JPS63273480A - 新規な発現系 - Google Patents

新規な発現系

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JPS63273480A
JPS63273480A JP63022134A JP2213488A JPS63273480A JP S63273480 A JPS63273480 A JP S63273480A JP 63022134 A JP63022134 A JP 63022134A JP 2213488 A JP2213488 A JP 2213488A JP S63273480 A JPS63273480 A JP S63273480A
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recombinant dna
dna molecule
dna
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pli
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は遺伝子工学の分野に関し、そしてアスペルギル
ス・ニガー−仏扛肛紅■胆　紅■旦のペクチンリアーゼ
（ｐｅｃｔｉｎ　　１ｙａｓｅ）　　Ｉ　　（ＰＬ　Ｉ
　）をコードするＤＮＡ配列及び／又はそのプロモータ
ー、シグナル配列もしくはターミネータ−を含んで成る
新規なりＮＡ分子を提供するものである。この新規なり
ＮＡ分子はアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）
におけるＰＬＩの過剰生産（ｏｖｅｒｐｒｏｄｕｃｔｉ
ｏｎ）のため、及び／又は糸状菌において外来遺伝子を
発現せしめるハイブリドベクターの造成のために有用で
ある。
（従来の技術〕 遺伝子工学技法において、原核性宿主及び真核性宿主の
ための多くのポリペプチド発現系がすでに知られている
が、これら既知の系を超える利点を有する新規な系の必
要性が常に存在する。
原核性のニジエリシャ・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
匹旦）宿主及び真核性酵母宿主、例えばサツカロミセス
・セレビシェ−（Ｓａｃｃｈａｒｏｍ　ｃｅｓ　　ｃｅ
ｒｅｖｉｓｉａｅ）が非常に広範に使用されており、こ
れらのための多数の異る発現ハイブリドベクター、主と
してプラスミド、が開発されている。Ｅ、コリ（Ｅ、　
ｃｏｌｉ）宿主の欠点は、それらが、生成されたポリペ
プチドをグリコジル化することができないこと、及び分
泌を欠（ため外来性ペプチドが宿主細胞内に蓄積し、そ
してその後の増殖を阻害することである。
酵母宿主はグリコジル化を行うが、しかしながらＥ、コ
リと同様に酵母はポリペプチドを、非常に小さいものを
除き、栄養培地中に分泌しない。酵母はべりブラズム空
間にのみ分泌する。高等真核性宿主は哺乳類の癌細胞で
あり、これらはグリコジル化することができ、そして栄
養培地に分泌することができるが、しかしながらそれら
の培養は非常にゆるやかでありそして高価であり、そし
て目的とするポリペプチドと供に、該ポリペプチドから
除去することができない発癌性核酸が単離される危険が
存在する。
他の宿主の必要のため、糸状菌、例えばニューロスポラ
・クラフサ（取肛匹Ｌ■ｃｒａｓｓａ）−、アスペルギ
ルス・ニドランス（Ａｓ　ｓｒ　１ｌｌｕｓ　　ｎ１ｄ
ｕｌａｎｓ）及びアスペルギルス・ニガーｎ鉦肛■旦旦
　旦■Ｕも研究されている。これらの真菌はすでに広く
工業的目的のために使用されているが、しかしながら遺
伝子工学技術におけるそれらの応用は、主として適当な
形質転換系を欠くために遅れている。
サツカロミセス・セレビシェ−とは異り、糸状菌は外来
遺伝子及び表現型選択の導入のために使用され得るプラ
スミドを含有しない。しかしながら、選択マーカー遺伝
子を含有する外来プラスミドにより糸状菌を形質転換す
ることは可能である。糸状菌のために今まで記載された
すべてのベクターは酵母のベクターとは異なり自律複製
せず、真菌染色体に組み込まれる。これは非常に低い頻
度においてのみ起こる。他方、有利なことには、組込み
形質転換（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ　　ｔｒａｎｓｆｏ
ｒｍａｔｉｏｎ）は形質転換体を非選択条件下において
さえ有糸分裂的に非常に安定なものとする。百コピー以
上のコピーの安定な組み込みが報告されている。
記載されている糸状菌の最初のベクターは選択マーカー
としてニューロスポラ・クラフサのｑａ−２遺伝子を含
有していた。この遺伝子は異化性デヒドロキナーゼ酵素
をコードし、そしてＮ、クラッサ藷−肛且組）のａｒｏ
変異株の機能的補完のために使用され得る（Ｃａｓｅ、
Ｍ、Ｅ、＋Ｓｃｂｗｅｉｚｅｒ＋Ｍ、＋にｕｓｈｎｅｒ
＋ｓ、Ｒ，＋　及びＧ１１ｅｓ、Ｎ、Ｈ，（Ｉ９７９）
Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ。
Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ｔｌｓＡ７６．５２５９−５２６３
）　、　ａ　ｒ　ｏ変異株は、芳香族アミノ酸の補充が
なければ最少培地で増殖することができない。ｑａ−’
ｌベクターによるＮ、クラフサの形質転換は染色体への
単一コピーのプラスミドの組込により起った。安定なａ
ｒｏ”組込み体の３０％が、細菌プラスミド配列になお
リンクしている組み込まれたｑａ−’ｌ遺伝子を保持し
た（Ｃａｓｅ、Ｍ、Ｅ（Ｉ９８２）、Ｇｅｎｅｔｉｃ　
Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇｏｆ　　Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎ
ｉｓｍｓ　　ｆｏｒ　　Ｃｈｅｍｔｃａｌｓ（■ｏｌ１
Ｍｎｄｅｒ、Ａ、　ｌＤｅＭｏｓｓ＋Ｄ、＋Ｋａｐｌａ
ｎ、Ｓ、Ｋｏｎｉｓｋｙ＋Ｊ、Ｓａｖａｇｅ＋Ｄ、及び
Ｗｏｌｆｅ、Ｒ，Ｓ、＆ｉ）　８７−１００頁、プレナ
ム〕。この観察が、非選択的ＤＮＡ配列と選択配列との
同時形質転換を確実なものとした。
性サイクルを有しそしてそれ故に古典的な遺伝的操作に
かかりやすいアスペルギルス・ニドランスにおいては、
正負両方の選択系が同定されている。Ｎ、クラフサから
の異種性ＤＮＡ又は同種性ＤＮＡを用いて、ｐｙｒＧ遺
伝子を含有するプラスミドによる形質転換によるＡ、ニ
ドランスｐｙｒＧ−変異株の機能的補完が得られた（Ｂ
ａｌｌａｎｃｅ等、ＢＢＲＣ１１２２８４１９８３；Ｔ
ｉ１ｂｕｒｎ等、Ｇｅｎｅ　２６２０５，１９８３）。
他の系において、豆匹座又はと韮座における変異が適切
なプラスミドによる形質転換により機能的に補完された
（Ｙｅｌ　ｔｏｎ等、ＰＮＡＳ８１．１４７０．１９８
４　；Ｙｅｔ　ｔｏｎ等、Ｔｉｍｂｅｒｌａｋｅ　Ｊ、
Ｃｅ１１．Ｂｉｏｃｈｅａ＋、５ｕｐｐ１．９ＣＩ？３
．１９８５；Ｊｏｈｎｓｔｏｎｅ等、ＥＭＢＯＪ、１．
１３０７．１９８３）　。
優性陽性選択系はまたＡ、ニドランスから単離されたａ
ｍｄｓ遺伝子を用いて開発された。この遺伝子はそれに
よって形質転換されたＡ、ニガーを、唯一の窒素源とし
てのアセタミド上で増殖できるようにする（Ｔｉｌｂｕ
ｒｎ等、Ｇｅｎｅ　２６．２０５．１９８３；Ｗｅｒｎ
ａｒｓ等、Ｃｕｒｒ、Ｑｅｎｅｔ、　９，３６１．１９
８５；）［ｅｌｌｙ。
Ｊ、Ｍ、等、ＩＩ！ＭＢＯＪ、　４，４７５．１９８５
）。
Ｎ、クラフサ又はＡ、ニドランスに比べて、Ａ、ニガー
ははるかに重要な生物である。この生物は、例えば食品
工業において使用するための酵素の工業的製造において
広範に使用されている。
Ａ、ニガーはその分泌能力においてＡ、ニドランスと異
り、Ａ、ニガーは種々の加水分解酵素、例えばグルコア
ミラーゼ、α−アミラーゼ、ペクチナーゼ、セルラーゼ
、β−グルカナーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ナリンジ
ナーゼ、ペクチナーゼ、酸性プロテアーゼ及びリパーゼ
を分泌し、グルコアミラーゼ及びペクチナーゼ複合体が
最も重要なものである。
Ａ、ニガーは既知の性サイクルを有しない。従って減数
分裂組換を介して変異を導入することができない。しか
しながら、古典的な変異及び選択法により、加水分解酵
素の分泌における広範な菌株改良が達成されている。
Ａ１、ニガー酵素の遺伝子の内、グルコアミラーゼ（Ｂ
ｏｅｌ等、ＥＭＢＯＪ、　　３．１５８１．１９８４）
並びにアルコール及びアルデヒドデヒドロゲナーゼ（Ｗ
Ｏ８６１０６０９７）がそれらのプロモーター及びシグ
ナル配列を伴う形で特徴付けられており、そしてそれぞ
れＡ、ニドランス及びＡ、ニガーを用いる形質転換実験
において使用されている。
Ａ、ニガーのための選択マーカーとして異種性ａｍｄｓ
遺伝子（Ｋｅｌｌｙ及びＨｙｎｅｓ、　ＥＭＢＯ３，４
，４７５゜１９８５）　、及び肛ｎ遺伝子（Ｂｕｘｔｏ
ｎ等、Ｇｅｎｅ　３７＋２０７．１９８５；ＥＰ　１８
４４３８；ＷＯ３６１０６０９７）が知られており、こ
の両者はＡ、ニドランスから得られたものである。
Ａ、ニガーは、ペクチン分解酵素の工業的生産のために
最も重要な生物である。ペクチンはα−１，４−グリコ
シド結合したＤ−ガラクチュロン酸ポリマーから成る高
分子量（２０，０００〜４０．０ＯＯＤ）のポリガラク
チュロニドであり、そして高等植物細胞の構成々分とし
て天然に存在し、これらは−次細胞壁及び中間ラメラ中
に主として見出されるセルロース分子に付着している。
最も豊富なペクチン源はレモン及びオレンジの外皮であ
り、これらは約３０％のこのポリサンカライドを含有し
ている。ペクチン酵素は、α−１，４−グリコシド結合
の加水分解（ポリガラクチュロナーゼ）により又はペク
チン分子からのα−４，５不飽和ガラクチユロン酸残基
のトランスエレミネーション（ｔｒａｎｓｅｌｅａｅｉ
ｎａｔｉｏｎ）　（異るペクチンリアーゼ類）により炭
水化物ポリマー基質を分解する。ペクチンリアーゼの組
織的な名称はペクチン・トランスエリミナーゼ（ＥＣ４
，２，２，１０）である。
Ａ、ニガーにおいて、ペクチン複合体の蛋白質は構成的
には発現されない、ペクチン又はその分解生成物を用い
る誘導条件下において、他の炭素源、例えばグルコース
又はシェークロースが制限されている場合に、Ａ、ニガ
ーはＰＬＩを包含する上記の酵素を発現する。表面培養
において、ペクチン酵素は外細胞壁と会合したままでい
る傾向がある。培地中での増加するペクチン及びｃｕ！
＋１度が完全な分泌を導く。
ＰＬＩのごときペクチナーゼは主として果汁の清澄のた
めに食品工業により使用される。
Ａ、ニガーから２種類の異るペクチンリアーゼ、すなわ
ちＰＬＩ及ｕｐｔ、ｎが精製され、そしてＦ、Ｂ、Ａ、
Ｖａｎ　Ｈｏｕｄｅｎｈｏｖｅｎ（Ｉ）により部分的に
特徴付けられている。ＰＬＩはマンノースの４個の残基
を含有し、他方ＰＬｎはマンノース及びグルコースの２
個ずつの残基を有する。これらの酵素は異る分子量を有
する（ＰＬ　Ｉ　：　３７．５ｋＤＳＰＬｎ　：　３６
ｋＤ）。
この発明の前の全体的又は部分的アミノ酸配列は知られ
ていない。
この発明は、蛋白質の対応する部分をコードするＤＮＡ
プローブの合成を可能にするペクチンリアーゼＩ（ＰＬ
Ｉ）の部分的構造決定に基いている。ＤＮＡプローブに
より、Ａ、ニガーの遺伝子ライブラリーから、ＰＬＩを
コードするＤＮＡを最終的にはそのプレー配列及びポス
ト−配列と一緒にスクリーニングしそして単離すること
が可能であった。
オ虜」Ｂ乞辻象 本発明の対象はペクチンリアーゼ発現系をコードする組
換ＤＮＡ分子及びその誘導体、例えばＰＬＩの構造遺伝
子及び対応する制御配列、例えばプロモーター、シグナ
ル及びターミネータ−配列、並びに対応するＤＮＡを含
んで成るハイブリドベクター、例えば同種性又は異種性
ポリペプチドをコードするＤＮＡを有するハイブリドベ
クタ−１該ベクターにより形質転換された宿主、特に糸
状菌、例えばアスペルギルス宿主、前記組換ＤＮＡ分子
及び前記宿主の製造方法、並びに新規な発現系の調製の
ための前記組換ＤＮＡ分子の使用に関する。他の対象は
、前記ＤＮＡ及び前記宿主によるポリペプチドの製造で
ある。
ペクチンリアーゼ発現系はプロモーターをコードするＤ
ＮＡ配列、シグナル配列、構造遺伝子及びペクチンリア
ーゼ遺伝子のターミネータ−を含んで成る。
さらに詳しくは、本発明の１つの対象は、ＰＬＩのプロ
モーター、場合によってはこの蛋白質のシグナル配列、
及び場合によっては同じ遺伝子の適当なターミネータ−
１をコードするＤＮＡ配列を含んで成るバイブリド発現
ベクターの造成である。これらのバイブリド発現ベクタ
ーは、特定の蛋白質をコードする遺伝子の導入のため並
びに糸状菌、例えばアスペルギルス（Ａｓ　ｅｒ　１ｌ
ｌｕｓ）　、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）
及びセファロスポリウム孤肛匝皿且ｏｒｉｕ紅の形質転
換のために使用される。異る２つのプラスミドによるＡ
、ニガーの形質転換を行うことができ、この場合プラス
ミドの一方は本発明の発現ベクターの群から選択され、
そして他方は特に造成された選択プラスミドであって、
これは糸状菌の変異株と関連して機能する。
この発明はまた、アスペルギルスの種におけるＰＬＩの
過剰生産（ｏｖｅｒｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）に関する。
本発明の種々の対象が以下の本発明の詳細な記載から一
層明らかになるであろう、９７、さらに詳しくは、本発
明は式（Ｉ）（第４図）のＤＮＡ配列又はその誘導体を
含んで成る組換ＤＮＡ分子に関する。
式（Ｉ）のＤＮＡ配列に関連して使用する場合、“誘導
体”なる語は、フランキング配列を伴う一層長い誘導体
、前記ＤＮＡ配列の断片、変異体、特に天然に存在する
変異体、及び変性されたＤＮＡ配列を包含することが意
図される。
式（Ｉ）ＤＮＡ分子の一層大きな誘導体は、Ａ、ニガー
のゲノムから切り出すことができそして式（Ｉ）のＤＮ
Ａ配列を含んで成るもの、例えば、核酸の断片化、適当
な制限酵素、例えば」Ｕ３Ａによる該断片の処理、適当
なベクター、例えばｐＵＮ１２１への連結、例えばＥ、
コリ（Ｅ、　ｃｏｌｔ）中でのクローニング、及び前記
と同じ制限酵素を用いる再度の切り出し、により得られ
たＡ、リガーのゲノムライブラリー中に見出し得るもの
である。
この様なｆ５誘導は例えば第１図に示されるプラスミド
ｐＣＧ３Ｂ１１の挿入部である。
式（Ｉ）のＤＮＡ配列の断片は、図面中に示される」）
↓Ｉ、Ｅｃ旦Ｒ１，Ｈ如ｄｌ［１，血３ＡＩ。
」ＬＩ　、ＣハＩ、Ｎ並１．Ａ匹１．Ｓ虹■。
」亘Ｉ、Ｓ虹１　、　」ＬＩ　、　　ＢれＩ、Ｈ匹ＲＶ
。
」紅ＩＩ、Ａ■Ｉ、Ｘ蝕１．Ｎｌ咀Ｉ、Ｂ■ＨＩ。
Ｘｍｎ１　、　　ＢａｍＨＩ　、　　Ｂｓ５ＨＩＩ等の
制限部位から選択される２個の制限部位間にわたる断片
である。
好ましい断片は、プロモーター配列、シグナル配列、Ｐ
ＬＩの構造遺伝子、及び／又はターミネータ−配列を含
有する断片である。
式（Ｉ）のＤＮＡ配列の断片は、他のＤＮＡ分子への好
結果の連結をもたらすリンカ−を含有することができる
。
ＰＬＩプロモーター配列はヌクレオチド位置−１〜−６
８８の間のＤ　Ｎ　Ａ　領域に含有され、およそヌクレ
オチド−１００と−１４６の間の配列が必須である。
プロモーター配列のためには、ヌクレオチド−１２０〜
−１４６にあるＴＡＴＡ＾ボックスがＲＮＡ−ポリメラ
ーゼ認識部位として重要である。これらの断片に適当な
リンカ−を付加することができる。
Ａ、ニガーのＰＬＩのプロモーターは誘導的である。す
なわち、これに付加される構造遺伝子、例えばＰＬＩを
コードする構造遺伝子又は任意の他の構造遺伝子は、培
地にペクチン又はペクチン分解生成物を添加することに
より誘導される。
シグナル配列はヌクレオチド１〜５７の間に延びる。こ
のシグナル配列は好ましい配列であり、そしてこれを含
んで成るＤＮＡ分子は、例えば前記配列及び任意的な適
当なリンカ−を含有するＤＮＡ分子は好ましいＤＮＡ分
子である。
ＰＬＩの構造遺伝子はヌクレオチド５８から始まり、そ
してヌクレオチド１３６６に延びる。式（Ｉ）から明ら
かなように、構造遺伝子は幾つかのイントロンを含有す
る。さらに、構造遺伝子は適当なリンカ−を含有するこ
とができる。
ターミネータ−はヌクレオチド１３６７の終止コドンＴ
ＡＡから始まりそしてヌクレオチド１５７０まで又は２
