JPH0947289A - 担子菌コリオラス属由来プロモーター活性を有するｄｎａ断片 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 担子菌アラガカワラタケを宿主とした形質転
換系によるリグニンパーオキシダーゼ又はマンガンパー
オキシダーゼ生産方法を提供する。 【解決手段】 コリオラス属アラゲカワラタケ由来のプ
ロモーターＤＮＡ配列を含んでなるＤＮＡ断片及びリグ
ニンパーオキシダーゼ遺伝子又はマンガンパーオキシダ
ーゼ遺伝子を含む組み換え体ベクターによって形質転換
された担子菌アラゲカワラタケ形質転換体を培地に培養
し、その培養物からリグニンパーオキシダーゼ又はマン
ガンパーオキシダーゼ遺伝子を採取することを特徴とす
るリグニンパーオキシダーゼ又はマンガンパーオキシダ
ーゼの製造方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は担子菌類アラゲカワ
ラタケから得られたプロモーター活性を有する新規ＤＮ
Ａ断片、それを含む組換えＤＮＡおよび該組換えＤＮＡ
を含む形質転換体およびその利用に関する。

【０００２】

【従来の技術】現在まで、組換えＤＮＡ技術を用いて多
様なポリペプチドを産生する系は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌ
ｉ）が中心となって行なわれている。しかしながら、大
腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）は宿主として適さない場合が多
い。例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において、ヒトな
ど高等生物由来の有用なポリペプチドを生産させる場
合、活性型酵素タンパク質として生産されないことが多
い。また目的ポリペプチド以外にも多数の毒性物質を産
生し、目的産物の精製が非常に困難となる等の問題点が
ある。上記問題点を解決する手段として下等真核生物の
酵母を宿主とした生産方法が盛んに研究されているが、
その場合目的ポリペプチドの生産性が低いという問題点
がある。そこで、ポリペプチド産生のため、より高等生
物な真核生物としてアスペルギラス（Ａｓｐｅｒｇｉｌ
ｌｕｓ）属などの糸状菌、またファネロカエート（Ｐｈ
ａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ）属やコリオラス属などの担子
菌を宿主とした形質転換系が開発され、酵素タンパク質
生産が検討されている。

【０００３】担子菌類は真核生物に属するが、酵母より
も動物細胞に近縁であると考えられている［Ｔ．Ｌ．Ｓ
ｍｉｔｈ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ
ＳＡ，８６，７０６３（１９８９）］。リグニン分解力
が強いアラゲカワラタケはコリオラス属に属する担子菌
類であり、本発明者らにより宿主・ベクター系が開発さ
れ、組換えＤＮＡ技術を用いて、これまで困難とされて
いたリグニンパーオキシダーゼ生産に成功した［特開平
６−０５４６９１号参照］。しかしながら用いるプロモ
ーター領域はアミノ酸合成系酵素遺伝子であるオルニチ
ンカルバモイルトランスフェラーゼ遺伝子やリグニン分
解に関与するフェノールオキシダーゼ遺伝子のプロモー
ター領域であるため、生産性が低く、もしくは二次代謝
産物であるため遺伝子が発現するまでに長い培養時間を
要する等の問題点があり、その生産量は野性株ＩＦＯ４
９１７株をリグニンパーオキシダーゼ生産用培地（低炭
素・低窒素源）で生産した時と同程度であった。また、
大腸菌や酵母を用いた形質転換系においてリグニンパー
オキシダーゼ生産を試みた場合、活性のある状態で生産
されていなかった［Ｒ．Ｌ．Ｆａｒｒｅｌｌ，Ｅｕｒｏ
ｐｅａｎ Ｐａｔｅｎｔ Ｏｆｆｉｃｅ Ｎｏ．０，２
６１，０８０，（１９８９）］。さらに、糸状菌トリコ
デルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅ
ｉ）の宿主・ベクター系を用いてフェレビア・ラデアタ
（Ｐｈｌｅｂｉａ ｒａｄｉａｔａ）由来のリグニンパ
ーオキシダーゼ遺伝子をセロビオハイドラーゼ遺伝子の
プロモーター下に連結し、酵素生産を試みたが活性型の
リグニンパーオキシダーゼは生産されなかった［Ｍ．Ｓ
ａｌｏｈｅｉｍｏ，ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ，８５，３
４３（１９８９）］。さらに他の生物種、例えば糸状菌
などの遺伝子組換えによる酵素タンパク質生産系に供さ
れているプロモーターが担子菌では機能しないことも報
告されている［Ａ．Ｌｏｒｎａ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒ
ｒ．Ｇｅｎｅｔ．，１６，３５（１９８９）］。また、
アスペルギラス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕ
ｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）由来のＡｒｇＢ遺伝子もアラゲ
カワラタケで機能しなかった［Ａ．Ｔｓｕｋａｍｏｔ
ｏ，ｅｔ ａｌ．，ＵＳ Ｐａｔｅｎｔ Ａｐｐｌｎ．
Ｓ．Ｎ．０８／０２７，９８６（１９９３）］。そこ
で、担子菌アラゲカワラタケで機能する、より強力な転
写活性を有するプロモーターに対する関心が高まってい
るが、現在までにそのようなプロモーターが取得された
旨の報告はない。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、担子
菌アラゲカワラタケ宿主・ベクター系を用いて目的とす
る蛋白質を大量に生産させるためのプロモーター、該プ
ロモーターを用いた蛋白質の遺伝子系並びに該遺伝子系
を用いた蛋白質の大量発現生産方法を提供することであ
る。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、恒常的に
発現するアラゲカワラタケのグリセルアルデヒド−３−
りん酸脱水素酵素（以下ＧＰＤと略す）遺伝子に着目
し、アラゲカワラタケの染色体ＤＮＡ制限酵素断片から
ＧＰＤをコードするＤＮＡ断片をクローン化し、この遺
伝子のプロモーター領域の下流に、アラゲカワラタケか
らクローニングされた高温誘導リグニンパーオキシダー
ゼ遺伝子［特開平５−２６０９７８号］またはマンガン
パーオキシダーゼ遺伝子[ 特開平７−１２３５４０号]
のシグナルペプチドを含む構造遺伝子を連結し、オルニ
チンカルバモイルトランスフェラーゼ（以下ＯＣＴと略
す）欠損アラゲカワラタケ変異株に移入することによ
り、リグニンパーオキシダーゼ高生産株及びマンガンパ
ーオキシダーゼ高生産株を取得することに成功し、本発
明を完成するに至った。

