NO179078B

NO179078B - Replikerbar ekspresjonsvektor, anvendelse derav og transformert vert

Info

Publication number: NO179078B
Application number: NO880470A
Authority: NO
Inventors: Jutta Heim; Christof Gysler; Jacob Visser; Hermanus Cornelis Maria Kester
Original assignee: Ciba Geigy Ag
Priority date: 1987-02-04
Filing date: 1988-02-03
Publication date: 1996-04-22
Also published as: DE3854947T3; FI880439A; NZ223392A; IL85293A; ES2082746T3; DD267511A5; EP0278355B1; IE880292L; IE72506B1; PT86684A; KR970001116B1; ZA88757B; DD283838A5; GR3018863T3; EP0278355B2; FI105484B; NO179078C; YU21688A; DK54588A; ATE133706T1

Description

Foreliggende Oppfinnelse vedrører en replikerbar ekspresjonsvektor, transformert vert og anvendelse av den replikerbare ekspresjonsvektoren. DNA-molekylene innbefatter DNA-sekvenser som koder for pektinlyase I (PLI) fra Aspergillus niger og/eller promoteren, signalsekvensen eller terminatoren derav og kan benyttes for overproduksjon av PLI i Aspergillus og/eller konstruksjonen hybride vektorer som uttrykker fremmede gener i trådsopp.

Selv om det innenfor genetiske konstrueringsteknikker finnes flerfoldige polypeptid ekspresjonssystemer for prokaryote og eukaryote verter, er det hele tiden nødvendig med nye systemer som kan ha fordeler i forhold til de kjente system-ene .

Den prokaryote Escherichia coli verten og den eukaryote gjærverten, f.eks. Saccharomyces cerevisiae, er veldig mye brukt. Et stort antall forskjellige ekspresjonshybride vektorer, for det meste plasmider, er utviklet. Ulempene med E.coli verter er at de ikke kan glykosylere det dannede polypeptidet og på grunn av mangelen på sekresjon vil det fremmede peptidet akkumulere i vertscellen og så forhindre vekst. Gjærverter glykosyleres, men som E.coli, utskiller de ikke polypeptidene, med unntagelse av de som er veldig små, inn i næringsmediet. Gjær utskiller bare inn i periplasma-området. Høyere eukaryote verter er pattedyr-kreftceller som har muligheten for å glykosylere og utskiller inn i næringsmediet, men virkning er veldig sakte og kostbar og den overhengende faren er at onkogene nukleinsyrer blir isolert sammen med det ønskede peptidet som peptidet ikke kan bli kvitt.

Da det var nødvendig med andre verter, ble også trådsopp, så som Neurospora crassa, Aspergillus nidulans og Aspergillus niger undersøkt. Slik sopp er allerede meget anvendt i industrielle anvendelser, men anvendelse derav i genetiske konstruksjonsteknikker har ligget etter, hovedsakelig på grunn av mangel på et hensiktsmessig transformasjonssystem. I motsetning til Saccharomyces cerevisiae, inneholder ikke trådsopp plasmider som kunne bli brukt for å introdusere fremmede gener og fenotyp seleksjon. Det er derimot mulig å transformere trådsopp med fremmede plasmider som inneholder et selekterbart markørgen. Alle vektorene som til nå er blitt beskrevet for trådsopp replikerer ikke autonomt, slik som gjær gjør, men blir integrert inn i soppkromosomet. Denne hendelsen skjer bare med lav frekvens. Integrerende transformasjon gjør transformantene mitotisk meget stabile, selv under ikke-selektive betingelser, og dette er veldig fordelaktig. Stabil integrasjon av mer enn ett hundre kopier er blitt rapportert.

Den første vektor for trådsopp som er beskrevet inneholder qa-2 genet til Neurospora crassa som selekterbar markør. Dette genet koder for katabolsk dehydroquinaseenzymet og kan bli brukt ved funksjonell komplementasjon av aro-mutanter fra N. crassa [Case, M.E., Schweizer, M., Kushner, S.R. og Giles, N.H. (1979) Proe. Nati. Acad. Sei. USA 76, 5259-5263]. Aro-mutanter kan ikke vokse på minimalmedium uten et aromatisk aminosyretilskudd. Transformasjon av N. crassa med qa-2 vektoren skjedde ved integrasjon av et enkelt kopi av plasmidet inn i kromosomet. 30$ av stabile aro<+>som var integrert beholdt det integrerte qa-2 genet festet til de bakterielle plasmidsekvensene [Case, M.E. (1982) i Genetic Engineering of Microorganisms for Chemicals (Hollander, A., DeMoss, D. , Kaplan, S., Konisky, J., Savage, D. og Wolfe, R.S., eds), pp. 87-100, Plenum]. Denne observasjonen gjorde kotransformasjon av ikke-selektive DNA-sekvenser sammen med selektive mulig.

Aspergillus nidulans har en seksuell syklus og kan derfor utsettes for klassisk genetisk manipulasjon, der både negative og positive seleksjonssystemer blir identifiserte. Enten ved bruk av heterologt DNA fra N. crassa eller homologt DNA, ble funksjonell komplementasjon av A. nidulans pyrG- mutanter ved transformasjon med plasmider som inneholder pyrG-genet oppnådd (Ballance et al., BBRC 112, 284 1983; Tilburn et al. Gene 26, 205, 1983). I andre systemer var mutasjoner ved trpC eller argB lokuset funksjonelt komplementert ved transformasjon med de hensiktsmessige plasmidene [Yelton et al. PNAS 81, 1470, 1984; Yelton et Timberlake J. Cell Biochem. Suppl. 9C 173, 1985; Johnstone et al. EMBO J. 4, 1307, 1983].

Et dominant positivt seleksjonssystem har også blitt utviklet og benyttet seg av amdS-genet isolert fra A. nidulans som gjør det mulig for A. niger som er transformert dermed å vokse på acetamid som eneste nitrogenkilde (Tilburn et al., Gene 26, 205, 1983); Wernars et al., Curr.Genet. 9, 361, 1985, Kelly, J.M. et al., EMBO J. 4, 475, 1985).

Sammenlignet med N. crassa eller A. nidulans, er A. niger den viktigste organismen. Den blir i stor utstrekning brukt i den industrielle fremstilling av enzymer, f.eks. for bruk i matindustrien. A. niger er forskjellig fra A. nidulans når det gjelder dets utskillingskapasitet, da det utskiller forskjellige hydrolytisk enzymer, f.eks. glukoamylase, a-amylase, pektinase, cellulase, g<->glukanase,3-galaktosidase, naringinase, pentosanase, syreprotease og lignase, hvor glukoamylase og pektinasekomplekset er de viktigste.

A. niger har ingen kjent seksuell syklus. Mutasjoner kan derfor ikke bli introdusert via meiotiske rekombinasjoner. Ved klassisk mutasjon og seleksjonsfremgangsmåter, er det blitt utviklet stammeforbedringer når det gjelder sekresjon av hydrolytiske enzymer.

Når det gjelder genene til A. niger enzymene er bare glukoamylase (Boel et al. EMBO J. 3, 1581, 1984) og alkohol og aldehyd dehydrogenase (WO 86/06097) sammen med deres promoter og signalsekvenser blittkarakterisertog brukt i transforma-sjonseksperimenter med A. nidulans og A. niger.

Som seleksjonsmarkører for A. niger er det heterologe amds-genet blitt brukt (Kelly og Hynes, EMBO 3. 4, 475, 1985), og argB-genet (Buxton et al., Gene 37, 207, 1985; EP 184 438; WO 86/06097), begge ervervet fra A. nidulans.

A. niger er den viktigste organismen i den industrielle fremstilling av pektin degraderende enzymer. Pektiner er polygalakturonider med molekylvekt (20000-40000 D) bestående av a-1,4-glykosidbundet D-galakturon-syrepolymerer og eksisterer i naturen som bestanddeler av høyere planteceller, hvor de er bundet til cellulosemolekyler som hovedsakelig finnes i den primære celleveggen og middel lamella. De rikeste kildene på pektin er sitron og appelsinskall, som inneholder 30$ av dette polysakkaridet. Pektinenzymer nedbryter karbohydrat polymersubstratet enten ved hydrolyse av a-1,4-glyksidbindingen (polygalakturonase) eller ved transeliminasjon av a-4,5 umettet galakturonresidie fra pektinmolekylet (forskjellige pektinlyaser). Det systemat-iske navnet på pektinlyase er pektin-transeliminase (EC 4.2.2.10).

I A. niger blir proteinene i pektinkomplekset ikke uttrykt konstitutivt. Under induserende betingelser ved bruk av pektin eller nedbrytingsprodukter derav uttrykker A. niger de ovenfor nevnte enzymene, inkludert PLI, når andre karbonkil-der, som glukose eller sukrose, er begrensende. I overflate-kulturer forblir pektinenzymene assosiert med den ytre celleveggen. Økende pektin og Ca^<+>konsentrasjon i mediet fører til fullstendig utskilling.

Pektinaser, så som PLI, blir brukt i matvareindustrien hovedsakelig for å gjøre fruktsafter klare.

To forskjellige pektinlyaser fra A. niger, PLI og PLII, er blitt renset og delviskarakterisertav F.E.A. Van Houdenhoven (1). PLI inneholder fire mannose-residier, mens PLII har to mannose og to glukoseresidier. Enzymene har forskjel lige molekyl vekter (PLI: 37.5 kD, PLII: 36 kD). Det er før denne oppfinnelsen ikke "blitt publisert noen total eller delvis aminosyresekvenser.

Denne oppfinnelsen er basert på en partiell strukturbestemm-else av pektinlyase I (PLI) som gjør det mulig å fremstille DNA-prober som koder for relevante deler av proteinet. Ved bruk av DNA-probene var det mulig å screene for og isolere DNA som koder for PLI, sammen med pre- og post-sekvenser derav, fra et genbibliotek fra A. niger.

Foreliggende oppfinnelse vedrører replikerbar ekspresjonsvektor, kjennetegnet ved at den inneholder DNA-sekvenser som koder for pektinlyase (PL) ekspresjons-systemet fra trådsopp eller funksjonelle deler derav for ekspresjon av proteiner i trådsopp, promoteren, signalsekvensen og eventuelt det strukturelle genet som koder for pektinlyase eller homologt pektin lyase gen eller heterologt strukturelt gen, med eller uten terminatoren til PLI-ekspresjons-systemet.

En transformert vert, kjennetegnet ved at den inneholder et rekombinant DNA-molekyl som angitt ovenfor og som er i stand til å uttrykke det gitte genet, er også beskrevet.

Foreliggende oppfinnelse vedrører også anvendelse av replikerbar ekspresjonsvektor som angitt ovenfor for fremstilling av et polypeptid i trådsopp ved at en hybrid vektor blir uttrykt i en egnet vert og at polypeptidet blir isolert.

Pektinlyase-ekspresjonssystemet inneholder DNA-sekvenser som koder for promoteren, signalsekvensen, det strukturelle genet og terminatoren til et pektinlyasegen.

De hybride ekspresjonsvektorene er brukt for inkorporering av genene som koder for spesielle proteiner og for transformasjon av trådsopp, så som Aspergillus, Penicillium og Cephalosporium. Ko-transformasjon av A. niger med 2 forskjellige plasmider kan utføres, hvorpå et av plasmidene er selektert fra gruppen av ekspresjonsvektorer i denne oppfinnelsen, og den andre er en spesielt konstruert seleksjonsplasmid, som virker sammen med en mutert stamme fra en trådsopp.

Hensiktene med denne oppfinnelsen vil være mere tydelig fra følgende detaljerte beskrivelse av oppfinnelsen.

Eekombinante DNA-molekyler.

De rekombinante DNA-molekylene inneholder DNA-sekvensene i formel I (Figur 4) eller derivater derav.

Betegnelsen "derivativ" når det blir brukt i sammenheng med DNA-sekvensen i formel I er ment å innbefatte stor derivativer med flankerende sekvenser, fragmenter av nevnte DNA-sekvens, mutanter, spesielt naturlig forekommende mutanter, og DNA-sekvenser som er degenererte.

Større derivativer av DNA-molekylene i formel I innbefatter de som kan kuttes ut fra A. niger genomet og som innbefatter DNA-sekvensen i formel I, så som kan bli funnet i et genomisk bibliotek fra A. niger som er ervervet ved fragmentering av nukleinsyrene, behandling av fragmentene med egnede restriksjonsenzymer, f.eks. Sau3A, ligering inn i en egnet plasmid, f.eks. pUN121, kloning, f.eks. i E. coli, og utkutting igjen, med det samme restriksjpnsenzymet. Et slikt derivativ er f.eks. innskuddet til plasmid pCG3Bll vist i figur 1.

Fragmenter av DNA-sekvensen i formel I er de som ligger mellom to restriksjonsseter selektert fra følgende: Pst I, EcoEi, Hindlll, Sau3AI, Kpnl, Clal, Ncol, AccI, Salll, Pvul, Sali, Spel, Bgll, EcoRV, Bglll, Aval, Xhol, Nhel, BssHI, XmnI, BamHI, BssHII, og lignende, som vist i vedlagte f igurer.

Fragmenter som er å foretrekke er de som inneholder promoter-sekvensen, signalsekvensen, det strukturelle genet til PLI, og/eller terminatorsekvensen.

Fragmentene til DNA-sekvensen i formel I kan inneholde linkere som tilveiebringer vellykket binding til andre DNA-molekyler .

PLI-promoter-sekvensen ligger i DNA-regionen mellom nukleotid-posisjonene -1 til -688, hvor sekvensen mellom nukleotidene omtrent -100 og -146 er essensiell. For promoter-sekvensen er TATAA-boksen ved nukleotidene -120 til -146 viktige når de fungerer som RNA-polymerase gjenkjenningssete. Egnede linkere kan bli festet til disse fragmentene.

PLI-promoteren til A. niger er induserbar, d.v.s. ekspresjonen av det strukturelle genet festet dertil, f.eks. det strukturelle genet som koder for PLI eller hvilket som helst andre fremmede gener, er indusert ved tilsetting av pektin eller pektin-degraderingsprodukter til mediet.

Signalsekvensen strekker seg mellom nukleotidene 1 til 57. Signalsekvensen er en foretrukket sekvens og DNA-molekyler som inneholder den, f.eks. de som inneholder nevnte sekvens og valgfrie egnede linkere, er DNA-molekyler som er å foretrekke.

Det strukturelle genet til PLI begynner ved nukleotid 58 og strekker seg til nukleotid 1366. Som det er tydelig fra formel I, inneholder det strukturelle genet flere introns. Det strukturelle genet kan også inneholde egnede linkere.

Terminatoren begynner med stopp-kodon TAA ved nukleotid 1367 og kan strekke seg opp til nukleotid 1570 eller opp til 2029, spesielt opp til et av restriksjonssetene innenfor nevnte sekvens. Terminatorfragmentet kan inneholde egnede linkere. Egnede linkere til ovenfornevnte fragmenter har en DNA-sekvens som passer inn i restriksjonssetet til DNA'et som fragmentet kan bli festet til, eller som inneholder et restriksjonssete.

Fragmenter av DNA-sekvensen i formel I innbefatter også de som er sammensatt av mindre fragmenter, f.eks. de som består av promoteren og signal eller strukturelle sekvensen, eller av signal og den strukturelle sekvensen, det strukturelle genet uten introns, og lignende.

