HU214005B - Eljárás tarnszformált gazdasejtek és polipeptidek előállítására új gombakifejező rendszerrel - Google Patents

Eljárás tarnszformált gazdasejtek és polipeptidek előállítására új gombakifejező rendszerrel Download PDF

Info

Publication number
HU214005B
HU214005B HU88508A HU50888A HU214005B HU 214005 B HU214005 B HU 214005B HU 88508 A HU88508 A HU 88508A HU 50888 A HU50888 A HU 50888A HU 214005 B HU214005 B HU 214005B
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
pli
dna
gene
plasmid
transformed
Prior art date
Application number
HU88508A
Other languages
English (en)
Other versions
HUT46357A (en
Inventor
Christof Gysler
Jutta Heim
Hermaus Cornelis Maria Kester
Jacob Visser
Original Assignee
Novartis Ag.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=10611694&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=HU214005(B) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Novartis Ag. filed Critical Novartis Ag.
Publication of HUT46357A publication Critical patent/HUT46357A/hu
Publication of HU214005B publication Critical patent/HU214005B/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/81—Protease inhibitors
    • C07K14/815—Protease inhibitors from leeches, e.g. hirudin, eglin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
    • C12N1/145—Fungal isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2408—Glucanases acting on alpha -1,4-glucosidic bonds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/036—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif targeting to the medium outside of the cell, e.g. type III secretion
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi
    • C12R2001/66—Aspergillus
    • C12R2001/685—Aspergillus niger

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Complex Calculations (AREA)
  • Image Generation (AREA)
  • Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
  • Emulsifying, Dispersing, Foam-Producing Or Wetting Agents (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Multi-Process Working Machines And Systems (AREA)