【０００６】即ち、本発明は、目的遺伝子の発現を制御
するコリオラス属アラゲカワラタケ（Ｃｏｒｉｏｌｕｓ
ｈｉｒｓｕｔｕｓ）由来のプロモーターＤＮＡ配列を
含んでなるＤＮＡ断片である。上記目的遺伝子として
は、オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ遺伝
子、リグニンパーオキシダーゼ遺伝子又はマンガンパー
オキシダーゼ遺伝子等があげられる。上記プロモーター
ＤＮＡ配列としては、実質的に配列番号１の塩基配列が
あげられる。ここで、「実質的に配列番号１の塩基配
列」とは配列番号１の塩基配列並びに前記塩基配列にお
いてその一部の塩基配列が置換、挿入又は欠失するも配
列番号１の塩基配列と同一の作用・効果を有する塩基配
列の全てを指すことを意味するものである。

【０００７】さらに、本発明は、上記ＤＮＡ断片及び目
的遺伝子を含む組み換え体ベクターである。上記目的遺
伝子としては、オルニチンカルバモイルトランスフェラ
ーゼ遺伝子、リグニンパーオキシダーゼ遺伝子又はマン
ガンパーオキシダーゼ等が挙げられる。ただし目的遺伝
子としては、上記３種類に限定されるものではなく、い
ずれの目的遺伝子も使用することができる。

【０００８】さらに、本発明は、上記組み換え体ベクタ
ーによって形質転換された担子菌アラゲカワラタケ形質
転換体である。さらに、本発明は、上記コリオラス属担
子菌形質転換体を培養し、その培養物からリグニンパー
オキシダーゼ又はマンガンパーオキシダーゼを採取する
ことを特徴とするリグニンパーオキシダーゼ又はマンガ
ンパーオキシダーゼの製造方法である。

【０００９】以下、本発明を詳細に説明する。本発明に
用いる染色体ＤＮＡの供与体はアラゲカワラタケであ
り、具体的には例えばＣｏｒｉｏｌｕｓ ｈｉｒｓｕｔ
ｕｓＩＦＯ４９１７株である。本菌株から染色体ＤＮＡ
を調製するには、Ｙｅｌｔｏｎらの方法［Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１，１４７０
（１９８４）］等、通常の染色体ＤＮＡの抽出方法が用
いられる。

【００１０】次に、得られた染色体ＤＮＡをＳａｕ３Ａ
Ｉ等の適当な制限酵素で処理し、部分分解を行なった
後、ショ糖密度勾配超遠心法で分画して１０ｋｂｐ〜２
５ｋｂｐのＤＮＡ断片を得る。同じ接着末端を生じさせ
る制限酵素で処理したファージＤＮＡに、上記で得られ
たＤＮＡ断片を挿入して染色体遺伝子ライブラリーを作
製する。前記ファージＤＮＡとしては例えばＥＭＢＬ３
［Ａ−Ｍ，Ｆｒｉｓｈａｕｆ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏ
ｌ．Ｂｉｏｌ．１７０，８２７（１９８３）］が用いら
れる。挿入後、ｉｎ ｖｉｔｒｏでパッケージを行な
い、染色体ＤＮＡライブラリーとする。またサブクロー
ニングには常用のクローニングベクター、好ましくは大
腸菌クローニングベクター、例えば、ｐＵＣ系ベクタ
ー、例えばｐＵＣ１８［Ｃ．Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒ
ｏｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ，３３，１０３（１９８
５）］を用いる。

【００１１】上記で得られた染色体遺伝子ライブラリー
からのＧＰＤ遺伝子の単離にあたっては、他生物種から
単離されているＧＰＤ遺伝子のＤＮＡ配列に基づいて作
製した合成ＤＮＡをプローブとして用い、プラーク・ハ
イブリダイゼーションを行なう。単離されたＧＰＤ染色
体遺伝子を含む断片は図１で表される制限酵素地図から
成っていた。

【００１２】このＧＰＤ染色体遺伝子を含む断片を適当
なクローニングベクターに挿入し、塩基配列はＳａｎｇ
ｅｒらの方法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ，７４，５４６３（１９７７）］により決定
することができる。上記クローニングベクターとして
は、好ましくは細菌クローニングベクター、特に大腸菌
クローニングベクターであるｐＵＣ系クローニングベク
ター、例えばｐＵＣ１８が用いられる。

【００１３】次に、後記の実施例３で詳細に述べるよう
にＯＣＴ遺伝子の構造遺伝子部分をレポーター遺伝子と
して連結し、ＯＣＴ欠損アラゲカワラタケ変異株に移入
することによりＧＰＤ遺伝子のプロモーター活性を有す
る必要領域を決定することができる。ＯＣＴ構造遺伝子
としては、例えば特開平６−０５４６９１号公報に記載
されているものが用いられる。なお、この構造遺伝子を
含むプラスミドｐＵＣＲ１により形質転換された大腸菌
であるＪＭ１０９／ｐＵＣＲ１は、ＦＥＲＭ Ｐ−１２
６７９として工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託
されている。

