JPH05292975A - 担子菌の自律複製配列およびその利用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 自律複製機能を持ち、かつ担子菌の形質転換
効率を上げる機能を持つＤＮＡ断片を提供する。 【構成】 白色腐朽菌アラゲカワラタケの染色体ライブ
ラリーより酵母内で自律複製機能を持つＤＮＡ断片をク
ローニングし、その塩基配列を決定した。本ＤＮＡ断片
は担子菌の形質転換効率を上げる機能をも合わせ持って
いた。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、自律複製機能または形
質転換効率を上げる機能を有する新規なＤＮＡ断片また
はこれらの機能を有するＤＮＡ断片を組換えて得られる
新規なプラスミド、および上記のＤＮＡ断片またはプラ
スミドを宿主に導入することを特徴とする宿主の形質転
換法ならびに新規な形質転換体生物に関するものであ
る。

【０００２】更に詳しくは、フェノールオキシダーゼ、
リグニンパーオキシダーゼ、マンガンパーオキシダーゼ
等の酵素の分泌生産能に優れ、リグニン分解力の強力な
担子菌〔特に白色腐朽菌、例えばアラゲカワラタケ（Co
riolus hirsutus IFO 4917）など〕由来の自律複製機能
または形質転換効率を上げる機能を有するＤＮＡ断片ま
たはプラスミド、およびこれらのＤＮＡ断片またはプラ
スミドを利用した形質転換法ならびに形質転換体生物に
関するものである。

【０００３】

【従来の技術】今日までに遺伝子組換え技術を利用して
有用な蛋白質を大量に製造しようとする試みは、数多く
行なわれてきた。有用な蛋白質を大量に製造するための
遺伝子組換え技術は、基本的に宿主とベクターと有用蛋
白質をコードしている遺伝子から構成される。宿主とし
ては、大腸菌、枯草菌などの原核生物や酵母、動物細
胞、植物細胞などの真核生物など様々な宿主が用いられ
ており、発現させる蛋白質の性質やその用途に応じて適
切な宿主が選択されている。

【０００４】また、同時に用いられているベクターにつ
いても現在までに膨大な数にのぼる様々なベクターが開
発されてきた。ベクターとして要求される基本的な機能
としては、 (1) 目的とする蛋白質をコードするＤＮＡと試験管内組
換え体を作ることができる。 (2) 目的とする宿主ベクター内で増殖できる能力を持
つ。 (3) 目的とする宿主細胞へ導入することができる。 (4) 組換え体ＤＮＡを持つ細胞を特異的に検出できる。 の４つであるが、有用蛋白質を大量に生産するために
は、この他に、 (5) 強力なプロモーターおよびターミネーター（発現に
関するＤＮＡ配列）を持つ。 (6) シグナル配列（分泌に関するＤＮＡ配列）を持つな
どの条件が揚げられる。

【０００５】さて、担子菌を宿主とした遺伝子組換え技
術は、まだ充分には確立されていない。担子菌類には食
用きのこ、生理活性物質を生産するきのこ、リグニンを
分解しバイオロジカルパルピングやバイオブリーチング
に用いられるきのこ、セルロースを分解し木質成分を糖
化するきのこなど有用なきのこ類が多く含まれている。
これらのきのこ類の特徴を改良強化し、育種しようとす
る試みは従来から交配による方法や変異株を取得する方
法や細胞融合法などにより行なわれてきた。もし遺伝子
組換え技術を用いる分子生物学的育種法が可能となれ
ば、容易に優良な品種が得られるようになるなどその意
義は非常に大きい。また、こうじ菌類と同様に食品とし
て安全性が認められていることから蛋白質の生産用宿主
としても利用価値が高い。

【０００６】担子菌類のベクターとしては、シイタケ、
ヒラタケのミトコンドリア内の線状プラスミドＤＮＡを
利用したもの（遺伝42巻、９号、p.20、掌華房；1988）
が、報告されているが宿主内での安定性に問題があるな
どまだ実用的でないことが知られている。担子菌の形質
転換法について最初に報告されたのは、スエヒロタケ
（Schizophyllum commune ）のトリプトファン要求性株
とＴＲＰ１遺伝子を利用したものである（Munoz -Rivas
, A., Specht , C.A ., Drummond,B .J., Froeliger,E
.,Novotny , C.P .and Ullrich , R.C .(1986) Mol. G
en.Gent., 205, 103-106）。その後、同様の方法で遺伝
学的に最も研究が進んでいるネナガノヒトヨタケ（Copr
inus cinereus ）についても報告された（D .M .Binnin
ger ,C .Skrzynia, P.J. Pukkila and L. A. Casselto
n, (1987) EMB O J. , 6, 835-840 ）。

【０００７】子実体を形成しない半担子菌に属し、トウ
モロコシに黒穂病をおこすUstilagomaydis において
は、形質転換体内でフリーのプラスミドとして存在でき
るようなＡＲＳが得られたと報告（T. Tsukuda, S. Car
leton, S. Fortheringham andW. K. Holloman, (1988)
Mol. Cell. Biol. , 8, 3703 ）されている。しかし、
本ＡＲＳは酵母内ではＡＲＳとして機能せず、汎用性が
なく、さらにUstilago maydis が種子植物に寄生して黒
穂病をおこす病原菌であることから安全性の面から蛋白
質製造のための有用な宿主にはなり得ない。