Description

A találmány tárgya egyrészről eljárás Aspergillus niger pektinliáz (PLI) kifejezőrendszert vagy annak származékát hordozó rekombináns DNS-vektort tartalmazó transzformált baktérium- vagy gomba gazdasejt előállítására, melynek során valamely baktérium- vagy gomba-gazdasejtet transzformáló körülmények között Aspergillus niger pektinliáz (PLI) kifejező rendszert vagy származékát - ahol a származék -100-146 nukleotidok közötti promoter szekvenciát, az 1-57 nukleotidok közötti szignálszekvenciát, az 58. és 1366. nukleotidok közötti, kívánt esetben intronok nélküli és kívánt esetben a genetikai kód értelmezésén belül degenerált struktúrgént vagy legalább 649 bp nagyságú részét és/vagy az 1367. nukleotidtól az 1570-2029. nukleotidok bármelyikéig terjedő terminátort jelenti tartalmazó rekombináns DNS-vektorral transzformálják.
A találmány tárgya másrészről eljárás polipeptid előállítására Aspergillus niger pektinliáz (PLI) kifejezőrendszerrel baktérium- vagy gomba gazdasejtekben, melynek során Aspergillus niger pektinliáz (PLI) kifejezőrendszer promoter szekvenciáját, kívánt esetben szignálszekvenciáját, struktúrgénjét vagy egy heterológ struktúrgént és kívánt esetben terminátorát tartalmazó rekombináns DNS-vektort valamely gombatörzsben kifejeznek, és a polipeptidet izolálják.
A leírás terjedelme 34 oldal (ezen belül 13 lap ábra)
HU 214 005 B
HU 214 005 Β
A találmány a genetikai technika területén olyan új DNS-molekulák előállításával foglalkozik, amelyek Aspergillus niger pektinliáz I (PLI) kódoló szekvenciákat és/vagy ezek promotorját, szignálszekvenciáját vagy terminátorját tartalmazzák. Az új DNS-molekulák PLI túltermeléséhez alkalmasak Aspergillusban és/vagy olyan hibrid vektorok megalkotásához, amelyek idegen géneket fejeznek ki fonalas gombákban.
Bár a genetikai technikában számos polipeptid-kifejező rendszer ismeretes már prokarióta és eukarióta gazdaszervezetekhez, folyamatos igény van új rendszerekre, amelyek előnyökkel rendelkezhetnek az ismert rendszerekhez viszonyítva.
Széles körben alkalmazott a prokarióta Escherichia coli gazdaszervezet és az eukarióta gazdaszervezetek, mint például Saccharomyces cerevisiae, amelyekhez nagyszámú kifejező hibrid vektort, jórészt plazmidot, fejlesztettek ki. Az E. coli gazdaszervezeteknek az a hátránya, hogy nem tudják glikozilezni a keletkezett polipeptidet, és az, hogy kiválasztás hiányában az idegen peptid a gazdasejten belül halmozódik fel és akadályozza a további növekedést. Az élesztő ugyan glikozilez, viszont, akárcsak az E. coli, nem választja ki a polipeptideket, az egészen kisméretűek kivételével, a tápközegbe. Az élesztők csak a periplazmatikus térbe választanak ki. Magasabb eukarióta gazdaszervezetek az emlős ráksejtek, amelyek képesek glikozilezni és kiválasztani a tenyészközegbe, ezeknek tenyésztése azonban nagyon lassú és drága, és fennáll az a veszély, hogy onkogén nukleinsavakat izolálunk a kívánt polipeptidekkel együtt, amelyektől ez utóbbit nem tudjuk megszabadítani.
A további gazdaszervezetek iránti igény következtében fonalas gombákat is vizsgáltak, például Neurospora crassat, Aspergillus nidulanst és Aspergillus nigert. Az ilyen gombákat már elterjedten alkalmazzák ipari célokra, alkalmazásuk azonban a genetikai manipulációs technikákban elmaradt, főleg megfelelő transzformációs rendszer hiányában. A Saccharomyces cerevisiae-val ellentétben a fonalas gombák nem tartalmaznak plazmidokat, amelyeket alkalmazni lehetne idegen gének bevezetésére és fenotípusos szelekcióra. Lehetséges azonban transzformálni fonalas gombákat szelektálható marker génekkel rendelkező idegen plazmidokkal. Az összes eddig leírt, fonalas gombákhoz alkalmas vektor egyike sem replikálódik autonóm módon, ahogyan erre az élesztő vektorjai képesek, hanem a gomba kromoszómába integrálódnak. Ez az esemény csak igen alacsony frekvenciával megy végbe. Másrészt viszont az integrativ transzformálás a transzformánsokat mitotikusan nagyon stabillá teszi még nem szelektív körülmények között is. Több mint 100 másolat stabil integrációjáról számoltak már be.
Az első, fonalas gombákhoz leírt vektor a Neurospora crassa qa-2 génjét tartalmazza szelektálható markerként. Ez a gén a katabolikus dehidrokinázt kódolja, és ezt a N. crassa aro mutánsának funkcionális komplementációjához alkalmazhatjuk [Case M.E., Schweizer M., Kushner S.R. és Giles N.H.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 5259-5263. (1979)]. Az aro mutánsok képtelenek növekedni minimál tápközegen aromás aminosav-kiegészítés nélkül. A N. crassa transzformálása a qa-2 vektorral a lazmid egyedi kópiájának integrálódásával történik a kromoszómába. A stabil ar4 integránsok 30%-a megőrzi az integrált qa-2 gént még a bakteriális plazmid szekvenciákhoz kapcsolva is [Case Μ. E.: a „Genetic Engineering of Microorganisms fór Chemicals” című kiadványában, szerkesztők: Hollander A., DeMoss D., Káplán S., Konisky J., Savage D. és Wolfe R.S., kiadó: Plenum Press, 87-100. oldal (1982)]. Ez a megfigyelés megoldható feladattá teszi nem szelektív DNS-szekvenciák együtttranszformálását szelektív DNS-szekvenciákkal.
Az Aspergillus nidulansban, amelynek ivaros ciklusa van és ezért fogékony a klasszikus genetikai manipulációkra, mind negatív, mind pozitív szelekciós rendszert azonosítottak. Vagy N.crassa-ból származó heterológ DNS-t, vagy homológ DNS-t alkalmazva A. nidulans pyrG-mutánsok funkcionális komplementációját kapták pyrG gént tartalmazó plazmidokkal végzett transzformációval [Ballance és munkatársai: BBRC 112, 284 (1983); Tilbum és munkatársai: Gene, 26, 205 (1983)]. Más rendszerekben a trpC vagy argB lókuszoknál levő mutációkat funkcionálisan komplementáltak megfelelő plazmidokkal végzett transzformációval [Yelton és munkatársai: PNAS 81, 1470 (1984); Yelton és Timberlake: J. Cell. Biochem. Suppl. 9C 173 (1985); Johnstone és munkatársai; EMBO J. 4, 1307(1983)].
Domináns pozitív szelekciós rendszert is fejlesztettek ki A. nidulansból izolált amdS gént hasznosítva, amely képessé teszi az ezzel transzformált A. nigert, hogy növekedjék acetamidon, mint egyedüli nitrogénforráson [Tilburn és munkatársai: Gene, 26, 205 (1983); Wemars és munkatársai: Curr. Génét. 9, 361 (1985); Kelly J.M. és munkatársai: EMBO J. 4, 475 (1985)].
A N. crassaval vagy A. nidulans-sal összehasonlítva az A. niger sokkal fontosabb organizmus. Széles körben alkalmazzák enzimek ipari termelésére, például élelmiszeripari felhasználásra. Az A. niger kiválasztási kapacitásában különbözik az A. nidulanstól, amennyiben ez hidrolitikus enzimek széles választékát választja ki, ilyenek például a glukoamiláz, α-amiláz, pektináz, celluláz, β-glukanáz, β-galaktozidáz, naringináz, pentózanáz, savas proteáz és lignáz, ezek közül a glükoamiláz és pektináz komplex a legfontosabb enzimek.
Az A. nigeiTŐl nem ismeretes, hogy ivaros életciklusa lenne. Ennek megfelelően mutációkat nem lehet bevezetni meiotikus rekombinációkkal. A klasszikus mutációs és szelekciós eljárásokkal azonban kiterjedt törzsjavításokat értek el a hidrolitikus enzimek kiválasztása terén.
Az A. niger enzimek génjeiből csak a glukoamiláz génjeit [Boel és munkatársai; EMBO J. 3, 1581 (1984)] és az alkohol és aldehid dehidrogenáz génjeit (WO 86/06097 számú PCT közzétételi irat), valamint ezek promotor és szignál szekvenciáit jellemezték és alkalmazták A. nidulanssel illetve A. nigerrel végzett transzformációs kísérletekben.
HU 214 005 Β
Szelekciós markerként A. nigerhez a heterológ amds gént [Kelly és Hynes, EMBO J. 4, 475 (1985) és az argB gént Buxton és munkatársai: Gene, 37, 207 (1985); EP 184438 számú európai szabadalmi közzétételi irat; WO 86/06097 számú PCT közzétételi irat] alkalmazták, mindkettőt A. nidulansból kapták.
Az A. niger a legfontosabb organizmus a pektinbontó enzimek ipari termeléséhez. A pektinek a-1,4glikozid kötésű D-galakturonsav polimerekből álló nagy molekulatömegű (20 000-40 000 D) poligalakturonidok, és a természetben magasabbrendű növényi sejtek alkotórészeiként fordulnak elő, ahol ezek azokhoz a cellulóz molekulákhoz vannak rögzítve, amelyeket főleg a primer sejtfalakban és a középső lamellákban találunk. A pektin leggazdagabb forrásai közt van a citrom és narancs héja, amely ennek a poliszacharidnak mintegy 30%-át tartalmazza. A pektikus enzimek lebontják a szénhidrát polimer szubsztrátumot vagy az a-1,4glikozid kötések hidrolízisével (poligalakturonáz), vagy pektin molekulában lévő a-4,5-telítetlen galakturonsav gyök transz-eliminálásával (különböző pektin-liázok). A pektin liáz rendszertani neve pektin transzelimináz (EC 4.2. 2.10.).
Az A nigerben a pektikus komplex fehérjei nem konstitutívan fejeződnek ki. Indukáló körülmények között, pektint vagy ennek bomlástermékeit alkalmazva az A. niger kifejezi a fentebb említett enzimeket, beleértve a PLI-t, amikor a más szénforrásokat, mint például a glukózt vagy szacharózt korlátozzuk. Felületi tenyészetekben a pektikus enzimek hajlamosak arra, hogy asszociálva maradjanak a külső sejtfallal. A tápközegben növekvő pektin és Ca+3 koncentráció a teljes kiválasztáshoz vezet.
A pektinázokat, mint például a PLI-t, az élelmiszeriparban hasznosítják, főleg a gyümölcslevek derítéséhez.
Az A. nigerből két különböző pektinliázt, a PLI-t és PLII-t tisztította és részben jellemezte Van Houdenhoven F.E.A. [Doktori disszertáció az Agricultural University-ben, Wageningen; megjelent: Communications Agricultural University Wageningen, Hollandia, 75-13. (1975)]. A PLI négy mannózgyököt tartalmaz, míg a PLII két-két mannóz- és glukózgyököt tartalmaz. A két enzim molekulatömege eltérő (PLI: 37,5 kD, PLII: 36 kD). A jelen találmány előtt ezeknek sem teljes, sem részleges aminosav-szekvenciáját nem közölték.
A jelen találmány pektinliázl (PLI) részleges szerkezetmeghatározásán alapul, amely lehetővé teszi a fehérje fontosabb részeit kódoló DNS-vizsgáló minták szintézisét. A DNS-vizsgáló minták segítségével lehetségessé vált PLI-et kódoló DNS-ek átvizsgálása és izolálása, esetleg pre- és posztszekvenciáikkal együtt, A. niger génkönyvtárából.
A jelen találmány tárgya eljárás pektinliáz kifejezőrendszert kódoló rekombináns DNS-molekulák és származékokat, (ilyenek például a PLI struktúrgénje és megfelelő szabályozó szekvenciák, például promotor, szignál és terminátor szekvenciák;) tartalmazó hidrid vektorok, beleértve a homológ vagy heterológ polipeptideket kódoló DNS-ekkel bíró hibrid vektorokat; az említett vektorokkal transzformált gazdaszervezetek, elsősorban fonalas gombák, például Aspergillus gazdaszervezetek; előállítása; és a rekombináns DNS-molekulák alkalmazása új kifejező rendszerek előállítására. A találmány további tárgya polipeptidek előállítása az említett DNS-ek és az említett gazdaszervezetek segítségével.
A pektinliáz kifejező rendszer a pektinliáz gén promotorját, szignál szekvenciáját, struktúrgénjét és terminátorját kódoló DNS-szekvenciákat tartalmaz.
Részletesebben a jelen találmány egyik tárgya a PLI promotoiját, kívánt esetben ennek a fehétjének a szignál szekvenciáját és kívánt esetben ugyanennek a génnek megfelelő terminátorút kódoló DNS-szekvenciákat tartalmazó hibrid kifejező vektorok megalkotása. Ezeket a hibrid kifejező vektorokat alkalmazzuk az adott fehérjéket kódoló gének beépítésére és fonalas gombák, például Aspergillus, Penicillium és Cephalosporium transzformálására. Az A. niger együttes transzformálását két különböző plazmiddal is végbevihetjük, így a plazmidok egyikét a találmány szerinti kifejező vektorok csoportjából választjuk ki, és a másik egy speciálisan konstruált szelekciós plazmid, amely egy fonalas gomba mutált törzsével kapcsolatban működik.
A jelen találmány foglalkozik PLI túltermelésével is Aspergillus fajokban.
A jelen találmány különböző tárgyai nyilvánvalóak lesznek a találmány itt következő részletes leírásából.
A rekombináns DNS-molekulák
Részletesebben a jelen találmány az (I) képlet (4. ábra) DNS-szekvenciáját tartalmazó rekombináns DNSmolekulával vagy ennek szánnazékaival foglalkozik.
A 4. ábrán az egyes betűk jelentése a következő:
(A) alanin (D) aszparaginsav (F) fenilalanin (H) hisztidin (K) lizin (M) metionin (P) prolin (R) arginin (T) treonin (W) triptofán (C) cisztein (E) glutaminsav (G) glicin (I) izoleucin (L) leucin (N) aszparagin (Q) glutamin (S) szerin (V) valin (Y) tirozin
DNS-szekvenciájában a betűk az alábbi bázisokat jelentik:
(A) adenozin (C) citidin (G) guanozin (T) timidin.
A „származék” kifejezés, amikor az (I) képlet DNSszekvenciájával együtt alkalmazzuk, azt kívánja kifejezni, hogy ezek közé beleértjük a nagyobb származékokat szegélyező szekvenciákkal az említett DNS-szekvencia fragmentumait, mutánsait, főleg természetben előforduló mutánsait, és olyan DNS-szekvenciákat, amelyek degeneráltak.
Az I képlet DNS-molekulájának nagyobb származékai azok, amelyek az A. niger genomból kimetszhetők és az I. képletű DNS-szekvenciát magukban foglalják, ahogyan ezek az A. niger genomkönyvtárban találhatók; ez a könyvtár úgy készül, hogy a nukleinsavakat
HU 214 005 Β fragmentáljuk, a fragmentumokat megfelelő restrikciós enzimmel, például Sau3A-val kezeljük, egy alkalmas plazmidba, például pUN121-be ligáljuk, klónozzuk például E.coliban, és kimetsszük ismét az azonos restrikciós enzimmel. Ilyen származék például az 1. ábrában bemutatott pCG3B 11 plazmid beiktatása.
Az I. képlet DNS-szekvenciájának fragmentumai azok, amelyek két restrikciós enzim-hely között terülnek el az alábbi enzimek restrikciós enzim-helyei közül: PstI, EcoRI, HindlII, Sau3AI, KpnI, Clal, Ncol, Acél, SalII, Pvul, Sáli, Spel, BglI, EcoRV, Bglll, Aval, Xhol, Nhel, BssHI, XmnI, BamHI, BssHII és hasonlók, amint ezek a mellékelt ábrákban láthatók.
Az előnyös fragmentumok azok, amelyek tartalmazzák a PLI promotor szekvenciáját, szignálszekvenciáját és struktúrgénjét, és/vagy a terminátorszekvenciát.
Az I. képletű DNS-szekvencia fragmentumai tartalmazhatnak olyan kapcsolókat is, amelyek sikeres kapcsolatokat tesznek lehetővé más DNS-molekulákhoz.
A PLI promotor szekvenciát a -1-688 közti nukleotid helyek közti DNS-területben találjuk, amelyben a mintegy -100 és -146 közti szekvenciák esszenciálisak. A promotor szekvenciához a TATAA box a -120-146 közti nukleotidoknál fontos, mint RNS polimeráz-felismerő hely. Megfelelő kapcsolókat lehet rögzíteni ezekhez a fragmentumokhoz.
Az A. niger PLI-ének promotorja indukálható, azaz a hozzá rögzített struktúrgén, vagyis PLI-et vagy más idegen gént kódoló struktúrgén kifejeződését pektin vagy pektin bomlástermék tápközeghez való hozzáadásával indukálhatjuk.
A szignál szekvencia az 1-57. nukleotidok közt terül el. A szignál szekvencia előnyös szekvencia, és az ezt tartalmazó DNS-molekulák, például az említett szekvenciát és adott esetben megfelelő kapcsolókat tartalmazó DNS-molekulák előnyös DNS-molekulák.
A PLI struktúrgénje az 58. nukleotidnál kezdődik, és az 1366. nukleotidig terjed. Amint az I. képletből nyilvánvaló, a struktúrgén számos intront tartalmaz. A struktúrgén tartalmazhat megfelelő kapcsolókat is.
A terminátor az 1367. nukleotidnál levő TAA stop kodonnal kezdődik és az 1570. vagy 2029. nukleotidig, elsősorban az említett szekvencián belüli restrikciós helyekig terjed. A terminátor-fragmentum tartalmazhat megfelelő kapcsolókat is.
A fenti fragmentumoknak megfelelő kapcsolók olyan DNS-szekvenciával rendelkeznek, amelyek illenek annak a DNS-nek a restrikciós helyébe, amelyhez a fragmentumot kötjük, vagy amelyek egy restrikciós helyet tartalmaznak.
Az I. képlet DNS-szekvenciájának fragmentumai azok is, amelyek kisebb fragmentumokból vannak összeállítva, például azok, amelyek a promotor, és a szignál- vagy struktúrszekvenciából tevődnek össze, vagy azok, amelyek a szignál és struktúrszekvenciából, az intronok nélküli struktúrgénből, stb. tevődnek össze.
Az I. képletű DNS-szekvencia mutánsai például a természetben előforduló mutánsok, mint például az a mutáns, amelyben a T80 nukleotid Asű-nal van helyettesítve, ami által a valint kódoló GTG kodon megváltozik glutaminsavat kódoló GAG kodonná. Ez utóbbi aminosav egy A. niger törzsből kapott pektinolitikus enzimkeverékből (Ultrazym, Novo Industries, Koppenhága) izolált PLI-ben jelen van. A találmány magában foglalja a szignálszekvencia természetes vagy szintetikus mutánsait is hasonló vagy azonos hidrofobicitási profillal, például ahol a lizin (K8*), tirozin (Y8-) és arginin (R8+) poláris aminosavakhoz tartozó kodonok más olyan aminosavak kodonjaival vannak kicserélve, amelyek hasonló töltéssel bírnak, és az alanin(A), leucin(L) és treonin(T) hidrofób aminosavak kodonjai más hidrofób aminosavak kodonjaival vannak helyettesítve. így például a pozitív töltésű lizinhez tartozó kodont helyettesíteni lehet az arginin kodonjával és viszont, a negatív töltésű tirozinhoz tartozó kodont a glutaminsav vagy aszparaginsav kodonjával, és/vagy a nem-poláris, hidrofób alanin kodonját a treonin, prolin, valin, izoleucin, leucin, metionin, vagy fenilalanin valamelyikének kodonjával, stb. Más mutációk „csendes mutációk”, ahol egy vagy néhány nukleotid, például körülbelül 1-30 nukleotid egy vagy több más nukleotiddal van helyettesítve olyan módon, hogy az új kodonok ugyanazokat az aminosavakat kódolják.
Az I. képletű DNS-szekvenciák közül azok, amelyek degeneráltak, a csendes mutációkhoz hasonlóak, azaz a genetikai kód azonos jelentésén belül vannak, vagyis korlátlan számú nukleotid lehet helyettesítve más nukleotidokkal anélkül, hogy az aminosav-szekvencia, amelyet ezek kódolnak, megváltozna. Az ilyen degenerált DNS-szekvenciák hasznosak lehetnek különböző restrikciós helyekhez.
Az I. képletű DNS-szekvenciát vagy származékait tartalmazó rekombináns DNS-molekulák elsősorban rekombináns vektorok, más néven hibrid vektorok, amelyek az ilyen DNS-szekvenciát beiktatásként tartalmazzák. Ezek gazdaszervezetekben, mint például baktériumokban, gombákban vagy állati sejtekben való klónozáshoz alkalmazhatók. Az ilyen hibrid vektorok bármilyen olyan vektorból származhatnak, amelyek a genetikai manipulációk gyakorlatában használatosak, például fágokból, kozmidokból, plazmidokból, vagy kromoszomális DNS-ből, például BamHI emésztéssel linearizált λ-fág, például NM 989, M13mp8 fág DNSszármazékokból [Messing J.: Metholds in Enzymology, 101, 21-78. (1983)], bakteriális plazmidokból, például pBR322, pUN121, pUC18 plazmidokból, élesztő plazmidokból, például az élesztő 2 μ plazmidjából, vagy kromoszomális DNS-ből, például Aspergillusból, főleg A. nigerből származó DNS-ből, például olyanból, amelyet az EP 184438 számú európai szabadalmi közzétételi irat ismertet.
Egy jelen találmány szerinti hibrid vektor az I. képletű DNS-szekvencián vagy származékain kívül egy replikációs helyet és adott esetben, a DNS-származék típusától függően, egy kifejeződést szabályozó szekvenciát is tartalmaz, ilyenek például a fokozó szekvencia, aktiváló hely felfelé, promotor és szignálszekvenciák és/vagy a jelen levő A. niger eredetű szekvenciáknak megfelelő szekvenciáktól eltérő struktúrgének. Az ilyen fokozó szekvenciák származhatnak a Physarum poly4
HU 214 005 Β cephalum extrakromoszomális riboszomális DNS-éből (PCT/EP 8500278), vagy az aktiváló helyek lehetnek a PH05 savas foszfatáz géntől felfelé elhelyezkedő szekvenciák (86 111 820.6 számú európai szabadalmi bejelentés), vagy a promotorok lehetnek PH05, trp, PH05-GAPDH hibrid promotorok (86 111 820.6 számú európai szabadalmi bejelentés), vagy hasonló promotorok. Az ilyen kifejező kontrollszekvenciákat a PLI struktúrgénhez lehet hozzákapcsolni.
A jelen promotor, szignál- és/vagy terminátorszekvenciákhoz ligáit struktúrgének, az intronnal rendelkező vagy intron nélküli PLI-et kódoló géneken kívül, lehetnek más homológ pektin liáz gének, vagy legkülönbözőbb polipeptideket kódoló heterológ struktúrgének, például glikozilezett polipeptideket, főleg magasabbrendű eukarióta, elsősorban emlős, de különösen emberi polipeptideket kódoló gének, vagy tápanyagok előállításában vagy enzimes vegyi reakciók végrehajtásában alkalmazható enzimeket kódoló gének, vagy emberi és állati betegségek kezeléséhez és megelőzéséhez használatos és hasznos, nem enzim jellegű polipeptideket kódoló gének, az ilyen polipeptidek közé beleértve a hormonokat, immunmodulátor, vírusellenes és tumorellenes tulajdonságú polipeptideket, antitesteket, vírusantigéneket, vakcinákat, véralvadási faktorokat, élelmiszereket stb.
Az ilyen heterológ struktúrgénekre példák azok, amelyek az alábbi anyagokat kódolják: inzulin, növekedési faktorok, például epidermális, inzulinszerű növekedési faktorok, hízósejt-növekedési faktorok, idegvagy transzformáló növekedési faktorok, növekedési hormonok, mint például emberi vagy szarvasmarha növekedési hormonok, interleukinek, mint például interleukin-1 vagy -2, humán makrofág migrációt gátló faktor (MIF), interferonok, mint például humán a-interferon, például aA, aB, aD-interferon, β-interferon, γ-ίηterferon, vagy hibrid interferonok, mint például az aAaD- vagy aB- aD-hidrid interferonok, hepatitisz-vírus antigének, mint például hepatitisz-B vírus felületi vagy belső antigén vagy hepatitisz-A vírus antigén, plazminogén aktivátorok, mint például szöveti plazminogén aktivátor vagy urokináz, tumor nekrózis faktor, szomatosztatin, renin, β-endorfin, immunglobulinok, mint például a D, E vagy G immunglobulinok könnyű és nehéz láncai, immunglobulin-kötő faktorok, mint például az E immunglobulin-kötő faktor, kalcitonin, humánkalcitonin-rokon peptid, véralvadási faktorok, mint például a IX. vagy VIIIc. faktor, eglinek, mint például a C eglin, deszulfatohirudin, mint például a HV1, HV2 vagy PA deszulfatohirudin, vagy humán szuperoxid diszmutáz. Az előnyös gének azok, amelyek humán α-interferont vagy hibrid interferont, humán szöveti plazminogén aktivátort (+-PA), hepatitisz B vírus felületi antigént (HBVsAg), inzulin-szerű I. növekedési faktort, C eglint és deszulfatohirudint, például HV1 hirudinvariánst kódolnak. A jelen találmány szerinti hibrid vektorokban a jelen promotor és/vagy szignálszekvenciák operatívan kapcsolódnak a polipeptidet kódoló területhez úgy, hogy a polipeptid hatékony kifejezése biztosítva legyen.