Mutanter til DNA-sekvensen i formel I er f.eks. naturlig forekommende mutanter, så som mutanter hvor nukleotid Tgg er erstattet med Agg, hvorpå kodonet GTG som koder for val in blir skiftet til GAG som koder for glutaminsyre. Den siste aminosyren er tilstede i et PLI-isolat fra en blanding av pektinolytiske enzymer (Ultrazym, Novo Industries, København) ervervet fra en A. niger stamme. Naturlig eller syntetiske mutanter av signalsekvensen med en lignende eller identisk hydrofobisitetsprofil, f.eks. hvori kodonet for de polare aminosyrene lysin (K^<+>), tyrosin (Y^_) og arginin (R^<+>) blir byttet med kodoner for andre aminosyrer med lignende ladninger, og de hydrofobe aminosyrene alanin (A), leusin (L) og treonin (T), er erstattet av kodoner for andre hydrofobe aminosyrer. For eksempel, så kan kodonet for den positivt ladete lysin bli erstattet av et kodon for arginin og vise versa, kodonet for det negativt ladete tyrosin av et kodon for glutamat eller aspartat, og/eller kodonet for den ikke-polare, hydrofobe alanin av en hvilken som helst av kodonen for treonin, prolin, valin, isoleusin, metionin eller fenylalanin, og lignende. Andre mutasjoner er "stille mutasjoner" hvori en eller noen få andre nukleotider, f.eks. opp til omtrent 30, er erstattet av en eller flere andre nukleotider, hvorpå de nye kodonene koder for den samme aminosyren(e).

DNA-sekvensene i formel I som er degenererte er, så som stille mutasjoner, slike som er degenererte innenfor meningen av den genetiske kode, hvorpå et ubegrenset antall nukleotider er erstattet av andre nukleotider uten forandring av aminosyresekvensen som de koder for. Slike degenererte DNA-sekvenser kan være nyttige på grunn av deres forskjellige restriksjonsseter.

Rekombinante DNA-molekyler som består av en DNA-sekvens av formel I eller et derivativ derav er spesielt rekombinante vektorer, alternativt benevnt hybride vektorer, som inneholder slike DNA-sekvenser som innskudd. De kan benyttes for kloning i verter, så som bakterier, sopp eller dyreceller. Slike hybride vektorer er avledet fra hvilke som helst vektorer som kan benyttes innenfor genetisk konstruerings-område, så som fra fag, kosmider, plasmider eller kromosomal DNA, så som derivativer av fag X, f.eks. NM 989, M13mp8 fag DNA(15) linerarisert ved BamHI kutting, bakterielle plasmider, f.eks. pBR 322, pUN121, pUC18, eller gjærplasmider, f.eks. gjær 2u plasmid, eller også kromosomal DNA, avledet f.eks. fra Aspergillus, f.eks. A. niger, for eksempel de som tilveiebringes av EP 184 438.

En hybrid vektor i denne oppfinnelsen, inneholder i tillegg til DNA-sekvensen fra formel I eller et derivativ derav, et replikasjonssete og helst, avhengig av type DNA-derivativ, en ekspresjonskontrollsekvens, så som en forsterkersekvens, oppstrøms aktiveringssete, promoter og signalsekvenser, og/eller strukturelle gener i korresponderende som er tilstede i A. niger avledede sekvenser. Slike forsterker-sekvenser kan bli avledet fra ekstrakromosomalt ribosomalt DNA fra Physarum polycephalum (PCT/EP 8500278), eller er oppstrøms aktiveringssetene fra syrefosfatase PH05 genet (EP søknad nr. 86 111 820.6), eller PH05, trp, PH05-GAPDH hybrid (EP søknad nr. 86 111 820.6), eller lignende promotere. Slike ekspresjonskontrollsekvenser kan bli festet til det strukturelle genet til PLI.

Strukturelle gener som er ligert til denne promoter, signal og/eller terminator-sekvensene er, med unntagelse av de som koder for PLI med eller uten introns, også homologe andre pektinlyasegener, og heterologe strukturelle gener som koder for et stort spekter av polypeptider, inkludert glykosylerte polypeptider, spesielt fra høyere eukaryoter, spesielt pattedyr, så som dyr eller spesielt human opprinnelse, så som enzymer som kan bli brukt, for eksempel, for fremstilling av næringsstoffer og for utføring av enzymatiske reaksjoner i kjemi, eller ikke-enzymatiske polypeptider, som er nyttige og verdifulle for behandling av mennesker og dyresykdommer eller for forhindring derav, for eksempel hormoner, polypeptider med immunomodulatorisk, anti-viral og anti-svulst egenskaper, antistoffer, virale antigener, vaksiner, koaguleringsfakto-rer , matvarer og lignende.

Eksempler på slike heterologt strukturelle gener er f.eks. de som koder for insulin, vekstfaktorer, så som epidermal, insulin-1ignende, mast-celle, nerve eller transformerende vekstfaktor, veksthormoner, så som humant eller bovine veksthormoner, interleukin, så som interleukin-1 eller -2, human makrofagmigrasjons-inhibitorisk faktor (MIF), interferoner, så som human a-interferon, for eksempel interferon-aA, aB, aD eller aF, e-interferon, -Y-interf eron eller et hybrid interferon, for eksempel et aA-aD- eller et aB-aD-hybrid interferon, hepatittvirus antigener, så som hepatitt B virus overflate eller kjerneantigen eller hepatitt A virus antigen, plasminogen aktivatorer, så som vevsplasminogen aktivator eller urokinase, kreftnekrosis-faktor, somatostatin, renin, p-endorfin, immunoglobuliner, så som lette og/eller tunge kjeder til immunoglobulin D, E eller G, immunoglobulin bindingsfaktor, så som immunoglobulin E bindingsfaktor, kalsitonin, human kalsitonin-relatert peptid, blodkoaguler-ende faktorer, så som faktor IX eller VIIIc, eglin, så som egl in C, desulfator hirudin, så som desulfatohirudin variant HVI, HV2 eller PA, eller human superoksyd dismutase. Gener som er å foretrekke er de som koder for et humant a-inter feron eller hybrid interferon, humant vevsplasminogenaktiva-tor (t-PA), hepatitt B virusoverflate antigen (HBVsAg), insulin-lignende vekstfaktor I, eglin C og desulfatohirudin, f.eks. variant EVI. I de hybride vektorene i denne oppfinnelsen, er den tilstedeværende promoter og/eller signalsekvensen operativt festet til den polypeptidkodende regionen for å forsikre en effektiv ekspresjon av polypeptidet.

DNA-molekylene i denne oppfinnelsen kan inneholde selektive markører avhengig av verten som skal bli transformert, selektert og klonet. Et hvilken som helst markørgen kan bli brukt som letter seleksjon av transformanter grunnet den fenotypiske ekspresjonen av markøren. Egnede markører er spesielt de som uttrykker antibiotikaresistanse, f.eks. mot tetracyklin eller ampicillin, eller, når det gjelder aukso-trofe gjærmutanter, gener som komplementer vertslesjoner. Korresponderende gener utøver, for eksempel resistanse til cykloheksimid antibiotika, eller tilveiebringer prototrofi i en auksotrofisk gjærmutant, for eksempel ura3, leu2, his3 eller trpl genet. Det er også mulig å benytte strukturelle gener som markører, som er assosierte med et autonomt replikerende segment hvis verten som skal bli transformert er auksotroft for produktet som uttrykkes av markøren.

Spesielt viktig er markørgener som komplementerer A. niger vertslesjoner, så som argB-genet som koder for ornitin karbamoyl transferase, f.eks. avledet fra A. niger eller A. nidulans (EP 184 438), eller A. nidulans DNA-fragmenter som er homologe til N. crassa pyr4 genet (26).

Fremstillinger som er å foretrekke i denne oppfinnelsen er hybride vektorer hvori det strukturelle genet, spesielt det fremmede strukturelle genet er operativt festet til promoteren og signalsekvensene i denne oppfinnelsen. Slike hybride vektorer som er å foretrekke er f.eks. pCG3Bll, ml3 mp8-PL (Sall-EcoFvI) BssHII/BE5, pUBE5, pLHK3, pLHL5 og pLHLT7. Andre nyttige hybride vektorer er pPL29-5 og pPL35-5 (se eksemplene og figurene).

DNA fra formel I og derivativer derav, inkludert fragmenter kan bli brukt for screening av DNA gen-banker eller mRNA for lignende DNA eller mRNA.

Rekombinant DNA-molekyl som koder for pektinlyaseekspresjons-system eller et derivativ derav kan fremstilles ved dyrking av en vert som er blitt transformert med et DNA-molekyl som inneholder en DNA-sekvens som koder for pektinlyase-ekspresjonssystemet eller et derivativ derav og isolering av det ønskede rekombinante DNA-molekylet eller derivativ derav, eller fremstilling av det ved bruk av in vitro syntese.

Dyrking av vertene blir utført i et konvensjonelt nærings-medium som kan bli supplementert med fjerne kjemiske forbind-elser som tillater negativ eller positiv seleksjon av transformantene, d.v.s. slike verter som inneholder det ønskede DNA-molekylet sammen med en seleksjonsmarkør, fra ikke-transformantene, d.v.s. slike verter som mangler det ønskede DNA-molekylet.

Hvilke som helst verter som det er mulig å transformere og som er nyttige kan bli brukt, f.eks. bakterier, så som E.coli, sopp, så som Saccharomyces cerevisiae, eller spesielt trådsopp, så som Aspergillus, f.eks. A. nidulans, A.oryzae, A. carbonarius, A. awamori og spesielt A. niger. En vert som er å foretrekke er A. niger An8, som er en ny mutant som mangler pyrA-genet, som beskrives mere nedenfor. Transformasjon av vertene blir utført ved konvensjonelle metoder.

DNA-sekvensen som koder for PL-ekspresjonssystemet tilveiebringes fra en trådsopp som inneholder et slikt system, spesielt fra et genomisk bibliotek derav eller også via mRNA. I det følgende blir fremstilling av PLI-ekspresjonssystemet beskrevet i mere detalj.

Et genomt bibliotek kan bli fremstilt f.eks. ved delvis kutting av genomt DNA til en A. niger stamme, f.eks. N756, med Sau3AI og kloning av DNA-fragmenter med høy molekylvekt inn i E.coli plasmid pUN121. En hvilken som helst A. niger stamme som fremstiller PLI kan benyttes som kilde for det genome biblioteket og likeledes kan andre egnede vektorer bli brukt som mottagere for fragmentene.

For å screene det genome biblioteket for DNA-sekvenser som koder for PLI, var det nødvendig å bestemme sekvensen til dette enzymet eller deler derav. PLI ble renset fra en kommersielt tilgjengelig blanding av pektinolytiske enzymer fra A. niger (Ultrazym, Novo Industries) og sekvensert. N-termini av moden PLI viste sekvensen

og et fragment av PLI, som var tilveiebragt ved splitting av PLI med cyanogen-bromid, viste følgende N-terminale sekvens

hvori aminosyrene X på det tidspunktet ikke hadde blitt identifisert.

Basert på disse aminosyresekvensene ble et antall DNA-prober, d.v.s. blanding av DNA-sekvenser som koder for deler av aminosyresekvensene og de korresponderende degenererte DNA-sekvensene, kjemisk syntetisert og brukt for screening. Slike DNA-prober innbefatter for eksempel blandingene med følgende formler hvori Ri er A,C, G eller T, R2er C eller T og R3er A eller G, eller DNA-blanding 2060 ved følgende formel

hvori R^er A eller T, R2er A, T eller C og R3er A eller G.

Siden den totale DNA-sekvensen til PLI-genet ble kjent i løpet av dette arbeidet, kan hvilken som helst del derav som har minst omtrent 14 bp bli brukt for screening, som også innbefatter screening for mRNA som koder for PL systemet.

På grunn av screeningen blir DNA-probene 5' radioaktivt merket ved bruk av fremgangsmåter som er kjent innenfor fagområdet ved bruk av -y<32>P-ATP og T4 kinase. Verts-mikroorganismer som bærer nukleinsyrer fra denne oppfinnelsen som et innskudd, blir identifisert ved hybridisering med den merkede DNA-proben på filterreplika av genbiblioteket.

For å etablere et sub-bibliotek, kan kloner fra biblioteket, som viser en radioaktiv respons til den radioaktivt merkede DNA-proben som koder for den N-terminale delen av PLI bli isolert, dyrket og hybridisert med den andre DNA-probe som koder for de N-terminale aminosyrene fra CNBr fragmentet, som beskrevet før.

Kloner som viser en hybridiseringsrespons til en eller begge DNA-prober blir isolert og amplifisert.

For eksempel, så viste screening med DNA-probene 2014 og 2015 33 og 39 positive kloner, respektivt. De 72 klonene ble amplifisert og de oppnådde sub-bibliotekene ble igjen screenet med DNA-probe 2060 hvorpå 3 positive kloner kunne bli identifisert. En klon ble selektert og kalt E. coli BJ 5183/pCG3Bll. Den inneholder plasmid pCG3Bll hvorpå et delvis restriksjonskart er vist i figur 1. Sau3AI-fragmentet av pCG3Bll inneholder det Spel-Nhel fragmentet vist i figur 4 og formel I.

Plasmid pCG3Bll kan bli brukt for konstruering av andre DNA-molekyler i denne oppfinnelsen ved bruk av konvensjonell genetisk konstrueringsteknikker.

For eksempel, restriksjon av pCG3Bll med EcoRI og kloning av de to fragmenter inn i plasmid pUN121 fører til plasmid pPL 29-5 (Fig. 2) som inneholder promoteren, signalsekvensen og deler av det strukturelle PLI-genet opp til det sentrale EcoRI restriksjonssetet ved posisjon 649/650, og til plasmid pPL35-5 (Fig. 3) som inneholder deler av PLI-strukturelle genet som begynner ved posisjon 650 og terminatoren. pPL 29-5 inneholder videre de flankerende N-terminale sekvensene og pPL35-5 de flankerende C-terminale sekvensene til pCG3Bll.

Fragmentene til innskuddene i plasmidene pPL29-5 og pPL35-5 kan tilveiebringes for sekvensering ved restriksjon med egnede enzymer, så som Ahalll, PstI, Aval, Hindlll, EcoRI, Kpnl, Clal, Ncol, AccI, Sali, Pvul, Salll, Nhel, Bgll, EcoRI og EcoRV. Fragmentene kan bli subklonet, f.eks. inn i forskjellige M13 fag, helst M13mp8 og M13mpl8, og sekvensert, f. eks. ved bruk av M13 kloning- og sekvenseringskit (M13 sekvenseringskit N.4502, Amersham) som er de betingelsene som ble gitt av forhandleren (16). Hele sekvensen av det 2.7 kb Spel-Nhel fragmentet, som inneholder hele sekvensen til PLI-genet, er vist i figur 4. Det inneholder 688 nukleotider av promoterregionen, 1369 nukleotider av den strukturelle delen av PLI-genet og 661 nukleotider av terminatorregionen. 57 nukleotider som koder for signalpeptidet ved følgende formel

som går forut for sekvensen til pPL29-5, som korresponderer til aminosyresekvensen til N-termini til PLI som ble bestemt ved aminosyresekvensanalyse (eksempel 1).

