JPH1066587A - 選択マーカー遺伝子を持たない形質転換体の作製方法 - Google Patents
選択マーカー遺伝子を持たない形質転換体の作製方法Info
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- JPH1066587A JPH1066587A JP9179131A JP17913197A JPH1066587A JP H1066587 A JPH1066587 A JP H1066587A JP 9179131 A JP9179131 A JP 9179131A JP 17913197 A JP17913197 A JP 17913197A JP H1066587 A JPH1066587 A JP H1066587A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 酵母染色体に目的遺伝子を挿入した後に選択
マーカーが排除されるようにした形質転換系の提供。 【解決手段】 誘導性プロモーターの制御下に配置され
たＲ遺伝子と発現可能な選択マーカー遺伝子を挟む、同
方向に配置された１対のＲ認識配列を含んで成るＤＮＡ
断片の両端に、酵母の染色体ＤＮＡとの間で組換え可能
なＤＮＡ断片が直接又は間接に連結されているＤＮＡ構
成物において、前記Ｒ認識配列が非対称に短縮されてい
るために、Ｒ遺伝子の発現によってＲ認識配列の組換が
生じて選択マーカーが排除された後には、機能し得るＲ
認識配列が残らないようにしたＤＮＡ構成物。選択マー
カー排除後に機能し得るＲ認識配列が残らないので再組
換えが生じず、同一の選択マーカーを用いて外来遺伝子
を複数回挿入することができる。
マーカーが排除されるようにした形質転換系の提供。 【解決手段】 誘導性プロモーターの制御下に配置され
たＲ遺伝子と発現可能な選択マーカー遺伝子を挟む、同
方向に配置された１対のＲ認識配列を含んで成るＤＮＡ
断片の両端に、酵母の染色体ＤＮＡとの間で組換え可能
なＤＮＡ断片が直接又は間接に連結されているＤＮＡ構
成物において、前記Ｒ認識配列が非対称に短縮されてい
るために、Ｒ遺伝子の発現によってＲ認識配列の組換が
生じて選択マーカーが排除された後には、機能し得るＲ
認識配列が残らないようにしたＤＮＡ構成物。選択マー
カー排除後に機能し得るＲ認識配列が残らないので再組
換えが生じず、同一の選択マーカーを用いて外来遺伝子
を複数回挿入することができる。
Description
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、酵母の部位特異的
組換えを用いて、選択マーカー遺伝子が欠失した形質転
換体を作製する方法に関する。この方法を利用すること
により、目的とする遺伝子を酵母に導入した後に、選択
マーカー遺伝子を有しない酵母の形質転換体を得ること
ができる。
組換えを用いて、選択マーカー遺伝子が欠失した形質転
換体を作製する方法に関する。この方法を利用すること
により、目的とする遺伝子を酵母に導入した後に、選択
マーカー遺伝子を有しない酵母の形質転換体を得ること
ができる。
【０００２】
【従来の技術】現在までに多くの遺伝子導入方法が報告
されているが、遺伝子導入効率が低いため、それらのい
ずれの方法も組換え体を選択するマーカーが必要であ
る。選択マーカーとしては酵母などで用いられている栄
養要求性の回復などがあるが、一般的には抗生物質など
の薬剤に対する抵抗性遺伝子が用いられる。しかしなが
ら、形質転換体を選択した後は組換え体の実用化におけ
る安全性の面などから、選択マーカー遺伝子を取り除く
ことが望ましい。また、効率良く利用できる選択マーカ
ー遺伝子の種類が少ないことから同一個体を繰り返し形
質転換するためにはマーカー遺伝子の再利用を行うこと
が望まれる。
されているが、遺伝子導入効率が低いため、それらのい
ずれの方法も組換え体を選択するマーカーが必要であ
る。選択マーカーとしては酵母などで用いられている栄
養要求性の回復などがあるが、一般的には抗生物質など
の薬剤に対する抵抗性遺伝子が用いられる。しかしなが
ら、形質転換体を選択した後は組換え体の実用化におけ
る安全性の面などから、選択マーカー遺伝子を取り除く
ことが望ましい。また、効率良く利用できる選択マーカ
ー遺伝子の種類が少ないことから同一個体を繰り返し形
質転換するためにはマーカー遺伝子の再利用を行うこと
が望まれる。
【０００３】これらの問題を解決するために形質転換体
から選択マーカー遺伝子を除くいくつかの方法が開発さ
れている。例えば、コトランスフォーメーションの様に
導入したい遺伝子と選択マーカー遺伝子を別のプラスミ
ドまたはＤＮＡ断片上にのせ、別々の構成物として同時
に細胞に導入する方法がある。この方法ではそれぞれの
遺伝子が独立して存在するために、後代をとることによ
り、導入目的遺伝子を持つが選択マーカー遺伝子を持た
ない個体を得ることが可能である。また、トランスポゾ
ンを利用する方法も開発されている。
から選択マーカー遺伝子を除くいくつかの方法が開発さ
れている。例えば、コトランスフォーメーションの様に
導入したい遺伝子と選択マーカー遺伝子を別のプラスミ
ドまたはＤＮＡ断片上にのせ、別々の構成物として同時
に細胞に導入する方法がある。この方法ではそれぞれの
遺伝子が独立して存在するために、後代をとることによ
り、導入目的遺伝子を持つが選択マーカー遺伝子を持た
ない個体を得ることが可能である。また、トランスポゾ
ンを利用する方法も開発されている。
【０００４】これらは遺伝子導入後、トランスポゾンを
働かせることにより、導入目的遺伝子と選択マーカー遺
伝子の連鎖をなくし、その後に先ほどの例と同じく後代
をとることにより、導入目的遺伝子を持つが選択マーカ
ー遺伝子を持たない個体を得ることが可能である。しか
しながらこれらの方法は後代をとる必要があり、操作が
煩雑で時間がかかる。また、後代をとることによるばら
つきが生じ、実用的ではない。
働かせることにより、導入目的遺伝子と選択マーカー遺
伝子の連鎖をなくし、その後に先ほどの例と同じく後代
をとることにより、導入目的遺伝子を持つが選択マーカ
ー遺伝子を持たない個体を得ることが可能である。しか
しながらこれらの方法は後代をとる必要があり、操作が
煩雑で時間がかかる。また、後代をとることによるばら
つきが生じ、実用的ではない。
【０００５】一方、部位特異的な組換えを利用した方法
も開発されている。部位特異的組換えは組換えを行う酵
素とその酵素が認識する特異的な塩基配列の２つの要素
からなっており、組換え酵素は２個の認識配列間で組換
えを引き起こすことが知られている。これらの組換えは
認識配列の配置により、欠失、挿入、逆位などの現象を
引き起こす。部位特異的な組換えとしてバクテリオファ
ージＰ１由来のＣｒｅ／ｌｏｘ、出芽酵母（Saccharomy
ces cerevisiae）由来のＦＬＰ／ＦＲＴ、醤油酵母（Zy
gosaccharomyces rouxii）由来のＲ／ＲＳ、そして、バ
クテリオファージＭｕ由来のＧｉｎ／ｇｉｘの４つが知
られている。
も開発されている。部位特異的組換えは組換えを行う酵
素とその酵素が認識する特異的な塩基配列の２つの要素
からなっており、組換え酵素は２個の認識配列間で組換
えを引き起こすことが知られている。これらの組換えは
認識配列の配置により、欠失、挿入、逆位などの現象を
引き起こす。部位特異的な組換えとしてバクテリオファ
ージＰ１由来のＣｒｅ／ｌｏｘ、出芽酵母（Saccharomy
ces cerevisiae）由来のＦＬＰ／ＦＲＴ、醤油酵母（Zy
gosaccharomyces rouxii）由来のＲ／ＲＳ、そして、バ
クテリオファージＭｕ由来のＧｉｎ／ｇｉｘの４つが知
られている。
【０００６】これらの系を用いた部位特異的組換えは数
多く報告されている（Odell, J. T.and Russell, S.
H., In : Paszkowski ( ed.) Homologous Recombinatio
n andGene Silencing in Plants, pp 219-270, 1994 、
Kluwer Academic Publishers, Netherlands 、Yoder,
J. I. and Goldsbrough A. P., Bio/Technology , 12,2
63- 267, 1994 ）。例えば、出芽酵母のＦＬＰ／ＦＲＴ
の系を用いてメタノール酵母（Pichia pastoris ）でマ
ーカー遺伝子の切り出しが行われている（Cregg, J. M.
and Madden, K. R. , Mol. Gen. Genet. 219, 320- 32
3, 1989 ）。
多く報告されている（Odell, J. T.and Russell, S.
H., In : Paszkowski ( ed.) Homologous Recombinatio
n andGene Silencing in Plants, pp 219-270, 1994 、
Kluwer Academic Publishers, Netherlands 、Yoder,
J. I. and Goldsbrough A. P., Bio/Technology , 12,2
63- 267, 1994 ）。例えば、出芽酵母のＦＬＰ／ＦＲＴ
の系を用いてメタノール酵母（Pichia pastoris ）でマ
ーカー遺伝子の切り出しが行われている（Cregg, J. M.
and Madden, K. R. , Mol. Gen. Genet. 219, 320- 32
3, 1989 ）。
【０００７】彼らはＡＲＧ４遺伝子を選択マーカーと
し、同方向に繰り返し配置したＦＲＴの間にＡＲＧ４遺
伝子を組み込み、ａｒｇ４変異株のメタノール酵母を形
質転換した。その後、組換え酵素の遺伝子であるＦＬＰ
を持つプラスミドを同じメタノール酵母に導入し、部位
特異的な組換えを誘発し、選択マーカー遺伝子であるＡ
ＲＧ４の切り出しに成功している。この様に部位特異的
な組換えをマーカーの切り出しに利用できることは既に
報告されているが、Cregg らの例にもみられるように、
部位特異的な組換えを誘発するために最初の形質転換体
が得られた後、組換え酵素の遺伝子を導入し、部位特異
的組換えを誘導するという方法が採られている。
し、同方向に繰り返し配置したＦＲＴの間にＡＲＧ４遺
伝子を組み込み、ａｒｇ４変異株のメタノール酵母を形
質転換した。その後、組換え酵素の遺伝子であるＦＬＰ
を持つプラスミドを同じメタノール酵母に導入し、部位
特異的な組換えを誘発し、選択マーカー遺伝子であるＡ
ＲＧ４の切り出しに成功している。この様に部位特異的
な組換えをマーカーの切り出しに利用できることは既に
報告されているが、Cregg らの例にもみられるように、
部位特異的な組換えを誘発するために最初の形質転換体
が得られた後、組換え酵素の遺伝子を導入し、部位特異
的組換えを誘導するという方法が採られている。
【０００８】つまり、誘導には２回の形質転換が必要で
あり、さらにはそのための別の選択マーカーが必要とな
る。その他に報告されている部位特異的な組換えも組換
え酵素遺伝子の導入は最初の形質転換体を得た後に行わ
れており、再度の形質転換か、交雑による組換え酵素遺
伝子の導入が必須である。また、Araki らにより醤油酵
母のプラスミドｐＳＲ１に部位特異的組換えの機構が存
在することが明らかになっている（Araki, H., et al
J. Mol. Biol., 182, 191-203, 1985）。
あり、さらにはそのための別の選択マーカーが必要とな
る。その他に報告されている部位特異的な組換えも組換
え酵素遺伝子の導入は最初の形質転換体を得た後に行わ
れており、再度の形質転換か、交雑による組換え酵素遺
伝子の導入が必須である。また、Araki らにより醤油酵
母のプラスミドｐＳＲ１に部位特異的組換えの機構が存