【００１４】さらに、アラゲカワラタケのＯＣＴｃＤＮ
Ａ遺伝子は特開平６−０５４６９１号公報に記載されて
いる。この構造遺伝子を含むプラスミドｐＵＣＲＭによ
り形質転換された大腸菌ＪＭ１０９／ｐＵＣＲＭは、Ｆ
ＥＲＭ Ｐ−１３４２４として工業技術院生命工学工業
技術研究所に寄託されている。次に、後記実施例５で詳
しく述べるように上記ＧＰＤプロモーター領域の下流に
リグニンパーオキシダーゼ構造遺伝子部分又はマンガン
パーオキシダーゼ構造遺伝子部分を連結し、遺伝子組換
えによりリグニンパーオキシダーゼ又はマンガンパーオ
キシダーゼを大量に生産することができる。

【００１５】なお、アラゲカワラタケのＯＣＴ活性を欠
損している栄養要求性変異株ＯＪＩ−１０７８、高温誘
導リグニンパーオキシダーゼ遺伝子を含む大腸菌組換え
株Ｅ．ｃｏｌｉ ＸＬ−１ ｂｌｕｅ／ｐＢＳＬＰＯＧ
７、マンガンパーオキシダーゼ遺伝子を含む大腸菌組換
え株Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９／ｐＢＳＬＰＯＧ１及び
アラゲカワラタケ由来ＧＰＤ遺伝子のプロモーター領域
を含む大腸菌組換え株Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９／ｐＣ
ＨＧＰＤは工業技術院生命工学工業技術研究所にそれぞ
れＦＥＲＭ Ｐ−１２６７７、ＦＥＲＭ Ｐ−１２６８
３、ＦＥＲＭＰ−１４９３３及びＦＥＲＭ Ｐ−１５０
１５として寄託されている。

【００１６】

【発明の実施の形態】以下に本発明を実施例によりさら
に詳しく説明する。但し、本発明はこれら実施例により
その技術的範囲が限定されるものではない。 実施例１．染色体遺伝子ライブラリーの作製 アラゲカワラタケ（ＩＦＯ４９１７株）の平板寒天培養
から直径５ｍｍの寒天片をコルクボーラーで打ち抜き、
グルコース・ペプトン培地（グルコース２％、ポリペプ
トン０．５％、酵母エキス０．２％、ＫＨ₂ＰＯ₄０．１
％、ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ ０．０５％、りん酸でｐＨ
４．５に調製）２００ｍｌに植菌し、２８℃で７日間回
転振盪培養を行なった。菌体を集菌後、１Ｌの滅菌水で
菌体を洗浄し、液体窒素で凍結した。

【００１７】この凍結菌体５ｇを乳鉢を用いて粉砕し
た。粉砕した菌体を遠心管に移し、Ｌｙｓｉｓ緩衝液
（１００ｍＭトリス（ｐＨ８）、１００ｍＭＥＤＴＡ、
１００ｍＭＮａＣｌさらにプロテイナーゼＫを１００μ
ｇ／ｍｌとなるように添加）１０ｍｌを加え、５５℃で
３時間インキュベートした。インキュベート後、フェノ
ール抽出、クロロホルム抽出を行ない、抽出した水層部
分にエタノールを徐々に添加しＤＮＡが析出したところ
で染色体ＤＮＡを巻取り、ＴＥ溶液（１０ｍＭトリス
（ｐＨ８）、１ｍＭＥＤＴＡ）に懸濁した。

【００１８】得られた染色体ＤＮＡ１００μｇを制限酵
素Ｓａｕ３ＡＩ（宝酒造社製）で部分分解し、５〜２０
％ショ糖密度勾配超遠心分離（３０，０００ｒｐｍ，１
８時間）により分画し、１０〜２５ｋｂｐ断片区分を集
めた。この断片区分を東洋紡社製ファージλＥＭＢＬ３
−ＢａｍＨＩアームにＴ４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造社
製）を用いて連結し、得られたファージＤＮＡをＳＴＲ
ＡＴＡＧＥＮＥ社製ギガパックゴールドを用いてパッケ
ージング後、大腸菌Ｐ２３９２株（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮ
Ｅ社製）に感染せしめ染色体ＤＮＡライブラリーとし
た。 実施例２．染色体遺伝子ライブラリーからのＧＰＤ遺伝
子の単離 上記染色体ＤＮＡライブラリーからプラークハイブリダ
イゼーションによりＧＰＤ遺伝子を含むクローンの選抜
を行なった。この一連の操作は常法［Ｓａｍｂｒｏｏｋ
ら著、”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ／２ｎｄ Ｅｄｉｔ
ｉｏｎ（１９８９）］により行った。プラークハイブリ
ダイゼーションに用いたプローブは次の配列を持つ合成
オリゴマー（２本） ５’−ＴＡＴＡＴＧＴＴＴＡＡＡＴＡＴＧＡ−３’ Ｃ Ｃ Ｇ Ｃ ５’−ＴＧＧＴＡＴＧＡＴＡＡＴＧＡＡＴＧＧＧＧ−３’ Ｃ Ｃ Ｃ Ｇ を³²Ｐで放射能標識したものである。

【００１９】この結果、約４０，０００個のプラークの
中から４個の陽性クローンを選抜することができた。陽
性クローンから常法に従って調製した組換え体ファージ
ＤＮＡを各種制限酵素で消化し、上記２種の合成ＤＮＡ
を用いてサザンハイブリダイゼーションを行なった。そ
の結果、制限酵素ＥｃｏＲＩ（宝酒造社製）、且つＢａ
ｍＨＩ（宝酒造社製）で消化して得られた断片中に単一
のＤＮＡバンドとして３．８ｋｂｐにハイブリダイズす
るクローンが認められた。

