側の逆向き反復配列では１２個の塩基がそのまま維持されていることが望ましく、さらに１〜４個の反復配列が連結されて延長されていてもよい。ちなみに、前記のごとく、天然のＲ認識配列においては、化１（配列番号：１）に示す配列の各端が、さらに４個づつの反復配列により延長された構造を有しており、本発明のＲ認識配列においても、前記のごとく短縮された反復配列の側とは反対の反復配列は、天然配列と同様に複数回反復していてもよい。
【００１９】
本発明のＲ認識配列は、上に定義した配列を有するものの他に、それと実質的に同じ塩基配列を有するものも含まれる。ここで「実質的に同じ配列とは、上記に定義した配列に対して、スペーサー配列以外の部分において、およそ１個の塩基の置換、欠失又は付加により修飾されている塩基配列を意味する。
上記のごとき一対のＲ認識配列を有するＤＮＡ構成物に対して、Ｒ遺伝子産物が作用すれば、例えば図１０に示すようにＤＮＡの組換えが生ずる。すなわち、１対のＲ認識配列（例えば図７におけるＲＳ４とＲＳ３０４は図９に示すごとく配置され、図１０の（Ａ）に示すごとく、ＲＳ４配列とＲＳ３０４配列がオーバーラップする領域内（例えば、図１０（Ａ）において２本の交線で示す位置）において組換えが生ずる。
【００２０】
その結果、Ｒ遺伝子及び選択マーカー遺伝子が除去されると共に、一方のＲ認識配列（例えばＲＳ４）の短縮された側の部分と、他方のＲ認識配列（例えば、ＲＳ３０４）の短縮された側の部分とが融合した配列が再構成される。この再構成された配列は、スペーサー配列の両端に短縮された逆向き反復配列を有しており、例えばＲＳ４配列とＲＳ３０４配列とからは、図１０（Ｂ）（配列番号：５）に示すＲＳ４Ｗ配列が生ずる。
【００２１】
実施例１に示すごとく、スペーサー配列を中心にして、一方の側の逆向き反復配列のみが短縮されたＲ認識配列はＲ遺伝子産物の作用によって組換えを生ずるが、両側の逆向き反復配列が短縮された場合（例えば、ＲＳ４Ｗ配列）にはＲ遺伝子産物の作用による組換が生じにくくなる。
Ｒ遺伝子を発現させるための誘導性プロモーターとしては、酵母細胞中で機能する任意の誘導性プロモーターを使用することができ、例えばガラクトースにより誘導されるＧＡＬ１プロモーター、銅により誘導されるＣＵＰ２プロモーター、熱ショックにより誘導される熱ショック蛋白質遺伝子のプロモーター、低リン酸濃度により誘導されるＰＨＯ５プロモーター等が使用可能である。
【００２２】
また、選択マーカー遺伝子としては、酵母において使用される任意の選択マーカー遺伝子を用いることができ、例えばゲネチシン含有培地で選択可能なゲネチシン耐性遺伝子、セルレニン耐性遺伝子等を使用することができる。
酵母の染色体との間で組換えが可能なＤＮＡ断片は、酵母染色体上の遺伝子の一部分と相同性を有するＤＮＡ断片であり、酵母染色体上の遺伝子としては、その遺伝子が破壊されても酵母の増殖が阻害されない遺伝子であって、例えばプロテアーゼＡ遺伝子、リボソームＤＮＡ遺伝子、ＣＹＣ７遺伝子等、が挙げられる。
【００２３】
本発明はまた、上記のＤＮＡ構成物を用いる、酵母の形質転換方法を提供する。この方法においては、
【００２４】
（１）前記のＤＮＡ構成物を酵母細胞に導入し、該ＤＮＡ構成物の両端に存在する酵母の染色体との間で組換え可能なＤＮＡ配列と酵母染色体ＤＮＡとの間の組換えにより、該ＤＮＡ構成物を酵母染色体に組み込み、
（２）前記発現可能な選択マーカー遺伝子の発現により、前記ＤＮＡ構成物が酵母染色体に導入された酵母細胞を選択し、
（３）前記誘導性プロモーターを誘導することによりＲ遺伝子を発現せしめ、これによって前記１対のＲＳ配列間において組換えを起こし、前記誘導性プロモーターの制御下に配置されたＲ遺伝子と発現可能な選択マーカー遺伝子とを切除する。
【００２５】
この形質転換操作は複数回反復することができ、これにより、下記に説明するように、同一の選択マーカーを用いて多数の目的遺伝子を酵母の染色体に導入することができる。
上記の方法において、ＤＮＡ構成物はそれ自体からなる、もしくはそれ自体を含むＤＮＡ断片として、又は該ＤＮＡ構成物が挿入されたプラスミドの形で酵母細胞中に導入することができる。この導入は、すでに知られている任意の方法、例えば酢酸リチウム法、塩化リチウム法、プロトプラスト法等により行うことができる。
【００２６】
同方向に配置したＲ認識配列の間にＲ遺伝子と発現可能な選択マーカー遺伝子を配置したＤＮＡ構成物、例えばＤＮＡ断片、プラスミド、その他のベクター等を用いて形質転換を行うが、その際、前記のごとく定義される１対のＲ認識配列を用いることにより、組換え後に残存する配列がＲ遺伝子により認識されにくい配列になり、目的としない組換えを誘導する可能性が低減し、形質転換体から選択マーカー遺伝子を特異的に除去し、目的とする形質転換体を得ることができる。さらに詳しくは、Ｒ認識配列として、５’側のＲ認識配列の５’側を１ｂｐないし１０ｂｐ欠失させたもの及び／又は３’側のＲ認識配列の３’側を１ｂｐないし１０ｂｐ欠失させたものを用いることにより、組換え後に残存する配列が、Ｒ遺伝子により認識されにくい配列になり、目的とする形質転換体を得ることができる。
【００２７】
本発明の方法を用いることにより、後代をとったり、再度の形質転換や交配などの操作を伴うことなく、選択マーカー遺伝子の除去が可能となった。また、選択マーカー遺伝子に関する安全性評価を省略することも可能となった。さらに、選択マーカー遺伝子が欠失した形質転換個体を用いて、再び同じ選択マーカー遺伝子を用いた形質転換が可能となり、複数の遺伝子を繰り返し導入することも可能となる。
本発明の方法は、例えば有用な蛋白質をコードする目的遺伝子Ａを酵母の染色体に導入する場合に、次のようにして用いることができる。
【００２８】
本発明のＤＮＡ構成物においては、前記のごとく配列された１対のＲ認識配列（ＲＳ配列）を含んで成るＤＮＡ断片の両端に、１対のＲ認識配列を挟むように、酵母の染色体ＤＮＡとの間で組換えが可能なＤＮＡ断片（酵母染色体組換え領域と称する場合がある）が直接に又は間接に連結されている。Ｒ認識配列と右又は左ボーダーとが間接的に連結されている場合には、それらの間に酵母の染色体に組み込むべき目的とする遺伝子が挿入されている（図１１を参照のこと）。
このＤＮＡ構成物が酵母に導入されれば、このＤＮＡ構成物の酵母染色体組換え領域と酵母の対応する染色体遺伝子との間で組換えが生じ、ＤＮＡ構成物が全体として酵母染色体ＤＮＡに組み込まれる。
【００２９】
次に、この酵母を、Ｒ遺伝子のプロモーターを誘導する条件下で培養すればＲ遺伝子産物が生産され、これがＲ認識配列（ＲＳ配列）に作用して、１対のＲ認識配列間で前記のごとき組換えが生じ、これら１対のＲ認識配列に挟まれた領域（Ｒ遺伝子及びマーカー遺伝子を含む）が除去され、組換えにより融合した（両端が短縮された）Ｒ認識配列と酵母染色体組換え領域との間の目的遺伝子が酵母染色体遺伝子に組み込まれたまま残る。そして、上記の両端が短縮されたＲ認識配列はもはや組換えを生じないから、挿入された目的遺伝子は酵母染色体中に安定に維持される。
【００３０】
すなわち、本発明によれば、目的遺伝子が酵母染色体に挿入された後マーカー遺伝子（及びＲ遺伝子）が除去され、且つＲ認識配列が機能できなくなる。従って、目的遺伝子を１回導入した後、同じマーカー遺伝子を含有する遺伝子導入用ベクター（本発明のＤＮＡ構成物）を用いて、さらなる目的遺伝子の導入を行うことができる。
【００３１】
【実施例】
以下に本発明を実施例に基づいて詳細に説明するが、それらの実施例は例示を目的として提供されているだけであって本発明の範囲を限定することを意図しているものではない。実験の手順は特に記述しない限り、SambrookらのMolecular Cloning （Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 ）に従った。
実施例１． 部位特異的組換え酵素認識配列の解析
（１）プラスミドの構築
Ｒ遺伝子発現用プラスミドとして、ｐＨＭ１５３（Matsuzaki, H., et al., J. Bacteriol., 172, 610-618, 1990）のＲ遺伝子とＧＡＬ１プロモーターを含む HindIII−Sal I 断片を、ＹＥｐｌａｃ１９５（Gietz, R. D. and Sugino, A., Gene, 74, 527-534, 1988）のマルチクローニングサイトのHindIII ーSal I 間に挿入し、Ｕｒａ+ 形質でＲ遺伝子の上流にＧＡＬ１プロモーターを持つＲ蛋白質生産プラスミドｐＨＭ９９９を作製した。これを図１に示す。
【００３２】
次に、組換え検出用のプラスミドとして、ＬＥＵ２遺伝子の両端に２個のＲＳ配列（おのおのＲＳ−Ａ、ＲＳ−Ｂと称する）部位を持つプラスミドｐＳＲＴ１１７（Araki, H., et al., J Mol. Biol., 225, 25-37, 1992 ）のＬＥＵ２遺伝子を含むHindIII −BglII 断片を、ＹＣｐｌａｃ２２（Gietz, R. D. and Sugino, A., Gene, 74, 527-534, 1988）のＴＲＰ１遺伝子を含むHindIII −BamHI 断片に連結し、Ｔｒｐ+ Ｌｅｕ+ 形質のｐＯＤＡ２を作製した。これを図２に示す。
【００３３】
このプラスミドはＲ遺伝子の働きにより２個のＲＳ間で組換えが起こるとＬＥＵ２遺伝子を含む５．７ｋｂのプラスミドとＴＲＰ１遺伝子を含む４．５ｋｂのプラスミドに分かれる。ＬＥＵ２遺伝子を含むプラスミドは、選択圧をかけない状態においては自己複製能を持たないので細胞から脱落し、細胞はＬｅｕ- の表現型を示す。つまり、Ｒ遺伝子による組換えはこれら細胞のロイシンの要求性を調べることによってわかる。
【００３４】
次に、ｐＯＤＡ２のＲＳ−Ａの野生型ＲＳを、制限酵素部位HindIII と、XbaIまたはBamHI とを利用し、合成ＤＮＡにより作製された種々のＲＳに置き換えたプラスミドを作製した。用いた合成ＤＮＡの配列は以下に示す通りであるが、４個の繰り返し配列を欠失させたＲＳ１を基にして、ＲＳ１の逆向き反復配列の一方を徐々に欠失させた種々のＲＳ、その合成段階においてできたと考えられる点突然変異を持つＲＳ１Ｍ、ＲＳ２Ｍ、ＲＳ４ＭおよびＲＳ１の逆向き反復配列の両方の一部を欠失させたＲＳ４Ｗである。
【００３５】
ＲＳ１ TTGATGAAAGAA TACGTTA TTCTTTCATCAA （配列番号：１）
ＲＳ２ TTGATGAAAGAA TACGTTA TTCTTTCATC （配列番号：２）
ＲＳ３ TTGATGAAAGAA TACGTTA TTCTTTCA （配列番号：３）
ＲＳ４ TTGATGAAAGAA TACGTTA TTCTTT （配列番号：４）
ＲＳ４Ｗ AAAGAA TACGTTA TTCTTT （配列番号：５）
ＲＳ５ TTGATGAAAGAA TACGTTA TTCT （配列番号：６）
ＲＳ６ TTGATGAAAGAA TACGTTA TT （配列番号：７）
ＲＳ７ TTGATGAAAGAA TACGTTA （配列番号：８）
ＲＳ１Ｍ TTGATGAAAGAA TACGTTA T CTTTCATCAA （配列番号：９）
