PT86684B - Processo para a preparacao de novos sistemas de expressao - Google Patents

Description

Campo do Invento invento está relacionado com o campo da engenharia genética e proporciona novas moléculas de DNA compreendendo sequências de DNA codificador da pectina liase I (PLI) de Aspergillus niger e/ou o promotor, sequência sinal ou terminador da referida pectina liase I. As novas moléculas de DNA são úteis para a superprodução de PLI em Aspergillus e/ou na construção de vectores híbridos expressando genes estranhos em fungos filamentosos.

Fundamento do Invento

Apesar de nas técnicas de engenharia genética serem já conhecidos numerosos sistemas de expressão de polipeptídeos para hospedeiros procarióticos e eucarióticos, existe uma contínua necessidade de novos sistemas que possam ter vantagens sobre os sistemas conhecidos.

São largamente usados o hospedeiro procariótico Escherichia coli e o hospedeiro eucariótico levedura, e.g. Saccharomyces cerevisiae, para os quais foram desenvolvidos um elevado número de diferentes vectores hbridos de expressão, a maior parte das vezes plasmídeos. As desvantagens dos hospedeiros E. coli são não poderem glicosilar o polipeptídeo formado e devido à ausência de secreção o polipeptídeo poder acumular-se dentro da célula hospedeira e inibir o seu crescimento. Os hospedeiros do tipo levedura fazem a glicosilação, no entanto, tal como E. coli, não secretam os polipeptídeos, excepto os muito pequenos, para o meio nutritivo. As leveduras secretam apenas para o espaço periplasmático. Os hospedeiros eucarióticos superiores são células tumorais de mamífero que são capazes de glicosilar e secretar para o meio nutritivo, no entanto, a sua cultura é muito lenta e cara e existe o perigo de serem isolados ácidos nucleicos oncogénicos juntamente com o peptídeo

pretendido do qual este último pode não se libertar.

Atendendo à necessidade de outros hospedeiros, também foram investigados os fungos filamentosos tais como Neurospora crassa, Aspargillus nidulans e Aspargillus niger. Tais fungos são já largamente usados para fins I industriais, no entanto, a sua aplicação em técnicas de engenharia genética ficou para trás, principalmente devido a não haver sistema de transformação adequado. Ao contrário de Saccharomyces cerevisiae, os fungos filamentosos não conI têm plasmídeos que possam ser usados na introdução de genes

I estranhos e selecção de fenótipos. É no entanto, possível transformar os fungos filamentosos com plasmídeos estranhos contendo um gene para marca selectiva. Todos os vectores descritos até agora para fungos filamentosos não se replicam autonomamente, como o fungo de leveduras, mas são integrados no cromossoma do fungo. Este acontecimento ocorre apenas com uma frequência muito baixa. Vantajosamente, por outro lado, a transformação integrativa torna os transformentes mitóticamente muito estáveis, mesmo em condições não selectivas. A integração estável de mais de cem cópias foi já divulgada.

primeiro vector para fungos filamentosos descrito continha o gene qa-2 de Neurospora crassa como marca selectiva. Este gene codifica a enzima catabólica desidroquinase e pode ser usado para a complementação funcional de mutantes aro de N. crassa / Case, M.E. Schwei₍ zer, M., Kushmer, S.R. e Giles N.H (1979) p_roc. Natl. Acad.

Sei. USA, 76 , 5259-5263_7. Os mutantes aro são incapazes de crescer em meio mínimo sem um suplemento de aminoácido aromático. A transformação de N. crassapelo vector qa-2 ocorreu por integração de uma única cópia do plasmídeo no cromossoma 30% dos integrantes aro⁺ estáveis mantiveram o gene qa-2 integrado ainda ligado a sequências do plasmídeo bacteriano

/~Case, M.E. (1982) em Genetic Engineering of Microorganisms for Chemicals (Hollãnder, A., De Moss, D. Kaplan, S., Konisky, J. Savage, D. e Wolfe, R.S. eds) , pp. 87-100, Plenum7. Esta observação fez da contransformação de sequências de DNA não selectivas juntamente com selectivas uma tarefa possível.

Em Aspergillus nidulans, que tem um ciclo sexuado e é portanto adequado a manipulações genéticas clássicas, foram identificados sistemas de selecção negativa e positiva. Quer usando DNA heterólogo de N. crassa ou DNA homólogo, obteve-se complementação funcional de mutante pyr G, de A. nidulans por transformação com plasmídeos contendo o gene pyr G (Ballance et al., BBRC 112, 284, 1983) Tilburn et al, Gene 26, 205 1983). Noutros sistemas mutações no locus trpC ou ArgB foram funcionalmente complementados por transformação com os plasmídeos adequados / Yelton et al PNAS 81, 1470, 1984; Yelton et Timberlake, J. Cell. Biochem. Suppl. 9C 173, 1985; Jonhstone et al., EMBO J. £, 1307, 1983_7.

Também foi desenvolvido um sistema de selecção positiva dominante fazendo uso do gene amdS isolado a partir de A. nidulans que permite a Ά. niger transformado com ele, crescer em acetamida como única fonte de azoto (Tilburn et al., Gene 26, 205, 1983); Wernars et-al., Curr Genet. £, 361, 1985, Kelly, J. M. et al., EMBO J. £, 475, 1985).

Comparado com N. crassa ou A. nidulans, A.. niger é de longe o organismo mais importante. É largamente usado na produção industrial de enzimas, e.g. para usar na indústria alimentar A. niger difere de A. midulans pela sua capacidade secretora, por secretar uma variedade de enzimas hidroliticas, e.g. glucoamilase, -amilase, pectinase, celulose, β-glucamase, β -galactosidase, naringinase, pentosanase, protease ácida e linhase, sendo os complexos

glucoamilase e pectinase ou mais importante.

A. niger não tem ciclo sexuado conhecido. As mutações não podem portanto ser introduzidas via recombinações meióticas. Por mutação e processos de selecção clássicos, tem sido no entanto conseguidos grandes melhoramentos na secreção de enzimas hidrolíticas.

Dos genes de enzimas de A. niger apenas os da glucoamilase (Boel et al EMBO J. 3^ 1581, 1984) e álcool e aldeído desidrogenase (WO 86/06097) juntamente com o seu promotor e sequências sinal foram caracterizados e usados em experiências de transformação com A. nidulans e A. niger, respectivamente.

Têm sido usadas como marcas selectivas para A. niger o gene heterólogo amds (Kelly e Hynes, EMBO 3, _4, 475, 1985) e o gene argB (Buxton et al. , Gene 37, 207, 1985; EP 184438; WO 86/06097), ambos obtidos a partir de A. nidulans.

A. niger é o organismo mais importante para a produção industrial de enzimas que degradam pectinas. As pectinas são poligalacturonidos de alto peso molecular (20000-40000 D) consistindo em polímeros do ácido D-galacturónico ligados com ligações p^-1,4-glicosidicas e surgem na natureza como constituintes de células de plantas superiores, nas quais estão ligados a moléculas de celulose principalmente encontradas na parede celular primária e na lamela média. Entre as fontes mais ricas de pectina encontra-se a casca do limão e da laranja que contêm cerca de 30% deste polissacárido. As enzimas pécticas degradam o substracto polímero glicosilado por hidrólise da ligação Ος-1,4-glicosídica (poligalacturonase) ou por transeléminação do resíduo galacturónico -4,5-insaturado da molécula de pectina (diferentes pectina liases). O nome sistemático da pectina liase é pectina transeliminase (EC 4.2.2.10).

Em A. niger as proteínas do complexo péctico não são expressas constitutivamente. Em condições de indução usando pectina ou produtos da sua degradação, A. niger expressa as enzimas acima referidas, incluindo PLI, quando outras fontes de carbono, tais como glucose ou sucrose, são limitantes. Nasculturas em placa as enzimas pécticas tendem a permanecer associadas à parede celular externa. Aumentando a pectina e a concentração de Ca²⁺ no meio obtem-se secreção completa.

As pectinases tais como PLI, são usadas na indústria alimentar principalmente para a clarificação de sumos de fruta.

A partir de A. niger duas pectinas liases diferentes, PLI e PLii, foram purificadas e parcialmente caracterizadas por F.E.A. Van Hondenhoven (1). PLI contem quatro resíduos de manose, enquanto que PLII tem manose e glucose, dois resíduos de cada. As enzimas têm diferentes pesos moleculares (PLI: 37,5 KD, PLII: 36 KD). Antes do presente invento não foram publicadas quaisquer sequências de aminoácidos totais ou parciais.

presente invento baseia-se numa determinação parcial da estrutura da pectina liase I (PLI) que permitiu a síntese de sondas de DNA codificadoras de partes importantes da proteína. Por meio das sondas de DNA foi possível fazer o despiste e isolar DNA codificador de PLI, eventualmente juntamente com pre- e prosequências do referido DNA, a partir de uma biblioteca de genes de A. ni-8-

Objectivos do Invento

Os objectivos do invento são moléculas de DNA recombinante codificadoras de um sistema de expressão da pectina liase e seus derivados, tais como o gene estrutural de PLI e correspondentes sequências reguladoras, e.g. promotor, sequência sinal e terminador e vectores híbridos compreendendo os correspondentes DNAs, incluindo vectores híbridos com DNA codificador de polipeptídeos homólogos ou heterólogos, hospedeiros, especialmente fungos filamentosos, e.g. hospedeiros Aspargillus, transformados pelos referidos vectores, métodos para a preparação das referidas moléculas de DNA recombinante e referidos hospedeiros e o uso das moléculas de DNA recombinante para a preparação de novos sistemas de expressão. Um outro objectivo é a preparação de polipeptídeos pormeio dos referidos DNAs e dos referidos hospedeiros.

sistema de expressão da pectina liase compreende sequências de DNA codificadoras do promotor, sequência sinal, gene estrutural e terminador de um gene da pectina liase.

Mais particularmente, um objectivo do presente invento é a construção de vectores de expressão híbridos compreendendo seguências de DNA codificadoras do promotor de PLI, facultativamente da sequência sinal desta proteína e facultativamente de um terminador adequado do mesmo gene. Estes vectores de expressão híbridos são usados para a incorporação de genes codificadores de proteínas particulares e para a transformação de fungos filamentosos, tais como Aspergillus, Penicillium e Cephalosporium. A cotransformação de A. niger com 2 plasmídeos diferentes pode ser efectuada, sendo um dos plasmídeos seleccionado do grupo dos vectores de expressão do invento e o outro é um plasmídeo de selecção especialmente construído, que funciona em ligação com uma estirpe mutante de um fungo filamentoso.

presente invento também diz respeito à superprodução de PLI em espécies de Aspergillus.

Os vários assuntos do invento tornar-se-ão mais evidentes a partir da descrição detalhada do invento que se segue.

Descrição detalhada do invento

As moléculas de DNA recombinante

Mais particularmente, o presente invento diz respeito a uma molécula de DNA recombinante compreendendo a sequência de DNA da fórmula I (Figura 4) ou um seu derivado.

termo derivado quando usado em ligação com a sequência de DNA da fórmula pretende incluir derivados maiores com sequências delimitantes, fragmentos da referida sequência de DNA, mutantes, especialmente mutantes naturais e sequências de DNA que são degeneradas.

Os derivados maiores das moléculas de DNA da formula I são os retirados do genoma de A. niger e compreendem a sequência de DNA da fórmula I, tal como pode ser encontrada numa biblioteca genómica de A. niger obtida por fragmentação dos ácidos nucleicos, tratamento dos fragmentos com uma enzima de restrição adequada, e.g. Sau3A, ligação a um plasmídeo adequado, e.g. pUN121, clonagem, e.g. em E. coli e nova excisão com a mesma enzima de restrição. Tal derivado é e.g. a inserção do plasmídeo pCG3Bll apresentado na Figura 1.