【００２０】上記ＤＮＡ断片３．８ｋｂｐをアガロース
ゲル電気泳動法により切り出し、大腸菌ベクターｐＵＣ
１８（宝酒造社製）のＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩサイトに
サブクローン化し、大腸菌ＪＭ１０９株（宝酒造社製）
へ形質転換した。サブクローン化したＤＮＡを大量に調
製し、超遠心操作（５０，０００ｒｐｍ，１６ｈｒｓ，
１５℃）で精製し、塩基配列を決定した。塩基配列の決
定はシーケナーゼキット（Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ社製）を用いて行った。

【００２１】翻訳開始点から下流に８５０番目までの塩
基配列を配列番号２に示す。その結果、上記塩基配列の
範囲内においてアラゲカワラタケ由来ＧＰＤ遺伝子は６
つのイントロンにより分断されていた。イントロンを除
いた塩基配列から推定されるアミノ酸配列を、配列番号
３に示す。このアミノ酸配列は、これまで報告されてい
るＧＰＤ遺伝子と高い類似性が認められた。

【００２２】なお、得られたアラゲカワラタケ由来ＧＰ
Ｄ遺伝子を含む大腸菌形質転換株Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１
０９／ｐＣＨＧＰＤは工業技術院生命工学工業技術研究
所にＦＥＲＭ Ｐ−１５０１５として寄託されている。 実施例３．ＧＰＤ遺伝子制御領域に支配されるＯＣＴ構
造遺伝子の連結 担子菌アラゲカワラタケ用のＯＣＴ発現選択マーカー用
プラスミドｐＧＰＲＧはＧＰＤ遺伝子のプロモーター領
域の下流にＯＣＴ染色体遺伝子（特開平６−０５４６９
１；ＦＥＲＭ Ｐ−１２６７９）の構造遺伝子領域を連
結し、本来のＯＣＴ遺伝子からプロモーター領域を置換
した選択マーカー遺伝子とした。

【００２３】具体的にはＧＰＤ染色体遺伝子ＥｃｏＲＩ
且つＢａｍＨＩ消化により得られる３．８ｋｂｐのＤＮ
Ａ断片をファージベクターＭ１３ｍｐ１８のＥｃｏＲ
Ｉ、ＢａｍＨＩサイトにＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連
結し、これを大腸菌ＪＭ１０９株に形質転換し、一本鎖
ファージＤＮＡを調製した。次に、図２断片１に示すＤ
ＮＡプライマーをフォスフォアミダイド法により合成
し、上記一本鎖ファージＤＮＡにアニーリングを行い、
プライマー伸長法によりＧＰＤ遺伝子のプロモーター領
域だけを合成し、制限酵素ＥｃｏＲＩ（宝酒造社製）で
切断することにより０．９ｋｂｐのＤＮＡ断片を調製し
た（断片１）。この塩基配列は配列番号１である。

【００２４】一方、ＯＣＴの成熟型酵素をコードしてい
る遺伝子領域を取り出すため、プラスミドｐＵＣＲ１
（特開平６−０５４６９１号公報；ＦＥＲＭ Ｐ−１２
６７７）を制限酵素ＮｃｏＩ（宝酒造社製）で切断し、
次にＭｕｎｇ ｂｅａｎ ｎｕｃｌｅａｓｅ（宝酒造社
製）により突出部分を削り込み平滑末端とし、約２．５
ｋｂｐのＤＮＡ断片を得た（断片２）。

【００２５】大腸菌ベクターｐＵＣ１８を制限酵素Ｅｃ
ｏＲＩとＳｍａＩ（宝酒造社製）で切断し、上記２種類
のＤＮＡ断片を混合して、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで連結し
た後、大腸菌ＪＭ１０９株の形質転換を行い、アンピシ
リン耐性の形質転換株の中から上記断片１及び断片２の
２種類のＤＮＡ断片が同時に挿入されているプラスミド
を単離し、これをｐＧＰＲＧと命名した（図２）。 実施例４．アラゲカワラタケ（Ｃｏｒｉｏｌｕｓ ｈｉ
ｒｓｕｔｕｓ）形質転換法 ａ．一核菌糸培養 直径６mm前後のガラスビーズを約３０個入れた５００ｍ
ｌ容の三角フラスコにＳＭＹ培地（シュークロース１
％、麦芽エキス１％、酵母エキス０．４％）１００ｍｌ
を分注して滅菌後、アラゲカワラタケ（Ｃｏｒｉｏｌｕ
ｓ ｈｉｒｓｕｔｕｓ）ＯＪＩ−１０７８の平板寒天培
地から直径５mmの寒天片をコルクボーラーで打ち抜きＳ
ＭＹ培地に植菌し、２８℃で７日間静置培養した（前培
養）。

【００２６】ただし、菌糸を細分化するために、１日に
１〜２回振り混ぜた。次に、１Ｌ容の三角フラスコにＳ
ＭＹ培地２００ｍｌを分注し、さらに回転子を入れ、滅
菌後、前培養菌糸をナイロンメッシュ（孔径３０μｍ）
で濾集し、全量を植菌し、２８℃で培養した。なお、ス
ターラーで１日２時間撹拌することにより菌糸を細分化
した。この培養を４日間行なった。