０２９まで延び、特に該配列内の制限部位のい５１．ず
れかまで延びるであろう。ターミネータ−断片は適当な
リンカ−を含有することができる。
前記断片に対する適当なリンカ−は、該断片が連結され
るべきＤＮＡの制限部位に適合するＤＮＡ配列を有し、
又は制限部位を有する。
式（Ｉ）のＤＮＡ配列の断片はまた、より小さい断片か
ら成るもの、例えばプロモーターとシグナル又は構造配
列から成るもの、又はシグナル配列と構造遺伝子から成
るもの、イントロンを伴わない構造遺伝子等である。
式（Ｉ）のＤＮＡ配列の変異体は例えば天然変異体、例
えばヌクレオチドＴ、。がＡ、。により置き換えられて
おり、これによりバリンをコードするコドンＧＴＧがグ
ルタミン酸をコード子るＧＡＧに変化しているものであ
る。後者のアミノ酸は、Ａ、ニガーの株から得られたペ
クチン分解酵素〔ウルトラチーム（Ｕｌｔｒａｚｙｎ）
、ノボ・インダストリーズ、コペンハーゲン〕の混合物
から単独されたＰＬＩ中に存在する。この発明はまた、
同一の又は類似の疎水性プロフィールを有するシグナル
配列の天然又は合成変異体、例えば極性アミノ酸リジン
（Ｋ”）、チロシン（Ｙδ−）及びアルギニン（Ｒ［）
のコドンが類似の電価を有する他のアミノ酸のコドンに
より交換されており、そして疎水性アミノ酸アラニン（
Ａ）、ロイシン（Ｌ）及びスレオニン（Ｔ）のコドンが
他の疎水性アミノ酸のコドンにより置き換えられている
ものを包含する０例えば、正に荷電したリジンのコドン
をアルギニンのコドンにより置き換えることができ、こ
の逆も可能であり、負に荷電したチロシンのコドンをグ
ルタミン酸又はアスパラギン酸のコドンにより、そして
／又は非極性で疎水性のアラニンのコドンをスレオニン
、プロリン、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオ
ニン又はフェニルアラニンのコドンのいずれか１つによ
り置き換えることができる、等である。他の変異は“サ
イレント変異”であり、１個又は少数個、例えば３０個
までのヌクレオチドが、１個又は複数個の他のヌクレオ
チドにより置き換えられており、この場合新たなコドン
が同じアミノ酸をコードしている。
縮重する（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅｄ）式（Ｉ）のＤＮＡ
配列は、サイレント変異のように、限定されない数のヌ
クレオチドが、それらがコードしているアミノ酸配列を
変えることなく他のヌクレオチドにより置き換えられて
おり、遺伝子コードの意味内において変性されているも
のである。このような変性ＤＮＡ配列はそれらの異る制
限部位のために有用−である。
式（Ｉ）のＤＮＡ配列又はその誘導体を含んで成る組換
ＤＮＡ分子は特に組換ベクターであり、これはハイブリ
ドベクターとも呼ばれ、挿入部のごときＤＮＡ配列を含
有する。これらは宿主、例えば細菌、真菌又は動物細胞
におけるクローニングのために有用である。この様なハ
イブリドベクターは、遺伝子工学の分野において有用な
任意のベクターに由来するもの、例えばファージ、コス
ミド、プラスミド又は染色体ＤＮＡ、例えばファージλ
の誘導体、例えばＮＭ９８９．　ＢａｍＨＩ消化により
線状化されたＭ１３ｍｐ８、細菌プラスミド、例えばｐ
ＢＲ３２２、ｐＵＭ１２１　　、　ｐＵｃ１８　、又は
酵母プラスミド、例えば酵母２μプラスミドに由来する
もの、あるいはさらに、アスペルギルス、例えばＡ、ニ
ガー由来の染色体ＤＮＡ、例えばＥＰ　１８４．４３８
により提供されるものである。
この発明のハイブリドベクターは、式（Ｉ）のＤＮＡ配
列又はその誘導体に加えて、制限部位、及び場合によっ
ては、ＤＮＡ誘導体のタイプに由来して、発現制御配列
、例えばエンハンサ−配列、上流活性化部位、プロモー
ター配列及びシグナル配列、及び／又は対応して存在す
るＡ、ニガー由来配列とは異る構造遺伝子を含有する。
この様なエンハンサ−配列は、フイザルム・ポリセパル
ム（ハＬ肛叩ｏ１　ｃｅ　ｈａｌｕｍ）　（ＰＣＴ／Ｂ
Ｐ　８５００２７Ｂ）の染色体外リポゾームＤＮＡに由
来することができ、あるいは酸性ホスファターゼＰ）１
０５遺伝子からの上流活性化部位（ＢＰ出願番号阻８６
１１１８２０．６）、あるいはＰＨ０５、ｔｒｐ＋　Ｐ
Ｈ０５−ＧＡＰＤＨバイブリド（ＥＰ出側番号階８６１
１１８２０．６）　、あるいは類似のプロモーターであ
ることができる。
この発明のプロモーター、シグナル配列及び／又はター
ミネータ−配列に連結される構造遺伝子は、イントロン
を伴うか又は伴わないでＰＬＩをコードする遺伝子のほ
かに、さらに、類似の他のペクチンリアーゼ遺伝子、並
びに種々のポリペプチド、例えば、特に高等真核生物、
特に哺乳類、例えば動物又は特にヒト由来のグリコジル
化されたポリペプチド、例えば、栄養物の製造のため及
び酵素化学反応を行うために使用し得る酵素類、あるい
はヒト及び動物の疾患の治療のため又はその予防のため
に有用であり且つ価値がある非酵素性ポリペプチド、例
えばホルモン、免疫調節性、抗−ウィルス性及び抗−腫
瘍性を有するポリペプチド、抗体、ウィルス抗原、ワク
チン、凝血因子、食品、等をコードする異種性構造遺伝
子である。
これらの異種性構造遺伝子の例として、例えば、インシ
ュリン、成長因子、例えば上皮成長因子、インシュリン
様成長因子、マスト細胞成長因子、神経成長因子又は形
質転換成長因子、成長ホルモン、例えばヒト又はウシの
成長ホルモン、インターロイキン、例えばインターロイ
キン−１又は−２、ヒトマクロファージ遊走阻止因子（
Ｍ　Ｉ　Ｆ）、インターフェロン、例えばヒトα−イン
ターフェロン、例エバインターフェロン−αＡ１−αＢ
１−αＤ又は−αＦ１β−インターフェロン、Ｔ−イン
ターフェロン又はバイブリドインターフェロン、例えば
αＡ−αＤ−又はαＢ−αＤ−バイブリドインターフェ
ロン、肝炎抗原ウィルス、例えば肝炎Ｂウィルス表面も
くしはコアー抗原又は肝炎Ａウィルス抗原、プラスミノ
ーゲン活性化因子、例えば組織プラスミノーゲン活性化
因子又はウロキナーゼ、腫瘍壊死因子、ソマトスタチン
、レニン、β＝エンドルフィン、免疫グロブリン、例え
ば免疫グロブリンＤ、Ｅ又はＧの軽鎖及び／又は重鎖、
免疫グロブリン結合因子、例えば免疫グロブリンＥ結合
因子、カルシトニン、ヒトカルシト。
ニンー関連ペプチド、血液凝固因子、例えばファクター
ＩＸ又はＶｍｃ、ニグリン、例えばニグリンＣ１デスル
ファトヒルジン、例えばデスルファトヒルジン変異体Ｈ
ＶＩ　、　ＨＶ２又はＰＡ、又はヒトスーパオキシド・
ジスムターゼをコードする遺伝子が挙げられる。好まし
い遺伝子は、ヒトα−インターフェロン又はバイブリド
インターフェロン、ヒト組織プラスミノーゲン活性化因
子（ｔ−ＰＡ）、肝炎Ｂウィルス表面抗原（ＨＢＶｓＡ
ｇ）、インシュリン様成長因子１、ニグリンＣ１及びデ
スルファトヒルジン、例えば変異体ＨＶＩをコードする
遺伝子である。この発明のハイブリドベクターにおいて
、この発明のプロモーター及び／又はシグナル配列はポ
リペプチドコード領域に作用可能に（ｏｐｅｒａｂｌｙ
）連結され、こうして該ポリペプチドの効果的な発現が
保証される。
この発明のＤＮＡ分子は、形質転換され、選択されそし
てクローン化される宿主に依存して選択マーカーを含有
することができる。マーカーの表現型発現により形質転
換体の選択を促進する任意のマーカーを用いることがで
きる。適当なマーカーは特に、抗生物質耐性、例えばテ
トラサイタリン又はアンピシリンに対する耐性を発現す
るマーカー、あるいは栄養要求性酵母株の場合には宿主
の傷害を補完する遺伝子である。対応する遺伝子は、例
えば抗生物質シクロヘキシミドに対する耐性を付与し、
あるいは栄養要求性酵母変異株において原栄養性、例え
ばｕｒａ３　ｒ　１ｅｕ２　、　ｊ１鎧又は皿遺伝子を
提供する。さらに、形質転換されるべき宿主がマーカー
により発現される生成物について栄養要求性である場合
には自律複製セグメントと関連する構造遺伝子マーカー
として使用することが可能である。
特に重要なマーカー遺伝子は、Ａ、ニガー宿主の傷害を
補完するマーカー遺伝子、例えば、Ａ。
ニガー又はＡ、ニドランス由来のオルニチンカルバモイ
ルトランスフェラーゼをコードする」Ｂ遺伝子、あるい
はＮ、クラッテ（Ｎ、　ｃｒａｓｓａ）の肛ｄ遺伝子（
２６）に相同なＡ、ニドランスＤＮＡ断片である。
この発明の好ましい具体例は、構造遺伝子、特に外来ｉ
造遺伝子がこの発明のプロモーター及びシグナル配列に
連結されているハイブリドベクターである。この様な好
ましいハイブリドベクターは例えばｐＣＧ３Ｂ１１．　
Ｍ１３ｍｐ８−ＰＬ促■−血ＲＩ）ＢｓｓＨＩｆ　／Ｂ
Ｅ５．ｐＵＢＩ！５．ｐＬ）ｌＫ３．ｐＬＨＬ５　、及
びｐＬＨＬＴ７である（例及び図を参照のこと）。
式（Ｉ）のＤＮＡ及び断片を包含するその誘導体は類似
のＤＮＡ又はａ＋ＲＮＡについてＤＮＡ遺伝子バンク又
は細ＲＮＡをスクリーニングするために使用することが
できる。
ＤＮＡ　　　　　の　鵞　゛ この発明はまたペクチンリアーせ発現系をコードする組
換ＤＮＡ分子又はその誘導体の製造方法に関し、この方
法は、ペクチンリアーゼ発現系をコードするＤＮＡ配列
を含有するＤＮＡ分子又はその誘導体により形質転換さ
れた宿主を培養し、そして目的とする組換ＤＮＡ分子又
はその誘導体を単離するか、あるいはインビトロ合成に
より製造することを含んで成る。
宿主の培養は、形質転換体の負又は正の選択、すなわち
、非形質転換体すなわち目的とするＤＮＡ分子を欠（宿
主からの目的のＤＮＡ分子を選択マーカーと共に含有す
る宿主の選択を可能にするように、化合物が補完されて
いるか又は除去されている場合がある常用の栄養培地中
で行われる。
当業界において有用な任意の形質転換可能な宿主、例え
ば細菌、例えばＥ、コリ、真菌、例えばサツカロミセス
・セレビシェ−５又は特に糸状菌、例えばアスペルギル
ス、例えばＡ、ニドランス、Ａ、オリゼー１ｊ３−．　
肛ｕｕ）　、Ａ、カルボナリウス１ｊ３−．　ｃａｒｂ
ｏｎａｒｉｕｓ、Ａ、アワモリＱ、　ａｗａｍｏｒｉ）
、及び特にＡ、ニガーを使用することができる。好まし
い宿主は、後でさらに記載するように」■Ａ遺伝子を欠
いている新規な株であるＡ、ニガーＡｎ８である。宿主
の形質転換は常法により行われる。
ＰＬ発現系をコードするＤＮＡ配列はこれらの系を含有
する糸状菌から、特にそのゲノムライブラリーから、又
はさらにｄＮＡを介して得られる。
次に、ＰＬＩ発現系の調製をさらに詳細に記載する。
例えば、Ａ、ニガーの株、例えばＮ７５６株のゲノムＤ
ＮＡを５ａｕ３Ａ　Ｉにより部分消化し、そして高分子
量ＤＮＡ断片をＥ、コリプラスミドｐＵＮ１２１にクロ
ーン化することによりゲノムライブラリーを調製するこ
とができる。ＰＬＩを生産する他の任意のＡ、ニガーを
ゲノムライブラリー源として使用することができ、そし
て同様に、適当なベクターを断片の受容体として使用す
ることができる。
ＰＬＩをコードするＤＮＡについてゲノムライブラリー
を好結果にスクリーニングする゛ため、この酵素又はそ
の部分の配列決定が必要であった。
Ａ、ニガーのペクチン分解酵素の市販の混合物（ウルト
ラチーム、ノボ・インダストリーズ）からＰＬＩを精製
゛し、そして配列決定した。成熟ＰＬＩのＮ−末端は 次の配列： Ｖｌ−Ｇ−Ｖ−Ｘｉ−Ｇ−Ｔｈ−Ｐ−Ｅ−Ｇ−Ｆ−Ａを
示し、そしてシアノゲンプロマイドによりＰＬＩを開裂
させることにより得られたＰＬＩの断片は次のＮ−末端
配列： Ｖ＋ｚ＊−５−Ｇ−、Ｖ−Ｓ−Ｎ−Ｉ−１−１−Ｑ−Ｎ
４−Ａ−Ｖ−Ｌｔｚ−Ｄ−Ｉ−Ｎ−Ｘ＋ａ？４ （配列中Ｘはその時点で同定されなかったアミノ酸を示
す） を示した。
これらのアミノ酸配列を基にして、多数のＤＮＡプロー
ブ、すなわちアミノ酸配列の部分をコードするＤＮＡ配
列及び縮重（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ）　Ｄ　Ｎ　Ａ配列
の混合物を化学合成し、そしてスクリーニングのために
用いた。この様なりＮＡプローブは、例えば次の式： ％式％（） （式中、Ｒ８はＡ、Ｃ，Ｇ又はＴであり、Ｒ２はＣ又は
Ｔであり、そしてＲ１はＡ又はＧである）で表わされる
ＤＮＡ混合物；あるいは次の弐：５゛　八ＡＲ＋　　Ａ
ＴＲｚ　　ＡＴＲｚ　　ＡＴＲｚ　　ＣａＨ２Ａ　　３
’　（２０６０）（ＩＣ）（式中、Ｒ＋はＡ又はＴであ
り、Ｒ２はＡ、Ｔ又はＣであり、そしてＲ１はＡ又はＧ
である）で表わされるＤＮＡ混合物２０６０である。
ＰＬＩ遺伝子の全ＤＮＡ配列はこの研究を通じて明らか
になるから、約１４ｂｐ以上を有するその任意の部分を
スクリーニングのために使用することができ、このスク
リーニングにはＰＬ系をコードするｍＲＮＡのスクリー
ニングも含まれる。
スクリーニングのため、ＤＮＡプローブはγ３ｚＰ−Ａ
ＴＰ及びＴ４キナーゼを用いて既知の方法により５′末
端において放射性ラベルされる。挿入部として本発明の
核酸を担持する宿主微生物は、遺伝子ライブラリーのフ
ィルターレプリカ上でのラベル化ＤＮＡプローブとのハ
イブリダイゼーションにより同定される。
サブライブラリーを確立するため、ＰＬＩのＮ−末端部
分をコードする放射性ラベルされたＤＮＡプローブに放
射性応答を示すライブラリーのクローンを単離し、培養
し、そして上記のようなＣＮＢｒ断片のＮ−末端アミノ
酸をコードする第二ＤＮＡプローブとハイブリダイズせ
しめることができる。
一方又は両方のＤＮＡプローブにハイブリダイゼーショ
ン応答を示すクローンを単離しそして増幅する。
例えば、ＤＮＡプローブ２０１４及び２０１５を用いる
スクリーニングはそれぞれ３３個及び３９個の陽性クロ
ーンを示した。これら７２個のクローンを増幅し、そし
て得られたサブライブラリーをＤＮＡプローブ２０６０
により再スクリーニングし、こうして３個の陽性クロー
ンを同定することができた。
１つのクローンを選択し、そしてＥ、コリＢＪ５１８３
／ｐＣＧ３Ｂ１１と命名した。このものはプラスミドｐ
ＣＧ３Ｂ１１を含有し、その部分的制限地図を第１図に
示す。ｐＣＧ３Ｂ１１の」且３ＡＩ断片は第４図及び式
（Ｉ）に示す」凹Ｉ　−Ｎｈｅ　Ｉ断片を含んで成る。
プラスミドｐＣＧ３Ｂ１１は、常用の遺伝子工学技法を
用いることにより、この発明の他のＤＮＡ分子の造成の
ために使用することができる。
例えば、ｐＣＧ３Ｂ１１をＥｃｏＲＩにより制限酵素処
理し、そして２個の断片をプラスミドｐＵＮ１２１にク
ローン化することにより、プロモーター、シグナル配列
及び位置６４９／６５０の中央ｔｉｃｏＲＩ制限部位ま
での構造遺伝子の部分を含有するプラスミドｐＰＬ２９
−５（第２図）、並びに位置６５０から始まるＰＬＩ構
造遺伝子の部分及びターミネータ−を含有するプラスミ
ドｐＰＬ３５−５　（第３図）が導びかれる。
ｐＰＬ２９−５はさらにフランキングＮ−末端配列を含
有し、そしてｐＰＬ３５−５はｐＣＧ３Ｂ１１のフラン
キングＣ−末端配列を含有する。
プラスミドｐＰＬ２９−５及びρＰＬ３５−５の挿入部
の断片を得て、適当な制限酵素、例えばＡｈａ　Ｉｎ’
　＋　−ヱＩＩ、Ａ■■４匡側ｍ、Ｅ並Ｒ１，−エ四■
、血■。
」匹■・」匹Ｉ・　Ｓａｌ　Ｉ・」…Ｉ・　Ｓａｌπ・
±１、Ｂ■■、」並Ｒ１及び」赳ＲＶを用いる制限酵素
処理により配列決定を行うことができる。断片を例えば
異るＭ１３ファージ、例えばＭ１３ｓｐ８及びＭ１３ｓ
ｐ１８にサブクローン化し、そして例えばＭ１３クロー
ニング及び配列決定キット（Ｍ１３配列決定キットＮ、
４５０２、アメルシャム）を用いて供給者（Ｉ６）によ
り与えられた条件下で配列決定することができる。ＰＬ
Ｉ遺伝子の完全な配列を含んで成る２、　７　ｋｂ」匹
１−　Ｎｈｅ　Ｉ断片の全配列を第４図に示す、このも
のは、プロモーター領域の６８８ヌクレオチド、ＰＬＩ
遺伝子の構造遺伝子部分の１３６９ヌクレオチド、及び
ターミネータ−領域の６６１ヌクレオチドを含んで成る
。アミノ酸配列分析（例１）により決定されるＰＬＩの
Ｎ−末端のアミノ酸配列に対応するｐＰＬ２９−５の配
列は、次の式二Ｍ＋　４−Ｙ−Ａ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−＾
−Ｉ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ａ−Ａ−Ｒ−Ａ−Ａ−Ａｓ？で表わ
されるシグナルペプチドをコードする５７ヌクレオチド
により先行される。
ＰＬＩのＣ−末端側ＣＮＢｒ断片のアミノ酸配列（例３
）はｐＰＬ３５−５のクローン化ＤＮＡ断片（ヌクレオ
チド１２５７−１３７９）により連続的にはコードされ