在することが明らかになっている（Araki, H., et al
J. Mol. Biol., 182, 191-203, 1985）。
【０００９】プラスミドｐＳＲ１は、６２５１ｂｐから
なる環状プラスミドで、分子中に９５９ｂｐからなる一
対の逆向き反復配列を持ち、この逆向き反復配列間で部
位特異的組換えを起こすことが知られている。この逆向
き反復配列内の組換え部位は、７ｂｐのスペーサー配列
を挟む１２ｂｐの短い逆向き反復配列から構成され、さ
らに、片側には、４個の同じ１２ｂｐ配列の繰り返しが
続く。部位特異的組換えは、プラスミド自身にコードさ
れた組換えを行う酵素（Ｒ蛋白質）が、逆向き反復配列
内の組換え部位に存在する特異的な塩基配列であるＲ認
識配列に結合することによって起こる。
なる環状プラスミドで、分子中に９５９ｂｐからなる一
対の逆向き反復配列を持ち、この逆向き反復配列間で部
位特異的組換えを起こすことが知られている。この逆向
き反復配列内の組換え部位は、７ｂｐのスペーサー配列
を挟む１２ｂｐの短い逆向き反復配列から構成され、さ
らに、片側には、４個の同じ１２ｂｐ配列の繰り返しが
続く。部位特異的組換えは、プラスミド自身にコードさ
れた組換えを行う酵素（Ｒ蛋白質）が、逆向き反復配列
内の組換え部位に存在する特異的な塩基配列であるＲ認
識配列に結合することによって起こる。
【００１０】なお、Ｒ認識配列（ＲＳ配列）としては、
７ｂｐのスペーサー部分と１２ｂｐの逆向き反復配列か
らなる３１ｂｐの配列が知られている（Matsuzaki, H.,
etal. Biosci. Biotech. Biochem., 58, 1632-1637, 1
994）。この配列を配列表・配列番号１に示す。しかし
ながら、３１ｂｐのＲ認識配列を用いて部位特異的組換
えを行うと、組換え後の構造として、染色体あるいはプ
ラスミドＤＮＡ中に部位特異的酵素の認識配列が残り、
目的としない組換えを誘導する可能性があることから実
用的ではない。
７ｂｐのスペーサー部分と１２ｂｐの逆向き反復配列か
らなる３１ｂｐの配列が知られている（Matsuzaki, H.,
etal. Biosci. Biotech. Biochem., 58, 1632-1637, 1
994）。この配列を配列表・配列番号１に示す。しかし
ながら、３１ｂｐのＲ認識配列を用いて部位特異的組換
えを行うと、組換え後の構造として、染色体あるいはプ
ラスミドＤＮＡ中に部位特異的酵素の認識配列が残り、
目的としない組換えを誘導する可能性があることから実
用的ではない。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】そこで、本発明者ら
は、部位特異的組換えにより選択マーカー遺伝子を除去
した後に残存する配列が、Ｒ遺伝子産物により認識され
にくい配列となるＤＮＡ構成物を作製し、該ＤＮＡ構成
物を用いて形質転換を行うことにより、選択マーカー遺
伝子を欠失した形質転換体を作製する方法を提供するこ
とを課題とした。
は、部位特異的組換えにより選択マーカー遺伝子を除去
した後に残存する配列が、Ｒ遺伝子産物により認識され
にくい配列となるＤＮＡ構成物を作製し、該ＤＮＡ構成
物を用いて形質転換を行うことにより、選択マーカー遺
伝子を欠失した形質転換体を作製する方法を提供するこ
とを課題とした。
【００１２】
【課題を解決するための手段】上記の課題を解決するた
め、本発明は、誘導性プロモーターの制御下に配置され
たＲ遺伝子と発現可能な選択マーカー遺伝子とを挟む、
同方向に配置された１対のＲ認識配列を含んで成るＤＮ
Ａ断片の両端に、酵母染色体ＤＮＡとの間で組換えが可
能なＤＮＡ断片が連結されているＤＮＡ構成物におい
て、前記Ｒ認識配列が次の塩基配列：
め、本発明は、誘導性プロモーターの制御下に配置され
たＲ遺伝子と発現可能な選択マーカー遺伝子とを挟む、
同方向に配置された１対のＲ認識配列を含んで成るＤＮ
Ａ断片の両端に、酵母染色体ＤＮＡとの間で組換えが可
能なＤＮＡ断片が連結されているＤＮＡ構成物におい
て、前記Ｒ認識配列が次の塩基配列：
【００１３】
【化２】
【００１４】を含んで成るか又はこれと実質的に同一な
配列を含んで成り、但し前記Ｒ遺伝子の近傍に位置する
Ｒ認識配列は該Ｒ遺伝子に近接する側とは反対側に存在
する逆向き反復配列のスペーサー配列から遠位の側の１
０個以下の塩基が欠けており、そして選択マーカー遺伝
子の近傍に位置するＲ認識配列は該選択マーカー遺伝子
に近接する側とは反対側に存在する逆向き反復配列のス
ペーサー配列から遠位の側の１０個以下の塩基配列が欠
けていることを特徴とするＤＮＡ構成物を提供する。
配列を含んで成り、但し前記Ｒ遺伝子の近傍に位置する
Ｒ認識配列は該Ｒ遺伝子に近接する側とは反対側に存在
する逆向き反復配列のスペーサー配列から遠位の側の１
０個以下の塩基が欠けており、そして選択マーカー遺伝
子の近傍に位置するＲ認識配列は該選択マーカー遺伝子
に近接する側とは反対側に存在する逆向き反復配列のス
ペーサー配列から遠位の側の１０個以下の塩基配列が欠
けていることを特徴とするＤＮＡ構成物を提供する。
【００１５】
【発明の実施の形態】本発明においては、１対のＲ認識
配列の内、Ｒ遺伝子（例えば図７におけるＲｇｅｎｅ）
の近傍に位置するＲ認識配列（例えば図７におけるＲＳ
４）は、該Ｒ遺伝子に近接する側とは反対側に存在する
逆向き反復配列（例えば化１における逆向き反復配列
（２）；ちなみに図７におけるＲＳ４は左側が３′−末
端であり、右側が５′−末端である）において、スペー
サー配列から遠位の側の１０個以下の塩基配列が欠けて
いる。
配列の内、Ｒ遺伝子（例えば図７におけるＲｇｅｎｅ）
の近傍に位置するＲ認識配列（例えば図７におけるＲＳ
４）は、該Ｒ遺伝子に近接する側とは反対側に存在する
逆向き反復配列（例えば化１における逆向き反復配列
（２）；ちなみに図７におけるＲＳ４は左側が３′−末
端であり、右側が５′−末端である）において、スペー
サー配列から遠位の側の１０個以下の塩基配列が欠けて
いる。
【００１６】また、他方のＲ認識配列は、選択マーカー
遺伝子（例えば、図７における Geneticin耐性遺伝子）
の近傍に位置し（例えば、図７においてＲＳ３０４）、
該選択マーカー遺伝子に近接する側とは反対側に存在す
る逆向き反復配列（例えば化１に示す逆向き反復配列
（１）；ちなみに、図７におけるＲＳ３０４は左側が
３′−末端であり、右側が５′−末端である）におい
て、スペーサー配列から遠位の側の１０個以下の塩基配
列が欠けている。
遺伝子（例えば、図７における Geneticin耐性遺伝子）
の近傍に位置し（例えば、図７においてＲＳ３０４）、
該選択マーカー遺伝子に近接する側とは反対側に存在す
る逆向き反復配列（例えば化１に示す逆向き反復配列
（１）；ちなみに、図７におけるＲＳ３０４は左側が
３′−末端であり、右側が５′−末端である）におい
て、スペーサー配列から遠位の側の１０個以下の塩基配
列が欠けている。
【００１７】１例として、配列番号：４に示すＲＳ４
は、化１（配列番号：１）に示す配列の内、１２個の塩
基から成る逆向き反復配列（２）の内の６塩基が欠けて
いる。また、配列番号：１６中の５′−末端の５塩基及
び３′−末端の５塩基（これらは制限酵素認識部位であ
ってＲ認識配列の部分ではない）を除く中央の３ブロッ
クの配列が図７におけるＲＳ３０４配列であり、この配
列においては、化１（配列番号：１）に示す逆向き反復
配列（１）を構成する１２個の塩基の内６個が欠けてい
る。本発明のＲ認識配列において、上記の意味における
欠けることができる塩基数は、スペーサー配列に隣接す
る反復配列を構成する塩基（計１２個）の内の１０個以
下であり、例えば８個まで、好ましくは６個までであ
る。塩基が１０個より多く欠けると、ＤＮＡ組換えの可
能性が極めて低くなり好ましくない。
は、化１（配列番号：１）に示す配列の内、１２個の塩
基から成る逆向き反復配列（２）の内の６塩基が欠けて
いる。また、配列番号：１６中の５′−末端の５塩基及
び３′−末端の５塩基（これらは制限酵素認識部位であ
ってＲ認識配列の部分ではない）を除く中央の３ブロッ
クの配列が図７におけるＲＳ３０４配列であり、この配
列においては、化１（配列番号：１）に示す逆向き反復
配列（１）を構成する１２個の塩基の内６個が欠けてい
る。本発明のＲ認識配列において、上記の意味における
欠けることができる塩基数は、スペーサー配列に隣接す
る反復配列を構成する塩基（計１２個）の内の１０個以
下であり、例えば８個まで、好ましくは６個までであ
る。塩基が１０個より多く欠けると、ＤＮＡ組換えの可
能性が極めて低くなり好ましくない。
【００１８】上記のごとく、本発明のＲ認識配列は、化
１（配列番号：１）に示す配列を含んで成るが、その一
方の側の逆向き反復配列において、上記のごとく短縮さ
れている。しかしながら、短縮された逆向き反復配列と
は反対側の逆向き反復配列では１２個の塩基がそのまま
維持されていることが望ましく、さらに１〜４個の反復
配列が連結されて延長されていてもよい。ちなみに、前
記のごとく、天然のＲ認識配列においては、化１（配列
番号：１）に示す配列の各端が、さらに４個づつの反復
配列により延長された構造を有しており、本発明のＲ認
識配列においても、前記のごとく短縮された反復配列の
側とは反対の反復配列は、天然配列と同様に複数回反復
していてもよい。
１（配列番号：１）に示す配列を含んで成るが、その一
方の側の逆向き反復配列において、上記のごとく短縮さ
れている。しかしながら、短縮された逆向き反復配列と
は反対側の逆向き反復配列では１２個の塩基がそのまま
維持されていることが望ましく、さらに１〜４個の反復
配列が連結されて延長されていてもよい。ちなみに、前
記のごとく、天然のＲ認識配列においては、化１（配列
番号：１）に示す配列の各端が、さらに４個づつの反復
配列により延長された構造を有しており、本発明のＲ認
識配列においても、前記のごとく短縮された反復配列の
側とは反対の反復配列は、天然配列と同様に複数回反復
していてもよい。
【００１９】本発明のＲ認識配列は、上に定義した配列
を有するものの他に、それと実質的に同じ塩基配列を有
するものも含まれる。ここで「実質的に同じ配列とは、
上記に定義した配列に対して、スペーサー配列以外の部
分において、およそ１個の塩基の置換、欠失又は付加に
より修飾されている塩基配列を意味する。上記のごとき
一対のＲ認識配列を有するＤＮＡ構成物に対して、Ｒ遺
伝子産物が作用すれば、例えば図１０に示すようにＤＮ
Ａの組換えが生ずる。すなわち、１対のＲ認識配列（例
えば図７におけるＲＳ４とＲＳ３０４は図９に示すごと
く配置され、図１０の（Ａ）に示すごとく、ＲＳ４配列
とＲＳ３０４配列がオーバーラップする領域内（例え
ば、図１０（Ａ）において２本の交線で示す位置）にお
いて組換えが生ずる。
を有するものの他に、それと実質的に同じ塩基配列を有
するものも含まれる。ここで「実質的に同じ配列とは、
上記に定義した配列に対して、スペーサー配列以外の部
分において、およそ１個の塩基の置換、欠失又は付加に
より修飾されている塩基配列を意味する。上記のごとき
一対のＲ認識配列を有するＤＮＡ構成物に対して、Ｒ遺
伝子産物が作用すれば、例えば図１０に示すようにＤＮ
Ａの組換えが生ずる。すなわち、１対のＲ認識配列（例
えば図７におけるＲＳ４とＲＳ３０４は図９に示すごと
く配置され、図１０の（Ａ）に示すごとく、ＲＳ４配列
とＲＳ３０４配列がオーバーラップする領域内（例え
ば、図１０（Ａ）において２本の交線で示す位置）にお
いて組換えが生ずる。
【００２０】その結果、Ｒ遺伝子及び選択マーカー遺伝
子が除去されると共に、一方のＲ認識配列（例えばＲＳ
４）の短縮された側の部分と、他方のＲ認識配列（例え
ば、ＲＳ３０４）の短縮された側の部分とが融合した配
列が再構成される。この再構成された配列は、スペーサ
ー配列の両端に短縮された逆向き反復配列を有してお
り、例えばＲＳ４配列とＲＳ３０４配列とからは、図１