Os fragmentos da sequência de DNA com a fórmula I são os que se estendem entre dois sítios de restrição seleccionados de PstI, EcoRI, HindIII, Sau3AI, Kpnl,

Clal, Ncol, Accl, SalII, Pvul, Sall, Spel, Bgll, EcoRV, BglII, Aval, Xhol, Nhel, BssHI, Xmnl, BamHI, BssHII e similares como se mostra nas Figuras juntas.

São preferidos os fragmentos que contenham a sequência do promotor, a sequência sinal, o gene estrutural de PLI e/ou a sequência do terminador.

Os fragmentos da sequência de DNA da fórmula I podem conter adaptadores que proporcionam uma boa ligação a outras moléculas de DNA.

A sequência do promotor de PLI está contida na região do DNA entre as posições de nucleotídeos -1 a -688, em que a sequência entre os nucleotídeos à volta de -100 e -146 é essencial. Para a sequência do promotor a caixa TATAA nos nucleotídeos -120 a -146 é importante como local de recolhimento da RNA polimerase. Adaptadores adequados podem ser ligados a estes fragmentos.

O promotor de PLI de A. niger é induzível, i.e., a expressão do gene estrutural ligado a ele, e.g. o gene estrutural codificador de PLI ou qualquer outro gene estranho é induzido pela adição de pectina ou de produtos de degradação da pectina para o meio.

A sequência sinal estende-se entre os nucleotídeos 1 a 57. A sequência sinal é uma sequência preferida e as moléculas de DNA que a contêm, e.g. como sejam as que contêm a referida sequência e adaptadores adequados facultativos, são moléculas de DNA preferidas.

O gene estrutural de PLI começa no nucleotídeo 58 e estende-se até ao nucleotídeo 1366. Como é evidente a partir da fórmula I o gene estrutural contem vários intrões. Igualmente o gene estrutural pode conter vários adaptadores adequados.

terminador começa com o codão de paragem TAA no nucleotídeo 1367 e pode estender-se até ao nucleotídeo 1570 ou até ao 2029, especialmente até um dos sítios de restrição dentro da referida sequência. O fragmento terminador pode conter adaptadores adequados.

Os adaptadores adequados para os fragmentos acima têm uma sequência de DNA que se encaixa no sítio de restrição do DNA a que o fragmento se vai ligar ou que contem um sítio de restrição.

Os fragmentos da sequência de DNA da fórmula I são também de modo a serem compostos por fragmentos mais pequenos, e.g., os compostos pelo promotor e pela sequência sinal ou estrutural ou pela sequência sinal e estrutural, o gene estrutural sem intrões e similares.

Os mutantes da sequência de DNA com a fórmula I são e.g. mutantes naturais como seja o mutante cujo nucleotídeo T80 está substituído por Αθθ, pelo que o codão GTG codificador da valina é alterado para GAG codificador do ácido glutâmico. Este último aminoácido está presente na PLI isolada a partir de uma mistura de enzima pectinolíticas (Ultrazym , Novo Industries, Compenhagen) obtida de uma estirpe de A. niger. O invento compreende também mutantes naturais ou sintéticos da sequência sinal com um perfil de hidrofobicidade semelhante ou idêntica, e.g. em que os codões dos aminoácidos polares lisina (K ), tirosir _ na (Y ), e arginina (R ) são trocados por codões para outros aminoácidos tendo cargas semelhantes e os aminoácidos hidrofóbicos alanina (A), leucina (L), e treonina (T), são substituídos por codões de outros aminoácidos hidrofóbicos . Por exemplo, o codão para a lisina carregada positivamente pode ser substituído por um codão para a arginina e vice-versa, o codão da tirosina carregada negativamente por um codão do glutamato ou do aspartato e/ou o codão da alanina hidrofóbica não polar por qualquer um dos codões para treo

nina, prolina, valina, isoleucina, leucina, metionina ou fenilalanina e similares. Outras mutações são mutações silenciosas em que um ou alguns outros nucleotídeos, e.g. até cerca de 30 são substituídos por um ou mais de outros nucleotídeos, em que os novos codões codificam o(s) mesmo(s) aminoácido(s).

As sequências do DNA da fórmula I que são degenerados são, tal como as mutações silenciosas, as que são degeneradas dentro do contexto do código genético por um número ilimitado de nucleotídeos serem substituídos por outros nucleotídeos sem alteração da sequência de aminoácidos que eles codificam. Tais sequências de DNA degenerado podem ser úteis devido aos seus diferentes sítios de res-t trição.

As moléculas de DNA recombinante compreendendo uma sequência de DNA da fórmula I ou um seu derivado são especialmente vectores recombinantes, como alternativa designados vectores híbridos, contendo tais sequências de DNA como inserções. Elas são usadas para clonagem em hospedeiros, tais como bactérias, fungos ou células animais. Tais vectores híbridos são derivados de qualquer vector útil em engenharia genética, como sejam fagos, cosmídeos, plasmídeos ou DNA cromossómico, por exemplo derivados do fago JL· , e.g. NM 989, DNA do fago M13mp8 (15) linearizado por disgestão com BamHI, plasmídeos bactericinos, e.g. pBR322 , pUN121, pUC18 ou plasmídeos de levedura, e.g. plasmídeo 2 ji de levedura ou também DNA cromossómico, derivado e.g. do Aspergillus, e.g. A. niger, por exemplo os fornecidos por EP 184 438.

Um vector híbrido do invento, além da sequência de DNA da fórmula I ou um seu derivado, contem um sítio de replicação e facultativamente, dependendo do tipo do derivado de DNA, uma sequência de controle da expressão, como seja uma sequência potenciadora, sítio de activação a

motante, sequências do promotor e sinal e/ou genes estruturais diferentes das correspondentes presentes sequências de A. niger. Tais sequências potenciadoras podem ser derivadas de DNA extracromossómico ribossomal de Physarum polycephalum (PCT/EP 8500278) ou são os sítios de activação a montante dogene PHO5 da fosfatase ácida (EP Appl. N2 86 111 820.6) ) ou do híbrido PHO5, trp, PHO5-GAPDH (EP Appl. N° 86 111 820.6) ou promotores similares. Tais sequências de controle da expressão podem ser ligadas ao gene estrútural de PLI.

i Os genes estruturais ligados ao presen| te promotor, sequência sinal e/ou terminador são, além das codificadoras de PLI com ou sem intrões, também outros genes homólogos da pectina liase e genes estruturais heterólogos codificadores de uma larga variedade de polipeptídeos, incluindo polipeptídeos glicosilados, em particular de eucariotas superiores, especialmente mamíferos, como sejam de origem animal ou especialmente de origem humana, por exemplo enzimas que possam ser usadas, por exemplo para a produção de nutrientes e para a realização de reacções enzimáticas em química ou polipeptídeos não enzimáticos, que são úteis e importantes no tratamento de doenças de animais e humanas ou na sua prevenção, por exemplo hormonas, polipepI tídeos com propriedades imunomodulares, anti-virais e anti-tumorais, anticorpos, antigénios virais, vacinas, factores de coagulação, alimentos e similares.

Exemplos de tais genes estruturais heterólogos são e.g. os codificadores da insulina, factores de crescimento, como seja factores de crescimento epidérmico, tipo insulina, de mastócitos, dos nervos ou transformantes, hormonas de crescimento, tais como hormonas de crescimento humana ou bovina, interleuquina, como seja interleuquina 1 ou 2, factor humano inibidor da migração de macrófagos (MIF), interferões, como seja interferão humano, por exemplo interferão o(-A, <\B, <<D, ou F, interferão β, interferão ou um interferão híbrido, por exemplo um in-14-

terferão híbrido A- o( D ou b- °<D, antigénios do vírus da hepatite, como seja o antigénio da superfície ou do nucleóide do vírus da hepatite B ou antigénio do vírus da hepatite A, activadores do plasminogénio, tais como activador do plasminogénio tipo tecido ou urocinase, factor de necrose tumoral, somatostatina, renina, β -endorfina, imunoglobulinas, como sejam as cadeias leves e/ou pesadas da imunoglobulina D, E ou G, factores de ligação a imunoglobulina, como seja o factor de ligação à imunoglobulina E, calcitonina, peptídeo relacionado com a calcitomina humana, factores de coagulação do sangue, como sejam os factores IX ou VIIIc, eglina, como seja eglina C, dessulfato-hirudina, como seja a variante HV1, HV2 ou PA de dessulfato-hirudina ou superóxido dismutase humana. São preferidos os genes codificadores de interferão=/ humano ou interferão híbrido, activador do plasminogénio tipo tecido humano (t-PA), antigénio de superfície do vírus da hepatite B (HBVsAg), factor de crescimento tipo insalina I, eglina C e dessulfato-hirudina, e.g. variante HV1. Nos vectores híbridos do presente invento, o presente promotor e/ou sequência sinal está operacionalmente ligado à região codificadora do polipeptídeo de modo a assegurar a expressão eficaz do polipeptídeo.

As moléculas de DNA do presente invento podem conter marcas selectivas dependendo do hospedeiro a ser transformado, seleccionado e clonado. Pode ser usado qualquer marca genética que facilite a selecção de transformantes devido à expressão fenotípica da marca. São particularmente adequadas as que expressem resistência a antibióticos, e.g. resistência à tetraciclina ou ampicilina ou no caso de mutantes de levedura auxotróficos, genes que complementem as lesões do hospedeiro. Os genes correspondentes conferem, por exemplo, resistência ao antibiótico ciclo-heximida ou proporcionam prototrofia num mutante de levedura auxotrófico,por exemplo o gene ura3, leu2, his3 ou trpl. È também possível empregar com marcas genes estruturadores que estejam associados a um segmento de replicação autónoma

desde que o hospedeiro a ser transformado seja auxotrófico para o produto expresso pela marca.

São de particular importância as marcas genéticas que complementam lesões do hospedeiro A. niger, como seja o gene argB codificador da ornitina carbamoil transferase, e.g. derivado de fragmentos de DNA de h_. niger ou A. nidulans (EP 184 438) ou de A. nidulans homológos do gene pyr4 de N. crassa (26).

As execuções preferidas do presente invento são vectores híbridos em que o gene estrutural, especialmente o gene estrutural estranho é operacionalmente ligado ao promotor e seguências sinal do presente invento. Tais vectores híbridos preferidos são e.g. pCG3Bll, M13 mpl8-PL (Sall-EcoRI) BssHII/BES, pUBE5, pLHK3, pLHL5 e pLHLT7. Outros vectores híbridos úteis são pPL29-5 e pPL35-5 (ver Exemplos e Figuras).

DNA da fórmula I e seus derivados, incluindo fragmentos podem ser usados para rastreio de bancos de DNA de genes ou mRNA relativamente a DNAs ou mRNAs semelhantes.

Processo para a preparação de moléculas de DNA recombinante invento diz respeito também a um processo para a preparação de uma molécula de DNA recombinante codificadora de um sistema de expressão da pectina liase ou um seu derivado, compreendendo cultura de um hospedeiro transformado com uma molécula de DNA contendo uma sequência de DNA codificadora do sistema de expressão da pectina liase ou um seu derivado e isolamento da molécula de DNA recombinante pretendida ou o seu derivado ou preparação da referida molécula por síntese in vitro.

A cultura dos hospedeiros é efectuada num meio nutritivo convencional que pode ser suplementado ou privado de compostos químicos que permitam selecção negativa ou positiva dos transformantes, i.e. os referidos hospedeiros contendo a molécula de DNA pretendida juntamente com uma marca selectiva, de entre os não-transformantes, i.e. os referidos hospedeiros sem a molécula de DNA pretendida .