ていない、エクソン／イントロン連結部の共通配列及び
イントロン内部配列についてのコンピューターによる検
索（Ｂｏｅｌ　Ｅ、等（Ｉ８）、及びＭｏｕｎｔＳ、　
Ｍ、　（Ｉ９）　）は、長さがそれぞれ６５ｂｐ　、　
６２ｂｐ　、　６３ｂｐ及び５７ｂｐの４個のイントロ
ンの存在を予想させる（第４図）。
ファージＭ１３Ｉｌｐ８と、プロモーターの１３０ヌク
レオチド及びＰＬＩ遺伝子のＮ−末端部分を含有するプ
ラスミドｐＰＬ２９−５の０．８ｋｂ　５ａｉｌ　−Ｅ
並ＲＩ断片とから得られた１つのファージをＭ１３ｍｐ
８旦虹１−ＥｃｏＲＩ）と命名し、そしてこの発明の他
のＤＮＡ分子の調製のためのその後の段階において使用
する。
式（Ｉ）のＤＮＡ配列の断片を含有するこの発明の前記
のような他のＤＮＡ分子は第５図〜第９図に記載したよ
うにして造成することができ、この場合所望によりＰＬ
Ｉ遺伝子のシグナル配列中に例えばＢｓ５ＨＩＩ制限部
位を導入することができる。この様なりＮＡ分子はプラ
スミド又はファージ、それぞれｐｌＪＢＩＥ５　、　Ｍ
Ｂｓ＋ｐ８−ＰＬＬ１２Ｅ赳Ｒ１）上Ｈｎ　／ＢＥ５（
第５図）　、ｐＬＨＫ３（第７図）　、　ｐＬＨＬ５、
Ｍ１３ｍｐｌＢ−ＰＬＬ１２−　　Ｅｃｏ　ＲＩ　　）
Ｂｓｓ　ＨＩＩ　／へＣ５ｐＬＩＩＬＴ７（第９図）で
あり、この向後の３種類のプラスミドはデスルファトヒ
ルジンをコードする構造遺伝子を含有する。
新たな制限部位を含有する変異体は、例えばインビトロ
で部位特定変異誘発により、常法ＣＭ、Ｊ。
Ｚｏｌｌｅｒ及びＭ、Ｓｍ１ｔｈ、Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅ
ｎｚｙｍｏｌ、１００．４６８（Ｉ９８３）　；　Ｄ、
Ｂｏｔｓｔｅｉｎ及びり、５ｈｏｒｔｌｅ、５ｃｉｅｎ
ｃｅ　２２９゜１１９３（Ｉ９８５）　；又はに、Ｎｏ
ｒｒｉｓ等、Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ。
■、　５１０３　（Ｉ９８３）の総説論文を参照のこと
〕に従って調製することができる。
例えば、この発明のＤＮＡ配列の変異体は、プロモータ
ー及びＰＬＩの分泌シグナル配列を含んで成るＭ１３ａ
＋ｐ８ＰＬ血Ｉ−Ｅ並Ｒ１）から誘導される。　Ｍ１３
ｍｐ８ＰＬ（Ｓａｌ　　−ＥｃｏＲ−Ｉ　）遺伝子のシ
グナル配列への新たなり５ｓＨＩＩ部位の導入は、ＰＬ
Ｉシグナル配列のＣ−末端部分の近傍に位置する位置３
６−５４のＤＮＡ配列に相補的であるが但し位置４５に
おいてＣ／Ｇ転換が導入されている化学合成ブライマー
オリゴヌクレオチド（変異原ブライマー）を用いること
により行われる。
新たなり５ｓＨ１１部位を担持する変異したファージは
Ｍ１３ｍｐ８ＰＬ旦韮−一シ辺Ｒ１）上ＨＩＩと命名さ
れ、そして同種又は異種遺伝子の発現ベクターの造成の
ために使用することができる。
対応する例において、ｐＭＬ３１Ｑ（ＥＰ１６８３４２
）のデスルファトヒルジン遺伝子がファージＭ１３ｎｐ
ｌＢ−ＰＬ血１−　ＥｃｏＲＩ　）ＢｓｓＨＩＩ　／Ａ
Ｃ５に再クローン化される（第６図〜第９図）　、　Ｍ
１３−ρ１８−ＰＬ旦凹Ｉ−」匹Ｒ１）−も咀ＨＩＩ／
ＡＣ５の血Ｈｆｆに適合するｐＭＬ３ＱＩＬのデスルフ
ァトヒルジン遺伝子の」■Ｉ制限部位を作るために、」
■Ｉ／Ｂｓ５ＨＩ［リンカ−を造成する。このリンカ−
ＤＮＡを、開裂されたファージＤＮＡに連結する。リン
カ−断片を担持するファージＤＮＡをＨｉｎｄｌ［によ
り２つの断片に開裂せしめる。ＰＬＩのシグナル構造及
びリンカ−断片を含んで成る０、７ｋｂ断片を単離する
。
、ＪｇＨＩ制限部位を担持する適当な複製プラスミド、
例えばｐＢＲ３２２を−ＢａｓＨＩにより開裂せしめる
。
クローン化すべき遺伝子をゲノムＤＮＡ、プラスミド又
はファージＤＮＡから適当な制限酵素により切り出し、
そして必要であれば必要とされる適合する制限部位を設
ける。
適合する制限部位を設けるための他の方法は、例えばｐ
ＭＬ３０１Ｌ（第６図）の造成により行われるよう、な
インビトロ変異誘発である。血ｌ制限部位を含有するリ
ンカ−が造成され、そしてデスルファトヒルジン遺伝子
の５′−末端に付加される。
高い発現速度のため、任意の真核性ターミネータ−配列
を構造遺伝子の末端に連続することができる。この発明
の好ましい態様においてはＰＬＩ遺伝子のターミネータ
−領域を用いる。例えば、上記の方法を次の様に改変す
ることにより、ＰＬＩのターミネータ一部位を含んで成
る発現ベクターを得ることができる。プロモーター及び
分泌シグナル配列をプラスミドＭ１３ｍｐｌＢ−ＰＬ旦
匹１−上Ｒ１）Ｂ鈍Ｈ１ｌ／ＡＣ５から得る。ターミネ
ータ−領域はｐＰＬ３５−５から得る。Ｍ１３ｍｐ１８
−ＰＬ血■−′」匹Ｒ１）Ｂ旦Ｈ１ｌ／ＡＣ５を上ＨＩ
Ｉにより開裂せしめ、そしてＢｓ５ＨＩＩ−血Ｉリンカ
−を連結する。変形においては、プラスミドｐＰＬ３５
−５を」旦Ｉにより２個の断片に開裂せしめ、この断片
に、クローン化された遺伝子の３′末端と適合する適当
なリンカ−を再び連結する。Ｐｓｔ制限部位の接着末端
を酵素Ｔ４ポリメラーゼにより満たし、例えばビオラプ
ス、ニューイングランドから得られるＢａｍＨＩリンカ
−を加える。ｐＰＬ３５−５プラスミドをＮｈｅ　Ｉに
より開裂せしめ、そしてＰＬＩのターミネータ−領域を
含有する得られる０、７ｋｂ断片を単離する。増幅のた
め、適合する制限部位を有する任意のプラスミド、例え
ばｐＵｃｌＢを使用することができる。ｐＵｃｌＢの場
合、このプラスミドをＨｉｎｄｌ［Ｉ及びＸｈａ　Ｉに
より開裂せしめる。
４個のＤＮＡ断片、すなわち、Ｂｓ５ＨＩＩ−血！リン
カ−を担持するＭ１３慣ｐｔａ−ｐｔ、旦凹Ｉ−Ｅ匹Ｒ
１）血Ｈｎ／ＡＣ５、Ｂ憇ＨＩリンカ−を担持するｐＰ
Ｌ３５−５の０．７　ｋｂ断片、Ｈｉｎ　ｄ　ｍ　／　
Ｘｈａ　Ｉにより開裂されたｐｕｃｔａ　、及びデスル
ファトヒルジン遺伝子の血１−　Ｂａｎ　ＨＩ断片を連
結してｐＬＨＬ７を形成せしめる（第９図）。
細菌を常法に従って形質転換し、そして形質転換体を例
えばテトラサイタリンに対する耐性により同定する。
特に、記載された発現ベクターが適当なＥ、コリ宿主株
、例えばＨＢＩＯＩ中で増幅され、形質転換され（Ｉ０
）、そして当業界における常法に従って選択される。増
幅されたプラスミドＤＮＡは常法により、特にＢｉｒｎ
ｂｏｉｍ及びＤｏｌｙ（Ｉ７）により記載されているよ
うにして細菌から単離される。
同様にして、他の同種又は異種遺伝子を含有する他のプ
ラスミドを造成することができる。
この発明のＤＮＡ分子はまた、常法に従うインビトロ合
成によって製造することもできる。インビトロ合成は特
に、ＰＬ発現系の小さい断片の調製のため、例えばプロ
モーターもしくはＰＬＩのシグナル配列又はそれらの変
異体の調製のために適用することができる。
ＰＬＩプロモーター、並びに場合によってはＰＬＩシグ
ナル配列、ＰＬＩ構造遺伝子、任意の他の異種性構造遺
伝子及び／又はＰＬＩターミネータ−を含んで成るこの
発明のＤＮＡ分子はまた、糸状菌、例えばアスペルギル
ス、ペニシリウム又はセファロスポリウム（Ｃｅｐｈａ
ｌｏｓｐｏｒｉｕｍ）、例えばＡ、ニドランス、Ａ、オ
リゼー、Ａ、カルボコリウス（Ａ、　ｃａｒｂｏｎａｒ
ｉｕｓ）、そして特にＡ、ニガーを形質転換するために
使用することができる。
未形質転換真菌からの形質転換された真菌の選択を可能
にするため、この発明のＤＮＡ分子は選択マーカーを担
持しており、あるいは真菌をその様なマーカーを含有す
る第二ベクターと共に同時形質転換する。他の系の場合
と同様に、この様な選択マーカーは発現可能な構造遺伝
子であって該遺伝子の発現されたポリペプチド（酵素）
が形質転換体に対して毒性の化合物に対する耐性を提供
し、又はこのような必須ポリペプチドを欠く変異株の酵
素系を完結する。この様なマーカー遺伝子は、例えば既
知の旦−２，ｄ、　血１立凪Ｌ」並又は肛■遺伝子であ
る。
この発明の範囲内において、ｍと称する新規なマーカー
遺伝子がＡ、ニガーのゲノムライブラリーから単離され
た。このものはＡ、ニドランスのｄ及びＮ、クラッサの
ｍと関連し、そして類似の機能を有する。すなわち酵素
オロチジン５′−ホスフェートデカルボキシラーゼを生
産する。
この酵素は、オロチジン５′−ホスフェートからウリジ
ル酸（ウリジン５′−ホスフェートへの脱炭酸、及びフ
ルオロ−オロチン酸から毒性のフルオロ−ウリジンへの
脱炭酸を触媒する。ＬＩＬＡ遺伝子を含有するＥ、コリ
のクローンを、ｄ遺伝子の部分を含有するｐＤＪＢ２　
（２６）の１．１ｋｂ　Ｈｉｎｄ　ｍ断片とのハイブリ
ダイゼーションにより同定した。
但し、オロチジン−５′−ホスフェート・デカルボキシ
ラーゼをコードする他の任意のｌＬＬ遺伝子のＤＮＡを
使用することができる。Ｅ、コリＢ７５１８３／　ｐＣ
Ｇ５９Ｄ７　と称する陽性クローンがら囮遺伝子を含ん
で成るプラスミドｐＣＧ５９Ｄ７を単離し、そしてＡ、
ニガーｐｙｒＡ−変異株の同時形質転換のために使用し
た。このｐｙｒＡ−変異株はオロチジン５′−ホスフェ
ートデカルボキシラーゼ遺伝子を欠き、そしてそれ故に
対応する酵素を生産することができない。Ａ、ニガーＮ
７５６の分生胞子を変性的ＵＶ照射のもとで処理し、そ
してフルオロ−オロチン酸及びウリジンの存在下で生存
するコロニーを選択することにより上記の変異株を調製
した。
フルオロ−オロチン酸の存在下で且つウリジンの非存在
下で生存するコロニーを除去する。残ったウリジン要求
性変異株は、形質転換可能なその能力に従って、それぞ
れ変異株Ａｎ８及びＡｎｌＯにより代表される２つの補
完群」■Ａ及び」■Ｂに属する。これらをそのプロトプ
ラストの形態において形質転換条件下でｍ含有プラスミ
ドルＣＧ５９Ｄフにより処理する。Ａｎ８コロニーのみ
が形質転換され、そしてその消化されたＤＮＡがｐＵＮ
１２１のＤＮＡとハイブリダイズする能力により証明さ
れる場合、肚が遺伝子を含有することが見出された。
この発明はまた選択マーカープラスミドｐＣＧ５９Ｄ７
、これを含有する宿主、及びｍ変異株Ａ、ニガーＡｎ８
、及びこれらの製造方法に関する。
この発明はさらに、この発明のハイブリドベクターによ
り形質転換された宿主及びそれらの製造方法に関する。
これらの形質転換体は細菌、例えばＥ、コリ、又は糸状
菌、例えばアスペルギルス、ペニシリウム又はセファロ
ストリウム、そして特にＡ、ニドラン又、Ａ、オリゼー
、Ａ、カルボナリウス、又は好ましくはＡ、ニガー、例
えばＡ。
ニガーＡｎ８である。この発明はさらに、この様な形質
転換体の製造方法に関し、この方法は宿主を形質転換条
件下で本発明の組換ＤＮＡ分子、特にハイブリドベクタ
ーにより、場合によっては選択マーカー遺伝子と共に処
理し、そして形質転換体を選択することを含んで成る。
この発明はまた、有用なポリペプチド、例えばＰＬＩ、
デスルファトヒルジン（ｄｅｓｕｌｆａｔｏｈｉｒｕｄ
ｉｎ）等を発現するハイブリドベクターを製造するため
の、組換ＤＮＡ又はその誘導体の使用に関する。
この発明はさらにポリペプチドの製造方法に関し、この
方法は、この発明のハイブリドベクターを適当な宿主中
で発現せしめ、そして常法に従ってポリペプチドを単離
することを特徴とする。こノ方法ハ、ＰＬＩの発現及び
分泌のための発現ハイブリドベクターにより形質転換さ
れたアスペルギルスを培養することによりアスペルギル
スの種においてＰＬＩを過剰生産せしめ、そして栄養培
地からＰＬＩを集めることを特徴とする。
次に、例によりこの発明をさらに具体的に説明する。但
しこれにより、この発明の範囲を限定するものではない
。
四は゛の　　を　　る ｂｐ　　　　塩基対 ＢＳＡ　　　ウシ血清アルブミン ｃｐｍ　　　カウント７分（放射能崩壊）ｄＡＴＰ　　
　２’−デオキシアデノシントリホスフェート ｄＣＴＰ　　　２’−デオキシシチジントリホスフェー
ト ｄＧＴＰ　　　２’−デオキシグアノシントリホスフェ
ート ｄＴＴＰ　　　２’−デオキシチミジントリホスフェー
ト ｄＮＴＰ　　　ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴ
ＴＰの混合物ＣＩＡＰ　　　ウシ腸からのアルカリホス
ファターゼＤＮＡ　　　デオキシ核酸 ＤＴ７　　　１．４−ジチオスレイトールＥＤＴＡ　　
　エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩 ＩＰＴＧ　　　イソプロピル−β−Ｄ−チオ−ガラクト
ピラノシド ｋｂ　　　　キロ塩基 ＰＬ　　　　ペクチンリアーゼ■ ＰＴＨフェニルチオヒダントイン ＲＰ−ＤＮＡ　　二本鎖複製形ＤＮＡ ＲＮＡ　　　　リボ核酸 ｒｐｍ　　　回転数７分 ＳＯ３ドデシル硫酸ナトリウム ３Ｓ　　　　−末鎖 Ｔｒｉｓ　　　トリス（ヒドロキシメチル）−アミノメ
タン ｔＲＮＡ　　　）ランスファーＲＮＡ Ｕ　　　単位 ｎ　　　マイクログラム ｖｏｌ　　　容量 Ｘ−ＧＡＬ　　５−ブロモ−４−クロロ−３−インドー
ル−β−ガラクトシド Ｕ立１１　″　；５ ｓｓ−デンハー）　　０．０２％フィコール（シグマ）
、０．０２％ポリビニルピロリドン （シグマ）　、０．０２％ＢＳＡ、１００鱈／ＩＲ１変
性サケ精子ＤＮＡ （シグマ） ＥｃｏＲＩ緩衝液　０．０１Ｍ　Ｔｒｉｓ−Ｈ（Ｊ　　
（ｐｉ（７，５）０、ＩＭ　ＮａＣｊ！　、０．ＯＩＭ
　ＭｇＣｊ！　ｚ＋１ｍＭ２−メルカプトエタノール 血！緩衝液　　５０ｍＭ　ＮａＣｊ２．１０ｍＭ　　Ｍ
ｇＣｌ！ｚ、１ｍＭ　ＤＴＴ、１００ｇ／ｄ　ＢＳＡ、
６ｍＭＴｒｉｓ　−ＨＣｌ（ｐＨ７，４） ＩＰＴＧ　　　　　　　１００ｍＭイソプロピル−β−
Ｄ−チオ−ガラクトピラノシド （２３，８曜／−水）（使用直前に 調製） ＬＢ培地　　　　　１％バタトートリプトン（ディフコ
）、０．５％バクト酵母 エキス（ディフコ）　、１７０ｍＭ ＮａＣ１、Ｎａ０ｔｌにてｐ）１７．５に調整 連結緩衝液　　　２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、　１０
ｍＭ　ＭｇＣｊ！　ｔ＋１０ｍＭジチオエリスリトール
、 ０．６ｍＭ　ＡＴＰ、　　（ｐＨ７，６）ＴＢＥ−緩衝
液　　　１リットル中１０．８ｇ　Ｔｒｉｓ。
５．５ｇ硼酸、４　ｍｌ　Ｏ，５Ｍ　ＥＤＴＡ（ｐＨ８
，０） ＴＥ緩衝液　　　　１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｆ！　　
（ｐＨ７，５）、　１ｍＭ　　ＨＤＴＡ 低ＴＥ緩衝液　　　１ｌＭ　Ｔｒｉｓ−）ＩＣｊ！　　
（ｐＨ７，５）。
０．１＋Ｍ　ＢＤＴＡ 上層寒天　　　　１リットル当り１０ｇバタトトリブト
ン、８ｇＮａＣ１，８ｇ 寒天 ２ｘＴＹ培地　　　　１リットル当り１６ｇバタトトリ
プトン、１０ｇ酵母エキス、 ５　ｇ　ＮａＣｆ Ｘ−ＧＡＬ　　　　　　２％（５−ブロモ−４−クロロ
−３−インドール−β−ガ ラクトシド５（使用直前にジメ チルホルムアミド中に調製） ＳＯＣ培地　　　　２％バタトトリプトン（ギプコ）、
０．５％酵母エキス（ギ ブコ）　、１０ｍＭ　ＮａＣ１、２，５ｍＭＫＣｊ！　
、　１０ｍＭ　ＭｇＣｌｚ、　５　ｍＭＭｇＳＯ□２０
１１Ｍグルコース キナーゼ緩衝液　５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｊ！　、　
１０ｍＭ　ＭｇＣ１，。
５　ｍＭ　ＤＯＴ　（ｐＨ７，５） Ｘ−ｇａｌプレート　０．００２％Ｘ−Ｇａ１．０．０
７ｍＭ　ＩＰＴＧＮＥＴ　　　　　　　Ｏ，１５Ｍ　　
Ｍａｃｌ、０．０１５Ｍ　Ｔｒｉｓ　・ＨＣｌ（ｐＨ７
，５）　　１　ａ＋Ｍ　ｔ！ＤＴＡＥ、コリ用最少　０
．６％ＮａＪＰＯ＊＋０．１％　ＮＨ４Ｃ４。
培地　　　　　　０．０５％ＮａＣ１、１ｎＭ　Ｍｇ５
Ｏｔ。
０．０１ｍＭ　ＣａＣＩｌ　、、　Ｉ　４１Ｍチアミン
−ＨＣｌ１．０．２％グルコース Ａ、　ニガー用量　１リツトル中６　ｇ　ＮａＮ０＋、
０．５２少培地　　　　　ｇ　　ＫＣＩＩ　、　０．５
２ｇ　Ｍｇ５ｏ４．　ｘ７Ｈｔ０．１．５２　ｇ　　Ｋ
ＨｚＰＯｎ、微量のＺｎ＋Ｐｅ、　１０ｇグルコース、
Ｎａ１ｌ（によりｐＨ６，５に調整 Ａ、ニガー用完　マイコフィル−４天（ＢＢＬ）全培地 ＰＣＴ　　　　　　　１０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（
ｐＨ７，５）。
５ＯｔＭ　ＣａＣｌ　ｚ中２５％ポリエチレングリコー
ル６０００　（メルク、 ダルムスタット） 胞子形成培地　　１０ｇ／ｆフイトン（ｐｈｙｔｏｎｅ
）ペプトン、１０ｇ／ｌグルコー ス、１０ｇ／Ｉｔ寒天 ＳＳＣ０，１５Ｍ　　Ｎａ（Ｊ　、０．０１５Ｍクエン