Aminosyresekvensen til N-terminale enden av det C-terminale CNBr-fragmentet til PLI (Eksempel 3) blir ikke kontinuerlig kodet for av det klonede DNA-fragmentet til pPL35-5 (nukleotid 1257-1379). Leting for consensus sekvenser av ekson/- intron spleisede grenser likeledes for intron indre sekvenser (Boel E. et al. (18) og Mount S.M. (19)) ved bruk av data leder til tilstedeværelsen av fire introner med lengder på 65 bp, 62 bp, 63 bp og 57 bp respektivt (Fig. 4).

En fag, tilveiebragt fra fagene M13mp8 og det 0.8 kb Sall-EcoRI-fragmentet til plasmid pPL29-5, som inneholder 130 nukleotider av promoteren og den N-terminale delen av PLI-genet, blir betegnet M13mp8 (SalI-EcoRI), og blir brukt i videre steg for fremstilling av andre DNA-molekyler i denne oppfinnelsen.

Slike DNA-molekyler i oppfinnelsen som inneholder fragmenter av DNA-sekvensen fra formel I kan bli konstruert som beskrevet i figurene 5 til 9, hvorpå, når ønskelig, kan restriksjonsseter bli introdusert, f.eks. et BssHII restriksjonssete innenfor signalsekvensen til PLI-genet. Slike DNA-molekyler er plasmidene eller fagene, respektivt, pUBE5, MBmp8-PL(SalI-EcoRI)BssHII/BE5 (fig. 5), pLHK3 (fig. 7), pLHL5 , ml3mpl8-PL(SpeI-EcoRI)BssHII/AC5 pLHLT7 (fig. 9), hvorpå de siste tre plasmidene inneholder det strukturelle genet som koder for desulfatohirudin.

Mutanter som inneholder nye restriksjonsseter kan bli fremstilt, for eksempel in vitro ved bruk av sete-rettet mutagenese, i henhold til konvensjonelle metoder [se over-siktsartikkel til M.J. Zoller og M. Smith, Methods Enzymol. 100, 468 (1983), D. Botstein og D. Shortle, Science 229, 1193 (1985 ) eller K. Norris et al., Nucl. Acids Res. 11, 5103

(1983)] .

For eksempel, er en mutant med disse DNA-sekvensene avledet fra en M13mp8PL(Sal-EcoRI) fag som inneholder promoteren og det utskillende signalgenet til PLI. Introduksjon av et nytt BssHII setet inn i signalsekvensregionen til M13mp8PL(Sal-EcoRI) genet blir utført ved bruk av en kjemisk syntetisert primer, oligonukleotid, som er komplementær til DNA-sekvensen ved posisjonene 36 - 54 som ligger nær den C-terminale delen av PLI signalsekvensen, med unntagelse av at posisjon 45 a C/G transversjon (mutagen primer) er introdusert.

Det muterte faget, som inneholder det nye BssHII setet blir betegnet som M13mp8PL (Sal-EcoRI) BssHII og kan bli brukt for konstruksjonen av ekspresjonsvektorer for homologe eller heterologe gener.

I et korresponderende eksempel blir desulfatohirudin-genet til pML310 (EP 168 342) på nytt klonet inn i fag M13mpl8-PL(SpeI-EcoRI)BssHII/AC5 (fig. 6 til 9). Et Hgal/BssHII linker blir konstruert, for å gjøre Hgal restriksjonssetet til det desulfatohirudin genet til pML301L kompatibelt med BssHII til M13mpl8-PL(SpeI-EcoRI)BssHII/AC5. Linker DNA blir ligert til det kuttede fag DNA'et. Fag DNA'et som inneholder linker-fragmentet blir kuttet med Hindlll, som gir to fragmenter. 0.7 kb fragmentet, som innbefatter signalstruk-turen til PLI og linkerf ragmentet blir isolert. En egnet replikasjonplasmid, som inneholder et BamHI restriksjonssete, så sompBR322, blir kuttet med BamHI. Genet som skal klones blir kuttet ut av det genome DNA'et, plasmid eller fag DNA'et med egnede restriksjonsenzymer og, hvis nødvendig, blir utstyrt med de nødvendige kompatible restriksjonssetene.

En annen metode for å gjøre restriksjonsseter kompatible er in vitro mutagenese, som for eksempel utføres ved konstruksjon av pML301L (fig. 6). En linker som inneholder et Hgal restriksjonssete blir konstruert og festet til 5'-terminal-enden av desulfatohirudin-genet.

For å oppnå høyere ekspresjonsgrader, kan hvilken som helst eukaryote terminatorsekvenser bli ligert til enden av det strukturelle genet. I en foretrukket fremstilling av oppfinnelsen, blir terminatorregionen av PLI-genet brukt. For eksempel så kan en ekspresjonsvektor som inneholder terminatorsetet til PLI bli oppnådd ved modifikasjon av den ovenfor beskrevne fremgangsmåten på følgende måte. Promoteren og utskillings-signalsekvenser tilveiebringes fra plasmid M13mpl8-PL(Spel-EcoRI)BssHII/AC5. Terminatorregionen tilveiebringes fra pPL35-5. M13mpl8-PL(SpeI-EcoRI)BssHII/AC5 blir kuttet med BssHII og et BssHII-Hgal linker blir ligert. Som modifikasjon, blir plasmid pPL35-5 kuttet med Pstl, som gir to resulterende fragmenter hvorpå en egnet linker, som er kompatibel med 3' enden av det klonede genet ligert. De klebrige endene til Pstl av restriksjonssetene blir fylt opp ved bruk av enzymet T4-polymerase og en BamHI linker blir tilsatt, for eksempel fra Biolabs, New England. pPL35-5 plasmidet blir kuttet med Nhel og det resulterende 0.7 kb fragmentet, som inneholder terminatorregionen til PLI, blir isolert. For amplifikasjon kan et hvilket som helst plasmid som har kompatible restrikssjonsseter blir brukt, f.eks. pUC18. Når det gjelder pUC18, blir plasmidet kuttet med Hindlll og Xbal. Fire DNA-fragmenter, M13mpl8-PL(SpeI-EcoRI)BssHII/AC5-fragment, som inneholder Bss HII-Hgal linker, 0.7 kB fragmentet til pPL35-5, som inneholder BamHI linker, Hindlll/Xbal kuttet pUC18 og Hgal-BamHI fragmentet til desulfatohirudin-genet, blir ligert for å danne pLHL7 (fig. 9).

Bakterier blir transformerte ved bruk av konvensjonelle metoder og transformantene identifisert ved hjelp av deres resistens, f.eks. mot tetracyklin.

De beskrevne ekspresjonsvektorene blir amplifisert i egnede E. coli vertsstammer, så som HB101, transformert (10) og selektert ved konvensjonelle metoder. Det amplifiserte plasmid DNA'et blir isolert fra bakterien ved bruk av konvensjonelle metoder, spesielt som beskrevet av Birnboim & Doly (17).

PÅ lignende måte kan andre plasmider med andre homologe eller heterologe gener bli konstruert.

DNA-molekylene i denne oppfinnelsen kan også bli fremstilt ved en in vitro syntese i henhold til konvensjonelle metoder. In vitro syntese er spesielt nyttig for fremstilling av mindre fragmenter av PL ekspresjonssystemet, f.eks. av DNA-sekvensene som koder for promoteren eller spesielt signalsekvensen til PLI, eller mutanter derav.

DNA-molekyler i oppfinnelsen som inneholder PLI-promoter og helst PLI-signalsekvens, PLI-strukturelle genet, et hvilket som helst annet heterologt strukturelt gen og/eller PLI-terminatoren kan også bli brukt til å transformere trådsopp, så som Aspergillus, Penicillium eller Cephalosporium, f.eks. A. nidulans, A. oryzae, A. carbonarius og spesielt A. niger.

For å tillate seleksjon av transformert fra ikke-transformerte sopp, så bærer DNA-molekylene i oppfinnelsen en selekteringsmarkør eller, alternativt, så blir sopp co-transformert med en annen vektor som inneholder en slik markør. Som i andre systemer er slike seleksjonsmarkører et strukturelt gen som kan uttrykkes, hvorpå det uttrykte polypeptidet (et enzym) tilveiebringer resistens mot forbind-elser som toksiske for transformanten eller som fullfører enzymsystemet til en mutant som mangler et slik essensielt polypeptid. Slike markørgener er for eksempel de kjente ga-2, pyrG, pyr4, trpC, amdS eller argB gener.

Innenfor rammen av oppfinnelsen ble et nytt markørgen, kalt pyrA, isolert fra det genome biblioteket til A. niger, som er relatert til og har lignende funksjoner som pyrG til A. nidulans og pyr4 til N. crassa, som fremstiller enzymet orotidin 5'-fosfatdekarboksylat. Dette enzymet katalysatorer dekarboksyleringen av orotidin 5'-fosfat til uridylin-syre (uridin 5'-fosfat) og også til fluoro-orotinsyre til det toksiske fluoro-uridin. En E. coil klon som inneholder pyrA genet ble identifisert ved hybridisasjon med 1.1 kb Hindlll fragmentet til pDJB2 (26) som inneholder deler av pyr4-genet, men, DNA fra en hvilket som helst annen pyr gen som koder for orotidin-5'-fosfat dekarboksylase kan bli brukt. Fra en positiv klon kalt E. coli B75183/pCG59D7, ble plasmidet pCG59D7, som inneholder pyrA-genet isolert, og brukt til ko-transformasjon av en A. niger pyrA" mutant. En slik pyrA-mutant har et defekt orotidin 5 '-fosfat-dekarboksylase-gen og derfor ikke fremstille det korresponderende enzymet. En slik mutant ble fremstilt ved å behandle konidiosporer fra A. niger N756 med en muterende UV-bestråling og koloniene som overlevde ved tilstedeværelse av fluoro-orotin-syre og uridin ble selektert. Kolonier som overlevde ved tilstedeværelse av fluoroorotinsyre og uten uridin ble eliminert. De gjenværende uridin-krevende mutantene, i henhold til deres mulighet av å bli transformerte, hører til to komplementasjonsgrupper pyrA og pyrB, som er representert ved mutantene An8 og AnlO, respektivt. De blir behandlet i form av protoplaster under transformende betingelser med pyrA inneholdende plasmid pCG59D7. Bare An8 koloniene ble transformerte og inneholdt pyrA-genet som ble klartlagt med hensyn til hybridiserings-muligheten som kuttet DNA derav hadde med DNA fra pTJN 121.

Oppfinnelsen vedrører videre verter transformert med de hybride vektorene i oppfinnelsen. Slike transformanter er for eksempel bakterier, så som E. coli eller trådsopp, så som Aspergillus, Penicillium eller Cephalosporium, og spesielt A. nidulans, A oryzae, A. carbonarius eller helst A. niger, f.eks. A. niger An8.

Beskrivelse av figurene.

Figur 1 viser restriksjonskartet til plasmid pCG3Bll som inneholder et Sau3AI fragment fra A. niger stamme N756 Figur 2 viser restriksjonskartet til plasmid pPL29-5 som inneholder det N-terminale EcoRI fragmentet fra DNA'et fra formel I Figur 3 viser restriksjonskartet til plasmid pPL35-5 som inneholder det C-terminale EcoRI fragmentet fra DNA'et i formel I Figur 4 viser DNA til formel I, som indikerer noen restrik-sj onsseter, og signalet og strukturelle aminosyresekvenser til PLI Figur 5 viser konstruksjonen av pUBE5 fra M13mp8-PL(SalI-EcoRI)BssHII/Be5 og pUN121. pUBE5 inneholder deler av PLI-promoteren, signalsekvensen med BssHII restriksjonssetet, og deler av det PLI strukturelle genet Figur 6 viser konstruksjonen av pML310L som inneholder

desulfatohirudin-genet

Figur 7 viser konstruksjonen av pLHK3 som inneholder deler av PLI-promoteren, signalsekvensen med BssHII restriksjonssetet, linker BssHII-Hgal, og desulfatohirudin-genet Figur 8 viser konstruksjonen av pLHL5 som inneholder PLI

promoteren, signalsekvensen med BssHII restriksjonssetet og desulfatohirudin-genet

Figur 9 viser konstruksjonen av pLHLT7 som inneholder PLI-promoteren, signalsekvensen med det BssHII restriksjonssetet, desulfatohirudin-genet og PLI-terminatoren.

Forkortelsene har følgende betydning:

bp basepar

BSA bovin-serumalbumin

cpm tellinger pr. minutt (radioaktivt forfall)

dATP 2'-deoksyadenosin-trifosfat

dCTP 2'-deoksycytidin-trifosfat

dGTP 2'-deoksyguanosin-trifosfat

dTTP 2'-deoksytymidin-trifosfat

dNTP blanding av dATP, dCTP, dGTP og dTTP

CIAP alkalisk fosfatase fra kalve-tarm

DNA deoksyribonukleinsyre

DTT 1,4-ditiotreitol

EDTA etylendiamintetraeddiksyre dinatriumsalt

t timer

IPTG isopropyl-p<->D-tio-galaktopyranosid

kb kilobaser

min minutter

PL pektinlyase I

PTH fenyltiohydantion

RF-DNA dobbel-trådet replikativ form DNA

RNA ribonukleinsyre

rpm omdreininger pr. minutt

SDS natrium-dodecyl-sulfat

ss enkel-trådet

RT romtemperatur

Tris tris(hydroksymetyl)-aminometan

tRNA transfer RNA

U enheter

jjg mikrogram

vol volum

X-GAL 5-bromo-4-kloro-3-indonyl-p<->galaktosid

Buffere, media, reagenser:

ss-Denhardt 0.02 % ficoll (Sigma), 0.02$ polyvinyl- pyrrolidon (Sigma), 0.02% BSA (Sigma), 100 )jg/ml denaturert laksespermie DNA (Sigma)

EcoRI buffer 0.01 M Tris EC1 pH 7.5 0. IM NaCl 0.01 M

MgClg- 1 niM 2-merkaptoetanol

Hgal buffer 50 mM NaCl, 10 mM MgCl2, 1 mM DTT, 100

jjg/ml BSA, 6 mM Tris-HCl pH 7.4

IPTG 100 mM Isopropyl-e-D-tio-galaktopyrano side

(23.8 mg/ml i H20)

fremstill like før bruk

LB-medium 1 # Bacto-trypton (Difco), 0.5 % Bacto gjærekstrakt (Difco), 170 mM NaCl, justert til pH 7.5 med NaOH ligeringsbuffer 20 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl2, 10 mM ditio-erytritol, 0.6 mM ATP, pH 7.6

TBE-buffer 1 liter inneholder 10.8 g Tris, 5,5 g

borsyre, 4 ml 0.5 M EDTA (pH 8.0)

TE-buffer 10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 1 mM EDTA

lav TE-buffer 10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 0.1 mM EDTA

topp-agar pr. liter 10 g bakto-trypton, 8 g NaCl, 8 g

agar

2xTY-medium pr. liter 16 g bakto-trypton, 10 g gjærekstrakt, 5 g NaCl

X-GAL 2 % (5-bromo-4-kloro-3-indonyl-p<->galakto-sid) i dimetylformamid, fremstill like før bruk