Podem ser usados quaisquer hospedeiros transformáveis úteis no ramo, e.g. bactérias, tais como

E. coli, fungos, tais como Saccharomyces cerevisiae, ou em particular fungos filamentosos, tais como Aspergillus, e.g. A. nidulans, A. oryzae, A. carbonarius, A. awamori e especialmente A. niger. Um hospedeiro preferido é _A. niger An8, um novo mutante sem o gene pyrA, conforme descrito abaixo. A transformação dos hospedeiros é efectuada segundo métodos convencionais.

A sequência do DNA codificadora do sistema de expressão PL é obtida a partir de fungos filamentosos contendo tal sistema, em particular a partir de uma biblioteca genómica dos referidos fungos ou também via mRNA.

A seguir descreve-se mais detalhadamente a preparação do sistema de expressão de PLI.

Um biblioteca genómica pode ser preparada e.g. por digestão parcial do DNA genómico de uma estirpe de A. niger, e.g. N756, com Sau3AÍ e clonagem dos fragmentos de DNA de alto peso molecular no plasmídeo pUN121 de E. coli. Qualquer outra estirpe de A. niger produtora de PLI pode servir como fonte da biblioteca genómica e igualmente podem ser usados outros vectores adequados como recipientes dos fragmentos.

Para se fazer um despiste bem sucedido

da biblioteca genómica relativamente a sequências de DNA codificadoras de PLI, foi necessária a determinação de sequências desta enzima ou partes dela. PLI foi purificada a partir de uma mistura comercial de enzimas pectinolíticas de A. niger (Ultrazym® Novo Industries) e sequênciada. O extremo N de PLI madura apresentou a sequência

I

V₁G-V-X₄-G-T₆-P-E-G-F-A, e um fragmento de PLI, obtido por divisão de PLI com brometo de cianogénio, revelou a sequência N-terminal

I ^V129-S-^G-^V-S-N-^I-^I-I-Q-N-I-A-V-^X143-^D-^I-N-^X147-E, em que os aminoácidos X naquela altura não tinham sido identificados .

Com base naquelas sequências de aminoácidos uma série de sondas de DNA, i.e. misturas de sequências de DNA codificando partes das sequências de aminoácidos e as correspondentes sequências de DNA degenerados, foram sintetizados quimicamente e usados no despiste. Tais sondas de DNA são por exemplo as misturas das fórmulas

3'TGR₁GGR₁CTR₂CCR₃AAR₃CG5' (2014) (la) ou • 3'TGR^GGR^CTRgCCRgAARgCG5¹ (2015) (Ib) _! em que é A, C, G ou T, R₂ é C ou T e Rg é A ou G ou mistura de DNA 2060 da fórmula

5'AAR₁ATR₂ATR₂ATR₂CAR₃A3' (2060) (Ic) em que R^ é A ou T, R₂ é A, T ou C e Rg é A ou G.

Uma vez que no decurso deste trabalho ficou conhecida toda a sequência de DNA do gene PLI, qual18-

quer parte dele tendo pelo menos cerca de 14 pb pode agora ser usada no despiste, que inclui também o despiste de mRNA codificador do sistema PL.

Para fins de despiste as sondas de DNA são marcadas radioactivamente no extremo 5' por métodos con) hecidos usando γ32_ρ__ΑΤρ _{e c}i_anse d_e t4 . Os microorganismos hospedeiros portadores dos ácidos nucleicos do presente invento como inserção, são identificados por hibridação com a sonda de DNA marcada de réplicas em filtro da biblioteca de ^f genes.

I

Para obtenção de uma sub-biblioteca, clones da biblioteca, apresentando uma resposta radioactiva à sonda de DNA marcada radioactivamente codificadora do extremo N de pCI podem ser isolados, cultivados e hibridados com a segunda sonda de DNA codificadora dos aminoâcidos N-terminais do fragmento obtido com CNBr, conforme anteriormente descrito.

Isolaram-se e ampliaram-se os clones que mostraram uma resposta de hibridação a uma ou a ambas as sondas de DNA.

Por exemplo, o despiste com as sondas de DNA 2014 e 2015 revelou 33 e 39 clones positivos, respectivamente. Os 72 clones foram amplificados e as sub-bibliotècas obtidas foram testadas novamente com a sonda de DNA 2060 pelo que puderam ser identificados 3 clones positivos. Seleccionou-se um clone e designou-se E. coli BJ 5183/ /pCG3Bll. Ele contem o plasmídeo pCG3Bll do qual se mostra na Figura 1 um mapa de restrição parcial. 0 fragmento Sau3Al de pCG3Bll compreende o fragmento Spel-Nhel mostrado na Figura 4 e fórmula I.

O plasmídeo pCG3Bll pode ser usado para a construção de outras moléculas de DNA do invento através

da aplicação de técnicas convencionais de engenharia genética .

Por exemplo, o corte de pCG3Bll com a enzima de restrição EcoRI e clonagem dos dois fragmentos no plasmídeo pUN121 conduz ao plasmídeo pPL29-5 (Fig. 2) contendo o promotor, a sequência sinal e a partir do gene estrutural de PLI até ao sítio de restrição EcoRI central na posição 649/650 e ao plasmídeo pPL-35-5- (Fig. 3) contendo parte do gene, estrutural de PL5 começando na posição 650 e o terminador. pPL29-5 contem ainda as sequências delimitantes N-terminais e pPL35-5 as sequências delimitantes C-terminais de pCG-3Bll.

Fragmentos das inserções dos plasmídeos pPL-29-5- e pPL35-5 podem ser obtidos para sequênciação por restrição com enzimas adequadas, tais como AhalII, Pstí, Aval HindIII, EcoRI, Kpnl, Ciai, NcoI, Accl, SalII, Pvul, Sall, Nhel, Bgll, EcoRI, e EcoRV. Os fragmentos podem ser subclonados, e.g. em diferentes fagos M13, de preferência M13 mp8 e M13 mpl8, e sequênciados e.g. usando οM13 Cloning and Sequencing Kit (M13 Sequencing Kit N° 4502, Amersham) nas condições descritas pelo fornecedor (16). Toda a sequência do fragmento Spel-Nhel de 2,7 kb, compreendendo a sequência completa do gene PLI está apresentada na Figura 4. Compreende 688 nucleotídeos da região do promotor, 1369 nucleotídeos da parte estrutural do gene PLI e 661 nucleotídeos da região terminadora. A sequência de pPC29-5, corrrespondendo à sequência de aminoácidos do extremo N de PLI conforme determinado pela análise da sequência de aminoácidos (Exemplo 1) é precedida de 57 nucleotídeos codificadores do peptídeo sinal da fórmula

M -K-Y-A-A-A-L-T-A-I-A-A-L-A-A-R-A-A-A_c_ o /

A sequência de aminoácidos do extremo N do fragmento C-terminal da clivagem de PLI com CNBr (Exem-20-

plo 3) não é codificada contínuamente pelo fragmento de DNA clonado de pPL35-5 (nucleotídeo 1257-1376). Uma pesquisa, com o auxílio de computador, das sequências consensus das junções de splicing exão/intrão assim como as sequências internas do intrão (Boel E. et al. (18) e Mount S.M. (19)) levou-nos a postular a presença de quatro intrões com o comprimento de 65 pb, 62 pb, 63 pb e 57 pb respectivamente (Fig. 4) .

Um fago obtido a partir dos fagos M13mp8 e o fragmento SalI-EcoRI de 0,8 kb de plasmídeo pPL29-5 contendo 130 nucleotídeos do promotor e a parte N-terminal do gene PLI, foi designado M13mp8 (SalI-EcoRI) e foi usado noutros passos posteriores para a preparação de outras moléculas de DNA do invento.

Tais outras moléculas de DNA do invento compreendendo fragmentos da seguência de DNA com a fórmula I podem ser construídas conforme descrito nas Figuras 5 a 9, pelo que, quando se pretende, podem ser introduzidos novos sítios de restrição, e.g. um sítio de restrição BssHII dentro da sequência sinal do gene PLI. Tais moléculas de DNA são os plasmídeos ou fagos, respectivamente, pUBE5, MBmp8-PL(SalI-EcoRI/Bss+III/BE5 (Figura 5), pLHK3 (Fig. 7), pLHL5, M13mpl8-PL(Spel-EcoRI)BssHII/ACS pLHLT7 (Fig. 9), dos quais os três últimos plasmídeos contêm o gene estrutural codificador da dessulfato-hirudina.

Mutantes contendo novos sítios de restrição podem ser preparados, por exemplo, por mutagénese dirigida in vitro, seguindo métodos convencionais / ver artigo de revisão de M.J. Zoller e M. Smith, Methods Enzymol. 100, 468 (1983 ), D. Botstein e D. Shortle, Science 229; 1193 (1985) ou K. Norris et al. , Nucl. Acids Res. 11, 5103 (198327

Por exemplo, um mutante das presentes sequências de DNA é derivado do fago M13mp8PL(SalI-EcoRI)

que compreende o promotor e a sequência sinal de secreção do gene de PLI. A introdução de um novo sítio BssHII na região da sequência sinal do gene M13mp8PL(Sal-EcoRI) é efectuada usando um oligonucleotídeo iniciador obtido por síntese química que é complementar da sequência de DNA nas posições 36-54 situadas perto da parte C-terminal da sequên) cia sinal de PLI, exceptuando na posição 45 onde foi introduzida uma transversão C/G (iniciador mutagénico).

fago mutante portador do novo sítio j BssHII é designado por M13mp8PL(Sal-EcoRI)BssHII e pode ser

I usado para a construção de vectores de expressão para genes homólogos ou heterólogos.

Num exemplo correspondente o gene da dessulfato-hirudina de pML310 (EP 168 342) é reclonado no fago M13mpl8-PL(Spal-EcoRI)BssHII/AC5 (Fig. 6 a 9). Construiu-se um adaptador Hgal/BssHII para tornar o sítio de restrição de Hgal do gene da dessulfato-hirudina de pML301L compatível com o sítio BssHII de M13mpl8-PL(SpeI-EcoRI)BssHII/ /AC5. 0 DNA adaptador é ligado ao DNA fágico clivado. Cliva-se o DNA fágico portador do fragmento adaptador com HindlII que dá dois fragmentos. Isola-se o fragmento de 0,7 kb, comI

I preendendo a estrutura sinal de PLI e o fragmento adaptador.

Cliva-se com BamHI um plasmídeo de replicação adequado portador de um sítio de restrição BamHI, como seja o pBR322. O que a ser clonado é retirado do DNA genómico por clivagem, o plasmídeo ou DNA fágico é cortado com enzimas de restrição ! adequadas e, se necessário, é provido dos sítios de restrição compatíveis necessários.

Um outro método para tornar os sítios de restrição compatíveis é a mutagénese in vitro como por exemplo efectuada pela construção de pML301L (fig. 6). Constrói-se um sítio de restrição Hgal e liga-se ao extremo 5' do gene da dessulfato-hirudina.