酸ナトリウム プレートのためには、すべての培地は１．５％／＜クト
アガ−（ディフコ）の添加により固化する。
次Ω殊土使里工ゑＬ 旦ユユユ」■虹抹：Ｆ−＊、ｈｓｄＳ２０（ｒ−＋＋ｍ
−Ｂ）、　　ｒｅｃＡ１３゜皿１４．」皿Ａ２．ユ匹Ｙ
ｌ、　Ｊｉ虹に２．」匹Ｌ２０（ｓｔｒ”　Ｌ　Ｊｉ−
５＋　　ｍｔｔ−Ｌ　」肚Ｅ４４＋λ−（Ｍａｎ　ｉａ
　ｔ　ｉｓ　・署噺！　、　（８）　）旦、ユニ且■競
抹：　　Ｆ−、ｅ閃＾＋　５ｂｃＢ−、ユ匹ＢＣ−。
ＪＬＬＬＫ、　ｓ＋ｅｔ−、ｓｔｒ”　、　　ｔ■−１
＋　　ｂｔｏＴ。
ｈｓｄＲ（ｒｘ−＋　ＩＩＫつ、λ−（Ｈａｎａｈａｎ
（Ｉ０）　）旦、ユユユ■虹抹：　旦Ｂ＋　ｔｈｉｓ　
Ａ豆匹−」皿＾Ｂ）。
（Ｆ　’　、　　ｔｒａＤ３６．」皿ＡＢ、　　１ａｃ
１９ＺΔＭ１５）（ＹａｎｉｓｈＰｅｒｒｏｎ　４＊！
、（２５）　）アスペルギルス・ニガーＮ７５６：この
株はペクチン分解複合酵素の高生産性のために選択され
た。
Ｍ１３ｍｐ　８　、９　、１８、及び１９は一末鎖バタ
テリオファージＭ１３の誘導体であり、そして多様なポ
リリンカ一部位におけるＤＮＡ断片のクローニング及び
同じ制限断片の可能な両方向へのクローニングを許容す
ることによりＤＮＡの配列決定を容易にするために設計
されている。これらのベクター中にクローン化された配
列は配列決定反応のための鋳型として、又は標準的オリ
ゴデオキシリボヌクレオチドブライマー及びＥ、コリＤ
ＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏ−断片を用いる単鎖プ
ローブの製造のために容易に使用することができる。ベ
クターＤＮＡはＥ、コリ１ａｃ−オペロンプロモーター
及びβ−ガラクトシダーゼの最初の１４５アミノ酸の遺
伝情報を担持している。多数制限部位を含有するポリリ
ンカー配列がｌａｃ　Ｚ配列に挿入されている。ポリリ
ンカーはｌａｃ　Ｚリーディングフレームを維持してお
り、そしてベクターはコ２α宿主株の対立遺伝子補完を
与え、ＩＰＴＧ及びＸ−ｇａｌを含有するプレート上で
青色プラークを生じさせる。このリーディングフレーム
を破壊するか又は他の方法でユａｃ　Ｚａペプチドの発
現を妨害する挿入部を含有する組換体ファージは無色の
プラークとして示される。
一１旦団ブラシ（虹Ｌ ｐＵｃ１８ブーｙｘミド（２８）はｌａｃ　Ｚ＆ｊｉｌ
域中ニＤＮＡ配列をクローニングするために使用するこ
とができ、組換プラスミドを含有する組換体がそれらの
Ｌａｃ表現型に基いて選択される。挿入部を伴わないプ
ラスミドを有する細菌は指示薬プレート（Ｘ−ｇａｌを
含有するプレート）上で青色のコロニーを形成し、他方
、組換プラスミドを有する細菌は白色コロニーを形成す
る。プラスミドｐＵｃ１ＢはＭ１３ｎ＋ｐ１８ファージ
のそれに適合するユａｃＺｇ領域中にユニーククローニ
ング部位を含有する。このプラスミドは３”の遺伝子を
担持する。
ＭＬ３１０ブースミド ｐＭＬ３１０はヨーロッパ特許出願磁０１６８３４２中
に記載されており、これは−リＩ１１、±！プロモータ
ー、及びヒル中に天然に存在するハロンビン阻害剤であ
るデスファトヒルジンをコードする遺伝子により特徴付
けられる。
ＵＮ１２１ブースミド プラスミドｐＵＮ１２１　（Ｎｉｌｓｓｏｎ等（９）〕
は、ＤＮＡ挿入部を含有するプラスミドを有する形質転
換体の陽性選択を可能にするクローニングベクターとし
て使用することができる。このプラスミドはバクテリオ
ファージλの上玉遺伝子、及びｔｅｔ遺伝子を含有する
。　ｐＵＮ１２１を有する細菌は、±１±遺伝子がバク
テリオファージλの右プロモーターから転写され、そし
てこのプロモーターはＣＩにコードされたリプレッサー
により抑制され得るのでテトラサイクリンに対して感受
性である。
ｃｌ遺伝子中の部位の１つへのＤＮＡ断片の挿入はリプ
レッサー遺伝子を不活性化し、テトラサイクリン耐性形
質転換体をもたらす、さらに、プラスミドｐＵＮ１２１
は機能的エエＬ遺伝子を有するので、プラスミドＤＮＡ
の増幅を選択条件下で行うことができる。
ミドｐＢＲ３２２は抗生物質アンピシリンに対する耐性
のための遺伝子（ａｍｐ”　）及びテトラサイクリンに
対する耐性のための遺伝子豆■０）を担持する。
このプラスミドは幾つかのユニーククローニング部位を
担持し、その内の幾つかはｍ遺伝子又はｔｅｔ遺伝子中
に位置し、このためクローン化ＤＮＡの挿入が抗生物質
感受性の細菌をもたらす。
」肘Ｕ工立Ｘ亙上 このプラスミドはＢａ１ｌａｎｃｅ及びＴｕｒｎｅｒ　
（２６）に記載されている。
ペクチンリアーゼ■をウルトラチーム（Ｕｌｔｒａ−ｚ
ｙｍ＠）（Ａ、ニガーから得られるペクチン分解酵素の
混合物；ノボインダストリーズ、コペンハーゲン）から
、Ｆ、Ｅ、Ａ、ｖａｎ　Ｈｏｕｄｅｎ）＋ｏｖｅｎ（Ｉ
）により記載されている方法と類似する方法により精製
する。２■のベクチンリアーゼエを数リットルの水に対
して透析し、そして次に凍結乾燥する。蛋白質を１．５
１Ｒ１の１００ｍＭ　ＮａＨＣＯｚ（ｐＨ１０，０）に
溶解し、そして室温に３時間保持する。この処理が、自
動エドマン分解法（２）により確実に配列決定すること
ができる段階の数の増加を抑制する。アルカリ処理の後
、蛋白質を１１の蒸留水、１％蟻酸及び蒸留水に対して
次々と透析する。ベックマン・回転カップシーケンサ−
、モデル８９０Ｃ中で自動エドマン分解を行う、無傷の
還元されそしてカルボキシメチル化された蛋白質を、ク
アドロール・シングルーフレベジ・プログラム（改変さ
れたベックマンプログラム０７２１７２Ｇ）を用いて分
解する。ペプチドの分解はジメチルベンジルアミン・シ
ングルーフレベジ・プログラム（ベックマンプログラム
０８２７７３）又はＨｕｎｋａｐｉ　１ｌｅｒ及びＨｏ
ｏｄのプログラムを用いて行う。ペプチドのウォッシュ
・アウトを防止するため、２．５■のタラのバルバルブ
ミンをキャリヤーとして使用する（３）、アミノ酸のフ
ェニルチオヒダントイン誘導体を高速液体クロマトグラ
フィーにより、Ｆａｎｋ及び５ｔｒｕｂｅｒｔ（４）の
方法に従って同定する。ペクチンリアーゼＩについて次
のＮ−末端アミノ酸配列が決定される。
Ｖ−Ｇ−Ｖ−Ｘ、−Ｇ−Ｔ−Ｐ−Ｂ−Ｇ−Ｐ−＾アミノ
酸Ｘａはセリンである可能性が非常に高いが、しかしそ
の存在は明確には確立されなかった。
ペクチンリアーゼＩの還元及びＳ−カルボキシメチル化
をＣｒｅｓｔｆｉｅｌｄ等（５）の方法に従って行う。
３ｇの尿素（高純度）を５ｍの蒸留水に溶解し、そして
０．５ｇの混合床イオン交換体（ビオラドＡｇ５０１−
Ｘ８）と共に１時間攪拌する。イオン交換ビーズを除去
した後、１０■のｆ！ＤＴＡ及び２００■のＴｒｉｓを
４−の尿素溶液に加え、そしてｐｔｔをＨＣｌにより８
．５に調整する。この溶液を、バイアル中で５１Ｒ１の
最終容量に蒸留水により満たす。
次に、Ｆ、Ｅ、Ａ、ｖａｎ　Ｈｏｕｄｅｎｈｏｖｅｎ（
Ｉ）により記載されているようにして精製された５〜２
０■のペクチンリアーゼＩを加え、そしてパイ・アルを
窒素のもとに置く。
最終的に３３Ｊ１１のβ−メルカプトエタノールを加え
、そして窒素のもとで室温にて４時間還元を続ける。　
０．３３＋＋ｄの新たに調製した溶液（ＩＭｌのｌＮＮ
ａＯＨ中０．２６８　ｇのヨード酢酸）を窒素のもとで
反応混合物に加え、そしてこの混合物を室温にて１５分
間暗中に保持する。
β−メルカプトエタノールを添加することにより反応を
停止する。次に、カルボキシメチル化された蛋白質をセ
ファデックスＧ−２５ゲル濾過カラム（Ｉ００ｄベフド
ボリウム）に適用し、これをアルミニウム箔で包み、そ
して０．５％蟻酸により溶出する。蛋白質画分をプール
し、そして凍結乾燥する。
このカルボキシメチル化ペクチンリアーゼＩ（２〜１０
■）を７０％蟻酸に溶解し、そしてペクチンリアーゼＩ
当り１残基存在するメチオニンに対しておよそ１００倍
モル過剰の固体シアノゲンブロミドを加える。この反応
混合物を連続して２４時間室温にて、密閉した反応バイ
アル中で攪拌する。５Ｉ１１のサンプルを一定の時間間
隔で採取し、そして１５％ＳＯＳ　−ＰＡＧＥ上で分析
して蛋白質が開裂された程度をチェックする。２４時間
後、水を添加し、そして窒素でフラッシュすることによ
り調製物を部分的に蒸発せしめる。この段階を反復して
蟻酸を除去する。
５Ｏ３−ＰＡＧＥ分析は、幾らかの残留するペクチンリ
アーゼＩのほかに、見かけ分子量１６．５ｋＤ及び３０
ｋＤを有するＣＢＩ及びＣＢＩ［を同定する。これらの
断片の精製を、２０１１１’ｌリン酸ナトリウム緩衝液
（ｐＨ６，０）、１００ｍＭ　ＮａＣｊ！　、４　Ｍ尿
素及び１％（Ｖ／Ｖ）β−メルカプトエタノール中で平
衡化したセファクリル−３２００カラム（長さ１９０ｃ
ｍ。
φｌａｍ）を用いるゲル浸透クロマトグラフィーにより
行う。ＣＢＩＩは２個のピーク中に現われ、１つのピー
クは残留する無傷の蛋白質のすぐ前に溶出し、従ってこ
れは原体でなければならず、そして他のピークは無傷の
蛋白質と小さいＣＢＩ断片との間にある。
例１．２の精製された非凝集ＣＢｎ断片２００河を用い
て、ベックマン回転カンプシーケンサーにより自動エド
マン分解（２）を行う。両分を蒸発せしめ、そしてこの
残渣に２００４のメタノール中２ＮＨｆＪを添加した後
、ＰＴＨアミノ酸への転換を６５℃にて１５分間行う。
次に、この溶液を再び蒸発せしめ、そして残渣を５０ｊ
１１のＴＨＰ／ＣＨｚＣＮ（Ｉ：１）中に溶解する。　
Ｒ，Ｋｎｅｃｈｔ等（６）に従ってゾルパックス（Ｚｏ
ｒｂａｘ）　ＣＮ”カラム（デュポン）を用いてＨＰＬ
ＣによりＰＴＨ−アミノ酸を同定する。
ＣＢｎのＮ−末端アミノ酸配列は次の通りである。
Ｖ−５−Ｇ−Ｖ−Ｓ−Ｎ−１−Ｉ−１−Ｑ−Ｎ−１−Ａ
−シーＸｌ５−Ｄ−Ｉ−Ｎ−Ｘ１９−ＥＸｔＳ及びＸｌ
’ｌは未同定アミノ酸残基である。
高分子量Ａ、ニガーＤＮＡの単離をＹｅｌｏｎ等（７）
の方法に従って行う。Ａ、ニガーＮ７５６株の分生胞子
を０．１％アルギニンを含有する２００ｉの最少培地に
接種し、そして１個のウェルを有する５０〇−のフラス
コ中で２８℃にてロータリーシェーカー上で２〜３日間
振とうする。菌糸を濾取し、凍無菌水で洗浄し、凍結し
、そして液体窒素中で粉末化する。細胞を２０−の５０
　ｍＭ　ＥＤＴＡ（ｐＨ８，５）、０．２％ＳＤＳ及び
２０１１１ジエチルピロカーボネート中に迅速に懸濁し
、そして室温にて１分間激しく振とうすることにより細
胞溶解を行う。この細胞溶解物を６８℃に１５分間加熱
し、室温に冷却し、そして室温にて１２０００Ｘｇで１
５分間遠心する。
１６１Ｒ１の上清を新たなチューブに移し、そして１−
の８Ｍ酢酸カリウム（ｐＨ４，２）を添加した後、氷上
に１時間置く。沈澱を２５０００Ｘｇにて１５分間４℃
で遠心分離する。１２−の上清を回収し、そして１２ｄ
のイソプロパツールにより核酸を沈澱せしめる。１２０
００Ｘｇにて１．５分間の遠心分離により沈澱をベレッ
ト化し、そしてベレットを、１０ｘ／−のＲＮＡ５ｅＡ
　（ベーリンガー、マンハイム）を含有する２ｍｊＴＥ
中に再懸濁する。Ｍａｎｉａｔｉｓ等（８）　、４５８
〜４５９頁及び４６１〜４６２頁に記載されているよう
にして、ＤＮＡ断片をクロロホルム／フェノールで抽出
し、そしてエタノールにより沈澱せしめる。
例２．１の高分子量Ｄ　Ｎ　Ａ　（Ｉ００ｎ）を遠心に
より沈澱せしめ、そしてベレットを、Ｔｒｉｓ　−ＨＯ
２（６＋ｕ＋ｏｊ！　／　ｌ　）、ＮａＣＪ！　（５０
ｍｍｏｊｔ　／　ｌ　）、ＭｇＣｆ　。
（６ｍｍｏｆ　／　ｊり（ｐＨ７，５）から成る緩衝液
Ｔ５０ｐｌに再懸濁する。０．２５〜０．０ＩＵ／ｎの
範囲の濃度で５ａｕ３Ａ　Ｉを用いて３７℃にて６０分
間、部分消化を行う、最終濃度２０ｎ＋Ｍとなるように
ＥＤＴＡを添加することにより反応を停止する。
部分消化されたＤＮＡ断片を０．４５％アガロースゲル
上で分離する。Ｂｉｎｄｌにより消化されたλＤＮＡを
マーカーとして用いて、部分消化されたＤＮＡ断片のサ
イズを決定する。１５ｋｂ〜２０ｋｂの範囲の消化断片
を含有するゲル領域を切り取り、そしてｌ５ＣＯ電気泳
動濃縮器（ＩＳＣＯＧｍｂＨ）のサンプルウェルに移し
、０．ＩＴＢＨにより覆い、そしてＩＷａｔｔにて９０
分間電気溶出する。ＤＮＡ断片をクロロホルム／フェノ
ールにより抽出し、そしてエタノールで沈澱せしめる。
４ｎの部分消化されたＤＮＡ断片を水中に再懸濁し、そ
してＢｄＩにより線状化された１■のｐＵＮ１２１プラ
スミドＤ　Ｎ　Ａ　（Ｎｉｌｓｓｏｎ等（９）〕に１５
℃にて１５時間、合計容量１０６Ａ！の連結緩衝液中で
６ＵのＴ４　ＤＮＡリガーゼ（ベーリンガー、マンハイ
ム）により連結する。このアニーリング混合物のアリコ
ール１０４を２１０μｌのコンピテントＥ、コリＢＪ５
１８３細胞に加える。このコンピテント細胞は１ｌａｎ
ａｈａｎ　（Ｉ０）により記載されているようにして、
形質転換のために調製されたものである。
細胞を氷上に３０分間保持し、そして４２℃に９０秒間
加熱し、氷上に２分間置き、８００　Ｊｌｌの５ＯＣ−
培地を加え、そして細胞を３７℃にて１時間インキュベ
ートせしめる。８■／１のテトラサイクリン（シグマ）
が補充されたＬＢ−培地を含有するｌＱｃｍの寒天プレ
ート上に細胞を拡げる。
プレートを３７℃にて１６時間インキュベートする。約
６０００個の形質転換されたコロニーを得、それらのテ
トラサイクリン耐性により特徴付ける。
効率は、１　、ｗ（７）ｐＵＮ１２１　ＤＮＡ当り約１
２０００〜２００００個のテトラサイクリン耐性コロニ
ーである。
１１個の無作為に選択された緩衝クローンのプラスミド
分析は１０ｋｂの平均ＤＮＡ挿入部を示す。
ライブラリー中のＡ、ニガーのゲノム（４，５Ｘ１０’
ｂｐ）をほとんど４倍代表するように、１５３６０個の
テトラサイクリン耐性コロニーを拾い上げ、そして個別
にミクロタイター皿のウェル中８■／ｉ！のテトラサイ
クリンを補充されたＬＢ−培地中で一夜増殖せしめる。
インキュベーションの後、グリセロールを５０％（Ｖ／
Ｖ）となるように加え、そしてミクロタイター皿を一７
０℃にて貯蔵する。
例２．２に記載したようにして得られたＤＮＡライブラ
リーからペクチンリアーゼ■遺伝子を単離するため、１
５３６０個の選択された形質転換Ｅ、コ１ＪＢＪ５１８
３細胞からのフィルターレプリカをＧｅｒｇｅｎ等（Ｉ
１）により記載されている方法に従って作る。
細胞をミクロタイター皿から、８に／ｊ！のテトラサイ
クリンを補充した寒天プレートにスタンプを用いて移し
、そして３７℃にて一夜増殖せしめる。
便利には、切断したワットマン５４１濾紙（Ｉ９２個の
クローン当り１１４Ｘ　１７５ｍｍ）をコロニーの上に
置く。３７℃にて２時間の後、２５０■／Ｍ１のクロラ
ムフェニコール（シグマ、セントルイス、米国）を含有
するＬＢプレートにフィルターを移し、そして３７℃に
て一夜インキユベートする。フィルターを０．５　Ｍ　
　ＮａＯＨ中で２回、０．５　Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｊｌ
（ｐＨ７，４）中で２回、４＝４ＳＳＣ中で２回洗浄し
、そして空気乾燥する。フィルターレプリカを幾つかの
ハイブリダイゼーション実験のために使用することがで
き、それぞれ上記の洗浄段階の後に行う。
■１１　第１ゴヌクレオ　′°８Ａ　の４例２．２にお
いて記載したようにして得られたＡ。
ニガーのＤＮＡライブラリーをスクリーニングするため
のオリゴヌクレオチドを例１．１及び１．３において決
定されたアミノ酸配列に対応してホスホラミダイト法Ｃ
Ｍ、Ｈ，Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ（Ｉ２）　）を用いて、ア
プライド・バイオシステム（モデル３８０Ｂ）オリゴヌ
クレオチド合成機により合成する。
以下余白 ｍ　　アスペルギルス・ニガーのベクチンニペクチンリ
アーゼ■蛋白質のＮ−末端をコードするオリゴヌクレオ
チドを、例１．１において決定されたそのアミノ酸組成
に関して合成する。遺伝的縮重のため、すべての可能性
を包含するためには２５６のオリゴヌクレオチドが必要
である。
技術的理由で混合物中のヌクレオチドの数を減少せしめ
る必要があるため、オリゴヌクレオチドの２つの別々の
混合物を化学合成する０両者は１２８種類の異るオリゴ
ヌクレオチドを含有し、それぞれアミノ酸配列Ｔ＆　　
Ｐ　　Ｅ　　Ｇ　　Ｆ　　Ａｌｌをコードする鎖に対し
て相補的である。次のように、これらを混合物２０１４
及び２０１５と称し、そして次のオリゴヌクレオチドか
ら成る。
混合物２０１４　３°ＴＧＲＩ　ＧＧＲＩ　ＣＴＲ１Ｃ
ＣＲ：ｌ　ＡＡＲ，ＣＧ５′混合物２０１５　３’ＴＧ