A jelen találmány szerinti DNS-molekulák tartalmazhatnak szelektív markereket is, attól a gazdaszervezettől függően, amelyet transzformálni, szelektálni és klónozni akarunk. Bármilyen marker gént lehet alkalmazni, amely megkönnyíti a transzformánsok szelekcióját a marker fenotípus kifejeződése következtében. A megfelelő markerek elsősorban azok, amelyek antibiotikum-rezisztenciát fejeznek ki például tetraciklin vagy ampicillin ellen, vagy auxotróf élesztőmutánsok esetében olyan gének, amelyek kiegészítik a gazdaszervezet hiányait. A megfelelő gének például rezisztenciát adnak át cikloheximid antibiotikumra, vagy prototrófiát biztosítanak auxotróf élesztőmutánsban, például ilyenek az ura3, leu2, his3 vagy trpl gének. Markerként lehetséges alkalmazni olyan struktúrgéneket is, amelyek autonóm módon replikálódó szegmenssel vannak asszociálva, ez azt teszi lehetővé, hogy a transzformálandó gazdaszervezet auxotróf legyen a marker által kifejezett termék számára.
Különösen fontosak azok a marker gének, amelyek kiegészítik az A. niger gazdaszervezet hiányosságait, ilyen például az omitin karbamoil transzferázt kódoló argB gén, például A. nigerből vagy A. nidulansból származó ilyen gén, vagy a N. crassa pyr4 génnel homológ A. nidulans DNS-fragmentumok [Ballance D. J. és Tumer G.: Gene, 36, 321-331. (1985)].
A jelen találmány előnyös kiviteli formái azok a hibrid vektorok, ahol a struktúrgén, előnyösen az idegen struktúrgén operatívan kapcsolódik a jelen találmány szerinti promotor és szignálszekvenciákhoz. Ilyen előnyös hibrid vektorok például a pCG3Bll, ml3mp8-PL(SalI-EcoRI) BssHII/BE5, pUBE5, pLHK3, pLHL5 és pLHLT7 vektorok. További hasznos hibrid vektorok a pPL29-5 és pPL35-5 vektorok (lásd a példákat és ábrákat).
Az I. ábra szerinti DNS-t és származékait, beleértve fragmentumait is, lehet alkalmazni DNS-génbankok vagy mRNS-ek átvizsgálására hasonló DNS-ekre vagy mRNS-ekre.
Eljárás a rekombináns DNS-molekulák előállítására
A találmány pektinliáz kifejező rendszert kódoló rekombináns DNS-molekulák vagy származékaik előállítására szolgáló eljárással is foglalkozik, az eljárás vagy abban áll, hogy a pektinliáz kifejező rendszert kódoló DNS-szekvenciát vagy származékait tartalmazó DNS-molekulákkal transzformált gazdasejtet tenyésztjük, és a kívánt rekombináns DNS-molekulát izoláljuk, vagy ezt in vitro szintézissel állítjuk elő.
A gazdaszervezet tenyésztését hagyományos tápközegekben hajtjuk végre, amelyek ki vannak egészítve bizonyos kémiai vegyületekkel, vagy amelyekből ki vannak vonva bizonyos kémiai vegyületek, így tesszük lehetővé a transzformánsok negatív vagy pozitív szelekcióját, vagyis ilyen módon tudjuk elválasztani a kívánt DNS-molekulát egy szelekciós markerral együtt tartalmazó gazdasejteket a nem transzformált gazdasejtektől, vagyis a kívánt DNS-molekulát nem tartalmazó gazdasejtektől.
HU 214 005 Β
Bármilyen, a szakterületen alkalmazott transzformálható gazdaszervezet használható, például baktériumok, mint az E. coli, gombák, mint a Saccharomyces cerevisiae, vagy főleg fonalas gombák, mint az Aspergillus, például az A. nidulans, A. oryzae, A. carbonarius, A. awamori, és különösen az A. niger. Előnyös gazdaszervezet az A. niger An8, ez olyan új mutáns, amelyből a pyrA gén hiányzik, amint ezt az alábbiakban leíijuk. A gazdaszervezet transzformálását hagyományos módszerekkel végezzük.
A PL kifejeződési rendszert kódoló DNS-szekvenciát ilyen rendszert tartalmazó fonalas gombákból kapjuk, főleg ezek genom könyvtárából vagy mRNS-én keresztül.
A következőkben a PLI kifejező rendszer előállítását részletesebben írjuk le.
Genom könyvtárat készíthetünk például Aspergillus niger törzs, elsősorban N756 törzs genom DNS-ének részleges emésztésével Sau3AI-gyel és a nagy molekulatömegű DNS-fragmentumok klónozásával pUN121 E. coli-plazmidba. Bármilyen más, PLI-et termelő A. niger törzs szolgálhat genomkönyvtár-forrásként és hasonlóképpen más vektorokat is lehet alkalmazni a fragmentumokhoz befogadóként.
Abból a célból, hogy sikeresen átvizsgáljuk a genom könyvtárat PLI-t kódoló DNS-szekvenciákra, ennek az enzimnek vagy részeinek szekvenciameghatározása szükséges. PLI-et tisztítunk A. niger kereskedelmileg rendelkezésre álló pektinolitikus enzimkeverékéből (Ultrazym, Novo Industries), és szekvenciaelemzésnek vetjük alá. Az érett PLI N-terminálisa az alábbi szekvenciát mutatja:
V,-G-V-X4-G-T6-P-E-G-F-A, és a PLI egyik fragmentuma, amelyet PLI hasításával kapunk cianogén-bromiddal, az alábbi szekvenciát mutatja:
V|29-S-G-V-S-N-I-I-I-Q-N-I-A-V-X143-D-IN-XI47-E, ahol X jelentése olyan aminosav, amelyet eddig még nem azonosítottunk.
Ezekre az aminosav-szekvenciákra alapozva számos DNS-vizsgálómintát, azaz az aminosav-szekvenciák részeit kódoló DNS-szekvenciák keverékét és az ezeknek megfelelő degenerált DNS-szekvenciákat szintetizálunk kémiai úton, és alkalmazunk az átvizsgáláshoz. Az ilyen DNS-vizsgáló minták például az alábbi képletü DNS-ek keverékei:
3’ TGR, GGR, CTR, CCR3 AAR3 CG5’(2014) (la) vagy
3’ TGR, GGR, CTR2 CCR, AAR3 CG5 (2015) (lb) ahol R, jelentése A, C, G vagy T, R2 jelentése C vagy T és R3 jelentése A vagy G, vagy a 2060. DNS-keverék az alábbi képlettel:
5’ AAR, ATR2 ATR2 CAR3 A 3’ (2060) (le), ahol R, jelentése A vagy T, R2 jelentése A, T vagy C és R3 jelentése A vagy G.
Mivel a PLI teljes DNS-szekvenciája a munka során ismeretessé vált, ennek bármely részét, amely legalább 14 bp-vel bír, lehet most átvizsgálásra alkalmazni, amely magában foglalja a PL rendszert kódoló mRNS átvizsgálását ís.
Átvizsgálás céljából a DNS-vizsgáló mintákat 5’-jelezzük radioaktívan a szakterületen ismert módon, y32P-ATP-t és T4 kinázt alkalmazva. A jelen találmány szerinti nukleinsavakat beiktatásként hordozó gazda mikroorganizmusokat jelzett DNS-vizsgáló mintával végzett hibridizálással azonosítjuk, a génkönyvtár szűrőreplikáin.
Abból a célból, hogy algénkönyvtárat hozzunk létre, a könyvtárnak a PLI N-terminális részét kódoló radioaktívan jelzett DNS-re radioaktív választ mutató kiónjait izolálhatjuk, tenyészthetjük és hibridizálhatjuk a második, a CNBr fragmentum N-terminális aminosavait kódoló DNS-vizsgáló mintával, amint ezt fentebb leírtuk.
Azokat a kiónokat, amelyek hibridizálási választ mutatnak az egyik vagy két DNS vizsgáló mintára, izoláljuk és sokszorozzuk.
így például az átvizsgálás a 2014. és 2015. DNSvizsgáló mintákkal feltár 33, illetve 39 pozitív kiónt. A 72 kiónt sokszorozzuk és a kapott alkönyvtárakat újból átvizsgáljuk a 2060. DNS-vizsgáló mintával, amely által 3 pozitív kiónt tudunk azonosítani. Az egyik kiónt kiválasztjuk és E. coli BJ 5183/pCG3Bl 1-nek nevezzük el. Ez a pCG3B 11 plazmidot tartalmazza amelynek részleges restrikciós térképét az 1. ábrában mutatjuk be. A pCG3Bl 1 Sau3AI fragmentuma a 4. ábrában és az I. képletben bemutatott Sphel-Nhel fragmentumot tartalmazza.
A pCG3Bl 1 plazmidot alkalmazhatjuk a találmány szerinti más DNS-molekulák megalkotására, hagyományos genetikai manipulációs technikákat alkalmazza.
így például a pCG3B 11 hasítása EcoRI-gyel és a két fragmentum klónozása pUN121 plazmidba a pPL 29-5 plazmidhoz (2. ábra) vezet, amely tartalmazza a promotort, a szignál szekvenciát és a PLI gén struktúrgénjének egy részét a 649/650 helynél levő központi EcoRI restrikciós helyig, illetve a pPL35-5 plazmidhoz vezet (3. ábra) amely tartalmazza a PLI struktúrgénnek a 650. helynél induló részét és a terminátort. A pPL 29-5 tartalmazza továbbá a pCG3Bl 1 szegélyező N-terminális szekvenciákat és a pPL35-t tartalmazza továbbá a pCG3B 11 szegélyező C-terminális szekvenciáit.
A pPL29-5 és pPL35-5 plazmidok beiktatásainak fragmentumait kaphatjuk meg szekvenciaelemzéshez megfelelő enzimekkel végzett hasításokkal, ilyen restrikciós enzimek például az AhalII, PstI, Aval, HindlII, EcoRI, KpnI, Clal, Ncol, AccI, Sáli, Pvul, SalII, Nhel, BglI, EcoRI és EcoRV. A fragmentumokat lehet szubklónozni például különböző M13 fágokba, előnyösen M13mp8 és M13mpl8 fágokba, ezeket a fragmentumokat szekvenciaelemzésnek vethetjük alá például M13 klónozó és szekvenciaclemző készletet alkalmazva (M13 Sequencing Kit N.4502, Amersham) a szállító által adott körülményeknek megfelelően (Ml3 cloning and sequencing handbook, Amersham International plc. Buckinghamshire, Anglia). A 2,7 kb-s Spel-Nhel fragmentum teljes szekvenciáját, amely a PLI gén teljes szekvenciáját tartalmazza, a 4. ábrában mutatjuk be. Ez tartalmazza a promotor terület 688 nukleotid szekvenciáját, a PLI gén struktúr-részének 1369 nukleotidját és a terminátor terület 661 nukleotidját. A pPL29-t-nek azt
HU 214 005 Β a szekvenciáját, amely a PLI N-terminális aminosavszekvenciájának felel meg az aminosav szekvenciaelemzés alapján meghatározva (1. ábra), 57 nukleotid szekvencia előzi meg, amelyek az alábbi képletű szignál peptidet kódolják:
Μ,-Κ-Υ-A-A-A-L-T-A-I-A-A-L-A-A-R-AA-A57.
A PLI C-terminális CNBr fragmentuma N-terminálisának aminosav szekvenciáját a pPL35-5 klónozó DNS fragmentuma (1257-1379 nukleotidok) nem kódolja folyamatosan. Egy számítógéppel segített kutatás exon/intron illeszkedési helyek együttműködő (konszenzus) szekvenciáira, valamint az intron belső szekvenciáira [Boel E., Hansen Μ. T., Hjort I., Hoegh I., Fiil
N. P.: EMBO J. 3, 1581-1589. (1984) és Mount S.M.: Nucleic Acids Rés. 10, 459—472 (1982)] arra vezet, hogy négy intron jelenlétét tartjuk lehetségesnek, 65 bp, 62 bp, 63 bp illetve 57 bp hosszúsággal (4. ábra).
Az M13mp8 fágokból és a pPL29-5 plazmid
O, 8 kb-s Sall-EcoRI fragmentumából nyert egyik plazmidot, amely a PLI gén promotorjának 130 nukleotidját és N-terminális részét tartalmazza, M13mp8 (SalI-EcoRI)-nek nevezzük, és más, találmány szerinti DNS-molekulák készítéséhez szolgáló további lépésekben használjuk fel ezeket.
Ilyen további, találmány szerinti I. képletű DNSszekvencia fragmentumait tartalmazó DNS-molekulákat alkothatunk meg olyan módon, ahogyan ezt az 5. és 9. ábrákban bemutatjuk, ahol, ha kívánatos, új restrikciós helyeket vezethetünk be, például BssII restrikciós helyet a PLI gén szignál szekvenciáján belül, az ilyen DNS-molekulák például az alábbi plazmidok, illetve fágok: pUBE5, M13mp8-PL(SalI-EcoRI)BssHII/BE5 (5. ábra), pLHK3 (7. ábra), pLHL5, M13mpl8PL(SpeI-EcoRI)BssHII/AC5, pLHT7 (9. ábra), amelyek közül az utolsó három plazmid a deszulfatohirudint kódoló struktúrgént tartalmazza.
Új restrikciós helyeket tartalmazó mutánsokat készíthetünk például in vitro hely-irányított mutagenezissel, hagyományos módszereket alkalmazva [lásd Zoller M. J. és Smith M. összefoglaló közleményét: Methods Enzymol. 100, 468 (1983); valamint az alábbi közleményeket: Botstein D. és Shortle D.: Science 229, 1193 (1985); Norris K. és munkatársai: Nucl. Acids. Rés. 11, 5103 (1983)].
így például a jelen DNS-szekvencia egyik mutánsa az M13mp8PL(SalI-EcoRI) fágból származik, amely a promotort és a PLI kiválasztó szignál génjét tartalmazza. Egy új BssHIl hely bevezetését az M13mp8PL(SalIEcoRI) gén szignál szekvencia területébe úgy hajtjuk végre, hogy olyan kémiailag szintetizált primer oligonukleotidot alkalmazunk, amely komplementer a PLI szignál szekvencia C-terminális részéhez közel elhelyezkedő 36-54 nukleotidoknál levő DNS-szekvenciával, azzal a kivétellel, hogy a 45. helynél C/G transzverziót (mutagén printert) vezetünk be.
Az új BssHIl helyet hordozó mutált fágot M13mp8PL(SalI-EcoRI)BssHII-nek nevezzük, és ezt felhasználhatjuk kifejező vektorok megalkotására homológ és heterológ génekhez.
Egy megfelelő példában a pML310 deszulfatohirudin génjét (168 342 lajstromszámú európai szabadalmi leírás) újra klónozzuk M13mpl8-PL(SpeI-EcoRI)BssHII/AC5 fágba (6-9. ábrák). Egy Hgal/BssHII kapcsolót alkotunk meg, hogy a pML301L deszulfatohirudin génjének Hgal restrikciós helyét kompatibilissé tegyük az M13mpl8PL(SpeI-EcoRI)BssHII/AC5 BssHIl helyével. A kapcsolót a hasított fág DNS-hez ligáljuk. A kapcsoló fragmentumot hordozó fág-DNS-t HindlII-mal hasítjuk, amely hasítás két fragmentumot ad. A 0,7 kb-s fragmentumot izoláljuk, amely a PLI szignál szekvenciáját és a kapcsoló fragmentumot tartalmazza. Egy alkalmas plazmidot, amely BamHI restrikciós helyet hordoz, például pBR322-t hasítunk BamHI-gyel. A klónozni kívánt gént kihasítjuk a genom DNS-ből, plazmid vagy fág DNS-ből megfelelő restrikciós enzimekkel, és ha szükséges, ellátjuk az igényelt kompatibilis restrikciós helyekkel.
Egy másik módszer, hogy kompatibilis restrikciós helyeket hozzunk létre, az in vitro mutagenezis, például ahogyan ezt a pML 30IL létrehozásánál végrehajtjuk (6. ábra). Hgal restrikciós helyet tartalmazó kapcsolót alkotunk meg és rögzítünk a deszulfatohirudin gén 5’terminálisán.
Nagyobb kifejezési arányokhoz bármilyen eukarióta terminátor szekvenciát ligálhatunk a struktúrgén végéhez. A találmány egyik előnyös kiviteli módjában a PLI gén terminátor területét alkalmazzuk. így például a PLI terminátor helyét tartalmazó kifejező vektort kaphatunk a fentebb leírt eljárás szerint a következő úton. A promotor és a kiválasztó szignál-szekvenciát az Μ13mp 18-PL(SpeI-EcoRI)BssHII/AC5 plazmidból kapjuk. A terminátor területet a pPL35-t-ből kapjuk. Az M13mpl8-PL(SpeI-EcoRI)BssHII/AC5-öt BssHIIvel hasítjuk és egy BssHII-Hgal kapcsolót ligálunk ide. pPL35-t plazmidot hasítunk Pstl-gyel, amely hasítás két fragmentumot eredményez, amelyekhez ismét megfelelő kapcsolót ligálunk, amely kapcsoló kompatibilis a klónozott gén 3’-végével. A PstI restrikciós helyek tapadós végeit betöltjük T4-polimeráz enzimmel és egy BamHI kapcsolót adunk hozzá, például olyan BamHI kapcsoló a Biolabs-nál (New England) kapható. A pPL35-5 plazmidot Nhel-gyel hasítjuk és az így létrejövő 0,7 kb-s fragmentumot, amely tartalmazza a PLI terminátor területét, izoláljuk. A sokszorozáshoz bármilyen plazmidot alkalmazhatunk, amely rendelkezik kompatibilis restrikciós helyekkel, például pUC18-at. pUC18 esetében a plazmidot HindlII-mal és Xbal-gyel hasítjuk. Négy DNS fragmentumot, vagyis a BssHIIHgal kapcsolót hordozó Μ13mp 18-PL(SpeIEcoRI)BssHN/AC5 fragmentumot, a pPL35-5 BamHI kapcsolót hordozó 0,7 kb-s fragmentumát, HindllI/Xbal-gyel hasított pUC18-at és a diszulfatohirudin gén Hgal-BamHI fragmentumot, ligálunk, hogy kialakítsuk a pLHL7-et (9. ábra).
A baktériumokat hagyományos módszerrel transzformáljuk, és a transzformánsokat rezisztenciájukkal, például tetraciklin elleni rezisztenciájukkal azonosítjuk.
A leírt kifejező vektorokat leginkább alkalmas transzformált E. coli, például HB101 gazdatörzsekben sokszorozzuk [HanahanD.: J. Mól. Bioi. 166, 557—580.
HU 214 005 Β (1983)], ahol a gazdasejteket a szakterületen alkalmazott módszerekkel szelektáljuk. A sokszorozott plazmid DNS-t a baktériumokból hagyományos módszerekkel izoláljuk, főleg a Bimbóim és Doly által leírt módszerrel [Nucleic Acids Rés. 7, 1513-1523. (1979)].
Hasonló módon alkothatunk meg más plazmidokat is más homológ vagy heterológ génekkel.
A jelen találmány szerinti DNS-molekulákat előállíthatjuk in vitro szintézissel is hagyományos módszerek szerint. Az in vitro szintézis különösen alkalmas a PL kifejező rendszer kisebb fragmentumainak előállításához, például a PLI promotorját, de elsősorban szignál szekvenciáját kódoló DNS-szekvenciák vagy ezek mutánsai előállításához.
A jelen találmány szerinti DNS-molekulákat, amelyek a PLI promotort és kívánt esetben a PLI szignál szekvenciát, a PLI struktúrgént, bármilyen más heterológ struktúrgént és/vagy a PLI terminátort tartalmazzák, alkalmazhatjuk fonalas gombák, például Aspergillus, Penicillium, vagy Cephalosporium, például A. nidulans, A. oryzae, A. carbonarius és különösen A. niger transzformálására.
Abból a célból, hogy lehetővé tegyük a transzformáit gombák elkülönítését a nem transzformált gombáktól, a jelen találmány szerinti DNS-molekulák hordoznak valamilyen szelekciós markert, vagy egy másik módszer szerint a gombákat együtt transzformáljuk egy ilyen markert tartalmazó második vektorral. Mint más rendszerekben, az ilyen szelekciós rnárker egy kifejezhető struktúrgén, amelynek kifejezett polipeptidje (egy enzim) rezisztenciát ad a transzformánsoknak toxikus vegyületek ellen, vagy amely kiegészíti egy mutáns enzimrendszerét, amelyből egy ilyen esszenciális polipeptid hiányzik. Ilyen marker gének például az ismert qa-2, pyrG, pyr4, trpC, amdS vagy argB gének.
A találmány keretein belül egy új marker gént, amelyet pyrA-.nak nevezünk, izolálunk A. niger genomkönyvtárából, amely hasonlít az A. nidulans pyrG-jéhez és a N.crassa pyr4-éhez és hasonló funkciót tölt be, nevezetesen az orotidin 5’-foszfát dekarboxiláz enzimet termeli. Ez az enzim katalizálja az orotidin 5’-foszfát dekarboxilezését uridilsavvá (uridin-5’-foszfát) és a fluor-orotsav dekarboxilezését a toxikus fluor-uridinné. Egy pyrA gént tartalmazó E. coli kiónt azonosítunk a pDJB2 [Ballance D. J. és Turner G.: Gene, 36, 321-331 (1985)] 1,1 kb-s HindlII fragmentumával végzett hibridizálással, ahol ez a fragmentum tartalmazza a pyrA gén egy részét, de bármilyen más, orotidin-5'-foszfát dekarboxilázt kódoló pyr gén DNS-t alkalmazhatunk. Egy E. coli B75183 pCG59D7 nevű pozitív kiónból a pyrA gént tartalmazó pCG59D7 plazmidot izoláljuk és egy A. niger pyrA- mutánssal való együtt transzformáláshoz alkalmazzuk. Az ilyen pyrA- mutáns hiányos orotidin5’-foszfatáz dekarboxiláz génben és ezért nem képes előállítani a megfelelő enzimet. Az ilyen mutánsokat a. niger N756 konidiospóráinak kezelésével állítjuk elő mutációt okozó UV-besugárzással, és a fluor-orotsav és uridin jelenlétében túlélő telepeket kiválasztjuk. A fluor-orotsav jelenlétében és uridin távollétében túlélő telepeket eltüntetjük. A fennmaradó úrid in-igényes mutánsok transzformálhatósági képességük alapján, két komplementációs csoportba tartoznak, a pyrA és pyrB csoportba, ezeket képviselik az An8 illetve Anl 0 mutánsok. ezeket protoplasztjuk formájában kezeljük transzformáló körülmények között pyrA-tartalmú pCG59D7 plazmiddal. Csak az An8 telepekről találjuk úgy, hogy transzformálódnak és tartalmazzák a pyrA gént, amint ez bizonyítást nyer emésztett DNS-ének hibridizálódási képességével pUN121 DNS-éhez.
A jelen találmány foglalkozik továbbá a jelen találmány szerinti hibrid vektorokkal transzformált gazdaszervezetekkel és ezek előállítási eljárásaival. Az ilyen transzformánsok lehetnek például baktériumok, mint például E. coli, vagy fonalas gombák, mint Aspergillus, Penicillium vagy Cephalosporium, és főleg A. nidulans, A. oryzae, A. carbonarius vagy előnyösen A. niger, például A. niger An8. A jelen találmány foglalkozik az ilyen transzformánsok előállítási módszerével is, a módszer abból áll, hogy egy gazdaszervezetet transzformáló körülmények között valamely találmány szerinti rekombináns molekulával, elsősorban hibrid vektorral kezelünk, kívánt esetben egy szelekciós marker génnel együtt, és a transzformánsokat kiválasztjuk.
A találmány foglalkozik a rekombináns DNS-ek vagy származékaik alkalmazásával is olyan hibrid vektorok előállításához, amelyek hasznos polipeptideket, például PLI-t, deszulfatohirudint és hasonlókat termelnek.
A találmány foglalkozik továbbá polipeptidek előállítási eljárásával, amelyet az jellemez, hogy a találmány szerinti hibrid vektort megfelelő gazdaszervezetben kifejezzük és a polipeptidet hagyományos módszerekkel izoláljuk. Ez a módszer magában foglalja PLI túltermelését is Aspergillus fajokban, PLI kifejezésére és kiválasztására alkalmas kifejező hibrid vektorral transzformáit Aspergillus gazdaszervezet tenyésztésével és a PLI kigyűjtésével a tápközegből.
Az alábbiakban röviden ismertetjük az ábrákat.
Az 1. ábra az A. niger N756 törzs Sau3AI fragmentumát tartalmazó pCG3Bl 1 plazmid restrikciós térképét mutatja be.
A 2. ábra az 1. képletű DNS N-terminális EcoRI fragmentumát tartalmazó pPL29-5 plazmid restrikciós térképét mutatja be.
A 3. ábra az 1. képletű DNS C-terminális EcoRI fragmentumát tartalmazó pPL35-5 plazmid restrikciós térképét mutatja be.
A 4. ábra az I. képletű DNS-t mutatja be, bizonyos restrikciós helyek bejelölésével, valamint a PLI szignál és struktúr-aminosavait mutatja be. A jelöléseket a leírás bevezető részében ismertettük.
Az 5. ábra a pUBE5 megalkotását mutatja be N13mp8PL(SalI-EcoRI)BssHII/BE5-ből és pUN121-ből. A pUBE5 tartalmazza a PLI promotor egy részét, a szignál szekvenciát BssHII restrikciós hellyel és a PLI struktúrgén egy részét.
A 6. ábra a deszulfatohirudin gént tartalmazó pML310L megalkotását mutatja be.
HU 214 005 Β
A 7. ábra a PLI promotor egy részét, a BssHII restrikciós hellyel rendelkező szignál szekvenciát, a BssHII-Hgal kapcsolót és a deszulfatohirudin gént tartalmazó pLHK3 megalkotását mutatja be. 5 bán), közvetlenül felhasználás előtt készítve LB tápközeg 1% Bacto-tripton (Difco), 0,5% Bactoélesztőkivonat (Difco), 170 mmol/1 NaCl, pH 7,5-re beállítva NaOH-val
A 8. ábra a PLI promotort, a BssHII restrikciós hellyel ligáló puffer 20 mmol/1 trisz-HCl, 10 mmol/1