ＲＳ２Ｍ TTGATGAAAGAA TA GTTA TTCTTTCATC （配列番号：１０）
ＲＳ４Ｍ TTGATGAAATAA TACGTTA TTCTTT （配列番号：１１）
【００３６】
以上の配列は合成ＤＮＡ作製時に５′側にHindIII 認識部位を、３′側にXbaIまたはBamHI 認識部位とを導入し、同時に合成した逆鎖の配列とアニーリング後、ｐＯＤＡ２ のHindIII 部位と、XbaIまたはBamHI 部位との間に導入した。ＲＳ１、ＲＳ２、ＲＳ３、ＲＳ４、ＲＳ４Ｗ、ＲＳ５、ＲＳ６、ＲＳ７、ＲＳ１Ｍ、ＲＳ２Ｍ又はＲＳ４Ｍを導入したプラスミドをそれぞれｐＯＤＡ２１、ｐＯＤＡ２２、ｐＯＤＡ２３、ｐＯＤＡ２４、ｐＯＤＡ２４Ｗ、ｐＯＤＡ２５、ｐＯＤＡ２６、ｐＯＤＡ２７、ｐＯＤＡ２１Ｍ、ｐＯＤＡ２２Ｍ又はｐＯＤＡ２４Ｍと名付けた。 また、同様に、ｐＯＤＡ２のＲＳ−Ｂの野生型ＲＳを合成ＤＮＡにより作製された次のＲＳに置き換えたプラスミドを作製した。
【００３７】
ＲＳ２０１ TTGATGAAAGAA TACGTTA TTCTTTCATCAA （配列番号：１２）
ＲＳ２０１配列は合成ＤＮＡの作製時に５′側にＳａｌＩ認識部位を、３′側にＳａｃＩ認識部位を導入し、同時に合成した逆鎖の配列とアニーリング後、ｐＯＤＡ２のＲＳ−Ｂの野性型ＲＳに置き換えた。
ＲＳ−ＡをＲＳ１で置き換え且つＲＳ−ＢをＲＳ２０１で置き換えたプラスミドをｐＯＤＡ２１２０１と名付け、そしてＲＳ−ＡをＲＳ４で置き換え且つＲＳ−ＢをＲＳ２０１で置き換えたプラスミドをｐＯＤＡ２４２０１と名付けた。
【００３８】
（２）Ｉｎ ｖｉｖｏにおける組換え頻度の検討
まず、ｐＨＭ９９９によりＫＡ３１１Ａ株（ＭＡＴ ａ ｔｒｐ１ ｌｅｕ２ｕｒａ３ ｈｉｓ３）をＵｒａ+ に形質転換し、この株に２２５ｂｐの野生型組換え部位を持つｐＯＤＡ２を導入し、Ｕｒａ+ Ｔｒｐ+ Ｌｅｕ+ 株を選択した。この株をＵｒａ- Ｔｒｐ- の選択圧をかけた５０ｇ／Ｌ濃度のガラクトースまたはグルコース液体培地で３０℃で一晩培養し、ｐＨＭ９９９上のＲ遺伝子を発現させて、ｐＯＤＡ２内の２個のＲＳ間で組換えを誘導した。
【００３９】
培養液を希釈しＵｒａ- Ｔｒｐ- 選択培地に塗布し、２８℃で２日間静置培養した。これをＬｅｕ- 選択培地にレプリカしコロニーを数えた。Ｕｒａ- Ｔｒｐ- 選択培地で増殖し、Ｌｅｕ- 選択培地で増殖しない細胞が組換えが起こった細胞である。
また、同様に、実施例１（１）において作製した種々のプラスミドを、ｐＨＭ９９９を持つ株に導入し、ガラクトース培地及びグルコース培地における組換え頻度を調べた。結果を表１に示す。
【００４０】
【表１】
【００４１】
表１に示す通り、ｐＯＤＡ２では、ガラクトース培地においては１００％の効率で切り出しが起こった。また、グルコース培地においても２６％の効率で切り出しが起こった。
さらに、ｐＯＤＡ２を持つ株とｐＯＤＡ２１を持つ株との間ではガラクトース培地、グルコース培地ともに切り出し頻度に差は見られなかった。従って４個の繰り返し配列は、少なくとも切り出しにおいては必要でないと考えられる。
【００４２】
また、ガラクトース培地では、ｐＯＤＡ２１、ｐＯＤＡ２２、ｐＯＤＡ２３及びｐＯＤＡ２４においてはほぼ１００％の頻度で切り出しが起こったが、ｐＯＤＡ２５でその頻度が急激に低下し、ｐＯＤＡ２６及びｐＯＤＡ２７ではほとんど切り出しが起こらなかった。グルコース培地では、ｐＯＤＡ２１及びｐＯＤＡ２２はｐＯＤＡ２と同程度の切り出し頻度であった。これらのことより、組換えには、逆向き反復配列の一方は２ｂｐ以上存在することが望ましいことがわかった。
【００４３】
一方、ＲＳに点突然変異を持つプラスミドで、スペーサー部分に変異点を持つｐＯＤＡ２２Ｍとスペーサー部分近くに変異点をもつｐＯＤＡ２１Ｍは切り出しはほとんど起こらず、ｐＯＤＡ２４Ｍでガラクトース培地において４８％の頻度で切り出しが起こった。従って、効率のよい組換えにはスペーサー部分が保存されていることが必須であると言える。
ｐＯＤＡ２４Ｗを持つ株ではガラクトース培地において３７％の頻度で切り出しが起こり、ｐＯＤＡ２４を持つ株との間で組換えの頻度に大きな差が見られた。このことは、両方の反復配列の欠失が一方のみと比べ組換え能が大きく低下することを示している。
【００４４】
（３）Ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける組換え頻度の検討
一方、大腸菌で生産し部分精製したＲ蛋白質を用いて、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける変異ＲＳを持つプラスミドでの組換え頻度を調べた。ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける組換え効率の測定は以下の方法に従った。５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）１０ｍＭ ＭｇＣｌ2 からなる反応液１００μｌ中にＤＮＡと１μｌの大腸菌で生産し部分精製したＲ蛋白質（Biore x 70 画分：Araki, H., et al., J Mol. Biol., 225, 25-37, 1992 ）を加え、３０℃で３０分間反応させた。エタノール沈殿を行った後、適当な制限酵素で切断し、アガロース電気泳動で確認した。結果を前記の表１に示す。
【００４５】
ｐＯＤＡ２、ｐＯＤＡ２１、ｐＯＤＡ２２及びｐＯＤＡ２１２０１では組換え頻度は高く、ｐＯＤＡ２３ではごく僅かではあるが切り出しが検知できる。ｐＯＤＡ２４ではＲ蛋白質量を２〜６倍に増加させると切り出しが検知できる。ｐＯＤＡ２４Ｗ、ｐＯＤＡ２５、ｐＯＤＡ２６、ｐＯＤＡ２７、ｐＯＤＡ２１Ｍ、ｐＯＤＡ２２Ｍ、ｐＯＤＡ２４Ｍ及びｐＯＤＡ２４２０１では切り出しは検知されなかった。
【００４６】
実施例２． 出芽酵母のプロテアーゼＡ遺伝子の破壊
（１）Ｒ認識配列を含むプラスミドｐＲＳ３０４−４の構築
Ｒ認識配列をプラスミドに導入するために４種類のオリゴヌクレオチドを合成した。
（RS4-S ）5'-C TTGATGAAAGAA TACGTTA TTCTTT G-3' （配列番号：１３）
（RS4-L ）5'-AATTC AAAGAA TAACGTA TTCTTTCATCAA GAGCT-3' （配列番号：１４）
（RS304-S ）5'-C TTGATGAAAGAA TAACGTA TTCTTT A-3' （配列番号：１５）
（RS304-L ）5'-AGCTT AAAGAA TACGTTA TTCTTTCATCAA GCATG-3' （配列番号：１６）
【００４７】
まず、市販のプラスミドであるｐＵＣ１９を制限酵素EcoR I及びSac I で切断した。合成ＤＮＡであるＲＳ４−Ｓ及びＲＳ４−Ｌをアニーリングし、ｐＵＣ１９のEcoR IーSac I 断片とライゲーションすることにより、ｐＲＳ４を構築した。さらにｐＲＳ４を制限酵素Sph I 及びHind IIIで切断し、合成ＤＮＡＲＳ３０４−Ｓ及びＲＳ３０４−ＬとライゲーションすることによりプラスミドｐＲＳ３０４−４−４を構築した。これを図３に示す。
【００４８】
（２）形質転換用プラスミドの構築
（２−１）プラスミド ｐＲＳ１５３ｄＢ１の作製
Ｒ遺伝子発現用プラスミドｐＨＭ１５３中において、Ｒ遺伝子はガラクトースで発現が誘導されるプロモーター（ＧＡＬ１プロモーター）で発現が制御されている。ｐＨＭ１５３をBamHI で消化した後、ＤＮＡ Ｂｌｕｎｔｉｎｇ ｋｉｔ（宝酒造社製）を用いて平滑末端処理を行った。
【００４９】
得られたＤＮＡ断片をセルフライゲーションすることにより得られたプラスミドをｐＨＭ１５３ｄＢとした。また、実施例２（１）において得られたプラスミドｐＲＳ３０４−４−４をSmaIとSacIで消化した後、同様に平滑末端処理を行った。得られた約２．９ｋｂのＤＮＡ断片に、ｐＨＭ１５３ｄＢをEcoR IとSalIで処理した後、同じく平滑末端処理を行って得られた約２．８ｋｂのＤＮＡ断片を組み込んで得られたプラスミドをｐＲＳ１５３ｄＢ１とした。これを図４に示す。
【００５０】
（２−２）プラスミドｐＰＲＡ１５３ｄＢ１の作製
プラスミドｐＲＳ１５３ｄＢ１をEcoR IとHind IIIで消化して得られる約２．８ｋｂのＤＮＡ断片と酵母（Saccharomyces cerevisiae ）のプロテアーゼＡ遺伝子の全長を含むプラスミドｐＰＲＡ１−２（Woodford, C.A., et al., Mol. Cell. Biol., 6, 2500-2510, 1988）をEcoR IとHind IIIで消化して得られる約４．２ｋｂのＤＮＡ断片とを連結して得られるプラスミドをｐＰＲＡ１５３ｄＢ１とした。これを図５に示す。なお、プラスミドｐＰＲＡ１−２をEcoR IとHind IIIで消化して得られる約４．２ｋｂのＤＮＡ断片には、プロテアーゼＡの５’上流領域８２ｂｐおよび開始コドンであるＡＴＧを含むＮ末端アミノ酸残基１３６残基が欠けている。
【００５１】
（２−３）プラスミドｐＰＲＡＧ４１８の作製
プラスミドｐＰＲＡ１５３ｄＢ１をBamHI で消化した後、大腸菌（E.coli A19）のアルカリホスファターゼで脱リン酸化し得られたＤＮＡ断片に、プラスミドｐＩＧＺ２（Nakazawa, N., et al., J. Ferment. Bioeng., 73, 265-270, 1992）をBamHI で消化して得られる約２．４ｋｂのＤＮＡ断片を連結し、プラスミドｐＰＲＡＧ４１８を作製した。これを図６に示す。このBamHI 断片には、酵母の構成的なプロモーターの一つであるグリセロアルデヒド ３リン酸脱水素酵素のプロモーターの下流に連結されたＧ４１８耐性を付与する遺伝子が含まれている。
【００５２】
（３）研究室株を用いたマーカー遺伝子の除去
一倍体の酵母としてＲ２７−７Ｃ−１Ｃ（ＭＡＴ α ｔｒｐ１ ｌｅｕ２ ｈｉｓ３ ｕｒａ３）を用いた。酵母の形質転換はリチュウムクロライドを用いた方法（Kodama, Y., et al. , J. Am. Soc. Brew. Chem., 53, 24-29, 1995 ）により行うことが可能である。実施例２（２−３） において得られたｐＰＲＡＧ４１８をSacIとNcoIで処理して得られた約５．８ｋｂのＤＮＡ断片（約１０μｇ）を酵母への組換えに使用し、形質転換体のゲネチシン耐性により選択した。すなわち、３００μｇ／ｍｌの濃度のゲネチシンを含むＹＰＤ寒天プレート（ペプトン２％、グルコース２％、酵母エキス１％、寒天２％）に上記形質転換操作をした酵母をまき、３０℃で７２時間インキュベートする。
【００５３】
Ｇ４１８遺伝子を含む形質転換株のみがこの寒天培地で生育可能であるため、出現したコロニーを形質転換株として選択した。得られた形質転換体はガラクトースを含む培地で培養することにより、Ｒ蛋白質をコードする遺伝子が発現し酵母細胞内でＲ蛋白質が誘導生産される。生産されたＲ蛋白質はＧ４１８薬剤耐性遺伝子の両端に挿入された認識配列を認識し、この認識配列にはさまれた領域を切断除去することが可能である。そこで、得られた形質転換体のコロニーを１０ｍｌのＹＰＧａｌ（ペプトン２％、ガラクトース５％、酵母エキス１％）液体培地にて３０℃、４８時間培養し認識配列の組換えを誘導した。