０（Ｂ）（配列番号：５）に示すＲＳ４Ｗ配列が生ず
る。
子が除去されると共に、一方のＲ認識配列（例えばＲＳ
４）の短縮された側の部分と、他方のＲ認識配列（例え
ば、ＲＳ３０４）の短縮された側の部分とが融合した配
列が再構成される。この再構成された配列は、スペーサ
ー配列の両端に短縮された逆向き反復配列を有してお
り、例えばＲＳ４配列とＲＳ３０４配列とからは、図１
０（Ｂ）（配列番号：５）に示すＲＳ４Ｗ配列が生ず
る。
【００２１】実施例１に示すごとく、スペーサー配列を
中心にして、一方の側の逆向き反復配列のみが短縮され
たＲ認識配列はＲ遺伝子産物の作用によって組換えを生
ずるが、両側の逆向き反復配列が短縮された場合（例え
ば、ＲＳ４Ｗ配列）にはＲ遺伝子産物の作用による組換
が生じにくくなる。Ｒ遺伝子を発現させるための誘導性
プロモーターとしては、酵母細胞中で機能する任意の誘
導性プロモーターを使用することができ、例えばガラク
トースにより誘導されるＧＡＬ１プロモーター、銅によ
り誘導されるＣＵＰ２プロモーター、熱ショックにより
誘導される熱ショック蛋白質遺伝子のプロモーター、低
リン酸濃度により誘導されるＰＨＯ５プロモーター等が
使用可能である。
中心にして、一方の側の逆向き反復配列のみが短縮され
たＲ認識配列はＲ遺伝子産物の作用によって組換えを生
ずるが、両側の逆向き反復配列が短縮された場合（例え
ば、ＲＳ４Ｗ配列）にはＲ遺伝子産物の作用による組換
が生じにくくなる。Ｒ遺伝子を発現させるための誘導性
プロモーターとしては、酵母細胞中で機能する任意の誘
導性プロモーターを使用することができ、例えばガラク
トースにより誘導されるＧＡＬ１プロモーター、銅によ
り誘導されるＣＵＰ２プロモーター、熱ショックにより
誘導される熱ショック蛋白質遺伝子のプロモーター、低
リン酸濃度により誘導されるＰＨＯ５プロモーター等が
使用可能である。
【００２２】また、選択マーカー遺伝子としては、酵母
において使用される任意の選択マーカー遺伝子を用いる
ことができ、例えばゲネチシン含有培地で選択可能なゲ
ネチシン耐性遺伝子、セルレニン耐性遺伝子等を使用す
ることができる。酵母の染色体との間で組換えが可能な
ＤＮＡ断片は、酵母染色体上の遺伝子の一部分と相同性
を有するＤＮＡ断片であり、酵母染色体上の遺伝子とし
ては、その遺伝子が破壊されても酵母の増殖が阻害され
ない遺伝子であって、例えばプロテアーゼＡ遺伝子、リ
ボソームＤＮＡ遺伝子、ＣＹＣ７遺伝子等、が挙げられ
る。
において使用される任意の選択マーカー遺伝子を用いる
ことができ、例えばゲネチシン含有培地で選択可能なゲ
ネチシン耐性遺伝子、セルレニン耐性遺伝子等を使用す
ることができる。酵母の染色体との間で組換えが可能な
ＤＮＡ断片は、酵母染色体上の遺伝子の一部分と相同性
を有するＤＮＡ断片であり、酵母染色体上の遺伝子とし
ては、その遺伝子が破壊されても酵母の増殖が阻害され
ない遺伝子であって、例えばプロテアーゼＡ遺伝子、リ
ボソームＤＮＡ遺伝子、ＣＹＣ７遺伝子等、が挙げられ
る。
【００２３】本発明はまた、上記のＤＮＡ構成物を用い
る、酵母の形質転換方法を提供する。この方法において
は、
る、酵母の形質転換方法を提供する。この方法において
は、
【００２４】（１）前記のＤＮＡ構成物を酵母細胞に導
入し、該ＤＮＡ構成物の両端に存在する酵母の染色体と
の間で組換え可能なＤＮＡ配列と酵母染色体ＤＮＡとの
間の組換えにより、該ＤＮＡ構成物を酵母染色体に組み
込み、（２）前記発現可能な選択マーカー遺伝子の発現
により、前記ＤＮＡ構成物が酵母染色体に導入された酵
母細胞を選択し、（３）前記誘導性プロモーターを誘導
することによりＲ遺伝子を発現せしめ、これによって前
記１対のＲＳ配列間において組換えを起こし、前記誘導
性プロモーターの制御下に配置されたＲ遺伝子と発現可
能な選択マーカー遺伝子とを切除する。
入し、該ＤＮＡ構成物の両端に存在する酵母の染色体と
の間で組換え可能なＤＮＡ配列と酵母染色体ＤＮＡとの
間の組換えにより、該ＤＮＡ構成物を酵母染色体に組み
込み、（２）前記発現可能な選択マーカー遺伝子の発現
により、前記ＤＮＡ構成物が酵母染色体に導入された酵
母細胞を選択し、（３）前記誘導性プロモーターを誘導
することによりＲ遺伝子を発現せしめ、これによって前
記１対のＲＳ配列間において組換えを起こし、前記誘導
性プロモーターの制御下に配置されたＲ遺伝子と発現可
能な選択マーカー遺伝子とを切除する。
【００２５】この形質転換操作は複数回反復することが
でき、これにより、下記に説明するように、同一の選択
マーカーを用いて多数の目的遺伝子を酵母の染色体に導
入することができる。上記の方法において、ＤＮＡ構成
物はそれ自体からなる、もしくはそれ自体を含むＤＮＡ
断片として、又は該ＤＮＡ構成物が挿入されたプラスミ
ドの形で酵母細胞中に導入することができる。この導入
は、すでに知られている任意の方法、例えば酢酸リチウ
ム法、塩化リチウム法、プロトプラスト法等により行う
ことができる。
でき、これにより、下記に説明するように、同一の選択
マーカーを用いて多数の目的遺伝子を酵母の染色体に導
入することができる。上記の方法において、ＤＮＡ構成
物はそれ自体からなる、もしくはそれ自体を含むＤＮＡ
断片として、又は該ＤＮＡ構成物が挿入されたプラスミ
ドの形で酵母細胞中に導入することができる。この導入
は、すでに知られている任意の方法、例えば酢酸リチウ
ム法、塩化リチウム法、プロトプラスト法等により行う
ことができる。
【００２６】同方向に配置したＲ認識配列の間にＲ遺伝
子と発現可能な選択マーカー遺伝子を配置したＤＮＡ構
成物、例えばＤＮＡ断片、プラスミド、その他のベクタ
ー等を用いて形質転換を行うが、その際、前記のごとく
定義される１対のＲ認識配列を用いることにより、組換
え後に残存する配列がＲ遺伝子により認識されにくい配
列になり、目的としない組換えを誘導する可能性が低減
し、形質転換体から選択マーカー遺伝子を特異的に除去
し、目的とする形質転換体を得ることができる。さらに
詳しくは、Ｒ認識配列として、５’側のＲ認識配列の
５’側を１ｂｐないし１０ｂｐ欠失させたもの及び／又
は３’側のＲ認識配列の３’側を１ｂｐないし１０ｂｐ
欠失させたものを用いることにより、組換え後に残存す
る配列が、Ｒ遺伝子により認識されにくい配列になり、
目的とする形質転換体を得ることができる。
子と発現可能な選択マーカー遺伝子を配置したＤＮＡ構
成物、例えばＤＮＡ断片、プラスミド、その他のベクタ
ー等を用いて形質転換を行うが、その際、前記のごとく
定義される１対のＲ認識配列を用いることにより、組換
え後に残存する配列がＲ遺伝子により認識されにくい配
列になり、目的としない組換えを誘導する可能性が低減
し、形質転換体から選択マーカー遺伝子を特異的に除去
し、目的とする形質転換体を得ることができる。さらに
詳しくは、Ｒ認識配列として、５’側のＲ認識配列の
５’側を１ｂｐないし１０ｂｐ欠失させたもの及び／又
は３’側のＲ認識配列の３’側を１ｂｐないし１０ｂｐ
欠失させたものを用いることにより、組換え後に残存す
る配列が、Ｒ遺伝子により認識されにくい配列になり、
目的とする形質転換体を得ることができる。
【００２７】本発明の方法を用いることにより、後代を
とったり、再度の形質転換や交配などの操作を伴うこと
なく、選択マーカー遺伝子の除去が可能となった。ま
た、選択マーカー遺伝子に関する安全性評価を省略する
ことも可能となった。さらに、選択マーカー遺伝子が欠
失した形質転換個体を用いて、再び同じ選択マーカー遺
伝子を用いた形質転換が可能となり、複数の遺伝子を繰
り返し導入することも可能となる。本発明の方法は、例
えば有用な蛋白質をコードする目的遺伝子Ａを酵母の染
色体に導入する場合に、次のようにして用いることがで
きる。
とったり、再度の形質転換や交配などの操作を伴うこと
なく、選択マーカー遺伝子の除去が可能となった。ま
た、選択マーカー遺伝子に関する安全性評価を省略する
ことも可能となった。さらに、選択マーカー遺伝子が欠
失した形質転換個体を用いて、再び同じ選択マーカー遺
伝子を用いた形質転換が可能となり、複数の遺伝子を繰
り返し導入することも可能となる。本発明の方法は、例
えば有用な蛋白質をコードする目的遺伝子Ａを酵母の染
色体に導入する場合に、次のようにして用いることがで
きる。
【００２８】本発明のＤＮＡ構成物においては、前記の
ごとく配列された１対のＲ認識配列（ＲＳ配列）を含ん
で成るＤＮＡ断片の両端に、１対のＲ認識配列を挟むよ
うに、酵母の染色体ＤＮＡとの間で組換えが可能なＤＮ
Ａ断片（酵母染色体組換え領域と称する場合がある）が
直接に又は間接に連結されている。Ｒ認識配列と右又は
左ボーダーとが間接的に連結されている場合には、それ
らの間に酵母の染色体に組み込むべき目的とする遺伝子
が挿入されている（図１１を参照のこと）。このＤＮＡ
構成物が酵母に導入されれば、このＤＮＡ構成物の酵母
染色体組換え領域と酵母の対応する染色体遺伝子との間
で組換えが生じ、ＤＮＡ構成物が全体として酵母染色体
ＤＮＡに組み込まれる。
ごとく配列された１対のＲ認識配列（ＲＳ配列）を含ん
で成るＤＮＡ断片の両端に、１対のＲ認識配列を挟むよ
うに、酵母の染色体ＤＮＡとの間で組換えが可能なＤＮ
Ａ断片（酵母染色体組換え領域と称する場合がある）が
直接に又は間接に連結されている。Ｒ認識配列と右又は
左ボーダーとが間接的に連結されている場合には、それ
らの間に酵母の染色体に組み込むべき目的とする遺伝子
が挿入されている（図１１を参照のこと）。このＤＮＡ
構成物が酵母に導入されれば、このＤＮＡ構成物の酵母
染色体組換え領域と酵母の対応する染色体遺伝子との間
で組換えが生じ、ＤＮＡ構成物が全体として酵母染色体
ＤＮＡに組み込まれる。
【００２９】次に、この酵母を、Ｒ遺伝子のプロモータ
ーを誘導する条件下で培養すればＲ遺伝子産物が生産さ
れ、これがＲ認識配列（ＲＳ配列）に作用して、１対の
Ｒ認識配列間で前記のごとき組換えが生じ、これら１対
のＲ認識配列に挟まれた領域（Ｒ遺伝子及びマーカー遺
伝子を含む）が除去され、組換えにより融合した（両端
が短縮された）Ｒ認識配列と酵母染色体組換え領域との
間の目的遺伝子が酵母染色体遺伝子に組み込まれたまま
残る。そして、上記の両端が短縮されたＲ認識配列はも
はや組換えを生じないから、挿入された目的遺伝子は酵
母染色体中に安定に維持される。
ーを誘導する条件下で培養すればＲ遺伝子産物が生産さ
れ、これがＲ認識配列（ＲＳ配列）に作用して、１対の
Ｒ認識配列間で前記のごとき組換えが生じ、これら１対
のＲ認識配列に挟まれた領域（Ｒ遺伝子及びマーカー遺
伝子を含む）が除去され、組換えにより融合した（両端
が短縮された）Ｒ認識配列と酵母染色体組換え領域との
間の目的遺伝子が酵母染色体遺伝子に組み込まれたまま
残る。そして、上記の両端が短縮されたＲ認識配列はも
はや組換えを生じないから、挿入された目的遺伝子は酵
母染色体中に安定に維持される。
【００３０】すなわち、本発明によれば、目的遺伝子が
酵母染色体に挿入された後マーカー遺伝子（及びＲ遺伝
子）が除去され、且つＲ認識配列が機能できなくなる。
従って、目的遺伝子を１回導入した後、同じマーカー遺
伝子を含有する遺伝子導入用ベクター（本発明のＤＮＡ
構成物）を用いて、さらなる目的遺伝子の導入を行うこ
とができる。
酵母染色体に挿入された後マーカー遺伝子（及びＲ遺伝
子）が除去され、且つＲ認識配列が機能できなくなる。
従って、目的遺伝子を１回導入した後、同じマーカー遺
伝子を含有する遺伝子導入用ベクター（本発明のＤＮＡ
構成物）を用いて、さらなる目的遺伝子の導入を行うこ
とができる。
【００３１】
【実施例】以下に本発明を実施例に基づいて詳細に説明
するが、それらの実施例は例示を目的として提供されて
いるだけであって本発明の範囲を限定することを意図し
ているものではない。実験の手順は特に記述しない限
り、SambrookらのMolecularCloning （Cold Spring Har