ellátott szignál szekvenciát, és a deszulfato- MgCl2, 10 mmol/1 ditiotreitol,
hirudin gént tartalmazó pLHL5 megalkotá- 0,6 mmol/1 ATP (pH 7,6)
sát mutatja be. TBE puffer 1 liter tartalmaz 10,8 g íriszt, 5,5 g bór-
A 9. ábra a PLI promotort, a BssHII restrikciós hellyel 10 savat és 4 ml 0,5 mol/l-es EDTA-t (pH
ellátott szignál szekvenciát, a deszulfatohi- 8,0)
rudin gént és a PLI terminátort tartalmazó TE puffer 10 mmol/1 trisz-HCl (pH 7,5),
pLHT7 megalkotását mutatja be. 1 mmol/1 EDTA kis koncentrációjú
Az alábbi példák szolgálnak arra a célra, hogy be- TE puffer 10 mmol/1 trisz-HCl (pH 7,5),
mutassák a jelen találmányt, céljuk azonban semmikép- 15 0,1 mmol/1 EDTA
pen sem az, hogy az oltalmi kört korlátozzák. fedőagar literenként 10 g Bacto-tripton, 8 g
A rövidítések jelentése az alábbi: NaCl, 8 g agar
bp bázispár 2 x TY tápközeg literenként lóg Bacto-tripton, 10 g
BSA szarvasmarha szérum, albumin élesztő kivonat, 5 g NaCl
cpm beütés/perc (radioaktív bomlás) 20 X-GAL 2% (5-bróm-4-klór-3-indanil-P-
dATP 2’-dezoxi-adenozín-trifoszfát galaktozid dimetil-formamidban, köz-
dCTP 2 ’ -dezoxi-citidin-trifoszfát vetlenül felhasználás előtt készítve
dGTP 2’-dezoxi-guanozin-trifoszfát SOC tápközeg 2% Bacto-tripton (Gibco), 0,5%
dTTP 2 ’-dezoxi-timidin-trifoszfát élesztőkivonat (Gibco), 10 mmol/1
dNTP a dATP, dCTP, dGTP és dTTP keveréke 25 NaCl, 2,5 mmol/1 KC1,
CIAP borjúbél-eredetű alkálikus foszfatáz 10 mmol/1 MgCl2, 5 mmol/1 MgSO4,
DNS dezoxi-ribonukleinsav 20 mmol/1 glükóz
DTT 1,4-ditiotreitol kináz puffer 50 mmol/1 trisz-HCl, 10 mmol/1
EDTA etilén-diamin-tetraecetsav dinátriumsó MgCl2, 5 mmol/1 DTT (pH 7,5)
hr óra 30 X-GAL lemezek 0,002% C-GAL, 0,07 mmol/1 IPTG
IPTG izopropil-p-D-tio-galaktopiranozid NET 0,15 mol/1 NaCl, 0,015 mol/1 trisz-HCl
kb kilobázis (pH 7,5), 1 mmol/1 EDTA
min perc minimál tápközeg
PL pektinliáz I E. coli-hoz 0,6% Na2HPO4, 0,1% NH4C1, 0,05%
PTH fenil-tio-hidontoin 35 NaCl, 1 mmol/1 MgSO4,0,01 mmol/1
RF-DNS kettős szálú, replikativ formájú DNS CaCl2, 1 mmol/1 tiamin-HCl, 0,2% glü-
RNS ribonukleinsav kóz
ford/perc fordulat/perc minimál tápközeg
SDS nátrium-dodecil-szulfát A. nigerhez 1 liter tartalmaz 6 g NaNO3-at, 0,52 g
SS egyszálú 40 KCl-t, 0,52 g MgSO4x7H2O-t, 1,52 g
trisz trisz(hidroxi-metil)-amino-metán KH2PO4-et, Zn és Fe nyomnyi mennyi-
tRNS transzfer RNS ségeit, 10 g glükózt, az oldat pH 6,5-re
E egység van beállítva NaOH-val
pg mikrogramm komplett tápközeg
térf. térfogat 45 A. nigerhez Mycofil-Agar (BBL)
X-GAL 5-bróm-4-klór-3-indanil-P-galaktozid PCT 25% polietilénglikol 6000 (Merck,
Darmstadt) 10 mmol/1 trisz-HCl-ben
Pufferek, tápközegek, reagensek (pH 7,5), 50 mmol/1 CaCl2
ss-Denhardt 0,02% Ficoll(Sigma), 0,02% spóráztató tápközeg
polivinilpirrolidon (Sigma), 0,02% 50 10 g/1 fiton pcpton, 10 g/1 glükóz,
BSA (Sigma), 100 pg/ml denaturált la- 10 g/1 agar
zac sperma DNS (Sigma) SSC 0,15 mol/1 NaCl 0,015 mol/1 nátrium-
EcoRI-puffer 0,01 mol/1 trisz-HCl(pH 7,5), citrát
0,1 mol/1 NaCl, 0,01 mol/1 MgCl2, A lemezeket az összes tápközegnél 1,5% Bacto-agar
1 mmol/1 2-merkapto-etanol 55 (Difco) hozzáadásával szilárdítjuk.
Hgal-puffer 50 mmol/1 NaCl, 10 mmol/1 MgCl2,
1 mmol/1 DTT, 100 pg/ml BSA, Az alábbi törzseket alkalmazzuk
6 mmol/1 trisz-HCl (pH 7,4) E. coli HB101 törzs: F~, hsdS20 (η; m-B), rec A13, ara
IPTG 100 mmol/1 izopropil-P-D-tio- 14, proA2, lacYl, galK2, rpsL20(strR), xyl-5,
galaktopiranozid (23,8 mg/ml, H2O- 60 mtl-1, supE44, X[Maniatis T., Fritsch E.F.,
HU 214 005 Β
Sambrook J.: Molecular cloning, a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1982)].
E. coli BJ5183 törzs: F~, endA, sbrB*, recBC-, galK, met, strR, thi-1, bioT, hasdR(rk,M(), XfHanahan D.:
J. Mól. Bioi. 166, 557-580. (1983)].
E. coliJMIOl törzs: supE, thi, A(lac-proAB), (F’, traD36, proAB, lacl9ZAM15) Yanis h-Perron C., Vieira J., Messing J.: közzétéve a Gene című folyóiratban).
Aspergillus niger N756 törzs: Az aspergillus niger N756 törzset választottuk ki a pektinolitikus enzimkomplex nagy termelési szintje miatt.
Az alábbi vektorokat alkalmazzuk:
M13mp.fág
Az M13mp8, 9, 18, 19 vektorok [Norrander J. és munkatársai: Gene, 26, 101-106 (1983)] az M13 egyszálú bakteriofág DNS-származékai, és ezeket arra szánták, hogy megkönnyítsék a DNS-szekvenciaképzést, lehetővé téve DNS-fragmentumok klónozását egy sokcélú polilinker helynél és az azonos restrikciós fragmentum klónozását mindkét lehetséges orientációban. Ezekbe a vektorokba klónozott szekvenciákat könnyen lehet templátként alkalmazni szekvenciaképző reakciókhoz, vagy egyszálú vizsgálóminták előállításához, standard oligodezoxi-ribonukleotid prímért és az E. coli DNS polimeráz I Klenow-fragmentumát alkalmazva. A vektor-DNS hordozza az E. coli lac-operon promotort és a β-galaktozidáz első 145 aminosavának genetikai információját. A sokcélú restrikciós helyeket tartalmazó polilinker szekvenciákat a lacZ szekvenciába iktatjuk be. A polilinker megőrzi a lacZ leolvasó keretet és a vektor egy lacZa gazdasejt alléi komplementációját adja, kék tarfoltokat termelve IPTG-t és X-gal-t tartalmazó lemezeken. Az olyan beiktatásokat tartalmazó rekombináns fágok, amely beiktatások elroncsolják a leolvasó keretet vagy más módon befolyásolják a lacZa kifejeződését, színtelen tarfoltként ismerhetők fel.
pUC18 plazmid
A pUC18 plazmidot [Norrander J. és munkatársai: Gene 26, 101-106 (1983)] lehet alkalmazni DNS-szekvenciák klónozására lacZa területben, így teremtve meg a rekombináns plazmidokat tartalmazó transzformánsok kimutatási lehetőségét lac fenotípusuk alapján. A beiktatásokat nem tartalmazó baktériumok kék telepeket képeznek indikátor lemezeken (X-gal-t tartalmazó lemezek), míg azok, amelyek rekombináns plazmidokat tartalmaznak, fehér telepeket képeznek. A pUC 18 plazmid egyedi klónozóhelyeket tartalmaz a lacZa területben, amelyek illeszkednek az M13mpl8 fág klónozó helyeihez. A plazmid ampR gént hordoz.
pML 310 plazmid
A pML 310-et a 0168342 számú európai szabadalmi bejelentés írja le. A pML310 ampR-rel, trp-promotorral és deszulfatohirudin kódológénnel jellemezhető, a deszulfatohirudin olyan trombin inhibitor, amely a természetben piócákban fordul elő.
pUN121 plazmid
A pUN121 plazmidot [Nilsson B., Uhlen M., Josephson S., Gatenbech S. és Philipson L.: Nucleic
Acids Research 77, 8019-8030. (1983)] lehet klónozó vektorként alkalmazni, ez lehetővé teszi DNS beiktatásokkal ellátott plazmidokat magában foglaló transzformánsok pozitív szelekcióját. A plazmid tartalmazza a lambda bakteriofág cl génjét, és a tét gént. A pUN121et magában foglaló baktériumok érzékenyek tetraciklinre, mivel a tét gén a lambda bakteriofág jobb promotorjától íródik át, és ezt a promotort a cl-vel kódolt represszor represszálja. DNS-fragmentumok beiktatása a cl génben levő helyek egyikére inaktiválja a represszor gént, tetraciklin-rezisztens transzformánsokat alakítva ki. Ezen kívül a pUN121 plazmidnak van egy funkcionális amp génje is úgy, hogy a plazmid-DNS sokszorozását szelektív körülmények között lehet végrehajtani.
pBR322 plazmid
A pBR322 plazmid ampicillin (ampR) és tetraciklin (tetR) antibiotikumokra való rezisztenciát hordoz. A plazmid számos egyedi klónozóhelyet hordoz, amelyek közül néhány vagy az amp, vagy a tét génen belül helyezkedik el úgy, hogy a klónozott DNS beiktatása antibiotikum-érzékeny baktériumokhoz vezet. pDJB2 lazmid
Ezt a plazmidot az alábbi irodalmi helyen íqák le: Ballance D.J. és Tumer G. Gene, 36, 321-331 (1985).
7. példa
Pektinliáz I izolálása és jellemzése
1.1. példa
A pektinliáz 1 N-terminális részének aminosav-szekvencia meghatározása A pektinliáz I-et Ultrazym-ből (A. niger-ből kapott pektinolitikus enzimkeverék, a Novo Industries, Koppenhága, terméke) tisztítjuk a Houdenhovan F. A. E. által leírt módszer analógiájára [Doktori disszertáció, Agricultural University, Wageningen, megjelent a „Communications Agricultural University Wageningen” című kiadványban, 75-13. oldal (1975), Hollandia]. 2 mg pektinliáz I-et dializálunk több liter desztillált vízzel szemben, majd ezt követően liofilezzük. A fehéijét feloldjuk 1,5 ml 100 mmol/1 NaHCO3-ban (pH 10,0) és szobahőmérsékleten tartjuk 3 órán át. Ez a kezelés kiküszöböli a lépések számának növelését, amely a megbízható szekvencia-elemzéshez szükséges az automatikus Edman-lebontási módszenei [Edrnan P. és Begg G.: Eur. J. Biochem. /, 80-91. (1967)]. Alkálikus kezelés után a fehéijét dializáljuk 1 liter desztillált vízzel, majd 1%-os hangyasav oldattal, majd megint desztillált vízzel szemben. Az automatikus Edinán lebontást Beckman forgóserleges szekvenciaelemzőben (890 C Modell) hajtjuk végre. Az ép, redukált és karboxilezett fehérjét egy kvadrol egyhasításos programot alkalmazva bontjuk el (082773 számú Beckman program), vagy Hunkapiller és Hood programját alkalmazva. Hogy a peptid kimosását megakadályozzuk, 2,5 nig tőkehal parvalbumint alkalmazunk hordozóként [Eur J. Biochem. 113, 157 (1980)].
Az aminosavak fenil-tio-hidantoin származékait nagy teljesítményű folyadékkromatográfiával (HPLC) azonosítjuk Frank és Strubert eljárása szerint [Frank G. és Strubert W.: Chromatographia 6, 522 (1973)]. A kö10
HU 214 005 Β vetkező N-terminális aminosavszekvenciát határozzuk meg a pektinliáz I-nél:
V_G-V-X4-G-T-P-E-G-F-A
Az X4 aminosav valószínűleg szerin, de ennek jelenlétét teljes bizonyossággal még nem állapítottuk meg.
1.2. példa
A pektinliáz I cianogén-bromidfragmentumainak előállítása
A pektinliáz I redukcióját és S-karboxi-metilezését Crestfíeld szerint végezzük [Crestfield A.M., Moore S. és Stein W.H.: J. Bioi. Chem. 238, 622 (1963)]. 3 g karbamidot (különlegesen tiszta) feloldunk 5 ml desztillált vízben és kevertetjük 0,5 g kevertágyas ioncserélőn (Bio-Rad Ag 50 1-X8) 1 órán át. Az ioncserélő gyöngyök eltávolítása után 10 mg EDTA-t és 200 mg triszt adunk a karbamidos oldat 4 ml-éhez és a pH-t 8,5-re állítjuk be HCl-lel. Az oldatot 5 ml végső térfogatra töltjük fel desztillált vízzel egy kémcsőben. Ezután 5-20 mg, Houdenhoven F. E. A. fentebb leírt módszere szerint tisztított pektinliáz I-et adunk hozzá és a kémcsövet nitrogén alatt tartjuk.
Végül 33 μΐ β-merkapto-etanolt adunk hozzá és a redukciót folytatjuk 4 órán át szobahőmérsékleten nitrogén alatt. 0,33 ml frissen készített oldatot (0,268 g jódecetsav 1 ml 1 n NaOH-ban) adunk nitrogén atmoszférában a reakciókeverékbe, és a keveréket sötétben tartjuk 15 percen át szobahőmérsékleten.
A reakciót β-merkapto-etanol hozzáadásával állítjuk le. Ezt követően a karboxi-metilezett fehérjét Sephadex G-25 gélszűrő oszlopra terheljük (100 ml agytérfogat), amelyet azután alumínium fóliába beburkolunk, és eluáljuk 0,5%-os hangyasavval. A fehérjefrakciókat összegyűjtjük és liofilezzük.
A karboxi-metilezett pektinliáz I-et (2-10 mg) feloldjuk 70%-os hangyasavban és szilárd cianogén bromidot adunk hozzá mintegy 100-szoros feleslegben metioninra számítva, amelyből 1 gyök fordul elő 1 pektinliáz I-ben. A reakciókeveréket folyamatosan kevertetjük 24 órán át szobahőmérsékleten zárt reakció ampullában. 5 ml-nyi mintákat veszünk szabályos időközönként és elemezzük 15%-os SDS-PAGE-on, hogy ellenőrizzük a fehérje hasadásának mértékét. 24 óra múlva vizet adunk hozzá és a készítményt részlegesen bepároljuk nitrogén átfuvatás segítségével. Ezt a lépést megismételjük, hogy a hangyasavat eltávolítsuk.
Az SDS-PAGE-elemzés - bizonyos maradék pektinliáz I-en kívül - a cianogén-bromid hasítás eredményeképp két peptidet, a CBI-et és CBII-t azonosítja
16,5 kD és 30 kD látszólagos molekulatömeggel. Ezeknek a fragmentumoknak a tisztítását gél-permeációs kromatográfiával hajtjuk végre, 20 mmol/1 nátriumfoszfát puffért (pH 6,0), 100 mmol/1 NaCl-t, 4 mol/1 karbamidot és 1% (térf./térf.) β-merkapto-etanolt tartalmazó oldattal kiegyensúlyozott Sephacryl-S200 oszlopot (190 cm hosszúság, 1 cm átmérő) alkalmazva. A CBII fragmentum két csíkban jelenik meg, az egyik csík eluálódik még a maradék érintetlen fehérje előtt, ez tehát aggregátumot kell, hogy képviseljen, míg egy másik csúcs az érintetlen fehérje és a kis CBI fragmentum között eluálódik.
1.3. példa
A pektinliáz I CBlI-je N-terminális részének aminosavszekvencia meghatározása
200 pg, 1.2. példa szerinti, tisztított, nem aggregált
CBII fragmentumot alkalmazunk aztomatikus Edman lebontásokhoz (Edman P., korábban idézett munka) Beckman forgóserleges szekvenciaelemzőt alkalmazva. A PTH aminosavakká való átalakulás a frakciók bepárlása és 200 μΐ 2 n metanolos HCl-nek a maradékhoz hozzáadása után 15 perc alatt 65 °C hőmérsékleten megy végbe. Az oldatot ezután ismét bepároljuk és a maradékot 50 μΐ THF/CH3CN(l:l)-ben felvesszük. A PTH-aminosavakat HPLC-vel azonosítjuk, Zorbax CNR oszlopot (Du Pont) alkalmazva Knecht és munkatársai módszere szerint [Anal. Biochem. 130, 65 (1983)].
A CBII N-terminális aminosavszekvenciája a következő:
V-S-G-V-S-N-I-I-I-Q-N-I-A-V-X, j-D-I-NX19-E.
Az X]5 és X19 olyan aminosavgyökök, amelyeket eddig még nem azonosítottunk.
2. példa
Aspergillus niger genomkönyvtárának megalkotása
2.1. példa
Nagy molekulatömegű DNS izolálása Aspergillus nigerből
A nagy molekulatömegű A. niger DNS-izolálását Yelton és munkatársai szerint végezzük [Yelton M.M., Hamer J.E., Timberlake W.E.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 1470-1474. (1984)]. A. niger N756 törzs konidiospóráit inokuláljuk 200 ml minimál tápközegben, amely 0,1% arginint is tartalmaz, és egy horonnyal ellátott 500 ml-es lombikokban rázatjuk 28 °C hőmérsékleten 2-3 napon át. A micéliumot szűréssel kinyerjük, steril, hideg vízzel mossuk, fagyasztjuk, és folyékony nitrogénben porítjuk. A sejteket gyorsan szuszpendáljuk 20 ml, 50 mmol/1 EDTA-t, 0,2% SDS-t és 20 μΐ dietil-pirokarbonátot tartalmazó oldatban, és lizáljuk élénk keverés mellett 1 percen át, szobahőmérsékleten. A lizátumot 68 °C hőmérsékleten 15 percen át kevertetjük, lehűtjük szobahőmérsékletre, és 15 percen át centrifugáljuk 12000 g-nél szobahőmérsékleten. 16 ml felülúszót átviszünk új csőbe, és 1 ml 8 mol/l-es kálium-acetát oldat (pH 4,2) hozzáadása után jégen tartjuk 1 órán át. A csapadékot 25000 g-nél centrifugáljuk 15 percen át 4 °C hőmérsékleten. 12 ml felülúszót kinyerünk és a nukleinsavakat 12 ml izopropanollal kicsapjuk. A csapadékot centrifugálással üledékbe visszük, 1,5 percig 12000 g-vel végezve a centrifügálást, és az üledéket újra szuszpendáljuk 2 ml TE-ben, amely 10 pg/ml RN-áz A-t is (Boehringer, Mannheim) tartalmaz. A DNS fragmentumokat kloroform/fenollal extraháljuk és etanollal kicsapjuk, amint ez maniatis és
HU 214 005 Β munkatársai leírták (fentebb idézett munka, 458-459. és 461—462. oldalak).
2.2. példa
Nagy molekulatömegü DNS-fragmentumok klónozása pUN 12-be
A 2.1 példa szerinti nagy molekulatömegű DNS-t (100 pg) centrifugálással kicsapjuk, és az üledéket újra szuszpendáljuk 750 μΐ pufferban, amely 6 mmol/1 triszHCl-t, 50 mmol/1 NaCl-t, 6 mmol/1 MgCl2-t tartalmaz (pH 7,5). Részleges emésztést végzünk Sau3AI-gyel, amelynek koncentrációja 0,02-0,01 E/g között van, 60 percen át 37 °C hőmérsékleten. A reakciót EDTA hozzáadásával fejezzük be 20 mmol/1 végső koncentrációra.
A részlegesen emésztett DNS-fragmentumokat 0,45%-os agaróz gélen különítjük el. HindlII-mal emésztett lambda DNS-t alkalmazunk markerként, hogy meghatározzuk a részlegesen emésztett DNS fragmentumok méretét. A kívánt, 15 kb-20 kb tartományban levő fragmentumokat tartalmazó gél-területet kihasítjuk, és átvisszük ISCO elektroforetikus koncentrátor (ISCO GmbH) mintaüregeibe, fedjük 0,1 TBE-vel és elektro-eluáljuk 1 watt-nál 90 percen át. A DNS-fragmentumokat kloroform/fenollal extraháljuk, és etanollal kicsapjuk.
pg részlegesen emésztett DNS-fragmentum-keveréket újra szuszpendálunk H2O-ban, és 15 órán át ligálunk 15 °C hőmérsékleten 1 pg, BclI-gyel linearizált pUN121 plazmid DNS-hez [Nilsson B., Uhlen M., Josephson S., Gatenbech S. és Philipson L.: Nucleic Acids Research, II, 8019-8030 (1983)] a ligálást 106 pl ligáló puffer teljes térfogatban végezve 6 egység T4 DNS ligázzal (Boehringer, Mannheim). Ennek az összeforrasztó keveréknek 10 λ-ét hozzáadjuk kompetens E. coli BJ5183 sejtek 210 μΐ-éhez amely sejteket a transzformáláshoz a Hanahan korábban idézett közleményében leírt módon készítjük elő. A sejteket jégen tartjuk 30 percen át, majd 90 másodperc alatt 42 °C hőmérsékletre melegítjük, újból jégre helyezzük 2 percre, 800 pl SOC tápközeget adunk hozzá, és a sejteket 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk 1 órán át. A sejteket 1 cm-es agarlemezre szélesztjük, amely lemez 8 mg/1 tetraciklinnel (SIGMA) kiegészített LB tápközeget tartalmaz. A lemezeket 37 °C hőmérsékleten 16 órán át inkubáljuk. Mintegy 600 transzformált telepet kapunk, amelyek tetraciklin rezisztenciájukkal jellemezhetők. A hatékonyság mintegy 1200020000 tetraciklin-rezisztens telep 1 γτη pUN121 DNSre számítva.
véletlenszerűen kiválasztott rekombináns klón plazmidelemzése átlagosan 10 kb-s beiktatást jelez. Hogy az A. niger genom (4,5x107 bp) képviseletét a könyvtárban csaknem négyszeresre növeljük, 15360 tetraciklin rezisztens telepet szúrunk fel, és egyenként növesztjük ezeket egy éjszakán át mikrotitráló lemezek üregeiben, 8 mg/i tetraciklinnel kiegészített LB-tápközegben. Az inkubálás után glicerint adunk hozzá 50% térf.-ig, és a mikrotitráló lemezeket -70 °C hőmérsékleten tároljuk.
3. példa
Az A. niger genom-könyvtárának átvizsgálása
PLl-gyel összefüggő nukleinsavakra
3.1. példa
A könyvtár szűrő replikáinak előállítása
A pektinliáz I gén izolálásához a 2.2 példában leírt módon kapott DNS-könyvtárból, a kiválasztott 15360 E. coli BJ5183 sejtből szűrő replikákat készítünk Gergen és munkatársai által leírt módszert követve [Gergen J.P., Stem R.H., Wensink P.C.: Nucleic Acids Research 7, 2115-2136. (1979)]. A sejteket a mikrotitráló lemezekről 8 mg/1 tetraciklinnel kiegészített agar-lemezekre visszük át, és egy éjszakán át 37 °C hőmérsékleten növesztjük. Kényelmesen elvégezve Whatman 541 szűrőpapírokat (114><175 mm/192 klón) helyezünk a telepek tetejére. 2 óra múlva 37 °C hőmérsékleten a szűrőket 250 mg/ml klóramfenikolt (Sigma, St. Louis, USA) tartalmazó LB lemezekre visszük át, és egy éjszakán át inkubáljuk 37 °C hőmérsékleten. A szűrőket kétszer mossuk 0,5 mol/1 NaOH-val, kétszer 0,5 mol/1 trisz-HCl-lel (pH 7,4), kétszer mossuk SSC-ben, majd levegőn szárítjuk. A szürőreplikákat alkalmazhatjuk számos hibridizációs kísérlethez, amelyek mindegyikét megelőzik a fentebb említett mosási lépések.
3.2. példa
Oligonukleotid keverékek szintézise
A 2.2 példában leírt módon kapott A. niger DNSkönyvtár átvizsgálásához olyan oligonukleotidokat szintetizálunk, amelyek megfelelnek az 1.1 és 1.3 példákban meghatározott aminosav szekvenciának, a szintézist foszforamidit módszerrel végezve [Caruther M.H.: Chemical and Enzymatic Synthesis of Gene Fragments: A a laboratory manual., Verlag Chemie (1982)], Applied Biosystem oligonukleotid szintetizáló berendezéssel (380 B modell).
3.2.1. példa
Aspergillus niger pektinliáz I N-terminális részét kódoló oligonukleotid szintézise A pektinliáz I N-terminálisát kódoló elogonukleotidokat szintetizáljuk az 1.1. példában meghatározott aminosav-összetételt tekintetbe véve. A genetikai degeneráció miatt 256 oligonukleotid szükséges, hogy minden lehetőség benne foglaltassék.
Oligonukleotidok két külön keverékét szintetizáljuk kémiai úton, mivel technikai okokból szükség van a nukleotidok számának csökkentésére a keverékben. Mindkét keverék 128 különböző oligonukleotidot tartalmaz, amelyek mindegyike a T6-P-E-G-F-Ah aminosav-szekvenciát kódoló szálak komplementer szála. A következőkben ezeket 2014 cs 2015 keveréknek nevezzük, ezek az alábbi oligonukleotidokból tevődnek össze:
2014. keverék 3’TGRb GGR, CTR, CCR3 AAR3 CG5’
2015. keverék 3’TGR, GGR, CTR, CCR2 AAR3 CG5’, ahol R| jelentése A, C, G, vagy T, R2 jelentése C vagy T és R3 jelentése A vagy G.
HU 214 005 Β
3.2.2. példa
A CNBr-rel elbontott pektinliáz Ifehérje
C-terminális fragmentumainak N-terminális részét kódoló oligonukleotid szintézise A CNBr-rel elbontott pektinliáz I fehérje C-terminális fragmentumának N-terminális részét kódoló oligonukleotidot az 1.3. példában meghatározott aminosavösszetételre tekintettel szintetizáljuk. vl08 oligonukleotid keverékét szintetizáljuk, amelyek az N|J4-I-1-1-Ql38 aminosavszekvenciát kódoló szálak komplementer szálai, és az alábbi oligonukleotidokból tevődnek össze:
2060. keverék: 5’AAR, ATR2 ATR2 ATR2 CAR3 A 3’, ahol R| jelentése C vagy T, R2 jelentése A vagy C, és R3 jelentése A vagy G.
3.2.3. példa
Az oligonukleotid-keverékek 32P-jelzése
A 3.2.1 és 3.2.2 példák 2014. 2015. és 2060. oligonukleotid keverékeiből egyenként 67 pikomolt jelzünk, 50 pmol [γ32Ρ] ATP-t (Amersham, Buckinghamshire, Anglia, 5000 Ci/mmol) alkalmazva. Az inkubálást 37 °C hőmérsékleten hajtjuk végre 150 egység T4 polinukleotid kinázzal (New England Nuclear) 500 μΐ kináz pufferban. A radioaktívan jelzett ATPlligálási reakcióját az oligonukleotidokhoz a reakciókeverék egy-egy alikvotjának futtatásával mutatjuk ki 20% poliakrilamid gélen, amelyet autoradiográfia követ.
3.3. példa
A génkönyvtár átvizsgálása a radioaktívan jelzett
2014. és 2015. oligonukleotid keverékekhez
A génkönyvtár átvizsgálását a 3.2.1. példa radioaktívan jelzett 2014. és 2015. oligonukleotid keverékeivel hajtjuk végre. A gén-könyvtár (3.1. példa) 20 szűrőreplikából álló tételeit megnedvesítjük 6*NET-ben és előhibridizáljuk 200 ml 6*NET-et, lxss-Denhardt-ot, 0,1% SDS-t tartalmazó oldatban 49,3 °C hőmérsékleten 4 órán át. Ezután 67 pmol radioaktívan jelzett 2014. oligonukleotid keveréket adunk hozzá és a hibridizálást 49,3 °C hőmérsékleten hajtjuk végre egy éjszakán át. Ugyanezt az eljárást hajtjuk végre radioaktívan jelzett