【００５４】
培養液を無菌水で１０万倍に希釈した後、そのうちの２０μｌをＹＰＤ寒天培地にまき、３０℃で４８時間培養した。得られた約１万コロニーのうち１１株を無作為に選択し、６００μｇ／ｍｌの濃度でゲネチシンを含むＹＰＤ寒天培地とゲネチシンを含まない同培地で、３０℃、４８時間それぞれ培養した。選択した１１株は全てゲネチシンを含まない培地のみで生育が可能であり、選択マーカー遺伝子が除去されたと考えられる。
なお、ここで行われたプロテアーゼＡ遺伝子の破壊及び部位特異的組換えによる選択マーカーの除去について、図７にその概略を示す。
【００５５】
（４）醸造用酵母を用いたマーカー遺伝子の除去
（４−１）１回目の形質転換
形質転換体の作出は研究室株を用いた場合と同じ方法で行った。宿主としては高次倍数体の醸造用株ＢＨ８４（Kodama, Y., et al. , J. Am. Soc. Brew. Chem., 53, 24-29, 1995 ）を用いたが、二倍以上の倍数性を持つ酵母であればいずれの酵母を用いても良い。得られた形質転換体のコロニーを、５％のガラクトースを含む１０ｍｌのＹＮＢ液体培地にて３０℃、４８時間培養した。
【００５６】
ガラクトースを含む培地で培養することにより、Ｒ蛋白質をコードする遺伝子を発現させ酵母細胞内でＲ蛋白質を生産させる。Ｒ蛋白質はＧ４１８薬剤耐性遺伝子の両端に挿入されたＲ認識配列を認識し、このＲ認識配列部分を切断除去することが可能である。よって、５％ガラクトースを含む酵母最少培地（Yeast Nitrogen Base w/o amino acid （DIFCO 社））液体培地で４８時間培養した後の培養液を純水で１０万倍に希釈し、そのうちの２０μｌを５％ガラクトースを含むＹＮＢ寒天培地にまき、３０℃で４８時間培養した。
【００５７】
得られた約1 万コロニーのうち１２５株を選択し、２％グルコースと６００μｇ／ｍｌのゲネチシンを含む酵母最少寒天培地とゲネチシンを含まない同培地で、３０℃、４８時間それぞれ培養した。そのうち、ゲネチシンを含む培地では生育できないが、ゲネチシンを含まない培地には生育可能な株が１株得られた。
【００５８】
（４−２）２回目の形質転換
上記操作によって得られたプロテアーゼＡ遺伝子が１遺伝子破壊され、さらに耐性マーカーが欠失した株を基に２回目の形質転換を行った。コンピテント細胞の調製ならびにプラスミドｐＰＲＡＧ４１８を用いた形質転換はすべて１回目の形質転換と同条件にて行った。１回目の形質転換の時に用いたものと同じゲネチシンを含むＹＰＤ寒天培地で形質転換株の選択を行ったところ、５株のゲネチシン耐性を持つ形質転換株が得られた。
【００５９】
上記操作により得られた５株の形質転換株から１株を選び、選択マーカー遺伝子の切断除去を行った。Ｒ蛋白質の誘導と選択マーカー遺伝子の除去は全て１回目の場合と同様に行った。その結果、６００μｇ／ｍｌのゲネチシンを含む培地では生育できないが、ゲネチシンを含まない培地では生育可能な株が３株得られた。
【００６０】
（４−３）プロテアーゼＡ遺伝子の破壊
形質転換が成功し、プロテアーゼＡをコードする染色体上の遺伝子が破壊されたことは、次のようなサザンブロット解析をすることにより確認することができる。Ｒ遺伝子を発現した後の形質転換株の染色体ＤＮＡを常法に従い抽出し、制限酵素Hind IIIで切断する。アガロースゲルにて泳動した後ニトロセルロースにブロッティングし、プロテアーゼＡをコードするプラスミド（ｐＰＲＡ１−２）を制限酵素SacI-XhoI で切断した１．９ｋｂｐの断片をプローブとしてサザンブロットを行う。
【００６１】
その結果、野性株では４．２及び１．２ｋｂのバンドが検出され（図８のレーン１及び２）、一回目の形質転換では７．９及び１．２ｋｂのバンドが検出され（図８のレーン３）、そしてＲ遺伝子を発現した後の形質転換体では３．７及び１．２ｋｂのバンドが検出される（図８のレーン４）。バンドの濃淡から遺伝子破壊された染色体数が推定できる。このようにして、プロテアーゼＡ遺伝子の１遺伝子破壊株、２遺伝子破壊株を確認した。この結果を図８に示す。
【００６２】
実施例３． リゾパス属由来グルコアミラーゼ遺伝子の野生型酵母への導入及 びその発現
酵母(Saccharomyces cerevisiae) AY-01株は２倍体である。グルコアミラーゼ遺伝子を導入する際、形質転換と部位特異的組換え配列でのマーカー遺伝子の切り出しを２回繰り返えすことにより、対立する両方の染色体の同じ位置にグルコアミラーゼ遺伝子のみを導入することが出来る。
【００６３】
（１）形質転換用のプラスミド pUPRGA3 の構築
Ｒ認識配列をプラスミドに導入するために４種類のオリゴヌクレオチドを合成した。
(RS3-S) 5'-C TTGATGAAAGAA TACGTTA TTCTTTCA-3'（配列番号：17）
(RS3-L) 5'-AATTC TGAAAGAA TAACGTA TTCTTTCATCAA GAGCT-3'（配列番号：18）
(RS303-S) 5'-C TTGATGAAAGAA TAACGTA TTCTTTCA-3'（配列番号：19）
(RS303-L) 5'-AGCT TGAAAGAA TACGTTA TTCTTTCATCAA GCATG-3' （配列番号：20）
これらの合成ＤＮＡの5'末端をリン酸化したのち、RS3-S とRS3-L 、RS303-S とRS303-L をそれぞれアニーリングし、前者をpUC19 の制限酵素EcoRI-SacIサイトに、つづいて後者を制限酵素SphI-HindIIIサイトに挿入し、プラスミドpRS303-3を構築した。
【００６４】
次に、pRS303-3を制限酵素SacI消化後Bulunting Kit （宝酒造( 株) 製）で末端を平滑化したのち制限酵素SphIで消化して得た2.7kb の断片と、プラスミドpPRACer11 （図１２）を制限酵素SalIで消化後Bulunting Kit で末端を平滑化したのち制限酵素SphIで消化して得た2.7kb の断片とを連結し、プラスミドpRS303-3-Cerを得た。
pRS303-3-Cerの制限酵素SalIサイトに、pPRACer11 を制限酵素SalIで消化して得られる2.7kb 断片を挿入し、プラスミドpRCer303-3-1を構築した。
【００６５】
pRCer303-3-1をHindIII で消化後、Bulunting Kit で末端を平滑化し、pSmaI linker（宝酒造( 株) 製）を挿入してpRCer303-3-2を構築した。
pUC19 を制限酵素EcoRI-HindIII で消化し、pRCer303-3-2を制限酵素SmaI-EcoRIで消化して得られる5.5kb 断片と、YEp24(Botstein, D., et al. Gene, 8,17,1979) のURA3遺伝子を含む1.1kb の制限酵素HindIII-SmaI断片とを連結して挿入し、pU5'RCerRS3 を構築した。
【００６６】
pUC18 を制限酵素EcoRI 及びSphIで消化し、Bulunting Kit （宝酒造）で末端を平滑化したあと連結し、pUC18HSpを構築した。この制限酵素HindIII サイトにYEp24 のURA3遺伝子を含む1.2kb の制限酵素HindIII 断片を挿入し、pURA34を構築した。
pURA34のSmaIサイトにpEcoRI linker （宝酒造）を挿入してpURA35を構築し、これを制限酵素EcoRI で消化し、制限酵素HindIII で部分消化した2.8kb の断片とpU5'RCerRS3 の6.6kb の制限酵素HindIII-EcoRI 断片を連結し、プラスミドpUPRRS3 を構築した。
【００６７】
pUPRRS3 の制限酵素SmaIサイトに、PYGA2269（Ashikari,T.,et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 30,535,1989 ）の3.2kb の制限酵素HindIII 断片をBulunting Kit （宝酒造）で末端を平滑化したのち挿入しプラスミドpUPRGA3 を構築した（図１３）。
このプラスミドでは、図１３に示すとおり、URA3遺伝子のコード領域の下流に以下の遺伝子が挿入されている。
【００６８】
A ．構成的に発現される酵母グリセルアルデヒド３−リン酸脱水素酵素遺伝子(GAP) プロモーターにつないだグルコアミラーゼ遺伝子。これが本実施例において導入したい遺伝子である。
B ．部位特異的組換え配列（RS303,RS3 ）で挟まれた、マーカー遺伝子（PDR4；セルレニン及びシクロヘキシミド耐性遺伝子）および部位特異的組換え配列間の組換えを触媒する酵素のＲ遺伝子。Ｒ遺伝子はガラクトースで発現誘導されるようにGAL1プロモーターにつないでいる。これらの遺伝子は、形質転換株の選択の後、部位特異的組換え配列での組換えにより除去されるように設計した。
【００６９】
（２）形質転換（その１）
形質転換には５μgのプラスミドpUPRGA3 を制限酵素HindIII で消化し、エタノール沈殿後、10μlのＴＥ緩衝液に溶解してその全量を使用した。宿主として酵母（Saccharomyces cerevisiae）AY-01 株（a/α野生型）を用い、プラスミドpUPRGA3 の制限酵素HindIII 消化物でリチウム法により形質転換した。その後、1.0 ％シクロヘキシミドを含むＹＰＤプレートにひろげ、30℃で３日間培養してシクロヘキシミド耐性株を選択した。
【００７０】
得られた約400 株の形質転換株のうち、４株（GA3-PDR4- ＃1 、＃2 、＃3 及び＃4 ）をサザンブロッティングで解析した。染色体は制限酵素HindIII で消化しURA3遺伝子をプローブとした。その結果、４株とも1.2kb と9.7kb の断片が検出された。これは親株のAY-01 株と比較すると、染色体の一方のURA3遺伝子の位置に8.5kb の挿入があることを示しており、上記のA 、B 両方が挿入されているものと考えられた。
【００７１】
（３）マーカー遺伝子の切り出し（その１）
マーカー遺伝子を切り出すために、前記形質転換（その１）で得られた形質転換株（GA3-PDR4- ＃1 、＃2 、＃3 及び＃４）１白金耳を合成培地（yeast nitrogen base w/o amino acid 6.7g 、ガラクトース2g /1L）10mlに植菌し、30℃で一晩振とう培養してR 遺伝子を誘導した。適当に希釈しYPD プレートにひろげて３日間30℃で培養した。これらのコロニーを各形質転換株由来のものから200 個ずつ計800 個選択し、YPD プレートおよび1.0mg/mlのシクロヘキシミドを含むＹＰＤプレートにレプリカし、30℃で3 日間培養し、シクロヘキシミド耐性を調べた。
【００７２】
その結果、３株（GA3-＃1028、＃1151及び＃1171）のシクロヘキシミド感受性の株が得られた。これらの株をサザンブロッティングで解析した結果、GA3-＃1028、＃1151及び＃1171の3 株では4.2kb と1.2kb の断片が検出され、一方の染色体のURA3領域に約3kb の挿入があることを示していた。これは形質転換株のマーカーが部位特異的組換えにより切り出され、グルコアミラーゼ遺伝子のみが挿入されていることを示している。