Para níveis de expressão elevados, qualquer terminador eucariótico pode ser ligado ao extremo 3’ do gene estrutural. Numa execução preferida do invento usa-se a região do terminador do gene PLI. Por exemplo um vector de expressão compreendendo o sítio terminador de PLI pode ser obtido por modificação do processo acima descrito como se segue. 0 promotor e a sequência sinal de secreção são obtidos a partir do plasmídeo M13mpl8-PL(Spel-EcoRI) BSSHII/AC5. A região do terminador é obtida a partir de pPL35-5. Cliva-se M13mpl8-PL(Spel-EcoRI)BssHII/AC5 com BssHII e liga-se num adaptador BssHII-Hgal. Em modificação, o plasmídeo pPL35-5 é clivado com PstI, o que dá dois fragmentos aos quais de novo se liga um adaptador adequado, compatível com o extremo 3' do gene clonado. Os extremos coesivos dos sítios de restrição PstI são preenchidos pela enzima Polimerase T4 e adiciona-se um novo adaptador BamHI, por exemplo que se pode adquirir a Biolabs, New England. O plasmídeo pPL35-5 é clivado com Nhel e o fragmento resultante de 0,7 kb, compreendendo a região do terminador de PLI, é isolada. Para amplificação pode ser usado qualquer plasmídeo tendo sítios de restrição compatíveis, e.g. pUC18. No caso de pUC18, o plasmídeo é clivado com HindIIIe Xbal. Quatro fragmentos de DNA, o fragmento de M13mpl8-PL( Spel-EcoRI )BssHII/AC5, portador do adaptador BssHII-Hgal, o fragmento de 0,7 kb do pPL35-5, portador do adaptador BamHI, pUC18 clivado com HindIII/Xbal e o fragmento Hgal-BamHI do gene da dessulfato-hirudina, são ligados para formar pLHL7 (Fig. 9).

As bactérias são transformadas segundo um método convencional e os transformantes identificados pela sua resistência, e.g. contra a tetraciclina.

Em particular os vectores de expressão descritos são amplificados em estirpes hospedeiras adequadas de E. coli, como seja HB101, transformados (10) e seleccionados por métodos convencionais. O DNA de plasmídeo amplificado é isolado a partir de bactérias por métodos con-23-

vencionais, em particular como descrito por Birnboim & Doly (17).

De modo semelhante podem ser construídos outros plasmídeos com outros genes homólogos ou heterólogos.

As moléculas de DNA do presente invento podem igualmente ser preparadas por síntese in vitro segundo métodos convencionais. A síntese in vitro é especialmente aplicável à preparação dos fragmentos mais pequenos do sistema de expressão de PL, e.g. das sequências de DNA codificadoras do promotor ou especialmente da sequência sinal de PLI ou seus mutantes.

As moléculas de DNA do invento compreendem o promotor PLI e facultativamente a sequência sinal de PLI, ogene estrutural de PLI, qualquer outro gene estrutural heterólogo e/ou o terminador de PLI podem também ser usados para transformar fungos filamentosos, tais como Aspergillus, Penicillium ou Cephalosporium, e.g. A. nidulans, A. oryzae, A. carbonarius e especialmente A. niger.

Para permitir a selecção dos fungos transformados de entre os não transformados, as moléculas de DNA do invento são portadoras de uma marca selectiva ou, como alternativa, os fungos são cotransformados com um segundo vector contendo tal marca. Como noutros sistemas tal marca selectiva é um gene estrutural expressável, o polipeptídeo expresso que quando enzima proporciona resistência do transformante contra compostos tóxicos ou completa o sistema enzimático de um mutante que não contenha o polipeptídeo essencial. Tais marcas são por exemplo os genes conhecidos qa-2, pyrG, pyr4, trpC, amd cí ou argB.

Dentro da linha do invento um gene de uma nova marca, designado pyrA, foi isolado a partir da bi-24-

blioteca genómica de A. niger, a qual está relacionada e tem uma função semelhante a pyrG de A. nidulans e a pyr4 de N. crassa, nomeadamente produtos da enzima orotidina 5'-fosfato descarboxilase. Esta enzima catalisa a descarboxilação de orotidino 5'-fosfato em ácido uridilico (uridina 5'-fosfato) e também o ácido fluoro-orótico na fluoro-uridina tóxica. Um clone de E. coli contendo o gene pyrA foi identificado por hibridação com o fragmento HindIII de 1,1 kb do pDJB2 (26) contendo parte do gene pyr4, no entanto pode ser usado o DNA de qualquer outro gene pyr codificador de orotidina-5'-fosfato descarboxilase. A partir de um clone positivo designado E. coli B75183/pCG59D7, isolou-se o plasmídeo pCG59D7 compreendendo o gene pyrA e usou-se para cotransformação de um mutante pyrA de A. niger. Tal mutante pyrA^- é defectivo para o gene orotidina 5'-fosfato descarboxilase portanto incapaz de produzir a enzima correspondente. Tal mutante foi preparado por tratamento de conidiósporos de A. niger N756 com radiação UV mutagenizante e seleccionadas as colónias sobreviventes na presença de ácido fluoro-orótico e uridina. Eliminaram-se as colónias sobreviventes na presença do ácido fluoro-orótico e ausência de uridina. Os restantes mutantes dependentes de uridina, de acordo com a sua capacidade para serem transformados, pertencem a dois grupos de complementação pyrA e pyrB, representados pelos mutantes An8 e AnlO respectivamente. Eles são tratados na forma de protoplastos e em condições de transformação com o plasmídeo pCG59D7 contendo pyrA. Apenas as colónias An8 se verificou serem transformadas e conterem o gene pyrA conforme evidênciado pela capacidade de hibridação do seu DNA digerido com DNA de pUN121.

invento diz também respeito ao plasmídeo pCG59D7 contendo a marca selectiva, a um hospedeiro que o possua, e ao mutante pyrA An8 de A. niger e processos para a sua preparação.

invento diz respeito ainda a hospe-25-

deiros transformados com os vectores híbridos do invento e métodos para a sua preparação. Tais transformantes são por exemplo bactérias tais como E. coli, ou fungos filamentosos, tais como Aspergillus, Penicillium ou Cephalosporium e em particular A. nidulans, A. oryzae, A. carbonarius ou de preferência A. niger, e.g. A. niger An8. 0 invento diz respeito a um método para a preparação de tais transformantes compreendendo tratamento de um hospedeiro em condições de trans formação com uma molécula de DNA recombinante, especialmente um vector híbrido, do invento, facultativamente juntamente com um gene de marca selectiva e selecção dos transformantes .

invento diz também respeito a uso de DNAs recombinantes ou seus derivados na preparação de vectores híbridos que expressem polipeptídeos úteis, e.g. PLI, dessulfato-hirudina e similares.

invento diz ainda respeito a um método para a preparação de polipeptídeos, caracterizado por um vector híbrido do invento ser expresso num hospedeiro adequado e o polipeptídeo ser isolado por métodos convencionais. Este método compreende a super-produção de PLI em espécies de Aspergillus por cultura de um hospedeiro Aspergillus transformado com um vector híbrido de expressão para a expressão e secreção de PLI e colheita de pLI a partir do meio nutritivo.

Descrição Resumida das Figuras

Figura 1 mostra o mapa de restrição do plasmídeo pCG3Bll contendo um fragmento Sau3AI da estirpe N756 de A. niger.

Figura 2 mostra o mapa de restrição do plasmídeo pPL29-5 contendo o fragmento EcoRI N-terminal do

DNA da fórmula I.

Figura 3 mostra o mapa de restrição do plasmídeo pPL35-5 contendo o fragmento EcoRI C-terminal do DNA da fórmula I.

Figura 4 mostrou o DNA da fórmula (I), com indicações de alguns sítios de restrição e as sequências de aminoácidos sinal e estrutural de PLI.

₍ Figura 5 mostra a construção de pUBE5 a partir de M13mp8-PL(SalI-EcoRI)BssHII/BE5 e pUN121. pUBE5 contem parte do promotor PLI, a sequência sinal com o sítio de restrição BssHII e parte do gene estrutural de PLI.

Figura 6 mostra a construção de pML310L contendo o gene da dessulfato-hirudina.

Figura 7 mostra a construção de pLHK3 contendo parte do promotor PLI, a sequência’sinal com o sítio de restrição BssHII, o adaptador BssHII-Hgal e o gene da dessulfato-hirudina.

| Figura 8 mostra a construção de pLHL5 contendo o promotor PLI, a sequência sinal com o sítio de restrição BssHII e o gene da dessulfato-hirudina.

Figura 9 mostra a construção de pLHLT7 contendo o promotor PLI, a sequência sinal com o sítio de I restrição BssHII, o gene da dessulfato-hirudina e o terminador PLI.

Os exemplos que se seguem servem para ilustrar o invento, no entanto não pretendem de modo algum restringi^lo.

As abreviaturas têm os seguintes significados bp pares de bases

BSA albumina do soro bovina cpm contagem por minuto (decaimento radioactivo) dATP 2¹-desoxiadenosina trifosfato dCTP 2¹-desoxitidina trifosfato dGTP 2'-desoxiguanosina trifosfato dTTP 2¹-desoxitimidina trifosfato dNTP mistura de dATP, dCTP, dGTP e dTTP

CIAP fosfatase alcalina de intestino de vitela

DNA ácido desoxirribonucleico

DTT 1,4-ditiotreitol

EDTA ácido etilenodiaminotetraacético, sal di-sódico hrs horas

IPTG isopropil- ^>-D-tio-galactopiranosido kb kilobases min minutos

PL pectina liase I

PTH feniltio-hidantoina

RF-DNA DNA forma replicativa de cadeia dupla

RNA ácido ribonucleico rpm revoluções por minuto

SDS dodecilsulfato de sódio ss cadeia simples

RT temperatura ambiente

Tris tris(hidroximetil)-aminometano tRNA RNA de transferência

U unidades ug micrograma vol volume

X-GAL 5-bromo-4-cloro-3-indonil- (l>-galactosido

-28Tampões, meios, reagentes:

ss-Denhardt

0,02% ficol (Sigma), 0,02% polivinilpirrolidona (Sigma), 0,02% BSA (Sigma), 100 ^ug/ml de DNA de esperma de salmão desnaturado (Sigma) tampão EcoRI tampão Hgal

IPTG

0,01M Tris HC1 pH 7,5, 0,lM NaCl, 0,01M

MgClg. 1 mM 2-mercaptoetanol mM NaCl, 10 mM MgClg, 1 mM DTT, 100 ^ig/ml BSA, 6 mM Tris-HCl pH 7,4

100 mM isopropil-/} -D-tio-galactopiramosido (23,8 mg/ml em HgO) preparar imediatamente antes de usar meio LB tampão de ligação tampão TBE tampão TE tampão TE baixo agar de topo meio 2xtY

X-GAL meio SOC

1% Bacto-triptona (Difco), 0,5% extracto de levedura Bacto (Difco), 170 mM NaCl, ajustado a pH 7,5 com NaOH.

mM Tris-HCl, 10 mM MgClg, 10 mM ditiotreitol, 0,6 mM ATP, pH 7,6.

litro contem 10,8 g de Tris, 5,5 g de ácido bórico, 4 ml de 0,5M EDTA (pH 8,0) mM Tris-HCl (pH 7,5), 1 mM EDTA mM Tris-HCl (pH 7,5), 0,1 mM EDTA por litro 10 g de bacto-triptona, 8 g de NaCl, 8 g de agar por litro 16 g de bacto-triptona, 10 g de extracto de levedura, 5 g de NaCl

2% de 5-bromo-4-cloro-3-indonil- β-galactosido em dimetilformamida preparado imediatamente antes de usar

2% Bacto-triptona (Gibco), 0,5% de extracto de levedura (Gibco), 10 mM NaCl,

2,5 mM KC1, 10 mM MgClg, 5 mM MgSO^, mM glucose

tampão cinase	50 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl2, 5 mM DDT (pH 7,5)
placas X-gal	0,02% X-GAL, 0,07 mM IPTG
NET	0,15 NaCl, 0,015M Tris-HCl (pH 7,5) 1 mM EDTA
meio mínimo	0,6% Na2HPO4, 0,1% NH4C1, 0,05% NaCl,
para E. coli	1 mM MgSO4, 0,01 mM CaCl2, 1 mM tiami-
- 7 ;'	na-HCl, 0,2% de glucose
meio mínimo	1 litro contem 6 g de NaNO^, 0,52 g de
para A. niger	KC1, 0,52 g de MgSO4 x 7 H2O, 1,52 g de KH2PO4, vectigios de Zn, Fe, 10 g de glucose, ajustado a pH 6,5 com NaOH
meio completo para A. niger	Agar Mycophil (BBL)
PCT	25% de polietilenoglicol 6000 (Merck, Darmotadt) em 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 50 mM CaCl2
meio de	10 g/1 de fitona peptona, 10 g/1 de
esporulação	glicose, 10 g/1 de agar
SSC	0,15M NaCl, 0,015M citrato de sódio

Para as placas todos os meios são solidificados pela adição de 1,5% de agar Bacto (Difco).