【０００８】日本では輸入有害菌にあたる白色腐朽菌
(Phanerochaete chrysosporium)については、Ｇ４１８
薬剤感受性株とカナマイシン耐性遺伝子を利用した形質
転換法（Randall, T. A. , T. R. Rao and C. A. Redd
y, (1989) Biochem. Biophys. Res. Commun. 161, 720-
725）やアデニン要求性株と Schizophyllum Commune由
来のＡＤＥ２遺伝子またはＡＤＥ５遺伝子を利用した遺
伝子組込み型の形質転換法（Alic, M. , E. K. Clark,
J. R. Kornegay and M. H. Gold, (1990) Curr. Genet.
17, 305-311, Alic, M. , J. R. Kornegay, D. Pribno
w and M. H. Gold,(1989) Appl. Environ. Microbiol.
, 55, 406-411）や P. chrysosporium 由来の自律複製
機能を持つＤＮＡ断片を利用した形質転換法が報告（ T
homas Randall, C. A. Reddy and K. Boominathan, (19
91) J. Bacteriol. , 173, 776-782）されている。 P.
chrysosporium のリグニン分解能には優れたものがある
が蛋白質製造のための宿主としては性能の良いプロモー
ター等の開発が遅れていること、日本では輸入有害菌に
指定されていることなどの問題がある。

【０００９】国産の白色腐朽菌アラゲカワラタケはリグ
ニン分解力に優れ、フェノールオキシダーゼやリグニン
パーオキシダーゼやマンガンパーオキシダーゼなどの酵
素の分泌生産能力に優れている。アラゲカワラタケは、
アルギニン要求性株とアラゲカワラタケ由来のオルニチ
ンカルバモイルトランスフェラーゼ遺伝子（ＯＣＴ遺伝
子）を利用した形質転換法も本発明者らのグループによ
って開発されている（特願平４−５０５１３）。さら
に、アラゲカワラタケは液体培養することによりフェノ
ールオキシダーゼを構成的に大量に分泌生産するが、こ
のフェノールオキシダーゼの染色体遺伝子も既に本発明
者らによってクローニングされており、その大量発現と
分泌に関わるＤＮＡ（プロモーター、シグナル配列およ
びターミネーター）についてもクローン化している（Y.
Kojima, Y. Tsukuda, Y. Kawai, A. Tsukamoto, J. Su
giura, M. Sakaino and Y. Kita, (1990) J. Biol. Che
m. ,265, 15224-15230, 特開平3-15392 ）。

【００１０】すなわち、アラゲカワラタケは強力なプロ
モーターがクローニングされており、かつ栄養要求性株
を利用した安全な形質転換法が可能な蛋白質製造に適し
た白色腐朽菌ということができる。同じ Coriolus 属の
カワラタケについては、Ｇ４１８感受性とカナマイシン
耐性株を利用した形質転換法（ N. Morohoshi and Y. K
atayama et al, (1991) 第４１回日本木材学会大会研究
発表要旨）が報告されている。

【００１１】

【発明が解決しようとする課題】遺伝子組換え技術を利
用した分子生物学的育種法や有用蛋白質の製造法は急速
に発達し、その有用性も認められている。担子菌につい
ても同様であるが大腸菌や酵母等に比べ、形質転換効率
が低いという問題点を持っている。現在、この形質転換
効率が低いという問題点が研究開発速度を低下させ、育
種や有用蛋白質を製造することに支障を来たしている。

【００１２】したがって、担子菌を宿主として遺伝子組
換え技術を利用する場合に、その形質転換効率を改良す
る方法が望まれていた。また、同時にシャトルベクター
は研究開発速度を揚げるために有効であるが、このシャ
トルベクターを作成するために必要な自律複製機能を持
つＤＮＡ断片も望まれていた。

【００１３】

【課題を解決するための手段】そこで本発明者らは鋭意
探索および研究を行なった結果、本要望に答え得る発明
を完成した。すなわち、白色腐朽菌アラゲカワラタケの
染色体ＤＮＡライブラリーから自律複製機能を有し、さ
らに形質転換効率を向上させる機能を有する新規なＤＮ
Ａ断片を開発することに成功した。

【００１４】従って本発明は、（１） 担子菌の染色体
ライブラリーから単離した自律複製機能または形質転換
効率を上げる機能を有するＤＮＡ断片を提供する。好ま
しくは、前記担子菌が白色腐朽菌アラゲカワラタケ（Co
riolus hirsutus)であることを特徴とする記載のＤＮＡ
断片であり、例えば配列番号１の配列の全部または一部
を含むことを特徴とする自律複製機能または形質転換効
率を上げる機能を有するＤＮＡ断片である。

【００１５】本発明はさらに、上記記載のＤＮＡ断片を
組換えて得られる新規なプラスミドを提供する。本発明
はまた、上記のＤＮＡ断片、または上記の新規なプラス
ミドを宿主に導入することを特徴とする宿主の形質転換
法を提供し、さらにこの形質転換法によって得られる新
規な生物をも提供する。本発明者らは、担子菌を宿主と
した形質転換法において、その効率を改良する方法につ
いて鋭意探索および研究を行なった結果、自律複製機能
を有し、かつ形質転換効率を上げる機能を有するＤＮＡ
断片を得ることが肝要であると考えた。