【００７３】
（４）形質転換（その２）
GA3-＃1028及び＃1171を、前記形質転換（その１）と同様に形質転換した。形質転換株として前者由来のものが６株、後者由来のものが３株得られた。これらをサザンブロッティングで解析した。その結果、１株(GA3-PDR4-＃135)は4.2kb と9.7kb の断片が検出された。これは一方の染色体のURA3遺伝子の位置にはA のみ、他方はA とB の両方が挿入されていることを示しており、すでに遺伝子が挿入されている染色体とはちがう染色体に新たに遺伝子が挿入されたものと考えられる。
【００７４】
（５）マーカー遺伝子の切り出し（その２）
マーカー遺伝子の切り出し（その１）と同様にして、GA3-PDR4- ＃135 株を１日間ガラクトースを含む培地で培養し、Ｒ遺伝子を誘導した。800 個のコロニーを選択しシクロヘキシミド耐性を調べたが、シクロヘキシミド感受性の株はなかった。
そこでＲ遺伝子を誘導期間を２日間にし、そのうち400 株を選択してシクロヘキシミド耐性を調べた。その結果、７株（GA3-＃5197、＃5198、＃5199、＃5200、＃6198、＃6199及び＃6200 )がシクロヘキシミド感受性になった。これらの株は誘導後まいたＹＰＤプレート上で若干大きめのコロニーを形成していた。サザンブロッティングで解析したところ、4.2kb の断片が検出され、両方の染色体のURA3領域に約３kbの挿入があることを示しており、グルコアミラーゼ遺伝子のみが挿入されていると考えられた。
【００７５】
（６）グルコアミラーゼ遺伝子の発現
親株AY-01 株とグルコアミラーゼ遺伝子導入株３株（GA3-PDR4- ＃1 、GA3-＃1028及びGA3-＃5197）をＹＰＤ培地に１白金耳植菌し、３０℃で１８時間培養した。培養液の一部を取り、遠心分離後の上清を用いてグルコアミラーゼ活性を測定した。測定は熱により糊化させた可溶性澱粉を用い４０℃で反応させた後に遊離したグルコースの量を定量することにより測定した。
【００７６】
グルコアミラーゼの酵素活性は４０℃で１分間に１μmoleのグルコースを遊離する活性を１単位とした。その結果、親株であるAY-01 株ではグルコアミラーゼ活性を全く示さなかったが、グルコアミラーゼ遺伝子導入株３株、GA3-PDR4- ＃1 、GA3-＃1028及びGA3-＃5197では、培溶液上清１ml当たりそれぞれ0.173 、0.179 及び0.389 ユニットのグルコアミラーゼを分泌生産していた。
【００７７】
【発明の効果】
以上のように酵母の部位特異的組換え機構を用いて形質転換体から選択マーカー遺伝子を除く技術が確立された。その結果、後代をとったり、再度の形質転換や交配などの操作を伴うことなく、選択マーカー遺伝子の除去が可能となった。また、本発明において定義する１対のＲ認識配列を用いることにより、組換え後に残存する配列がもはやＲ蛋白質により認識されにくい配列になることから、選択マーカー遺伝子除去後の形質転換個体を用いて再び、同じ選択マーカーを用いた形質転換が可能となった。
【００７８】
このことは理論的には同じ選択マーカーをもちいて無限の遺伝子を同一個体に導入する技術が可能となったことを意味する。また、我々が発明した方法を用いることにより、形質転換体から選択マーカー遺伝子を特異的に除去できることから、組換え体の安全性評価においても選択マーカー遺伝子に関する評価を省略することが可能であり、育種された個体の産業利用において非常に有用な技術を提供することができる。
【００７９】
【配列表】
【００８０】
【００８１】
【００８２】
【００８３】
【００８４】
【００８５】
【００８６】
【００８７】
【００８８】
【００８９】
【００９０】
【００９１】
【００９２】
【００９３】
【００９４】
【００９５】
【００９６】
【００９７】
【００９８】
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、プラスミドｐＨＭ９９９の構造を示す図である。
【図２】図２は、プラスミドｐＯＤＡ２の構造を示す図である。
【図３】図３は、プラスミドｐＲＳ３０４−４−４の構造を示す図である。
【図４】図４は、プラスミドｐＲＳ１５３ｄＢ１の構築の概略を示す図である。
【図５】図５は、プラスミドｐＰＲＡ１５３ｄＢ１の構築の概略を示す図である。
【図６】図６は、プラスミドｐＰＲＡＧ４１８の構築の概略を示す図である。
【図７】図７は、プロテアーゼＡ遺伝子の破壊及び部位特異的組換えによる選択マーカー遺伝子の除去についての概略を示す図である。
【図８】図８は、サザンブロット解析の結果を示し、電気泳動の結果を示す図面代用写真である。
【図９】図９は、１対のＲ認識配列内で組換えが生ずる際の１対のＲ認識配列の配置を示す。２本の交線（Ｘ記号）は組換えが生ずる部位を示す。
【図１０】図１０において、（Ａ）は１対のＲ認識配列間で組換えが生ずる際のＲ認識配列の塩基配列の配置を様式的に示す図である。（Ｂ）は、Ａに示す１対のＲ認識配列間で組換えが生じた際に生成するＲ認識配列の融合体の塩基配列を示す図である。
【図１１】図１１は、本発明の方法を用いて酵母の染色体に目的遺伝子を組み込む場合の方法を示す模式図である。
【図１２】図１２は、プラスミドｐＰＲＡＣｅｒｌｌの構造を示す図である。
【図１３】図１３は、プラスミドｐＵＰＲＧＡ３の構造を示す図である。
【発明の属する技術分野】
本発明は、酵母の部位特異的組換えを用いて、選択マーカー遺伝子が欠失した形質転換体を作製する方法に関する。この方法を利用することにより、目的とする遺伝子を酵母に導入した後に、選択マーカー遺伝子を有しない酵母の形質転換体を得ることができる。
【０００２】
【従来の技術】
現在までに多くの遺伝子導入方法が報告されているが、遺伝子導入効率が低いため、それらのいずれの方法も組換え体を選択するマーカーが必要である。選択マーカーとしては酵母などで用いられている栄養要求性の回復などがあるが、一般的には抗生物質などの薬剤に対する抵抗性遺伝子が用いられる。しかしながら、形質転換体を選択した後は組換え体の実用化における安全性の面などから、選択マーカー遺伝子を取り除くことが望ましい。また、効率良く利用できる選択マーカー遺伝子の種類が少ないことから同一個体を繰り返し形質転換するためにはマーカー遺伝子の再利用を行うことが望まれる。
【０００３】
これらの問題を解決するために形質転換体から選択マーカー遺伝子を除くいくつかの方法が開発されている。例えば、コトランスフォーメーションの様に導入したい遺伝子と選択マーカー遺伝子を別のプラスミドまたはＤＮＡ断片上にのせ、別々の構成物として同時に細胞に導入する方法がある。この方法ではそれぞれの遺伝子が独立して存在するために、後代をとることにより、導入目的遺伝子を持つが選択マーカー遺伝子を持たない個体を得ることが可能である。また、トランスポゾンを利用する方法も開発されている。
【０００４】
これらは遺伝子導入後、トランスポゾンを働かせることにより、導入目的遺伝子と選択マーカー遺伝子の連鎖をなくし、その後に先ほどの例と同じく後代をとることにより、導入目的遺伝子を持つが選択マーカー遺伝子を持たない個体を得ることが可能である。しかしながらこれらの方法は後代をとる必要があり、操作が煩雑で時間がかかる。また、後代をとることによるばらつきが生じ、実用的ではない。
【０００５】
一方、部位特異的な組換えを利用した方法も開発されている。部位特異的組換えは組換えを行う酵素とその酵素が認識する特異的な塩基配列の２つの要素からなっており、組換え酵素は２個の認識配列間で組換えを引き起こすことが知られている。これらの組換えは認識配列の配置により、欠失、挿入、逆位などの現象を引き起こす。部位特異的な組換えとしてバクテリオファージＰ１由来のＣｒｅ／ｌｏｘ、出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae）由来のＦＬＰ／ＦＲＴ、醤油酵母（Zygosaccharomyces rouxii）由来のＲ／ＲＳ、そして、バクテリオファージＭｕ由来のＧｉｎ／ｇｉｘの４つが知られている。
【０００６】
これらの系を用いた部位特異的組換えは数多く報告されている（Odell, J. T. and Russell, S. H., In : Paszkowski ( ed.) Homologous Recombination and Gene Silencing in Plants, pp 219-270, 1994 、Kluwer Academic Publishers, Netherlands 、Yoder, J. I. and Goldsbrough A. P., Bio/Technology , 12, 263- 267, 1994 ）。例えば、出芽酵母のＦＬＰ／ＦＲＴの系を用いてメタノール酵母（Pichia pastoris ）でマーカー遺伝子の切り出しが行われている（Cregg, J. M. and Madden, K. R. , Mol. Gen. Genet. 219, 320- 323, 1989 ）。
【０００７】
彼らはＡＲＧ４遺伝子を選択マーカーとし、同方向に繰り返し配置したＦＲＴの間にＡＲＧ４遺伝子を組み込み、ａｒｇ４変異株のメタノール酵母を形質転換した。その後、組換え酵素の遺伝子であるＦＬＰを持つプラスミドを同じメタノール酵母に導入し、部位特異的な組換えを誘発し、選択マーカー遺伝子であるＡＲＧ４の切り出しに成功している。この様に部位特異的な組換えをマーカーの切り出しに利用できることは既に報告されているが、Cregg らの例にもみられるように、部位特異的な組換えを誘発するために最初の形質転換体が得られた後、組換え酵素の遺伝子を導入し、部位特異的組換えを誘導するという方法が採られている。
【０００８】
つまり、誘導には２回の形質転換が必要であり、さらにはそのための別の選択マーカーが必要となる。その他に報告されている部位特異的な組換えも組換え酵素遺伝子の導入は最初の形質転換体を得た後に行われており、再度の形質転換か、交雑による組換え酵素遺伝子の導入が必須である。
また、Araki らにより醤油酵母のプラスミドｐＳＲ１に部位特異的組換えの機構が存在することが明らかになっている（Araki, H., et al J. Mol. Biol., 182, 191-203, 1985）。
【０００９】
プラスミドｐＳＲ１は、６２５１ｂｐからなる環状プラスミドで、分子中に９５９ｂｐからなる一対の逆向き反復配列を持ち、この逆向き反復配列間で部位特異的組換えを起こすことが知られている。この逆向き反復配列内の組換え部位は、７ｂｐのスペーサー配列を挟む１２ｂｐの短い逆向き反復配列から構成され、さらに、片側には、４個の同じ１２ｂｐ配列の繰り返しが続く。部位特異的組換えは、プラスミド自身にコードされた組換えを行う酵素（Ｒ蛋白質）が、逆向き反復配列内の組換え部位に存在する特異的な塩基配列であるＲ認識配列に結合することによって起こる。
【００１０】