【００２７】ｂ．プロトプラストの調製 上記液体培養菌糸をナイロンメッシュ（孔径３０μｍ）
で濾集し、浸透圧調節溶液（０．５Ｍ ＭｇＳＯ₄、５
０ｍＭマレイン酸バッファー（ｐＨ５．６））で洗浄し
た。次に湿菌体１００ｍｇあたり１ｍｌの細胞壁分解酵
素液に懸濁し、緩やかに振盪しながら２８℃で４時間イ
ンキュベートしてプロトプラストを遊離させた。細胞壁
溶解酵素として、次の市販酵素製剤を組み合わせて使用
した。即ち、セルラーゼ・オノズカ（ｃｅｌｌｕｌａｓ
ｅ ＯＮＯＺＵＫＡ ＲＳ）（ヤクルト社製）５ｍｇ、
ノボザイム（Ｎｏｖｏｚｙｍｅ２３４）（ノボ社製）１
０ｍｇを上記浸透圧調節溶液１ｍｌに溶解して酵素液と
して用いた。

【００２８】ｃ．プロトプラストの精製 上記酵素反応液からナイロンメッシュ（孔径３０μｍ）
で菌糸断片を除いた後、プロトプラストの回収率を高め
るため、ナイロンメッシュ上に残存する菌糸断片とプロ
トプラストを上記浸透圧調節溶液で１回洗浄した。得ら
れたプロトプラスト懸濁液を遠心分離（１，０００ｘ
ｇ、５分間）し、上清を除去し、４ｍｌの１Ｍシューク
ロース（２０ｍＭ ＭＯＰＳ緩衝液、ｐＨ６．３）で再
懸濁後、遠心操作を繰り返し、上記１Ｍシュークロース
溶液で２回洗浄した。沈澱物に１Ｍソルビトール溶液
（２０ｍＭ ＭＥＳ、ｐＨ６．４）に４０ｍＭ塩化カル
シウムを加えた溶液５００μｌに懸濁し、プロトプラス
ト溶液とした。この溶液を４℃で保存した。

【００２９】プロトプラスト濃度は血球計算盤を用いて
直接検鏡により求めた。全ての遠心操作はスウィングロ
ーターで１，０００ｘｇ、５分間、室温下で行った。 ｄ．形質転換 １０⁶個／１００μｌ濃度のプロトプラスト溶液１００
μｌに対し、実施例３で作製したプラスミドｐＧＰＲＧ
２μｇを添加し、３０分間氷冷した。つぎに、液量に対
し等量のＰＥＧ溶液（５０％ ＰＥＧ３４００、２０ｍ
Ｍ ＭＯＰＳ（ｐＨ６．４））を加え、３０分間氷冷し
た。つぎに、０．５Ｍシュークロースおよびロイシンを
含む最少軟寒天培地（寒天１％）に混合してプレートに
撒いた。上記プレートを２８℃で４日間培養を行ない、
形質転換体を得た。この時における形質転換効率は３０
０コロニー／μｇ形質転換ＤＮＡであった。なお、プラ
スミドベクターｐＵＣ１８だけのＤＮＡ供与体を用いた
対照実験では形質転換体は全く得られなかった。 実施例５．リグニンパーオキシダーゼ発現プラスミドの
構築 上記実施例３で作製したＤＮＡ断片１（担子菌アラゲカ
ワラタケ用のＧＰＤ遺伝子のプロモーター）の下流にリ
グニンパーオキシダーゼ染色体遺伝子（特開平５−２６
０９７８号；ｐＢＳＬＰＯＧ７；ＦＥＲＭ Ｐ−１２６
８３）の構造遺伝子領域を連結し、発現プラスミドとし
た。

【００３０】具体的にはリグニンパーオキシダーゼの構
造遺伝子部分を取り出しはプラスミドｐＢＳＬＰＯＧ７
を基礎として図３の断片３に示すプライマーを用いて実
施例３と同様にプライマー伸長法によりＤＮＡ断片を作
製し、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで切断することによりリ
グニンパーオキシダーゼ構造遺伝子部分からなる１．７
ｋｂｐのＤＮＡ断片を得た（断片３）。

【００３１】さらに大腸菌ベクターｐＵＣ１８を制限酵
素ＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩで切断し、実施例３記載
のＤＮＡ断片（断片１）と上記ＤＮＡ断片（断片３）の
２種類のＤＮＡ断片を混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで連
結した後、大腸菌ＪＭ１０９株の形質転換を行い、アン
ピシリン耐性の形質転換株の中から断片１及び断片３の
２種類のＤＮＡ断片が同時に挿入されているプラスミド
を単離し、これをｐＧＰＨＬＧと命名した（図３）。 実施例６．リグニンパーオキシダーゼを高分泌生産する
アラゲカワラタケ形質転換体の作製 実施例５で得たｐＧＰＨＬＧを用いてアルギニン要求性
アラゲカワラタケ（ＯＪＩ−１０７８）を形質転換する
場合、選択マーカーとしてアラゲカワラタケ由来のＯＣ
Ｔ遺伝子保持するプラスミド（ｐＵＣＲ１）を同時に導
入すること（ＰＥＧ法、もしくはエレクトロポーレーシ
ョン法など）により形質転換体ｐＧＰＨＬＧ／ＯＪＩ−
１０７８を得た。ここで、形質転換に供与することがで
きるＤＮＡは環状、もしくは直鎖状にかかわらず、目的
とする形質転換体を得ることができた。以下に形質転換
条件を記す。