Usaram-se as seguintes estirpes:

E. coli estirpe HB101: F~ hsdS20(r~m-B) recA13, aral4, ^K r b— -proA2, lacYl, galK2, rpsL20 (str ), Xyl-5, mtl-1, supE44,

Jo (Maniatis et al. (8)).

E. coli estirpe BJ5183: F^-, endA, sbcB~, recBc~, galK, met~, str^R, thi-1, bioT, hsdR(r , m_K ⁺ ), (Hanahan (10)).

E. coli estirpe JM101: supE, thi, Λ (lac-proAB), (F¹ , tra D36,

-30proAB, lac!9Z M15) (Yamish-Perron et al. (25)).

Aspergillus niger estirpe N756: A estirpe N756 de A. niger foi seleccionada relativamente a produção elevada de enzimas do complexo pectinolítico.

Usaram-se os seguintes vectores:

Fago M13mp

Os vectores M13mp 8, 9, 18, 19 (28) são derivados do bacteriófago M13 de DNA de cadeia simples e destinam-se a facilitar a sequênciação de DNA permitindo a clonagem de fragmentos de DNA num sítio poliadaptador versátil e a clonagem do mesmo fragmento de restrição em ambas as orientações possíveis. As sequências clonadas nestes vectores podem ser fácilmente usadas como moldes para reacções de sequênciação ou na produção de sondas de cadeia simples usando umoligodesoxirribonucleótídeo iniciador e o fragmento Klenow da DNA polimerase I de E. coli. O DNA vector é portador do promotor do operão lac de E. coli e da informação genética para os primeiros 145 aminoácidos da β -galactosidase. As sequências de poliadaptador contendo múltiplos sítios de restrição são inseridos na sequência de lacZ. O poliadaptador retem a grelha de leitura de lacZ e o vector dá complementação alélila de uma estirpe LacZ , dando placas azuis em placas contendo IPTG e X-gal. Os fagos recombinantes contendo inserções que destroem a grelha de leitura ou que de outro modo interfiram com a expressão do peptídeo lacZo< surgem como placas incolores.

plasmídeos pUC18

O plasmídeo pUC18 (28) pode ser usado para clonagem de sequências de DNA na região lacZ proporcionando uma detecção de transformantes contendo plasmídeos recombinantes com base no seu fenfipo Lac. As bactérias por tadoras de plasmideos sem inserções fazem colónias azuis em placas indicadoras (placas com X-gal) enquanto que as portadoras de plasmideos recombinantes fazem colónias brancas. 0 plasmídeo pUC18 contem sítios únicos de clonagem na região lacZ 0< que condizem com os do fàgo M13mpl8. 0 plas,, · R rnideo possui um gene para amp .

plasmídeo pML310 pML310 está descrito no Pedido de Patente Europeia N2 0168342, pML310 é caracterizado por amp , o promtor trp e um gene codificador da dessulfato-hirudina, um inibidor da trombina que ocorre naturalmente nas sanguessugas .

plasmídeo pUN121 plasmídeo pUN121 /(Nilson et al.(9)7 pode ser usado como vector de clonagem que permite selecção positiva de transformantes portadores de plasmideos com inserções de DNA. O plasmídeo contem o gene Cl do bacteriófago lambda e o gene tet. As bactérias portadoras de pUN121 são sensíveis à tetraciclina uma vez que o gene tet é transcrito a partir do promotor directo do bacteriófago lambda e este promotor pode ser reprimido pelo repressor codificado por Cl. A inserção de fragmentos'de DNA num dos sítios no gene Cl inactiva o gene repressor, dando transformantes resistentes à tetraciclina. Em adição o plasmídeo pLJN121 tem um gene amp funcional de modo que a amplificação do DNA de plasmídeo pode ser feita sob condições selectivas.

plasmídeo pBR322

O plasmídeo pBR322 possui genes para a resisitência aos antibióticos ampicilina (amp ) e tetracicli na (tet ). O plasmídeo possui vários sítios únicos de clonagem, dos quais alguns estão situados no gene amp ou tet de

modo a que a inserção de DNA clonado conduz a bactérias sensíveis a antibióticos.

plasmídeo pDJB2

Este plasmídeo foi descrito por Ballan) ce e Turner (26).

Exemplo 1: Isolamento e caracterização de pectina liasel

Exemplo 1.1: Determinação da sequência de aminoácidos da parte N-terminal da pectina liase I

A pectina liase I é purificada a partir de Ultrazym^ (uma mistura de enzimas pectinolíticas obtidas a partir de A. niger, Novo Industries, Copenhagen) em analogia com o método descrito por F.E.A. van Houdenhouver (1). Duas mg de pectina liase I são dialisadas contra vários litros de água destilada e liofilizada subsequentemente. A proteína é dissolvida em 1,5 ml de 100 mM NaHCOg, pH 10,0 e mantida à temperatura ambiente durante 3 hrs. Este tratamento tem a finalidade de aumentar o número de passos que podem ser reprodutivelmente sequênciados pelo método de degradação automática de Edmam (2). Após o tratamento alcalino a proteína é dialisada contra 1 litro de água destilada, 1% de ácido fórmico e água destilada subsequentemente. A degradação automática de Edman é efectuada num sequênciador Beckman de copo giratório modelo 890C. A proteína intacta reduzida e carboximetilada é designada usando um programa quadrol de clivagem simples (modificação do programa Beckman 072172C). A degradação do peptídeo é efectuada usando um programa de clivagem simples com dimetilbenzilamina (programa Beckamn 082773) ou o programa de Hunkapiller e Hood. Para evitar a remoção do peptídeo na lavagem usa-se 2,5 mg de parvalbumina de bacalhau como veículo (3). Os derivados

feniltio-hidantoína dos aminoácidos são identificados por cromatografia líquida de alta resolução de acordo com o método de Frank e Strubert (4). Determinou-se a sequência de aminoácidos N-terminal da pectina liase I que se segue:

v_g-v-x₄-g-t-p-e-g-f-a aminoácido X₄ é provávelmente ser mas a sua presença não foi estabelecida sem ambiguidade.

Exemplo 1.2: Preparação de fragmentos de pectina liase I usando brometo de cianogénio.

A redução e S-carboximetilação da pectina liase I fez-se de acordo com Crestfield et al. (5). Dissolveu-se 3 g de ureia (ultra pura) em 5 ml de água destilada e agitou-se durante 1 h com 0,5 g de um permutador de iões de leite misto (Biorad Ag 50 1-X8). Após remoção das partículas de permuta ionica, adicionou-se 10 mg de EDTA e 200 mg de Tris a 4 ml de solução de ureia e ajustou-se o pH a 8,5 com HC1. A solução foi completada para um volume final de 5 ml num frasco com água destilada. Em seguida adicionou-se 5-20 mg de pectina liase I purificada como descrito por F.E.A. van Houdeshoven (1) e o frasco mantido sob uma barreira de azoto.

Finalmente juntou-se 33 jj.1 de β -mercaptoetanol e a redução continuou durante 4 hrs à temperatura ambiente sob uma barreira de azoto. Ainda em azoto adiciona-se 0,33 ml de uma solução preparada de fresco (0,268 g de ácido iodoacético em 1 ml de 1N NaOH) à mistura de reacção e a mistura é mantida no escuro durante 15 min à temperatura ambiente.

A reacção é parada pela adição de β -mercaptoetanol. Subsequentemente a proteína carboximetila-34-

da é aplicada a uma coluna de filtração em gel de Sephadex G-25 (100 ml de volume de leito) que é envolvida em folha de alumínio e eluida com 0,5% de ácido fórmico. As fracções de proteína são reunidas e liofilizadas.

A pectina liase I carboximetilada (2-10 mg) é dissolvida em 70% de ácido fórmico e adiciona-se brometo de cianogénio sólido, num excesso molar de aproximadamente cem vezes relativamente à metionina da qual ocorre o resíduo por pectina liase I. Agita-se continuamente a mistura de reacção durante 24 hes à temperatura ambiente num vaso de reacção fechado. Retiraram-se amostras de 5 H¹ em intervalos de tempo regulares e analisaram-se em 15% SDS-PAGE para verificar o grau de clivagem da proteína. Após 24 hrs adicionou-se água e a preparação foi parcialmente evaporada injectando azoto. Este passo é repetido para remover o ácido fórmico.

A análise por SDS-PAGE identifica, além de alguma pectina liase I residual, dois peptídeos de brometo de cianogénio, CBI e CBII com pesos moleculares aparentes de 16,5 KD. A purificação destes fragmentos é efectuada por cromatografia de permeação em gel usando uma coluna de Sephacryl-S200 (comprimento 190 cm, 0 1 cm) equilibrada em tampão fosfato de sódio 20 mM pH 6,0, 100 mM NaCl, ureia 4M e 1% (v/v) de β> -mercaptoetanol. O fragmento CBII surge em dois picos, um pico eluido mesmo antes da proteína intacta residual que portanto deve representar um agregado e um outro pico entre a proteína intacta e o fragmento pequeno CBI.

Exemplo 1.3:

Determinação da sequência de aminoácidos da parte N-terminal de CBII da pectina liase I

Usaram-se 200 ug do fragmento CBII não agregado purificado do Exemplo 1.2 para as degradações au-35-

tomáticas de Edman (2) usando um sequênciador Beckman de copo cilíndrico goratório. A conversão dos aminoácidos PTH é analisada após evaporação das fracções e adição de 200 pl de HC1 em metanol ao resíduo durante 15 min. a 65°C. A solução é então novamente evaporada e o resíduo suspenso em 50 |il de THF/CH^CN (1:1). Os aminoácidos PTH são identificados

I por HPLC usando uma coluna Zorbax CbF^ (Du Pont) de acordo com R. Knecht et al. (6).

A sequência de aminoácidos N-terminal de CBII é a seguinte:

I V-S-G-V-S-N-I-I-I-Q-N-I-A-V-X_{n C}-D-I-N-X. _Q-E

19 ^X15 ^{e X}19 ^sã° resíduos de aminoácidos que não foram identificados .

Exemplo 2: Construção de uma biblioteca genómica de Aspergillus niger

Exemplo 2.1: Isolamento de DNA de alto peso molecular a partir de Aspergillus niger

O isolamento de DNA de alto peso molecular de A. niger é feito de acordo com Yelton et al. (7). Os conidiósporos da estirpe N756 de A. niger são inoculados em 200 ml de meio mínimo contendo 0,1% de arginina e agitados em frascos de 500 ml com um poço a 28°C num agitador rotativo durante 2-3 dias. Colhe-se o núcleo por filtração, lava-se com água estéril fria, congela-se e reduz-se a pó em azoto líquido. As células são rápidamente suspensas em 20 ml de 50 mM EDTA pH 8,5, 0,2% de SDS e 20 jil de dietilpirocarbonato e lisados por agitação vigorosa durante 1 min. à temperatura ambiente. O lisado é aquecido a 68°C durante 15 min., arrefecido até à temperatura ambiente e centrifugado durante 15 min. a 12000 g à temperatura ambiente. Trans-36-

feriu-se para um novo tubo 16 ml do sobrenadante e após adição de 1 ml de acetato de potássio 8M pH 4,2 deixou-se em gelo durante 1 h. 0 precipitado foi centrifugado a 25000 g durante 15 min. a 4°C. Recuperou-se 12 ml do sobrenadante e precipitaram-se os ácidos nucleicos com 12 ml de isopropanol. Sedimentou-se o precipitado por centrifugação duran) te 1,5 min. a 12000 g e o sedimento foi ressuspenso em 2 ml de TE contendo 10 pg/ml de TNAseA (Boehringer, Mannheim). Os fragmentos de DNA são extraídos com clorofórmio/fenol e precipitados com etanol como descrito por Maniatis et al (8) nas páginas 458-459 e 461-462.