bor Laboratory Press, 1989 ）に従った。実施例１． 部位特異的組換え酵素認識配列の解析 （１）プラスミドの構築 Ｒ遺伝子発現用プラスミドとして、ｐＨＭ１５３（Mats
uzaki, H., et al., J. Bacteriol., 172, 610-618, 19
90）のＲ遺伝子とＧＡＬ１プロモーターを含むHindIII
−Sal I 断片を、ＹＥｐｌａｃ１９５（Gietz, R. D. a
nd Sugino, A.,Gene, 74, 527-534, 1988）のマルチク
ローニングサイトのHindIII ーSal I 間に挿入し、Ｕｒ
ａ+ 形質でＲ遺伝子の上流にＧＡＬ１プロモーターを持
つＲ蛋白質生産プラスミドｐＨＭ９９９を作製した。こ
れを図１に示す。
するが、それらの実施例は例示を目的として提供されて
いるだけであって本発明の範囲を限定することを意図し
ているものではない。実験の手順は特に記述しない限
り、SambrookらのMolecularCloning （Cold Spring Har
bor Laboratory Press, 1989 ）に従った。実施例１． 部位特異的組換え酵素認識配列の解析 （１）プラスミドの構築 Ｒ遺伝子発現用プラスミドとして、ｐＨＭ１５３（Mats
uzaki, H., et al., J. Bacteriol., 172, 610-618, 19
90）のＲ遺伝子とＧＡＬ１プロモーターを含むHindIII
−Sal I 断片を、ＹＥｐｌａｃ１９５（Gietz, R. D. a
nd Sugino, A.,Gene, 74, 527-534, 1988）のマルチク
ローニングサイトのHindIII ーSal I 間に挿入し、Ｕｒ
ａ+ 形質でＲ遺伝子の上流にＧＡＬ１プロモーターを持
つＲ蛋白質生産プラスミドｐＨＭ９９９を作製した。こ
れを図１に示す。
【００３２】次に、組換え検出用のプラスミドとして、
ＬＥＵ２遺伝子の両端に２個のＲＳ配列（おのおのＲＳ
−Ａ、ＲＳ−Ｂと称する）部位を持つプラスミドｐＳＲ
Ｔ１１７（Araki, H., et al., J Mol. Biol., 225, 25
-37, 1992 ）のＬＥＵ２遺伝子を含むHindIII −BglII
断片を、ＹＣｐｌａｃ２２（Gietz, R. D. and Sugino,
A., Gene, 74, 527-534, 1988）のＴＲＰ１遺伝子を含
むHindIII −BamHI 断片に連結し、Ｔｒｐ+ Ｌｅｕ+ 形
質のｐＯＤＡ２を作製した。これを図２に示す。
ＬＥＵ２遺伝子の両端に２個のＲＳ配列（おのおのＲＳ
−Ａ、ＲＳ−Ｂと称する）部位を持つプラスミドｐＳＲ
Ｔ１１７（Araki, H., et al., J Mol. Biol., 225, 25
-37, 1992 ）のＬＥＵ２遺伝子を含むHindIII −BglII
断片を、ＹＣｐｌａｃ２２（Gietz, R. D. and Sugino,
A., Gene, 74, 527-534, 1988）のＴＲＰ１遺伝子を含
むHindIII −BamHI 断片に連結し、Ｔｒｐ+ Ｌｅｕ+ 形
質のｐＯＤＡ２を作製した。これを図２に示す。
【００３３】このプラスミドはＲ遺伝子の働きにより２
個のＲＳ間で組換えが起こるとＬＥＵ２遺伝子を含む
５．７ｋｂのプラスミドとＴＲＰ１遺伝子を含む４．５
ｋｂのプラスミドに分かれる。ＬＥＵ２遺伝子を含むプ
ラスミドは、選択圧をかけない状態においては自己複製
能を持たないので細胞から脱落し、細胞はＬｅｕ- の表
現型を示す。つまり、Ｒ遺伝子による組換えはこれら細
胞のロイシンの要求性を調べることによってわかる。
個のＲＳ間で組換えが起こるとＬＥＵ２遺伝子を含む
５．７ｋｂのプラスミドとＴＲＰ１遺伝子を含む４．５
ｋｂのプラスミドに分かれる。ＬＥＵ２遺伝子を含むプ
ラスミドは、選択圧をかけない状態においては自己複製
能を持たないので細胞から脱落し、細胞はＬｅｕ- の表
現型を示す。つまり、Ｒ遺伝子による組換えはこれら細
胞のロイシンの要求性を調べることによってわかる。
【００３４】次に、ｐＯＤＡ２のＲＳ−Ａの野生型ＲＳ
を、制限酵素部位HindIII と、XbaIまたはBamHI とを利
用し、合成ＤＮＡにより作製された種々のＲＳに置き換
えたプラスミドを作製した。用いた合成ＤＮＡの配列は
以下に示す通りであるが、４個の繰り返し配列を欠失さ
せたＲＳ１を基にして、ＲＳ１の逆向き反復配列の一方
を徐々に欠失させた種々のＲＳ、その合成段階において
できたと考えられる点突然変異を持つＲＳ１Ｍ、ＲＳ２
Ｍ、ＲＳ４ＭおよびＲＳ１の逆向き反復配列の両方の一
部を欠失させたＲＳ４Ｗである。
を、制限酵素部位HindIII と、XbaIまたはBamHI とを利
用し、合成ＤＮＡにより作製された種々のＲＳに置き換
えたプラスミドを作製した。用いた合成ＤＮＡの配列は
以下に示す通りであるが、４個の繰り返し配列を欠失さ
せたＲＳ１を基にして、ＲＳ１の逆向き反復配列の一方
を徐々に欠失させた種々のＲＳ、その合成段階において
できたと考えられる点突然変異を持つＲＳ１Ｍ、ＲＳ２
Ｍ、ＲＳ４ＭおよびＲＳ１の逆向き反復配列の両方の一
部を欠失させたＲＳ４Ｗである。
【００３５】 ＲＳ１ TTGATGAAAGAA TACGTTA TTCTTTCATCAA （配列番号：１） ＲＳ２ TTGATGAAAGAA TACGTTA TTCTTTCATC （配列番号：２） ＲＳ３ TTGATGAAAGAA TACGTTA TTCTTTCA （配列番号：３） ＲＳ４ TTGATGAAAGAA TACGTTA TTCTTT （配列番号：４） ＲＳ４Ｗ AAAGAA TACGTTA TTCTTT （配列番号：５） ＲＳ５ TTGATGAAAGAA TACGTTA TTCT （配列番号：６） ＲＳ６ TTGATGAAAGAA TACGTTA TT （配列番号：７） ＲＳ７ TTGATGAAAGAA TACGTTA （配列番号：８） ＲＳ１Ｍ TTGATGAAAGAA TACGTTA T CTTTCATCAA （配列番号：９） ＲＳ２Ｍ TTGATGAAAGAA TA GTTA TTCTTTCATC （配列番号：１０） ＲＳ４Ｍ TTGATGAAATAA TACGTTA TTCTTT （配列番号：１１）
【００３６】以上の配列は合成ＤＮＡ作製時に５′側に
HindIII 認識部位を、３′側にXbaIまたはBamHI 認識部
位とを導入し、同時に合成した逆鎖の配列とアニーリン
グ後、ｐＯＤＡ２ のHindIII 部位と、XbaIまたはBamH
I 部位との間に導入した。ＲＳ１、ＲＳ２、ＲＳ３、Ｒ
Ｓ４、ＲＳ４Ｗ、ＲＳ５、ＲＳ６、ＲＳ７、ＲＳ１Ｍ、
ＲＳ２Ｍ又はＲＳ４Ｍを導入したプラスミドをそれぞれ
ｐＯＤＡ２１、ｐＯＤＡ２２、ｐＯＤＡ２３、ｐＯＤＡ
２４、ｐＯＤＡ２４Ｗ、ｐＯＤＡ２５、ｐＯＤＡ２６、
ｐＯＤＡ２７、ｐＯＤＡ２１Ｍ、ｐＯＤＡ２２Ｍ又はｐ
ＯＤＡ２４Ｍと名付けた。 また、同様に、ｐＯＤＡ２
のＲＳ−Ｂの野生型ＲＳを合成ＤＮＡにより作製された
次のＲＳに置き換えたプラスミドを作製した。
HindIII 認識部位を、３′側にXbaIまたはBamHI 認識部
位とを導入し、同時に合成した逆鎖の配列とアニーリン
グ後、ｐＯＤＡ２ のHindIII 部位と、XbaIまたはBamH
I 部位との間に導入した。ＲＳ１、ＲＳ２、ＲＳ３、Ｒ
Ｓ４、ＲＳ４Ｗ、ＲＳ５、ＲＳ６、ＲＳ７、ＲＳ１Ｍ、
ＲＳ２Ｍ又はＲＳ４Ｍを導入したプラスミドをそれぞれ
ｐＯＤＡ２１、ｐＯＤＡ２２、ｐＯＤＡ２３、ｐＯＤＡ
２４、ｐＯＤＡ２４Ｗ、ｐＯＤＡ２５、ｐＯＤＡ２６、
ｐＯＤＡ２７、ｐＯＤＡ２１Ｍ、ｐＯＤＡ２２Ｍ又はｐ
ＯＤＡ２４Ｍと名付けた。 また、同様に、ｐＯＤＡ２
のＲＳ−Ｂの野生型ＲＳを合成ＤＮＡにより作製された
次のＲＳに置き換えたプラスミドを作製した。
【００３７】 ＲＳ２０１ TTGATGAAAGAA TACGTTA TTCTTTCATCAA （配列番号：１２） ＲＳ２０１配列は合成ＤＮＡの作製時に５′側にＳａｌ
Ｉ認識部位を、３′側にＳａｃＩ認識部位を導入し、同
時に合成した逆鎖の配列とアニーリング後、ｐＯＤＡ２
のＲＳ−Ｂの野性型ＲＳに置き換えた。ＲＳ−ＡをＲＳ
１で置き換え且つＲＳ−ＢをＲＳ２０１で置き換えたプ
ラスミドをｐＯＤＡ２１２０１と名付け、そしてＲＳ−
ＡをＲＳ４で置き換え且つＲＳ−ＢをＲＳ２０１で置き
換えたプラスミドをｐＯＤＡ２４２０１と名付けた。
Ｉ認識部位を、３′側にＳａｃＩ認識部位を導入し、同
時に合成した逆鎖の配列とアニーリング後、ｐＯＤＡ２
のＲＳ−Ｂの野性型ＲＳに置き換えた。ＲＳ−ＡをＲＳ
１で置き換え且つＲＳ−ＢをＲＳ２０１で置き換えたプ
ラスミドをｐＯＤＡ２１２０１と名付け、そしてＲＳ−
ＡをＲＳ４で置き換え且つＲＳ−ＢをＲＳ２０１で置き
換えたプラスミドをｐＯＤＡ２４２０１と名付けた。
【００３８】（２）Ｉｎ ｖｉｖｏにおける組換え頻度
の検討 まず、ｐＨＭ９９９によりＫＡ３１１Ａ株（ＭＡＴ ａ
ｔｒｐ１ ｌｅｕ２ｕｒａ３ ｈｉｓ３）をＵｒａ+
に形質転換し、この株に２２５ｂｐの野生型組換え部位
を持つｐＯＤＡ２を導入し、Ｕｒａ+ Ｔｒｐ+ Ｌｅｕ+
株を選択した。この株をＵｒａ- Ｔｒｐ- の選択圧をか
けた５０ｇ／Ｌ濃度のガラクトースまたはグルコース液
体培地で３０℃で一晩培養し、ｐＨＭ９９９上のＲ遺伝
子を発現させて、ｐＯＤＡ２内の２個のＲＳ間で組換え
を誘導した。
の検討 まず、ｐＨＭ９９９によりＫＡ３１１Ａ株（ＭＡＴ ａ
ｔｒｐ１ ｌｅｕ２ｕｒａ３ ｈｉｓ３）をＵｒａ+
に形質転換し、この株に２２５ｂｐの野生型組換え部位
を持つｐＯＤＡ２を導入し、Ｕｒａ+ Ｔｒｐ+ Ｌｅｕ+
株を選択した。この株をＵｒａ- Ｔｒｐ- の選択圧をか
けた５０ｇ／Ｌ濃度のガラクトースまたはグルコース液
体培地で３０℃で一晩培養し、ｐＨＭ９９９上のＲ遺伝
子を発現させて、ｐＯＤＡ２内の２個のＲＳ間で組換え
を誘導した。
【００３９】培養液を希釈しＵｒａ- Ｔｒｐ- 選択培地
に塗布し、２８℃で２日間静置培養した。これをＬｅｕ
- 選択培地にレプリカしコロニーを数えた。Ｕｒａ- Ｔ
ｒｐ- 選択培地で増殖し、Ｌｅｕ- 選択培地で増殖しな
い細胞が組換えが起こった細胞である。また、同様に、
実施例１（１）において作製した種々のプラスミドを、
ｐＨＭ９９９を持つ株に導入し、ガラクトース培地及び
グルコース培地における組換え頻度を調べた。結果を表
１に示す。
に塗布し、２８℃で２日間静置培養した。これをＬｅｕ
- 選択培地にレプリカしコロニーを数えた。Ｕｒａ- Ｔ
ｒｐ- 選択培地で増殖し、Ｌｅｕ- 選択培地で増殖しな
い細胞が組換えが起こった細胞である。また、同様に、
実施例１（１）において作製した種々のプラスミドを、
ｐＨＭ９９９を持つ株に導入し、ガラクトース培地及び
グルコース培地における組換え頻度を調べた。結果を表
１に示す。
【００４０】
【表１】
【００４１】表１に示す通り、ｐＯＤＡ２では、ガラク
トース培地においては１００％の効率で切り出しが起こ
った。また、グルコース培地においても２６％の効率で
切り出しが起こった。さらに、ｐＯＤＡ２を持つ株とｐ
ＯＤＡ２１を持つ株との間ではガラクトース培地、グル
コース培地ともに切り出し頻度に差は見られなかった。
従って４個の繰り返し配列は、少なくとも切り出しにお
いては必要でないと考えられる。
トース培地においては１００％の効率で切り出しが起こ
った。また、グルコース培地においても２６％の効率で
切り出しが起こった。さらに、ｐＯＤＡ２を持つ株とｐ
ＯＤＡ２１を持つ株との間ではガラクトース培地、グル
コース培地ともに切り出し頻度に差は見られなかった。
従って４個の繰り返し配列は、少なくとも切り出しにお
いては必要でないと考えられる。
【００４２】また、ガラクトース培地では、ｐＯＤＡ２
１、ｐＯＤＡ２２、ｐＯＤＡ２３及びｐＯＤＡ２４にお
いてはほぼ１００％の頻度で切り出しが起こったが、ｐ
ＯＤＡ２５でその頻度が急激に低下し、ｐＯＤＡ２６及