【００１６】さらに最も効果的なＤＮＡ断片は使用する
宿主の染色体ライブラリー由来のＤＮＡ断片がよいと考
えた。すなわち、担子菌の中でも強力なプロモーターが
クローニングされており、栄養要求性を利用した安全な
形質転換法が可能で、かつ酵素等の大量分泌能を有する
蛋白質製造に適した担子菌であり、リグニン分解力も優
れている白色腐朽菌アラゲカワラタケの染色体由来のＤ
ＮＡ断片が有効であると考えた。

【００１７】また、その自律複製機能を利用してシャト
ルベクターを作成することを考慮すると、酵母等の細胞
内で自律複製する機能を有するＤＮＡ断片（ＡＲＳ）と
して選抜し、その中から形質転換効率を同時に有するも
のを選抜する方法が最適である。以下、本発明を詳細に
説明する。

【００１８】ベクター 担子菌（特に白色腐朽菌アラゲカワラタケ）由来の自律
複製機能を有し、形質転換効率を上げる機能を有するＤ
ＮＡ断片を得るために必要な染色体ＤＮＡライブラリー
を構築するには、ベクターが必要である。このためのベ
クターとしては、パン酵母の染色体組み込み型のプラス
ミド（ＹＩｐ１、ＹＩｐ５、ＹＩｐ２５、ＹＩｐ３２、
ＹＩｐ３３等）が使用できる。

【００１９】しかし、これらのプラスミドを利用してＡ
ＲＳクローニングを行うとマーカー遺伝子の相同性組換
えによるバックグランドが出ると報告されている。目的
のＤＮＡ断片を得るためには、このバックグランドがな
いほうが望ましい。相同性組換えによるバックグランド
を避ける方法としては、パン酵母の染色体と相同性の低
いマーカー遺伝子を用いることが考えられる。すなわ
ち、パン酵母ではなくて他の生物種由来のマーカーがよ
い。

【００２０】具体的には糸状菌や分裂酵母のマーカー遺
伝子がよい。図１に分裂酵母のマーカー遺伝子ＬＥＵ１
を利用したベクターｐＹＫ４１の作製方法を示す。染色体ＤＮＡの調製 本発明に使用するＤＮＡ断片はどの生物種由来のもので
あってもよいが、その目的が担子菌の形質転換効率を高
めることであるから担子菌の染色体ＤＮＡをその起源に
する方が望ましい。さらに、担子菌の中でも種が異なれ
ばその効果が異なることが予想されるので、最終的に宿
主とする生物由来のＤＮＡ断片が良いと思われる。すな
わち、蛋白質製造に適した白色腐朽菌、特にアラゲカワ
ラタケの染色体由来のＤＮＡ断片が望ましい。

【００２１】白色腐朽菌を生育繁殖させる培地の組成
は、主炭素源としてグルコースを使用するが、白色腐朽
菌が資化可能な他の炭素源を使用してもよく、主窒素源
としては酵母エキス、ポリペプトンを使用するが、白色
腐朽菌が資化可能なアンモニウム塩、硝酸塩などの無機
窒素化合物、尿素、カゼインなどの有機窒素化合物も使
用することができる。その他、カルシウム塩、マグネシ
ウム塩、カリウム塩、りん酸塩、マンガン塩、亜鉛塩、
鉄塩などの無機塩やコーンスティープリカー、ビタミン
類、アミノ酸類、核酸類などの栄養物質、成長促進物質
を添加することも可能である。

【００２２】前記の培地に白色腐朽菌を接種し、培養す
る。培養後、集菌し、液体窒素中で凍結し、乳鉢中で破
砕後、フェノール抽出法により染色体ＤＮＡを抽出、精
製し、染色体ＤＮＡを得る。染色体ＤＮＡのフェノール
抽出の前に予めプロティナーゼ処理を行うと効率よく染
色体ＤＮＡを抽出することができる。染色体ＤＮＡライブラリーの構築 染色体ＤＮＡライブラリーは前記のベクターを使用すれ
ば良い。特に、相同性組換えによるバックグランドの低
いベクター（ｐＹＫ４１等）が適していると考えられ、
ここではこれを用いて説明する。

【００２３】前記の染色体ＤＮＡを制限酵素 Sau3AI
〔宝酒造（株）製、1082A 〕で部分分解し、２〜１０Ｋ
ｂの大きさの染色体ＤＮＡ断片を得る。一方、プラスミ
ドベクターｐＹＫ４１を制限酵素 BamHI〔宝酒造（株）
製、1010S 〕で完全分解し、脱リン酸化処理し、上記の
部分分解した染色体ＤＮＡ断片を加え、Ｔ４ＤＮＡリガ
ーゼ〔宝酒造（株）製〕によってＤＮＡ鎖の結合反応を
行う。

【００２４】得られた結合反応物を適当な大腸菌（カラ
ーセレクションが可能な大腸菌が望ましい）に形質転換
し、組換え体プラスミドを持つ大腸菌を１万個以上得
る。各大腸菌からアルカリ抽出法により組換え体プラス
ミドを抽出し、染色体ライブラリーとする。この時、30
0〜500個の組換え体大腸菌を１本の培地で増殖させ、ま
とめて組換え体プラスミドを抽出すると操作が簡便とな
る。