【００３２】約１０⁶個／１００μｌ濃度のプロトプラ
スト溶液を１００μｌに対し上記実施例５で作製したプ
ラスミド２μｇを環状、もしくは直鎖状で添加し、さら
に選択マーカーとしてｐＵＣＲ１を０．２μｇ添加し、
３０分間氷冷した。次に、等量のＰＥＧ溶液（５０％
ＰＥＧ３４００、２０ｍＭ ＭＯＰＳ（ｐＨ６．４））
を加え、３０分間氷冷した。０．５Ｍシュークロースお
よびロイシンを含む最少軟寒天培地（寒天１％）に混合
してプレートに撒いた。上記プレートを２８℃で４日間
培養を行ない、形質転換体を得た。さらに上記形質転換
株からＤＮＡを調製し、目的とするリグニンパーオキシ
ダーゼ発現プラスミドが組み込まれていることをサザン
ハイブリダイゼーションにより確認した。 実施例７．形質転換株の培養およびリグニンパーオキシ
ダーゼの活性測定 上記実施例６で得られた形質転換株（ｐＧＰＨＬＧ／Ｏ
ＪＩ−１０７８）を５００ｍｌ容の三角フラスコに５０
ｍｌのグルコースペプトン液体培地（グルコース２０ｇ
／ｌ、ペプトン５ｇ／ｌ、酵母エキス２ｇ／ｌ、ＫＨ₂
ＰＯ₄１ｇ／ｌ、ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ０．５ｇ／ｌ、り
ん酸でｐＨ４．５に調製）に５ｍｍの寒天片を５個接種
し、２８℃で６日間、振盪下で培養した（前前培養）。
その後、菌体をワーリングブレンダーで破砕し、さらに
２日間グルコースペプトン培地で２８℃で振盪培養を継
続した（前培養）。次に、菌体を集菌し、菌体を新鮮な
グルコースペプトン液体培地５０ｍｌに再懸濁し、新し
い５００ｍｌ容三角フラスコへ移し、２８℃で静置培養
を実施した。得られる培養液を遠心分離し、その上清を
得た。

【００３３】活性測定法は８ｍＭベラトリルアルコール
２５μｌ、０．５Ｍ酒石酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ３．
０）５０μｌ、酵素液４００μｌ、２．７ｍＭ過酸化水
素２５μｌを充分に混合し、反応の結果生じるベラトル
アルデヒドの３１０ｎｍの吸光度を時間を追って記録す
ることにより行い、上記培養上清中にベラトリルアルコ
ールをベラトルアルデヒドへ変換する酵素活性が静置培
養開始５日目で３００〜５００ユニット／ｍｌの範囲で
認められた。ここで酵素活性単位は１分間にベラトルア
ルデヒド１μｍｏｌ増加させる活性を１ユニットとし
た。一方、同条件下で培養した供与ＤＮＡを含まないＯ
ＪＩ−１０７８株の培養上清には本活性は認められなか
った。 実施例．８ マンガンパーオキシダーゼ発現プラスミド
の構築 担子菌アラゲカワラタケ用のＧＰＤ遺伝子のプロモータ
ーの支配下にさらされたマンガンパーオキシダーゼ発現
用プラスミドｐＧＰＭＰＧは実施例３で作製したＤＮＡ
断片１の下流にマンガンパーオキシダーゼ染色体遺伝子
（特開平７−１２３５４０；ｐＢＳＭＰＯＧ１；微工研
菌寄第１４９３３号）の構造遺伝子を連結し、発現プラ
スミドとした。

【００３４】具体的にはマンガンパーオキシダーゼの構
造遺伝子部分の取り出しはプラスミドｐＢＳＭＰＧ１を
基礎として図４の断片４に示すプライマーを用いて実施
例３と同様にプライマー伸長法によりＤＮＡ断片を作製
し、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで切断することによりマン
ガンパーオキシダーゼ構造遺伝子部分からなる２．８ｋ
ｂｐのＤＮＡ断片を得た（断片４）。

【００３５】さらに大腸菌ベクターｐＵＣ１８を制限酵
素ＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩで切断し、上記２種類の
ＤＮＡ断片を混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで連結した
後、大腸菌ＪＭ１０９株の形質転換を行い、アンピシリ
ン耐性の形質転換株の中から２種類のＤＮＡ断片が同時
に挿入されているプラスミドを単離し、これをｐＧＰＭ
ＰＧと命名した（図４）。

【００３６】実施例９．マンガンパーオキシダーゼを高
分泌生産するアラゲカワラタケ形質転換体の作製 実施例８で得たｐＧＰＭＰＧを用いてアルギニン要求性
アラゲカワラタケ（ＯＪＩ−１０７８）を形質転換する
場合、選択マーカーとしてアラゲカワラタケ由来のＯＣ
Ｔ遺伝子を保持するプラスミド（ｐＵＣＲ１）を同時に
導入すること（ＰＥＧ法、もしくはエレクトロポーレー
ション法など）により形質転換体ｐＧＰＭＰＧ／ＯＪＩ
−１０７８を得た。ここで、形質転換に供与することが
できるＤＮＡは環状、もしくは直鎖状にかかわらず、目
的とする形質転換体を得ることができた。以下に形質転
換条件を記す。