びｐＯＤＡ２７ではほとんど切り出しが起こらなかっ
た。グルコース培地では、ｐＯＤＡ２１及びｐＯＤＡ２
２はｐＯＤＡ２と同程度の切り出し頻度であった。これ
らのことより、組換えには、逆向き反復配列の一方は２
ｂｐ以上存在することが望ましいことがわかった。
１、ｐＯＤＡ２２、ｐＯＤＡ２３及びｐＯＤＡ２４にお
いてはほぼ１００％の頻度で切り出しが起こったが、ｐ
ＯＤＡ２５でその頻度が急激に低下し、ｐＯＤＡ２６及
びｐＯＤＡ２７ではほとんど切り出しが起こらなかっ
た。グルコース培地では、ｐＯＤＡ２１及びｐＯＤＡ２
２はｐＯＤＡ２と同程度の切り出し頻度であった。これ
らのことより、組換えには、逆向き反復配列の一方は２
ｂｐ以上存在することが望ましいことがわかった。
【００４３】一方、ＲＳに点突然変異を持つプラスミド
で、スペーサー部分に変異点を持つｐＯＤＡ２２Ｍとス
ペーサー部分近くに変異点をもつｐＯＤＡ２１Ｍは切り
出しはほとんど起こらず、ｐＯＤＡ２４Ｍでガラクトー
ス培地において４８％の頻度で切り出しが起こった。従
って、効率のよい組換えにはスペーサー部分が保存され
ていることが必須であると言える。ｐＯＤＡ２４Ｗを持
つ株ではガラクトース培地において３７％の頻度で切り
出しが起こり、ｐＯＤＡ２４を持つ株との間で組換えの
頻度に大きな差が見られた。このことは、両方の反復配
列の欠失が一方のみと比べ組換え能が大きく低下するこ
とを示している。
で、スペーサー部分に変異点を持つｐＯＤＡ２２Ｍとス
ペーサー部分近くに変異点をもつｐＯＤＡ２１Ｍは切り
出しはほとんど起こらず、ｐＯＤＡ２４Ｍでガラクトー
ス培地において４８％の頻度で切り出しが起こった。従
って、効率のよい組換えにはスペーサー部分が保存され
ていることが必須であると言える。ｐＯＤＡ２４Ｗを持
つ株ではガラクトース培地において３７％の頻度で切り
出しが起こり、ｐＯＤＡ２４を持つ株との間で組換えの
頻度に大きな差が見られた。このことは、両方の反復配
列の欠失が一方のみと比べ組換え能が大きく低下するこ
とを示している。
【００４４】（３）Ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける組換え頻
度の検討 一方、大腸菌で生産し部分精製したＲ蛋白質を用いて、
ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける変異ＲＳを持つプラスミドで
の組換え頻度を調べた。ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける組換
え効率の測定は以下の方法に従った。５０ｍＭ Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）１０ｍＭ ＭｇＣｌ2 からな
る反応液１００μｌ中にＤＮＡと１μｌの大腸菌で生産
し部分精製したＲ蛋白質（Biore x 70 画分：Araki,
H., et al., J Mol. Biol., 225, 25-37, 1992 ）を加
え、３０℃で３０分間反応させた。エタノール沈殿を行
った後、適当な制限酵素で切断し、アガロース電気泳動
で確認した。結果を前記の表１に示す。
度の検討 一方、大腸菌で生産し部分精製したＲ蛋白質を用いて、
ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける変異ＲＳを持つプラスミドで
の組換え頻度を調べた。ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける組換
え効率の測定は以下の方法に従った。５０ｍＭ Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）１０ｍＭ ＭｇＣｌ2 からな
る反応液１００μｌ中にＤＮＡと１μｌの大腸菌で生産
し部分精製したＲ蛋白質（Biore x 70 画分：Araki,
H., et al., J Mol. Biol., 225, 25-37, 1992 ）を加
え、３０℃で３０分間反応させた。エタノール沈殿を行
った後、適当な制限酵素で切断し、アガロース電気泳動
で確認した。結果を前記の表１に示す。
【００４５】ｐＯＤＡ２、ｐＯＤＡ２１、ｐＯＤＡ２２
及びｐＯＤＡ２１２０１では組換え頻度は高く、ｐＯＤ
Ａ２３ではごく僅かではあるが切り出しが検知できる。
ｐＯＤＡ２４ではＲ蛋白質量を２〜６倍に増加させると
切り出しが検知できる。ｐＯＤＡ２４Ｗ、ｐＯＤＡ２
５、ｐＯＤＡ２６、ｐＯＤＡ２７、ｐＯＤＡ２１Ｍ、ｐ
ＯＤＡ２２Ｍ、ｐＯＤＡ２４Ｍ及びｐＯＤＡ２４２０１
では切り出しは検知されなかった。
及びｐＯＤＡ２１２０１では組換え頻度は高く、ｐＯＤ
Ａ２３ではごく僅かではあるが切り出しが検知できる。
ｐＯＤＡ２４ではＲ蛋白質量を２〜６倍に増加させると
切り出しが検知できる。ｐＯＤＡ２４Ｗ、ｐＯＤＡ２
５、ｐＯＤＡ２６、ｐＯＤＡ２７、ｐＯＤＡ２１Ｍ、ｐ
ＯＤＡ２２Ｍ、ｐＯＤＡ２４Ｍ及びｐＯＤＡ２４２０１
では切り出しは検知されなかった。
【００４６】実施例２． 出芽酵母のプロテアーゼＡ遺
伝子の破壊 （１）Ｒ認識配列を含むプラスミドｐＲＳ３０４−４の
構築 Ｒ認識配列をプラスミドに導入するために４種類のオリ
ゴヌクレオチドを合成した。 （RS4-S ）5'-C TTGATGAAAGAA TACGTTA TTCTTT G-3'
（配列番号：１３） （RS4-L ）5'-AATTC AAAGAA TAACGTA TTCTTTCATCAA GAG
CT-3' （配列番号：１４） （RS304-S ）5'-C TTGATGAAAGAA TAACGTA TTCTTT A-3'
（配列番号：１５） （RS304-L ）5'-AGCTT AAAGAA TACGTTA TTCTTTCATCAA G
CATG-3' （配列番号：１６）
伝子の破壊 （１）Ｒ認識配列を含むプラスミドｐＲＳ３０４−４の
構築 Ｒ認識配列をプラスミドに導入するために４種類のオリ
ゴヌクレオチドを合成した。 （RS4-S ）5'-C TTGATGAAAGAA TACGTTA TTCTTT G-3'
（配列番号：１３） （RS4-L ）5'-AATTC AAAGAA TAACGTA TTCTTTCATCAA GAG
CT-3' （配列番号：１４） （RS304-S ）5'-C TTGATGAAAGAA TAACGTA TTCTTT A-3'
（配列番号：１５） （RS304-L ）5'-AGCTT AAAGAA TACGTTA TTCTTTCATCAA G
CATG-3' （配列番号：１６）
【００４７】まず、市販のプラスミドであるｐＵＣ１９
を制限酵素EcoR I及びSac I で切断した。合成ＤＮＡで
あるＲＳ４−Ｓ及びＲＳ４−Ｌをアニーリングし、ｐＵ
Ｃ１９のEcoR IーSac I 断片とライゲーションすること
により、ｐＲＳ４を構築した。さらにｐＲＳ４を制限酵
素Sph I 及びHind IIIで切断し、合成ＤＮＡＲＳ３０４
−Ｓ及びＲＳ３０４−Ｌとライゲーションすることによ
りプラスミドｐＲＳ３０４−４−４を構築した。これを
図３に示す。
を制限酵素EcoR I及びSac I で切断した。合成ＤＮＡで
あるＲＳ４−Ｓ及びＲＳ４−Ｌをアニーリングし、ｐＵ
Ｃ１９のEcoR IーSac I 断片とライゲーションすること
により、ｐＲＳ４を構築した。さらにｐＲＳ４を制限酵
素Sph I 及びHind IIIで切断し、合成ＤＮＡＲＳ３０４
−Ｓ及びＲＳ３０４−Ｌとライゲーションすることによ
りプラスミドｐＲＳ３０４−４−４を構築した。これを
図３に示す。
【００４８】（２）形質転換用プラスミドの構築 （２−１）プラスミド ｐＲＳ１５３ｄＢ１の作製 Ｒ遺伝子発現用プラスミドｐＨＭ１５３中において、Ｒ
遺伝子はガラクトースで発現が誘導されるプロモーター
（ＧＡＬ１プロモーター）で発現が制御されている。ｐ
ＨＭ１５３をBamHI で消化した後、ＤＮＡ Ｂｌｕｎｔ
ｉｎｇ ｋｉｔ（宝酒造社製）を用いて平滑末端処理を
行った。
遺伝子はガラクトースで発現が誘導されるプロモーター
（ＧＡＬ１プロモーター）で発現が制御されている。ｐ
ＨＭ１５３をBamHI で消化した後、ＤＮＡ Ｂｌｕｎｔ
ｉｎｇ ｋｉｔ（宝酒造社製）を用いて平滑末端処理を
行った。
【００４９】得られたＤＮＡ断片をセルフライゲーショ
ンすることにより得られたプラスミドをｐＨＭ１５３ｄ
Ｂとした。また、実施例２（１）において得られたプラ
スミドｐＲＳ３０４−４−４をSmaIとSacIで消化した
後、同様に平滑末端処理を行った。得られた約２．９ｋ
ｂのＤＮＡ断片に、ｐＨＭ１５３ｄＢをEcoR IとSalIで
処理した後、同じく平滑末端処理を行って得られた約
２．８ｋｂのＤＮＡ断片を組み込んで得られたプラスミ
ドをｐＲＳ１５３ｄＢ１とした。これを図４に示す。
ンすることにより得られたプラスミドをｐＨＭ１５３ｄ
Ｂとした。また、実施例２（１）において得られたプラ
スミドｐＲＳ３０４−４−４をSmaIとSacIで消化した
後、同様に平滑末端処理を行った。得られた約２．９ｋ
ｂのＤＮＡ断片に、ｐＨＭ１５３ｄＢをEcoR IとSalIで
処理した後、同じく平滑末端処理を行って得られた約
２．８ｋｂのＤＮＡ断片を組み込んで得られたプラスミ
ドをｐＲＳ１５３ｄＢ１とした。これを図４に示す。
【００５０】（２−２）プラスミドｐＰＲＡ１５３ｄＢ
１の作製 プラスミドｐＲＳ１５３ｄＢ１をEcoR IとHind IIIで消
化して得られる約２．８ｋｂのＤＮＡ断片と酵母（Sacc
haromyces cerevisiae ）のプロテアーゼＡ遺伝子の全
長を含むプラスミドｐＰＲＡ１−２（Woodford, C.A.,
et al., Mol. Cell. Biol., 6, 2500-2510, 1988）をEc
oR IとHind IIIで消化して得られる約４．２ｋｂのＤＮ
Ａ断片とを連結して得られるプラスミドをｐＰＲＡ１５
３ｄＢ１とした。これを図５に示す。なお、プラスミド
ｐＰＲＡ１−２をEcoR IとHind IIIで消化して得られる
約４．２ｋｂのＤＮＡ断片には、プロテアーゼＡの５’
上流領域８２ｂｐおよび開始コドンであるＡＴＧを含む
Ｎ末端アミノ酸残基１３６残基が欠けている。
１の作製 プラスミドｐＲＳ１５３ｄＢ１をEcoR IとHind IIIで消
化して得られる約２．８ｋｂのＤＮＡ断片と酵母（Sacc
haromyces cerevisiae ）のプロテアーゼＡ遺伝子の全
長を含むプラスミドｐＰＲＡ１−２（Woodford, C.A.,
et al., Mol. Cell. Biol., 6, 2500-2510, 1988）をEc
oR IとHind IIIで消化して得られる約４．２ｋｂのＤＮ
Ａ断片とを連結して得られるプラスミドをｐＰＲＡ１５
３ｄＢ１とした。これを図５に示す。なお、プラスミド
ｐＰＲＡ１−２をEcoR IとHind IIIで消化して得られる
約４．２ｋｂのＤＮＡ断片には、プロテアーゼＡの５’
上流領域８２ｂｐおよび開始コドンであるＡＴＧを含む
Ｎ末端アミノ酸残基１３６残基が欠けている。
【００５１】（２−３）プラスミドｐＰＲＡＧ４１８の
作製 プラスミドｐＰＲＡ１５３ｄＢ１をBamHI で消化した
後、大腸菌（E.coli A19）のアルカリホスファターゼで
脱リン酸化し得られたＤＮＡ断片に、プラスミドｐＩＧ
Ｚ２（Nakazawa, N., et al., J. Ferment. Bioeng., 7
3, 265-270, 1992）をBamHI で消化して得られる約２．
４ｋｂのＤＮＡ断片を連結し、プラスミドｐＰＲＡＧ４
１８を作製した。これを図６に示す。このBamHI 断片に
は、酵母の構成的なプロモーターの一つであるグリセロ
アルデヒド ３リン酸脱水素酵素のプロモーターの下流
に連結されたＧ４１８耐性を付与する遺伝子が含まれて
いる。
作製 プラスミドｐＰＲＡ１５３ｄＢ１をBamHI で消化した
後、大腸菌（E.coli A19）のアルカリホスファターゼで