【００２５】酵母内で自律複製機能を有するＤＮＡ断片の選抜 酵母内で自律複製機能を有するＤＮＡ断片を選抜する方
法は、酵母のＡＲＳクローニングと同様の方法（ K. St
ruhl et al.,(1979) Proc. Natl. Acad. U.S.A. , 76,
1035）で行なえば良い。すなわち、染色体ＤＮＡライブ
ラリーで酵母を形質転換し、栄養要求性が相補された酵
母からプラスミドを抽出し、組込まれたＤＮＡ断片を回
収すれば良い。回収したＤＮＡ断片の解析は全て遺伝子
操作の慣用技術により行なえる。

【００２６】酵母は適当な栄養要求性が付与されていれ
ばどのような種を使用してもよく、酵母の形質転換法
は、酵母のプロトプラストとＰＥＧを利用した方法、プ
ロトプラストとＤＮＡを封入したリポソームの融合によ
る方法、電気パルスによる方法、タングステン粒子にＤ
ＮＡをコーティングし、高速度で酵母に射出するBiolis
tic 法、アルカリ１価カチオン処理した酵母を使用する
ＫＵ法等が報告されており、どの方法で行なっても良い
が、簡便なリチウムを使ったＫＵ法が最も良い。

【００２７】形質転換効率への影響 クローン化したＤＮＡ断片による形質転換効率への影響
については、既存の形質転換系を利用すればよく、本Ｄ
ＮＡ断片を付加した場合としない場合の形質転換効率を
比較すれば良い。形質転換する宿主には何を使用しても
問題はないが、形質転換効率の低い生物に応用する方が
効果的であることから、担子菌を宿主とした形質転換系
を利用する方が望ましい。

【００２８】以上の遺伝子操作は全て慣用技術（例え
ば、Maniatis et al.,(1982) Molecular Cloninng ； A
Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory
参照）により行うことができる。

【００２９】

【実施例】以下、実施例により本発明をさらに詳細に説
明する。実施例１ ．ベクターの作製 酵母用選択マーカーには、分裂酵母由来のＬＥＵ１遺伝
子（Y.Kikuchi et al.,(1988) Curr.Genet.,14,375-37
9）を使用した。分裂酵母由来のＬＥＵ１遺伝子は宿主
に用いるパン酵母染色体と相同性がなく形質転換時に相
同性組換え等によるバックグランドがほとんどないとい
う利点を持つ。このＬＥＵ１遺伝子の必要部分である D
raI 断片をプラスミドｐＵＣ１９の EcoO109制限酵素切
断部位に連結し、クローニングベクターｐＹＫ４１（約
4.1Kb ）を作製した（図１参照）。

【００３０】ｐＹＫ４１は、(1) 多コピー（プラスミド
ｐＵＣ１９のori ）で調製が容易、(2) バックグランド
が低い、(3) 遺伝子組換え体のカラーセレクションがで
きる、(4) サイズが小さいため（4.1Kb ）比較的大きな
ＤＮＡを組込むことができる、(5) サイズが小さいため
取り扱いが容易、などの特徴を持っている。

【００３１】実施例２．染色体ＤＮＡの調製 アラゲカワラタケ（IFO4917 ）を１ＬのＹＰＤ培地（酵
母エキス１０ｇ／ｌ、ポリペプトン２０ｇ／ｌ、グルコ
ース２０ｇ／ｌ）が入った５Ｌ容三角フラスコに植菌
し、２７℃、７日間培養した。培養後、集菌し、液体窒
素中で凍結させた結果、約２０ｇの凍結菌体を得た。

【００３２】１０ｇの凍結菌体を液体窒素下で乳鉢を用
いて約１５分間破砕した。あらかじめ４２℃に保温した
緩衝液（0.1M NaCl 、0.1M Tris-HCl 、0.1M EDTA 、pH
8）１０ｍｌにプロテアーゼＫ（最終濃度、100 μg/ml
ベーリンガー・マンハイム山之内 161519）を加え、
その中に５ｇの破砕菌体を入れ穏やかに攪拌しながら２
時間反応させた。等量のＴＥ（10mM Tris-HCl、1mM EDT
A、pH 8 ）飽和フェノールで染色体ＤＮＡを抽出後、エ
タノール沈澱を行い、再び５ｍｌのＴＥに溶かし、３７
℃、３０分間 RNaseA〔最終濃度 100μl、宝酒造（株）
製〕処理し、ＲＮＡを除いた。ＣｓＣｌを用いた平衡密
度勾配遠心分離（ベックマン、Vti80ローター、１５
℃、５０Krpm、１６時間）を行い、精製した染色体ＤＮ
Ａを１．５ｍｇ得た。

【００３３】実施例３ ．染色体ＤＮＡライブラリーの構築 上記の精製した染色体ＤＮＡ５０μｇに４塩基認識の制
限酵素 Sau3AI を加え、３７℃で部分分解し、２〜１０
ｋｂの大きさのＤＮＡ画分を回収した。回収方法は、ア
ガロースゲル電気泳動法でＤＮＡ分解物を分画後、２〜
１０ｋｂのＤＮＡ画分をＤＥＡＥメンブランＮＡ−４５
に吸着させ、回収する方法を用いた。回収後、２〜１０
ｋｂのＤＮＡ断片を１０μｇ得た。

【００３４】クローニングベクターｐＹＫ４１（約１０
μｇ）を制限酵素 BamHIで完全分解後、脱リン酸処理
し、供与ベクターとした。２〜１０ｋｂのＤＮＡ断片と
この供与ベクターをライゲーションし、大腸菌ＸＬ１−
blue（ W. O. Bullock et al., (1987) Bio. Technique
s, 5, 376-378）に形質転換し、 X-gal、IPTG、アンヒ゜シリン
入りのＬ培地に撒くことにより、白色のコロニーとな
った組換え体大腸菌を１２０００個得た。