ＲＩ　ＧＧＲＩ　ＣＴＲｆｆ１　ＣＣＲｔＡＡＲ３ＣＧ
５’式中、Ｒ３はＡ、Ｃ，Ｇ又はＴであり、Ｒ２はＣ又
はＴであり、そしてＲ３はＡ又はＧである。
五１１ムＣＮＢｒで　”されたペクチンリアーゼ■底 ＣＮＢｒで分解されたペクチンリアーゼＩのＣ−末端断
片のＮ−末端部分をコードするオリゴヌクレオチドを、
例１．３において決定したそのアミノ酸組成に関して合
成する。アミノ酸配列Ｎ１５ａ　　　Ｉ−Ｉ　−Ｉ　　
Ｑ＋！ａをコードする鎖の相補鎖である１０８種類のオ
リゴヌクレオチドの混合物を合成し、これを次のオリゴ
ヌクレオチドから成る。
混合物２０６０　５’ＡＡＲＩ　ＡＴＲｌ　ＡＴＲｌ　
ＡＴＲｔ　ＣＡＲａ　Ａ　３゜式中、Ｒ，はＣ又はＴで
あり、Ｒ２はＡ、Ｔ又はＣであり、そしてＲ１はＡ又は
Ｇである。
例３．２．１及び３．２．２の６７　ｐａ＋ｏｌずつの
各オリゴヌクレオチド混合物２０１４　、２０１５、及
び２０６０を、５０　ｐｍｏｆのｒｙ”Ｐ）ＡＴＰ　（
アメルシャム、パツキンガムシャー、イングランド、５
０００Ｃｉ／ｒ＊ｒｎｏｌ　）を用いて５′−ラベル化
する。５００μｌのキナーゼ緩衝液中１５０ユニツトの
Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼにューイングランド・ユ
クレアー）と共に３７℃にてインキュベーションを行う
。
オリゴヌクレオチドへの放射性ラベル化ＡＴＰの連結反
応は、反応混合物のアリコートを２０％ポリアクリルア
ミドゲル泳動せしめ、次にオートラジオグラフィーを行
うことにより検出する。
例３．２．１の放射性ラベルされたオリゴヌクレオチド
混合物２０１４及び２０１５とのハイブリダイゼーシヨ
ンにより遺伝子ライブラリーのスクリーニングを行う、
遺伝子ライブラリー（例３．１）の２０株のフィルター
レブニカのバッチを６ＸＮＥＴ中で湿し、そして２００
−の６ＸＮＥＴ　、　ｌ　Ｘｓ　ｓ−デンハート、０．
１％ＳＤＳ中で、４９．３℃にて４時間ブレハイブリダ
イズせしめる。次に、６７　ｐｍｏｆｆｉの放射性ラベ
ルされたオリゴヌクレオチド混合物２ｏ１４を加え、そ
してハイブリダイゼーシヨンを４９．３℃にて一夜行う
、放射性ラベルされたオリゴヌクレオチド混合物２０１
５を用いて同じ方法を実施する。フィルターを２　Ｘ５
ＳＣ、０，１％ＳＯＳ中で室温にて２回５分間、２　Ｘ
５ＳＣ、０，１％ＳＤＳ中で４９．３℃にて２回１時間
、そしてＱ、　２　Ｘ５ＳＣ、０，５％ＳＯＳ中で４９
．３℃にて１回２時間洗浄する。濾紙を空気乾燥し、そ
してコダックＸ−ｏＩｌａｔ　５Ｏ２８２フイルムを用
いて３日間オートラジオグラフ処理する。
比較的強いハイブリダイゼーション応答を示すクローン
が、オリゴヌクレオチド混合物２０１４を用いて３３個
、及びオリゴヌクレオチド２０１５を用いて３９個見出
された。サブライブラリーを確立するため、７２個のク
ローンを新たなミクロタイター皿で増殖せしめ、そして
例３．１に記載したようにしてワットマン５４１フイル
ターに移す。このサブライブラリーの２枚フィルターレ
プリカを個別に両プローブとハイブリダイズせしめ、洗
浄し、そしてオートラジオグラフィーにかける。オリゴ
ヌクレオチド２０１４混合物とのハイブリダイゼーシヨ
ンにより得られたクローンのみがオリゴヌクレオチド２
０１４混合物とハイブリダイズする。同様に、オリゴヌ
クレオチド混合物２０１５とのハイブリダイゼーション
により得られたクローンのみがオリゴヌクレオチド２０
１５混合物とハイブリダイズする。
例３．３において得られたサブライブラリー（７２クロ
ーン）のフィルターレプリカヲ６ｘＮＥＴ中で湿し、そ
して１５Ｈ１の６ＸＮＥＴ、ｌＸ５ｓ−デンハート、０
．１％ＳＤＳ中３２℃にて４時間プレハイブリダイズせ
しめる。例３．２．３中に記載したようにして放射性ラ
ベルした８　ｐｍｏｌのオリゴヌクレオチド混合物２０
６０を添加し、そして３２℃にて一夜パイプリダイゼー
シッンを行う。フィルターを５分間ずつ２回、２　Ｘ５
ＳＣ、０，１％ＳＯ３中で室温にて；１時間ずつ２回２
　Ｘ５ＳＣ、０，１％ＳＯＳ中で３２℃にて；そして２
時間にわたり１回０．２ｘｓｓｃ　、　ｏ、　ｓ％ＳＯ
Ｓ中で３２℃にて、それぞれ洗浄する。フィルターを空
気乾燥し、そしてコダッりＸ−ｏｍａｔ　５Ｏ２８２フ
イルムを用いて３日間オートラジオグラフ処理する。３
個の陽性クローンが見出され、すべてが例９に記載する
ように２０１４−プローブとハイブリダイズする群に属
し、１つのクローンをＥ、コリＢＪ５１８３／　ｐＣＧ
３Ｂ１１　と命名する（３Ｂ１１と略す）。
例３．４に記載したようにして得られたクローン３Ｂ１
１の大量プラスミド調製（Ｉ４）を行う、　ｐＣＧ３Ｂ
１１と称する対応するプラスミドを、ＨｉｎｄＩ［［。
ＥｃｏＲＩ　及ヒＰｓｔ　Ｉ　　（すべてベーリンガー
、マンハイム）による完全消化、並びに１％アガロース
ゲル上での電気泳動分離により分析する（第１図）。
ＩＩ４のプラスミドｐＧｃ３Ｂ１１（例４）を１８ユニ
ツトの制限エンドヌクレアーゼ−５ａｕ３Ａ　Ｉ　　（
ベーリンガー、マンハイム）により２０４の１０　ｍｍ
ｏ１／１　　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、　　７５　　ｔａｍｏ
ｌ　／　ｌ　　ＮａＣ１、１０ｎ＋ｍｏｆｆｉ／　Ｉ　
ＭｇＣ１ｚ（ｐＨ７，２）中で３７℃にて１時間完全消
化する。ＥＤＴＡを最終濃度２０ｍＭに添加することに
より反応を停止する。ＤＮＡ断片をフェノール／クロロ
ホルムで抽出し、エタノールで沈澱せしめ、そして２０
ｍのＴＥ緩衝液中に溶解する。
１１００ｎの５ａｕ３Ａ　Ｉ消化ＤＮＡを、ＢａｍＨＩ
（ベーリンガー、マンハイム）消化により線状化された
２０ｍｇのＭ１３ｎ＋ｐ８ファージＤ　Ｎ　Ａ　（Ｉ５
）に連結する。
アメルシャムハンドブック（Ｉ６）２５頁に従って５０
ｍｇＭｃａ（Ｊ、中にコンピテントＥ、コリＪＭＩＯＩ
細胞を調製する。コンピテントＪＭＩＯＩ細胞のアリコ
ート０．３−を１５１＃ｌの氷上の１５−無菌培養チュ
ーブに移す。５Ｉの連結されたファージＤＮＡを各チュ
ーブに加える。混合物を氷上に４０分間置く。
細胞を３分間４２℃にヒートショック処理し、そしてチ
ューブを水浴にもどす、各チューブについて、次の混合
物を調製する：４０１１１のジメチルホルムアミド中Ｉ
ＰＴＧ　１００＋ｓＭ、４０　ｔｄ　Ｘ−ｇａｌ　２％
、及び新鮮な対数増殖中の培養物からのＥ、コリＪＭＩ
ＯＩ細胞２００ｄ、　　２７０ｄのこの混合物を、ヒー
トショックを受けたＥ、コリＪＭＩＯＩ細胞を収容する
各チューブに加える。３−の溶融した寒天（４２℃に維
持）を各チューブに加え、そしてチューブを寒天プレー
ト上に注加する。プレートを逆にして３７℃にて一夜イ
ンキエベートする。
組換ファージＤＮＡにより形質転換されたＥ。
コリＪＭＩＯＩは例５．１のＸ−ｇａｌ含有する寒天プ
レート上で白色のプラークを示し、その内の３８５個を
拾い、そして１５パの対数的に増殖中のＥ、コリＪＭＩ
ＯＩ細胞を接種した１、５−の２ＸＴＹ培養中で個別に
増殖せしめる。６時間後、３８４個の培養物をエッペン
ドルフ遠心管中で５分間遠心分離し、そしてファージ上
清を４℃にて貯蔵する。３８４個の上清からの１００　
ｄずつを、９６スロツトを有するバイオドツト（Ｂｉｏ
　Ｄｏｔ）装置（バイオラド）を用いて４株のシーンス
クリーン（Ｇｅｎｅ　５ｃｒｅｅｎ）膜にューヨーク・
ニエクレア）に移す。膜を０．５Ｍ　ＮａＯＨ、１，５
Ｍ　ＮａＣｊｌ中に５分間、そして３ＭＮａＣＪ！、Ｉ
Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｊｔ　　（ｐＨ５，６）中に５分間
浸漬し、空気中で乾燥し、そして８０℃にて２時間真空
乾燥する。最後に、４枚の膜をハイブリダイズせしめ、
例３．２．２に記載するような放射性ラベルされたオリ
ゴヌクレオチド混合物２０６０とハイブリダイズせしめ
、洗浄し、そして例３．４に記載したようにしてオート
ラジオグラフ処理する。例５．１の連結実験から１個の
陽性の組換ファージを、さらに分析するために選択し、
ｓ＋ｐ８−３Ａと命名する。
■五１１１８−３Ａフ　−ジの　１ 例５．２に記載したようにして得られたファージ■ｐ８
−３Ａを含有する上滑を用いて、アメルシャムハンドブ
ック（Ｉ６）　１８〜２７頁に記載されているようにシ
テ一本１！［ＤＮＡ及び複製形ＤＮＡ（ＲＰ−ＤＮＡ）
を調製する。アメルシャムハンドブック３０〜３５頁に
記載されているチェイン・ターミネータ−法を用いて単
鎖鋳型を配列決定する。ファージは、オリゴヌクレオチ
ドプローブ２０６０の予想されるヌクレオチド配列を５
８４〜５９９位に有する５７４ｂｐの血３ＡＩ断片を含
有することが証明される。
ファージｍｐ８−３Ａ　（例５．３）の配列決定された
ＥｃｏＲＩ制限部位を用いて２個のＢｃｏＲ１断片を同
定しそしてサブクローニングする。１つはターミネータ
−領域を含むＰＬＩ遺伝子のＣ−末端部分を含有し、そ
して他の１つはプロモーター領域を含む遺伝子のＮ−末
端の部分を含有する。次の２個のオリゴヌクレオチドを
例３．２に記載したようにして合成する。
オリゴヌクレオチド５０５２：　　５’　ＴＧＧＡＴＧ
ＡＴＧＡＴＧＴＴＧＧＡＧＡＣ３’ これは、位置６４９／６５０の中央ＥｃｏＲＩ部位の５
′側の５９７位から始まり５７７位に延びる（相補鎖）
。
オリゴヌクレオチド５０６６：　　５’　ＡＧＧＴＣＣ
ＡＧＧＡＣＡＡＣＡＣＣＴＡＣ３’ これは、中央のＥｃｏＲ１部位の３′側の１０２０位が
ら始まり、そして１０３９位に延びる。
ヌクレオチド混合物５０５２及び５０６６を例３．３に
記載したようにして放射性ラベルする。
１躍のプラスミドｐＣＧ３Ｂ１１　（例４）ＤＮＡをＥ
ｃｏＲＩ（ベーリンガー、マンハイム）にヨリ完全消化
し、そして断片を１％アガロースゲル上で分離する。Ｄ
ＮＡ断片をシーンスクリーン膜（二ニー・イングランド
・ニュクレア）に供給者により記載されている（３８３
−３８６頁）ようにしてプロットし、そしてＭａｎｉａ
ｔｉｓ等（８）３８７−３８９頁に記載されている様に
してオリゴヌクレオチド５０５２及び５ｏ６６の放射性
ラベルされたプローブとハイブリダイズせしめる。プロ
ーブ５０６６はＰＬＩ遺伝子のＣ−末端部分及びターミ
ネータ−領域を含有する３、５ｋｂＥｃｏＲ１断片とハ
イブリダイズする。プローブ５０５２は遺伝子のＮ−末
端及びプロモーター金環を含有する２、　９　ｋｂ　Ｅ
ｃｏＲＩ断片とハイブリダイズする。
以下余白 ■１ｉＣＧ３Ｂ１１のＥｃｏＲＩ　　　のＵＮ１２１へ
の例４に記載したようにして得られた４、５躍のプラス
ミドｐＣＧ３Ｂ１１　ＯＮＡを５０ニー’−７トのＥｃ
ｏＲＩ（ベーリンガー、マンハイム）と共に５０ｍの０
゜０１Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｊ！　　（ｐＨ７，５）　、
０．ＩＭ　ＮａＣ１、０，０１Ｍ　ＭｇＣｊ！ｚ　１１
１１Ｍメルカプトエタノール℃にて２時間インキュベー
トする。ＤＮＡ断片を１％アガロースゲル上で分離し、
２．９ｋｂ断片及び３、５ｋｂ断片を含有するゲルスラ
イスを例５に記載したようにして溶出し、そしてＤＮＡ
をフェノール／クロロホルムにより抽出し、そしてエタ
ノールにより沈澱せしめる．沈澱を４０１１１のＴＥ緩
衝液中に再懸濁し、そして１０１１１のこの溶液を、Ｅ
ｃｏＲＩ消化により線状化した１００ｎｇのｐＵＮ１２
１　（９）に連結する．連結は１５℃にて４時間、５ユ
ニツトのＴ４　ＤＮＡリガーゼ（ベーリンガー、マンハ
イム）を用いて３５．５ｍの２０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−Ｈ
Ｃｊ！　、　１ｍＭ　ＥＤＴ＾、５ｍＭジチオスレイト
ール、６０ｍＭ　　ＫＣｌ、５０％グリセロール（ｐＨ
　７．　６　＞中で行う。
このアニーリング混合物の１７．５ｍずつのアリコート
を２００　ｄのコンピテントＥ．コリ　ＨＢＩＯＩ細胞
に加える。この細胞はＭａｎｉａｔｉｓ等（８）　２５
０頁に記載されているようにして塩化カルシウムで処理
することにより形質転換のために調製したものである。
この混合物を氷上に３０分間保持し、４２℃に２分間加
熱し、次に１−のＳＯＣ−培地で稀釈し、そして３７℃
にて１時間インキュベートする。
２０００Ｘｇでの５分間の遠心により細胞を集める。
各細胞ペレットを６００　１１１のＳＯＣ−培地に再懸
濁し、そして８　ｑｒ　／　１のテトラサイクリンが補
充されたＬＢ−培地を含有する３枚の寒天プレート上に
拡げる．プレートを３７℃にて１６６時間インキュベー
トる。
６個の組換体ｔｅｔ”クローンのプラスミドを、各形質
転換から旧ｒｎｂｏｉｍ及びＤｏｌｙ　（Ｉ７）の方法
により単離し、そして制限分析により分析する。
ｐＣＧ３Ｂ１１の２．９ｋｂＥ匹Ｒ１断片を含有するク
ローンをさらに分析するために選択し、そしてｐＰＬ２
９−５と命名する（第２図）。ｐＣＧ３Ｂ１１の３．５
ｋｂＥ印ＲＩ断片を含有する他のクローンを選択し、そ
してｐＰＬ３５−５と命名する（第３図）。
、イクリー〕５ユ　ペクチン奮アーゼ■゛　−の配置ン
ＰＬＩ遺伝子のＮ−末端部分を含有するｐＰＬ２９−５
（例５．５）のＤＮＡ、及びＰＬＩ遺伝子のＣ−末端を
含有するｐＰＬ３５−５（例５．５）のＤＮＡを、Ｈｕ
ｍｐｈｒｅｙｓ等（Ｉ４）により記載されている方法に
より単離する。ｐＰＬ２９−５及びｐＰＬ３５−５の挿
入部の部分を適当な制限酵素により得る。断片をＭ１３
ｍｐ８及びＭ１３ｍｐ８中にサブクローニングし、そし
てＭ１３クローニング及び配列決定キット（Ｍ１５シー
ケンシングキットＮ、４５０２、アメルシャム）を用い
て供給者（Ｉ６）により示された条件下で配列決定する
。
ＰＬＩ遺伝子の完全な配列を含んで成る２、７ｋｂの上
１−　Ｎｈｅ　Ｉ断片の全配列を第４図に示す。
これは、６８８ヌクレオチドのプロモーター領域、１３
６９の残基のＰＬＩ遺伝子の構造部分、及び６６０ヌク
レオチドのターミネータ−領域を含んで成る。
アミノ酸配列分析（例１）により決定されたＰＬＩのＮ
−末端のアミノ酸配列に対応するＰＬＩの配列は、次の
シグナル配列： Ｍｌ−に−Ｙ−＾−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ａ−Ｉ−＾−Ａ−
Ｌ−Ａ−Ａ−Ｒ−Ａ−Ａ−Ａｓｙをコードする５７ヌク
レオチドにより先行される。
エクソン／イントロン−スプライス連結部の共通配列及
びイントロン内部配列（Ｂｏｅｌ　Ｅ、等（Ｉ８）二及
びＭｏｕｎｔ　Ｓ、Ｍ、　（Ｉ９）　）のコンピュータ
ーによる検索は、それぞれ６５ｂｐ、　６２ｂｐ、　６
３ｂｐ、及び５７ｂｐの長さを有する４個のイントロン
の存在を予想させる（第４図）。
ＰＬＩ遺伝子の配列はプラスミドｐＰＬ２９−５の」匹
Ｒ１−５凹Ｉ断片及びｐＰＬ３５−５の」並ＲＩ−Ｎｈ
ｅ　Ｉ断片の配列の組合せにより決定される。
インビトロ変異誘発によるＰＬＩ遺伝子（例６゜におい
て配列決定された）のシグナル配列領域への新たな上Ｈ
ｎ部位の導入をＺｏｌｌｅｒ及びＳｍ　ｉ　ｔｈ（２０
）の方法に従って行う、１９残基から成るオリゴヌクレ
オチドを例３．２に記載した方法により合成する。この
オリゴヌクレオチドはＰＬＩシグナル配列のＣ−末端部
分をコードするＤＮＡ配列（位置３６−５４）に対して
相補的であるが、Ｃ／Ｇ転換を導くヌクレオチド１０　
（４５）は例外である（変異系プライマー）。この変異
系プライマーの交換されたヌクレオチド４５を＊印で示
す。
ＰＬＩシグナル配列の部分５’　ＣＣＴＣＧＣＴＧＣＣ
ＣＧＣＧＣＣＧＣＴ３”・　　　　　・　　　　　　本
　　　　　　−昏変異系プライ？−５１５６５’　ＣＣ
ＴＣＧＣＴＧＣＧＣＧＣＧＣＣＧＣＴ３’インビトロ変
異誘発のため、２００ｐｍｏｌのオリゴヌクレオチド５
１５６を２０　ｎｓ＋ｏｊ！のｒＡＴＰにより５′−リ
ン酸化する。この反応は、３７℃にて１時間、１０ユニ
ツトのＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ベーリンガー、
マンハイム）を用いて２０ｄのキナーゼ緩衝液中で行う
。６５℃に１０分間加熱することにより反応を停止せし
める。
ｔｍ　　　　旧３ｍ　８−ＰＬ　Ｓａｌ　　−ＢｃｏＲ
Ｉ）ＤＮＡの第一のインビトロ変異誘発は、ＰＬＩ遺伝
子のプロモーターの１１７ヌクレオチド及びＮ−末端部
分を含有するプラスミドｐＰＬ２９−５　（７）　０．
８　ｋｂ　Ｓａｔ　１−　ＥｃｏＲＩ断片を含有する例
６において得られたファージＭ１３ｍｐ８−ＰＬ（Ｓａ
ｌ　Ｉ　−ＥｃｏＲＩ　）がらの単鎖ＤＮＡに関するｅ