2015. oligonukleotid keveréket alkalmazva. A szűrőket kétszer mossuk 5 percig 2><SSC-t és 0,1% SDS-t tartalmazó oldattal szobahőmérsékleten, kétszer egy órán át 2xSSC-t és 0,1% SDS-t tartalmazó oldattal 49,3 °C hőmérsékleten, és egyszer két órán át 0,2*SSC-t és 0,5% SDS-t tartalmazó oldattal 49,3 °C hőmérsékleten. A szűrőket levegőn szárítjuk és autoradiográfiának vetjük alá 3 napon át, KODAK X-omat S0282 filmet alkalmazva.
A 2014. oligonukleotid keverékkel 33 kiónt, a 2015. oligonukleotid keverékkel 39 kiónt találunk, amelyek meglehetősen erős hibridizációs választ adnak. Hogy al-könyvtárat hozzunk létre, a 72 kiónt új mikrotitráló lemezen növesztjük ki, és átvisszük Whatman 541 szűrőre, amint ezt a 3.1 példában leírtuk, az alkönyvtár két szűrőreplikáját hibridizáljuk mindkét vizsgáló mintával egyenként, mossuk, és autoradiográfiának vetjük alá. A 2014. oligonukleotid keverékkel csak azok a kiónok hibridizálnak, amelyeket a 2014. oligonukleotid keverékkel végzett hibridizálással kaptunk. Hasonlóképpen, a 2015. oligonukleotid keverékkel csak azok a kiónok hibridizálnak, amelyeket a 2015. oligonukleotid keverékkel végzett hibridizálással kaptunk.
3.4. példa
Az alkönyvtár átvizsgálása a 2060. oligonukleotid keverékkel
A 3.3 példában kapott alkönyvtár szűrő replikáit (72 klón) megnedvesítjük 6*NET-ben, és 4 órán át előhibridizáljuk 15 ml 6*NET-et, l*ss-Denhardt-ot és 0,1% SDS-t tartalmazó oldatban, 32 °C hőmérsékleten. 8 pmol, a 3.2.3 példában leírt, radioaktívan jelzett 2060. oligonukleotid keveréket adunk hozzá és a hibridizálást egy éjszakán át 32 °C hőmérsékleten hajtjuk végre. A szűrőket kétszer mossuk 5-5 percen át 2*SSC-t és 0,1% SDS-t tartalmazó oldatban szobahőmérsékleten, kétszer 1-1 órán át 2x SS C-t és 0,1% SDS-t tartalmazó oldatban 32 °C hőmérsékleten, és egyszer két órán át 0,2><SSC-t és 0,5% SDS-t tartalmazó oldatban 32 °C hőmérsékleten. A szűrőket levegőn szárítjuk, és 3 napon át autoradiográfiának vetjük alá, KODAK X-omat S0282 filmen. 3 pozitív kiónt találunk, mindegyik abba a csoportba tartozik, amely a 2014. vizsgáló mintával hibridizál, amint ezt a 9. példában leírjuk; egy kiónt E. coli BJ5183/pCG3Bl 1-nek nevezünk (vagy röviden 3B 11-nek).
4. példa pCG3Bll plazmid izolálása és restrikciós elemzése
Nagy mennyiségű plazmidkészítmény [Humphreys G. O., Willshaw G.A., Anderson E. S.: Biochemica et Biophysica Acta, 383, 457-463. (1975)] készítünk a
3.4. példában leírt módon kapott 3B11 kiónból. A megfelelő plazmidot, amelyet pCG3B 11-nek nevezünk, HindlII-mal, EcoRI-gyel és Pstl-gyel (mindhárom Boehringer, Mannhiem) végzett teljes restrikciós emésztéssel és 1 % agaróz gélen végzett elektroforetikus elkülönítéssel elemezzük (1. ábra).
5. példa
A pektinliáz Igén N-terminális és C-terminális frakcióit tartalmazó pCG3BI I EcoRI fragmentumainak szubklónozása
5.1. példa pCG3Bl 1 Sau3AI fragmentumainak izolálása, és ligálás Ml 3 DNS-be μg pCG3Bll plazmidot (4. példa) teljességig emésztünk 18 egység Sau3AI restrikciós endonukleázzal (Boehringer, Mannheim) 20 μΐ, 10 mmol/1 trisz-HClt, 75 mmol/1 NaCl-t és 10 mmol/1 MgCl2-t tartalmazó oldatban (pH 7,2), 1 órán át 37 °C hőmérsékleten. A reakciót EDTA hozzáadásával állítjuk le 20 mmol/1 végső koncentrációig. A DNS-fragmentumokat fenol/kloroformmal extraháljuk, etanollal kicsapjuk, és újra oldjuk 20 μΐ TE pufferban 100 ng Sau3AI-gyel emésztett DNS-t ligálunk 20 ng, BamHI-emésztéssel (Boehringer Mannheim) linearizált M13mp8 fág DNS-be [Messing
HU 214 005 Β
J.: Methods in Enzymology, 101, 21-78. (1983)]. A ligálást 4 órán át 15 °C hőmérsékleten végezzük 1 egység T4 DNS ligázzal (Boehringer Mannheim) 10 μΐ ligáló puffer teljes térfogatban. Kompetens E. coli JM101 sejteket készítünk 50 mmol/1 CaCl2-ben, az Amersham kézikönyvvel összhangban [Ml3 cloning and sequencing handbook, Amersham International plc.; Buckinghamshire, Anglia, 25. oldal]. Kompetens JM101 sejtek 0,3 ml-es alikvotjait visszük át 15 ml-es steril tenyésztőcsőbe, jégre. 5 pl ligáit fág DNS-t adunk minden egyes csőhöz. A keverékeket jégen tartjuk 40 percen át. A sejteket hő-sokknak vetjük alá 42 °C hőmérsékleten 3 percig, majd a csöveket visszahelyezzük a jégfürdőbe. Az egyes csövekhez az alábbi keverékeket állítjuk elő: 40 μΐ IPTG (100 mmol/1), 40 μΐ X-gal (2% dimetil-formamidban) és 200 μΐ E. coli JM101 sejt friss, exponenciális növésben levő tenyészetből. Ennek a tenyészetnek 270 μΐ-ét adjuk a hő-sokkolt E. coli JM101 sejteket tartalmazó csövekhez. 3 ml olvadt fed agart (42 °C hőmérsékleten tartott) adunk az egyes csövekhez, és a csöveket agarlemezekre öntjük. A lemezeket 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk egy éjszakán át, felfordított állapotban.
5.2. példa
Rekombináns fágok átvizsgálása a 2060. oligonukleotid-vizsgáló mintával A rekombináns fág DNS-sel transzformált E. coli
JM101 fehér tarfoltokat mutat az 1. példa szerinti Xgalt tartalmazó agarlemezeken, ezek közül 384-et felszúrunk egy egyenként növesztünk 37 °C hőmérsékleten 1,5 ml 2*TY tápközegben, amelyet 15 μΐ exponenciális fázisban növekvő E. coli JM101 sejttel inokulálunk. Hat óra múlva a 384 tenyészetet centrifugáljuk 5 percen át Eppendorf centrifugában, és a fág felülúszókat 4 °C hőmérsékleten tároljuk. A 384 felülúszó mindegyikéből 100 μΐ-t viszünk át négy Gene Sreen membránra (New England Nuclear), BioDot készüléket alkalmazva 96 réssel (Bio Rád). A membránokat 5 percig áztatjuk 0,5 mol/1 NaOH-t, 1,5 mol/1 NaClt tartalmazó oldatban, majd 5 percig 3 mol/1 NaCl-t és 1 mol/1 trisz-HCl-t tartalmazó oldatban (pH 5,6), levegőn szárítjuk, és vákuumban sütjük 80 °C hőmérsékleten 2 órán át. A négy membránt végül előhibridizáljuk, a 8. példában leírt módon radioaktívan jelzett 2060. oligonukleotid keverékkel hibridizáljuk, mossuk, majd autoradiográfiának vetjük alá, amint ezt a 3.4 példában leírtuk. Az 5.1 példa szerinti ligálási kísérletekből egy pozitív, rekombináns fágot választunk ki további elemzésre, ezt mp8-3A-nak nevezzük el.
5.3. példa
A rekombináns mp8-3A fág szekvenciaelemzése Az 5.2 példában leírt módon kapott mp8-3A fágot tartalmazó felülúszót alkalmazzuk egyszálú és replikatív formájú DNS (RF-DNS) előállítására, amint ezt a korábban idézett Amersham Kézikönyvben, a 16. oldalon leírják. Az egyszálú templátok szekvenciáját elemezzük, a korábban idézett Amersham Kézikönyvben leírt (30-35. oldal) lánc-terminátor módszert alkalmazva. A fágról bebizonyosodik, hogy az 574 bp-s
Sau3AI fragmentumot tartalmazza, mely az 584-599.
helynél a 2060. oligonukleotid vizsgáló minta megjósolt nukleotid szekvenciájával rendelkezik
5.4. példa
A pektinliáz I gén N-terminális és C-terminális
EcoRI fragmentumainak azonosítása
Az mp8-3A fág (5.3 példa) szekvencia-elemzett EcoRI restrikciós helyét alkalmazzuk két EcoRI fragmentum azonosítására és klónozására, az egyik a PLI gén C-terminális részét tartalmazza a terminátor területtel együtt, a másik a gén N-terminális részét tartalmazza a promotor területtel együtt. A következő két oligonukleotidot szintetizáljuk a 3.2 példában leírtak szerint:
5052. oligonukleotid:
5’TGGATGATGATGTTGGAGAC3’, az 597. helynél indul, 5’ felé a 649/650, helynél lévő központi EcoRI helytől, és az 577. helyig terjed (komplementer szál). 5066. oligonukleotid:
5’AGGTCCAGGACAACACCTAC3’, az 1020-tól indul, 3’ felé a központi EcoRI-helytől, és az 1039. helyig terjed.
Az 5052. és 5066. oligonukleotid keverékek radioaktívan jelzettek, amint ezt a 3.3 példában leírtuk.
pg pCG3Bll plazmid DNS-t teljességig emésztünk EcoRI-gyel (Boehringer Mannheim), és a fragmentumokat 1% agaróz gélen különítjük el. A DNSfragmentumokat Gene Screen-membránra (New England Nuclear) visszük át foltonként, amint ezt a szállító leírja útmutatójában (383-386. oldal), és a membránokat az 5052. és 5066. oligonukleotidok radioaktívan jelzett vizsgáló mintáival hibridizáljuk, amint ez Maniatis és munkatársai korábban idézett munkájukban a 387-389. oldalon leírják, az 5066. vizsgálóminta egy 3,5 kb-s EcoRI fragmentumot hibridizál, amely tartalmazza a PCI gén C-terminális részét és a terminátor területet. Az 5052. vizsgáló minta egy 2,9 kb-s EcoRI fragmentummal hibridizál, amely tartalmazza a gén Nterminális és promotor területét.
5.5 példa pPL29-5 éspPL35-5 megalkotása pCG3Bl l EcoRI fragmentumainak újra klónozásával pUN 121-be
A 4. példában leírt módon kapott CG3B11 plazmid
4,5 pg-ját inkubáljuk 50 egység EcoRI-gyel (Boehringer Mannheim) 5 pl, 0,01 mol/1 trisz-HCl-t (pH 7,5), 0,1 mol/1 NaCl-t, 0,01 mol/1 MgCl2-t és 1 mmol/1 merkapto-etanolt tartalmazó oldatban, 2 órán át 37 °C hőmérsékleten. A DNS-fragmentumokat 1%-os agaróz gélen szeparáljuk, a 2,9 kb-s fragmentumokat és 3,5 kbs fragmentumokat tartalmazó gélszeleteket az 5. példában leírt módon eluáljuk, és a DNS-t fenol/kloroformmal extraháljuk és etanollal kicsapjuk. A csapadékokat újra szuszpendáljuk 40 qml kis koncentrációjú TE pufferban, és ennek az oldatnak 10 μΐ-ét ligáljuk 100 ng EcoRI emésztéssel linearizált pUN121-be [Nilsson B., Uhlen M„ Josephson S., Gatenbeck S. és Philipson L.:
HU 214 005 Β
Nucleic Acids Research, 11, 8019-8030. (1983)]. A ligálást 15 °C hőmérsékleten végezzük 4 órán át 5 egység T4 DNS-ligázzal (Boehringer Mannheim)
35,5 μΐ, 20 mmol/1 trisz-HCl-t, 1 mmol/1 EDTA-t, mmol/1 ditiotreitolt, 60 mmol/1 KCl-t és 50% glicerint tartalmazó oldatban (pH 7,6).
Ennek az összeforrasztó keveréknek 17,5 μΐ-es alikvotjait adjuk külön-külön 200 μΐ kompetens E. coli HB101 sejthez, ezeket a kompetens sejteket a transzformáláshoz kalcium-kloridos kezeléssel úgy készítjük elő, amint ezt Maniatis és munkatársai korábban idézett munkájukban leírták (a 250. oldalon). A keveréket 30 percen át jégen tartjuk, ezután 42 °C hőmérsékleten melegítjük 2 percen át, majd 1 ml SOC tápközeggel hígítjuk, és 37 °C hőmérsékleten 1 órán át inkubáljuk. A sejteket centrifugálással nyerjük ki, 2000 g-nél 5 percen át centrifugálva. Az egyes üledékeket újra szuszpendáljuk 600 μΐ SOC tápközegben és három agar lemezre szélesztjük, amelyek 8 mg/1 tetraciklinnel kiegészített LB tápközeget tartalmaznak. A lemezeket 37 °C hőmérsékleten 16 órán át inkubáljuk.
Hat rekombináns tetR klón plazmidjait izoláljuk az egyes transzformációkból Bimbóim és Doly módszerével [Bimbóim H.C. és Doly J.: Nucleic Acids Rés. 7, 1513-1523 (1979)], és restrikciós elemzéssel analizáljuk. Egy kiónt választunk ki a további elemzéshez, amely tartalmazza a pCG3Bl 12,9 kb-s EcoRl fragmentumát, ezt pPL29-5-nek nevezzük (3. ábra). Egy másik kiónt is választunk ki, amely a pCG3Bll 3,5 kb-s EcoRl fragmentumát tartalmazza, ezt pPL35-5-nek nevezzük (2. ábra).
6. példa
A pektinliáz I gén szekvenciameghatározása
A PLI gén N-terminális részét tartalmazó pPL29-5 DNS-ét (5.5 példa) és a PLI gén C-terminális részét tartalmazó pPL 35-5 DNS-ét (5.5 példa) izoláljuk, amint ezt Humphreys és munkatársai leírták [Humphreys G.O., Willshaw G. A., Anderson E. S.: Biochimica et Biophysica Acta, 383, 457-463. (1975)]. A pPL29-5 és pPL35-5 plazmidok beiktatásainak részeit kapjuk meg megfelelő enzimekkel (Spol, Prul, Nool, Clal, KpnI, HindlII, Xhol, Pstl, Bgil, Nhel és EcoRl) végzett hasításokkal. A fragmentumokat M13mp8-ba szubklónozzuk és szekvenciaelemzésnek vetjük alá „M13 Cloning and Sequencing Kit” készletet alkalmazva (Ml5 Sequencing Kit N.4502, Amersham), a szállító által megadott körülmények között [Ml3 cloning and sequencing handbook, Amersham International plc., Buckinghamshire, Anglia],
A 2,7 kb-s Spel-Nhel fragmentum, amely a PLI gén teljes szekvenciáját tartalmazza, teljes szekvenciáját a
4. ábrában mutatjuk be. Ez a promotor terület 688 nukleotidját, a PLI gén struktúr-részének 1369 gyökét és a terminátor terület 660 nukleotidját tartalmazza.
A PLI szekvenciáját, amely a PLI aminosavszekvencia elemzéssel (1. példa) meghatározott N-terminális aminosavszekvenciájának felel meg, 57 nukleotid előzi meg, amely a szignál szekvenciát kódolja:
Μ,-Κ-Υ-A-A-A-L-T-A-I-A-A-L-A-A-R-AA-A57
Egy, az exon/intron illesztési-elválasztási helyek együttműködő (konszenzus) szekvenciáira, valamint az intron belső szekvenciáira irányuló, számítógéppel segített kutatás [Boel E., Hansen Μ. T., Hjort I., Hoegh I. és Fiil Ν. P.: EMBO J. 3, 1581-1585. (1984); Mount
S.M.: Nucleic Acids Rés. 10, 459-472. (1982)] arra az eredményre vezet, hogy négy intron jelenléte valószínűsíthető 65 bp, 62 bp, 63 bp, illetve 47 bp hosszúsággal (4. ábra).
A PLI gén szekvenciáját a pPL29-5 EcoRI-Spel fragmentumai és a pPL35-5 EcoRI-Nhel fragmentumai szekvenciáinak (mindkettőt Ml3-ban végzett szubklónozással határozzuk meg) kombinálásával határozzuk meg.
7. példa
Kifejező vektorok megalkotása
7.1. példa
Új restrikciós hely bevezetése a PLI gén szignál szekvenciájába
Egy új BsHII hely bevezetését a PLI gén szignál szekvencia területébe (a 6. példában megadott szekvencia szerint) in vitro mutagenezissel végezzük Zoller és Smith szerint [Zoller M. J. és Smith M.: DNA, 3, 479-488. (1984)]. 19 gyököt tartalmazó oligonukleotidot szintetizálunk a 3.2 példában leírt módszerrel, amely oligonukleotid komplementer a PLI szignál szekvencia a C-terminális részét kódoló DNS-szekvencia 36-54 közti részével, a 10(45) nukleotid kivételével, amely C/G transzverzióhoz vezet (mutagén primer). A mutagén primer 45.-nél levő nukleotid cseréjét *-gal jelöljük.
a PLI szignál szekvencia része:
5’ CCTCGCTGCCCGCGCCGCT3’
40 50 54 *
5156. mutagén primer:
5’ CCTCGCTGCGCGCGCCGCT3’
Az in vitro mutagenezishez 200 pikomol 5156. oligonükleotidot 5’-foszforilezünk 200 nmol rATP-vel. A reakciót 1 órán át 37 °C hőmérsékleten végezzük 10 egység T4 polinukleotid kinázzal (Boehringer Mannheim) 20 μΐ kináz pufferban. A reakciót 65 °C-on 10 percig végzett melegítéssel fejezzük be.
7.2. példa
Ml3mp8-PL(Sal-EcoRl) templát DNS in vitro mutagenezise
Az első in vitro mutagenezis kísérlet Μ13mp8-PL(SalI-EcoRI) fágból kapott egyszálú DNS-re irányul, amelyet a 6. példában kaptunk meg, és amely a pPL29-5 plazmid 0,8 kb-s Sall-EcoRI fragmentumát tartalmazza, ez a fragmentum a promotor 117 nukleotidját és a PLI gén N-terminális részét tartalmazza. 1 pmol egyszálú M13mp8PL(SalI-EcoRI) DNS-t összekeverünk 20 pikomol 5156. mutagén primerrel (7.1 példa), és 10 pmol uni15
HU 214 005 Β verzális M13 szekvenciáló primerrel (N.4511, Amersham) 10 pl, 0,02 mol/1 trisz-HCl-t (pH 7,5), 0,01 mol/1 MgCl2-t, 0,05 mol/1 NaCl-t és 0,001 mol/1 DTT-t tartalmazó oldatban. A keveréket gyorsan felmelegítjük 5 °C hőmérsékletre, és lassan lehűtjük szobahőmérsékletre. 1 pl, 0,2 mol/1 trisz-HCl-t (pH 7,5), 0,1 mol/1 MgCl2-t és 0,01 mol/1 DTT-t tartalmazó oldatot, 4 μΐ 2 mmol/l-es dNTP-t és 1 μΐ 10 mmol/l-es ATP-t adunk a keverékhez, majd 3 egység T4 DNSligázt (Boehringer, Mannheim), és 2 egység DNSpolimeráz I-et (Klenow-fragmentum, Amersham) adunk hozzá, és a polimerizációs reakciót 15 órán át végezzük 15 °C hőmérsékleten. A polimerizációs keverék három hígítását (1:20, 1:100 és 1:500) készítjük el kis koncentrációjú TE-pufferban. Mindegyik hígításból 1 pl-t és 5 pl-t adunk külön-külön 300 μΐ kompetens E. coli JM101 sejthez, amelyet előzőleg az
5.1 példában leírtak szerint készítünk elő transzformációhoz. A sejteket X-gal lemezekre öntjük és fehér tarfoltokat képző telepeket kapunk. A fehér tarfoltok közül 100-at fogpiszkálóra tűzve átvisszük LB lemezekre. A fág DNS-sel transzformált baktériumokat egy éjszakán át növesztjük 37 °C hőmérsékleten, majd Whatman 541 szűrőkre visszük át, amint ezt a 3.1 példában leírtuk. A szűrőket mossuk (3.1 példa), majd előhibridizáljuk 6*NET-et, 1 *ss-Denhardt-ot, és 0,1% SDS-t tartalmazó oldatban 30 percen át 67 °C hőmérsékleten. A hibridizálást szobahőmérsékleten végezzük (3.4 példa) 30 percen át 15 pmol radioaktívan jelzett 5156. oligonukleotiddal (3.3 példa) szűrőnként, 6*SSC-ben. Hibridizálás után a szűrőket 4*40 másodpercig mossuk 6*SSC-ben, szobahőmérsékleten, és levegőn száradás után 1 órán át Kodak XAR-5 filmre helyezzük, Ilford Screen berendezést alkalmazva. A szűrőket mégegyszer mossuk 5 percen át 6*SSC-ben, 72 °C hőmérsékleten (az 5156. mutagén primer Tm értéke 70 °C), azonosítjuk, és egy éjszakán át Kodak XAR-5 filmen exponáljuk.
A pozitív szignálokat képező telepeket a második mosás után felszúrjuk az eredeti LB lemezről, 1 ml LB tápközegben szuszpendáljuk és 70 °C hőmérsékleten 20 percen át melegítjük. A bakteriofág oldatot 1:10, 1:1000 és 1:100 000 arányban hígítjuk, és az egyes hígítások 10 pl-ét alkalmazzuk 300 pl, exponenciális növési fázisban levő E. coli JM101 sejt átfertőzéséhez, majd a keveréket X-gal lemezekre öntjük. Az 1:100 000 hígításból 6 tarfoltot egyenként átvísziink fogpiszkálóval 1,5 ml 2*TY-ba, amely 15 μΐ exponenciálisan növekvő E. coli JM101 sejtet tartalmaz, és 37 °C hőmérsékleten növesztjük 6 órán át. A tenyészeteket 5 percen át centrifugáljuk Eppendorf centrifugában, és a felülúszókat 4 °C hőmérsékleten tároljuk (fág törzsoldat), és a sejteket alkalmazzuk RF készítményekhez Bimbóim és Doly korábban idézett módszere szerint. A BssII-vel végzett restrikciós elemzés után egy mutáns fágot választunk ki a további kísérletekben, amely egy új BssHII helyet visel a PLI Sall-EcoRI fragmentumában, ezt a mutáns fágot M13mpl8-PL(SalI-EcoRI)BssHII/BE5-nek nevezzük.
7.3. példa
Az MI3mpl8-PL(SpeI-EcoRI) templát in vitro mutagenezise
A második in vitro mutagenezis kísérletet a 6. példában kapott, M13mpl8-PL(SpeI-EcoRI) fágból származó egyszálú DNS-sel végezzük. Ez a rekombináns fág tartalmazza a pPL29-5 plazmid 1,4 kb-s Spel-EcoRI fragmentumát, és így a promotor 688 nukleotidját és a PLI gén N-terminális részét. Ennek a templátnak a mutagenezisét pontosan úgy hajtjuk végre, ahogyan ezt a 7.2 példában leírtuk. Egy fágot választunk ki a további négy kísérlethez, amely fág az új BssHII helyet viseli a PLI Spel-EcoRI beiktatásában, ezt ennek megfelelően M13mpl8-PL(SpeI-EcoRI) BssHII/AC5-nek nevezzük.
7.4. példa
A pUBE5 plazmid megalkotása
A könnyebb kezelés érdekében a 7.2 példában leírtak szerint kapott M13mp8-PL(SalI-EcoRI)BssHII/BE5 fág BamHI-EcoRI fragmentumát, amelyben megtalálható a PLI gén 130 bp-s promotor területe és az N-terminális része az újonnan bevezetett BssHII hellyel együtt a szignál szekvencia területben, szubklónozzuk a pUN121 plazmid vektorba (Nilsson és munkatársai, korábban idézett munka), amint ezt az 5. ábrában bemutatjuk és az alábbi példában leírjuk.
pg M13mp8-PL(SalI-EcoRI)BssHII/BE5 fág RF DNS-t izolálunk az 5.3 példa szerint, és teljességig emésztjük BamHI és EcoRI endonukleázokkal (Boehringer Mannheim). A fragmentumokat 1%-os agaróz gélen elkülönítjük, és a 0,8 kb-s BamHI-EcoRI fragmentumot tartalmazó gélszeleteket a 2.2 példában leírt módon elektroeluáljuk, ez a fragmentum tartalmazza a PLI gén promotorjának 117 bp-jét és N-terminális részét. A DNS-t fenol/kloroformmal extraháljuk és etanollal kicsapjuk. A DNS üledéket újra szuszpendáljuk 10 μΐ vízben (50 ng/μΐ).
pg pUN121-et emésztünk teljességig Bell és EcoRI endonukleázokkal (Boehringer Mannheim). A fragmentumokat 1% agaróz gélen elkülönítjük és a 4,0 kb-s fragmentumot elektro-eluáljuk, amint ezt a
2.2 példában leírtuk. Fenol/kloroformos extrahálás és etanolos kicsapás után a DNS-t 18 pl vízben feloldjuk (100 ng/pl).
300 ng BamHI-EcoRI fragmentumot, amely a BssHII helyet tartalmazza, ligáljuk 500 ng, BclI/EcoRIgyel hasított pUN121 DNS-T4 DNS ligázzal (Biolabs) 20 pl, 50 mmol/1 trisz-HCl-t (pH 7,8), 10 mmol/1 MgCl2-t, 20 mmol ditiotreitolt és 1,0 mmol/1 ATP-t tartalmazó oldatban. 10 pl ligálási keveréket alkalmazunk 100 pl kompetens E. coli HB101 sejt transzformálására, a kompetenssé tételt Maniatis és munkatársai korábban idézett módszer szerint végezve. A sejteket 8 mg/1 tetraciklint (SIGMA) is tartalmazó LB-lemezekre szélesztjük és egy éjszakán át inkubáljuk 37 °C hőmérsékleten.
Plazmidkészítményeket állítunk elő 12 tetR telepből Bimbóim és Doly korábban idézett módszere sze16
HU 214 005 Β rint, és egy plazmidot, amely a kívánt, 5. ábrában bemutatott restrikciós térképpel rendelkezik, választunk ki a további elemzéshez, ezt pUBE5-nek nevezzük el.
7.5. példa
Hgal restrikciós hely bevezetése a pML310 deszulfatohirudin génje előtt, és a 0,22 kb-s Hgal-BamHI gén fragmentum izolálása
Hgal restrikciós hely beiktatása érdekében a deszulfatohirudin gén előtt (6. ábra) 8 pg pML310 plazmid DNS-t emésztünk teljességig EcoRI restrikciós endonukleázzal. A hasított DNS-t fenol/kloroformmal extraháljuk és etanollal csapjuk ki. A túlérő 5’-végek eltávolítása érdekében 4 pg pML310/EcoRI DNS-t emésztünk 100 pl, 150 mmol/1 NaCl-t, 1 mmol/1 ZnSO4-et, 30 mmol/1 nátrium-acetátot (pH 4,6) és 20 egység/ml S1 nukleázt (SIGMA) tartalmazó oldatban, 45 percen át 37 °C hőmérsékleten.
A DNS-t fenol/kloroformmal extraháljuk és etanollal kicsapjuk. A pML310/EcoRI/Sl DNS-t újra szuszpendáljuk 100 pl 50 mmol/l-es trisz-HCl-ben (pH 8,0), és inkubáljuk 2 egység borjúbéleredetű alkálikus foszfatázzal (CIAP, ortofoszforsav-foszforiláz, EC.
3.1.3.1, Beohringer) egy órán át 37 °C hőmérsékleten. Az enzimet 65 °C hőmérsékleten inaktiváljuk 1,5 órán át. Az NaCl koncentrációt 150 mmol/l-re állítjuk be. A defoszforilezett DNS-t (pML310/EcoRI/Sl/CIAP) [150 mmol/1 NaCl, 10 mmol/1 trisz-HCl (pH 8,0) és 1 mmol/1 EDTA] adszorbeáltatva tisztítjuk. A DNS-t etanollal kicsapjuk és újra szuszpendáljuk H2O-ban 0,8 mg/ml koncentrációnál.
Hgal hely bevezetésére az