SOC-medium 2 % Bakto-Trypton (Gibco), 0.5 % Gjærekstrakt (Gibco), 10 mM NaCl, 2.5 mM KC1, 10 mM MgCl2, 5 mM MgS04, 20 mM Glukose

kinase-buffer 50 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl25 mM DDT (pH

7.5 )

X-gal plater 0.002 % X-Gal, 0.07 mM IPTG

NET 0.15 M NaCl, 0.015 M Tris-HCl (pH 7.5) 1 mM

EDTA

minimal-medium

for E. coli 0.6 % Na2HP04, 0.1 4 NH4C1, 0.05 * NaCl, 1 ;mM MgS04, 0.01 mM CaCl2, 1 mM tiamin-HCl, 0.2 % glukose ;minimal-medium ;for A. niger 1 liter inneholder 6 g NaNOs, 0.52 g KC1, ;0.52 g MgS04x 7 H20, 1.52 g KH2P04 , spor av Zn, Fe, 10 g glukose, justert til pH 6.5 med NaOH ;komplett medium ;for A. niger Mycophil-Agar (BBL) ;PCT 25 % polyetylenglykol 6000 (Merck, Darm-stadt) i 10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 50 mM CaCl2;sporulerings- ;medium 10 g/l fytonpepton, 10 g/l glukose, 10 g/l ;agar ;SSC 0.15 M NaCl, 0.015 M natriumcitrat ;Når det gjelder skåler blir alle medier faste ved tilsetting av 1.5% Bacto agar (Difco). ;Følgende stammer blir brukt: ;E. coli stamme HB101: F-,hsdS20(r"Bm-B), recA13, aral4, proA2, lacYl, galK2, rpsL20(str<R>), xyl-5, mtl-1, supE44, \ ;(Maniatis et al. (8)) ;E. coli stamme BJ5183: F~, endA, sbcB", recBC-, galK, met-, str<R>, thi-1, bioT, hsdR(rK, mK<+>), X (Hanahan (10)). ;E. coli stamme JM101; supE, thi, a(lac-proAB), (F',traD36, proAB,lacl9ZAM15) (Yanish-Perron et al. 25)). ;Aspergillus niger stamme N756): En A. niger stamme N756 er blitt selektert for å oppnå en høy produksjon av pektinolyt-isk kompleks enzymer. ;Følgende vektorer er benyttet: ;M13mp fag. ;M13mp8,9,18,19 vektorer (28) er derivativer av enkel-trådet DNA-bakteriofag M13 og er fremstilt for å lette DNA-sekvensering ved å tillate kloning av DNA-fragmenter ved et allsidig polylinker-sete og kloning av det samme restriksjonsfragmen-tet i begge mulige orienteringer. Sekvenser som er klonet inn i disse vektorene kan lett bli brukt som templater for sekvenseringsreaksjoner eller for fremstilling av enkelt-trådete prober ved bruk av en standard oligodeoksyribo-nukleotid-primer og Klenowfragmentet til E. coli DNA polymerase I. Vektor DNA'et bærer E. coli lac-operon-promoteren og den genetiske informasjonen av de første 145 aminosyrene til p-galaktosidase. Polylinkersekvensene som inneholder flere restriksjonsseter blir satt inn i lacZ sekvensen. Polylink-eren opprettholder lacZ-leserammen og vektoren gir allelisk komplementasjon av LacZa vertsstammen, som gir blå plaques på skåler som inneholder IPTG og X-gal. Rekombinante fag som inneholder innskudd som ødelegger leserammen eller på andre måter interfererer med ekspresjon av lacZa-peptidet sees som fargeløse plaques. ;pUC18 plasmid. ;pUC18 plasmid (28) kan benyttes for kloning av DNA-sekvenser i lacZa-området som tilveiebringer en deteksjon for transformanter som inneholder rekombinante plasmider på grunnlag av deres Lac-fenotyp. Bakterier som inneholder plasmider uten innskudd lager blå kolonier på indikatorskålene (skåler med X-gal) mens de som inneholder rekombinante plasmider lager hvite kolonier. Plasmid pUC18 inneholder unike kloningsseter i lacZa-området som passer til M13mpl8-fag. Plasmidet bærer et gen for amp<R>. ;pML 310 plasmid. ;pML 310 er beskrevet i Europa patentsøknad nr. 0168342, pML310 erkarakterisertgjennom amp<R>, trp-promoteren og et gen som koder for desulfatohirudin, en trombin-inhibitor som naturlig fremkommer i igler. ;pUN121 plasmid. ;Plasmid pUN121 (Nilsson et al. (9)) kan bli brukt som en kloningsvektor som tillater positiv seleksjon av transformanter som inneholder plasmider med DNA-innskudd. Plasmidet inneholder cl-genet til bakteriofag lambda, og tet-genet. Bakterier som inneholder pUN121 er sensitiv for tetracyklin da tet-genet blir transkribert fra den høyre promoteren til bakteriofag lambda og denne promoteren kan bli undertrykt av cl-kodete repressoren. Innskudd av DNA-framgenter inn i et av setene i cl-genet inaktiverer repressor-genet, som gir tetracyklin-resistente transformanter. I tillegg har plasmid pUN121 et funksjonelt amp-gen slik at amplifisering av plasmid DNA kan bli utført under selektive betingelser. ;pBR322 plasmid. ;Plasmid pBR322, inneholder gener for resistens mot antibiotika ampicillin (amp<R>) og tetracyklin (tet<R>). Plasmidet inneholder flere unike kloningsseter, hvorpå noen ligger i enten amp eller tet-genet slik at innskudd av klonet DNA fører til antibiotika-sensitive bakterier. ;pDJB2 plasmid. ;Dette plasmidet er blitt beskrevet av Ballance og Turner (26). ;Eksempel 1: Isolering og karakterisering av pektinlyase ;I. ;Eksempel 1. 1; Aminosyre sekvens-bestemmelse av den N-terminale delen av pektinlyase I. ;Pektinlyase I blir renset fra Ultrazym (en blanding av pektinolytiske enzymer fra A. niger, Novo Industries, København) analog til fremgangsmåten beskrevet av F.E.A. van Houdenhoven (1). To mg pektinlyase I blir dialysert mot flere liter destillert vann og deretter frysetørret. Proteinet blir oppløst i 1.5 ml 100 mM NaHC03, pH 10.0 og holdt ved romtemperatur i 3 t. Denne behandlingen fører til økning i antall steg, som trygt kan bli sekvensert ved bruk av den automatiske Edman-degraderingsfremgangsmåten (2). Etter behandling med alkali blir proteinet dialysert mot 1 liter destillert vann, 1 % maursyre og destillert vann. Automatisk Edman degradering blir utført i en Beckman spinnende-kopp sekvenator, modell 890 C. Det intakte reduserte og karboksymetylerte proteinet ble degradert ved bruk av en kvadral enkel-kuttings-program (modifikasjon av Beckman program 072172 C). Degradering av peptidet blir utført ved bruk av et dimetylbenzylamin enkel-kuttings-program (Beckman program 082773) eller programmet til Hunkapiller og Hood. For å forhindre utvasking av peptidet, ble 2.5 mg torske-parvalbumin brukt som en bærer (3). Fenyltiohydantoin-derivativer av aminosyrene "ble identifisert ved høy-utførelse væske-kromatografi i henhold til metoden til Frank og Strubert (4). Følgende N-terminale aminosyresekvens er bestemt for pektinlyase I: ;V-G-V-X4-G-T-P-E-G-F-Å ;Aminosyre X4er sannsynligvis ser, men dets tilstedeværelse er ikke blitt helt bestemt. ;Eksempel 1. 2; Fremstilling av cyanogen-bromid-fragmenter ;av pektinlyase I. ;Reduksjon og S-karboksymetylering av pektinlyase I blir utført i henhold til Crestfield et al. (5). 3 g urea (ultra ren) blir løst opp i 5 ml destillert vann og rørt med 0.5 g blandet-bed ione-bytter (Biorad Ag 50 1-X8) i lt. Etter fjerning av ione-bytter-kulene, blir 10 mg EDTA og 200 mg Tris tilsatt til 4 ml av ureaoppløsningen og pH blir justert til 8.5 med HC1. Oppløsningen blir fylt opp til et finalt volum på 5 ml i et rør med destillert vann. Deretter blir 5-20 mg pektinlyase I renset som beskrevet av F.E.A. van Houdenhoven (1) blir tilsatt og røret blir holdt under en nitrogenbarriere. ;Til slutt blir 33 ul g<->merkaptoetanol tilsatt og reduksjonen fortsetter i 4 t romtemperatur under nitrogenbarriere. 0.33 ml av en nylig laget løsning (0.268 g jod-eddiksyre i 1 ml IN NaoH) blit tilsatt under nitrogen til reaksjonsblandingen og holdt i mørke i 15 min. ved romtemperatur. ;Reaksjonen stoppet ved tilsetting av p<->merkaptoetanol. Deretter ble det karboksymetylerte proteinet applisert på en Sephadex G-25 gelfi 1treringskolonne (100 ml bed-volum) som blir trukket med aluminiumsfolie og eluerte med 0.5% maursyre. Proteinfraksjonene blir slått sammen og frysetørret. Karboksymetylert pektinlyase I (2-10 mg) blir løst opp i 70 % maursyre og fast cyanogen-bromid blir tilsatt i 1 omtrentelig hundre-ganger molart overskudd til metionin hvorpå 1 residie er til stede pr. pektinlyase I. Reaksjonsblandingen røres kontinuerlig i 24 t ved romtemperatur i et lukket reaksjons-rør. Prøver på 5 pl blir tatt ut ved fastsatte tidsinterval-ler og analysert på 15 % SDS-PAGE for å analysere i hvilken grad proteinet er blitt splittet. Etter 24 t blir vann tilsatt og preparatet blir delvis fordampet ved spruting med nitrogen. Dette steget gjentas for å fjerne maursyre. ;SDS-PAGE analysene identifiserer, i tillegg til noe gjenværende pektinlyase I, to cyanogen bromidpeptider, CBI og CBII med molekylvekter på 16.5 kD og 30 kD. Rensing av disse fragmentene utføres ved gel-permeasjonskromatografi ved bruk av en Sephacryl-S200 kolonne (lengde 190 cm, 0 1 cm) ekvili-brert i 20 mM natriumf osfatbuf f er pH 6.0, 100 mM NaCl, 4 M urea og 1 % (v/v) g<->merkaptoetanol. CB II fragmentet fremkommer i to topper, en topp som eluerer til og med før det gjenværende intakte proteinet og som derfor må representere et aggregat og en annen topp som kommer i mellom det intakte proteinet og det lille CBI-fragmentet. ;Eksempel 1. 3: Aminosyresekvensbestemmelse av den N-terminale delen av CB II til pektinlyase I. ;200 >jg av det rensede ikke-aggregerte CB II fragmentet i eksempel 1.2. blir brukt for de automatiske Edmon degrader-ingene (2) ved bruk av en Beckman spinnende-kopp sekvenator. ;Overføring til PTH aminosyrene skjer etter fordamping av fraksjonene og tilsetting av 200 pl 2N HC1 i metanol til residiet i 15 min. ved 65°C. Løsningen ble deretter igjen fordampet og residiet blir tatt opp i 50 ul THF/CH3CN (1:1). PTH-aminosyrene blir identifisert ved HPLC ved bruk av en Zorbax CN<R>kolonne (Du Pont) i henhold til R. Knecht et al. (6). ;N-terminal aminosyresekvens til CB II er som følger: V-S-G-V-S-N-I-I-I-Q-N-I-A-V-X15-D-I-N-Xig-E ;X^5og X19er aminosyreresidier som ikke er blitt identifiserte. ;Eksempel 2: Konstruksjon av et genomt bibliotek fra ;Aspergillus niger. ;Eksempel 2. 1: Isolasjon av DNA med høy molekylvekt fra ;Aspergillus niger. ;Isolasjon av høy molekylvekt A. niger DNA utføres i følge Yelton et al. (7). Konidiosporer fra A. niger stamme N 756 blir inokulert i 200 ml minimal medium som inneholder 0.1 % arginin og rystet i 500 ml flasker med en brønn ved 28° C på en roterende rister i 2-3 dager. Myceliet blir høstet ved filtrering, vasket med kaldt sterilt vann, frosset og gjort til pudder i væske-nitrogen. Cellene blir raskt suspendert i 20 ml 50 mM EDTA pH 8.5, 0.2 % SDS og 20 ul dietylpyrokarbo-nat og lysert ved vigorøs risting i 1 min ved romtemperatur. Lysatet varmes opp til 68°C i 15 min., avkjøles til romtemperatur og sentrifugeres i 15 min ved 12000 g ved RT. 16 ml av supernatanten blir overført til et nytt rør og etter tilsetting av 1 ml 8 M kaliumacetat pH 4.2 ble den satt på is i 1 t. Presipitatet blir sentrifugert ved 25000 g i 15 min. ved 4°C. 12 ml av supernatanten blir gjenvunnet og nukleinsyrene presipitert med 12 ml isopropanol. Presipitatet pelleteres ved sentrifugering i 1.5 min. ved 12000 g og pelleten resuspendert i 2 ml TE som inneholder 10 pg/ml RNAseA (Boehringer, Mannheim). DNA-fragmentene blir ekstrahert med kloroform/fenol og presipitert med etanol som beskrevet i Maniatis et al. (8) på sidene 458-459 og 461-462. ;Eksempel 2. 2: Kloning av høymolekyl-vekt DNA-fragmenter fra Aspergillus niger inn i pUN121. Høymolekyl-vekt DNA fra eksempel 2.1. (100 pg) blir presipitert ved sentrifugering og pelletene resuspendert i 750 pl buffer som består av Tris-HCl 6 mmol/1, NaCl 50 mmol/1, MgClg 6 mmol/1, pH 7.5. Partielle kuttinger blir utført med Sau3AI, med konsentrasjoner innenfor området 0.25-0.01 U/pg i 60 min. ved 37°C. Reaksjonene blir avsluttet ved tilsetting av EDTA til en final konsentrasjon på 20 mM. ;De delvis kuttede DNA-fragmentene blir separert på en 0.45 % agarosegel. Lambda DNA kuttet med Hindlll blir brukt som en markør for bestemmelse av størrelsen på de delvis kuttede DNA-fragmentene. Gelområdet som inneholder de ønskede fragmentene i området på 15 kb til 20 kb blir kuttet ut og overført til en prøvebrønn på en ISCO elektroforetisk konsentrator (ISCOGmbH), dekket med 0.1 TBE og elektroeluert ved 1 watt i 90 min. DNA-f ragmentene blir ekstrahert med kloroform/fenol og presipitert med etanol. 4 pg av de delvis kuttede DNA-fragmentene blir resuspendert i H20 og ligert i 15 t ved 15° C til 1 pg pUN121 plasmid DNA (Nilsson et al. (9)), linerarisert med BC1I, i et totalt volum på 106 pl ligeringsbuf f er med 6U T4 DNA-ligase (Boehringer, Mannheim). 10 pl aliquoter av denne sammensmeltings-blandingen blir satt til 210 pl kompetente E. coli PJ5183 celler, som er blitt klargjorte for transformasjon som beskrevet av Hanahan (10). Cellene blir holdt på is i 30 minutter og varmet opp til 42°C i 90 sek., satt på is i 2 min., 800 pl SOC-medium ble tilsatt og cellene ble inkubert ved 37°C i 1 t. Cellene spres på 10 cm agarskåler inneholdende LB-medium supplementert med 8 mg/l tetracyklin (SIGMA). Skålene ble inkubert ved 37°C i 16 t. Omtrent 6000 transformerte kolonier blir oppnåddkarakterisert vedderes tetra-cyklinresistens. Effektiviteten er omtrent 12000 til 20000 tetracyklin-resistente kolonier pr. pg pUN121 DNA. ;Plasmidanalyse på 11 fritt valgte rekombinante kloner indikerer et gjennomsnittlig DNA innskudd på 10 kb. For å representere genomet til A. niger (4.5 x IO<7>bp) i biblioteket nesten 4 ganger, ble 15360 tetracyklin resistente kolonier plukket og latt vokse individuelt over natt i brønnene på mikrotiterplater i LB-medium supplementert med 8 mg/l tetracyklin. Etter inkubering blir glyserol tilsatt til 50 % v/v og mikrotiterplatene blir oppbevart ved -70°C. ;Eksempel 3: Screening av det genome biblioteket til A. ;niger for nukleinsyrer relatert til PLI. ;Eksempel 3. 1: Fremstilling av filter-kopien fra biblioteket . ;For isolering av pektinlyase I genet fra DNA-biblioteket som er oppnådd som beskrevet i Eksempel 2.2., ble filterkopier fra de 15360 valgte transformerte E. coli BJ5183 celler laget ifølge metoden beskrevet av Gergen et al. (11). Cellene blir overført fra mikrotiterplater til agarskåler supplementert med 8 mg/l tetracyklin ved bruk av et stempel og latt vokse over natt ved 37°C. Spesielt kuttede Whatman 541 filter papir (114 x 175 mm per 192 kloner) blir plassert på toppen av koloniene. Etter 2 t ved 37°C blir filtrene overført til LB-plater som inneholder 250 mg/ml kloramfenikol (Sigma, St. Louis, USA) og inkubert over natt ved 37° C. Filtrene ble vasket to ganger i 0.5 M NaOE, to ganger i 0.5 M Tris HC1, pH 7.4, vasket to ganger i 2 x SSC og deretter lufttørket. Filterkopiene kan bli brukt for flere hybridiseringseksperi-menter, men først er nødt til å gå gjennom vaskingstrinnene som er nevnt ovenfor. ;Eksempel 3. 2: Syntese av oligonukleotidblandinger. ;Oligonukleotidene for screening av DNA-biblioteket til A. niger, som er oppnådd som beskrevet i eksempel 2.2., blir syntetisert i henhold til aminosyresekvensen som ble bestemt i eksempel 1.1. og 1.3. ved bruk av fosforamiditmetoden (M.H. Caruthers (12), med en Applied Biosystem (Model 380B) oligonukleotid-synthesizer. 3. 2. 1. : Syntese av et oligonukleotid som koder for den N-termini delen til pektinlyase I fra Aspergillus niger. ;Oligonukleotidet som koder for N-termini til pektinlyase I proteinet blir syntetisert med hensyn på dets aminosyre-sammensetning som ble bestemt i eksempel 1.1. På grunn av genetisk degenerasjon er 256 oligonukleotider nødvendig for å innbefatte alle muligheter. ;To separate oligonukleotidblandinger blir kjemisk syntetisert, da det på grunn av tekniske grunner er nødvendig å redusere nukleotidantallet i blandingen. Begge inneholder 128 forskjellige oligonukleotider, hvor hver er en komplementær tråd til trådene som koder for aminosyresekvensen T^-P-E-G-F-A-Li- De blir i det følgende kalt blandingene 2014 og 2015, og består av følgende oligonukleotider: blanding 2014 3'TGR^GGR^CTR2CCR3AAR3CG5' ;blanding 2015 3'TGRjlGGR^CTR2CCR2AAR3CG5 ' ;hvori R^er A, C, G eller T, R2er C eller T og R3er A eller ;G. ;Eksempel 3. 2. 2: Syntese av en oligonukleotid som koder for N-termini-delen av det C-terminale fragmentet til CNBr kuttede pektinlyase I proteinet. ;Oligonukleotidet som koder for N-termini-delen av det C-terminale fragmentet til det CNBr kuttede pektinlyase I proteinet blir syntetisert med hensyn på dets aminosyre-sammensetning som beskrevet i Eksempel 1.3. En blanding av 108 oligonukleotider blir syntetisert som er en komplementær tråd til trådene som koder for aminosyresekvensen N134-I-I-I-C?138» og er sammensatt av oligonukleotider som følger. ;blanding 2060 5 'AAR2. ATR2ATR2ATR2CAR3A 3' ;hvori R-l er C eller T, R2er A, T eller C og R3er A eller G. ;Eksempel 3. 