脱リン酸化し得られたＤＮＡ断片に、プラスミドｐＩＧ
Ｚ２（Nakazawa, N., et al., J. Ferment. Bioeng., 7
3, 265-270, 1992）をBamHI で消化して得られる約２．
４ｋｂのＤＮＡ断片を連結し、プラスミドｐＰＲＡＧ４
１８を作製した。これを図６に示す。このBamHI 断片に
は、酵母の構成的なプロモーターの一つであるグリセロ
アルデヒド ３リン酸脱水素酵素のプロモーターの下流
に連結されたＧ４１８耐性を付与する遺伝子が含まれて
いる。
【００５２】（３）研究室株を用いたマーカー遺伝子の
除去 一倍体の酵母としてＲ２７−７Ｃ−１Ｃ（ＭＡＴ α
ｔｒｐ１ ｌｅｕ２ｈｉｓ３ ｕｒａ３）を用いた。酵
母の形質転換はリチュウムクロライドを用いた方法（Ko
dama, Y., et al. , J. Am. Soc. Brew. Chem., 53, 24
-29, 1995 ）により行うことが可能である。実施例２
（２−３） において得られたｐＰＲＡＧ４１８をSacI
とNcoIで処理して得られた約５．８ｋｂのＤＮＡ断片
（約１０μｇ）を酵母への組換えに使用し、形質転換体
のゲネチシン耐性により選択した。すなわち、３００μ
ｇ／ｍｌの濃度のゲネチシンを含むＹＰＤ寒天プレート
（ペプトン２％、グルコース２％、酵母エキス１％、寒
天２％）に上記形質転換操作をした酵母をまき、３０℃
で７２時間インキュベートする。
除去 一倍体の酵母としてＲ２７−７Ｃ−１Ｃ（ＭＡＴ α
ｔｒｐ１ ｌｅｕ２ｈｉｓ３ ｕｒａ３）を用いた。酵
母の形質転換はリチュウムクロライドを用いた方法（Ko
dama, Y., et al. , J. Am. Soc. Brew. Chem., 53, 24
-29, 1995 ）により行うことが可能である。実施例２
（２−３） において得られたｐＰＲＡＧ４１８をSacI
とNcoIで処理して得られた約５．８ｋｂのＤＮＡ断片
（約１０μｇ）を酵母への組換えに使用し、形質転換体
のゲネチシン耐性により選択した。すなわち、３００μ
ｇ／ｍｌの濃度のゲネチシンを含むＹＰＤ寒天プレート
（ペプトン２％、グルコース２％、酵母エキス１％、寒
天２％）に上記形質転換操作をした酵母をまき、３０℃
で７２時間インキュベートする。
【００５３】Ｇ４１８遺伝子を含む形質転換株のみがこ
の寒天培地で生育可能であるため、出現したコロニーを
形質転換株として選択した。得られた形質転換体はガラ
クトースを含む培地で培養することにより、Ｒ蛋白質を
コードする遺伝子が発現し酵母細胞内でＲ蛋白質が誘導
生産される。生産されたＲ蛋白質はＧ４１８薬剤耐性遺
伝子の両端に挿入された認識配列を認識し、この認識配
列にはさまれた領域を切断除去することが可能である。
そこで、得られた形質転換体のコロニーを１０ｍｌのＹ
ＰＧａｌ（ペプトン２％、ガラクトース５％、酵母エキ
ス１％）液体培地にて３０℃、４８時間培養し認識配列
の組換えを誘導した。
の寒天培地で生育可能であるため、出現したコロニーを
形質転換株として選択した。得られた形質転換体はガラ
クトースを含む培地で培養することにより、Ｒ蛋白質を
コードする遺伝子が発現し酵母細胞内でＲ蛋白質が誘導
生産される。生産されたＲ蛋白質はＧ４１８薬剤耐性遺
伝子の両端に挿入された認識配列を認識し、この認識配
列にはさまれた領域を切断除去することが可能である。
そこで、得られた形質転換体のコロニーを１０ｍｌのＹ
ＰＧａｌ（ペプトン２％、ガラクトース５％、酵母エキ
ス１％）液体培地にて３０℃、４８時間培養し認識配列
の組換えを誘導した。
【００５４】培養液を無菌水で１０万倍に希釈した後、
そのうちの２０μｌをＹＰＤ寒天培地にまき、３０℃で
４８時間培養した。得られた約１万コロニーのうち１１
株を無作為に選択し、６００μｇ／ｍｌの濃度でゲネチ
シンを含むＹＰＤ寒天培地とゲネチシンを含まない同培
地で、３０℃、４８時間それぞれ培養した。選択した１
１株は全てゲネチシンを含まない培地のみで生育が可能
であり、選択マーカー遺伝子が除去されたと考えられ
る。なお、ここで行われたプロテアーゼＡ遺伝子の破壊
及び部位特異的組換えによる選択マーカーの除去につい
て、図７にその概略を示す。
そのうちの２０μｌをＹＰＤ寒天培地にまき、３０℃で
４８時間培養した。得られた約１万コロニーのうち１１
株を無作為に選択し、６００μｇ／ｍｌの濃度でゲネチ
シンを含むＹＰＤ寒天培地とゲネチシンを含まない同培
地で、３０℃、４８時間それぞれ培養した。選択した１
１株は全てゲネチシンを含まない培地のみで生育が可能
であり、選択マーカー遺伝子が除去されたと考えられ
る。なお、ここで行われたプロテアーゼＡ遺伝子の破壊
及び部位特異的組換えによる選択マーカーの除去につい
て、図７にその概略を示す。
【００５５】（４）醸造用酵母を用いたマーカー遺伝子
の除去 （４−１）１回目の形質転換 形質転換体の作出は研究室株を用いた場合と同じ方法で
行った。宿主としては高次倍数体の醸造用株ＢＨ８４
（Kodama, Y., et al. , J. Am. Soc. Brew. Chem., 5
3, 24-29, 1995 ）を用いたが、二倍以上の倍数性を持
つ酵母であればいずれの酵母を用いても良い。得られた
形質転換体のコロニーを、５％のガラクトースを含む１
０ｍｌのＹＮＢ液体培地にて３０℃、４８時間培養し
た。
の除去 （４−１）１回目の形質転換 形質転換体の作出は研究室株を用いた場合と同じ方法で
行った。宿主としては高次倍数体の醸造用株ＢＨ８４
（Kodama, Y., et al. , J. Am. Soc. Brew. Chem., 5
3, 24-29, 1995 ）を用いたが、二倍以上の倍数性を持
つ酵母であればいずれの酵母を用いても良い。得られた
形質転換体のコロニーを、５％のガラクトースを含む１
０ｍｌのＹＮＢ液体培地にて３０℃、４８時間培養し
た。
【００５６】ガラクトースを含む培地で培養することに
より、Ｒ蛋白質をコードする遺伝子を発現させ酵母細胞
内でＲ蛋白質を生産させる。Ｒ蛋白質はＧ４１８薬剤耐
性遺伝子の両端に挿入されたＲ認識配列を認識し、この
Ｒ認識配列部分を切断除去することが可能である。よっ
て、５％ガラクトースを含む酵母最少培地（Yeast Nitr
ogen Base w/o amino acid （DIFCO 社））液体培地で
４８時間培養した後の培養液を純水で１０万倍に希釈
し、そのうちの２０μｌを５％ガラクトースを含むＹＮ
Ｂ寒天培地にまき、３０℃で４８時間培養した。
より、Ｒ蛋白質をコードする遺伝子を発現させ酵母細胞
内でＲ蛋白質を生産させる。Ｒ蛋白質はＧ４１８薬剤耐
性遺伝子の両端に挿入されたＲ認識配列を認識し、この
Ｒ認識配列部分を切断除去することが可能である。よっ
て、５％ガラクトースを含む酵母最少培地（Yeast Nitr
ogen Base w/o amino acid （DIFCO 社））液体培地で
４８時間培養した後の培養液を純水で１０万倍に希釈
し、そのうちの２０μｌを５％ガラクトースを含むＹＮ
Ｂ寒天培地にまき、３０℃で４８時間培養した。
【００５７】得られた約1 万コロニーのうち１２５株を
選択し、２％グルコースと６００μｇ／ｍｌのゲネチシ
ンを含む酵母最少寒天培地とゲネチシンを含まない同培
地で、３０℃、４８時間それぞれ培養した。そのうち、
ゲネチシンを含む培地では生育できないが、ゲネチシン
を含まない培地には生育可能な株が１株得られた。
選択し、２％グルコースと６００μｇ／ｍｌのゲネチシ
ンを含む酵母最少寒天培地とゲネチシンを含まない同培
地で、３０℃、４８時間それぞれ培養した。そのうち、
ゲネチシンを含む培地では生育できないが、ゲネチシン
を含まない培地には生育可能な株が１株得られた。
【００５８】（４−２）２回目の形質転換 上記操作によって得られたプロテアーゼＡ遺伝子が１遺
伝子破壊され、さらに耐性マーカーが欠失した株を基に
２回目の形質転換を行った。コンピテント細胞の調製な
らびにプラスミドｐＰＲＡＧ４１８を用いた形質転換は
すべて１回目の形質転換と同条件にて行った。１回目の
形質転換の時に用いたものと同じゲネチシンを含むＹＰ
Ｄ寒天培地で形質転換株の選択を行ったところ、５株の
ゲネチシン耐性を持つ形質転換株が得られた。
伝子破壊され、さらに耐性マーカーが欠失した株を基に
２回目の形質転換を行った。コンピテント細胞の調製な
らびにプラスミドｐＰＲＡＧ４１８を用いた形質転換は
すべて１回目の形質転換と同条件にて行った。１回目の
形質転換の時に用いたものと同じゲネチシンを含むＹＰ
Ｄ寒天培地で形質転換株の選択を行ったところ、５株の
ゲネチシン耐性を持つ形質転換株が得られた。
【００５９】上記操作により得られた５株の形質転換株
から１株を選び、選択マーカー遺伝子の切断除去を行っ
た。Ｒ蛋白質の誘導と選択マーカー遺伝子の除去は全て
１回目の場合と同様に行った。その結果、６００μｇ／
ｍｌのゲネチシンを含む培地では生育できないが、ゲネ
チシンを含まない培地では生育可能な株が３株得られ
た。
から１株を選び、選択マーカー遺伝子の切断除去を行っ
た。Ｒ蛋白質の誘導と選択マーカー遺伝子の除去は全て
１回目の場合と同様に行った。その結果、６００μｇ／
ｍｌのゲネチシンを含む培地では生育できないが、ゲネ
チシンを含まない培地では生育可能な株が３株得られ
た。
【００６０】（４−３）プロテアーゼＡ遺伝子の破壊 形質転換が成功し、プロテアーゼＡをコードする染色体
上の遺伝子が破壊されたことは、次のようなサザンブロ
ット解析をすることにより確認することができる。Ｒ遺
伝子を発現した後の形質転換株の染色体ＤＮＡを常法に
従い抽出し、制限酵素Hind IIIで切断する。アガロース
ゲルにて泳動した後ニトロセルロースにブロッティング
し、プロテアーゼＡをコードするプラスミド（ｐＰＲＡ
１−２）を制限酵素SacI-XhoI で切断した１．９ｋｂｐ
の断片をプローブとしてサザンブロットを行う。
上の遺伝子が破壊されたことは、次のようなサザンブロ
ット解析をすることにより確認することができる。Ｒ遺
伝子を発現した後の形質転換株の染色体ＤＮＡを常法に
従い抽出し、制限酵素Hind IIIで切断する。アガロース
ゲルにて泳動した後ニトロセルロースにブロッティング
し、プロテアーゼＡをコードするプラスミド（ｐＰＲＡ
１−２）を制限酵素SacI-XhoI で切断した１．９ｋｂｐ
の断片をプローブとしてサザンブロットを行う。
【００６１】その結果、野性株では４．２及び１．２ｋ
ｂのバンドが検出され（図８のレーン１及び２）、一回
目の形質転換では７．９及び１．２ｋｂのバンドが検出
され（図８のレーン３）、そしてＲ遺伝子を発現した後
の形質転換体では３．７及び１．２ｋｂのバンドが検出
される（図８のレーン４）。バンドの濃淡から遺伝子破
壊された染色体数が推定できる。このようにして、プロ
テアーゼＡ遺伝子の１遺伝子破壊株、２遺伝子破壊株を
確認した。この結果を図８に示す。
ｂのバンドが検出され（図８のレーン１及び２）、一回
目の形質転換では７．９及び１．２ｋｂのバンドが検出
され（図８のレーン３）、そしてＲ遺伝子を発現した後
の形質転換体では３．７及び１．２ｋｂのバンドが検出
される（図８のレーン４）。バンドの濃淡から遺伝子破
壊された染色体数が推定できる。このようにして、プロ
テアーゼＡ遺伝子の１遺伝子破壊株、２遺伝子破壊株を
確認した。この結果を図８に示す。
【００６２】実施例３． リゾパス属由来グルコアミラ
ーゼ遺伝子の野生型酵母への導入及びその発現 酵母(Saccharomyces cerevisiae) AY-01株は２倍体であ
る。グルコアミラーゼ遺伝子を導入する際、形質転換と
部位特異的組換え配列でのマーカー遺伝子の切り出しを
２回繰り返えすことにより、対立する両方の染色体の同
じ位置にグルコアミラーゼ遺伝子のみを導入することが
出来る。
ーゼ遺伝子の野生型酵母への導入及びその発現 酵母(Saccharomyces cerevisiae) AY-01株は２倍体であ