5-AGCGTCGACGCT-3 ’ képletű oligonukleotidot szintetizáljuk a foszfotriészter módszerrel [Hakura és munkatársai: J. Am. Chem. Soc. 103, 706 (1981)]. Az oligonukleotid szekvenciája ön-kiegészítő, és tartalmazza a Hgal restrikciós endonukleázhoz tartozó -GACGC- felismerő helyzet. Két egyedi szál összeforrasztása kettős szálú DNS kapcsolóhoz vezet.
1,2 pg szintetikus, egyszálú oligodezoxinukleotidot foszforilezünk 10 pl, 60 mmol/1 trisz-HCl-t (pH 7,5), 10 mmol/1 MgCl2-t 5 mmol/1 DTT-t, 30 pCi [γ—rtp]ATP-t (3000 Ci mmol1, Amersham) és 6 egység T4 polinukleotid kinázt (Boehringer) tartalmazó oldatban, 30 percen át 37 °C hőmérsékleten 0,5 mmol/1 ATP jelenlétében. A keveréket tovább inkubáljuk 10 percig 75 °C hőmérsékleten, hogy az enzimet inaktiváljuk. A keveréket lehűtjük szobahőmérsékletre az összeforrasztáshoz.
0,6 pg (170 pmol) 32P-jelzett kapcsoló DNS-t összekeverünk 2,4 pg (1,75 pmol) pML310/EcoRI/Sl/CIAPvel, és ligáljuk 20 pl, 61 mmol/1 trisz-HCl-t (pH 7,5), 10 mmol/1 MgCl2-t, 5 mmol/1 DTT-t, 3,5 mmol/1 ATP-t és 800 egység T4 DNS ligázt (Biolabs) tartalmazó oldatban 20 percen át 15 °C hőmérsékleten. A ligázt 85 °C hőmérsékleten 10 perces hőkezeléssel inaktiváljuk és a kapcsoló molekulák fölöslegét a DNS kicsapásával eltávolítjuk 10 mmol EDTA (pH 7,5), 300 mmol/1 nátriumacetát (pH 6,0) és 0,54 térfogat izopropanol jelenlétében. 30 perc múlva szobahőmérsékleten a DNS-t üledékbe visszük, újra szuszpendáljuk 45 pl (fentebb ismertetett) ligáló keverékben, és 6 órán át ligálunk 13 °C hőmérsékleten, hogy köralakú DNS-t kapjunk.
A ligálási keverék 1 pl-es és 3 pl-es alikvotjait adjuk 100 pl kalcium-kezeit, transzformáláshoz kompetens E. coli HB101 sejthez amelyet Hanahan D. módszere szerint készítettünk: J. Mól. Bioi. 166, 557-580. (1983). A sejteket jégen hagyjuk állni 30 percig, majd 3 percen át inkubáljuk 42 °C hőmérsékleten, 2 percig jégen hűtjük, majd 1 órán át inkubáljuk 37 °C hőmérsékleten 400 pl SOC tápközegben. A sejteket koncentráljuk 100 pl SOC tápközegben, és mindegyik koncentrátumot 50 pg/ml ampicillint tartalmazó LB agarra szélesztjük, és egy éjszakán át 37 °C hőmérsékleten növesztjük.
transzformált ampR telepet izolálunk, és egyenként növesztjük 100 pg/ml ampicillint tartalmazó LB tápközegben. Plazmid DNS-t készítünk Holmes és munkatársai módszere szerint [Holmes D. S. és Quigley M.: Anal. Biochem. 114, 193-197. (1981)]. A szintetikus oligonukleotid kapcsoló jelenlétét DNS-szekvenciaelemzéssel igazoljuk, primerként egyszálú DNSfragmentumot alkalmazva, amely hibridizál a hirudin kódoló szálához. Az egyik ki ónt, amely a kapcsoló DNS-t korrekt helyen tartalmazza a hirudin gén előtt, pML3 lOL-nek nevezzük.
A 0,22 kb-s Hgal-BamHI deszulfatohirudin gén fragmentum izolálására 40 pg pML310L plazmidot teljességig emésztünk Pvul és BamHl endonukleázokkal (Boehringer) 150 pl, 0,01 mol/1 trisz-HCl-t (pH 7,5), 0,1 mol/1 NaCl-t, 0,01 mol/1 MgCl2-t és 1 mmol/1 2merkapto-etanolt tartalmazó oldatban, 2 órán át 37 °C hőmérsékleten. A fragmentumokat 1%-os agaróz gélen különítjük el, és a 0,84 kb-s PvuI-BamHI fragmentumot tartalmazó gélszeleteket elektroeluáljuk, amint ezt az 5. példában leírtuk. Fenol/kloroformos extrakció és etanolos kicsapás után a DNS-t újra szuszpendáljuk 20 pl Hgal-pufferban, és teljességig emésztjük Hgal restrikciós endonukleázzal (Biolabs). A fragmentumokat 2%-os agaróz gélen el különítjük, és a 0,22 kb-s Hgal-BamHI fragmentumot tartalmazó gélszeleteket eluáljuk az előbbiekben ismertetettek szerint. Fenol/kloroformos extrahálás és etanolos kicsapás után a fragmentumot újra szuszpendáljuk 55 pl steril vízben (0,1 pmol/pl).
7.6. példa
A PLI szignálszekvencia és a deszulfatohirudin struktúrgén fúziója
Azért, hogy megfelelő kapcsolót biztosítsunk a PLI gén szignálszekvencia-kódoló terület (7.2 példa) BssHII helyének és a deszulfatohirudin gén (7.5 példa) Hgal helyének ligálásához, két ligonukleotidot szintetizálunk, amint ezt a 3.2 példában leírtuk.
PLI szignál szekvencia Deszulfatohirudin
N-terminális aminosavai
HU 214 005 Β
ALA ALA LEU ALA ALA ARG ALA ALA ALA VAL VAL 5’
GCC GCC CTC GCT Gcg ege gcc get get GTT GTT 5172. oligonukleotid CGG CGG GAG CGA GGC GCg egg cga cga caa caA 5173. oligonukleotid
3’ 5’
BssHII (a kisbetűk a kapcsolót jelképezik)
Az egyes oligonukleotidókból 300 pikomolt különkülön kinázos kezelésnek vetünk alá 400 pmol rATPvel és 10 egység T4 polinukleotid kinázzal (New England Nuclear) 15 pl, 50 mmol/1 trisz-HCl-t (pH 7,8), 10 mmol/1 MgCl2-t, 20 mmol/1 ditiotreitolt, mmol/1 ATP-t és 50 pg/ml BSA-t tartalmazó oldatban. Mindkét, kinázos kezelésnek alávetett oligonukleotidot összekeverjük 1:1 arányban, 95 °C hőmérsékletre melegítjük, és lassan lehűtjük szobahőmérsékletre az összeforrasztáshoz. Az összeforrasztott kapcsolókat -20 °C hőmérsékleten tároljuk.
7.7. példa
A pLHK3 megalkotása
A PLI megrövidített promotorát tartalmazó deszulfatohirudin kifejező vektor (7. ábra) megalkotásához 7 pg pUBE5 DNS-t (7.4 példa) emésztünk teljességig BssHII restrikciós endonukleázzal (Boehringer), extraháljuk fenol/kloroformmal és kicsapjuk etanollal. A DNS-t (1,9 pmol) újra szuszpendáljuk 10 pl steril vízzel. 300 pmol összeforrasztott 5172./5173. kapcsolót (7.6 példa) Egálunk 1,9 pmol, BssHII-vel hasított pUBE5-höz 400 egység T4 ligáz (Biolabs) segítségével 60 pl, 50 mmol/1 trisz-HCl-t (pH 7,8), 10 mmol/1 MgCl2-t, 20 mmol/1 ditiotreitolt, 0 mmol/1 ATP-t és 50 pg/ml BSA-t tartalmazó oldatban. A ligálás 15 órán át 15 °C hőmérsékleten végezzük. A ligázt 85 °C hőmérsékleten 10 percig végzett melegítéssel inaktiváljuk. A puffért 0,01 mol/1 trisz-HCl-re (pH 8,0), 0,1 mol/1 NaCl-re, 0,005 mol/1 MgCl2-re és 1 mmol/12-merkaptoetanolra állítjuk be. 36 egység BamHI-et (Boehringer) adunk hozzá, és az emésztést 2 órán át 37 °C hőmérsékleten folytatjuk. A fragmentumokat 1 %-os agaróz gélen elkülönítjük és a 3,4 kb-s BamHI-[BssHII]HgaI kapcsoló fragmentumot a gél-szelet elektro-elúciójával izoláljuk, ezt követi a fenol/kloroformos extrahálás és az etanolos kicsapás. A DNS-t újra szuszpendáljuk 14 pl steril vízzel 0,1 pmol/pl koncentrációra. A 0,22 kb-s deszulfatohirudin Hgal-BamHI fragmentum 0,2 pmólját 0,1 pmol emésztett pUBE5 DNS-hez ligáljuk. A ligálást 15 órán át 15 °C hőmérsékleten végezzük 400 egység T4 DNS ligázzal (Biolabs) 10 pl, 50 mmol/1 trisz-HCl-t (pH 7,8), 10 mmol/1 MgCl2-t, 20 mmol/1 ditiotreitolt, 1,0 mmol/1 ATP-t és 50 pg/ml BSA-t tartalmazó oldatban.
7.8. példa
A pLHL5 megalkotása
A deszulfatohirudin kifejező vektor megalkotásához, amely a PLI gén komplett promotor szekvenciáját tartalmazza, 10,3 pg M13mpl8-PL(SpeI-EcoRI)BssHII/AC5 fág (3.3 példa) RF DNS-t teljességig emésztjük BssHII restrikciós endonukleázzal (Boehringer), fenol/kloroformmal extraháljuk, etanollal kicsapjuk, és újra szuszpendáljuk 10 pl steril vízzel 1,9 pmol koncentrációra. 300 pmol 5172./5173. összeforrasztott kapcsolót (lásd fentebb) Egálunk 0,9 pmol, BsHII-vel hasított fág DNS-hez, amint ezt a 7.7 példában leírtuk. A T4 DNS ligáz inaktiválása után a puffért 0,01 mol/1 trisz-HCl-re (pH 7,6), 0,05 mol/1 NaCl-re, 0,01 mol/1 MgCl2-re és 0,014 mol/1 DTT-re állítjuk be. 36 egység HindlII restrikciós endonukleázt (Boehringer) adunk hozzá, és az emésztést 2 órán át 37 °C hőmérsékleten folytatjuk. A fragmentumokat 1%-os agaróz gélen elkülönítjük és az 1,4 kb-s HindIII-[BssHII] Hgal-kapcsoló fragmentumot izoláljuk elektro-elucióval, amint ezt a
2.2 példában leírtuk. A fragmentumot újra szuszpendáljuk 15 pl steril vízzel, hogy 0,1 pmol/pl koncentráció alakuljon ki.
pg pBR322 plazmidot [Bolivár F., Rodriguez R. L., Greene P. J., Betlach M. C., Heineker H. L., Boyer J., Crosa J. H. és Falkow S.: Gene, 2, 95-113. (1977)] teljességig emésztünk BamHI és HindlII endonukleázokkal (Boehringer Mannheim). 20 pl, 0,01 mol/1 trisz-HCl-t (pH 7,5), 0,1 mol/1 NaCl-t, 0,01 mol/1 MgCl2-t és 1 mmol/1 2-merkapto-etanolt tartalmazó oldatban, és a fragmentumokat 1%-os agaróz gélen különítjük el. A nagy 4,15 kb-s HindlII-BamHI fragmentumot eluáljuk a 2.2 példában leírtak szerint, és újra szuszpendáljuk 8 pl steril vízben (0,1 pmol/pl).
A deszulfatohirudin 0,2 kb-s Hgal-BamHI fragmentumának 0,2 pikomolját és az 1,4 kb-s PLI promotorszignál szekvencia HindIII-[BssHII]Hga-kapcsoló 0,2 pmolját Egáljuk 0,1 pmol, HindlII/BamHI-gyel hasított pBR322-be, 15 órán át 15 °C hőmérsékleten. A ligálást 400 egység T4 ligázzal (Biolabs) hajtjuk végre 10 pl, 50 mmol/1 trisz-HCl-t (pH 7,8), 10 mmol/1 MgCl2-t 20 mmol/1 ditiotreitolt, 1,0 mmol/1 ATP-t és 50 pg/ml BSA-t tartalmazó oldatban. 1 pl ligálási keveréket alkalmazunk 100 pl kompetens E. coli HB101 sejt transzformálására, ahol a kompetenssé tételt Manitatis korábban idézett kézikönyve szerint végeztük. Egy kiónt választunk ki a további kísérletekhez, ezt pLHL5-nek nevezzük (8. ábra)
7.9. példa
A pLHLT7 megalkotása
Abból a célból, hogy terminátorterületet biztosítsunk a PLI-deszulfatohirudin kifejező rendszernek, a pPL35-5 plazmid 0,7 kb-s Pstl-Nhel fragmentumát fuzionáljuk a deszulfatohirudin génhez, amint ezt a 9. ábrában bemutatjuk.
pg pPL35-5-öt teljességig emésztünk Pstl-gyel (Boehringer). A DNS-t fenol/kloroformmal extraháljuk
HU 214 005 Β és etanollal kicsapjuk. A fragmentumokat újra szuszpendáljuk 0,033 mol/1 trisz-acetátot (pH 7,9), 0,066 mol/1 kálium-acetátot, 0,01 mol/1 magnézium-acetátot, 0,5 mmol/1 DTT-t és 100 ng/ml BSA-t tartalmazó oldatban. 10 egység T4 DNS-polimerázt (Boehringer) adunk hozzá és a reakciót 180 másodpercig végezzük 37 °C hőmérsékleten. A reakciókeveréket jégre helyezzük, 20-22 nmol dATP-t, dCTP-t, dGTP-t és dTTP-t adunk hozzá, a puffért beállítjuk a fenti körülmények közé és a reakciót 35 percig végezzük 37 °C hőmérsékleten. Fenol/kloroformos extrakció és etanolos kicsapás után a DNS-t újra szuszpendáljuk 10 μΐ steril vízben (1,9 pmol = 11,4 pmol tompa vég). 900 pmol kinázzal kezelt és összeforrasztott BamHI-kapcsolót (7.6 példa; Biolabs) adunk hozzá és a ligálást 15 órán át végezzük 15 °C hőmérsékleten 400 egység T4 DNS ligázzal (Biolabs) 60 μΐ, 50 mmol/1 trisz-HCl-t (pH 7,8), 10 mmol/1 MgCl2-t, 20 mmol/1 ditiotreitolt, 1,0 mmol/1 ATP-t és 50 pg/ml BSA-t tartalmazó oldatban. A ligáz inaktiválása után 85 °C hőmérsékleten 10 percen át végzett melegítéssel a puffért 0,01 mol/1 trisz-HCl-re (pH 8,0), 0,1 mol/1 NaCl-re, 5 mmol) MgCl2-re és 1 mmol/1 2merkapto-etanolra állítjuk be: 20 egység Nhel restrikciós endonukleázt (Biolabs) adunk hozzá és emésztést végzünk 2 órán át 37 °C hőmérsékleten. A fragmentumokat 1,2%-os agaróz gélen különítjük el, és a 0,7 kb-s Nhel-PstI BamHI fragmentumot elektroelucióval izoláljuk, amint ezt a 2.2 példában leírtuk. A fragmentumot újra szuszpendáljuk 15 μΐ steril vízzel, hogy 0,1 pmol/μΐ koncentráció alakuljon ki.
Ligálást hozunk létre 0,2 pmol 0,7 kb-s Nhel-PstI BamHI terminátor fragmentum, 0,2 pmol 1,4 kb-s HindlII-BssHII Hgal promotor koncentrátum (7.4 példa), 0,2 pmol 0,2 kb-s Hgal-BamHI deszulfatohirudin fragmentum (7.5 példa) és 0,1 pmol, HindlII-mal és Xbal-gyel linearizált pUC18 vektor [Yanishc-Perron C., Vieira J., Messing J.: a Gene című kiadványban (1984)] között. A reakciót 400 egység T4 DNS-ligázzal (Biolabs) végezzük 15 órán át 15 °C hőmérsékleten 10 ml, 50 mmol/1 trisz-HCl-t (pH 7,8), 10 mmol/1 MgCl2-t, 20 mmol/1 ditiotreitolt, 1,0 mmol/1 ATP-t és 50 μg/ml BSA-t tartalmazó oldatban. 2 μΐ ligálási keveréket alkalmazunk E. coli HB101 sejtek transzformálására. 12 ampR transzformánst elemzünk, amint ezt a 7.6 példában leírtuk, és a korrekt fúziós szekvenciákat mutató plazmidot pLHLT7-nek nevezzük.
8. példa
A. nigerhez alkatmás együtt-transzformálási rendszer megalkotása
8.1. példa
Az Aspergillus niger pyrA génjét tartalmazó pCG59D7 elkészítése
A N. crassa pyr4 génjének egy részét hordozó pDJB2 [Ballance D. J. és Turner G.: Gene, 36, 321-331. (1985)] 1,1 kb-s HindlII fragmentumából 300 ng-ot radioaktívan jelzünk nick-transzlációval, Maniatis és munkatársai korábban idézett kézikönyve szerint. A génkönyvtár szűrőreplikáit (3.1 példa) megnedvesítjük 6*NET-ben és előhidridizálunk 6*NET-et, xss-Denhardt-ot, 0,1% SDS-t tartalmazó oldatban 4 órán át 50 °C hőmérsékleten. Hibridizálás után a szűrőket egyszer mossuk 5 percig 4xSSC-t és 0,1% SDS-t tartalmazó oldatban 50 °C hőmérsékleten. A nicktranszlációnak alávetett HindlII fragmentumot hozzáadjuk (300 ng/80 szűrő) és hibridizálást hajtunk végre 15 órán át 50 °C hőmérsékleten. Levegőn végzett szárítás után a szűrőket KODAK X-omat SO282 filmre helyezzük 3 napra. Egy erősen hibridizáló telepet, amelyet Escherichia coli BJ5183/ek CE59D7-nek (röviden 59D7-nek) nevezünk, izolálunk, és egy nagy plazmidot állítunk elő ebből (lásd Humphreys korábban idézett munkáját). A plazmidot pCG59D7-nek nevezzük, és ezt használjuk a 9.2 példában a transzformáláshoz.
8.2. példa
Az A. niger N756 törzs mutálása és uridinre auxotróf mutánsok izolálása
Az A. niger N756 törzs orotidin-5’-foszfát dekarboxiláz aktivitásnak fajlagos hiányát mutató mutánsaira való szelekciót pozitív szelekcióval lehet elérni a fluororotsav toxikus analóg [Boeke J. D., Lacroute F., Fink G. R.: Mól. Gén. Génét. 197, 345-346. (1984)] és uridin jelenlétében. A. niger N756 törzs 3T06 konidiospóráját 10 ml, 1 g/1 argininnel és 50 mg/1 uridinnel kiegészített minimál tápközeget tartalmazó lemezre visszük. A spórákat rövidhullámú UV-besugárzásnak vetjük alá (2600 Á) olyan dózissal, amely 0,5% túlélő telepet eredményez. 2 nap inkubálás után 28 °C hőmérsékleten, amikor a kinövő micélium gyengén látható, 10 mg fluor-orotsavat adunk minden lemezhez, és az inkubálást további 2-3 napig folytatjuk. A fluor-orotsav rezisztens telepek élénken növő és spórázó telepekként tűnnek fel a háttért képező, fehéres, érzékeny micélium-növekményből. A mutagénes kezelést túlélő mintegy 40 000 telepből 8 mutánst izolálunk. Ezek közül kettőt, amely fluor-orotsavra rezisztens a nélkül, hogy uridin-igénye lenne, nem növesztjük tovább. A többi hatnak uridin-auxotrófiája van. Heterokarionokat készítünk két fluorecetsav rezisztens mutáns konidiospóráinak keverékét növesztve egy éjszakán át, mindegyiket komplett tápközegen. Micéliumok blokkjait visszük át minimál tápközegre. A mutációjukban egymással komplementer mutánsok prototróf heterokarióta micéliumokat mutatnak a széleiken, míg azok, amelyekben ugyanazok az allélek mutálódtak, nem. Az N756 törzsből számlázó 6 uridin-igényes mutáns, akárcsak a S. Cerevisiae-ban [Boeke J. D., Lacroute F., Fink G. R.: Mól. Gén. Génét. 197, 345-346. (1984), két komplementációs csoportba tartozik. Mindkettőből egyet - az An8-at és AnlO-et - alkalmazunk transzformációhoz.
8.3. példa
Protoplasztok készítése és az A. niger N756 An8 és An 10 uridin-mutánsok transzformációja Az An8 és AnlO mutánsok konidiospóráit különkülön növesztjük ferde agaron 4-5 napon át 28 °C hőmérsékleten komplett tápközegben. 2108 An8 illetve AnlO konidiospórát alkalmazunk külön-külön 200 ml,
HU 214 005 Β g/1 argininnel és uridinnel kiegészített minimál tápközeg inokulálására (8.2 példa). Húszórás növesztés után 28 °C hőmérsékleten, 180 fordulat/perccel rázatva, a micéliumot Miracloth-on keresztül szűrve kinyerjük, kétszer mossuk 10 ml, 0,8 mol/KCl-t és 50 mmol/1 CaCl2-t tartalmazó oldattal, és újra szuszpendáljuk 20 pl, 0,8 mol/1 KCl-t, 50 mmol/1 CaCl2-t és 0,5 mg/ml Novozym 234-et (Novo Industries) tartalmazó oldatban. A keveréket inkubáljuk rázó vízfürdőben (30 °C, 50 fordulat/perc), amíg mikroszkóposán a maximális protoplaszt kibocsátást nem észleljük (90-120 perc). A protoplaszt szuszpenziót tölcsérben levő üveggyapot dugón át szűrjük, hogy a micélium-törmeléket eltávolítsuk. A protoplasztokat enyhe centrifugálással (10 perc, 2000 fordulat/perc) üledékbe visszük szobahőmérsékleten, és kétszer mossuk 10 ml, 0,8 mol/1 KCl-t és 50 mmol/1 CaCl2-t tartalmazó oldattal. A protoplasztokat végül újra szuszpendáljuk 200-500 pl, 0,8 mol/1 KCl-t és 50 mmol/1 CaCl2-t tartalmazó oldattal, hogy 1.108/ml koncentrációt érjünk el.
A transzformációhoz protoplaszt szuszpenziók (An8 illetve AnlO) 200-200 μΐ-es alikvotjait inkubáljuk olyan oldattal együtt, amely 10 pg/20mI pCG59D7 DNS-t és 50 μΐ PCT puffért tartalmaz [10 mmol/1 trisz-HCl (pH 7,5), 50 mmol/1 CaCl2 és 25% PEG 6000]. Az inkubációs keveréket jégen tartjuk 20 percen át, további 2,0 ml PCT puffért adunk hozzá és a keveréket további 5 percen át inkubáljuk szobahőmérsékleten. 4 ml, 0,8 mol/1 KCl-t és 50 mmol/1 CaCl2t tartalmazó oldatot adunk hozzá, és ennek a végső transzformációs oldatnak 1 ml-es alikvotjait folyékony, 0,8 mol/1 KCl-lel stabilizált minimál tápközeggel keveijük össze [minimál tápközeg + 1 g/1 arginin + 10 g/1 Bacto-agar (Difco)]. A keveréket azonnal azonos tápközeget tartalmazó agarlemezekre öntjük és 28 °C hőmérsékleten inkubáljuk.
napos növesztés után 28 °C hőmérsékleten stabil transzformánsok tűnnek fel élénken növekvő és spórázó telepekként sok száz kicsiny, valószínűleg félbemaradt transzformáns-kinövekedésen, mint háttéren.
A pCG59D7-tel végzett transzformálás csak az An8 mutánsban sikeres, az Anl0-ben nem. Az An8-at e szerint olyannak tekintjük, amelyből az omitin-5'-foszfát dekarboxiláz aktivitás hiányzik, ezt egészíti ki a pCG59D7 szelekciós plazmid teljes hosszúságú génterméke. Az An8-ban mintegy 20-30 transzformánst kapunk, 1 pg pCG59D7-re számítva.
An8 transzformánst felszúrunk, minimál tápközegen altenyészetet készítünk, és a DNS-t izoláljuk, majd elemezzük pCG59D7 szekvenciák jelenlétére. A transzformánsok DNS-ét a folyékony nitrogénben fagyasztott micélium porítása után izoláljuk az alábbi irodalmi helyen publikált eljárással: Yelton Μ. M., Hamer J. E., Timberlake W. E.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 1470-1474. (1984). Az egyes transzformánsok 1 pg-ját teljességig emésztjük Xhol-gyel, elektroforézissel frakcionáljuk 1%-os agaróz gélen, és nitrocellulóz szűrőre itatjuk fel Maniatis és munkatársai fentebb idézett kézikönyvében leírt módszer (382-386. oldal) szerint. Az átitatott szűrőket [a—52P]-vel jelzett pUN121 DNS-sel hibridizáljuk, standard eljárást követve Maniatis és munkatársai fentebb idézett kézikönyvében leírt módszer (387-389. oldal) szerint. A kapott különböző hibridizációs minták a transzformáló pCG59D7 plazmid kromoszomális integrációját jelzik a gazdaszervezet genomjába.
9. példa
A deszulfatohirudin gén kifejeződése PL1 promotor szabályozása alatt A. nigerben
9.1. példa
An8 mutáns együtt-transzformálása pCG59D7-tel, pLPIK 3-mal, pLHL5-tel vagy pLHLT7-tel An8 mutánst protoplasztjait készítjük el a 8.2 példa szerint és együtt transzformáljuk 5 pg pCG59D7 szelekciós plazmiddal és/vagy 10 pg pLHK3 plazmiddal (7.7 példa), vagy 10 pg pLHL5 plazmiddal (7.8 példa), vagy 10 pg pLHLT7 plazmiddal (7.9 példa), a 8.2 példában leírt eljárást követve.
A transzformált An8 sejteket minimál tápközegen választjuk ki uridin prototrófiára a 8.2 példában leírtak szerint. Az egyes együtt-transzformálási kísérletekből 50 transzformánst szúrunk fel véletlenszerűen, és elemezzük deszulfatohirudin kifejezésre. A deszulfatohirudin aktivitást trombin-gátlási méréssel vizsgáljuk a kromogén pepiid szubsztrátum gyártójának (Boehringer Mannheim, Német Szövetségi Köztársaság) útmutatója szerint.
9.2 példa
Deszulfatohirudin kifejezése a PLIpromotor szabályozása alatt An8 mutáns transzformálásában A 9.1 példa szerint kapott transzformánsokból konidiospórákat előtenyésztünk egyenként 50 ml előtenyésztő tápközegben [3 g/1 Pectin Slow Set L (Unipectin, SA, Redon, Franciaország), 2 g/1 NH4C1, 0,5 g/1 KH2PO4, 0,5 g/1 NaCl, 0,5 g/1 Mg2SO4.7H2O, 0,5 g/1 Ca2SO4.2H2O (pH 7,0)]. Az előtenyészetet 72 órán át inkubáljuk 250 fordulat/percnél, 28 °C hőmérsékleten. Az előtenyészet 10%-át alkalmazzuk 50 ml főtenyészet tápközeg inokulálására (20 g/1 szójaliszt, 5 g/1 Slow Set pektin). A tenyészet 72-96 óráig (a pektinliáz termelés legnagyobb sebessége) növesztjük 250 fordulat/percnél 28 °C hőmérsékleten (ezeket indukáló körülményeknek nevezzük). An8 mutáns transzformánsait növesztjük nemindukáló körülmények között is, 10 g/1 Phytone peptont és 10 g/1 glükózt tartalmazó tápközegben a fő tenyészet tápközeg helyett.
Különböző időpontokban (minden 20. órában) mintákat veszünk, a sejteket centrifugálással üledékbe visszük és ultrahangos kezeléssel szétzúzzuk. Mind a felülúszót, mind a sejtkivonatokat megvizsgáljuk deszulfatohirudin aktivitásra a 9.1 példa szerint leírt módon. Az együtt-transzformálást követően pLHK3 plazmiddal nem volt kimutatható deszulfatohirudin aktivitás. A teljes hosszúságú PLI promotort tartalmazó pLHL5 és pLHL7 egyaránt képes előidézni a deszulfatohirudin kifejeződését az A. niger An8 mutánsban. Az együtttranszformálási kísérletekből (9.1 példa) kiválasztott 50 transzfonnáns közül 10 mutat deszulfatohirudin aktivitást a tápközegben.
HU 214 005 Β
Az An8 mutánsban a deszulfatohirudin kifejeződését a teljes hosszúságú PLI promotor ellenőrzése alatt, valamint a PLI szignál peptid hasznosulását ennél fogva a pektin szubsztrátum indukciója szabályozza, és ez a deszulfatohirudin kiválasztásához vezet a tápközegbe.
A mikroorganizmusok deponálása
Az alábbi mikroorganizmusokat helyeztük letétbe a Budapesti Szerződés szabályai szerint a Deutsche Sammlung von Mikroorganismennél (Német Mikroorganizmus Gyűjtemény), Grisebachstrasse 8, D-3400 Göttingen, Német Szövetségi Köztársaság):
Mikroorganizmus Letéti szám A letevés időpontja
Escherichia coli BJ5183/pCG3Bl 1 DSM 3916 1986. december 11.
Aspergillus niger An8 DSM 3917 1986. december 11.
Escherichia coli BJ5183/pCG59D7 DSM 3968 1987. február 2.
SZABADALMI IGÉNYPONTOK