2. 3: ^<p>^<g>^ing av oligonukleotidblandigene. ;67 pmol av hver av oligonukleotidblandingene 2014, 2015 og 2060 fra eksempel 3.2.1 og 3.2.2 blir 5'merket ved bruk av 50 pmol av [-y^<p>jat<p>(Amersham, Buckinghamshire, England, 5000 Ci/mmol). Inkubasjonen ble utført ved 37° C med 150 enheter T4 polynukleotidkinase (New England, Nuclear) i 500 ul kinasebuffer. Ligeringsreaksjonen til radioaktivt merket ATP til oligonukleotidene blir detektert ved kjøring av en aliquot av reaksjonsblandingen på en 20% polyakrylamid gel etterfulgt av autoradiografi. ;Eksempel 3. 3: Screening av gen-biblioteket med radioaktivt merkede oligonukleotidblandinger 2014 og 2015. ;Screening av genbiblioteket blir utført ved hybridisering med den radioaktivt merkede oligonukleotidblandingen 2014 og 2015 fra eksempel 3.2.1. Porsjoner på 20 filterkopier av gen-biblioteket (eksempel 3.1.) blir fuktet i 6 x NET og blir prehybridisert i 200 ml 6 x NET, lxss-Denhardt, 0.1 % SDS ved 49.3° C i 4 t. Deretter blir 67 pmol av den radioaktivt merkede oligonukleotidblandingen 2014 tilsatt og hybridiser-ingene utføres over natt ved 49.3°C. Samme fremgangsmåten blir utført ved bruk av den radioaktivt merkede oligonukleotidblandingen 2015. Filtrene blir vasket to ganger i 5 minutter i 2 x SSC, 0.1 % SDS ved romtemperatur, to ganger i 1 t i 2 x SSC, 0.1 % SDS ved 49.3 % og en gang i to t i 0.2 x SSC, 0.5 % SDS ved 49.3 %. Filtrene blir lufttørket og autoradiografert i 3 dager ved bruk av KODAK X-omat S0282 filmer. ;Med oligonukleotidblandingen 2014 ble 33 kloner funnet og med oligonukleotidblanding 2015 ble 39 kloner funnet, som ga en sterk hybridiseringsrespons. For å etablere et sub-bibliotek ble 72 kloner latt vokse i en ny mikrotiterplate og overført til Whatman 541 filter som beskrevet i eksempel 3.1. To filterkopier fra sub-biblioteket blir hybridisert individuelt med begge probene, vasket og autoradiografert. Når det gjelder oligonukleotid 2014 blandingen hybridiserte bare de klonene som ble oppnådd ved hybridisering med oligonukleotid 2014 blandingen. På lignende måte, med oligonukleotid 2015 blandingen ble bare de klonet som ble oppnådd ved hybridisering med oligonukleotidblanding 2015 hybridisert. ;Eksempel 3. 4: Screening av sub-biblioteket med oligonukleotid-blanding 2060. ;Filterkopiene fra sub-biblioteket (72 kloner), som ble oppnådd i eksempel 3.3, blir fuktet i 6 x NET og prehybridisert i 4 t i 15 ml 6 x NET, 1 x ss-Denhardt, 0.1 % SDS ved 32" C. 8 pmol av oligonukleotidblandingen 2060, som var radioaktivt merket som beskrevet i eksempel 3.2.3, blir tilsatt og hybridiseringen utført over natt ved 32°C. Filtrene blir vasket to ganger i 5 minutter hver i 2 x SSC, 0.1 % SDS ved romtemperatur, to ganger i 1 time hver i 2 x SSC, 0.1 % SDS ved 32°C og en gang i to timer i 0.2 x SSC, 0.5 % SDS ved 32° C. Filtrene ble lufttørket og utsatt for radiografi i 3 dager ved bruk av KODAK X-omat S0282 filmer. 3 positive kloner ble funnet, alle tilhørende den gruppe som hybridiserte med 2014-proben som beskrevet i eksempel 9; en klon blir kalt E. coli BJ5183/pCG3Bll (forkortet 3B11). ;Eksempel 4: Isolering av plasmid pCG3Bll og restriksjonsanalyse derav. ;Store plasmidpreparater (14) blir fremstilt av klon 3B11, som ble oppnådd som beskrevet i eksempel 3.4. Det korresponderende plasmidet, kalt pCG3Bll, blir analysert ved fullstendig restriksjonskutting med Hindlll, EcoRI og Pstl (alle Boehringer, Mannheim) og. elektroforetisk separasjon over en 1 % agarosegel (figur 1). ;Eksempel 5: Subkloning av EcoRI fragmenter til pCG3Bll som inneholder de N-terminale og C-terminale fraksjoner av pektinlyase I genet. ;Eksempel 5. 1; Isolering av Sau3AI fragmenter fra pCG3Bll ;og ligering inn i M13DNA. ;1 ug plasmid pGC3Bll (eksempel 4) ble fullstendig kuttet med 18 enheter restriksjonsendonuklease Sau3AI (Boehringer, Mannheim) i 20 pl 10 mmol/1 Tris-HCl, 75 mmol/1 NaCl, 10 mmol/1 MgCl2«pH 7.2 i 1 time ved 37° C. Reaksjonen blir avsluttet ved tilsetting av EDTA til en final konsentrasjon på 20 mM. DNA-fragmentene ble ekstrahert med fenol/kloroform presipitert med etanol og gjenoppløst i 20 pl TE buffer. 100 ng Sau3AI kuttet DNA blir ligert til 20 ng M13mp8 fag DNA (15) linearisert ved BamHI kutting (Boehringer, Mannheim). Ligeringen blir utført i 4 timer, ved 15°C med 1 enhet T4 DNA-ligase (Boehringer, Mannheim) i et totalt volum på 10 pl ligeringsbuffer. Kompetente E. coli JM101 celler blir laget i 50 mM CaCl2i henhold til Amerham håndbok (16) p. 25. 0.3 ml aliquoter av de kompetente JM celler blir overført til 15 ml sterile kulturrør på is. 5 pl ligert fag-DNA blir satt til hvert rør. Blandingene blir holdt på is i 40 min. Cellene blir utsatt for varmesjokk til 42°C i 3 min.og rørene blir igjen satt på isbad. For hvert rør blir følgende blanding fremstilt: 40 pl IPTG 100 mM, 40 pl X-gal 2% i dimetylformamid og 200 pl E. coli JM101 celler fra en frisk eksponentiell voksende kultur. 270 pl av denne blandingen blir tilsatt i hvert rør som inneholder E. coli JM101 celler som var blitt utsatt for varmesjokk. 3 ml smeltet topp agar (holdt ved 42° C) blir satt til hvert rør og rørene helt på agarskåler. Skålene blir inkubert i snudd tilstand ved 37°C over natt. ;Eksempel 5. 2: Screening av rekombinante fag med oligonukleotidprobe 2060. ;E. coli JM101 transformert med det rekombinante fag-DNA'et viste hvite plaques på X-gal inneholdende agar-plater fra eksempel 5.1., 384 blir plukket og latt vokse individuelt ved 37°C i 1.5 ml 2 x TY medium inokulert med 15 pl eksponentielt voksende E. coli JM101 celler. Etter 6 t blir 384 kulturer sentrifugert i 5 min. i en Eppendorf sentrifuge og fag-supernatantene lagret ved 4°C. 100 pl fra hver av de 384 supernatantene blir overført til fire Gene Screen membraner (New England Nuclear) ved bruk av et BioDot apparat med 96 rom (BioRad). Membranene dynkes 5 min i 0.5 M NaOH, 1.5 M NaCl og 5 min i 3 min i 3 M NaCl, 1 M Tris-HCl, pH 5.6, tørket i luft og bakt i vakuum ved 80°C i 2 t. Deretter ble de fire membranne prehybridisert, hybridisert med oligonukleotidblanding 2060 som var radioaktivt merket som beskrevet i eksempel 8, vasket og utsatt for autoradiografi som beskrevet i eksempel 3.4. Fra ligeringseksperimentet i eksempel 5.1. ble en positiv, rekombinant fag valgt for bruk i videre analyser, som betegnet mp8-3A. ;Eksempel 5. 3: Sekvensanalyse av rekombinant mp8-3A fag. ;Supernatanten som inneholdt fag mp8-3A som ble tilveiebragt som beskrevet i eksempel 5.2., blir brukt til å fremstille enkelt-trådet og replikativ form DNA (RF-DNA) som beskrevet i Amersham håndbok (16) på s. 18-27. Enkelt-trådet templater blir sekvensert ved bruk av kjede terminator-metoden beskrevet i Amersham håndbok på s. 30-35. Faget viser seg å inneholde 574 bp Sau3AI fragmentet med den antatte nukleotid-sekvensen til oligonukleotidprobe 2060 ved posisjon 584 til 599. ;Eksempel 5. 4: Identifikasjon av de N-terminale og C-terminale EcoRI fragmenter til pektinlyase I-genet. ;Det sekvenserte EcoRI restriksjonssetet til fag mp8-3A (eksempel 5.3.), blir brukt til å identifisere og subklone to EcoRI fragmenter, en som inneholder den C-terminale delen av PLI-genet, som inneholder terminatorregionen, og en som inneholder den N-terminale delen av genet som inneholder promoter-regionen. Følgende to oligonukleotider blir syntetisert som beskrevet i eksempel 3.2. ;Oligonukleotid 5052: 5'TGGATGATGATGTTGGAGAC3' ;begynner ved posisjon 597, 5' til det sentrale EcoRI-setet ved posisjon 649/650, og rekker til posisjon 577 (komplementær tråd). ;Oligonukleotid 5066: 5'AGGTCCAGGACAACACCTAC3' ;begynner ved posisjon 1020, 3' til det sentrale EcoRI-setet, og rekker til posisjon 1039. ;01igonukleotidblandingene 5052 og 5066 blir radioaktivt merket som beskrevet i eksempel 3.3. 1 pg plasmid pCG3Bll (eksempel 11) DNA blir fullstendig kuttet med EcoRI (Boheringer, Mannheim) og fragmentene separert på en 1 % agarosegel. DNA-fragmentene blir blottet til Gene Screen membran (New England Nuclear) som beskrevet av forhandleren s. 383-386 og membraner hybridisert med radioaktiv merkede prober av oligonukleotidene 5052 og 5066 som beskrevet av Maniatis et al. (8) s. 387-389. Probe 5066 hybridi seres med en 3.5 kb EcoRI fragment som inneholder den C-terminale delen og termatorregionen til PLI-genet. Probe 5052 hybridiseres med en 2.9 kb EcoRI fragment som inneholder N-termini og promoterregionen til genet. ;Eksempel 5. 5: Konstruksjon av pPL29-5 og pPL35-5 ved om-kloning av EcoRI fragmentene til pCG3Bll inn i pUN121. ;4.5 pg plasmid pCG3Bll DNA oppnådd som beskrevet i eksempel 4 blir inkubert med 50 enheter EcoRI (Boehringer, Mannheim) i 50 pl 0.01 m Tris-HCl pH 7.5, 0.1 M NaCl, 0.01 M MgCl2, 1 mM merkaptoetanol i 2 t ved 37°C. DNA-fragmentene blir separert på en 1% agarosegel, gelbiten som inneholder 2.9 kb fragmentet og 3.5 kb fragmentet blir eluert som beskrevet i eksempel 5 og DNA'et ekstrahert med fenol/kloroform og presipitert med etanol. Presipitatene blir resuspendert i 40 pl lav TE-buffer og 10 pl av denne løsningen blir ligert til 100 ng pUN121 (9) linearisert ved EcoRI kutting. Ligeringen utføres ved 15° C i 4 t med 5 enheter T4 DNA ligase (Boehringer, Mannheim) i 35.5 pl 20 mmol Tris-HCl, 1 mmol EDTA, ditioery-tritol 5 mmol, 60 mmol KC1, 50 % glyserol, pH 7.6. ;17.5 pl aliquoter av denne sammensmeltningsblandingen blir separat satt til 200 pl kompetent E. coli HB101 celler, som er blitt fremstilt for transformasjon ved behandling med kalsiumklorid som beskrevet av Maniatis et al. (8), s. 250. Blandingen blir holdt på is i 30 min. og varmet opp til 42°C i 2 min., og deretter fortynnet med 1 ml SOC-medium og inkubert ved 37°C i t. Cellene blir samlet ved sentrifugering ved 2000 g i 5 min. Hver celle-pellet blir resuspendert i 600 pl SOC-medium, og spredt på tre agarskåler som inneholder LB-medium supplementert med 8 mg/l tetracyklin. Skålene inkuberes ved 37°C i 16 t. ;Plasmidene til 6 rekombinante tet<R>kloner bli isolert fra hver transformasjon ved bruk av fremgangsmåten til Birnboim & Doly (17) og analysert ved restriksjonsanalyser. En klon som inneholder 2.9 kb EcoRi fragmentet til pCG3Bll blir valgt for videre analyser og kalt pPL29-5 (fig. 3). En annen klon som inneholder 3.5 kB EcoRI fragmentet til pCG3Bll blir valgt og kalt pPL35-5 (fig. 3). ;Eksempel 6: Sekvens-bestemmelse av pektinlyase I genet. ;DNA'et til pPL29-5 (eksempel 5.5.) som inneholder den N-terminale delen av PLI-genet og DNA'et til pPL35-5 (eksempel 5.5.) som inneholder den C-terminale delen av PLI-genet blir isolert som beskrevet av Humphreys et al. (14). Deler av innskuddene i plasmidene pPL29-5 og pPL35-5 oppnås ved restriksjon med egnede enzymer. Fragmentene blir subklonet inn i M13mp8 og M13mpl8 og sekvensert ved bruk av M13 kloning og sekvenserings-kit (M15 Sekvenserings-kit N.4502, Amersham) ved de betingelser som er gitt ved forhandleren (16). ;Hele sekvensen til det 2.7 kb Spel-Nhel fragmentet, som inneholder hele sekvensen til PLI-genet, er vist i fig. 4. Det innbefatter 688 nukleotider av promoter-regionen, 1369 residier av den strukturelle delen til PLI-genet og 660 nukleotider av terminatorregionen. ;Sekvensen til PLI, som korresponderer til aminosyresekvensen til N-termini til PLI som bestemt ved aminosyresekvensanalyse (eksempel 1), hvor 57 nukleotider som koder for signalsekvensen: ; Datasøking for consensus-sekvenser til ekson/intron spleise-grenser og for intron indre sekvenser (Boel E. et al.) (18) og Mount S.M. (19)) fører til en postulering av tilstedeværelse av fire introner med lengder på 65 bp, 62 bp, 63 bp og 57 bp respektivt (fig. 4, understreket). ;Sekvensen til PLI-genet blir bestemt ved kombinasjon av sekvensene til EcoRI-Spel fragmentet til plasmid pPL29-5 og EcoRI-Nhel fragmentet til pPL35-5 (begge bestemt ved subkloning i M13). ;Eksempel 7: Konstruksjon av ekspresjons-vektorer. ;Eksempel 7. 1; Introduksjon av et nytt restriksjonssete i ;signalsekvensen til PLI-genet. ;Introduksjon av et nytt BssHII-sete i signalsekvensregionen til PLI-genet (sekvensert i eksempel 6) ved in vitro mutagenese utføres i henhold til Zoller og Smith (20). Et oligonukleotid bestående av 19 residier ble syntetisert ved fremgangsmåten beskrevet i eksempel 3.2. som er komplementær til DNA-sekvens (pos. 36-54) som koder for den C-terminale delen av PLI-signalsekvensen, med unntagelse av nukleotid 10 (45) som fører til en C/G transversjon (mutagen primer). Det byttede nukleotid 45 til den mutagene primeren er merket med ; ; For in vitro mutagenese ble 200 pmol av oligonukleotid 5156 5'fosforylert med 20 nmol rATP. Reaksjonen utføres ilt ved 37°C med 10 enheter T4 Polynukleotid kinase (Boehringer, Mannheim) i 20 ul kinasebuffer. Reaksjonen blir avsluttet ved oppvarming til 65°C i 10 min. ;Eksempel 7. 2: In vitro mutagenese av templat M13mp8-PL ;(Sal-EcoRI) DNA. ;Det første in vitro mutagenese eksperimentet innbefatter enkelttrådet DNA fra fag M13mp8-PL (Sall-EcoRI), oppnådd i eksempel 6, som inneholder 0.8 kB Sall-EcoRI fragment til plasmid pPL29-5, som inneholder 117 nukleotider av promoteren og den N-terminale delen av PLI-genet. 1 pmol enkelt-trådet M13mp8-PL(SalI-EcoRI ) DNA blir blandet med 20 pmol mutagen primer 5156 (eksempel 7.1.) og 10 pmol universal M13 sekvenser ingsprimer (N.4511, Amersham) i 10.5 pl 0.02 M Tris-HCl pH 7.5, 0.01 M MgCl2, 0.05 M NaCl, 0.001 M DDT. Blandingen blir raskt varmet opp til 56°C og sakte avkjølt til romtemperatur. 1 ul 0.2 M Tris HC1 pH 7.5, 0.1 M MgCl2, 0.01 M DDT, 4 pl 2 mM dNTP, 1 pl 10 mM ATP blir satt til blandingen, og 3 enheter T4 DNA ligase (Boehringer, Mannheim) og 2 enheter DNA polymerase I (Klenow fragment, Amersham) blir satt til og polymeringsreaksjonen utføres i 15 t ved 15°C. Tre fortynn-inger av polymeriseringsblandingen blir laget (1:20, 1:100 og 1:500) i lav TE-buffer. Fra hver fortynning blir 1 pl og 5 pl satt til 300 pl kompetent E. coli JM101 celler separat, som er blitt forberedt for transformasjon ved bruk av fremgangsmåten beskrevet i eksempel 5.1. Cellene blir helt på X-gal skåler og det oppnås kolonier som danner hvite plaques. 100 av de hvite plaquene blir tatt med tannpirker og overført til LB-skåler. Bakterier transformert med fag DNA blir latt vokse over natt ved 37° C og deretter overført til Whatman 541 filtere som beskrevet i eksempel 3.1. Filtrene blir vasket (eksempel 3.1.), prehybridisert i 6 x NET, 1 x ss-Denhardt, 0.1 % SDS i 30 min. ved 67°C. Hybridiseringen utføres ved RT (eksempel 3.4) i 30 min. med 15 pmol radioaktivt merkede (eksempel 3.3.) oligonukleotid 5156 per filter i 6 x SSC. Etter hybridiseringen ble filtrene vasket i 4 x 40 sek i 6 x SSC ved romtemperatur etter lufttørking utsatt for Kodak XAR-5 filmer ved bruk av en Ilford Screen. Filtrene ble vasket for annen gang i 5 min. i 6 x SSC ved 72° C (Tm til mutagen primer 5156 er 70°C), tørket og utsatt over natt for en Kodak XAR-5 film. ;Koloniene som gir positive signaler etter den andre vaske-steget blir plukket fra den opprinnelige LB-skålen, suspendert i 1 ml LB-medium og varmet opp til 70°C i 20 min. Denne bakteriofag-oppløsningen blir fortynnet 1:10, 1:1'000 og 1:100<*>000 og 10 pl av hver av fortynningene blir brukt til å transfektere 300 pl eksponentielt voksende E. coli JM101 celler og helt på X-gal-skåler. 6 plaques fra 1:100000 fortynningen blir individuelt tatt med tannpirker inn i 1.5 ml 2 x TY som inneholder 15 pl eksponentielt voksende E. coli JM101 celler og latt vokse ved 37° C i 6 t. Kulturen blir sentrifugert 5 min. i en Eppendorf sentrifuge, supernatantene lagret ved 4°C (fag-stokk) og celle-pelleten blir brukt til å gjøre RF-preparater i henhold til metoden til Birnboim & Doly (17). Etter restriksjonsanalyse med BssHII blir en mutant fag som inneholder et nytt BssHII setet i PLI Sall-EcoRI fragmentet valgt for videre eksperimenter og betegnet (M13mpl8-PL(SalI-EcoRI)BssHII/BE5).