る。グルコアミラーゼ遺伝子を導入する際、形質転換と
部位特異的組換え配列でのマーカー遺伝子の切り出しを
２回繰り返えすことにより、対立する両方の染色体の同
じ位置にグルコアミラーゼ遺伝子のみを導入することが
出来る。
【００６３】（１）形質転換用のプラスミドpUPRGA3 の
構築 Ｒ認識配列をプラスミドに導入するために４種類のオリ
ゴヌクレオチドを合成した。 (RS3-S) 5'-C TTGATGAAAGAA TACGTTA TTCTTTCA-3'
（配列番号：17） (RS3-L) 5'-AATTC TGAAAGAA TAACGTA TTCTTTCATCAA G
AGCT-3'（配列番号：18） (RS303-S) 5'-C TTGATGAAAGAA TAACGTA TTCTTTCA-3'
（配列番号：19） (RS303-L) 5'-AGCT TGAAAGAA TACGTTA TTCTTTCATCAA GC
ATG-3' （配列番号：20） これらの合成ＤＮＡの5'末端をリン酸化したのち、RS3-
S とRS3-L 、RS303-SとRS303-L をそれぞれアニーリン
グし、前者をpUC19 の制限酵素EcoRI-SacIサイトに、つ
づいて後者を制限酵素SphI-HindIIIサイトに挿入し、プ
ラスミドpRS303-3を構築した。
構築 Ｒ認識配列をプラスミドに導入するために４種類のオリ
ゴヌクレオチドを合成した。 (RS3-S) 5'-C TTGATGAAAGAA TACGTTA TTCTTTCA-3'
（配列番号：17） (RS3-L) 5'-AATTC TGAAAGAA TAACGTA TTCTTTCATCAA G
AGCT-3'（配列番号：18） (RS303-S) 5'-C TTGATGAAAGAA TAACGTA TTCTTTCA-3'
（配列番号：19） (RS303-L) 5'-AGCT TGAAAGAA TACGTTA TTCTTTCATCAA GC
ATG-3' （配列番号：20） これらの合成ＤＮＡの5'末端をリン酸化したのち、RS3-
S とRS3-L 、RS303-SとRS303-L をそれぞれアニーリン
グし、前者をpUC19 の制限酵素EcoRI-SacIサイトに、つ
づいて後者を制限酵素SphI-HindIIIサイトに挿入し、プ
ラスミドpRS303-3を構築した。
【００６４】次に、pRS303-3を制限酵素SacI消化後Bulu
nting Kit （宝酒造( 株) 製）で末端を平滑化したのち
制限酵素SphIで消化して得た2.7kb の断片と、プラスミ
ドpPRACer11 （図１２）を制限酵素SalIで消化後Bulunt
ing Kit で末端を平滑化したのち制限酵素SphIで消化し
て得た2.7kb の断片とを連結し、プラスミドpRS303-3-C
erを得た。pRS303-3-Cerの制限酵素SalIサイトに、pPRA
Cer11 を制限酵素SalIで消化して得られる2.7kb 断片を
挿入し、プラスミドpRCer303-3-1を構築した。
nting Kit （宝酒造( 株) 製）で末端を平滑化したのち
制限酵素SphIで消化して得た2.7kb の断片と、プラスミ
ドpPRACer11 （図１２）を制限酵素SalIで消化後Bulunt
ing Kit で末端を平滑化したのち制限酵素SphIで消化し
て得た2.7kb の断片とを連結し、プラスミドpRS303-3-C
erを得た。pRS303-3-Cerの制限酵素SalIサイトに、pPRA
Cer11 を制限酵素SalIで消化して得られる2.7kb 断片を
挿入し、プラスミドpRCer303-3-1を構築した。
【００６５】pRCer303-3-1をHindIII で消化後、Bulunt
ing Kit で末端を平滑化し、pSmaIlinker（宝酒造( 株)
製）を挿入してpRCer303-3-2を構築した。pUC19 を制
限酵素EcoRI-HindIII で消化し、pRCer303-3-2を制限酵
素SmaI-EcoRIで消化して得られる5.5kb 断片と、YEp24
(Botstein, D., et al. Gene, 8,17,1979) のURA3遺伝
子を含む1.1kb の制限酵素HindIII-SmaI断片とを連結し
て挿入し、pU5'RCerRS3 を構築した。
ing Kit で末端を平滑化し、pSmaIlinker（宝酒造( 株)
製）を挿入してpRCer303-3-2を構築した。pUC19 を制
限酵素EcoRI-HindIII で消化し、pRCer303-3-2を制限酵
素SmaI-EcoRIで消化して得られる5.5kb 断片と、YEp24
(Botstein, D., et al. Gene, 8,17,1979) のURA3遺伝
子を含む1.1kb の制限酵素HindIII-SmaI断片とを連結し
て挿入し、pU5'RCerRS3 を構築した。
【００６６】pUC18 を制限酵素EcoRI 及びSphIで消化
し、Bulunting Kit （宝酒造）で末端を平滑化したあと
連結し、pUC18HSpを構築した。この制限酵素HindIII サ
イトにYEp24 のURA3遺伝子を含む1.2kb の制限酵素Hind
III 断片を挿入し、pURA34を構築した。pURA34のSmaIサ
イトにpEcoRI linker （宝酒造）を挿入してpURA35を構
築し、これを制限酵素EcoRI で消化し、制限酵素HindII
I で部分消化した2.8kb の断片とpU5'RCerRS3 の6.6kb
の制限酵素HindIII-EcoRI 断片を連結し、プラスミドpU
PRRS3 を構築した。
し、Bulunting Kit （宝酒造）で末端を平滑化したあと
連結し、pUC18HSpを構築した。この制限酵素HindIII サ
イトにYEp24 のURA3遺伝子を含む1.2kb の制限酵素Hind
III 断片を挿入し、pURA34を構築した。pURA34のSmaIサ
イトにpEcoRI linker （宝酒造）を挿入してpURA35を構
築し、これを制限酵素EcoRI で消化し、制限酵素HindII
I で部分消化した2.8kb の断片とpU5'RCerRS3 の6.6kb
の制限酵素HindIII-EcoRI 断片を連結し、プラスミドpU
PRRS3 を構築した。
【００６７】pUPRRS3 の制限酵素SmaIサイトに、PYGA22
69（Ashikari,T.,et al., Appl. Microbiol. Biotechno
l., 30,535,1989 ）の3.2kb の制限酵素HindIII 断片を
Bulunting Kit （宝酒造）で末端を平滑化したのち挿入
しプラスミドpUPRGA3 を構築した（図１３）。このプラ
スミドでは、図１３に示すとおり、URA3遺伝子のコード
領域の下流に以下の遺伝子が挿入されている。
69（Ashikari,T.,et al., Appl. Microbiol. Biotechno
l., 30,535,1989 ）の3.2kb の制限酵素HindIII 断片を
Bulunting Kit （宝酒造）で末端を平滑化したのち挿入
しプラスミドpUPRGA3 を構築した（図１３）。このプラ
スミドでは、図１３に示すとおり、URA3遺伝子のコード
領域の下流に以下の遺伝子が挿入されている。
【００６８】A ．構成的に発現される酵母グリセルアル
デヒド３−リン酸脱水素酵素遺伝子(GAP) プロモーター
につないだグルコアミラーゼ遺伝子。これが本実施例に
おいて導入したい遺伝子である。 B ．部位特異的組換え配列（RS303,RS3 ）で挟まれた、
マーカー遺伝子（PDR4；セルレニン及びシクロヘキシミ
ド耐性遺伝子）および部位特異的組換え配列間の組換え
を触媒する酵素のＲ遺伝子。Ｒ遺伝子はガラクトースで
発現誘導されるようにGAL1プロモーターにつないでい
る。これらの遺伝子は、形質転換株の選択の後、部位特
異的組換え配列での組換えにより除去されるように設計
した。
デヒド３−リン酸脱水素酵素遺伝子(GAP) プロモーター
につないだグルコアミラーゼ遺伝子。これが本実施例に
おいて導入したい遺伝子である。 B ．部位特異的組換え配列（RS303,RS3 ）で挟まれた、
マーカー遺伝子（PDR4；セルレニン及びシクロヘキシミ
ド耐性遺伝子）および部位特異的組換え配列間の組換え
を触媒する酵素のＲ遺伝子。Ｒ遺伝子はガラクトースで
発現誘導されるようにGAL1プロモーターにつないでい
る。これらの遺伝子は、形質転換株の選択の後、部位特
異的組換え配列での組換えにより除去されるように設計
した。
【００６９】（２）形質転換（その１） 形質転換には５μgのプラスミドpUPRGA3 を制限酵素Hin
dIII で消化し、エタノール沈殿後、10μlのＴＥ緩衝液
に溶解してその全量を使用した。宿主として酵母（Sacc
haromyces cerevisiae）AY-01 株（a/α野生型）を用
い、プラスミドpUPRGA3 の制限酵素HindIII 消化物でリ
チウム法により形質転換した。その後、1.0 ％シクロヘ
キシミドを含むＹＰＤプレートにひろげ、30℃で３日間
培養してシクロヘキシミド耐性株を選択した。
dIII で消化し、エタノール沈殿後、10μlのＴＥ緩衝液
に溶解してその全量を使用した。宿主として酵母（Sacc
haromyces cerevisiae）AY-01 株（a/α野生型）を用
い、プラスミドpUPRGA3 の制限酵素HindIII 消化物でリ
チウム法により形質転換した。その後、1.0 ％シクロヘ
キシミドを含むＹＰＤプレートにひろげ、30℃で３日間
培養してシクロヘキシミド耐性株を選択した。
【００７０】得られた約400 株の形質転換株のうち、４
株（GA3-PDR4- ＃1 、＃2 、＃3 及び＃4 ）をサザンブ
ロッティングで解析した。染色体は制限酵素HindIII で
消化しURA3遺伝子をプローブとした。その結果、４株と
も1.2kb と9.7kb の断片が検出された。これは親株のAY
-01 株と比較すると、染色体の一方のURA3遺伝子の位置
に8.5kb の挿入があることを示しており、上記のA 、B
両方が挿入されているものと考えられた。
株（GA3-PDR4- ＃1 、＃2 、＃3 及び＃4 ）をサザンブ
ロッティングで解析した。染色体は制限酵素HindIII で
消化しURA3遺伝子をプローブとした。その結果、４株と
も1.2kb と9.7kb の断片が検出された。これは親株のAY
-01 株と比較すると、染色体の一方のURA3遺伝子の位置
に8.5kb の挿入があることを示しており、上記のA 、B
両方が挿入されているものと考えられた。
【００７１】（３）マーカー遺伝子の切り出し（その
１） マーカー遺伝子を切り出すために、前記形質転換（その
１）で得られた形質転換株（GA3-PDR4- ＃1 、＃2 、＃
3 及び＃４）１白金耳を合成培地（yeast nitrogen bas
e w/o amino acid 6.7g 、ガラクトース2g /1L）10mlに
植菌し、30℃で一晩振とう培養してR 遺伝子を誘導し
た。適当に希釈しYPD プレートにひろげて３日間30℃で
培養した。これらのコロニーを各形質転換株由来のもの
から200 個ずつ計800 個選択し、YPD プレートおよび1.
0mg/mlのシクロヘキシミドを含むＹＰＤプレートにレプ
リカし、30℃で3 日間培養し、シクロヘキシミド耐性を
調べた。
１） マーカー遺伝子を切り出すために、前記形質転換（その
１）で得られた形質転換株（GA3-PDR4- ＃1 、＃2 、＃
3 及び＃４）１白金耳を合成培地（yeast nitrogen bas
e w/o amino acid 6.7g 、ガラクトース2g /1L）10mlに
植菌し、30℃で一晩振とう培養してR 遺伝子を誘導し
た。適当に希釈しYPD プレートにひろげて３日間30℃で
培養した。これらのコロニーを各形質転換株由来のもの
から200 個ずつ計800 個選択し、YPD プレートおよび1.