I

Exemplo 2.2: Clonagem de fragmentos de DNA de alto peso molecular de Aspergillus niger em pUN121

O DNA de alto peso molecular do Exemplo 2.1 (100 ^pg) foi precipitado por centrifugação e o sedimento ressuspenso em 750 pl de tampão consistindo em Tris-HCl 6 mmoles/1, NaCl 50 mmoles/1, MgClg 6 mmoles/1, pH 7,5. Efectuaram-se digestões parciais com Sau3AI, sendo as concentrações na gama de 0,25-0,01 U/^ig durante 60 min. a 37°C. As reacções terminaram pela adição de EDTA para concentrações finais de 20 mM.

I

Os fragmentos de DNA parcialmente digeridos foram separados num gel de 0,45% de agarose. DNA de lambda digerido com HindIII foi usado como marcador para determinar o tamanho dos fragmentos de DNA parcialmente digeridos . A região do gel contendo os fragmentos pretendidos na gama de 15 kb a 20 kb foi cortada e transferida para o poço de amostra de um concentrador electroforético ISCO (ISCO GmbH), coberto com 0,1 TBE e electroeluido a 1 Watt durante 90 min. Os fragmentos de DNA foram extraídos com clorofórmio/fenol e precipitados com etanol.

Ressuspendeu-se 4 ug dos fragmentos de DNA parcialmente digerido em e ligou-se durante 15 horas

a 15°C com 1 jig de DNA do plasmídeo pUN121 (Nilsson et al.

(9)), linearizou-se com Bcll, num volume total de 106 jil de tampão de ligação com 6U de DNA ligase de T4 (Boehringer, Mannheim). Quantidades de 10 /11 desta mistura de emparelhamento foram adicionadas a 210 p.1 de células competentes de E. coli BJ 5183, as quais foram previamente preparadas.para | transformação como descrito por Hanahan (10). As células foram mantidas em gelo durante 30 minutos e aquecidas a 42°C durante 90 seg., colocadas novamente em gelo durante 2 min., adicionou-se 800 /11 de meio SOC e incubaram-se as células a 37°C durante 1 hr. Emparelharam-se as células numa placa

I de agar de 10 cm contendo meio LB suplementado com 8 mg/1 de tetraciclina (SIGMA). Obtiveram-se cerca de 6000 colónias transformadas caracterizadas pela sua resistência à tetraciclina. A eficácia foi de cerca de 12000 a 20000 colónias resistentes à tetraciclina por /ig de DNA de pUN121.

A análise dos plasmídeos de 11 clones recombinantes escolhidos ao acaso indicou uma inserção de DNA média de 10 kb. Para representar o genoma de A. niger (4,5x10 pb) na biblioteca quase 4 vezes foram repicadas

5360 colónias resistentes à tetraciclina e crescidas individualmente durante a noite em poços de placas de microtituI lação em meio LB suplementado com 8 mg/1 de tetraciclina.

Após incubação adicionou-se glicerol para 50% v/v e as placas de microtitulação foram guardadas a -70°C.

Exemplo 3: Despiste da biblioteca genómica de A. niger para ácidos nucleicos relacionados com PLI

Exemplo 3.1: Preparação de réplicas em filtro da biblioteca

Para o isolamento do gene da pectina liase I a partir da biblioteca de DNA obtida como descrito no Exemplo 2.2, fizeram-se réplicas em filtro das 15360 cé lulas escolhidas de E. coli BJ5183 transformadas seguindo ométodo descrito por Georgen et al. (11). As células foram transferidas de placas de microtitulação para placas de agar suplementado com 8 mg/1 de tetraciclina usando uma impressora e crescidas durante a noite a 37°C. Colocaram-se sobre as colónias papéis de filtro Whatman 541 convenientemente cortados (114x175 mm por 192 clones). Após 2 hrs a 37°C os filtros foram transferidos para placas LB contendo 250 mg/ml de cloranfenicol (Sigma, St. Louis, USA) e incubadas durante a noite a 37°C. Lavaram-se os filtros duas vezes em 0,5M NaOH, duas vezes em 0,5M Tris HCl, pH 7,4, lavaram-se duas vezes em SSC e secaram-se ao ar. As réplicas dos filtros podem ser usados para várias experiências de hibridação cada uma delas precedida dos passos de lavagem referidos atrás.

Exemplo 3.2: Síntese de misturas de oligonucleotídeos

Os oligonucleotídeos para despiste da biblioteca de DNA de A. niger, obtida como descrito no Exemplo 2.2, foram sintetizados correspondendo à sequência de aminoácidos determinada nos Exemplos 1.1 e 1.3 usando o método da fosforamidite (M.H. Caruthers (12), com sintetizador de oligonucleotídeos Applied Biosystem (Modelo 380B).

3.2.1: Síntese de um oligonucleotídeo codificador da parte do extremo N da pectina liase I de Aspergillus niger

O oligonucleotídeo codificador do extremo N da proteína pectina liase I é sintetizado em relação à sua composição em aminoácidos conforme determinado no Exemplo 1.1. Devido à degeneração genética são necessários 256 oligonucleotídeos para englobar todas as possibilidades.

Duas misturas separadas de oligonucleotídeos foram obtidas por síntese química devido a razões técnicas ser necessário reduzir o número de nucleotídeos na

mistura. Ambas contêm 128 oligonucleotídeos diferentes, cada um sendo uma cadeia complementar das cadeias codificadoras da sequência de aminoácidos Τθ-Ρ-Ε-G-F-A^^. No que se segue elas são designadas misturas 2014 e 2015 e são compostas por oligonucleotídeos como se segue:

mistura 2014 3¹TGR₁ GGR_X CTR₂ CCR₃ AAR₃ CG 5' mistura 2015 3' TGR_X GGR_X CTR₂ CCRg AAR₃ CG‘5’ em que é A, C, G ou T, R₂ é C ou T e R₃ é A ou G.

Exemplo 3.2.2: Síntese de um oligonucleotídeo codificador da parte do extremo N do fragmento C-terminal da proteína pectina liase I decomposta por CNBr oligonucleotídeo codificador da parte do extremo N do fragmento C-terminal da proteína pectina liase I decomposta por CNBr foi sintetizado em relação à sua composição em aminoácidos conforme determinado no Exemplo

1.3. Sintetizou-se uma mistura de 108 oligonucleotídeos sen- do uma cadeia complementar das cadeias codificadoras da se quenência

aminoácidos Ν-^^-Ι-ϊ-ΐ-ζλ^θ sendo mistura composta por oligonucleotídeos como se a referida segue:

mistura 2060 5¹AAR^ ATR₂ ATR₂ ATR₂ CAR₃A 3' em que é C ou T, R₂ é A, T ou C e R₃ é A ou G.

Exemplo 3.2.3: Marcação com P das misturas de oligonucleotídeos pmoles de cada uma das misturas de oligonucleotídeos 2014, 2015 e 2060 do Exemplo 3.2.1 e 3.2.2.

— 32 foram marcadas nos extremos 5' usando 50 pmoles de / y P7ATP (Amersham, Buckinghamshire, England, 5000 Ci/mmol). A

incubação efectuou-se a 37°C com 150 unidades de polinucleotídeo cinase de T4 (New England Nuclear) em 500 μΐ de tampão cinase. A reacção de ligação de ATP marcado radioactivamente aos nucleotídeos é detectada fazendo migrar uma amostra de mistura de reacção em gel de 20% de poliacrilamida seguido de autorradiografia.

Exemplo 3.3: Despiste da biblioteca de genes com as misturas de oligonucleotídeos 2014 e 2015 marcados radioactivamente

O despiste da biblioteca de genes-foi efectuado por hibridação com as misturas de oligonucleotídeos marcados radioactivamente 2014 e 2015 do Exemplo 2.2.1. Conjuntos de 20 réplicas em filtro da biblioteca de genes (Exemplo 3.1) foram molhados em 6xNET e pré-hibridados em 800 ml de 6xNET, lxss^Denhardt, 0,1% de SDS a 49,3°C durante 4 horas. Em seguida adicionou-se 67 pmoles da mistura de oligonucleotídeos marcada radioactivamente 2014 e as hibridações foram efectuadas durante a noite a 49,3°C. O mesmo processo foi realizado usando a mistura de oligonucleotídeos marcada radioactivamente 2015. Os filtros foram lavados duas vezes durante 5 minutos em 2xSSC, 0,1% SDS à temperatura ambiente, duas vezes durante 1 hora em 2xSSC, 0,1% SDS a 49,3°C e uma vez durante duas horas em 0,2xSSC, 0,5% de SDS a 49,3°C. Os filtros são secos ao ar e autorradiograf ados durante 3 dias usando filmes KODAK X-omat S0282.

Encontraram-se 33 clones que deram uma resposta de hibridação forte usando a mistura de oligonucleotídeos 2014 e 39 clones usando a mistura de oligonucleotídeos 2015. Para estabelecer uma sub-biblioteca, os 72 clones foram cultivados numa nova placa de microtitulação e transferidos para filtro Whatman 541 conforme descrito no Exemplo 3.1. Duas réplicas em filtro da sub-biblioteca foram hibridadas com ambas as sondas individualmente, lavadas e

autorradiografadas. Com a mistura de oligonucleotídeos 2014 apenas hibridaram os clones obtidos por hibridação com a mistura de oligonucleotídeos 2014. De igual modo com a mistura de oligonucleotídeos 2015 apenas hibridaram os clones obtidospor hibridação com a mistura de oligonucleotídeos 2015.

Exemplo 3.4: Despiste da sub-biblioteca com a mistura de oligonucleotídeos 2060

As réplicas em filtro da sub-biblioteca (72 clones), obtidas no Exemplo 3.3, são molhadas em 6xNET e pré-hibridadas durante 4 hrs em 15 ml de 6xNET, lxss-Denhardt, 0,1% de SDS a 32°C. 8 pmoles da mistura de oligonucleotídeos 2060, marcada radioactivamente como descrito no Exemplo 3.2.3, foram adicionadas e a hibridação efectuada durante a noite a 32°C. Lavaram-se os filtros duas vezes durante 5 minutos cada em 2xSSC, 0,1% SDS à temperatura ambiente, duas vezes durante 1 hora cada em 2xSSC, 0,1% SDS a 32°C e uma vez durante duas horas em 0,2xSSC, 0,5% SDS a 32°C. Os filtros foram secos ao ar e autorradiografados durante 3 dias usando filmes KODAK X-omat SO282. Encontraram-se 3 clones positivos, todos pertencentes ao grupo que hibrida com a sonda 2014 como descrito no Exemplo 9; Um clone foi designado E. coli BJ5183/pCG3Bll (abreviado 3B11).

Exemplo 4: Isolamento do plasmídeo pCG3Bll e sua análise de restrição

Fizeram-se preparações em grande escala (14) do clone 3B11, obtido como descrito no Exemplo 3.4. O plasmídeo correspondente designado pCG3Bll, foi analisado por digestão completa com as enzimas de restrição HindlII, EcoRI e PSTI (todas Boehringer, Mannheim) e separação electroforética num gel de 1% de agarose (Figura 1).