Eksempel 7. 3: In-vitro mutagenese av templat M13mpl8-PL(SpeI-EcoRI).

Det andre in-vitro eksperimentet blir utført med enkelt-trådet DNA fra fag M13mpl8-PL(SpeI-EcoRI), som ble oppnådd i eksempel 6. Denne rekombinante fagen inneholder 1.4 kb Spel-EcoRI fragmentet til plasmid pPL29-5 og dermed 688 nukleotider av promoteren pluss den N-terminale delen av PLI-genet. Mutagenese av dette templatet blir utført nøyaktig som beskrevet i eksempel 7.2. En fag som inneholder det nye BssHII setet i PLI Spel-EcoRI innskuddet blir valgt for fire eksperimenter og kalt respektivt M13mpl8-PL(SpeI-EcoRI )BssHII/AC5.

Eksempel 7. 4: Konstruksjon av plasmid pUBE5.

For lettere håndtering av BamHI-EcoRI fragmentet til M13mpl8-PL(SalI-EcoRI)BssHII/Be5 faget kan bli oppnådd som beskrevet i eksempel 7.2, som inneholder 130 bp av promoterregionen og den N-terminale delen av PLI-genet som innbefatter den nylig introduserte BssHII setet i signalsekvensregionen, blir den subklonet inn i plasmidvektor pUN121 (9) som illustrert i fig. 5 og beskrevet i det som følger. 4 pg RF DNA fra fag M13mpl8-PL(SalI-EcoRI )BssHII/BE5 blir isolert i henhold til eksempel 5.3. og blir fullstendig kuttet restriksjonsendonuklease BamHI og EcoRI (Boehringer, Mannheim). Fragmentene blir separert på en 1 % agarosegel og gelbitene som inneholder det 0.8 kb BamHI-EcoRi fragmentet, som består av 117 bp av promoteren og N-terminale delen av PLI-genet blir elektroeluert som beskrevet i eksempel 2.2. DNÅ'et blir ekstrahert med fenol/kloroform og presipitert med etanol. DNA pelleten blir resuspendert i 10 ul vann (50 ng/pl). 2 pg pUN121 blir fullstendig kuttet med Bell og EcoRI (Boehringer, Mannheim). Fragmentene blir separert på en lH> agarosegel og 4.0 kb fragmentet blir elektroeluert som beskrevet i eksempel 2.2. Etter fenol/kloroform ekstraksjon og etanol-presipitasjon ble DNA'et løst opp i 18 pl vann (100 ng/pl).

300 ng av BamHI-EcoRI fragmentet som inneholder BssHII setet blir ligert til 500 ng BclI/EcoRI kuttet pUN121 DNA. Ligeringen utføres i 5 t ved 15° C med 400 enheter T4 DNA ligase (Biolabs) i 20 pl 50 mM Tris-HCl (pH 7.8) 10 mM MgCl2, 20 mM ditiotreitol, 1.0 mM ATP. 10 pl av 1igeringsblandingen blir brukt til å transformere 100 pl kompetent E. coli HB 101 celler (8). Cellene blir platet på LB-skåler som inneholder 8 mg/l tetracyklin (SIGMA) og inkubert over natt ved 37°C.

Plasmid-preparater blir fremstilt fra 12 tet<R>kolonier i henhold til metoden til Birnboim & Doly (17) og et plasmid med det ønskede restriksjonsmønsteret vist i fig. 5 blir kalt pUBE5 og brukt i videre analyser.

Eksempel 7. 5: Introduksjon av et Hgal restriksjonssete foran desulfatohirudin-genet til pML310 og isolering av 0.22 kb Hgal-BamHI gen-fragment.

For introduksjonen av et Hgal restriksjonssete foran desulfatohirudin-genet (fig. 6) blir 8 pg plasmid pML310 DNA fullstendig kuttet med restriksjons-endonuklease EcoRI. Det kuttede DNA'et blir ekstrahert med fenol/kloroform og presipitert med etanol. For å fjerne 5' overhengende ender, blir 4 pg av pML310/EcoRI DNA kuttet i 100 pl 150 mM NaCl, 1 mM ZnS04, 30 mM natr iumacetat pH 4.6 og 20 U/ml av nuklease S1(Sigma) i 45 min. ved 37°C.

DNA'et blir ekstrahert med fenol/kloroform og presipitert med etanol. DNA 'et (pMLSlO/EcoRI/S-L) blir resuspendert i 100 pl 50 mM Tris-HCl pH 8.0 og inkubert med 2 enheter alkalisk fosfatase fra kalvetarm (CIAP, ortofosfor-monoesterfosfory-lase, EC 3.1.3.1., Boehringer) i en time ved 37°C. Enzymene blir inaktivert ved 65<6>C i 1.5 time. NaCl-konsentrasjonen blir justert til 150 mM. Det defosforylerte DNA'et (pML310/- EcoRI/S^/CIAP) blir renset ved adsorpsjon til en DE52 (Whatman) ionebytte-kolonne i en lav-salt buffer (150 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl pH 8.0, 1 mM EDTA). Eluering utføres med en høy-salt bufferoppløsning (1.5 M NaCl, 10 mM Tris-HCl pH 8.0, 1 mM EDTA). DNA'et blir presipitert med etanol og resuspendert i vann ved en konsentrasjon på 0.8 mg/ml.

For introduksjon av et Hgal sete ble et oligonukleotid med følgende formel

5'-AGCGTCGACGCT -3'

syntetisert ved bruk av fosfotriester fremgangsmåten (21). Sekvensen til oligonukleotidet er selv-komplementaer og inneholder gjenkjenningssetet -GACGC- for restriksjonsendonuklease Hgal. Sammensmelting av to enkelt-tråder fører til en dobbelt-trådet DNA-linker.