　１　ｐｍｏｊ２の単鎖Ｍ１３ａ＋ｐ８−　ＰＬＬ１２
−　ＥｃｏＲＩ　）ＤＮＡを２０　ｐｒ＠ｏＪの変異系
プライマー５１５６　（例７．１）及び１０　ｐｍｏｌ
のユニバーサルＭ１３シーケンシングプライマー（Ｎ、
４５１１、アメルシャム）と、１０．５ＩＪ１（７）０
．０２Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｊ！　（ｐＨ７，５）　、０
．０１Ｍ　ＭｇＣｊｚ　、０．０５Ｍ　ＮａＣ１，０，
００１Ｍ　ＤＴＴ中で混合する。この混合物を迅速に５
６℃に加熱し、そして室温まで徐々に冷却する。１ｉ１
！の０．２　Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣ＃　（ｐＨ７，５）、
０、１　Ｍ　ＭｇｃＩ１２．０．０１Ｍ　ＤＴＴ、　４
１１１２ｍＭ　ｄＮＴＰ　。
１　ｔｒｉ　１０ｄ　ＡＴＰを混合物に加え、３ユニツ
トのＴ４　ＤＮＡリガーゼ（ベーリンガー、マンハイム
）及び２ユニツトのＤＮＡホリメラーゼ１　（クレノウ
断片、アメルシャム）を加え、そして重合反応を１５℃
にて１５分間行う０重合反応混合物の３種類の稀釈物（
Ｉ：２０　、１：１００　、及び１：５００　＞を低Ｔ
Ｅ援衝液中に調製する。各稀釈物からのＩＩ及び５Ｊ１
１を、例５．１に記載した方法により形質転換のために
調製した３００ｊ１１のコンピテントＥ、コリＪｌ’１
１０１細胞に個々に添加する。細胞をＸ−ｇａｌプレー
ト上に注加し、そして白色プラークを形成するコロニー
を得る。１００個の白色プラークを楊枝で拾い上げ、そ
してＬＢプレートに移す、ファージＤＮＡにより形質転
換された細菌を３７℃にて一夜増殖せしめ、そして次に
例３．１に記載したようにしてワットマン５４１フイル
ターに移す、フィルターを洗浄しく例３．１）、次に６
　ＸＮＥＴ　、　Ｉ　Ｘ５ｓ−デンハート、０．１％Ｓ
ＯＳ中で６７℃にて３０分間プレハイブリダイズせしめ
るｅＳＸｓｓｃ中でフィルター当り１５　ｐｓ＋ｏｆｆ
ｉの放射性ラベル化（例３．３）オリゴヌクレオチド５
１５６との室温（例３．４）にて３０分間ハイプリダイ
ゼーシッンを行う、ハイブリダイゼーシヨンの後、フィ
ルターを５Ｘｓｓｃ中室温にて４０秒間ずつ４回洗浄し
、そして空気乾燥後、イルフォード（Ｉｌｆｏｒｄ）ス
クリーンを用いてコダックＸＡＲ−５フィルムに１時間
暴露する。このフィルターをさらにＱＸｓｓｃ中で７２
℃（変異系プライマー５１５６のＴｍは７０℃である）
にて５分間洗浄し、乾燥し、そしてコダックＸＡＲ−５
フィルムに一夜暴露する。
第２の洗浄段階の後に陽性シグナルを生じさせるコロニ
ーをもとのＬＢプレートから拾い上げ、ｌａｄのＬＢ培
地に懸濁し、そして７０℃にて２０分間加熱する。この
バクテリオファージ溶液を１：１０　、　ｔ：ｉ、ｏｏ
ｏ　、及び１：１００．ＯＯＯに稀釈し、そして１０１
１１の各稀釈物を使用して３００Ｊ！１の対数的に増殖
中のＥ、コリＪＭＩＯＩ細胞をトランフフエクトし、そ
してＸ−ｇａｌプレート上に注加する。１：１００．０
００稀釈の６個のプラークを、１５ｍの対数的に増殖中
のＥ、コリＪＭＩＯＩ細胞を含有する１、５−の２×Ｔ
Ｖに、別々に楊枝を使って移し、そして３７℃にて６時
間増殖せしめる。培養物をエフベンドルフ遠心管中で５
分間遠心分離し、そして上清を４℃にて貯蔵しくファー
ジストック）、そして細胞ペレットを使用してＢｉｒｎ
ｂｏｔ＋ｓ及びＤｏｌｙ　（Ｉ７）の方法に従ってＲＦ
の調製を行う＊　　Ｂｓ５ＨＩＩによる制限分析の後、
ＰＬＩ　　Ｓａｌ　Ｉ　−ＢｃｏＲＩ断片中に新たなり
５ｓＨＯ部位を担持する１個の変異体ファージをさらに
実験するために選択し、そして（Ｍ１３ｓ＋ｐ１８−Ｐ
Ｌ（Ｓａｌ　Ｉ−血Ｒ１ル鉦ＨＩＩ　／ＢＥ５）と命名
する。
例６．において得られた、ファージ Ｍ１３ｗｐ１Ｂ−ＰＬ　（Ｓｐｅ　１−　ＥｃｏＲＩ　
）からの単鎖ＤＮＡを用いて第二のインビトロ変異誘発
実験を行う。
この組換ファージはプラスミドｐＰＬ２９−５の１．４
　ｋｂ上１−　Ｆ、ｃｏ　ＲＩ断片、そしてそれ故プロ
モーターの６８８ヌクレチオド＋ＰＬＩ遺伝子のＮ−末
端部分を含有する。この鋳型の変異誘発は例７．２にお
いて記載した通りに行われる。
ＰＬＩ　上１−　ＪｍＲＩ挿入部中に新たなり５ｓＨＩ
Ｉ部位を有する１つのファージを４個の実験のために選
択し、そしてＭ１３＋５ｐｌＢ−ＰＬ　（血１−Ｅ並Ｒ
１）−シ惺Ｈｎ　／ＡＣ５と命名する。
■１虹　ブースミ゛ｕＢＢ５ノ゛ 取扱いを一層容易にするため、シグナル配列領域中に新
たに導入されたＢｓ５ＨＩＩ部位を含有するＰＬＩ遺伝
子のＮ−末端部分及びプロモーター領域の１３０ｂｐを
含む、例７．２に記載したようにして得られたファージ
Ｍ１３ｐ８−ＰＬ（韮■−血ＲＩ）血）Ｉ　ＩＩ　／Ｂ
Ｅ５のＢａｗｌ　Ｉ　−Ｈ匹Ｒ１断片を、第５図に示し
そして下に記載するようにしてプラスミドベクターｐＵ
Ｎ１２１　（９）中にサブクローン化する。
ファージＭ１３請ｐ８−ＰＬＣ旦ｌ−立Ｒ１ル且）（Ｉ
Ｉ／８８５の４〜のＲＦ　ＤＮＡを例５．３に従って単
離し、そして制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩ及びＥ
ｃｏＲｌ（ベーリンガー、マンハイム）によす完全消化
する。断片を１％アガロースゲル上で分離し、そしてプ
ロモーターの１１７ｂｐ及びＰＬＩ遺伝子のＮ−末端部
分から成る０、８ｋｂＢ憇Ｈ１−ＥｃｏＲＩ断片を含有
するゲルスライスを例２．２に記載したようにして電気
溶出する。ＤＮＡをフェノール／クロロホルムで抽出し
、そしてエタノールで沈澱せしめる。ＤＮＡペレットを
１０１１１の水中に再懸濁する（５０ｎｇ／１ｌｌ）。
２趨のｐｔｌＮ１２１を一彫Ｊ２Ｉ及び」並ＲＩ（ベー
リンガー、マンハイムによりＢｃｌ　Ｉ及ヒＥｃｏＲＩ
で完全消化する。断片を１％アガロースゲル上で分離し
、そして４．Ｏｋｂ断片を例２．２に記載したようにし
て電気溶出する。フェノール／クロロホルム抽出及びエ
タノール沈澱の後、ＤＮＡを１８１Ｊ１の水に溶解する
（Ｉ００ｎｇ／　ｐｌ　）　。
Ｂｓ５Ｈｎ部位を含んで成る」鰭Ｈ１−Ｅ並ＲＩ断片３
００ｎｇをＢｃｌ　Ｉ　／　ＥｃｏＲＩで切断されたＳ
ＯＯｎｇのｐＵＮ１２１　ＤＮＡに連結する。この連結
は１５℃にて４時間、４００ユニツトの７４　ＤＮＡリ
ガーゼ（バイオラプス）を用いて、２０４の５０ａ＋Ｍ
　Ｔｒｉｓ−ＨＣｊｌ（ｐＨ７，８）　、１０ａ＋Ｍ　
ＭｇＣ１ｔ　　、　２０ｍＭジチオスレイトール、１．
　ＯｍＭ　ＡＴＰ中で行う。１０１１１の連結混合物を
使用して１００　ｄのコンピテントＥ、コリＨＢＩＯＩ
細胞（８）を形質転換する。細胞を８■／ｌのテトラサ
イクリン（シグマ）を含有するＬＢプレート上にプレー
トし、そして３７℃にて一夜インキエベートする。
Ｂｉｒｎｂｏｉｍ及びＤｏｌｙ（Ｉ７）の方法に従って
、１２個のｔｅｒ’コロニーからプラスミドを調製し、
そして第５図に示す望ましい制限パターンを有する１つ
のプラスミドをｐＵＢＢ　５と命名し、そしてさらに分
析するために使用する。
デスルファトヒルジン遺伝子（第６図）の前に」■Ｉ制
限部位を導入するため、８ｎのプラスミドｐＭＬ３１０
　ＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼ」姐Ｒ１により完全
消化する。開裂されたＤＮＡをフェノール／クロロホル
ムで抽出し、そしてエタノールで沈澱せしめる。５′突
出末端を除去するため、４Ｊ１ｇのｐＭＬ３１０／　Ｅ
ｃｏＲＩ　　ＤＮＡを１００Ｊｚ１の１５Ｏｎ＋ＭＮａ
ＣＩｌ　％　ｌｄ　Ｚｎ５Ｏ，，３０ｍＭ酢酸ナトリウ
ム（ｐＨ４，６）及び２０Ｕ／−のヌクレアーゼＳ＋（
シグマ）中で３７℃にて４５分間消化する。
ＤＮＡをフェノール／クロロホルムで抽出し、そしてエ
タノールで沈澱せしめる。　ＤＮＡ（ｐＭＬ３１０／Ｅ
ｃｏＲＩ　／Ｓ＋）を１００１１１の５０ａｉＭ　Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣＪ　（ｐＨ８，０）中に再懸濁し、そしてウ
シ腸からのアルカリ性ホスファターゼ（ＣＩＡＰ、オル
トホスホリッターモノエステルホスホリラーゼ、［ＩＣ
３，１，３，１，べ−リンガ−）２ユニツトと共に３７
℃にて１時間インキュベートする。酸素を６５℃にて１
．５時間インキュベートするｅ　　ＮａＣ１濃度を１５
０ｍＭに調整する。脱リン酸化されたＤＮＡ（ｐＭＬ３
１０／　Ｅ並ＲＩ／Ｓ、／ＣＩＡＰ）を、低塩緩衝液（
Ｉ５０＋＋Ｍ　ＮａＣｆｆ１　、１０＋＋）’ＩＴｒｉ
ｓ−ＨＣ１（ｐＨ８，０）　、１ｍＭ　ＥＤＴＡ）中Ｄ
Ｅ５２　（ワットマン）イオン交換カラムへの吸着によ
り精製する。高温緩衝液（Ｉ，５Ｍ　Ｎａｃｌ　％　１
０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｊｌ（ｐＨ８，０）　、ｌｄ　
ＥＤＴＡ）により溶出を行う、ＤＮＡをエタノールで沈
澱せしめ、そして０．８■／ｄの濃度で水中に再懸濁す
る。
ＵＬＬ１部位の導入のため、次の式： ％式％ で表わされるオリゴヌクレオチドをホスホトリエステル
法（２１）により合成する。オリゴヌクレオチドの配列
は制限エンドヌクレアーゼ血１のための認識部位−ＧＡ
ＣＧＣ−を含有し自己相補的である。
２つの単鎖のアニーリングが２本鎖ＤＮＡリンカ−を導
（。
１．２罐の合成単鎖オリゴデオキシヌクレオチドを１０
１１１の６０＋ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７，５）
　、１０ｍＭＭｇＣＩ　、　　、５ｎＭ　　ロＴＴ　　
、３０μｃｉの　〔γ−３”Ｐ）　　ＡＴＰ（３０００
Ｃｉ　・５ｕｓｏｊ！−’　、アメルシャム）及び６ユ
ニツトのＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ベーリンガー
）中で３７℃にて３０分間リン酸化し、次に０、５　ｍ
Ｗ　ＡＴＰの存在下で３７℃にて１５分間追跡する。混
合物を７５℃にてさらに１０分間インキュベートして酵
素を不活性化せしめる。混合物を室温に冷却してアニー
リングを行う。
０、６　ｎ　（Ｉ７０ｐｗ＋ｏｌ）の３２Ｐ−ラベル化
リンカ−ＤＮＡを２．４　ｇ　（Ｉ，７５ｐｔａｏｌ末
端）のＧ）ＭＬ３１０／」匹ＲＩ　／Ｓｉ／ＣＩＡＰと
混合し、そして２０パの６０５Ｍ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣｊ
ｌ　　　（ｐ）１７．５）　　、　１０ｍＭ　　ＭｇＣ
１ｚ　　、５ｍＭＤＴＴ　、　３．５ｍＭ　ＡＴＰ、　
８００　：Ｌニア　）（７）Ｔ４　ＤＮＡリガーゼ（バ
イオラプス）中で連結する。リガーゼを８５℃にて１０
分間不活性化し、そして１０ｍＭＥＤＴＡ　（ｐＨ７，
５）　、３００ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ６，０）及び
０．５４容量のインプロパツールの存在下でのＤＮＡの
沈澱により過剰のリンカ−分子を除去する。室温にて３
０分間の後、ＤＮＡをベレット化し、４５Ｉｌ！の連結
混合物（前記）中に再懸濁し、そして１５℃にて６時間
連結して環状ＤＮＡを形成せしめる。
連結混合物の１　ｐｌ及び３ＩＪＩのアリコートを１０
０４のカルシウム処理された形質転換コンピテントＥ、
コリＨＢＩＯＩ細胞（Ｄ、　Ｈａｎａｈａｎ　（Ｉ０）
の方法に従って調製〕に加える。細胞を３０分間氷上に
置き、次に４２℃にて３分間インキュベートし、氷上で
２分間冷却し、そして次に４００　ＪのＳＯＣ培地中で
３７℃にて１時間インキュベートする。細胞を１００１
１１のＳＯＣ培地中に濃縮し、それぞれを５０ｎ／ｄの
アンピシリンを含有するＬＢ寒天プレート上にプレート
し、そして３７℃にて一夜増殖せしめる。
１２個の形質転換されたａｍｐ”コロニーを単離し、そ
して１０（Ｊｕｇ／ｍ１のアンピシリンを含有するＬＢ
培地中で別々に増殖せしめる。プラスミドＤＮＡをり、
Ｓ、Ｈｏ１ａ＋ｅｓ等（２２）の方法に従って調製する
。ヒルジンのコード鎖にハイブリダイズする単鎖ＤＮＡ
断片をプライマーとして用いてＤＮＡの配列を決定する
ことにより、合成オリゴヌクレオチドリンカーの存在を
確認する。ヒルジン遺伝子の前の正しい位置にリンカ−
ＤＮＡを含有する１つのクローンをｐＭＬ３１０Ｌと称
する。
０．２２ｋｂ血Ｉ　−ＢａｍＨＩデスルファトヒルジン
遺伝子の単離のため、４０１ｒｇのプラスミドｐＭＬ３
１０Ｌを制限エンドヌクレアーゼＰｖｕ　Ｉ及び血Ｈ１
（ベーリンガー）により、１５０４の０、ＯＩＭ　Ｔｒ
ｉｓ−Ｈ（Ｊ　（ｐＨ７，５）　、０．１　Ｍ　ＮａＣ
１。
０、ＯＩＭ　ＭｇＣＪｚ　、１ｍＭ　　２−メルカプト
エタノール中で３７℃にて２時間、完全消化する。断片
を１％アガロースゲル上で分離し、そして０，８４ｋｂ
Ｐｖｕ　１−　ＢａｍＨ１を含有するゲルスライスを例
５に記載したようにして電気溶出する。フェノール／ク
ロロホルム抽出及びエタノール沈澱の後、ＤＮＡを２０
バの血！−緩衝液に再懸濁し、そして制限酵素血Ｉ（バ
イオラプス）により完全消化する。断片を２％アガロー
スゲル上で分離し、そして０．２２ｋｂ」１１−血ＨＩ
断片を含有するゲルスライスを前記のようにして溶出す
る。フェノール／クロロホルム抽出及びエタノール沈澱
の後、断片を５５Ｊｌ！の無菌水（０，１ｐｍｏｆｆ　
／１１！＞に再懸濁する。
ＰＬＩ遺伝子のシグナル配列（例７．２．）コード領域
のＵｍＨｍ部位とデスルファトヒルジン遺伝子（例７．
５）の血■部位とを連絡するためのリンカ−を得るため
、２種類のオリゴヌクレオチドを例３．２に記載したよ
うにして合成する。
以下余白 ＰＬＩシグナル配列　　　　　　ｉ　デスルファトヒル
ジンのＩ　Ｎ−末端アミノ酸 ＡＬＡ　ＡＬＡ　ＬＥυＡＬＡ　ＡＬＡ　ＡＲＧ　ＡＬ
Ａ　ＡＬＡ　ＡＬＡ　ｉ　ＶＡＬ　ＶＡＬ５’　　　　
　　　　３”： αＥ　ＧＣＣＣＴＣＧＣｒ　Ｇｃｇ　ｃｇｃ　ｇｅｅ　
ｇｃｔ　ｇｃｔ　’、　ＧＴｒ　Ｇ貫オリゴヌクレオチ
ド５１７２ｓｓＨＵ ３００ｐｍｏｆの各オリゴヌクレオチドを別々に４００
ｐＩＩｏｎ＋のｒＡＴＰ及び１０ユニツトのＴ４ポリヌ
クレオチドキナーゼ（二ニー・イングランド・ヌクレア
）を用いて、１５Ｊ１１の５０ａ＋Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣ
ｊ２　　ＣｐＨ７，８）、１０ｍＭ　Ｍｇ（ｌ　ｚ　、
２０ｍＭジチオスレイトール、１．０ｍＭＡＴＰ　、　
５０ｇ／ａｄ　ＢＳＡ中でキナーゼ処理する。両方のキ
ナーゼ処理されたオリゴヌクレオチドを１：１の比率で
混合し、９５℃に加熱し、そしてアニーリングのために
徐々に室温に冷却する。アニールされたリンカ−を−２
０℃にて貯蔵する。
！ＬＬ−ＬＬ　　此」す」（社）１戊 ＰＬＩの縮小されたプロモーターを含んで成るデスルフ
ァトヒルジン発現ベクター（第７図）を造成するため、
７ｔｔｇのｐＵＢＥ５　ＤＮＡ　（例７．４）を制限エ
ンドヌクレアーゼＢｓ５ＨＩ［（ベーリンガー）により
完全消化し、フェノール／クロロホルムにより抽出し、
そしてエタノールにより沈澱せしめる。ＤＮＡ　（Ｉ，
９ｐｍｏｌ）をｉｏｙの無菌水に再懸濁する。３００ｐ
ｍｏＪのアニールされたリンカ−５１７２１５１７３（
例７．６）を、６０Ｉ１１の５ｔＭ　Ｔｒｉｓ−Ｈ（Ｊ
（ｐＨ７，８）　、１０ｍＭ　ＭｇＣ１ｔ　、２０ｍＭ
ジチオスレイトール、１．０１＾ＴＰ、　５０珂／−の
ＢＳＡ中４００ユニットのＴ４リガーゼ（バイオラプス
）を用いて上ＨＩＥにより切断された１、９　ｐｍｏｎ
のｐＵＢＥ５に連結する。この連結は１５℃にて１５時
間行う。
８５℃にて１０分間加熱することによりリガーゼを不活
性化する。緩衝液を０．ＯＩＭ　Ｔｒｔｓ−１１Ｃ１（
ｐＨ８，０）　、０．１Ｍ　ＮａＣｊ！　、Ｏ，ＯＯＭ
　ＭｇＣＡｔ　、　１ｍＭ２−メルカプトエタノールに
調整する。３６ユニツトのＢａｍＨＩ（ベーリンガー）
を加え、そして消化を３７℃にて２時間行う、断片を１
％アガロースゲル上で分離し、そして３．４　ｋｂ　Ｂ
ａｍＨＩ　−（Ｂｓｓ　ＨＩｆ　）　」ｌｕ−リンカ−
断片をゲルスライスの電気溶出により単離し、次にフェ
ノール／クロロホルム抽出、及びエタノール沈澱を行う
。
ＤＮＡを１４１１１の無菌水中に０．１　ｐｍｏｊ！　
／ｌｄの濃度に再懸濁する。０．２ｐｍｏｌの０．２２
ｋｂデスルフアトヒルジン」■Ｉ　−Ｂａｎ　ＨＩ断片
を０．１ｐｍｏｌの消化されたｐＵＢＥ５に連結する。
連結は１５℃にて１５時間、４００ユニツトの７４　Ｄ
ＮＡリガーゼ（バイオラプス）を用いてＩＯＪの５Ｏｎ