0mg/mlのシクロヘキシミドを含むＹＰＤプレートにレプ
リカし、30℃で3 日間培養し、シクロヘキシミド耐性を
調べた。
【００７２】その結果、３株（GA3-＃1028、＃1151及び
＃1171）のシクロヘキシミド感受性の株が得られた。こ
れらの株をサザンブロッティングで解析した結果、GA3-
＃1028、＃1151及び＃1171の3 株では4.2kb と1.2kb の
断片が検出され、一方の染色体のURA3領域に約3kb の挿
入があることを示していた。これは形質転換株のマーカ
ーが部位特異的組換えにより切り出され、グルコアミラ
ーゼ遺伝子のみが挿入されていることを示している。
＃1171）のシクロヘキシミド感受性の株が得られた。こ
れらの株をサザンブロッティングで解析した結果、GA3-
＃1028、＃1151及び＃1171の3 株では4.2kb と1.2kb の
断片が検出され、一方の染色体のURA3領域に約3kb の挿
入があることを示していた。これは形質転換株のマーカ
ーが部位特異的組換えにより切り出され、グルコアミラ
ーゼ遺伝子のみが挿入されていることを示している。
【００７３】（４）形質転換（その２） GA3-＃1028及び＃1171を、前記形質転換（その１）と同
様に形質転換した。形質転換株として前者由来のものが
６株、後者由来のものが３株得られた。これらをサザン
ブロッティングで解析した。その結果、１株(GA3-PDR4-
＃135)は4.2kbと9.7kb の断片が検出された。これは一
方の染色体のURA3遺伝子の位置にはA のみ、他方はA と
B の両方が挿入されていることを示しており、すでに遺
伝子が挿入されている染色体とはちがう染色体に新たに
遺伝子が挿入されたものと考えられる。
様に形質転換した。形質転換株として前者由来のものが
６株、後者由来のものが３株得られた。これらをサザン
ブロッティングで解析した。その結果、１株(GA3-PDR4-
＃135)は4.2kbと9.7kb の断片が検出された。これは一
方の染色体のURA3遺伝子の位置にはA のみ、他方はA と
B の両方が挿入されていることを示しており、すでに遺
伝子が挿入されている染色体とはちがう染色体に新たに
遺伝子が挿入されたものと考えられる。
【００７４】（５）マーカー遺伝子の切り出し（その
２） マーカー遺伝子の切り出し（その１）と同様にして、GA
3-PDR4- ＃135 株を１日間ガラクトースを含む培地で培
養し、Ｒ遺伝子を誘導した。800 個のコロニーを選択し
シクロヘキシミド耐性を調べたが、シクロヘキシミド感
受性の株はなかった。そこでＲ遺伝子を誘導期間を２日
間にし、そのうち400 株を選択してシクロヘキシミド耐
性を調べた。その結果、７株（GA3-＃5197、＃5198、＃
5199、＃5200、＃6198、＃6199及び＃6200 )がシクロヘ
キシミド感受性になった。これらの株は誘導後まいたＹ
ＰＤプレート上で若干大きめのコロニーを形成してい
た。サザンブロッティングで解析したところ、4.2kb の
断片が検出され、両方の染色体のURA3領域に約３kbの挿
入があることを示しており、グルコアミラーゼ遺伝子の
みが挿入されていると考えられた。
２） マーカー遺伝子の切り出し（その１）と同様にして、GA
3-PDR4- ＃135 株を１日間ガラクトースを含む培地で培
養し、Ｒ遺伝子を誘導した。800 個のコロニーを選択し
シクロヘキシミド耐性を調べたが、シクロヘキシミド感
受性の株はなかった。そこでＲ遺伝子を誘導期間を２日
間にし、そのうち400 株を選択してシクロヘキシミド耐
性を調べた。その結果、７株（GA3-＃5197、＃5198、＃
5199、＃5200、＃6198、＃6199及び＃6200 )がシクロヘ
キシミド感受性になった。これらの株は誘導後まいたＹ
ＰＤプレート上で若干大きめのコロニーを形成してい
た。サザンブロッティングで解析したところ、4.2kb の
断片が検出され、両方の染色体のURA3領域に約３kbの挿
入があることを示しており、グルコアミラーゼ遺伝子の
みが挿入されていると考えられた。
【００７５】（６）グルコアミラーゼ遺伝子の発現 親株AY-01 株とグルコアミラーゼ遺伝子導入株３株（GA
3-PDR4- ＃1 、GA3-＃1028及びGA3-＃5197）をＹＰＤ培
地に１白金耳植菌し、３０℃で１８時間培養した。培養
液の一部を取り、遠心分離後の上清を用いてグルコアミ
ラーゼ活性を測定した。測定は熱により糊化させた可溶
性澱粉を用い４０℃で反応させた後に遊離したグルコー
スの量を定量することにより測定した。
3-PDR4- ＃1 、GA3-＃1028及びGA3-＃5197）をＹＰＤ培
地に１白金耳植菌し、３０℃で１８時間培養した。培養
液の一部を取り、遠心分離後の上清を用いてグルコアミ
ラーゼ活性を測定した。測定は熱により糊化させた可溶
性澱粉を用い４０℃で反応させた後に遊離したグルコー
スの量を定量することにより測定した。
【００７６】グルコアミラーゼの酵素活性は４０℃で１
分間に１μmoleのグルコースを遊離する活性を１単位と
した。その結果、親株であるAY-01 株ではグルコアミラ
ーゼ活性を全く示さなかったが、グルコアミラーゼ遺伝
子導入株３株、GA3-PDR4- ＃1 、GA3-＃1028及びGA3-＃
5197では、培溶液上清１ml当たりそれぞれ0.173 、0.17
9 及び0.389 ユニットのグルコアミラーゼを分泌生産し
ていた。
分間に１μmoleのグルコースを遊離する活性を１単位と
した。その結果、親株であるAY-01 株ではグルコアミラ
ーゼ活性を全く示さなかったが、グルコアミラーゼ遺伝
子導入株３株、GA3-PDR4- ＃1 、GA3-＃1028及びGA3-＃
5197では、培溶液上清１ml当たりそれぞれ0.173 、0.17
9 及び0.389 ユニットのグルコアミラーゼを分泌生産し
ていた。
【００７７】
【発明の効果】以上のように酵母の部位特異的組換え機
構を用いて形質転換体から選択マーカー遺伝子を除く技
術が確立された。その結果、後代をとったり、再度の形
質転換や交配などの操作を伴うことなく、選択マーカー
遺伝子の除去が可能となった。また、本発明において定
義する１対のＲ認識配列を用いることにより、組換え後
に残存する配列がもはやＲ蛋白質により認識されにくい
配列になることから、選択マーカー遺伝子除去後の形質
転換個体を用いて再び、同じ選択マーカーを用いた形質
転換が可能となった。
構を用いて形質転換体から選択マーカー遺伝子を除く技
術が確立された。その結果、後代をとったり、再度の形
質転換や交配などの操作を伴うことなく、選択マーカー
遺伝子の除去が可能となった。また、本発明において定
義する１対のＲ認識配列を用いることにより、組換え後
に残存する配列がもはやＲ蛋白質により認識されにくい
配列になることから、選択マーカー遺伝子除去後の形質
転換個体を用いて再び、同じ選択マーカーを用いた形質
転換が可能となった。
【００７８】このことは理論的には同じ選択マーカーを
もちいて無限の遺伝子を同一個体に導入する技術が可能
となったことを意味する。また、我々が発明した方法を
用いることにより、形質転換体から選択マーカー遺伝子
を特異的に除去できることから、組換え体の安全性評価
においても選択マーカー遺伝子に関する評価を省略する
ことが可能であり、育種された個体の産業利用において
非常に有用な技術を提供することができる。
もちいて無限の遺伝子を同一個体に導入する技術が可能
となったことを意味する。また、我々が発明した方法を
用いることにより、形質転換体から選択マーカー遺伝子
を特異的に除去できることから、組換え体の安全性評価
においても選択マーカー遺伝子に関する評価を省略する
ことが可能であり、育種された個体の産業利用において
非常に有用な技術を提供することができる。
【００７９】
配列番号：１ 配列の長さ：３１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 TTGATGAAAG AATACGTTAT TCTTTCATCA A 31
【００８０】配列番号：２ 配列の長さ：２９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 TTGATGAAAG AATACGTTAT TCTTTCATC 29
【００８１】配列番号：３ 配列の長さ：２７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 TTGATGAAAG AATACGTTAT TCTTTCA 27
【００８２】配列番号：４ 配列の長さ：２５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 TTGATGAAAG AATACGTTAT TCTTT 25
【００８３】配列番号：５ 配列の長さ：１９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 AAAGAATACG TTATTCTTT 19
【００８４】配列番号：６ 配列の長さ：２３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 TTGATGAAAG AATACGTTAT TCT 23
【００８５】配列番号：７ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 TTGATGAAAG AATACGTTAT T 21
【００８６】配列番号：８ 配列の長さ：１９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 TTGATGAAAG AATACGTTA 19
【００８７】配列番号：９ 配列の長さ：３０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 TTGATGAAAG AATACGTTAT CTTTCATCAA 30
【００８８】配列番号：１０ 配列の長さ：２８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 TTGATGAAAG AATAGTTATT CTTTCATC 28
【００８９】配列番号：１１ 配列の長さ：２５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 TTGATGAAAT AATACGTTAT TCTTT 25
【００９０】配列番号：１２ 配列の長さ：３１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 TTGATGAAAG AATACGTTAT TCTTTCATCA A 31
【００９１】配列番号：１３ 配列の長さ：２７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 CTTGATGAAA GAATACGTTA TTCTTTG 27
【００９２】配列番号：１４ 配列の長さ：３５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 AATTCAAAGA ATAACGTATT CTTTCATCAA GAGCT 35
【００９３】配列番号：１５ 配列の長さ：２７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 CTTGATGAAA GAATAACGTA TTCTTTA 27
【００９４】配列番号：１６ 配列の長さ：３５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 AGCTTAAAGA ATACGTTATT CTTTCATCAA GCATG 35
【００９５】配列番号：１７ 配列の長さ：２８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 CTTGATGAAA GAATACGTTA TTCTTTCA 28
【００９６】配列番号：１８ 配列の長さ：３７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 AATTCTGAAA GAATAACGTA TTCTTTCATC AAGAGCT 37
【００９７】配列番号：１９ 配列の長さ：２８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 CTTGATGAAA GAATAACGTA TTCTTTCA 28
【００９８】配列番号：２０ 配列の長さ：３６ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 AGCTTGAAAG AATACGTTAT TCTTTCATCA AGCATG 36
【図１】図１は、プラスミドｐＨＭ９９９の構造を示す
図である。
図である。
【図２】図２は、プラスミドｐＯＤＡ２の構造を示す図
である。
である。
【図３】図３は、プラスミドｐＲＳ３０４−４−４の構
造を示す図である。
造を示す図である。
【図４】図４は、プラスミドｐＲＳ１５３ｄＢ１の構築
の概略を示す図である。
の概略を示す図である。
【図５】図５は、プラスミドｐＰＲＡ１５３ｄＢ１の構
築の概略を示す図である。
築の概略を示す図である。
【図６】図６は、プラスミドｐＰＲＡＧ４１８の構築の
概略を示す図である。
概略を示す図である。
【図７】図７は、プロテアーゼＡ遺伝子の破壊及び部位
特異的組換えによる選択マーカー遺伝子の除去について
の概略を示す図である。
特異的組換えによる選択マーカー遺伝子の除去について
の概略を示す図である。
【図８】図８は、サザンブロット解析の結果を示し、電
気泳動の結果を示す図面代用写真である。
気泳動の結果を示す図面代用写真である。
【図９】図９は、１対のＲ認識配列内で組換えが生ずる
際の１対のＲ認識配列の配置を示す。２本の交線（Ｘ記
号）は組換えが生ずる部位を示す。
際の１対のＲ認識配列の配置を示す。２本の交線（Ｘ記
号）は組換えが生ずる部位を示す。
【図１０】図１０において、（Ａ）は１対のＲ認識配列
間で組換えが生ずる際のＲ認識配列の塩基配列の配置を
様式的に示す図である。（Ｂ）は、Ａに示す１対のＲ認
識配列間で組換えが生じた際に生成するＲ認識配列の融
合体の塩基配列を示す図である。
間で組換えが生ずる際のＲ認識配列の塩基配列の配置を
様式的に示す図である。（Ｂ）は、Ａに示す１対のＲ認
識配列間で組換えが生じた際に生成するＲ認識配列の融
合体の塩基配列を示す図である。
【図１１】図１１は、本発明の方法を用いて酵母の染色
体に目的遺伝子を組み込む場合の方法を示す模式図であ
る。
体に目的遺伝子を組み込む場合の方法を示す模式図であ
る。
【図１２】図１２は、プラスミドｐＰＲＡＣｅｒｌｌの
構造を示す図である。
構造を示す図である。
【図１３】図１３は、プラスミドｐＵＰＲＧＡ３の構造
を示す図である。
を示す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:865） (72)発明者 荒木 弘之 大阪府箕面市西宿２−21−501 (72)発明者 大嶋 泰治 大阪府高槻市日吉台２番町６−５
Claims (6)
- 【請求項１】 誘導性プロモーターの制御下に配置され
たＲ遺伝子と発現可能な選択マーカー遺伝子とを挟む、
同方向に配置された１対のＲ認識配列を含んで成るＤＮ
Ａ断片の両端に、酵母の染色体ＤＮＡとの間で組換えが
可能なＤＮＡ断片が直接又は間接に連結されているＤＮ
Ａ構成物において、前記Ｒ認識配列が次の塩基配列： 【化１】 を含んで成るか又はこれと実質的に同一な配列を含んで
成り、但し前記Ｒ遺伝子の近傍に位置するＲ認識配列は
該Ｒ遺伝子に近接する側とは反対側に存在する逆向き反
復配列においてスペーサー配列から遠位の側の１０個以
下の塩基が欠けており、そして選択マーカー遺伝子の近
傍に位置するＲ認識配列は該選択マーカー遺伝子に近接
する側とは反対側に存在する逆向き反復配列においてス
ペーサー配列から遠位の側の１０個以下の塩基配列が欠
けていることを特徴とするＤＮＡ構成物。 - 【請求項２】 前記酵母の染色体ＤＮＡとの間で組換え
可能なＤＮＡ断片と、その近傍にあるＲ認識配列との間
に、酵母染色体に組み込むべき目的遺伝子が挿入されて
いる、請求項１に記載のＤＮＡ構成物。 - 【請求項３】 プラスミド中に挿入されている請求項１
又は２項に記載のＤＮＡ構成物。 - 【請求項４】 酵母の形質転換方法において、 （１）請求項１〜３のいずれか１項に記載のＤＮＡ構成
物を酵母細胞に導入し、該ＤＮＡ構成物の両端に存在す
る酵母の染色体との間で組換可能なＤＮＡ断片と酵母染
色体ＤＮＡとの間の組換により、該ＤＮＡ構成物を酵母
染色体に組み込み、 （２）前記発現可能な選択マーカー遺伝子の発現によ
り、前記ＤＮＡ構成物が酵母染色体に導入された酵母細
胞を選択し、 （３）前記誘導性プロモーターを誘導することによりＲ
遺伝子を発現せしめ、これによって前記１対のＲ認識配
列間において組換えを起こし、前記誘導性プロモーター
の制御下に配置されたＲ遺伝子と発現可能な選択マーカ
ー遺伝子とを切除する、ことを特徴とする方法。 - 【請求項５】 前記酵母の染色体ＤＮＡとの間で組換え
可能なＤＮＡ配列と、その近傍にあるＲ認識配列との間
に、酵母染色体に組み込むべき目的遺伝子が挿入されて
いるＤＮＡ構成物を用い、該目的遺伝子を酵母染色体に
挿入することを特徴とする、請求項４に記載の方法。 - 【請求項６】 前記操作を複数回反復することを特徴と
する、請求項４又は５に記載の方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP17913197A JP4090090B2 (ja) | 1996-06-21 | 1997-06-20 | 選択マーカー遺伝子を持たない形質転換体の作製方法 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP17982096 | 1996-06-21 | ||
| JP8-179820 | 1996-06-21 | ||
| JP17913197A JP4090090B2 (ja) | 1996-06-21 | 1997-06-20 | 選択マーカー遺伝子を持たない形質転換体の作製方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH1066587A true JPH1066587A (ja) | 1998-03-10 |
| JP4090090B2 JP4090090B2 (ja) | 2008-05-28 |
Family
ID=26499082
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP17913197A Expired - Fee Related JP4090090B2 (ja) | 1996-06-21 | 1997-06-20 | 選択マーカー遺伝子を持たない形質転換体の作製方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP4090090B2 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2002520061A (ja) * | 1998-07-16 | 2002-07-09 | ノボ ノルディスク アクティーゼルスカブ | 形質転換した酵母細胞におけるタンパク質の製造方法 |
| JP2009082119A (ja) * | 2007-09-29 | 2009-04-23 | Nippon Paper Industries Co Ltd | 新規な部位特異的組換え酵素認識配列及びベクター |
-
1997
- 1997-06-20 JP JP17913197A patent/JP4090090B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2002520061A (ja) * | 1998-07-16 | 2002-07-09 | ノボ ノルディスク アクティーゼルスカブ | 形質転換した酵母細胞におけるタンパク質の製造方法 |
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