1.2 pg av det syntetiske enkelt-trådet oligodeoksynukleotidet blir fosforylert i 10 pl 60 mM Tris-HCl pH 7.5, 10 mM MgCl2, 5 mM DTT, 30 pCi [7-<32>P] ATP (3000 Ci-mmol-<1>, Amersham) og 6 enheter T4 polynukleotidkinase (Boehringer) i 30 min. ved 37° C, etterfulgt av en 15 min. chase ved 37° C ved tilstedeværelse av 0.5 mM ATP. Blandingen blir videre inkubert i 10 min. ved 75° C for å inaktivere enzymet. Blandingen blir avkjølt til romtemperatur for sammensmelting.

0.6 pg (170 pmol) av<32>P-merket linker-DNA ble blandet med 2.4 pg (1.75 pmol ender) av pMLSlO/EcoRI/S-jyciAP og ligert i 20 pl 60 mM Tris-HCl pH 7.5, 10 mM MgCl2, 5 mM DTT, 3.5 mM ATP, 800 enheter T4 DNA-ligase (Biolabs) i 20 t ved 15°C. Ligasen blir inaktivert ved 85°C i 10 min. og overskudd av linkermolekyler blir fjernet ved presipitering av DNA'et ved tilstedeværelse av 10 mM EDTA pH 7.5, 300 mM natriumacetat pH 6.0 og 0.54 volum isopropanol. Etter 30 min. ved romtemperatur blir DNA'et pelletert og resuspendert i 45 pl ligerings-blanding (spesifisert ovenfor) og ligert i 6 t ved 15°C for dannelse av sirkulært DNA.

Aliquoter på 1 pl og 3 pl av 1 igeringsblandingen blir satt til 100 pl kalsium-behandlet, transformasjonskompetente E. coli HB101 celler (fremstilt i henhold til fremgangsmåten til D. Hanahan (10)). Cellene blir satt på is i 30 min., deretter inkubert i 3 min. ved 42°C, avkjølt på is i 2 min. og deretter inkubert ilt ved 37° C i 400 pl SOC-medium. Cellene blir konsentrert i 100 pl av SOC-medium hver platet på LB-agarskåler som inneholder 50 pg/ml ampicillin og latt vokse over natt ved 37°C.

12 transformerte amp<R>kolonier blir isolert og latt vokse individuelt i LB-medium som inneholder 100 pg/ml ampicillin. Plasmid DNA blir fremstilt i henhold til fremgangsmåten til D.S. Holmes et al. (22). Tilstedeværelse av den syntetiske oligonukleotidlinkeren blir fastslått ved DNA-sekvensering ved bruk av en enkelt-trådet DNA-fragment som primer som hybridiserer til den kodende tråden til hirudin. En klon som inneholder linker DNA'et i riktig posisjon foran hirudin-genet blir kalt pML310L.

For isolering av 0.22 kb Hgal-BamHI desulfatohirudin-gen-fragmentet, ble 40 pg plasmid pML310L fullstendig kuttet med restriksjonsendonuklease Pvul og BamHI (Boehringer) i 150 pl 0.01 M Tris-HCl pH 7.5, 0.1 M NaCl, 0.01 M MgCl2, 1 mM 2-merkaptoetanol i 2 t ved 37°C. Fragmentene blir separert på en 1% agarosegel og gelbiten som inneholder 0.84 kb Pvul-BamHI fragmentet blir elektroeluert som beskrevet i eksempel 5. Til fenol/kloroform-ekstraksjon og etanolpresipitasjon blir DNA'et resuspendert i 20 pl Hgal-buffer og fullstendig kuttet med restriksjonsendonuklease Hgal (Biolabs). Fragmentene blir separert på en 2% agarosegel og gelbitene som inneholder 0.22 kb Hgal-BamHi fragmentet blir eluert som før. Etter fenol/kloroform ekstraksjon og etanolpresipitasjon blir fragmentet resuspendert i 55 pl sterilt vann (0.1 pmol/pl).

Eksempel 7. 6: Fusjon av PLI-signalsekvensen og det

strukturelle genet for desulfatohirudin.

For å tilveiebringe en linker for å ligere BssHII setet til signalsekvensen (eksempel 7.2.) kodende området til PLI-genet og Hgal-setet til desulfatohirudin-genet (eksempel 7.5), ble to oligonukleotider syntetisert som beskrevet i eksempel 3.2.

300 pmol av hver oligonukleotid ble separat blandet med kinase med 400 pmol rATP og 10 enheter T4 polynukleotidkinase (New England Nuclear) i 15 pl 50 mM Tris-HCl (pH 7.8), 10 mM MgCl2, 20 mM ditiotreitol 1.0 mM ATP, 50 pg/ml BSA. Begge kinase-behandlede oligonukleotider ble blandet i et 1:1 forhold, varmet til 95°C og deretter sakte avkjølt ned til romtemperatur for sammensmelting. De sammensmeltede linker-ene blir lagret ved -20°C.

Eksempel 7. 7: Konstruksjon av pLHK3.

For konstruksjon av den desulfatohirudin ekspresjonsvektor (fig. 7) som inneholder den forkortede promoteren til PLI, ble 7 pg pUBE5 DNA (eksempel 7.4) fullstendig kuttet med restriksjonsendonuklease BssHII (Boehringer), ekstrahert med fenol/kloroform og presipitert med etanol. DNA'et (1.9 pmol) blir resuspendert i 10 pl sterilt vann. 300 pmol av den sammensmeltede linker 5172/5173 (eksempel 7.6) blir ligert til 1.9 pmol BssHII-kuttet pUBE5 med 400 enheter T4 DNA-ligase (Biolabs) i 60 pl 50 mM Tris-HCl (pH 7.8), 10 mM MgClg, 20 mM ditiotreitol 1.0 mM ATP, 50 pg/ml BSA. Ligeringen utføres i 15 t ved 15°C. Ligasen inaktiveres ved oppvarming til 85°C i 10 min. Bufferen blir justert til 0.01 M Tris-HCl pH 8.0, 0.1 M NaCl, 0.005 M MgCl2, 1 mM 2-merkaptoetanol. 36 enheter BamHI (Boehringer) blir tilsatt og kuttingen utføres i 2 t ved 37°C. Fragmentene blir separert på en 1% agarosegel og det 3.4 kB BamHI_[BssHII]HgaI-linker-fragmentet isolert ved elektroeluering av gelbiten etterfulgt av fenol/kloroform-ekstraksjon og etanolprespitasjon. DNA'et blir resuspendert i 14 pl sterilt vann til en konsentrasjon på 0.1 pmol/pl. 0.2 pmol av 0.22 kb desulf atohirudin Hgal-BamHI fragmentet blir ligert til 0.1 pmol av det kuttede pUBE5 DNA'et. Ligering utføres i 15 t ved 15° C med 400 enheter T4 DNA-ligase (Biolabs) i 10 pl 50 mM Tris-HCl (pH 7.8), 10 mM MgCl2, 20 mM ditiotreitol, 1.0 mM ATP, 50 pg/ml

BSA.

2 ul av ligeringsblandingen blir brukt til å transformere 100 pl kompetent E. coli HB101 celler (8), som deretter blir platet på LB-skåler som inneholder 50 mg/l ampicillin (SIGMA). DNA'et fra 12 amp<R>kolonier blir fremstilt ved fremgangsmåten til Birnboim & Doly (17) og analysert ved restriksjonsanalyse. 1 klon blir valgt for sekvensanalyse ved bruk av dideoksy-kjede-terminatormetoden til Sanger et al. (23). En klon som viser det ønskede restriksjonsmønst-eret og den riktige sekvensen innenfor PLI-signalsekvens-desulfatohirudin-grensen blir isolert og kalt pLHK3.

Eksempel 7. 8: Konstruksjon av pLHL5.

Når det gjelder konstruksjon av desulfatohirudin ekspresjonsvektoren, som inneholder promotersekvensen til PLI-genet, ble 10.3 pg RF DNA fra fag M13mpl8-PL(Spel-EcoRI)BssHII/AC5 (eksempel 3.3) blir fullstendig kuttet med restriksjonsendonuklease BssHII (Boehringer), ekstrahert med fenol/kloroform, presipitert med etanol og resuspendert i 10 pl sterilt vann til en konsentrasjon på 1.9 pmol. 300 pmol av sammensmeltet linker 5172/5176 (se ovenfor) blir ligert til 1.9 pmol BssHII-kuttet fag DNA som beskrevet i eksempel 7.7. Etter inaktivering av T4 DNA-ligase blir bufferen justert til 0.01 M Tris-HCl, pH 7.6, 0.05 M NaCl, 0.01 M MgCl2, 0.014 M DTT. 36 enheter av restriksjonsendonuklease Hindlll (Boehringer) blir tilsatt og kuttingen utføres i 2 t ved 37°C. Fragmentene blir separert på en 1% agarosegel og ved 1.4 kb Hindlll-[BssHII]HgaI-linkerfragmentet blir isolert ved elektroeluering som beskrevet i eksempel 2.2. Fragmentet blir resuspendert i 15 pl sterilt vann som fører til en konsentrasjon på 0.1 pmol/pl. 3 pg plasmid pBR322 (24) blir fullstendig kuttet med restriksjonsendonuklease BamHI og Hindlll ((Boehringer, Mannheim) i 20 pl 0.01 M Tris-HCl pH 7.5, 0.1 M NaCl, 0.01 M MgCl2, 1 mM 2-merkaptoetanol og fragmentene blir separert på en 1% agarosegel. Det store 4.15 kb Hindlll-BamHI fragmentet blir eluert som beskrevet i eksempel 2.2 og resuspendert i 8 pl sterilt vann (0.1 pmol/pl). 0.2 pmol 0.2 kb Hgal-BamHI fragment av desulfatohirudin og 0.2 pmol av 1.4 kb PLI promoter-signalsekvens Hindlll-[BssHII]HgaI-linkerfragment blir ligert til 0.1 pmol of HindIII/-BamHI-kuttet pBR322 i 15 t ved 15°C. Ligeringen utføres med 400 enheter T4 DNA-ligase (Biolabs) i 10 pl 50 mM Tris-HCl (pH 7.8), 10 mM MgCl2, 20 mM ditiotreitol, 1.0 mM ATP, 50 pg/ml BSA. 1 pl av ligeringsblandingen blir brukt til å transformere 100 pl kompetent E. coli HB101 celler (8). 12 amp<R>kolonier blir isolert og DNA'et analysert som beskrevet i eksempel 7.7. En klon blir valgt for videre eksperimenter og kalt pLHL5 (fig. 8).

Eksempel 7. 9: Konstruksjon av pLHLT7.

For å tilveiebringe et terminatorområde til PLI-desulfatohirudin ekspresjonssystemet, ble det 0.7 kb Pstl-Nhel fragmentet til plasmid pPL35-5 fusert 3' til desulfatohirudin-genet som illustrert i fig. 9.

10 pg pPL35-5 blir fullstendig kuttet med Pstl (Boehringer). DNA blir fenol/kloroform ekstrahert og presipitert med etanol. Fragmentene blir resuspendert i 0.033 M tris-acetat pH 7.9, 0.066 M kalium-acetat, 0.01 M magnesium-acetat, 0.5 mM DTT og 100 ng/ml BSA. 10 enheter T4 DNA polymerase (Boehringer) blir tilsatt og reaksjonen utføres i 180 sekunder ved 37°C. Reaksjonsblandingen blir satt på is, og 20 nmol av dATP, dCTP, dGTP, dTTP blir tilsatt, og bufferen justert til de ovenfor nevnte betingelsene og reaksjonen utført i 35 min. ved 37°C. Etter fenol/kloroform ekstraksjon og etanolpresipitasjon blir DNA'et resuspendert i 10 pl sterilt vann (1.9 pmol = 11.4 pmol butte ender). 900 pmol av kinasebehandlet og sammensmeltet (eksempel 7.6) BamHI-linkere (Biolabs) blir tilsatt og ligeringen utføres i 15 t ved 15°C med 400 enheter T4 DNA ligase (Biolabs) i 60 pl 50 mM Tris-

HC1 (pH 7.8), 10 mM MgCl2, 20 mM ditiotreitol 1.0 mM ATP, 50 pg/ml BSA. Etter inaktivering av ligasen ved oppvarming til 85°C i 10 min., blir bufferen justert til 0.01 Tris-HCl pE 8.9, 0.1 M NaCl, 5 mM MgCl2, 1 mM 2-merkatoetanol. 20 enheter restriksjonsendonuklease Nhel (Biolabs) blir tilsatt og kuttingen blir utført i 2 t ved 37° C. Fragmentene blir separert på en 1. 2% agarosegel og det 0.7 kb Nhel-[Pst]BamEI fragmentet blir isolert ved elektroeluering som beskrevet i eksempel 2.2. Fragmentet blir resuspendert i 15 pl sterilt vann som gir en konsentrasjon på 0.1 pmol/pl.

Et ligeringsoppsett med 0.2 pmol 0.7 kb Nhel-[Pstl] BamHI terminatorfragment, 0.2 pmol 1.4 kb HindIII-[BssEII]EgaI promoter fragment (eksempel 7.4), 0.2 pmol 0.2 kb Hgal-BamEI desulfatohirudinfragment (eksempel 7.5) og 0.1 pmol pUC18 vektor (25) linearisert med Eindlll og Xbal. Reaksjonen utføres med 400 enheter T4 DNA-ligase (Biolabs) i 15 t ved 15°C i 10 pl 50 mM Tris-ECl (pE 7.8), 10 mM MgCl2, 20 mM ditiotreitol 1.0 mM ATP, 50 pg/ml BSA. 2 pl av ligeringen blir brukt til å transformere E. coli EB101 celler. 12 amp<R>transformanter blir analysert som beskrevet i eksempel 7.6. og det plasmidet som viser de riktige fusjonssekvensene refereres til som pLELT7.

Eksempel 8: Konstruksjon av et kotransformasjonssystem

for A. niger.

Eksempel 8. 1: Fremstilling av pCG59D7 som inneholder

pyrA-genet til Aspergillus niger.

300 ng av et 1.1 kb Eindlll fragment fra pDJB2 (26) som inneholder deler av N. crassa pyr4 genet blir radioaktivt merket med nick-translasjon i henhold til Maniatis et al., (8). Filterkopiene til genbiblioteket (eksempel 3.1) blir fuktet i 6 x NET og prehybridisert i 6 x NET, 1 x ss-Denhardt, 0.1 % SDS i 4 t ved 50° C. Nick-translatert Eindlll fragment blir tilsatt (300 ng/80 filtere) og hybridiseringen

utføres i 15 t ved 50°C. Etter hybridisering blir filtrene vasket 1 x i 5 min i 4 x SSC, 0.1 % SDS ved 50° C. Etter lufttørking blir filtrene utsatt for KODAK X-Omat S0282 filmer i 3 dager. En sterkt hybridiserende koloni, kalt Escherichia coli BJ5183/pCG59D7 (forkortet 59D7) blir isolert og fra denne ble et stort plasmidpreparat .laget (14). Plasmidet blir kalt pCG59D7 og blir brukt for transformasjon i eksempel 9.2.

Eksempel 8. 2: Mutasjon av A. niger stamme N 756 og isolering av mutanter auksotrope for uridin.