なお、Ｒ認識配列（ＲＳ配列）としては、７ｂｐのスペーサー部分と１２ｂｐの逆向き反復配列からなる３１ｂｐの配列が知られている（Matsuzaki, H., et al. Biosci. Biotech. Biochem., 58, 1632-1637, 1994）。この配列を配列表・配列番号１に示す。しかしながら、３１ｂｐのＲ認識配列を用いて部位特異的組換えを行うと、組換え後の構造として、染色体あるいはプラスミドＤＮＡ中に部位特異的酵素の認識配列が残り、目的としない組換えを誘導する可能性があることから実用的ではない。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
そこで、本発明者らは、部位特異的組換えにより選択マーカー遺伝子を除去した後に残存する配列が、Ｒ遺伝子産物により認識されにくい配列となるＤＮＡ構成物を作製し、該ＤＮＡ構成物を用いて形質転換を行うことにより、選択マーカー遺伝子を欠失した形質転換体を作製する方法を提供することを課題とした。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
上記の課題を解決するため、本発明は、誘導性プロモーターの制御下に配置されたＲ遺伝子と発現可能な選択マーカー遺伝子とを挟む、同方向に配置された１対のＲ認識配列を含んで成るＤＮＡ断片の両端に、酵母染色体ＤＮＡとの間で組換えが可能なＤＮＡ断片が連結されているＤＮＡ構成物において、前記Ｒ認識配列が次の塩基配列：
【００１３】
【化２】
を含んで成るか又はこれと実質的に同一な配列を含んで成り、但し前記Ｒ遺伝子の近傍に位置するＲ認識配列は該Ｒ遺伝子に近接する側とは反対側に存在する逆向き反復配列のスペーサー配列から遠位の側の１０個以下の塩基が欠けており、そして選択マーカー遺伝子の近傍に位置するＲ認識配列は該選択マーカー遺伝子に近接する側とは反対側に存在する逆向き反復配列のスペーサー配列から遠位の側の１０個以下の塩基配列が欠けていることを特徴とするＤＮＡ構成物を提供する。
【００１５】
【発明の実施の形態】
本発明においては、１対のＲ認識配列の内、Ｒ遺伝子（例えば図７におけるＲｇｅｎｅ）の近傍に位置するＲ認識配列（例えば図７におけるＲＳ４）は、該Ｒ遺伝子に近接する側とは反対側に存在する逆向き反復配列（例えば化１における逆向き反復配列（２）；ちなみに図７におけるＲＳ４は左側が３′−末端であり、右側が５′−末端である）において、スペーサー配列から遠位の側の１０個以下の塩基配列が欠けている。
【００１６】
また、他方のＲ認識配列は、選択マーカー遺伝子（例えば、図７における Geneticin耐性遺伝子）の近傍に位置し（例えば、図７においてＲＳ３０４）、該選択マーカー遺伝子に近接する側とは反対側に存在する逆向き反復配列（例えば化１に示す逆向き反復配列（１）；ちなみに、図７におけるＲＳ３０４は左側が３′−末端であり、右側が５′−末端である）において、スペーサー配列から遠位の側の１０個以下の塩基配列が欠けている。
【００１７】
１例として、配列番号：４に示すＲＳ４は、化１（配列番号：１）に示す配列の内、１２個の塩基から成る逆向き反復配列（２）の内の６塩基が欠けている。また、配列番号：１６中の５′−末端の５塩基及び３′−末端の５塩基（これらは制限酵素認識部位であってＲ認識配列の部分ではない）を除く中央の３ブロックの配列が図７におけるＲＳ３０４配列であり、この配列においては、化１（配列番号：１）に示す逆向き反復配列（１）を構成する１２個の塩基の内６個が欠けている。本発明のＲ認識配列において、上記の意味における欠けることができる塩基数は、スペーサー配列に隣接する反復配列を構成する塩基（計１２個）の内の１０個以下であり、例えば８個まで、好ましくは６個までである。塩基が１０個より多く欠けると、ＤＮＡ組換えの可能性が極めて低くなり好ましくない。
【００１８】
上記のごとく、本発明のＲ認識配列は、化１（配列番号：１）に示す配列を含んで成るが、その一方の側の逆向き反復配列において、上記のごとく短縮されている。しかしながら、短縮された逆向き反復配列とは反対側の逆向き反復配列では１２個の塩基がそのまま維持されていることが望ましく、さらに１〜４個の反復配列が連結されて延長されていてもよい。ちなみに、前記のごとく、天然のＲ認識配列においては、化１（配列番号：１）に示す配列の各端が、さらに４個づつの反復配列により延長された構造を有しており、本発明のＲ認識配列においても、前記のごとく短縮された反復配列の側とは反対の反復配列は、天然配列と同様に複数回反復していてもよい。
【００１９】
本発明のＲ認識配列は、上に定義した配列を有するものの他に、それと実質的に同じ塩基配列を有するものも含まれる。ここで「実質的に同じ配列とは、上記に定義した配列に対して、スペーサー配列以外の部分において、およそ１個の塩基の置換、欠失又は付加により修飾されている塩基配列を意味する。
上記のごとき一対のＲ認識配列を有するＤＮＡ構成物に対して、Ｒ遺伝子産物が作用すれば、例えば図１０に示すようにＤＮＡの組換えが生ずる。すなわち、１対のＲ認識配列（例えば図７におけるＲＳ４とＲＳ３０４は図９に示すごとく配置され、図１０の（Ａ）に示すごとく、ＲＳ４配列とＲＳ３０４配列がオーバーラップする領域内（例えば、図１０（Ａ）において２本の交線で示す位置）において組換えが生ずる。
【００２０】
その結果、Ｒ遺伝子及び選択マーカー遺伝子が除去されると共に、一方のＲ認識配列（例えばＲＳ４）の短縮された側の部分と、他方のＲ認識配列（例えば、ＲＳ３０４）の短縮された側の部分とが融合した配列が再構成される。この再構成された配列は、スペーサー配列の両端に短縮された逆向き反復配列を有しており、例えばＲＳ４配列とＲＳ３０４配列とからは、図１０（Ｂ）（配列番号：５）に示すＲＳ４Ｗ配列が生ずる。
【００２１】
実施例１に示すごとく、スペーサー配列を中心にして、一方の側の逆向き反復配列のみが短縮されたＲ認識配列はＲ遺伝子産物の作用によって組換えを生ずるが、両側の逆向き反復配列が短縮された場合（例えば、ＲＳ４Ｗ配列）にはＲ遺伝子産物の作用による組換が生じにくくなる。
Ｒ遺伝子を発現させるための誘導性プロモーターとしては、酵母細胞中で機能する任意の誘導性プロモーターを使用することができ、例えばガラクトースにより誘導されるＧＡＬ１プロモーター、銅により誘導されるＣＵＰ２プロモーター、熱ショックにより誘導される熱ショック蛋白質遺伝子のプロモーター、低リン酸濃度により誘導されるＰＨＯ５プロモーター等が使用可能である。
【００２２】
また、選択マーカー遺伝子としては、酵母において使用される任意の選択マーカー遺伝子を用いることができ、例えばゲネチシン含有培地で選択可能なゲネチシン耐性遺伝子、セルレニン耐性遺伝子等を使用することができる。
酵母の染色体との間で組換えが可能なＤＮＡ断片は、酵母染色体上の遺伝子の一部分と相同性を有するＤＮＡ断片であり、酵母染色体上の遺伝子としては、その遺伝子が破壊されても酵母の増殖が阻害されない遺伝子であって、例えばプロテアーゼＡ遺伝子、リボソームＤＮＡ遺伝子、ＣＹＣ７遺伝子等、が挙げられる。
【００２３】
本発明はまた、上記のＤＮＡ構成物を用いる、酵母の形質転換方法を提供する。この方法においては、
【００２４】
（１）前記のＤＮＡ構成物を酵母細胞に導入し、該ＤＮＡ構成物の両端に存在する酵母の染色体との間で組換え可能なＤＮＡ配列と酵母染色体ＤＮＡとの間の組換えにより、該ＤＮＡ構成物を酵母染色体に組み込み、
（２）前記発現可能な選択マーカー遺伝子の発現により、前記ＤＮＡ構成物が酵母染色体に導入された酵母細胞を選択し、
（３）前記誘導性プロモーターを誘導することによりＲ遺伝子を発現せしめ、これによって前記１対のＲＳ配列間において組換えを起こし、前記誘導性プロモーターの制御下に配置されたＲ遺伝子と発現可能な選択マーカー遺伝子とを切除する。
【００２５】
この形質転換操作は複数回反復することができ、これにより、下記に説明するように、同一の選択マーカーを用いて多数の目的遺伝子を酵母の染色体に導入することができる。
上記の方法において、ＤＮＡ構成物はそれ自体からなる、もしくはそれ自体を含むＤＮＡ断片として、又は該ＤＮＡ構成物が挿入されたプラスミドの形で酵母細胞中に導入することができる。この導入は、すでに知られている任意の方法、例えば酢酸リチウム法、塩化リチウム法、プロトプラスト法等により行うことができる。
【００２６】
同方向に配置したＲ認識配列の間にＲ遺伝子と発現可能な選択マーカー遺伝子を配置したＤＮＡ構成物、例えばＤＮＡ断片、プラスミド、その他のベクター等を用いて形質転換を行うが、その際、前記のごとく定義される１対のＲ認識配列を用いることにより、組換え後に残存する配列がＲ遺伝子により認識されにくい配列になり、目的としない組換えを誘導する可能性が低減し、形質転換体から選択マーカー遺伝子を特異的に除去し、目的とする形質転換体を得ることができる。さらに詳しくは、Ｒ認識配列として、５’側のＲ認識配列の５’側を１ｂｐないし１０ｂｐ欠失させたもの及び／又は３’側のＲ認識配列の３’側を１ｂｐないし１０ｂｐ欠失させたものを用いることにより、組換え後に残存する配列が、Ｒ遺伝子により認識されにくい配列になり、目的とする形質転換体を得ることができる。
【００２７】
本発明の方法を用いることにより、後代をとったり、再度の形質転換や交配などの操作を伴うことなく、選択マーカー遺伝子の除去が可能となった。また、選択マーカー遺伝子に関する安全性評価を省略することも可能となった。さらに、選択マーカー遺伝子が欠失した形質転換個体を用いて、再び同じ選択マーカー遺伝子を用いた形質転換が可能となり、複数の遺伝子を繰り返し導入することも可能となる。
本発明の方法は、例えば有用な蛋白質をコードする目的遺伝子Ａを酵母の染色体に導入する場合に、次のようにして用いることができる。
【００２８】
本発明のＤＮＡ構成物においては、前記のごとく配列された１対のＲ認識配列（ＲＳ配列）を含んで成るＤＮＡ断片の両端に、１対のＲ認識配列を挟むように、酵母の染色体ＤＮＡとの間で組換えが可能なＤＮＡ断片（酵母染色体組換え領域と称する場合がある）が直接に又は間接に連結されている。Ｒ認識配列と右又は左ボーダーとが間接的に連結されている場合には、それらの間に酵母の染色体に組み込むべき目的とする遺伝子が挿入されている（図１１を参照のこと）。
このＤＮＡ構成物が酵母に導入されれば、このＤＮＡ構成物の酵母染色体組換え領域と酵母の対応する染色体遺伝子との間で組換えが生じ、ＤＮＡ構成物が全体として酵母染色体ＤＮＡに組み込まれる。
【００２９】
次に、この酵母を、Ｒ遺伝子のプロモーターを誘導する条件下で培養すればＲ遺伝子産物が生産され、これがＲ認識配列（ＲＳ配列）に作用して、１対のＲ認識配列間で前記のごとき組換えが生じ、これら１対のＲ認識配列に挟まれた領域（Ｒ遺伝子及びマーカー遺伝子を含む）が除去され、組換えにより融合した（両端が短縮された）Ｒ認識配列と酵母染色体組換え領域との間の目的遺伝子が酵母染色体遺伝子に組み込まれたまま残る。そして、上記の両端が短縮されたＲ認識配列はもはや組換えを生じないから、挿入された目的遺伝子は酵母染色体中に安定に維持される。
【００３０】