Claims (14)

  1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK
    1. Eljárás az (I) képlet szerint DNS-szekvenciájú Aspergillus niger pektinliáz (PLI) kifejezőrendszert vagy annak származékát hordozó rekombináns DNSvektort tartalmazó transzformált baktérium vagy gomba gazdasejt előállítására, azzal jellemezve, hogy valamely baktérium- vagy gomba gazdasejtet transzformáló körülmények között az (I) képlet szerinti DNS-szekvenciájú Aspergillus niger pektinliáz (PLI) kifejezőrendszert vagy származékát - ahol a származék -100-146. nukleotidok közötti promoter szekvenciát, az 1-57. nukleotidok közötti szignálszekvenciát, az 58-1366. nukleotidok közötti, kívánt esetben intronok nélküli és kívánt esetben a genetikai kód értelmezésén belül degenerált struktúrgént vagy legalább 649 bp nagyságú részét és/vagy az 1367. nukleotidtól az 1570-2029. nukleotidok bármelyikéig terjedő terminátort jelenti tartalmazó rekombináns DNS-vektorral transzformáljuk.
  2. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy gazdasejtként E. coli, Saccharomyces cerevisiaevagy Aspergillus-sejteket transzformálunk a DNS-vektorral.
  3. 3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az E. coli B55183/pCG3Bl 1 (DSM 3916) gazdasejt előállítására egy E. coli BJ5183 gazdasejtet a PLI kifejezőrendszert tartalmazó pCG3Bll plazmiddal transzformáljunk.
  4. 4. Az I. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy E. coli HB101 törzs sejtjeit a PLI kifejező rendszer promoterből, szignálszekvenciából és a PLI struktúrgén N-terminálisából álló származékát tartalmazó pPI29-5 plazmiddal transzformáljuk.
  5. 5. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy E. coli HB101 törzs sejtjeit a PLI kifejezőrendszer PLI struktúrgén N-terminálisából és terminátorból álló származékát tartalmazó pPL 35-5 plazmiddal transzformáljuk.
  6. 6. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy E. coli HB 101 törzs sejtjeit a PLI kifejezőrendszer PLI promoterből, szignálszekvenciából és a struktúrgén N-terminálisából álló származékát tartalmazó pUBE5 plazmiddal transzformáljuk.
  7. 7. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy E. coli HB101 törzs sejtjeit a PLI M13mp8-PL(SalI-EcoRI) BssHII/BE5 plazmiddal transzformáljuk.
  8. 8. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az E. coli HB101 törzset pCG59D7 plazmiddal ko-transzformáljuk.
  9. 9. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy E. coli HB101 törzs sejtjeit pLHK3 plazmiddal transzformáljuk.
  10. 10. Eljárás polipeptid előállítására Aspergillus niger pektinliáz (PLI) kifejezőrendszerrel gomba gazdasejtekben, azzal jellemezve, hogy az (I) képlet szerinti DNS-szekvenciájú Aspergillus niger pektinliáz (PLI) kifejezőrendszer promoter szekvenciáját, kívánt esetben szignálszekvenciáját, struktúrgénjét vagy egy heterológ struktúrgént és kívánt esetben terminátorát tartalmazó rekombináns DNS-vektort valamely gombatörzsben kifejezünk, és a polipeptidet izoláljuk.
  11. 11. A 10. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a polipeptidet Aspergillusban fejezzük ki.
  12. 12. A 11. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy heterológ struktúrgénként deszulfatohirudin gént tartalmazó pLHL-5 plazmidot fejezünk ki.
  13. 13. A 10. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy heterológ struktúrgént deszulfatohirudin gént tartalmazó pLHLT7 plazmidot fejezünk ki.
  14. 14. A 10. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a PLHL5 vagy pLHLT7 plazmidot Aspergillus niger An8 törzsben fejezzük ki.
HU88508A 1987-02-04 1988-02-03 Eljárás tarnszformált gazdasejtek és polipeptidek előállítására új gombakifejező rendszerrel HU214005B (hu)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GB878702475A GB8702475D0 (en) 1987-02-04 1987-02-04 Expression system