＋Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７，８）　、１０ｍＭ　
ＭｇＣｊ！、　、２抛ｈジチオスレイトール、１、　Ｏ
ｍＭ　ＡＴＰ、　５０趨／−のＢＳＡ中で行う。
２ｉ１！の連結混合物を使用して１００Ｉのコンピテン
トＥ、コリＨＢＩＯＩ細胞（８）を形質転換し、次にこ
れを５０■／ｌのアンピシリン（シグマ）を含有するＬ
Ｂｉ上にプレートする。１２個のａ＋ｍｐ”コロニーの
ＤＮＡをＢｉｒｎｂｏｉｍ及びＤｏｌｙ（Ｉ７）の方法
により調製し、そして制限分析により分析する。
１つのクローンを選択し、Ｓａｎｇｅｒ等（２３）のジ
デオキシ・チェイン・ターミネータ−法により配列を分
析する。望ましい制限パターン及びＰＬＩ−シグナル配
列−デスルファトヒルジン連結内で正しい配列を示すク
ローンを単離し、そしてｐＬ）ＩＫ　３と命名する。
側ユＪ４　几μｊ」（社）１底 ＰＨ１遺伝子の完全なプロモーター配列を含んで成るデ
スルファトヒルジン発現ベクターを造成するため、ファ
ージＭ１３ｍｐｌＢ−ＰＬ困肛Ｉ−ＥｃｏＲＩ　）　　
Ｂｓ５Ｈ■／ＡＣ５（例３．３）の１０．３ａｇのＲＦ
　ＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼＢｓ５ＨＩＩ（べ一
リンガー）により完全消化し、フェノール／クロロホル
ムで抽出し、エタノールで沈澱せしめ、そして１Ｏ１１
！の無菌水中に１．９　ｐｍｏｌの濃度で再懸濁する。
３００　　ｐｍｏｇのアニールされたリンカ−５１７２
１５１７６（前記参照のこと）を、例７．７に記載した
ように、Ｂｓ５ＨＩＩにより切断された１、９．ｐｍｏ
ｊ？のファージＤＮＡに連結する。Ｔ４　ＤＮＡリガー
ゼを不活性化した後、緩衝液をＯ，ＯＩＭ　Ｔｒｔｓ−
Ｈ（Ｊ　（ｐＨ７，６）、０．０５Ｍ　ＮａＣ１，０，
ＯＩＭ　ＭｇＣ１ｔｔ　ＳＯ，０１４ＭＤＴＴに調整す
る。３６ユニツトの制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｄＩ
［［（ベーリンガー）を加え、そして３７℃にて２時間
消化を行う。断片を１％アガロースゲル上で分離し、そ
して１．４ｋｂ　Ｈｉｎｄ　ｍ　−〔上Ｈｎ）血■−リ
ンカー断片を、例２．２に記載したようにして電気溶出
により単離する。断片を１５ｍの無菌水に再懸濁して０
．１　ｐｃｓｏｌ　／　Ｉｌと濃度とする。
３ｎのプラスミドｐＢＲ３２２（２４）を、２０パの０
．０１Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　（ｐＨ７，５）　、０．
１　Ｍ　Ｎａ（Ｊ！　、　０．０１ＭＭｇＣＡ！、１ｍ
Ｍ　２−メルカプトエタノール中で制限エンドヌクレア
ーゼＢａｍＨＩ及びＨｔｎｄｌｌ（ベーリンガー、マン
ハイム）により完全消化し、そして断片を１％アガロー
スゲル上で分離する。
大４．１５ｋｂ血ｄｎｌ−Ｂ憇Ｈ１断片を例２．２に記
載したようにして溶出し、そして８ｕｌの無菌水に再懸
濁する（０．１　ｐ＋ｍｏｆ　／ｍ）。
デスルファトヒルジンの０．２　ｋｂ血１−　ＢａｎＨ
１断片０．２ｐ＋ａｏｌ及び０．２　ｐｔａｏｆｌの１
．４　ｋｂ　ｉ’Ｌ、Ｉプロモーター−シグナル配列Ｈ
ｉｎｄｌｌｌ（血ＨＩ［）ＵＥＡ！−リンカ−断片を一
旧ｎｄｕ［／勿Ｈ１で切断された０、１ｐｍｏｌのｐＢ
Ｒ３２２に１５℃にて１５時間連結する。この連結は４
００ユニツトの７４　ＤＮＡリガーゼ（バイオラプス）
を用いて１０ｍの５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｊｌ　（ｐＨ
７，８）　、１０ｍＭ　ＨｚＣｌ　！　、２０ｍＭジチ
オスレイトール、１．０　ｍＭ　ＡＴＰ、　５０ｔｒｇ
／−のＢＳＡ中で行う。ｌ１１ｔの連結混合物を用いて
１００Ｊ１１のコンピテントＥ、コリＨＢＩＯＩ細胞（
８）を形質転換する。
１２個のａｎ＋ｐ”コロニーを単離し、そしてＤＮＡを
例７．７に記載したようにして分析する。さらに実験す
るために１つのクローンを選択し、そしてｐＬＨＬ５（
第８図）と命名する。
■工ｌ　」述は１■遺底 ＰＬＩ−デスルファトヒルジン発現系へのターミネータ
−領域を得るため、プラスミドｐＰＬ３５−５の０．７
ｋｂ　Ｐｓｔｌ　−Ｎｈｅｌ断片をデスルファトヒルジ
ン遺伝子の３′側に融合せしめる（第９図に示す）。
１０躍のｐＰＬ３５−５を上旦ｔｌ　　（ベニリンガ−
）により完全消化する。ＤＮＡをフェノール／クロロホ
ルム抽出し、そしてエタノールにより沈澱せしめる。断
片を０．０３３Ｍ　　Ｔｒｉｓ−アセテート　（ｐＨ７
，９）、０．００６Ｍ酢酸カリウム、０．０１Ｍ酢酸マ
グネシウム、０．５ｍＭ　ＤＴＴ及び１１００ｎ／−の
ＢＳＡ中に再懸濁する。１０ユニツトのＴ４　ＯＮＡポ
リメラーゼ（ベーリンガー）を加え、そして反応を３７
℃にて１８０秒間行う。反応混合物を氷上に置き、２０
　ｎｔｇｏｌｌずつのｄＡＴＰ　、　ｄＣＴＰ　、　ｄ
ＧＴＰ　、　ｄＴＴＰを加え、緩衝液を上記の条件に調
整し、そして反応を３７℃にて３５分間行う。フェノー
ル／クロロホルム抽出及びエタノール沈澱の後、ＤＮＡ
を１０ｍの無菌水（Ｉ，９ｐｍｏｊ！　＝１１．４　ｐ
ｍｏｌ平滑末端）。
９００ｐｓｏｊ！のキナーゼ処理されそしてアニールさ
れた（例７．６）　　Ｂａｓ＋ＨＩ−リンカ−（バイオ
ラプス）を加え、そして連結を１５℃にて１５時間、４
００ユニツトのＴ４　ＤＮＡリガーゼ（バイオラプス）
を用いて６０１１１の５０＋ｓＭ　Ｔｒｉｓ−ＩＣ！　
（ｐ）１７．８）　、１０ｍＭＭｇＣ１ｔ　、２０ｄジ
チオスレイトール、１．　ＯｍＭ　ＡＴＰ。
５０躍／１１Ｒ１のＢＳＡ中で行う。８５℃にて１０分
間加熱することによりリガーゼを不活性化した後、緩衝
液を０．ＯＩＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｊｌ　　（ｐＨ８，０
）　０．１　Ｍ　ＮａＣｌ２　。
５ｓＭ　ＭｇＣ１ｚ　、１ｍ）’ｌ　　２−メルカプト
エタノールに調整する。２０ユニツトの制限エンドヌク
レアーゼＮｈｅｌ（バイオラプス）を加え、そして連結
を３７℃にて２時間行う、断片を１．２％アガロースゲ
ル上で分離し、そして０．７ｋｂ　Ｎｈｅｌ　−（Ｐｓ
ｔｌ）ＢａｍＨＩ断片を、例２．２に記載したようにし
て電気溶出により単離する。断片を１５Ｉｌｌの無菌水
に再懸濁し０．１　ｐｍｏｌ　／１ｄの濃度とする。
０．２ｐｍｏｆｆｉの０．７ｋｂ　Ｎｈｅｌ　−（Ｐｓ
ｔｌ）　　ＢａｍＨｌターミネータ−断片、０．２ｐｍ
ｏｊ！の１．４ｋｂ」旦ｄｌｌ［−（ＢｓｓＨＩＩ）　
　Ｈ■■プロモーター断片（例７．４）、０．２ｐ組Ｉ
の０．２ｋｂ血Ｉ−Ｂ憇Ｈｌデスルファトヒルジン断片
（例７．５）、並びに血ｄｌ［を及びＸｂａ　１により
線状化された０、１ｐｍａｌｌのｐＵｃ１８ベクター（
２５）を用いて連結を行う。
この反応は４００ユニツトのＴ４ＤＮＡリガーゼ（バイ
オラプス）を用いて１５℃にて１５時間、１０１０１１
１（７）５０　Ｔｒｉｓ−ｆｌｃｊ＋　（ｐＨ７２８）
　、１ｍＭ　ＭｇＣ７１！　、２０ｍＭジチオスレイト
ール、１．Ｏｓ＋Ｍ　ＡＴＰ、　５０ｘ／ｓｒのＢＳＡ
中で行う、２ｄの連結混合物を用いてＥ。
コリＨＢＩＯＩ細胞を形質転換する。１２個のａｓｐ”
形質転換体を例７．６に記載したようにして分析し、そ
して正しい融合配列を示すプラスミドをｐＬＨＬＴ７と
称する。
Ｎ、クラッサｄ遺伝子の部分を担持するｐＤＪＢ２（２
６）の１．　ｌｋｂ　Ｈｉｎｄ　ｍ断片３００ｎｇを、
Ｍａｎｉａｔｉｓ等（８）に従うニックトランスレーシ
ョンによす放射性ラベルする。遺伝子ライブラリー（例
３．１）のフィルターレプリカを５ｘＮＢＴ中で湿し、
そして６　ＸＮＨＴ、　ｌＸ５ｓ−デンハート、０．１
％ＳＯＳ中で５０℃にて４時間、プレハイブリダイズせ
しめる。
ニックトランスレーションされたＢｉｎｄｎ［断片を添
加しく３００ｎｇ／８０フィルター）、そして５０℃に
て１５時間ハイブリダイゼーションを行う。ハイブリダ
イゼーションの後、フィルターを４ｘｓｓｃ。
０．１％ＳＤＳ中で５分間にわたり１回、５０℃にて洗
浄する。空気中で乾燥した後、フィルターをコダックＸ
−０ａ＋ａｔ　５０２８２フイルムに３日間暴露する。
ニジエリシャ・コリ　（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ″　卵
重Ｌ）ＢＪ５１８３／ｐＣＧ５９Ｄ７（５９Ｄ７と略す
）と称する１個の強くハイブリダイズするコロニーを単
離し、そのプラスミドを大量調製する（Ｉ４）。このプ
ラスミドをｐＣＧ５９Ｄ７と称し、そして例９．２にお
ける形質転換のために使用する。
オロチジン−５′−ホスフェートデカルボキシラーゼ活
性を特異的に欠＜Ａ、ニガーＮ７５６株の変異株の選択
は、ウリジンの存在下での毒性類似体フルオロ−オロチ
ン酸（２７）に対する陽性選択により達成することがで
きる。Ａ、ニガーＮ７５６株の分生胞子３Ｘ１０６個を
、１　ｇ／ｌのアルギニン及び５０■／ｌのウリジンが
補充された最少培地プレート１〇−上に置く。胞子を短
波長ＵＶ照射（２６００人）に、０．５％の生存コロニ
ーをもたらす照射量でかける。２８℃にて２日間のイン
キュベーションの後、外側に増殖する菌糸がわずかに見
えるとき、各プレートに１０■のフルオロ−オロチン酸
を添加し、そしてさらに２〜３日間インキュベーション
を続ける。フルオロ−オロチン酸に対して耐性のコロニ
ーが、白っぽい感受性の菌糸のバックグラウンド増殖上
に濃く増殖する。変異処理された約４０．０００の生存
株から８個の変異株が単離される。これらの内、ウリジ
ンの要求を伴わないでフルオロ−オロチン酸に耐性の２
株はさらに追跡しない、これらの内６株はウリジン要求
性を有する。
２種類のフルオロ−酸耐性変異株のそれぞれの分生胞子
の混合物を完全培地に一夜増殖せしめることによりヘテ
ロカオリンが作られる。菌糸の塊を最少培地に移す、そ
れらの変異において相互に補完的な変異株は縁において
栄養要求性ヘテロカオリン菌糸の厚い増殖を示し、同一
の対立遺伝子中に変異を有する株はそうではない、　Ｎ
７５６株からの６個のウリジン要求性変異株は、Ｓ、セ
レビシェ−（２７）の場合と同様、２つの補完群に属す
る。
それぞれの群からの１つづつ、Ａｎ８及びＡｎｌＯを形
質転換のために使用する。
ｌｕ　　Ａ、　ニガーＮ７５６のつｌジン・Ａｎ８変異
株Ａｎ８及びＡｎｌＯの分生胞子を別々に、完全培地の
スラント上に２８℃にて４〜５日間増殖せしめる。Ａｎ
８及びＡｎｌＯの分子胞子２×１０１個を用いて別々に
、１　ｇ／１．のアルギニン及びウリジンを補充した最
少培地（例８．２）に接種する。
２８℃、　１ＢＯｒｐｍにて２０時間の増殖の後、ミラ
クロス（Ｍｉｒａｃｌｏｔｈ）を通して濾過することに
より菌糸を収得し、１０ｒｄの０．８　Ｍ　　ＫＣＩＩ
　、　５０ｍＭ　ＣａＣ１２ｚにより２回洗浄し、そし
て２０ｄの０．８Ｍ　　ＫＧｇ。
５０ｍＭ　ＣａＣ１ｚ＋　０．５ｕ／−ノボチーム（Ｎ
ｏｖｏｚｙｍ）２３４（ノボ・インダストリーズ）中に
再懸濁する。この混合物を振とう水浴（３０℃、　５０
ｒｐｍ）中で、プロトプラストの最大放出が顕微鏡観察
され得るまで（９０〜１２０分間）インキュベートする
。漏斗中ガラス綿栓を通してプロトプラスト懸濁液を濾
過することにより菌糸断片を除去する。室温での穏和な
遠心分離（Ｉ０分間、２０００ｒｐｍ）によりプロトプ
ラストをベレット化し、１０−の０．８Ｍ　　ＫＣｌ。
５０＋ａＭ　ＣａＣ１ｚにより２回洗浄する。最後にプ
ロトプラストを２００〜５００ｐｌの０．８　Ｍ　　Ｍ
ＣＩ　、　５０ｍＭＣａＣｊ！　ｚに再懸濁してｌＸｌ
０”／−の濃度にする。
形質転換のため、プロトプラスト懸濁液（Ａｎ　８及び
ＡｎｌＯ）の２００Ｉのアリコートを別々に、１０趨／
２０ＩのｐＣＧ５９Ｄ７　ＤＮＡ、　５０ｍのＰ　ＣＴ
　［１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　（ｐＨ７，５）　、
５０＋ａＭ　ＣａＣ１ｚ　、２５％ＰＥＧ６０００）か
ら成る溶液と共にインキュベートする。このインキュベ
ーション混合物を２０分間氷上に保持し、さらに２．０
−のＰＣＴを添加し、そして混合物を室温にてさらに５
分間インキュベートする。４艷の０．８　Ｍ　　ＫＣＩ
Ｉ　、　５０ｄ　ＣａＣｌ　ｔを添加し、そしてこれら
の最終形質転換溶液の１−のアリコートを、０、８　Ｍ
　　ＫＣＩＩにより安定化された、液化した最少寒天培
地（ＭＭ＋１ｇ／ｊ！のアルギニン＋１０ｇ／ｌのバク
ドアガー（ディフコ）〕と混合する。
この混合物をすぐに、同じ培地の寒天プレートに性別し
、そして２８℃にてインキュベートする。
２８℃にて３日間の増殖の後、安定な形質転換体が、数
百の小さいおそらく失敗の形質転換体のバンクグラウン
ド増殖の上に旺盛に増殖しそして胞子を形成するコロニ
ーとして出現する。
ｐＣＧ５９Ｄ７による形質転換は変異株＾ｎ８において
のみ好結果でありＡｎｌＯにおいてはそうではない。
従って、Ａｎ８はオルニチン−５′−ホスフェートデカ
ルボキシラーゼ活性を欠き、これが選択プラスミドｐＣ
Ｇ５９Ｄ７の十分な長さの遺伝子産物により補完される
と思われる。Ａｎ８においては、１■のｐＣＧ５９０７
当り約２０〜３０個の形質転換体が得られる。
Ａｎ８の１０個の形質転換体を拾い、最少培地上で培養
し、そしてＤＮＡを単離し、そしてｐＣＧ５９Ｄ７配列
の存在について分析する。公表されている方法（７）に
従って液体窒素中で凍結された菌糸を粉砕した後、形質
転換体のＤＮＡを単離する。各形質転換体のＩＫのＤＮ
ＡをＸｈｏ　Ｉにより完全消化し、１％アガロースゲル
上での電気泳動により分画し、そしてＭａｎｉａｔｉｓ
（８）　、３８２−３８６頁に行ってニトロセルロース
フィルターにプロットする。
Ｍａｎｉａｔｉｓ等（８）　、３８７−３８９頁に記載
されているような標準的方法に従って、プロットを〔α
−１２ｐ　）　　７　ヘル化ｐＵＮ１２１ＤＮＡトハイ
フリタイスセしめる。得られる種々のハイブリダイゼー
ションパターンは、宿主ゲノムの種々の場所への形質転
換プラスミドｐＣＧ５９Ｄ７の染色体取り込みを示す。
変異株Ａｎ８のプロトプラストを例８．２に従って調製
し、そして５ＩＩｇの選択プラスミドｐＣＧ５９Ｄ７と
、１０躍のプラスミドｐＬｌ（Ｋ３　　（例７．７）、
１０ｊ１ｇのプラスミドｐＬｌ（Ｌ５　（例７．８）又
は１０ＩＩ！のプラスミド（例７．９）のいずれかとに
より、例８．２に記載した方法に従って同時形質転換す
る。
形質転換されたＡｎ８細胞を、例８．２に記載したよう
にして、ウリジン栄養要求性について最少培地上で選択
する。各形質転換実験の５０個の形質転換体を無作為に
拾い、そしてデスルファトヒルジンの発現について分析
する０発色性ペプチド基質の製造者（ベーリンガー、マ
ンハイム、西独）に従うトロンビン阻害アッセイにおい
てデスルファトヒルジンの活性を試験する。
例８．３に従って得られた形質転換体からの分生胞子を
別々に５０−の前培養培地（Ｐｅｃｔｉｎ　ＳｌｏｗＳ
ｅｔ　Ｌ（Ｕｎｉｐｅｃｔｉｎ、　ＳＡ、　Ｒｅｄｏｎ
、フランス）３ｇ／１ＳＮＨ＊Ｃ１２ｇ／　Ｉｔ、　Ｋ
ＨｚＰＯａ　Ｏ，５ｇ／　１２．、ＮａＣ１０，５ｇ　
／　１１ＭｇｔＳＯ＊　・７Ｈｔ００．５ｇ　／　１　
、ＣａｚＳＯａ＝２Ｈ！ＯＯ，５ｇ　／　ｌ　、ｐＨ７
，０）中で前培養する。前培養物を２５０ｒｐａ＋、　
２８℃にて７２時間インキエベートする。１０％の前培
養物を５０ｍ１の主培養培地（大豆粉２０　ｇ／　ｊ！
５Ｐｅｃｔｉｎ　Ｓｌｏｗ　Ｓｅｔ　５ｇ／　ｊりに接
種する。培養物を２５Ｏｒｐｍ及び２８℃（誘導条件と
称する）にて７２〜９６時間（ペクチンリアーゼ生産の
最高速度）増殖せしめる。変異株Ａｎ８の形質転換体を
また、主培養培地ではなくフィトン（Ｐｈｙｔｏｎｅ）
ペプトン１０　ｇ　／　１、グルコース１０ｇ／Ｉｌの
非誘導条件下でも増殖せしめる。
種々の時点（２０時間毎）にサンプルを採取し、遠心分
離により細胞をペレット化し、そして超音波により破砕
する。上清及び細胞抽出物の両者を、例９．１に記載し
たようにしてデスルファトヒルジン活性について試験す
る。プラスミドｐＬＨＫ　３との同時形質転換の後デス
ルファトヒルジン活性は検出されない、十分な長さのＰ
ＬＩプロモーターを含有するｐＬ）ＩＬ　５及びｐＬ）
ＩＬ　７はいずれもＡ、ニガー変異株Ａｎ８においてデ
スルファトヒルジンの発現を駆動することができる。同
時形質転換実験（例９．１）から得られた５０個の形質
転換体の内、１０株はそれぞれ培地中でデスルファトヒ
ルジン活性を示す。
従って、十分な長さのＰＬＩプロモーターの制御のもと