【００３５】１２０００個の組換え体大腸菌を３００個
づつ４０組に分けた。組換え体大腸菌を１組ごと１００
ｍｌの アンヒ゜シリン入りＬ培地で１晩培養することによりプ
ラスミドを増幅させた。培養後、アルカリ抽出法により
大腸菌から全プラスミドを抽出した。４０組の増幅した
プラスミドをもって組換えプラスミドの染色体ライブラ
リーとした。この中には、３００×４０＝１２０００種
類のＤＮＡ断片が含まれていることになる。

【００３６】実施例４．酵母内で自律複製機能を有する
ＤＮＡ断片の選抜 酵母への形質転換は、リチウム処理した酵母細胞を使用
する方法（H.Ito, Y.Fukuda, K. Murata and A. Kimur
a, (1983) J. Bacteriol. , 153, 163）で行なった。宿
主には、ロイシン要求性(leu^- ) である３種類の株（NA
87−11A 、DKD−5D、SHY3）を使用した。

【００３７】組換えプラスミドの染色体ＤＮＡライブラ
リー（１組ごと、約１０μｇづつ）を用いて酵母に形質
転換した結果、４０組の中で３組の染色体ＤＮＡライブ
ラリーからロイシン要求性が相補された株を得た。これ
は自律複製機能を有するＤＮＡ断片が組込まれたプラス
ミドが酵母中での複製能力を獲得し、このプラスミドを
取り込んだ酵母がロイシン要求性を相補されることによ
り、ロイシンを含まない培地上で生育し、コロニーを形
成したものである。

【００３８】３組の染色体ＤＮＡライブラリーを酵母に
形質転換することによって得られたロイシン要求性相補
株からプラスミドＤＮＡの回収を試みたところ、１組に
ついては酵母の生育が途中で止まってしまい回収不能で
あった。残りの２組の酵母については、それぞれ常法
（F.Sherman et al.(1986)”Laboratory Course Manual
For Method in Yeast Genetics ”，Cold Spring Harbo
r Laboratory ， p127）により全ＤＮＡを抽出した。

【００３９】抽出した全ＤＮＡを再度大腸菌に形質転換
し、得られた組換え体大腸菌からアルカリ抽出法によっ
て組換え体プラスミド２種（ｐＹＫ４４、ｐＹＫ４６）
を回収した。２種のプラスミドに組込まれていたＤＮＡ
断片は約２．１ｋｂと約１．９ｋｂと大きさは少し異な
るがその制限酵素物理地図は等しく、アラゲカワラタケ
の染色体サザンハイブリダイゼーションでも同じ場所に
ハイブリダイズすることから染色体上の同一部分と判断
した。ｐＹＫ４４に組込まれたＤＮＡ断片の制限酵素物
理地図を第２図に示す。また、その塩基配列を配列表の
配列番号１に示す。この配列の中には、酵母のＡＲＳの
コンセンサス配列と一致する配列が１箇所、１個違いの
配列が５箇所存在した。なお、ｐＹＫ４４は、工業技術
院微生物工業研究所にＦＥＲＭ Ｐ−１２６９５の受託
番号で寄託されている。

【００４０】ｐＹＫ４４に組込まれたＤＮＡ断片を内部
の３箇所の HindIII部位とベクター上の HindIII部位で
切断し、３つのＤＮＡ断片に分けた。それぞれをｐＹＫ
４１の HindIII部位にサブクローニングし、酵母へ形質
転換した結果、全てのプラスミドで形質転換体酵母（ロ
イシン要求性相補株）を得ることができた。このことか
ら、自律複製機能はｐＹＫ４４に組込まれたＤＮＡ断片
全てを必要とするのではなく、１部でも可能であること
が証明された。

【００４１】実施例５．形質転換効率への影響 クローン化したＤＮＡ断片による担子菌の形質転換効率
への影響については、本発明者グループが既に開発した
アラゲカワラタケの形質転換系（特願平４−５０５１
３）を用いて試験した。本形質転換系は、アルギニン要
求性株を宿主とし、アルギニン要求性相補遺伝子（ＯＣ
Ｔ遺伝子；オルニチンカルハ゛モイルトランスフェラーセ゛遺伝子）をマーカー
として、種々の遺伝子をプロトプラスト−ＰＥＧ法等に
よって導入する方法である。具体的には、次の(1) 〜
(4) のステップで行なった。

【００４２】(1) 一核菌糸培養 直径６mm前後のガラスビーズを約３０個入れた５００ｍ
ｌ容の三角フラスコにＳＭＹ培地（シュークロース１
％、麦芽エキス１％、酵母エキス０．４％）１００ｍｌ
を分注し、滅菌する。アルギニン要求性株であるアラゲ
カワラタケOJI-1078（Coriolus hirsutus 、微工研受託
番号 FERM P-12677 ）の平板寒天培地から直径５mmの菌
糸を含む寒天片をコルクボーラーで打ち抜き、上記ＳＭ
Ｙ培地に植菌し、２８℃、７日間静置培養した（前培
養）。ただし、菌糸が菌膜を作ったり、ペレットになら
ないように１日に１〜２回振り混ぜた。次に１Ｌ容の三
角フラスコに２００ｍｌのＳＭＹ培地と回転子を入れ、
滅菌し、本培養の培地とした。前培養菌糸をナイロンメ
ッシュ（孔径３０μｍ）で濾別し、菌糸だけを本培養培
地に植菌した。スターラーで１日２回約３０分攪拌しな
がら、２８℃で４日間培養した。