-42Exemplo 5:

Subclonagem dos fragmentos EcoRI de pCG3Bll contendo as fracções N-terminal e C-terminal do gene da pectina liase I

Exemplo 5.1: Isolamento dos fragmentos Sau3AI de pCG3Bll e ligação ao DNA de M13 pg do plasmídeo pGC3Bll (Exemplo 4) foi digerido completamente com 18 unidades da endonuclease de restrição Sau3AI (Boehringer, Mannheim) em 20 pl de 10 mmol/1 Tris-HCl, 75 mmol/1 NaCl, 10 mmol/1 MgC^, pH 7,2 durante 1 hora a 37°C. A reacção foi terminada pela adição de EDTA para uma concentração final de 20 mM. Os fragmentos de DNA foram extraídos com fenol/clorofórmio, precipitados por etanol e redissolvidos em 20 pl de tampão TE. 100 ng de DNA digerido com Sau3AI foi ligado a 20 ng de DNA do fago M13mp8 (15) linearizado por digestão com BamHI (Boehringer, Mannheim). A ligação foi efectuada durante 4 horas, a 15°C com 1 unidade de DNA ligase de T4 (Boehringer, Mannheim) num volume total de 10 pl de tampão de ligação. Células competentes E. coli JM101 foram tornadas 50 mM CaC^ de acordo com o manual de Amersham (16) p. 25. Quantidades de 0,3 ml de células competentes JM101 foram transferidas para tubos de cultura de 15 ml estéreis colocados em gelo. Adicionou-se 5 pl de DNA fágico ligado a cada um dos tubos. As misturas foram mantidas em gelo durante 40 min. Fez-se um choque térmico às células a 42°C durante 3 min. e os tubos voltaram para o banho de gelo. Para cada um dos tubos prepararam-se as seguintes misturas: 40 pl IPTG 100 mM, 40 X-gal 2% em dimetilformamida e 200 ^il de células E. coli JM101 de uma cultura fresca em crescimento exponencial. Adicionou-se 270 pl desta mistura a cada um dos tubos contendo células E. coli JM101 préviamente sujeitas a choque térmico. Adicionou-se a cada um dos tubos 3 ml de agar do topo fundido (mantido a 42°C) e os tubos foram vertidos sobre placas de agar. Incubaram-se as placas invertidas a

37°C durante a noite.

Exemplo 5.2: Despiste de fagos recombinantes com a sonda de oligonucleotídeos 2060

E. coli JM101 transformada com o DNA fágico recombinante mostrou placas brancas nas placas de agar contendo X-gal do Exemplo 5.1., 384 das quais foram repicadas e cultivadas individualmente a 37°C em 1,5 ml de meio 2xTY inoculado com 15 pl de células E. coli JM101 em crescimento exponencial. Após 6 horas as 384 culturas foram centrifugadas durante 5 min numa centrífuga Eppendorf e os sobrenadantes com fagos guardados a 4°C. 100 jil de cada um dos 384 sobrenadantes foram transferidos para quatro membranas Gene Screen (New England Nuclear) usando um sistema BioDot com 96 buracos (Bio Rad). As membranas foram enxaguadas 5 min em 0,5 M NaOH, 1,5M NaCl e 5 min em 3M NaCl, 1M Tris-HCl, pH 5,6, secas ao ar e incubadas a 80°C durante 2 hrs. Finalmente as quatro membranas foram pré-hibridadas, hibridados com a mistura de oligonucleotídeos 2060 marcado radioactivamente como descrito no Exemplo 3.4. Da experiência de ligação do Exemplo 5.1 escolheu-se um fago recombinante positivo para posterior análise, designado mp8-3A.

Exemplo 5.3: Análise de sequências do fago recombinante mp8-3A

O sobrenadante contendo o fago mp8-3A obtido como descrito no Exemplo 5.2, foi usado para preparar DNA de cadeia simples e DNA forma replicativa (RF-DNA) como descrito no manual da Amersham (16) nas págs. 18-27. Os moldes de cadeia simples foram seguênciados usando ométodo terminador de cadeia descrito no manual da Amersham nas págs. 30-35. O fago confirmou ter o fragmento Sau3AI de 547 pb com a sequência de nucleotídeos prevista para a sonda de oligonucleotídeos 2060 nas posições 584 a 599.

Exemplo 5.4: Identificação dos fragmentos EcoRI N-terminal e C-terminal do gene da pectina liase I sítio de restrição EcoRI sequênciado do fago mp8-3A (Exemplo 5.3) foi usado para identificar e subclonar dois fragmentos EcoRI, um contendo a parte C-terminal do gene PLI, comprendendo a região do terminador e um contendo a parte N-terminal do gene compreendendo a região do promotor. Os dois oligonucleotídeos que se seguem foram sintetizados como descrito no Exemplo 3.2.

Oligonucleotídeo 5052: 5¹TGGATGATGATGTTGGAGAC começa na posição 597, 5' relativamente ao sítio EcoRI central na posição 649/650 e prolonga-se até à posição 577 (cadeia complementar). Oligonucleotídeo 5066:

5¹AGGTCCAGGACAACACCTAC3¹ começa na posição 1020, 3' relativamente ao sítio central EcoRI e prolonga-se até à posição 1039.

As misturas de oligonucleotídeos 5032 e 5056 foram marcados radioactivamente como descrito no Exemplo 3.3.

jug de DNA do plasmídeo pCG3Bll (Exemplo 11) foi totalmente digerido com EcoRI (Boehringer, Mannheim) e os fragmentos separados num gel de 1% de agarose. Os fragmentos de DNA foram transferidos para membrana de Gene Screen (New England Nuclear) conforme descrito pelo fornecedor p. 383-386 e as membranas foram hibridadas com as sondas de oligonucleotídeos marcadas radioactivamente 5052 e 5066 como descrito por Maniatis et al. (8) p. 387-389. A sonda 5066 hibrida com um fragmento EcoRI de 3,5 kb que contem a parte C-terminal e a região do terminador do gene PLI. A sonda 5052 hibrida com um fragmento EcoRI de 2,9 kb contendo o extremo N e a região do promotor do gene.

Exemplo 5.5: Construção de pPL29-5 e pPL35-5 por reclonagem dos fragmentos EcoRI de pCG3Bll em pUN121

4,5 pg de DNA do plasmídeo pCG3Bll ob- : tido como descrito no Exemplo 4 foram incubados com 50 unidades de EcoRI (Boehringer, Mannheim) em 50 p.1 de 0,01M ) Tris-HCl pH 7,5, 0,lM NaCl, 0,01M mGClg, 1 mM mercaptoneta- nol durante 2 hrs a 37°C. Os fragmentos de DNA foram separados num gel de 1% de agarose, a fatia de gel contendo o fragmento de 2,9 kb e o fragmento de 3,5 kb foi eluida conforme descrito no Exemplo 5 e o DNA extraído com fenol/cloI rofórmio e precipitado com etanol. Ressuspenderam-se os precipitados em 40 ^liI de tampão TE baixo e 10 jil desta solução foram ligados a 100 ng de pUN121 (9) linearizado por digestão com EcoRI. A ligação foi efectuada a 15°C durante 4 hrs com 5 unidades de DNA ligase de T4 (Boehringer, Mannheim) em

33,5 ul de 20 mmol Tris-HCl, 1 mmol EDTA, ditiotreitol 5 mmol, 60 mmol KC1, 50% glicerol, pH 7,6.

Quantidades de 17,5 yul desta mistura de emparelhamento foram adicionados separadamente a 200 pl de células competentes E. coli HB101, as quais tinham sido · preparadas para transformação por tratamento com cloreto de cálcio conforme descrito por Maniatis et al. (8), p. 250. As misturas foram mantidas em gelo durante 30 minutos e aquecidas a 42°C durante 2 min., depois diluídas com 1 ml de meio SOC e incubadas a 37°C durante 1 h. Colheram-se as células por'-.centrifugação a 2000 g durante 5 min. Cada um dos sedimentos celulares foi ressuspenso em 600 ul de meio SOC e espalhado em três placas de agar contendo meio LB suplementado com 8 mg/1 de tetraciclina. As placas foram incubadas a 37°C durante 16 h.

De cada uma das transformações isolaz R z ram-se os plasmídeos de 6 clones recombinantes tet pelo método de Birnboim & Doly (17) e analisou-se por análise de restrição. Um clone contendo o fragmento EcoRI de 2,9 kb do

pCG3Bll foi escolhido para posterior análise e designado pPL29-5 (Fig. 3). Um outro clone contendo o fragmento EcoRI de 3,5 kb do pCG3Bll foi escolhido e designado pPL35-5 (Fig. 3).

Exemplo 6; Determinação da sequência do gene da pectina liase I

DNA de pPL29-5 (Exemplo 5.5) contendo a parte N-terminal do gene PLI e o DNA de pPL35-5 (Exemplo 5.5) contendo a parte C-terminal do gene PLI foram isolados como descrito por Humphreys et al. (14). Partes das inserções dos plasmideos pPL29-5 e pPL35-5 foram obtidas por restrição com enzimas adequadas. Os fragmentos foram subclonados em M13mp8 e M13mpl8 e sequênciados usando o M13 Cloning and Sequencing Kit (M15 Sequencing Kit N. 4502, Amersham.) nas condições enviadas pelo fornecedor (16).

Na Figura 4 está representada toda a sequência do fragmento Spel-Nhel de 2,7 kb, compreendendo a sequência completa do gene PLI. Inclui 688 nucleotídeos da região do promotor, 1369 resíduos da parte estrutural do gene PLI e 660 nucleotídeos da região do terminador.

A sequência de PLI, correspondendo à sequência de aminoácidos do extremo N de PLI conforme determinado pela análise da sequência de aminoácidos (Exemplo 1), é precedida de 57 nucleotídeos codificadores da sequência sinal:

M _K-Y-A-A-A-L-T-A-I-A-A-L-A-A-R-A-A-A_Cn ± □ /

A pesquisa, feita com o auxílio de computador, das sequências consensus das junções de splicing exão/intrão assim como das sequências internas dos intrões (Boel E. et al. (18) e Mount S.M. (19)) levou-nos a postular

-Μ-

a presença de quatro intrões com o comprimento de 65 pb, 62 pb, 63 pb e 57 pb respectivamente (Figura 4, sublinhado ).

A sequência do gene PLI foi determinada por combinação das sequências do fragmento EcoRI-Spel de pPL35-5 (ambas determinadas por subclonagem em M13).

Exemplo 7: Construção de vectores de expressão

Exemplo 7.1: Introdução de um novo sítio de restrição na sequência sinal do gene PLI

A introdução de um novo sítio BssHII na região da sequência sinal do gene PLI (sequênciado no Exemplo 6) por mutagénese in vitro foi feita segundo Zoller e Smith (20). Sintetizou-se um oligonucleotídeo consistindo em 19 resíduos pelo método descrito no Exemplo 3.2 que é complementar da sequência de DNA (pos. 36-54) codificadora da parte C-terminal da sequência sinal de PLI, exceptuando no nucleotídeo 10 (45) que levou a uma transversão C/G (iniciador mutagénico). O nucleotídeo 45 trocado do iniciador mutagénico está marcado com * *.

Parte da sequência sinal de PLI 5¹CCTCGCTGCCCGCGCCGCT3'

40 50 54 *

iniciador mutagénico 5156: 5'CCTCGCTGCGCGCGCCGCT3'

Para a mutagénese in vitro 200 pmoles do oligonucleotídeo 5156 foram fosforiladas no extremo 5' com 20 mmoles de dATP. A reacção foi efectuada durante 1 h a 37°C com 10 unidades de polinucleotídeo cinase de T4 (Boe hringer, Mannheim) em 20 /11 de tampão cinase. Parou-se a reacção aquecendo a 65°C durante 10 min.