Publications (2)

Publication Number Publication Date
HUT46357A HUT46357A (en) 1988-10-28
HU214005B true HU214005B (hu) 1998-08-28

Family

ID=10611694

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU88508A HU214005B (hu) 1987-02-04 1988-02-03 Eljárás tarnszformált gazdasejtek és polipeptidek előállítására új gombakifejező rendszerrel

Country Status (23)

Country Link
EP (2) EP0278355B2 (hu)
JP (1) JP2633885B2 (hu)
KR (1) KR970001116B1 (hu)
AT (1) ATE133706T1 (hu)
AU (1) AU625773B2 (hu)
CA (1) CA1327330C (hu)
DD (3) DD267511A5 (hu)
DE (1) DE3854947T3 (hu)
DK (1) DK175569B1 (hu)
ES (1) ES2082746T5 (hu)
FI (1) FI105484B (hu)
GB (1) GB8702475D0 (hu)
GR (1) GR3018863T3 (hu)
HU (1) HU214005B (hu)
IE (2) IE960902L (hu)
IL (1) IL85293A (hu)
MX (1) MX10286A (hu)
NO (1) NO179078C (hu)
NZ (1) NZ223392A (hu)
PH (1) PH26106A (hu)
PT (1) PT86684B (hu)
YU (1) YU21688A (hu)
ZA (1) ZA88757B (hu)

Families Citing this family (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5618920A (en) * 1985-11-01 1997-04-08 Xoma Corporation Modular assembly of antibody genes, antibodies prepared thereby and use
US5576195A (en) * 1985-11-01 1996-11-19 Xoma Corporation Vectors with pectate lyase signal sequence
US5447862A (en) * 1987-02-04 1995-09-05 Ciba-Geigy Corporation Pectin lyase genes of aspergillus niger
AU627443B2 (en) * 1988-01-11 1992-08-27 Xoma Corporation Novel plasmid vector with pectate lyase signal sequence
DE68926882T2 (de) * 1988-01-11 1997-02-13 Xoma Corp Plasmidvektor mit pectatlyase-signalsequenz
DE68913846T3 (de) * 1988-07-28 2002-10-02 Novartis Ag Expressionssystem.
EP0421919A3 (en) * 1989-09-02 1992-04-15 Ciba-Geigy Ag Polygalacturonase encoding fungal expression system
US5624834A (en) * 1992-12-24 1997-04-29 Gist-Brocades, B.V. Cloning and expression of the exo-polygalacturonase gene from aspergillus
WO1994021786A1 (en) * 1993-02-16 1994-09-29 Novo Nordisk A/S An enzyme with pectin lyase activity
US5674728A (en) * 1993-11-03 1997-10-07 Novartis Corporation Aspergillus niger vacuolar aspartyl protease
US6027888A (en) * 1996-04-05 2000-02-22 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods for producing soluble, biologically-active disulfide-bond containing eukaryotic proteins in bacterial cells
US6083715A (en) * 1997-06-09 2000-07-04 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods for producing heterologous disulfide bond-containing polypeptides in bacterial cells
WO1999027083A1 (en) * 1997-11-24 1999-06-03 Novo Nordisk A/S PECTIN DEGRADING ENZYMES FROM $i(BACILLUS LICHENIFORMIS)
US6187580B1 (en) 1997-11-24 2001-02-13 Novo Nordisk A/S Pectate lyases
US6165769A (en) * 1997-11-24 2000-12-26 Novo Nordisk A/S Pectin degrading enzymes from Bacillus licheniformis
EP1187925B1 (en) * 1999-06-02 2005-03-30 Novozymes A/S Pectate lyase fusion for expression and secretion of polypeptides
US8765442B2 (en) 2008-12-19 2014-07-01 Dupont Nutrition Biosciences Aps Process for production of an enzyme product
TR201809053T4 (tr) 2012-08-16 2018-07-23 Bangladesh Jute Res Institute Macrophomina phaseolina'dan elde edilen pektin parçalama enzimleri ve bunların kullanımları.
WO2023225459A2 (en) 2022-05-14 2023-11-23 Novozymes A/S Compositions and methods for preventing, treating, supressing and/or eliminating phytopathogenic infestations and infections

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4885249A (en) 1984-12-05 1989-12-05 Allelix, Inc. Aspergillus niger transformation system
ATE161881T1 (de) 1985-04-15 1998-01-15 Gist Brocades Nv Verwendung von promotoren von filamentösen pilzen
DE68913846T3 (de) * 1988-07-28 2002-10-02 Novartis Ag Expressionssystem.

Also Published As

Publication number Publication date
KR880010126A (ko) 1988-10-07
PH26106A (en) 1992-02-06
AU1123488A (en) 1988-08-18
FI105484B (fi) 2000-08-31
ZA88757B (en) 1988-08-04
GR3018863T3 (en) 1996-05-31
JP2633885B2 (ja) 1997-07-23
NO179078C (no) 1996-07-31
ATE133706T1 (de) 1996-02-15
IL85293A (en) 1992-12-01
DD267511A5 (de) 1989-05-03
NZ223392A (en) 1991-05-28
EP0278355B1 (en) 1996-01-31
DD283837A5 (de) 1990-10-24
CA1327330C (en) 1994-03-01
DE3854947T2 (de) 1996-11-14
MX10286A (es) 1993-12-01
YU21688A (en) 1991-04-30
EP0278355B2 (en) 2002-10-23
PT86684A (pt) 1988-03-01
DK54588A (da) 1988-08-05
DK175569B1 (da) 2004-12-13
IL85293A0 (en) 1988-07-31
FI880439A (fi) 1988-08-05
EP0278355A3 (en) 1989-12-20
EP0278355A2 (en) 1988-08-17
KR970001116B1 (en) 1997-01-28
ES2082746T5 (es) 2003-06-16
NO880470D0 (no) 1988-02-03
AU625773B2 (en) 1992-07-16
PT86684B (pt) 1992-04-30
DE3854947D1 (de) 1996-03-14
NO880470L (no) 1988-08-05
DE3854947T3 (de) 2003-04-30
DD283838A5 (de) 1990-10-24
IE880292L (en) 1988-08-04
EP0683228A2 (en) 1995-11-22
IE72506B1 (en) 1997-04-23
JPS63273480A (ja) 1988-11-10
ES2082746T3 (es) 1996-04-01
FI880439A0 (fi) 1988-02-01
NO179078B (no) 1996-04-22
IE960902L (en) 1988-08-04
GB8702475D0 (en) 1987-03-11
DK54588D0 (da) 1988-02-03
EP0683228A3 (en) 1996-03-06
HUT46357A (en) 1988-10-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
HU214005B (hu) Eljárás tarnszformált gazdasejtek és polipeptidek előállítására új gombakifejező rendszerrel
WO1983004051A1 (en) Expression of preprothaumatin-like proteins in kluyveromyces yeasts
JPH07110233B2 (ja) リプレツシブルイ−ストプロモ−タ−
CA1338859C (en) Expression system
JP3424840B2 (ja) 菌類プロテアーゼ
US5447862A (en) Pectin lyase genes of aspergillus niger
EP0439997B1 (en) Novel fungal expression system
US5726043A (en) Process for the production of protease inhibitors
CA1335081C (en) Expression system comprising aspergillus niger pectin lyase i gene sequences
KR0166956B1 (ko) 펙틴 리아제의 발현 시스템을 암호화하는 재조합 dna분자
NZ214422A (en) Dna vector, process for making proteins and transformed cells

Legal Events

Date Code Title Description
DFC9 Refusal of application
HPC4 Succession in title of patentee

Owner name: NOVARTIS AG., CH