すなわち、本発明によれば、目的遺伝子が酵母染色体に挿入された後マーカー遺伝子（及びＲ遺伝子）が除去され、且つＲ認識配列が機能できなくなる。従って、目的遺伝子を１回導入した後、同じマーカー遺伝子を含有する遺伝子導入用ベクター（本発明のＤＮＡ構成物）を用いて、さらなる目的遺伝子の導入を行うことができる。
【００３１】
【実施例】
以下に本発明を実施例に基づいて詳細に説明するが、それらの実施例は例示を目的として提供されているだけであって本発明の範囲を限定することを意図しているものではない。実験の手順は特に記述しない限り、SambrookらのMolecular Cloning （Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 ）に従った。
実施例１． 部位特異的組換え酵素認識配列の解析
（１）プラスミドの構築
Ｒ遺伝子発現用プラスミドとして、ｐＨＭ１５３（Matsuzaki, H., et al., J. Bacteriol., 172, 610-618, 1990）のＲ遺伝子とＧＡＬ１プロモーターを含む HindIII−Sal I 断片を、ＹＥｐｌａｃ１９５（Gietz, R. D. and Sugino, A., Gene, 74, 527-534, 1988）のマルチクローニングサイトのHindIII ーSal I 間に挿入し、Ｕｒａ+ 形質でＲ遺伝子の上流にＧＡＬ１プロモーターを持つＲ蛋白質生産プラスミドｐＨＭ９９９を作製した。これを図１に示す。
【００３２】
次に、組換え検出用のプラスミドとして、ＬＥＵ２遺伝子の両端に２個のＲＳ配列（おのおのＲＳ−Ａ、ＲＳ−Ｂと称する）部位を持つプラスミドｐＳＲＴ１１７（Araki, H., et al., J Mol. Biol., 225, 25-37, 1992 ）のＬＥＵ２遺伝子を含むHindIII −BglII 断片を、ＹＣｐｌａｃ２２（Gietz, R. D. and Sugino, A., Gene, 74, 527-534, 1988）のＴＲＰ１遺伝子を含むHindIII −BamHI 断片に連結し、Ｔｒｐ+ Ｌｅｕ+ 形質のｐＯＤＡ２を作製した。これを図２に示す。
【００３３】
このプラスミドはＲ遺伝子の働きにより２個のＲＳ間で組換えが起こるとＬＥＵ２遺伝子を含む５．７ｋｂのプラスミドとＴＲＰ１遺伝子を含む４．５ｋｂのプラスミドに分かれる。ＬＥＵ２遺伝子を含むプラスミドは、選択圧をかけない状態においては自己複製能を持たないので細胞から脱落し、細胞はＬｅｕ- の表現型を示す。つまり、Ｒ遺伝子による組換えはこれら細胞のロイシンの要求性を調べることによってわかる。
【００３４】
次に、ｐＯＤＡ２のＲＳ−Ａの野生型ＲＳを、制限酵素部位HindIII と、XbaIまたはBamHI とを利用し、合成ＤＮＡにより作製された種々のＲＳに置き換えたプラスミドを作製した。用いた合成ＤＮＡの配列は以下に示す通りであるが、４個の繰り返し配列を欠失させたＲＳ１を基にして、ＲＳ１の逆向き反復配列の一方を徐々に欠失させた種々のＲＳ、その合成段階においてできたと考えられる点突然変異を持つＲＳ１Ｍ、ＲＳ２Ｍ、ＲＳ４ＭおよびＲＳ１の逆向き反復配列の両方の一部を欠失させたＲＳ４Ｗである。
【００３５】
ＲＳ１ TTGATGAAAGAA TACGTTA TTCTTTCATCAA （配列番号：１）
ＲＳ２ TTGATGAAAGAA TACGTTA TTCTTTCATC （配列番号：２）
ＲＳ３ TTGATGAAAGAA TACGTTA TTCTTTCA （配列番号：３）
ＲＳ４ TTGATGAAAGAA TACGTTA TTCTTT （配列番号：４）
ＲＳ４Ｗ AAAGAA TACGTTA TTCTTT （配列番号：５）
ＲＳ５ TTGATGAAAGAA TACGTTA TTCT （配列番号：６）
ＲＳ６ TTGATGAAAGAA TACGTTA TT （配列番号：７）
ＲＳ７ TTGATGAAAGAA TACGTTA （配列番号：８）
ＲＳ１Ｍ TTGATGAAAGAA TACGTTA T CTTTCATCAA （配列番号：９）
ＲＳ２Ｍ TTGATGAAAGAA TA GTTA TTCTTTCATC （配列番号：１０）
ＲＳ４Ｍ TTGATGAAATAA TACGTTA TTCTTT （配列番号：１１）
【００３６】
以上の配列は合成ＤＮＡ作製時に５′側にHindIII 認識部位を、３′側にXbaIまたはBamHI 認識部位とを導入し、同時に合成した逆鎖の配列とアニーリング後、ｐＯＤＡ２ のHindIII 部位と、XbaIまたはBamHI 部位との間に導入した。ＲＳ１、ＲＳ２、ＲＳ３、ＲＳ４、ＲＳ４Ｗ、ＲＳ５、ＲＳ６、ＲＳ７、ＲＳ１Ｍ、ＲＳ２Ｍ又はＲＳ４Ｍを導入したプラスミドをそれぞれｐＯＤＡ２１、ｐＯＤＡ２２、ｐＯＤＡ２３、ｐＯＤＡ２４、ｐＯＤＡ２４Ｗ、ｐＯＤＡ２５、ｐＯＤＡ２６、ｐＯＤＡ２７、ｐＯＤＡ２１Ｍ、ｐＯＤＡ２２Ｍ又はｐＯＤＡ２４Ｍと名付けた。 また、同様に、ｐＯＤＡ２のＲＳ−Ｂの野生型ＲＳを合成ＤＮＡにより作製された次のＲＳに置き換えたプラスミドを作製した。
【００３７】
ＲＳ２０１ TTGATGAAAGAA TACGTTA TTCTTTCATCAA （配列番号：１２）
ＲＳ２０１配列は合成ＤＮＡの作製時に５′側にＳａｌＩ認識部位を、３′側にＳａｃＩ認識部位を導入し、同時に合成した逆鎖の配列とアニーリング後、ｐＯＤＡ２のＲＳ−Ｂの野性型ＲＳに置き換えた。
ＲＳ−ＡをＲＳ１で置き換え且つＲＳ−ＢをＲＳ２０１で置き換えたプラスミドをｐＯＤＡ２１２０１と名付け、そしてＲＳ−ＡをＲＳ４で置き換え且つＲＳ−ＢをＲＳ２０１で置き換えたプラスミドをｐＯＤＡ２４２０１と名付けた。
【００３８】
（２）Ｉｎ ｖｉｖｏにおける組換え頻度の検討
まず、ｐＨＭ９９９によりＫＡ３１１Ａ株（ＭＡＴ ａ ｔｒｐ１ ｌｅｕ２ｕｒａ３ ｈｉｓ３）をＵｒａ+ に形質転換し、この株に２２５ｂｐの野生型組換え部位を持つｐＯＤＡ２を導入し、Ｕｒａ+ Ｔｒｐ+ Ｌｅｕ+ 株を選択した。この株をＵｒａ- Ｔｒｐ- の選択圧をかけた５０ｇ／Ｌ濃度のガラクトースまたはグルコース液体培地で３０℃で一晩培養し、ｐＨＭ９９９上のＲ遺伝子を発現させて、ｐＯＤＡ２内の２個のＲＳ間で組換えを誘導した。
【００３９】
培養液を希釈しＵｒａ- Ｔｒｐ- 選択培地に塗布し、２８℃で２日間静置培養した。これをＬｅｕ- 選択培地にレプリカしコロニーを数えた。Ｕｒａ- Ｔｒｐ- 選択培地で増殖し、Ｌｅｕ- 選択培地で増殖しない細胞が組換えが起こった細胞である。
また、同様に、実施例１（１）において作製した種々のプラスミドを、ｐＨＭ９９９を持つ株に導入し、ガラクトース培地及びグルコース培地における組換え頻度を調べた。結果を表１に示す。
【００４０】
【表１】
表１に示す通り、ｐＯＤＡ２では、ガラクトース培地においては１００％の効率で切り出しが起こった。また、グルコース培地においても２６％の効率で切り出しが起こった。
さらに、ｐＯＤＡ２を持つ株とｐＯＤＡ２１を持つ株との間ではガラクトース培地、グルコース培地ともに切り出し頻度に差は見られなかった。従って４個の繰り返し配列は、少なくとも切り出しにおいては必要でないと考えられる。
【００４２】
また、ガラクトース培地では、ｐＯＤＡ２１、ｐＯＤＡ２２、ｐＯＤＡ２３及びｐＯＤＡ２４においてはほぼ１００％の頻度で切り出しが起こったが、ｐＯＤＡ２５でその頻度が急激に低下し、ｐＯＤＡ２６及びｐＯＤＡ２７ではほとんど切り出しが起こらなかった。グルコース培地では、ｐＯＤＡ２１及びｐＯＤＡ２２はｐＯＤＡ２と同程度の切り出し頻度であった。これらのことより、組換えには、逆向き反復配列の一方は２ｂｐ以上存在することが望ましいことがわかった。
【００４３】
一方、ＲＳに点突然変異を持つプラスミドで、スペーサー部分に変異点を持つｐＯＤＡ２２Ｍとスペーサー部分近くに変異点をもつｐＯＤＡ２１Ｍは切り出しはほとんど起こらず、ｐＯＤＡ２４Ｍでガラクトース培地において４８％の頻度で切り出しが起こった。従って、効率のよい組換えにはスペーサー部分が保存されていることが必須であると言える。
ｐＯＤＡ２４Ｗを持つ株ではガラクトース培地において３７％の頻度で切り出しが起こり、ｐＯＤＡ２４を持つ株との間で組換えの頻度に大きな差が見られた。このことは、両方の反復配列の欠失が一方のみと比べ組換え能が大きく低下することを示している。
【００４４】
（３）Ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける組換え頻度の検討
一方、大腸菌で生産し部分精製したＲ蛋白質を用いて、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける変異ＲＳを持つプラスミドでの組換え頻度を調べた。ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける組換え効率の測定は以下の方法に従った。５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）１０ｍＭ ＭｇＣｌ2 からなる反応液１００μｌ中にＤＮＡと１μｌの大腸菌で生産し部分精製したＲ蛋白質（Biore x 70 画分：Araki, H., et al., J Mol. Biol., 225, 25-37, 1992 ）を加え、３０℃で３０分間反応させた。エタノール沈殿を行った後、適当な制限酵素で切断し、アガロース電気泳動で確認した。結果を前記の表１に示す。
【００４５】
ｐＯＤＡ２、ｐＯＤＡ２１、ｐＯＤＡ２２及びｐＯＤＡ２１２０１では組換え頻度は高く、ｐＯＤＡ２３ではごく僅かではあるが切り出しが検知できる。ｐＯＤＡ２４ではＲ蛋白質量を２〜６倍に増加させると切り出しが検知できる。ｐＯＤＡ２４Ｗ、ｐＯＤＡ２５、ｐＯＤＡ２６、ｐＯＤＡ２７、ｐＯＤＡ２１Ｍ、ｐＯＤＡ２２Ｍ、ｐＯＤＡ２４Ｍ及びｐＯＤＡ２４２０１では切り出しは検知されなかった。
【００４６】
実施例２． 出芽酵母のプロテアーゼＡ遺伝子の破壊
（１）Ｒ認識配列を含むプラスミドｐＲＳ３０４−４の構築
Ｒ認識配列をプラスミドに導入するために４種類のオリゴヌクレオチドを合成した。
（RS4-S ）5'-C TTGATGAAAGAA TACGTTA TTCTTT G-3' （配列番号：１３）
（RS4-L ）5'-AATTC AAAGAA TAACGTA TTCTTTCATCAA GAGCT-3' （配列番号：１４）
（RS304-S ）5'-C TTGATGAAAGAA TAACGTA TTCTTT A-3' （配列番号：１５）
（RS304-L ）5'-AGCTT AAAGAA TACGTTA TTCTTTCATCAA GCATG-3' （配列番号：１６）
【００４７】
まず、市販のプラスミドであるｐＵＣ１９を制限酵素EcoR I及びSac I で切断した。合成ＤＮＡであるＲＳ４−Ｓ及びＲＳ４−Ｌをアニーリングし、ｐＵＣ１９のEcoR IーSac I 断片とライゲーションすることにより、ｐＲＳ４を構築した。さらにｐＲＳ４を制限酵素Sph I 及びHind IIIで切断し、合成ＤＮＡＲＳ３０４−Ｓ及びＲＳ３０４−ＬとライゲーションすることによりプラスミドｐＲＳ３０４−４−４を構築した。これを図３に示す。
【００４８】
（２）形質転換用プラスミドの構築
（２−１）プラスミド ｐＲＳ１５３ｄＢ１の作製