【００４３】(2) プロトプラストの調製 上記液体培養菌糸をナイロンメッシュで濾別し、１００
ｍｌの浸透圧調節溶液〔 0.5M MgSO4 、50mM マレイン
酸バッファー（pH 5.6）〕で洗浄した。次に湿菌体１０
０ｍｇあたり１ｍｌの細胞壁分解酵素に懸濁し、緩やか
に浸透しながら２８℃で３時間処理し、プロトプラスト
を遊離させた。細胞壁溶解酵素液はセルラーゼ・オノズ
カ（Cellulase ONOZUKA R-10、ヤクルト社製）５ｍｇと
ノボザイム２３４（Novozyme 234、ノボ社製）１０ｍｇ
を浸透圧調節溶液１ｍｌに溶解し作製した。

【００４４】(3) プロトプラストの精製 上記酵素反応液をナイロンメッシュで菌糸断片を除いた
後、遠心分離（１０００ｘｇ、１０分間）を行い、上清
を除去した。プロトプラストが含まれる沈澱に２ｍｌの
浸透圧調節溶液を加え、再懸濁した。２０ｍＭ、ＭＯＰ
Ｓバッファー（pH 6.3）で調製した１Ｍシュークロース
溶液４ｍｌを入れた別の遠心チューブに再懸濁したプロ
トプラスト液重層し、再度遠心分離（１０００ｘｇ、５
分）し、上部の２ｍｌを分取した。分取したプロトプラ
スト液に２倍量の１Ｍソルビトール溶液を加え、１００
０ｘｇで１０分間遠心分離を行なった。上清を除去し、
沈澱物（プロトプラスト）に３ｍｌの１Ｍソルビトール
溶液を加え、穏やかに懸濁後、再度遠心分離し、酵素類
を洗浄した。沈澱物に４０ｍＭ塩化カルシウムを加えた
１Ｍソルビトール溶液５００μｌに懸濁し、プロトプラ
スト液とした。プロトプラスト液は、４℃で数日保存可
能である。

【００４５】(4) 形質転換 １０⁷ 個／１００μｌ濃度のプロトプラスト液１００μ
ｌに対し、図３に示すプラスミド（ｐＵＣＲ１、ｐＹＫ
１４０、ｐＵＣ１８、ｐＹＫ４４）を２μｇ添加し、３
０分間氷冷した。次に液量に対し２／３のＰＥＧ〔２５
％ ＰＥＧ４０００、２０ｍＭ ＭＯＰＳ（ pH 6.4
）〕を加え、３０分間氷冷した。さらに、６０分間室
温で放置した後、０．５Ｍシュークロースを含むＭ軟寒
天培地（１％アガロース）に混合してプレートに撒き、
２８℃で数日間培養し、形質転換体を得た。形質転換効
率はこの形質転換体を計数し、μｇＤＮＡあたりで算出
した。

【００４６】この結果、ｐＵＣＲ１の形質転換効率は３
００コロニー／μｇＤＮＡであり、ｐＹＫ１４０は１０
００コロニー／μｇＤＮＡであった。したがって、クロ
ーン化したＤＮＡ断片を接続することにより、形質転換
効率が３．３倍に上昇することが証明された。また、対
象実験として用いたｐＵＣ１８やｐＹＫ４４では、形質
転換体は得られなかった。

【００４７】

【発明の効果】本発明により自律複製機能を有し、形質
転換効率を上げる機能を有するＤＮＡ断片を提供する。
本ＤＮＡは担子菌（特に白色腐朽菌アラゲカワラタケ）
で効果的に働く。本ＤＮＡが開発されたことで形質転換
効率が低い生物（特に担子菌）の形質転換効率が上昇
し、研究開発速度を上げることが可能となった。また、
研究開発速度が速まったことで育種や有用蛋白質の製造
を効律的に行なうことができるようになった。さらに、
本ＤＮＡは酵母の酵母内でも自律複製機能（ＡＲＳ活
性）を持つことから、酵母とのシャトルベクター作製も
可能となった。