【００３７】約１０⁶ 個／１００μｌ濃度のプロトプラ
スト溶液を１００μｌに対し実施例５で作製したプラス
ミド２μｇを環状、もしくは直鎖状で添加し、さらに選
択マーカーとしてｐＵＣＲ１を０．２μｇ添加し、３０
分間氷冷した。次に、等量のＰＥＧ溶液（５０％ ＰＥ
Ｇ３４００、２０ｍＭ ＭＯＰＳ（ｐＨ６．４））を加
え、３０分間氷冷した。０．５Ｍシュークロースおよび
ロイシンを含む最小軟寒天培地（寒天１％）に混合して
プレートに撒いた。上記プレートを２８℃で４日間培養
を行い、形質転換体を得た。さらに上記形質転換株から
ＤＮＡを調製し、目的とするリグニンパーオキシダーゼ
発現プラスミドが組み込まれていることをサザンハイブ
リダイゼーションにより確認した。 実施例１０．形質転換株の培養およびマンガンパーオキ
シダーゼの活性測定 上記実施例９で得られた形質転換株（ｐＧＰＭＰＧ／Ｏ
ＪＩ−１０７８）を５００ｍｌ容の三角フラスコに５０
ｍｌのグルコース・ペプトン液体培地（グルコース２０
ｇ／ｌ、ペプトン５ｇ／ｌ、酵母エキス２ｇ／ｌ、ＫＨ
₂ ＰＯ₄ １ｇ／ｌ、ＭｇＳＯ₄ ・７Ｈ₂ Ｏ０．５ｇ／
ｌ、りん酸でｐＨ５．０に調製）に５０ｍｍ² の寒天片
を５個接種し、２８℃で６日間、振盪下で培養した（前
前培養）。その後、菌体をワーリングブレンダーで破砕
し、菌体液１０ｍｌを新鮮なグルコースペプトン培地１
０ｍｌを含む直径９ｃｍのシャーレへ植菌し、２８℃で
１０日間静置培養を行い菌体マットを形成させた。次
に、菌体を集菌し、ワーリングブレンダーにより菌体を
破砕洗浄後、新鮮な改変グルコースペプトン液体培地
（グルコース２０ｇ／ｌ、ペプトン５ｇ／ｌ、酵母エキ
ス２ｇ／ｌ、ＫＨ₂ ＰＯ₄１ｇ／ｌ、ＭｇＳＯ₄ ・７Ｈ
₂ Ｏ０．５ｇ／ｌ、０．２ｍＭ ＭｎＳＯ₄ りん酸でｐ
Ｈ５．０に調製）２０ｍｌに再懸濁し、新しい２００ｍ
ｌ容三角フラスコへ移し、２８℃で静置培養を実施し
た。得られる培養液を遠心分離し、その上清を得た。

【００３８】活性測定法は０．５Ｍマロン酸ナトリウム
緩衝液（ｐＨ５．５）５０μｌ、酵素液４４５μｌ、１
０ｍＭ過酸化水素５μｌ、１ｍＭ ＭｎＳＯ₄ １００μ
ｌを充分に混合し、反応の結果生じるＭｎ（ＩＩＩ）マ
ロン酸複合体の２７０ｎｍの吸光度増加を時間を追って
記録することにより行い、上記培養上清中にＭｎ（ＩＩ
Ｉ）マロン酸複合体を生成する酵素活性が静置培養開始
７日目で５μｍｏｌ／ｍｌ／ｍｉｎで認められた。ここ
で酵素活性単位は１分間にＭｎ（ＩＩＩ）マロン酸複合
体１μｍｏｌ増加させる活性を１ユニットとした。一
方、同条件下で培養した供与ＤＮＡを含まないＯＪＩ−
１０７８株の培養上清には本活性は認められなかった。

【００３９】

【発明の効果】本発明は、これまで遺伝子組換え技術に
よる酵素の大量生産が困難とされていたリグニンパーオ
キシダーゼ又はマンガンパーオキシダーゼを、アラゲカ
ワラタケの形質転換系において活性のある形で、さらに
高生産させるための新規なＤＮＡ断片を提供するもので
ある。

【００４０】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：９２２ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic DNA 起源 生物名：アラゲカワラタケ（Ｃｏｒｉｏｌｕｓ ｈｉｒ
ｓｕｔｕｓ） 株名：ＩＦＯ４９１７ 配列の特徴 860-866 TFIID site 配列： GAATTCAGAG GCGAGAGCGG ACGAGGTCGG CCGGAGAGCA AGAGTCCGTT CTGCCCTGAA 60 GTGCCCCCCT GCGCATGGCG ACTTGGGACT AGTTTAGCTC AGCGTCGCGG CTCGCCCATA 120 GCAAACGCTG AGGTAGAACA TGACGTTGCA TGCCGGCTTG AACTCAAACA CTCGCCATCC 180 ACAGCCTGCG CGGAGCTTGT GGATTGCGTC TGCATTAGAG AGCAGAGGGC GTCGTACATG 240 TCAGAGCGCG AGTCTGACAA ATGTCTGACA GAGCGGCGGA GGCGCCGTGC GAGCGGCGGG 300 AGAGGAGAAG GACCGCGGTG TGATTGGCTG GGGAGACGCG TCGTGGCGCG TCCTGCCCAG 360 ACCGCGACGT CGGAGAAGAG ACGAGGACGG GCGAGAAGGG CGAGCAGCCG TATGTCCGCC 420 GCGCCAGAGC GCTATCGATT GATGGTCGTC ACACCCGCGG CGAGGCAGTG TTCTCTCGCG 480 CAGAGTCGCT GGGCTGACTG AGAGTGTGCA GCGACTGGGC AGATCGTACG TGCGGGGTCG 540 GACGCGGCGA ACGGCACGGA CGAAGGCGAC CGATCCGCGC GATGAGCAAA TGTCGGACGA 600 GTCATTGCCT CACGCACGTT CGATCGCGCA CAACTTGCAT CCCCAGCAGC TGGCACTGTG 660 GGCAGCTCAC TCGGGCTGGT CGTCGACGTC GGGAAAGCGA GTCCGTCTGG ACGTCGAACG 720 TGAGCGTCGT CGGAACGGAG GAAGGAGGAC GAGCGGGGAC CCGGCACGGA CAGACGGACG 780 GAGGGGCGCT TGAGGGGGAG GGAGGACAGG CGCCTGTGCG GGTCGCGTCC GATCCATCTC 840 AGATAAGAAT CGGACTGGCT ATATAACGCA CCACCCGCGC CCCTCCCAGT CCCCATCCTC 900 TCATCCCCAT CCACCACACA TC 922