Ｒ遺伝子発現用プラスミドｐＨＭ１５３中において、Ｒ遺伝子はガラクトースで発現が誘導されるプロモーター（ＧＡＬ１プロモーター）で発現が制御されている。ｐＨＭ１５３をBamHI で消化した後、ＤＮＡ Ｂｌｕｎｔｉｎｇ ｋｉｔ（宝酒造社製）を用いて平滑末端処理を行った。
【００４９】
得られたＤＮＡ断片をセルフライゲーションすることにより得られたプラスミドをｐＨＭ１５３ｄＢとした。また、実施例２（１）において得られたプラスミドｐＲＳ３０４−４−４をSmaIとSacIで消化した後、同様に平滑末端処理を行った。得られた約２．９ｋｂのＤＮＡ断片に、ｐＨＭ１５３ｄＢをEcoR IとSalIで処理した後、同じく平滑末端処理を行って得られた約２．８ｋｂのＤＮＡ断片を組み込んで得られたプラスミドをｐＲＳ１５３ｄＢ１とした。これを図４に示す。
【００５０】
（２−２）プラスミドｐＰＲＡ１５３ｄＢ１の作製
プラスミドｐＲＳ１５３ｄＢ１をEcoR IとHind IIIで消化して得られる約２．８ｋｂのＤＮＡ断片と酵母（Saccharomyces cerevisiae ）のプロテアーゼＡ遺伝子の全長を含むプラスミドｐＰＲＡ１−２（Woodford, C.A., et al., Mol. Cell. Biol., 6, 2500-2510, 1988）をEcoR IとHind IIIで消化して得られる約４．２ｋｂのＤＮＡ断片とを連結して得られるプラスミドをｐＰＲＡ１５３ｄＢ１とした。これを図５に示す。なお、プラスミドｐＰＲＡ１−２をEcoR IとHind IIIで消化して得られる約４．２ｋｂのＤＮＡ断片には、プロテアーゼＡの５’上流領域８２ｂｐおよび開始コドンであるＡＴＧを含むＮ末端アミノ酸残基１３６残基が欠けている。
【００５１】
（２−３）プラスミドｐＰＲＡＧ４１８の作製
プラスミドｐＰＲＡ１５３ｄＢ１をBamHI で消化した後、大腸菌（E.coli A19）のアルカリホスファターゼで脱リン酸化し得られたＤＮＡ断片に、プラスミドｐＩＧＺ２（Nakazawa, N., et al., J. Ferment. Bioeng., 73, 265-270, 1992）をBamHI で消化して得られる約２．４ｋｂのＤＮＡ断片を連結し、プラスミドｐＰＲＡＧ４１８を作製した。これを図６に示す。このBamHI 断片には、酵母の構成的なプロモーターの一つであるグリセロアルデヒド ３リン酸脱水素酵素のプロモーターの下流に連結されたＧ４１８耐性を付与する遺伝子が含まれている。
【００５２】
（３）研究室株を用いたマーカー遺伝子の除去
一倍体の酵母としてＲ２７−７Ｃ−１Ｃ（ＭＡＴ α ｔｒｐ１ ｌｅｕ２ ｈｉｓ３ ｕｒａ３）を用いた。酵母の形質転換はリチュウムクロライドを用いた方法（Kodama, Y., et al. , J. Am. Soc. Brew. Chem., 53, 24-29, 1995 ）により行うことが可能である。実施例２（２−３） において得られたｐＰＲＡＧ４１８をSacIとNcoIで処理して得られた約５．８ｋｂのＤＮＡ断片（約１０μｇ）を酵母への組換えに使用し、形質転換体のゲネチシン耐性により選択した。すなわち、３００μｇ／ｍｌの濃度のゲネチシンを含むＹＰＤ寒天プレート（ペプトン２％、グルコース２％、酵母エキス１％、寒天２％）に上記形質転換操作をした酵母をまき、３０℃で７２時間インキュベートする。
【００５３】
Ｇ４１８遺伝子を含む形質転換株のみがこの寒天培地で生育可能であるため、出現したコロニーを形質転換株として選択した。得られた形質転換体はガラクトースを含む培地で培養することにより、Ｒ蛋白質をコードする遺伝子が発現し酵母細胞内でＲ蛋白質が誘導生産される。生産されたＲ蛋白質はＧ４１８薬剤耐性遺伝子の両端に挿入された認識配列を認識し、この認識配列にはさまれた領域を切断除去することが可能である。そこで、得られた形質転換体のコロニーを１０ｍｌのＹＰＧａｌ（ペプトン２％、ガラクトース５％、酵母エキス１％）液体培地にて３０℃、４８時間培養し認識配列の組換えを誘導した。
【００５４】
培養液を無菌水で１０万倍に希釈した後、そのうちの２０μｌをＹＰＤ寒天培地にまき、３０℃で４８時間培養した。得られた約１万コロニーのうち１１株を無作為に選択し、６００μｇ／ｍｌの濃度でゲネチシンを含むＹＰＤ寒天培地とゲネチシンを含まない同培地で、３０℃、４８時間それぞれ培養した。選択した１１株は全てゲネチシンを含まない培地のみで生育が可能であり、選択マーカー遺伝子が除去されたと考えられる。
なお、ここで行われたプロテアーゼＡ遺伝子の破壊及び部位特異的組換えによる選択マーカーの除去について、図７にその概略を示す。
【００５５】
（４）醸造用酵母を用いたマーカー遺伝子の除去
（４−１）１回目の形質転換
形質転換体の作出は研究室株を用いた場合と同じ方法で行った。宿主としては高次倍数体の醸造用株ＢＨ８４（Kodama, Y., et al. , J. Am. Soc. Brew. Chem., 53, 24-29, 1995 ）を用いたが、二倍以上の倍数性を持つ酵母であればいずれの酵母を用いても良い。得られた形質転換体のコロニーを、５％のガラクトースを含む１０ｍｌのＹＮＢ液体培地にて３０℃、４８時間培養した。
【００５６】
ガラクトースを含む培地で培養することにより、Ｒ蛋白質をコードする遺伝子を発現させ酵母細胞内でＲ蛋白質を生産させる。Ｒ蛋白質はＧ４１８薬剤耐性遺伝子の両端に挿入されたＲ認識配列を認識し、このＲ認識配列部分を切断除去することが可能である。よって、５％ガラクトースを含む酵母最少培地（Yeast Nitrogen Base w/o amino acid （DIFCO 社））液体培地で４８時間培養した後の培養液を純水で１０万倍に希釈し、そのうちの２０μｌを５％ガラクトースを含むＹＮＢ寒天培地にまき、３０℃で４８時間培養した。
【００５７】
得られた約1 万コロニーのうち１２５株を選択し、２％グルコースと６００μｇ／ｍｌのゲネチシンを含む酵母最少寒天培地とゲネチシンを含まない同培地で、３０℃、４８時間それぞれ培養した。そのうち、ゲネチシンを含む培地では生育できないが、ゲネチシンを含まない培地には生育可能な株が１株得られた。
【００５８】
（４−２）２回目の形質転換
上記操作によって得られたプロテアーゼＡ遺伝子が１遺伝子破壊され、さらに耐性マーカーが欠失した株を基に２回目の形質転換を行った。コンピテント細胞の調製ならびにプラスミドｐＰＲＡＧ４１８を用いた形質転換はすべて１回目の形質転換と同条件にて行った。１回目の形質転換の時に用いたものと同じゲネチシンを含むＹＰＤ寒天培地で形質転換株の選択を行ったところ、５株のゲネチシン耐性を持つ形質転換株が得られた。
【００５９】
上記操作により得られた５株の形質転換株から１株を選び、選択マーカー遺伝子の切断除去を行った。Ｒ蛋白質の誘導と選択マーカー遺伝子の除去は全て１回目の場合と同様に行った。その結果、６００μｇ／ｍｌのゲネチシンを含む培地では生育できないが、ゲネチシンを含まない培地では生育可能な株が３株得られた。
【００６０】
（４−３）プロテアーゼＡ遺伝子の破壊
形質転換が成功し、プロテアーゼＡをコードする染色体上の遺伝子が破壊されたことは、次のようなサザンブロット解析をすることにより確認することができる。Ｒ遺伝子を発現した後の形質転換株の染色体ＤＮＡを常法に従い抽出し、制限酵素Hind IIIで切断する。アガロースゲルにて泳動した後ニトロセルロースにブロッティングし、プロテアーゼＡをコードするプラスミド（ｐＰＲＡ１−２）を制限酵素SacI-XhoI で切断した１．９ｋｂｐの断片をプローブとしてサザンブロットを行う。
【００６１】
その結果、野性株では４．２及び１．２ｋｂのバンドが検出され（図８のレーン１及び２）、一回目の形質転換では７．９及び１．２ｋｂのバンドが検出され（図８のレーン３）、そしてＲ遺伝子を発現した後の形質転換体では３．７及び１．２ｋｂのバンドが検出される（図８のレーン４）。バンドの濃淡から遺伝子破壊された染色体数が推定できる。このようにして、プロテアーゼＡ遺伝子の１遺伝子破壊株、２遺伝子破壊株を確認した。この結果を図８に示す。
【００６２】
実施例３． リゾパス属由来グルコアミラーゼ遺伝子の野生型酵母への導入及 びその発現
酵母(Saccharomyces cerevisiae) AY-01株は２倍体である。グルコアミラーゼ遺伝子を導入する際、形質転換と部位特異的組換え配列でのマーカー遺伝子の切り出しを２回繰り返えすことにより、対立する両方の染色体の同じ位置にグルコアミラーゼ遺伝子のみを導入することが出来る。
【００６３】
（１）形質転換用のプラスミド pUPRGA3 の構築
Ｒ認識配列をプラスミドに導入するために４種類のオリゴヌクレオチドを合成した。
(RS3-S) 5'-C TTGATGAAAGAA TACGTTA TTCTTTCA-3'（配列番号：17）
(RS3-L) 5'-AATTC TGAAAGAA TAACGTA TTCTTTCATCAA GAGCT-3'（配列番号：18）
(RS303-S) 5'-C TTGATGAAAGAA TAACGTA TTCTTTCA-3'（配列番号：19）
(RS303-L) 5'-AGCT TGAAAGAA TACGTTA TTCTTTCATCAA GCATG-3' （配列番号：20）
これらの合成ＤＮＡの5'末端をリン酸化したのち、RS3-S とRS3-L 、RS303-S とRS303-L をそれぞれアニーリングし、前者をpUC19 の制限酵素EcoRI-SacIサイトに、つづいて後者を制限酵素SphI-HindIIIサイトに挿入し、プラスミドpRS303-3を構築した。
【００６４】
次に、pRS303-3を制限酵素SacI消化後Bulunting Kit （宝酒造( 株) 製）で末端を平滑化したのち制限酵素SphIで消化して得た2.7kb の断片と、プラスミドpPRACer11 （図１２）を制限酵素SalIで消化後Bulunting Kit で末端を平滑化したのち制限酵素SphIで消化して得た2.7kb の断片とを連結し、プラスミドpRS303-3-Cerを得た。
pRS303-3-Cerの制限酵素SalIサイトに、pPRACer11 を制限酵素SalIで消化して得られる2.7kb 断片を挿入し、プラスミドpRCer303-3-1を構築した。
【００６５】
pRCer303-3-1をHindIII で消化後、Bulunting Kit で末端を平滑化し、pSmaI linker（宝酒造( 株) 製）を挿入してpRCer303-3-2を構築した。
pUC19 を制限酵素EcoRI-HindIII で消化し、pRCer303-3-2を制限酵素SmaI-EcoRIで消化して得られる5.5kb 断片と、YEp24(Botstein, D., et al. Gene, 8,17,1979) のURA3遺伝子を含む1.1kb の制限酵素HindIII-SmaI断片とを連結して挿入し、pU5'RCerRS3 を構築した。
【００６６】
pUC18 を制限酵素EcoRI 及びSphIで消化し、Bulunting Kit （宝酒造）で末端を平滑化したあと連結し、pUC18HSpを構築した。この制限酵素HindIII サイトにYEp24 のURA3遺伝子を含む1.2kb の制限酵素HindIII 断片を挿入し、pURA34を構築した。