【配列表】（１）配列番号：１ 配列の長さ：２０９７ 配列の型：核酸 鎖の数：２本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic DNA 起源 生物名：アラゲカワラタケ（ Coriolus hirsutus ） 株名：ＩＦＯ ４９１７ 直接の起源：ｐＹＫ４４ 配列 GATCTATATA ATCCTCCATC GCTTAACATT ATACCTATTA ATATTGAGTT AAGTTCTAAT 60 CTAGATATAT TAGGAGGTAG CGAATTGTAA TATGGATAAT TATAACTCAA TTCAAGATTA 60 GGTAAATTAG TATTAATATT ATTCATTGTA TTATTATTAT TATTCATTGT ATTGTGTATT 120 CCATTTAATC ATAATTATAA TAAGTAACAT AATAATAATA ATAAGTAACA TAACACATAA 120 CTTTAATTAA AATATGTTAG CAGTATTAAT TTACACTTCT ATGATTAAGA ATAATTTTTA 180 GAAATTAATT TTATACAATC GTCATAATTA AATGTGAAGA TACTAATTCT TATTAAAAAT 180 TATTGTGTTA TTTAAACCCA ACTCGCGTAA CCTTTTAATC GGCGAACAGC CGAACCCTTC 240 ATAACACAAT AAATTTGGGT TGAGCGCATT GGAAAATTAG CCGCTTGTCG GCTTGGGAAG 240 CAAGCTTCTA CCCCCGGAGG ATAGGTTGAG TCGACATCGA GGTGCCAATC AGCCGGGACA 300 GTTCGAAGAT GGGGGCCTCC TATCCAACTC AGCTGTAGCT CCACGGTTAG TCGGCCCTGT 300 ATGTGTACTC TCACCAGCTA TCAGCCTGTT CAATTATGTT ATCGTAAACT ATTTAAAATT 360 TACACATGAG AGTGGTCGAT AGTCGGACAA GTTAATACAA TAGCATTTGA TAAATTTTAA 360 TACTTCTTAC CTTCACAGGT AAGTTCAGAC TATGTCATCG TCTTAAAATC TATAGTTCAA 420 ATGAAGAATG GAAGTGTCCA TTCAAGTCTG ATACAGTAGC AGAATTTTAG ATATCAAGTT 420 TTATAAAGGA AATTTAGGTA ATTTATATTT CATTTCTTCT ACCAAATAAG GTTTTATTGA 480 AATATTTCCT TTAAATCCAT TAAATATAAA GTAAAGAAGA TGGTTTATTC CAAAATAACT 480 TTGATAAAAT CTGGAATAAC TAGAATCTTT AATTACAATA ATTTTTCTAT TTTTGTTTGA 540 AACTATTTTA GACCTTATTG ATCTTAGAAA TTAATGTTAT TAAAAAGATA AAAACAAACT 540 TCGCACTTCA CATAATAAAT CAAATTTACT GCTTATTTGC TCACACAATT TTTCAACTTC 600 AGCGTGAAGT GTATTATTTA GTTTAAATGA CGAATAAACG AGTGTGTTAA AAAGTTGAAG 600 TAAGTCTGTG AAACTATGAG TATTTAATAC TACACTTCTA TTCTTAGAAT TTTTATTGTA 660 ATTCAGACAC TTTGATACTC ATAAATTATG ATGTGAAGAT AAGAATCTTA AAAATAACAT 660 ATCTAATTTT CCGCCATCAT CCATAAACCA ATATGCTAAA CCCCTAGAGT TAAATGATCT 720 TAGATTAAAA GGCGGTAGTA GGTATTTGGT TATACGATTT GGGGATCTCA ATTTACTAGA 720 TGTACAAGGT TTTCACTTAT ACCTTTTTTC CCTCCTTTTT CTAATAGAAA GAGTTCAGCC 780 ACATGTTCCA AAAGTGAATA TGGAAAAAAG GGAGGAAAAA GATTATCTTT CTCAAGTCGG 780 AAATAATTAA AAGCGTTATG ACTTAAAGTT TGAAAACCCC AATTAATAAT AAGGTTACCT 840 TTTATTAATT TTCGCAATAC TGAATTTCAA ACTTTTGGGG TTAATTATTA TTCCAATGGA 840 TTAGGAGCTT AATCTTTCTT TTTTATGTGG TTGACTTAAT ACCCATTCAT CAAAAAGGTT 900 AATCCTCGAA TTAGAAAGAA AAAATACACC AACTGAATTA TGGGTAAGTA GTTTTTCCAA 900 AAAGACATGA AATACATAAG CTTTATTTTT ATCTCCTCAT TCAAACTTAA TTCTATAGGT 960 TTTCTGTACT TTATGTATTC GAAATAAAAA TAGAGGAGTA AGTTTGAATT AAGATATCCA 960 TTTACCGTTA TTATCCTCCA CGAGGTCGGC GGAGATTGGA GATTAACATC ACCTAACATT 1020 AAATGGCAAT AATAGGAGGT GCTCCAGCCG CCTCTAACCT CTAATTGTAG TGGATTGTAA 1020 AAACCTATTA TTGCTTCTTT TTGTTCTATA GATAATTCAA TTAAACTATC TTTGTATTCT 1080 TTTGGATAAT AACGAAGAAA AACAAGATAT CTATTAAGTT AATTTGATAG AAACATAAGA 1080 TTAAGTTTAG AGCTATTTGC ACCTAAACCT ATGACTTCAT TTTTTAATAT TTTTTTCATT 1140 AATTCAAATC TCGATAAACG TGGATTTGGA TACTGAAGTA AAAAATTATA AAAAAAGTAA 1140 TATACAGATT TATTTTTTTT TTTAATTTAA AATATGTTAG CAGCAGATTT ATTATATTTT 1200 ATATGTCTAA ATAAAAAAAA AAATTAAATT TTATACAATC GTCGTCTAAA TAATATAAAA 1200 ATTTTTATTT ACAATGAACG TTTAAATGAA TTTAATTTTA AGACGCCGGG CGCTCGTGGA 1260 TAAAAATAAA TGTTACTTGC AAATTTACTT AAATTAAAAT TCTGCGGCCC GCGAGCACCT 1260 AAGGTTATTG TATACACTAC TCACTTTCTA GTCGTTGAAC GTTCTTACTC CGATAATTGT 1320 TTCCAATAAC ATATGTGATG AGTGAAAGAT CAGCAACTTG CAAGAATGAG GCTATTAACA 1320 GTAGAAGTAA GCTTCGCTGC AAATTTACTT TTTTAATAAA AGTGGTCTTT GCAATTCACC 1380 CATCTTCATT CGAAGCGACG TTTAAATGAA AAAATTATTT TCACCAGAAA CGTTAAGTGG 1380 CAGTTTATTA CTTCTATTTT CCAATAGAAG AGGACAACTA TTTTATCCCT AGCGTAACTT 1440 GTCAAATAAT GAAGATAAAA GGTTATCTTC TCCTGTTGAT AAAATAGGGA TCGCATTGAA 1440 TTATCGATTG ATCCCCGTCT ATTCCATATT ATAGCGAAGG GTCACTATGC CCTACTTACG 1500 AATAGCTAAC TAGGGGCAGA TAAGGTATAA TATCGCTTCC CAGTGATACG GGATGAATGC 1500 TATCTGTGCG ACTTCTAAGT CTTTCAGTTA GGCATGCTTT CCGCCATTAC GCCGATTACA 1560 ATAGACACGC TGAAGATTCA GAAAGTCAAT CCGTACGAAA GGCGGTAATG CGGCTAATGT 1560 ACCTTTCTCA TTGGTTGATT GATTTCCATT CAATTATCTA GCTCTACCTT ATGTTATTAA 1620 TGGAAAGAGT AACCAACTAA CTAAAGGTAA GTTAATAGAT CGAGATGGAA TACAATAATT 1620 AAAATATAAA TAACTTTTTT TTACAATTAT TACTTATATT TATACATAGT TTTTACTTTT 1680 TTTTATATTT ATTGAAAAAA AATGTTAATA ATGAATATAA ATATGTATCA AAAATGAAAA 1680 ACTATGATTT ATATTCTCTG ATAAGCCAAG AGGCTTAAAG AGTAAATAAA GAAATATCTT 1740 TGATACTAAA TATAAGAGAC TATTCGGTTC TCCGAATTTC TCATTTATTT CTTTATAGAA 1740 TGGATGTACT TTGCTACTTT ATCAAAGACG ACCGCCCCAG TCAAACTGCC AATTAGCCAC 1800 ACCTACATGA AACGATGAAA TAGTTTCTGC TGGCGGGGTC AGTTTGACGG TTAATCGGTG 1800 CTATCCCTTA AATTTTTTTA TAATTACAAG GTAAATATTA ACCCAACCAA AGTCAGAAGG 1860 GATAGGGAAT TTAAAAAAAT ATTAATGTTC CATTTATAAT TGGGTTGGTT TCAGTCTTCC 1860 TATTCCATCT TTCGTCTATC GACATCCCTA ATTCCTATTA ACTAAGGTTG TTGTAGATCA 1920 ATAAGGTAGA AAGCAGATAG CTGTAGGGAT TAAGGATAAT TGATTCCAAC AACATCTAGT 1920 ATATGATAGC TAACTACAGT AAAGCTGCAT AGGGTCTTCC CGTCCACCTG GAGGCAACCC 1980 TATACTATCG ATTGATGTCA TTTCGACGTA TCCCAGAAGG GCAGGTGGAC CTCCGTTGGG 1980 GCATCTGCAC GGGTAATTCA ATTTCACTGA GCAAGTTGTA GAGACAGTGA GACCATCGTT 2040 CGTAGACGTG CCCATTAAGT TAAAGTGACT CGTTCAACAT CTCTGTCACT CTGGTAGCAA 2040 ACACTATTGA TACCAGACCA CATTTAATGG CCAATTTATT TTGCTACCTT TGGATCC 2097 TGTGATAACT ATGGTCTGGT GTAAATTACC GGTTAAATAA AACGATGGAA ACCTAGG 2097