Seleksjon av mutanter av A. niger stamme N 756 som spesifikt mangler orotidin-5'-fosfat dekarboksylase-aktivitet, kan oppnåes ved positiv seleksjon mot den toksisk analoge fluoro-orotin-syre (27) ved tilstedeværelse av uridin. 3 x IO<6>konidiale sporer fra A. niger stamme N 756 blir platet på 10 ml minimal medium skåler supplementert med 1 g/l arginin og 50 mg/l uridin. Sporene blir utsatt for kort-bølge UV-bestråling (2600 Å), ved en dose som resulterer i 0.5% overlevende kolonier. Etter 2 dagers inkubasjon ved 28° C, når det utvoksende mycelia så vidt er synlig, blir 10 mg fluoro-orotinsyre tilsatt til hver skål og inkubasjonen fortsatte for 2-3 dager til. Fluoro-orotinsyre resistente kolonier fremkommer som sterkt voksende og sporulerende kolonier mot en bakgrunnsvekst av hvit-lignende sensitive myceliaer. Fra omtrent 40'000 mutagenbehandlede overlevende ble 8 mutanter isolert. 2 av de som var resistente mot fluoro-oritin-syre uten å kreve uridin ble ikke fulgt videre.

6 av dem uridin-auksotrofi. Heterokaryoner ble laget ved å la vokse en blanding av konidial-sporer fra to fluoro-syre-resistante mutanter hver på komplett medium over natt. Myceliablokker blir overført til minimalmedium. Mutanter komplementære til hverandre når det gjelder deres mutasjon viser utvekst av prototropisk heterokaryotisk mycelier ved kantene, mens stammer med en mutasjon i samme allele ikke viser det. De 6-uridin-krevende mutantene fra stamme N 756 faller, som når det gjelder S. cerevisiae (27), inn i 2 komplementasjonsgrupper. En av hver - An 8 og An 10 - blir brukt for transformasjon.

Eksempel 8. 3: Fremstilling av protoplaster og transformasjon av uridin-mutantene An 8 og An 10 fra A. niger N 756.

Konidiale sporer fra mutanten An 8 og An 10 blir latt vokse separat på skrå-stilte substrater i 4 - 5 dager ved 28° C i komplett medium. 2 x 10^ konidiosporer fra An 8 og An 10 ble brukt til å separat inokulere 200 ml minimalmedium supplementert med 1 g/l arginin og uridin (eksempel 8.2). Etter 20 t vekst ved 28°C og 180 rpm. blir myceliet høstet ved filtrering gjennom Miracloth, og vasket to ganger med 10 ml 0.8 M KC1 50 mM CaCl2og resuspendert i 20 pl 0.8 M KC1, 50 mM CaCl2, 0.5 mg/ml Novozym 234 (Novo Industries). Blandingen blir inkubert i et roterende vannbad (30°C, 50 rpm.) inntil maksimalt protoplastfrigjører kan bli detektert ved hjelp av mikroskop (90 - 120 min.) Protoplast-suspensjonen blir filtrert gjennom en glassplugg i et traktrør for å fjerne myceli-holdig debris. Protoplastene blir pelletert ved mild sentrifugering (10 min, 2000 r.p.m) ved romtemperatur og vasket to ganger med 10 ml 0.8M KC1 50 mM CaCl2. Protoplastene blir deretter resuspendert i 200-500 pl 0.8M KC1, 50 mM CaCl2som gir en konsentrasjon på 1 x 10<8>/ml.

For transformasjon blir 200 pl aliquoter av protoplastsuspen-sjon (An 8 og An 10) separat inkubert sammen med oppløsninger bestående av 10 pg/20 pl pCG59D7 DNA, 50 pl PCT, (10 mM Tris-HCl pH 7.5, 50 mM CaCl2, 25 % PEG 6000). Inkubasjonsbland-ingene blir holdt i 20 min. på is, deretter ble 2.0 ml PCT tilsatt og blandingen ble videre inkubert i 5 min. ved romtemperatur. 4 ml 0.8M KC1, 50 mM CaCl2ble tilsatt og 1 ml aliquoter av disse finale transformasjonsoppløsninger ble blandet med flytende minimal agar-medium (MM + 1 g/l arginin + 10 g/l Bacto-Agar (Difco)) stabilisert med 0.8M KC1. Blandingene ble med en gang helt på agarskåler med samme medium og inkubert ved 28°C.

Etter 3 dager vekst ved 28°C, oppsto stabile transformanter som raskt voksende og sporulerende kolonier på en bakgrunn vekst av mange hundre små sannsynligvis aborterende transformanter.

Transformasjon med pCG59D7 lykkes bare i mutant An 8, ikke i An 10. An 8 anses derfor å mangle ornitin-5'-fosfat-dekar-boksylaseaktivitet, som er komplementert av gen-produktet med full-lengde av seleksjonsplasmid pCG59D7. I An 8 oppnås omtrent 20-30 transformanter per ug pCG59D7.

Ti transformanter av An 7 blir plukket, sub-dyrket på minimalmedium og DNA'et blir isolert og analysert for tilstedeværelse av pCG59D7 sekvenser. DNA fra transformanter blir isolert etter pudderdannelse av det frosne mycelia i flytende nitrogen i henhold til en publisert fremgangsmåte (7) . 1 ug DNA av hver transformant blir fullstendig kuttet med Xho I, fraksjonert ved elektroforese over 1% agarosegeler og blottet til nitrocellulosefiltere i henhold til Maniatis (8) , s. 382-386. Blottene blir hybridisert med [a-<32>P]-merket pUN 121 DNA etter samme fremgangsmåte som beskrevet av Maniatis et al. (8), s. 387-389. De forskjellige hybridiser-ingsmønstrene som ble oppnådd indikerer kromosomal integrasjon av det transformerende plasmidet pCG59D7 ved forskjellige beliggenheter inn i verts-genomet.

Eksempel 9: Ekspresjon av desulfatohirudin-genet under

kontroll av PLI-promoteren i A. niger.

Eksempel 9. 1: Ko-transformasjon av mutant An 8 medPCG59D7, pLHK3, pLHL5 eller pLHLT7. Protoplastene av mutant An 8 blir fremstilt i henhold til eksempel 8.2 og blir ko-transformert med 5 pg av seleksjonsplasmid pCG59D7 og enten 10 pg plasmid pLHK3 (eksempel 7.7), 10 pg plasmid pLHL5 (eksempel 7.8.) eller 10 pg plasmid pLHLT7 (eksempel 7.9.), med fremgangsmåte som beskrevet i eksempel 8.2.

Transformert An 8 celler blir selektert på minimalmedium for uridinprototropi som beskrevet i eksempel 8.2. 50 transformanter av hvert ko-transformasjonseksperiment blir tilfeldig plukket og analysert for desulfato-hirudin-ekspresjon. Desulfato-hirudin-aktivitet blir testet i en trombin inhiber-ingsanalyse i henhold til instruksjonene fra forhandlerene av det kromogene peptidsubstratet (Boehringer, Mannheim, FRG).

Eksempel 9. 2: Ekspresjon av desulfato-hirudin under kontroll av PLI-promoteren i transformanter fra mutant An 8.

Kondiale sporer fra transformanter som er tilveiebragt ifølge eksempel 8.3 blir individuelt pre-kultivert på 50 ml pre-kulturmedium (Pectin Slow Set L (Unipectin, SA, Redon, France) 3 g/l, NH4C1 2 g/l, KH2P040.5 g/l, NaCl 0.5 g/l, Mg2S04x 7 H20 0.5 g/l, Ca2S04x 2 H20 0.5 g/l, pH 7.0). Prekulturen blir inkubert i 72 t ved 250 rpm og 28° C. 10 % av prekulturen blir brukt for å inokulere 50 ml hovedkulturmedium (Soyabønnemel 20 g/l, pektin Slow Set 5 g/l). Kulturen blir latt vokse opp i 72-96 t (høyest pektinlyase-produksjon) ved 250 rpm og 28°C (referert til som induserende betingelser). Transformanter fra mutant An 8 blir også latt vokse under ikke-induserende betingelser i Phyton pepton 10 g/l, glukose 10 g/l istedenfor hovedkulturmedium.

Til forskjellige tider (hver 20. t) blir prøver tatt, cellene blir pelletert ved sentrifugering og ødelagt ved ultrasonisk desintegrasjon. Supernatant og celle ekstraktene blir begge testet for desulfato-hirudin-aktivtet som beskrevet i eksempel 9.1. Ingen desulfato-hirudin aktivitet er detektert etter kotransformasjon med plasmid pLHK3. pLHL5 og pLHL7 som inneholder full-lengde PLI-promoter kan begge drive ekspresjonen av desulfato-hirudin i A. niger mutant An 8. Av de 50 transformantene som ble tatt fra ko-transformasjons-eksperi-mentene (eksempel 9.1) viser 10 desulfato-hirudin-aktivitet i mediet.

Ekspresjon av desulfatohirudin i mutant An 8 under kontroll av hel-lengde PLI-promoter og som ved bruk av PLI-signalpeptidet er derfor regulert av det induserende substratpektin og fører til sekresjon av desulfatohirudin inn i mediet.

Deponering av mikroorganismer.

Følgende mikroorganismer er deponert under Budapest Treaty med Deutsche Sammlung von Mikroorganismen, Grisebachstr. 8, D-3400 Gbttingen: Mikroorganismer Dep. nr. Dep. dato. Escherichia coli BJ5183/pCG3Bll DSM 3916 Desember 11, 1986 Aspergillus niger An 8 DSM 3917 Desember 11, 1986 Escherichia coli BJ5183/pCG59D7 DSM 3968 Februar 2, 1987.

Referanser

1) F.E.A. van Houdenhoven. Ph.D. Thesius Agricultural University, Wageningen in Communications Agricultural University Wageningen, The Netherlands 75-13 (1975). 2) Edman P., og Begg G. (1967) Eur. J. Biochem. 1, 80-91. 3) J.M. Vereijken, J. Hofsteenge, H.J. Bak og J.J. Beintema. Eur. J. Biochem. 113, 151 (1980). 4) G. Frank og W. Strubert. Chromatographia 6, 522

(1973). 5) A.M. Crestfield, S. Moore og W.H. Stein, J. Biol. Chem. 238, 622 (1963).

6) Knecht et al., Anal. Biochem. 130, 65 (1983).

7) Yelton M.M., Hamer J.E., Timberlake W.E. (1984), Proe. Nati. Acad. Sei. USA 81, 1470-1474. 8) Maniatis T. , Fritsch E.F., Sambrook J., Molecular cloning, a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1982). 9) Nilsson B., Uhlen M. , Josephson S. , Gatenbeck S. og Philipson L. (1983). Nucleic Acids Research 11, 8019-8030.

10) Hanahan D., (1983). J. Mol. Biol. 166, 557-580.

11) Gergen J.P., Stern R.H., Wensink P.C. (1979). Nucleic Acids Research 7, 2115-2136. 12) M.H. Caruther, Chemical and Enzymatic Synthesis of Gene Fragments: a laboratory manual, Verlag Chemie (1982 ). 14) Humphreys G.O., Willshaw G.A., Anderson E.S. (1975). Biochimica et Biophysica Acta, 383, 457-463. 15) Messing J. (1983), Methods in Enzymology 101, 21-78. 16) M13 cloning and sequencing handbook, Amersham International plc. Buckinghamshire, England. 17) Birnboim H.C. & Doly J. (1979). Nucleic Acids Res 7, 1513-1523. 18) Boel E., Hansen M.T. , Hjort I., Hoegh I., Fiil N.P.

(1984). EMBO J. 3, 1581-1585. 19) Mount S.M. (1982). Nucleic Acids Res.10, 459-472.

20) Zoller M.J. & Smiten M. (1984). DNA 3, 479-488.

21) Itakura et al., J. Am. Chem. Soc. 103, 706 (1981). 22) Holmes D.S., Quigley M. (1981). Anal Biochem 114, 193-197. 23) Sanger T. , Nickler S. , Coulson A.R. (1977). Proe. Nati. Acad. Sei. USA 74, 5463-5467. 24) Bolivar F., Rodriguez R.L., Greene P.J., Betlach M.C., Heineker H.L., Boyer H., Crosa J.H., Falkow S.

(1977). Gene 2, 95-113. 25) Yanish-Perron C, Vieira J., Messing J. (1984). Submittéd to Gene. 26) Ballance D.J. and Turner G. (1985), Gene 36, 321-331.

27) Boeke J.D., Lacroute F., Fink G.R.

Mol. Gen. Geret. 1984, 197, 345-346.

28) Norrander, J. et al., Gene 26, 101-106 (1983).

Claims

1. Replikerbar ekspresjonsvektor,karakterisertved at den inneholder DNA-sekvenser som koder for pektinlyase (PL) ekspresjons-systemet fra trådsopp eller funksjonelle deler derav for ekspresjon av proteiner i trådsopp, promoteren, signalsekvensen og eventuelt det strukturelle genet som koder for pektinlyase eller homologt pektin lyase gen eller heterologt strukturelt gen, med eller uten terminatoren til PLI-ekspresjons-systemet.

2. Replikerbar ekspresjonsvektor ifølge krav 1,karakterisert vedat den innbefatter en DNA-sekvens ifølge formel I, figur 4, eller funksjonelle deler derav og nevnte DNA sekvens er eventuelt degenerert.

3. Replikerbar ekspresjonsvektor ifølge krav 1,karakterisert vedat det er pCG3Bll.

4. Replikerbar ekspresjonsvektor ifølge krav 1,karakterisert vedat det innbefatter promoter-sekvensen mellom nukleotidene -1 til -688, eller -100 og-146, signalsekvensen mellom nukleotidene 1 og 57, PLI strukturelle genet mellom nukleotidene 58 og 1366, og/eller terminatoren som strekker seg mellom nukleotidene 1367 og en hvilken som helst av nukleotidene 1570 opp til 2029.

5. Replikerbar ekspresjonsvektor ifølge krav 1,karakterisert vedat det innbefatter PLI strukturelle genet uten intronene.

6. Replikerbar ekspresjonsvektor ifølge krav 1,karakterisert vedat det er en rekombinant hybrid vektor.

7. Replikerbar ekspresjonsvektor ifølge krav 1,karakterisert vedat det er hybrid vektor pLHL5.

8. Replikerbar ekspresjonsvektor ifølge krav 1,karakterisert vedat det er hybrid vektor pLHLT7.

9. Transformert vert,karakterisert vedat den inneholder et rekombinant DNA-molekyl ifølge krav 1 og er i stand til å uttrykke det gitte genet.

10. Transformert vert ifølge krav 12,karakterisert vedat den er Escherichia coli B35183/pCG3Bll (DSM 3916).

11. Transformert vert ifølge krav 12,karakterisert vedat den er Aspergillus niger An8 (DSM 3917) transformert med et rekombinant DNA-molekyl ifølge krav 1 og seleksjon-markørplasmid pCG59D7.

12. Transformert vert ifølge krav 12,karakterisert vedat den er Aspergillus niger An8 (DSM 3917) transformert med pLHK3, pLHL5 eller pLHLT7, og seleksjons-markør plasmid pCG59D7.

13. Anvendelse av replikerbar ekspresjonsvektor ifølge krav 1 for fremstilling av et polypeptid i trådsopp, ved at en hybrid vektor ifølge krav 8 blir uttrykt i en egnet vert og at polypeptidet blir isolert.