pURA34のSmaIサイトにpEcoRI linker （宝酒造）を挿入してpURA35を構築し、これを制限酵素EcoRI で消化し、制限酵素HindIII で部分消化した2.8kb の断片とpU5'RCerRS3 の6.6kb の制限酵素HindIII-EcoRI 断片を連結し、プラスミドpUPRRS3 を構築した。
【００６７】
pUPRRS3 の制限酵素SmaIサイトに、PYGA2269（Ashikari,T.,et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 30,535,1989 ）の3.2kb の制限酵素HindIII 断片をBulunting Kit （宝酒造）で末端を平滑化したのち挿入しプラスミドpUPRGA3 を構築した（図１３）。
このプラスミドでは、図１３に示すとおり、URA3遺伝子のコード領域の下流に以下の遺伝子が挿入されている。
【００６８】
A ．構成的に発現される酵母グリセルアルデヒド３−リン酸脱水素酵素遺伝子(GAP) プロモーターにつないだグルコアミラーゼ遺伝子。これが本実施例において導入したい遺伝子である。
B ．部位特異的組換え配列（RS303,RS3 ）で挟まれた、マーカー遺伝子（PDR4；セルレニン及びシクロヘキシミド耐性遺伝子）および部位特異的組換え配列間の組換えを触媒する酵素のＲ遺伝子。Ｒ遺伝子はガラクトースで発現誘導されるようにGAL1プロモーターにつないでいる。これらの遺伝子は、形質転換株の選択の後、部位特異的組換え配列での組換えにより除去されるように設計した。
【００６９】
（２）形質転換（その１）
形質転換には５μgのプラスミドpUPRGA3 を制限酵素HindIII で消化し、エタノール沈殿後、10μlのＴＥ緩衝液に溶解してその全量を使用した。宿主として酵母（Saccharomyces cerevisiae）AY-01 株（a/α野生型）を用い、プラスミドpUPRGA3 の制限酵素HindIII 消化物でリチウム法により形質転換した。その後、1.0 ％シクロヘキシミドを含むＹＰＤプレートにひろげ、30℃で３日間培養してシクロヘキシミド耐性株を選択した。
【００７０】
得られた約400 株の形質転換株のうち、４株（GA3-PDR4- ＃1 、＃2 、＃3 及び＃4 ）をサザンブロッティングで解析した。染色体は制限酵素HindIII で消化しURA3遺伝子をプローブとした。その結果、４株とも1.2kb と9.7kb の断片が検出された。これは親株のAY-01 株と比較すると、染色体の一方のURA3遺伝子の位置に8.5kb の挿入があることを示しており、上記のA 、B 両方が挿入されているものと考えられた。
【００７１】
（３）マーカー遺伝子の切り出し（その１）
マーカー遺伝子を切り出すために、前記形質転換（その１）で得られた形質転換株（GA3-PDR4- ＃1 、＃2 、＃3 及び＃４）１白金耳を合成培地（yeast nitrogen base w/o amino acid 6.7g 、ガラクトース2g /1L）10mlに植菌し、30℃で一晩振とう培養してR 遺伝子を誘導した。適当に希釈しYPD プレートにひろげて３日間30℃で培養した。これらのコロニーを各形質転換株由来のものから200 個ずつ計800 個選択し、YPD プレートおよび1.0mg/mlのシクロヘキシミドを含むＹＰＤプレートにレプリカし、30℃で3 日間培養し、シクロヘキシミド耐性を調べた。
【００７２】
その結果、３株（GA3-＃1028、＃1151及び＃1171）のシクロヘキシミド感受性の株が得られた。これらの株をサザンブロッティングで解析した結果、GA3-＃1028、＃1151及び＃1171の3 株では4.2kb と1.2kb の断片が検出され、一方の染色体のURA3領域に約3kb の挿入があることを示していた。これは形質転換株のマーカーが部位特異的組換えにより切り出され、グルコアミラーゼ遺伝子のみが挿入されていることを示している。
【００７３】
（４）形質転換（その２）
GA3-＃1028及び＃1171を、前記形質転換（その１）と同様に形質転換した。形質転換株として前者由来のものが６株、後者由来のものが３株得られた。これらをサザンブロッティングで解析した。その結果、１株(GA3-PDR4-＃135)は4.2kb と9.7kb の断片が検出された。これは一方の染色体のURA3遺伝子の位置にはA のみ、他方はA とB の両方が挿入されていることを示しており、すでに遺伝子が挿入されている染色体とはちがう染色体に新たに遺伝子が挿入されたものと考えられる。
【００７４】
（５）マーカー遺伝子の切り出し（その２）
マーカー遺伝子の切り出し（その１）と同様にして、GA3-PDR4- ＃135 株を１日間ガラクトースを含む培地で培養し、Ｒ遺伝子を誘導した。800 個のコロニーを選択しシクロヘキシミド耐性を調べたが、シクロヘキシミド感受性の株はなかった。
そこでＲ遺伝子を誘導期間を２日間にし、そのうち400 株を選択してシクロヘキシミド耐性を調べた。その結果、７株（GA3-＃5197、＃5198、＃5199、＃5200、＃6198、＃6199及び＃6200 )がシクロヘキシミド感受性になった。これらの株は誘導後まいたＹＰＤプレート上で若干大きめのコロニーを形成していた。サザンブロッティングで解析したところ、4.2kb の断片が検出され、両方の染色体のURA3領域に約３kbの挿入があることを示しており、グルコアミラーゼ遺伝子のみが挿入されていると考えられた。
【００７５】
（６）グルコアミラーゼ遺伝子の発現
親株AY-01 株とグルコアミラーゼ遺伝子導入株３株（GA3-PDR4- ＃1 、GA3-＃1028及びGA3-＃5197）をＹＰＤ培地に１白金耳植菌し、３０℃で１８時間培養した。培養液の一部を取り、遠心分離後の上清を用いてグルコアミラーゼ活性を測定した。測定は熱により糊化させた可溶性澱粉を用い４０℃で反応させた後に遊離したグルコースの量を定量することにより測定した。
【００７６】
グルコアミラーゼの酵素活性は４０℃で１分間に１μmoleのグルコースを遊離する活性を１単位とした。その結果、親株であるAY-01 株ではグルコアミラーゼ活性を全く示さなかったが、グルコアミラーゼ遺伝子導入株３株、GA3-PDR4- ＃1 、GA3-＃1028及びGA3-＃5197では、培溶液上清１ml当たりそれぞれ0.173 、0.179 及び0.389 ユニットのグルコアミラーゼを分泌生産していた。
【００７７】
【発明の効果】
以上のように酵母の部位特異的組換え機構を用いて形質転換体から選択マーカー遺伝子を除く技術が確立された。その結果、後代をとったり、再度の形質転換や交配などの操作を伴うことなく、選択マーカー遺伝子の除去が可能となった。また、本発明において定義する１対のＲ認識配列を用いることにより、組換え後に残存する配列がもはやＲ蛋白質により認識されにくい配列になることから、選択マーカー遺伝子除去後の形質転換個体を用いて再び、同じ選択マーカーを用いた形質転換が可能となった。
【００７８】
このことは理論的には同じ選択マーカーをもちいて無限の遺伝子を同一個体に導入する技術が可能となったことを意味する。また、我々が発明した方法を用いることにより、形質転換体から選択マーカー遺伝子を特異的に除去できることから、組換え体の安全性評価においても選択マーカー遺伝子に関する評価を省略することが可能であり、育種された個体の産業利用において非常に有用な技術を提供することができる。
【００７９】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、プラスミドｐＨＭ９９９の構造を示す図である。
【図２】図２は、プラスミドｐＯＤＡ２の構造を示す図である。
【図３】図３は、プラスミドｐＲＳ３０４−４−４の構造を示す図である。
【図４】図４は、プラスミドｐＲＳ１５３ｄＢ１の構築の概略を示す図である。
【図５】図５は、プラスミドｐＰＲＡ１５３ｄＢ１の構築の概略を示す図である。
【図６】図６は、プラスミドｐＰＲＡＧ４１８の構築の概略を示す図である。
【図７】図７は、プロテアーゼＡ遺伝子の破壊及び部位特異的組換えによる選択マーカー遺伝子の除去についての概略を示す図である。
【図８】図８は、サザンブロット解析の結果を示し、電気泳動の結果を示す図面代用写真である。
【図９】図９は、１対のＲ認識配列内で組換えが生ずる際の１対のＲ認識配列の配置を示す。２本の交線（Ｘ記号）は組換えが生ずる部位を示す。
【図１０】図１０において、（Ａ）は１対のＲ認識配列間で組換えが生ずる際のＲ認識配列の塩基配列の配置を様式的に示す図である。（Ｂ）は、Ａに示す１対のＲ認識配列間で組換えが生じた際に生成するＲ認識配列の融合体の塩基配列を示す図である。
【図１１】図１１は、本発明の方法を用いて酵母の染色体に目的遺伝子を組み込む場合の方法を示す模式図である。
【図１２】図１２は、プラスミドｐＰＲＡＣｅｒｌｌの構造を示す図である。
【図１３】図１３は、プラスミドｐＵＰＲＧＡ３の構造を示す図である。
Claims (6)
- 誘導性プロモーターの制御下に配置された醤油酵母（ Zygosaccharomyces rouxii ）由来のＲ遺伝子と発現可能な選択マーカー遺伝子とを挟む、同方向に配置された１対のＲ認識配列を含んで成るＤＮＡ断片の両端に、酵母の染色体ＤＮＡとの間で組換えが可能なＤＮＡ断片が直接又は間接に連結されているＤＮＡ構成物において、前記Ｒ認識配列が次の塩基配列：
- 前記酵母の染色体ＤＮＡとの間で組換え可能なＤＮＡ断片と、その近傍にあるＲ認識配列との間に、酵母染色体に組み込むべき目的遺伝子が挿入されている、請求項１に記載のＤＮＡ構成物。
- プラスミド中に挿入されている請求項１又は２項に記載のＤＮＡ構成物。
- 酵母の形質転換方法において、
（１）請求項１〜３のいずれか１項に記載のＤＮＡ構成物を酵母細胞に導入し、該ＤＮＡ構成物の両端に存在する酵母の染色体との間で組換可能なＤＮＡ断片と酵母染色体ＤＮＡとの間の組換により、該ＤＮＡ構成物を酵母染色体に組み込み、
（２）前記発現可能な選択マーカー遺伝子の発現により、前記ＤＮＡ構成物が酵母染色体に導入された酵母細胞を選択し、
（３）前記誘導性プロモーターを誘導することにより醤油酵母（ Zygosaccharomyces rouxii ）由来のＲ遺伝子を発現せしめ、これによって前記１対のＲ認識配列間において組換えを起こし、前記誘導性プロモーターの制御下に配置された醤油酵母（ Zygosaccharomyces rouxii ）由来のＲ遺伝子と発現可能な選択マーカー遺伝子とを切除する、
ことを特徴とする方法。 - 前記酵母の染色体ＤＮＡとの間で組換え可能なＤＮＡ配列と、その近傍にあるＲ認識配列との間に、酵母染色体に組み込むべき目的遺伝子が挿入されているＤＮＡ構成物を用い、該目的遺伝子を酵母染色体に挿入することを特徴とする、請求項４に記載の方法。
- 請求項４に記載の工程（１）〜（３）を複数回反復することを特徴とする、請求項４又は５に記載の方法。
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