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、分裂酵母のマーカー遺伝子ＬＥＵ１を
利用したクローニングベクターｐＹＫ４１の構築方法を
示す。

【図２】図２は、ｐＹＫ４４に組込まれた自律複製機能
と形質転換効率を上げる機能を有するＤＮＡ断片の制限
酵素物理地図を示す。

【図３】図３は、実施例５で使用した各種プラスミドを
示す。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 15/80 //(Ｃ１２Ｎ 15/31 Ｃ１２Ｒ 1:645） (Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｒ 1:645） (Ｃ１２Ｎ 15/53 Ｃ１２Ｒ 1:645）

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 担子菌の染色体ライブラリーから単離し
   た自律複製機能または形質転換効率を上げる機能を有す
   るＤＮＡ断片。
2. 【請求項２】 担子菌が白色腐朽菌アラゲカワラタケ(C
   oriolus hirsutus)であることを特徴とする請求項１記
   載のＤＮＡ断片。
3. 【請求項３】 配列番号１の配列の全部または１部を含
   むことを特徴とする自律複製機能または形質転換効率を
   上げる機能を有するＤＮＡ断片。
4. 【請求項４】 請求項１〜３のいずれか１項に記載のＤ
   ＮＡ断片を組換えて得られる新規なプラスミド。
5. 【請求項５】 請求項１〜３のいずれか１項に記載のＤ
   ＮＡ断片、または請求項４記載のプラスミドを宿主に導
   入することを特徴とする宿主の形質転換法。
6. 【請求項６】 請求項５記載の形質転換法によって得ら
   れる新規な生物。