ての変異株Ａｎ８におけるデスルファトヒルジンの発現
は誘導基質ペクチンにより制御され、そしてＩＬＩシグ
ナルペプチドの使用がデスルフアトヒルジンの培地への
分泌をもたらす。
微士ｌｐ直丘 下記の微生物がブタペスト条約に基きＤｅｕｔｓｃｈｅ
Ｓａｍｍｌｕｎｇ　ｖｏｎ　Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓ
ｍｅｎ、　Ｇｒｉｓｅｂａｃｈｓｔｒ。
Ｌ　Ｄ−３４００Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎに寄託されてい
る。
エシェリシ＋’コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌ
ｉ）ＢＪ５１８３／ｐＣＧ３Ｂ１１ 寄託番号　　ＤＳＭ　３９１６ 寄託臼　　　１９８６年１２月１１日 アスペルギルス・ニガー（Ａｓ　ｅｒ　ｉ、１１ｕｓ　
　旦■Ｌ）ｎ８ 寄託番号　　ＤＳＭ　３９１７ 寄託臼　　　１９８６年１２月１１日 エシェリシ＋・コリ　（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　　ｃ
ｏ旦）ＢＪ５１８３／　ｐＣＧ５９Ｄ７ 寄託番号　　ＤＳＭ　３９６８ 寄託臼　　　１９８７年２月２日 １且文献 １）　Ｆ、Ｅ、Ａ、　ｖａｎ　Ｈｏｕｄｅｎｈｏｖｅｎ
、　Ｐｈ、Ｄ、　ＴｈｅｓｉｕｓＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒ
ａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、　　ワシントン。
Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒ
ａｌ　　ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＷａｇｅｎｉｎｇｅｎ、
　　Ｔｈｅ　Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ　７５−１３（Ｉ
９７５）　　ｅ２）　Ｅｄｍａｎ　Ｐ、＋及びＢｅｇｇ
　Ｇ、（Ｉ９６７）Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｂｆｏｃｈｅｓ。
１、　８０−９１゜ ３　）　Ｊ、Ｍ、　　Ｖｅｒｅｔｊｋｅｎ、　　Ｊ、　
　Ｈｏｆｓｔｅｅｎｇｅ、　　Ｈ，Ｊ、　　Ｂａｋ及び
Ｊ、Ｊ、　Ｂｅ１ｎｔｅ’ｎ＋ａ、　Ｅｕｒ、　Ｊ、　
Ｂｉｏｃｈｅａ＋、　　１１３＋１５１（Ｉ９８０）　
　。
４　）　Ｇ、　Ｆｒａｎｋ及び−、　５ｔｒｕｂｅｒｔ
＋　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉａ工、　５２２（Ｉ
９７３）。
５）　Ａ、Ｍ、　Ｃｒｅｓｔｆｉｅｌｄ、　Ｓ、　Ｍｏ
ｏｒｅ及び−、Ｈ，５ｔｅｉｎ。
Ｊ、Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　　２３８．　６２２（Ｉ
９６３）。
６　）　Ｋｎｅｃｈｔ等、　Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅ
ａ＋、　　１３０．６５（Ｉ９８３）。
？　）　　Ｙｅｌｔｏｎ　Ｍ、Ｍ、、　　Ｈａｍｍｅｒ
　Ｊ、Ｅ、、　　Ｔｉｍｂｅｒｌａｋｅ　Ｗ、Ｅ。
（Ｉ９８４Ｌ　　Ｐｒｏｃ、　　Ｎａｔｌ、　　Ａｃａ
ｄ、　　Ｓｅｔ、　　ＵＳ八へ１゜１４７０−１４７４
゜ ８　）　Ｍａｎｉａｔｉｓ　Ｔ、Ｆｒ１ｔｓｃｈ　Ｅ、
Ｆ、、　　Ｓａｍｂｒｏｏｋ　Ｊ、。
Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ、ａ　　１ａｂｏ
ｒａｔｏｒｙ　ｍａｎｕａｌ＋Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ
　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｉ９８２）　
　。
９）　Ｎｉ１ｓｓｏｎ　Ｂ、、　　Ｕｈｌｅｎ　Ｍ、、
　　Ｊｏｓｅｐｈｓｏｎ　Ｓ、＋Ｇａｔｅｎｂｅｃｋ　
Ｓ、及びＰｈｔｌｉｐｓｏｎ　Ｌ、（Ｉ９８３）。
Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　ＩＬ
　　８０１９−８０３０゜１０）　Ｈａｎａｈａｎ　Ｄ
、、　　（Ｉ９８３）、　　Ｊ、　Ｍｏ１．　　Ｂｉｏ
ｌ、　　１６６゜５５７−５８０　　。
１１）　Ｇｅｒｇｅｎ　Ｊ、Ｐ、、　５ｔｅｒｎ　Ｒ，
Ｈ，、Ｗｅｎｓｉｎｋ　Ｐ、Ｃ，（Ｉ９７９）＋Ｎｕｃ
ｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　’Ｌ　　２
１１５−２１３６　。
１２）　Ｍ、Ｈ，Ｃａｒｕｔｈｅｒ、　Ｃｈｅｍｉｃａ
ｌ及びＥｎｚｙｍａｔｉｃＳｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｏｆ　
Ｇｅｎｅ　Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ：　ａ　ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｙｍａｎｕａｌ、　　Ｖｅｒｌａｇ　Ｃｈｅｍｉｅ
（Ｉ９８２）　　。
１４）　Ｈｕｍｐｈｒｅｙｓ　Ｇ、Ｏ，、Ｗｉｌｌｓｈ
ａｗ　Ｇ、Ａ、、　　ＡｎｄｅｒｓｏｎＥ、Ｓ、（Ｉ９
７５）＋　　Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ　ｅｔ　Ｂｉｏｐｈ
ｙｓｉｃａ　Ａｃｔａ。
３８３．４５７−４６３゜ １５）　Ｍｅｓｓｉｎｇ　Ｊ、（Ｉ９８３Ｌ　　Ｍｅｔ
ｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙｌｏｌ、２１−
７８゜ １６）　Ｍ１３　ｃｌｏｎｉｎｇ　ａｎｄ　ｓｅｑｕｅ
ｎｃｉｎｇ　ｈａｎｄｂｏｏｋ。
Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　ｐｌ
ｃ、　Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍ−ｓｈｉｒｅ、Ｅｎｇｌａ
ｎｄａ １７）　Ｂｉｒｎｂｏｉｍ　Ｉｌ、Ｃ，＆　Ｄｏｌｙ　
Ｊ−、（Ｉ９７９）＋　　Ｎｕｃｌｅｉｃ八ｃｉｄｓ　
へＲｅｓ　　７．　１５１３−１５２３゜１８）　Ｂｏ
ｅｌ　Ｅ、ｌ　Ｈａｎｓｅｎ　Ｍ、Ｔ、＋　　Ｈｊｏｒ
ｔ　ｘ、ｌ　　Ｈｏｅｇｈ　１．。
Ｆｉｉｌ　　Ｎ、Ｐ、　　（Ｉ９８４）、　　ＥＭＢＯ
Ｊ、　　３．　１５８１−１５８５゜１９）　Ｍｏｕｎ
ｔ　Ｓ、Ｍ、（Ｉ９８２）＋　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１
ｄｓ　Ｒｅｓ、　１帆４５９−４７２　　。
２０）　Ｚｏｌｌｅｒ　Ｍ、Ｊ、　　＆　Ｓｍ１ｔｈ　
Ｍ、（Ｉ９８４）、　　ＤＮＡ　３．　４７９−４８８
　。
２１）　　Ｉｔａｋｕｒａ　　等、　　Ｊ、　　Ａ＋ｗ
、　　Ｃｈｅｗ、　　Ｓｏｃ、　　１０３＋　　７０６
（Ｉ９８１）。
２２）　Ｈｏｌｍｅｓ　Ｄ、Ｓ、、　Ｑｕｉｇｌｅｙ　
Ｍ、（Ｉ９８１Ｌ　　Ａｎａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍ１１４
．１９３−１９７゜ ２３）　Ｓａｎｇｅｒ　Ｔ、、　　Ｎ１ｃｋｌｅｒ　ｓ
、ｌ　Ｃｏｕｌｓｏｎ　Ａ、Ｒ，（Ｉ９７７）＋Ｐｒｏ
ｃ、　　Ｎａｔｌ、　　Ａｃａｄ、　　Ｓｃｉ、　　Ｕ
ＳＡ　７４．　５４６３−５４６７゜２４）　Ｂｏｌｉ
ｖａｒ　Ｆ、、　Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ　Ｒ，Ｌ、、　Ｇ
ｒｅｅｎｅ　Ｐ、Ｊ、。
Ｂｅｔｌａｃｈ　Ｍ＝Ｃ，、）Ｉｅｉｎｅｋｅｒ　Ｈ，
Ｌ、、　Ｂｏｙｅｒ　）１．。
Ｃｒｏｓａ　Ｊ、Ｈ，＋　　Ｆａｌｋｏｗ　Ｓ、（Ｉ９
７７）＋　　Ｇｅｎｅ　２＋　　９５−１１３　。
２５）　Ｙａｎｉｓｈ−Ｐｅｒｒｏｎ　Ｃ，、Ｖｉｅｉ
ｒａ　Ｊ、、　　Ｍｅｓｓｉｎｇ　Ｊ。
（Ｉ９８４）＋　　Ｓｕｂｍｉｔｔｅｄ　　ｔｏ　Ｇｅ
ｎｅ　。
２６）　Ｂａ１ｌａｎｃｅ　Ｄ、Ｊ、及びＴｕｒｎｅｒ
　Ｇ、（Ｉ９８５）＋　Ｇｅｎｅ３６．３２１−３３１
　　。
２７）　Ｂｏａｋｅ　Ｊ、ｏ、ｌ　　Ｌａｃｒｏｕｔｅ
　Ｆ、、　　Ｆｉｎｋ　Ｇ、Ｒ，、Ｍｏｌ。
Ｇｅｎ、　Ｇｅｒｅｔ、　　１９８４．　１９７．３４
５−３４６゜２８）　Ｎｏｒｒａｎｄｅｒ、　Ｊ、等、
　Ｇｅｎｅ　２６．１０１−１０６（Ｉ９８３）。
【図面の簡単な説明】
第１図は、Ａ、ニガーＮ７５６株の」旦３ＡＩ断片を含
有するプラスミドｐＣＧ３Ｂ１１の制限地図を示す。 第２図は、式（Ｉ）のＤＮＡのＮ−末端一壜辺Ｒ１断片
含有するプラスミドｐＰＬ２９−５の制限地図を示す。 第３図は、式（Ｉ）のＤＮＡのＣ−末端上Ｒ１断片を含
有するプラスミドｐＰＬ３５−５の制限地図を示す。 第４−１図〜第４−５図は、式（Ｉ）のＤＮＡを幾つか
の制限酵素部位の表示及びＰＬＩのシグナル配列及び構
造アミノ酸配列と共に示す。 式中、１個づつの文字がアミノ酸を示す場合、次に示す
天然Ｌ−アミノ酸を意味する；（Ａ）アラニン、（Ｃ）
システィン、（Ｄ）アスパラギン酸、（Ｅ）グルタミン
酸、（Ｆ）フェニルアラニン、（Ｇ）グリシン、（Ｈ）
ヒスチジン、（Ｉ）イソロイシン、（Ｋ）リジン、（Ｌ
）ロイシン、（Ｍ）メチオニン、（Ｎ）アスパラギン、
（Ｐ）プロリン、（Ｑ）グルタミン、（Ｒ）アルギニン
、（Ｓ）セリン、（Ｔ）スレオニン、（Ｖ）バリン、　
（Ｗ））リプトファン、　（Ｙ）チロシン。 また、ヌクレオチドを表わす場合、次の塩基を含むヌク
レオチドを意味する：　（Ａ）アデノシン、（Ｃ）シチ
ジン、（Ｇ）グアノシン、（Ｔ）チミジン。 第５図は、Ｍ１３ｍｐ８−ＰＬ（Ｓａｌ　Ｉ　−Ｅ並Ｒ
１）Ｂ旦Ｈ１ｔ／ＢＥ５及びｐＵＮ１２１からのｐＵＢ
Ｅ　５の造成を示す。 ｐＵＢＥ　５はＰＬＩプロモーターの部分、」旦Ｈ■制
限部位を伴うシグナル配列、及びＰＬＩ構造遺伝子の部
分を含有する。 第６図はデスルファトヒルジン遺伝子を含有するｐＭＬ
３１０Ｌの造成を示す。 第７図はＰＬＩプロモーターの部分、Ｂｓ５ＨＩＩ制限
部位を伴うシグナル配列、リンカ−ＢｓｓＨＩＩ−」■
■及びデスルファトヒルジン遺伝子を含有するｐＬＨＫ
　３の製造を示す。 第８図は、ＰＬＩプロモーター、」旦）ｉ　ｎ制限部位
を伴うシグナル配列及びデスルファトヒルジン遺伝子を
含有するｐＬＨＬ　５の造成を示す。 第９図は、ＰＬＩプロモーター、血ＨＩＥ制限部位を伴
うシグナル配列、及びデスルフプトヒルジン及びＰＬＩ
ターミネータ−を含有するｐＬＨＬＴ７の造成を示す。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １、ペクチンリアーゼ（ＰＬ）発現系をコードするＤＮ
    Ａ配列を含有する組換ＤＮＡ分子又はその誘導体。 ２、プロモーター、シグナル配列、及びＰＬＩ発現系の
    ターミネーターを伴うか又は伴わない構造遺伝子を含ん
    で成る請求項１に記載の組換ＤＮＡ分子。 ３、式（ I ）のＤＮＡ配列又はその誘導体を含んで成
    る請求項１に記載の組換ＤＮＡ分子。 ４、ｐＣＧ３Ｂ１１である請求項１に記載の組換ＤＮＡ
    分子。 ５、ヌクレオチド−１〜−６８８の間にプロモーター配
    列を含んで成る請求項１に記載の組換ＤＮＡ分子。 ６、ヌクレオチド１及び５７の間にシグナル配列を含ん
    で成る請求項１に記載の組換ＤＮＡ分子。 ７、ヌクレオチド５８及び１３６６の間にＰＬＩ構造遺
    伝子を含んで成る請求項１に記載の組換ＤＮＡ分子。 ８、イントロンを伴わないＰＬＩ構造遺伝子を含んで成
    る請求項１に記載の組換ＤＮＡ分子。 ９、ヌクレオチド１３６７とヌクレオチド１５７０〜２
    ０２９のいずれか１つとの間に延びるターミネーターを
    含んで成る請求項１に記載の組換ＤＮＡ分子。 １０、縮重する式（ I ）のＤＮＡ配列を含んで成る請
    求項１に記載の組換ＤＮＡ分子。 １１、組換ハイブリドベクターである請求項１に記載の
    組換ＤＮＡ分子。 １２、ＰＬＩ構造遺伝子、又は同種（ｈｏｍｏｌｏｇｏ
    ｕｓ）ペクチンリアーゼ遺伝子もしくは異種（ｈｅｔｅ
    ｒｏ−ｌｏｇｏｕｓ）構造遺伝子を含んで成るハイブリ
    ドベクターである請求項１の組換ＤＮＡ分子。 １３、マーカー遺伝子￥ｐｙｒ￥Ａを含んで成るハイブ
    リドベクターである請求項１の組換ＤＮＡ分子。 １４、ハイブリドベクターｐＬＨＬ５である請求項１に
    記載の組換ＤＮＡ分子。 １５、ハイブリドベクターｐＬＨＬＴ７である請求項１
    に記載の組換ＤＮＡ分子。 １６、請求項１に記載の組換ＤＮＡ分子の製造方法であ
    って、ペクチンリアーゼ発現系をコードするＤＮＡ分子
    を含有するＤＮＡ分子又はその誘導体により形質転換さ
    れた宿主を培養し、そして目的の組換ＤＮＡ分子又はそ
    の誘導体を単離するか、あるいはそれをインビトロ合成
    により調製する、ことを含んで成る方法。 １７、請求項１に記載の組換ＤＮＡ分子を含有する形質
    転換された宿主。 １８、エシェリシャ・コリ￥（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
    ￥　￥ｃｏｌｉ￥）Ｂ３５１８３／ｐＣＧ３Ｄ１１（Ｄ
    ＳＭ　３９１６）である請求項１に記載の形質転換され
    た宿主。 １９、請求項１に記載の組換ＤＮＡ分子及び選択マーカ
    ープラスミドｐＣＧ５９Ｄ７により形質転換されたアス
    ペルギルス・ニガー￥（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ￥　￥
    ｎｉｇｅｒ）￥Ａｎ８（ＤＳＭ　３９１７）である請求
    項１７に記載の形質転換された宿主。 ２０、ｐＬＨＫ３、ｐＬＨＬ５又はｐＬＨＬＴ７のいず
    れか、及び選択マーカープラスミドｐＣＧ５９Ｄ７によ
    り形質転換されたアスペルギルス・ニガー￥（Ａｓｐｅ
    ｒｇｉｌｌｕｓ￥　￥ｎｉｇｅｒ）￥Ａｎ８（ＤＳＭ　
    ３９１７）である請求項１７に記載の形質転換された宿
    主。 ２１、請求項１７に記載の形質転換された宿主の製造方
    法であって、宿主を形質転換条件下で、場合によっては
    選択マーカー遺伝子と共に、請求項１に記載の組換ＤＮ
    Ａ分子により形質転換し、そして形質転換体を選択する
    ことを含んで成る方法。 ２２、アスペルギルス・ニガー￥（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌ
    ｕｓ￥　￥ｎｉｇｅｒ）￥Ａｎ８を請求項１に記載の組
    換ＤＮＡ分子及び選択マーカープラスミドｐＣＧ５９Ｄ
    ７により同時形質転換することを特徴とする請求項１に
    記載の方法。 ２３、有用なポリペプチドを発現するハイブリドベクタ
    ーの製造のための請求項１に記載の組換ＤＮＡ分子の使
    用。 ２４、請求項１１に記載のハイブリドベクターを適当な
    宿主中で発現せしめ、そしてポリペプチドを単離するこ
    とを特徴とするポリペプチドの製造方法。 ２５、ＰＬＩの発現及び分泌のための発現ハイブリドベ
    クターにより形質転換されたアスペルギルス（Ａｓｐｅ
    ｒｇｉｌｌｕｓ）宿主を培養し、そして栄養培地からＰ
    ＬＩを回収することを特徴とするアスペルギルスの種に
    おいてＰＬＩを過剰生産（ｏｖｅｒｐｒｏ−ｄｕｃｔｉ
    ｏｎ）するための請求項２４に記載の方法。 ２６、選択マーカープラスミドｐＣＧ５９Ｄ７。 ２７、請求項２６に記載のプラスミドを含有する宿主。 ２８、エシェリシャ・コリ￥（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈ￥　
    ￥ｃｏｌｉ）￥ＢＪ５１８３／ｐＣＧ５９Ｄ７（ＤＳＭ
    ３９６８）である請求項２７に記載の宿主。 ２９、アスペルギルス・ニガー￥（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌ
    ｕｓ￥　￥ｎｉｇｅｒ）￥Ａｎ８（ＤＳＭ　３９１７）
    。
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