【００４１】配列番号：２ 配列の長さ：８５０ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic DNA 起源 生物名：アラゲカワラタケ（Ｃｏｒｉｏｌｕｓ ｈｉｒ
ｓｕｔｕｓ） 株名：ＩＦＯ４９１７ 配列の特徴 1-850 P CDS 7-63 intron 87-153 intron 159-216 intron 287-350 intron 567-630 intron 749-813 intron 配列： ATGTCGGTCA GTACCCTGCA GCCTCCAGCA CCCCCTTACT CGTGCTGACC GTCCCTACAG 60 CAGCAAGTCA ACGTCGGAAT CAACGGGTAA GTACCATCGC GCGCCTTCCT CTGCGCCGCC 120 CCTAATCTAA TCCAATCCGC GCGTCCCCTT CAGTTTCGGT GAGCCTCCAT TCCCTCCATC 180 GCACCCCGAC GCGCGCATAT ACTCATCCTT TTCAAGGTCG TATCGGCCGT ATCGTCCTCC 240 GGAATGCCCT CCAGCACGGC AAGATCAACG TCGTTGCTGT GAACGAGTGA GCGTGGACTC 300 CCGCCTCGGA TCGACCAATC AACCGGACTC TAACGACATA TGCTATCCAG CCCCTTCATC 360 GACCTTGAGT ACATGGTCTA CATGTTCAAG TACGACTCCG TCCACGGCCG CTTCAAGGGC 420 CACGTCGAGG CCAAGGACGG CAAGCTCTGG GTCGAGGGCA AGCCCATCTC CGTCTTCCAG 480 GAGAAGGACC CCGCCAACAT CCCCTGGGGC TCCGTGGGTG CCGACTACAT CGTCGAGTCC 540 ACCGGTGTCT TCACTACCAC TGAAAAGTGC GCATACACCC TGACTACTGT CGTGCAGAAC 600 CGTGAGACTG ACACGGTACT CGATTGATAG GGCCTCTGCC CACTTGAAGG GCGGTGCCAA 660 GAAGGTCATC ATCTCCGCAC CCTCCGCCGA CGCGCCCATG TTCGTCGTCG TGGTTAACCT 720 CGAGTCCTAC GACCCCAAGT ACACTGTCGT ACGTAAATTT GCTCATCCGC TTTCGAGACT 780 CCCGATTTAC CTCCGCATTC GCTACTCGCG TAGATCTCGA ACGCGTCCTG CACGACCAAC 840 TGCTTGGCTC 850

【００４２】配列番号：３ 配列の長さ：１６０ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 起源 生物名：アラゲカワラタケ（Ｃｏｒｉｏｌｕｓ ｈｉｒ
ｓｕｔｕｓ） 株名：ＩＦＯ４９１７ 配列の特徴 1-160 P mat peptide 配列： MetSerGlnValAsnValGlyIleAsnGly PheGlyArgIleGlyArgIleVanLeuArg 20 AsnAlaLeuGlnHisGlyLysIleAsnVal ValAlaValAsnAspProPheIleAspLeu 40 GluTyrMetValTyrMetPheLysTyrAsp SerValHisGlyArgPheLysGlyHisVal 60 GluAlaLysAspGlyLysLeuTrpValGlu GlyLysProIleSerValPheGlnGluLys 80 AspProAlaAsnIleProTrpGlySerVal GlyAlaAspTyrIleValGluSerThrGly 100 ValPheThrThrThrGluLysAlaSerAla HisLeuLysGlyGlyAlaLysLysValIle 120 IleSerAlaProSerAlaAspAlaProMet PheValValValValAsnLeuGluSerTyr 140 AspProLysTyrThrValIleSerAsnAla SerCysThrThrAsnCysLeuAlaProLeu 160

【図面の簡単な説明】

【図１】図１はアラゲカワラタケのグリセルアルデヒド
−３−りん酸脱水素酵素遺伝子の染色体上の制限酵素地
図である。

【図２】図２は実施例３に示したアルギニン要求性アラ
ゲカワラタケ変異株へのために使用されるプラスミドｐ
ＧＰＲＧの構築図である。

【図３】図３は実施例５に示したリグニンパーオキシダ
ーゼ発現プラスミドｐＧＰＨＬＧの構築図である。

【図４】図４は実施例８に示したマンガンパーオキシダ
ーゼ発現プラスミドｐＧＰＭＰＧの構築図である。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:645） (Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｒ 1:645） (Ｃ１２Ｎ 9/08 Ｃ１２Ｒ 1:645）

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 目的遺伝子の発現を制御するコリオラス
   属アラゲカワラタケ由来のプロモーターＤＮＡ配列を含
   んでなるＤＮＡ断片。
2. 【請求項２】 プロモーターＤＮＡが実質的に配列番号
   １の塩基配列である請求項１記載のＤＮＡ断片。
3. 【請求項３】 目的遺伝子がリグニンパーオキシダーゼ
   遺伝子又はマンガンパーオキシダーゼ遺伝子である、請
   求項１記載のＤＮＡ断片。
4. 【請求項４】 請求項１または２記載のＤＮＡ断片及び
   外来遺伝子を含む組み換え体ベクター。
5. 【請求項５】 目的遺伝子がリグニンパーオキシダーゼ
   遺伝子又はマンガンパーオキシダーゼ遺伝子である、請
   求項４記載の組み換え体ベクター。
6. 【請求項６】 請求項４または５記載の組み換え体ベク
   ターによって形質転換された担子菌アラゲカワラタケ形
   質転換体。
7. 【請求項７】 請求項５記載のコリオラス属担子菌形質
   転換体を培養し、その培養物からリグニンパーオキシダ
   ーゼ又はマンガンパーオキシダーゼを採取することを特
   徴とするリグニンパーオキシダーゼ又はマンガンパーオ
   キシダーゼの製造方法。