Exemplo 7.2: Mutagénese in vitro do DNA molde de M13mp8-PL (Sal-EcoRl)

A primeira experiência de mutagénese in vitro diz respeito a DNA de cadeia simples do fago M13mp8-PL (SalI-EcoRI) obtido no Exemplo 6, que contem o fragmento SalI-EcoRI de 0,8 kb do plasmídeo pPL29-5, contendo 117 nucleotídeos do promotor e a parte N-terminal do gene PLI. Misturou-se 1 pmole de DNA de cadeia simples de M13mp8-PL (SalI-EcoRI, com 20 pmoles do iniciador mutagénico 5156 (Exemplo 7.1) e 70 pmoles do iniciador de sequênciaçao universal de M13 (N. 4511, Amersham) em 10,5 ^ul de 0,02M Tris-HC1 pH 7,5, 0,01M MgCl₂, 0,05M NaCl, Ο,ΟΟΙΜ DTT. A mistura foi rápidamente aquecida a 56° e deixada arrefecer lentamente até à temperatura ambiente. À mistura adicionou-se 1 pl 0,2H Tris-HCl pH 7;5, O,1M MgCl₂, 0,01M DTT, 4 pl 2 mM dNTP, 1 pl 10 mM ATP e finalmente 3 unidades de DNA ligase de T4 (Boehringer, Mannheim) e 2 unidades de DNA polimerase I (fragmento Klenow, Amersham) e a reacção de polimerização decorreu durante 15 hrs a 15°C. Fizeram-se três diluições da mistura de polimerização (1:20, 1:100 e 1:500) em tampão TE baixo. De cada uma das diluições adicionou-se separadamente 1 yil e 5 pl a 300 pl de células competentes E. coli JM101, as quais tinham sido preparadas para transformação pelo método descrito no Exemplo 5.1. Verteram-se as células sobre placas X-gal e obtiveram-se colónias formadoras de placas brancas. 100 das placas brancas foram repicadas com palito e transferidas.para placas LB. As bactérias transformadas com DNA fágico foram cultivadas durante a noite a 37°C e subsequentemente transferidas para filtros Whatman 541 conforme descrito no Exemplo 3.1. Lavaram-se os filtros (Exemplo 3.1.), em seguida pré-hibridaram-se em 6xNET lxss-Denhardt, 0,1% SDS durante 30 min. a 67°C. A hibridação decorreu à temperatura ambiente (Exemplo 3.4) durante 30 min. com 15 pmoles do oligonucleotídeo 5156 marcado radioactivamente (Exemplo 3.3) por filtro em 4xSSC. Após hibridação lavaram-se os filtros durante 4X40 seg. em 6xSSC à temperatu-49-

ra ambiente e após secagem ao ar foram expostos 1 hr a filme KODAK XAR-5 usando um écran Ilford. Lavaram-se os filtros uma segunda vez durante 5 min. em 6xSSC a 72°C (Tm do iniciador mutagénico 5156 é 70°C), secaram-se e exposeram-se durante a noite a um filme Kodak XAR-5.

As colónias que deram origem a sinais positivos após o segundo passo de lavagem foram repicados da placa LB original, suspensas em 1 ml de meio LB e aquecidas a 70°C durante 20 min. Esta solução de bacteriófagos foi diluida a 1:10, 1:1000 e 1:100 000 e usou-se 10 jil de cada diluição para transfectar 300 pl de células E. coli JM101 em crescimento exponencial que foram vestidas sobre placas X-gal. 6 placas da diluição 1:100 000 foram repicadas individualmente para 1,5 ml de 2xTY contendo 15 ul de células E. coli JM101 em crescimento exponencial e cultivadas a 37°C durante 6 hrs. As culturas foram centrifugadas 5 min. numa centrífuga Eppendorf, os sobrenadantes guardados a 4°C (stockde fagos) e usados os sedimentos de células para fazer preparações RF de acordo com o método de Birnboim & Doly (17). Após análise de restrição com BssHII, um fago mutante portador de um novo sítio BssHII no fragmento SalI-EcoRI de PLI foi escolhido para posteriores experiências e designado (M13mpl8-PL(SalI-EcoRI)BssHII/BE5).

Exemplo 7.3: Mutagénese in vitro do molde M13mpl8-PL(SpeI-EcoRI)

A segunda experiência de mutagénese in vitro foi efectuado com DNA de cadeia simples do fago M13mpl8-PL (Spel-EcoRI), obtido no Exemplo 6. Este fago recombinante contem o fragmento Spel-EcoRI de 1,4 kb do plasmídeo pPL-29-5 e portanto 688 nucleotídeos do promotor mais a parte N-terminal dogene PLI. A mutagénese deste molde foi efectuado exactamente como descrito no Exemplo 7.2. Um fago portador do novo sítio BssHII na inserção Spel-EcoRI de PLI

foi escolhido durante quatro experiências e designado respectivamente M13mpl8-PL (Speí-EcoRI)BssHII/AC5.

Exemplo 7.4: Construção do plasmídeo pUBE5

Para uma manipulação mais fácil do fragmento BamHI-EcoRI do fago M13mp8-PL (SalI-EcoRI)BssHII/ /BE5 obtido como descrito no Exemplo 7.2 incluindo 130 pb da reacção do promotor e a parte N-terminal do gene PLI incluindo o sítio BssHII introduzido na região da sequência sinal, foi subclonado no vector plasmídeo pUN121 (9) conforme ilustrado na Fig. 5 e descrito a seguir.

pg de RF-DNA do fago M13mp8-PL (Sall-EcoRI)BssHII/BE5 foi isolado de acordo com o Exemplo 5.3 e totalmente digerido com as endonucleases de restrição BamHI e EcoRI (Boehringer, Mannheim). Separaram-se os fragmentos num gel de 1% de agarose e a fatia de gel contendo o fragmento de 0,8 kb BamHI-EcoRI, consistindo em 117 pb do promotor e na parte N-terminal do gene PLI, foi electroeluida como descrito no Exemplo 2.2. Extraiu-se o DNA com fenol/ /clorofórmio e precipita-se com etanol. O sedimento de DNA foi ressuspenso em 10 pl de água (50 ng/jil).

Digeriu-se totalmente 2 pg de pUN121 com Bcll e EcoRI (Boehringer, Mannheim). Separaram-se os fragmentos num gel de 1% de agarose e electroeluiu-se o fragmento de 4,0 kb como descrito no Exemplo 2.2. Após extracção com fenol/clorofórmio e precipitação com etanol, dissolveu-se o DNA em 18 pl de água (100 ng/ul).

300 ng do fragmento BamHI-EcoRI, compreendendo o sítio BssHII foram ligados a 500 ng do DNA de pUN121 cortado com Bcll/EcoRI. A ligação fez-se durante 4 horas a 15°C com 400 unidades de DNA ligase de T4 (Biolabs) em 20 pl de 50 mM Tris-HCl (pH 7,8), 10 mM MgCl₂, 20 mM ditiotreitol, 1,0 mM ATP. Usou-se 10 pl da mistura de ligação

para transformar 100 pl de células competentes E. coli HB101 (8). Semearam-se as células em placas LB contendo 8 mg/1 de tetraciclina (SIGMA) e incubaram-se a 37°C durante a noite.

Fizeram-se preparações de plasmídeos a partir de 12 colónias tet de acordo com o método de Birnboim & Doly (17) e um plasmídeo com padrão de restrição pretendido mostrado na Fig. 5 foi designado pUBE5 e usado para posterior análise.

Exemplo 7.5: Introdução de um sítio de restrição Hgal antes do gene da dessulfato-hirudina de pML310 e isolamento do fragmento de gene Hgal-BamHI de 0,22 kb

Para a introdução de um sítio de restrição Hgal antes do gene da dessulfato-hirudina (Fig. 6) digeriu-se completamente 8 jug de DNA do plasmídeo pML310 com a endonuclease de restrição EcoRI. O DNA clivado foi extraído com fenol/clorofórmio e precipitado com etanol. Para remover os extremos salientes 5', 4 pg do DNA de pML310/EcoRI foram digeridos em 100 pl de 150 mM NaCl, 1 mM ZnSO^, 30 mM acetato de sódio pH 4,6 e 20U/ml de nuclease SI (Sigma) durante 45 min. a 37°C. O DNA foi extraído com fenol/clorofórmio e precipitado por etanol. Ressuspendeu-se o DNA (pML310/EcoRI/Sj-) em 100 p-1 de 50 mM Tris-HCl pH 8,0 e incubou-se com 2 unidades de fosfatase alcalina de intestino de vitela (CIAP, monoesterfosforilase ortofosfórica EC 3.1.3.1, Boehringer) durante uma hora a 37°C. A enzima foi inactivada a 65°C durante 1,5 horas. A concentração de NaCl foi ajustada a 150 mM. 0 DNA desfosforilado (pML310/EcoRI/S^/CIAP) foi purificado por adsorção a uma coluna de permuta ionica DE52 (Whatman) num tampão de baixa concentração salina (150 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl pH 8,0, 1 mM EDTA). A eluição foi feita com uma solução tampão de concentração salina elevada (1,5M

NaCl, 10 mM Tris-HCl pH 8,0, 1 mM EDTA). O DNA foi precipitado com etanol e ressuspenso em numa concentração de 0,8 mg/ml.

Para a introdução de um sítio Hgal sintetizou-se um oligonucleotídeo da fórmula

5¹-AGCGTCGACGCT-3¹ pelo método fosfotriéster (21). A sequência do oligonucleotídeo é autocomplementar contendo o sítio de reconhecimento-GACGC- da endonuclease de restrição Hgal. O emparelhamento das duas cadeias simples conduz a um adaptador de DNA de cadeia dúpla;

Fosforilou-se 1,2 jig do oligonucleotídeo sintético de cadeia simples em 10 pl de 60 mM Tris-HCl pH 7,5, 10 mM MgCl₂, 5 mM DTT, 30 pCi de /“f -³²P_7ATP (3000 Ci . mmol~\ Amersham) e 6 unidades de polinucleotídeo cinase de T4 (Boehringer) durante 30 min. a 37°C, seguido de 15 min. a 37°C na presença de 0,5 mM ATP. A mistura foi ainda incubada durante 10 min a 75°C para inactivar a enzima. Deixou-se a mistura arrefecer até à temperatura ambiente para emparelhamento.

0,6 pg (170 pmoles) de DNA adaptador marcado com P foi misturado com 2,4 jug (1,75 pmoles de extremos) de pML310/EcoRI/S^/CIAP e ligado em 20 ^ul de 60 mM Tris.HCl pH 7,5, 10 mM MgCl₂, 5 mM DTT, 3,5 mM ATP, 800 unidades de DNA ligase de T4 (Biolabs) durante 20 hrs a 15°C. A ligase foi inactivada a 85°C durante 10 min. e o excesso de moléculas de adaptador foi removido por precipitação do DNA na presença de 10 mM EDTA pH 7,5, 300 mM acetato de sódio pH 6,0 e 0,54 volumes de isopropanol. Após 30 min. à temperatura ambiente o DNA é sedimentado e ressuspenso em 45 ul de mistura de ligação (especificada acima) e ligado durante 6 horas a 15°C para formar DNA circular.

Quantidades de 1 ul e 3 ul da mistura de ligação foram adicionadas a 100 ^il de células E. coli HB101 competentes para a transformação por tratamento com cálcio (preparadas segundo o método de D. Hanahan (10)). As células foram deixadas em gelo durante 30 min., depois incubadas durante 3 min. a 42°C, arrefecidas em gelo durante 2

min. e depois incubadas durante uma hora a 37°C em 400 ^ul de meio SOC. As células foram concentradas em 10 de meio

SOC e semeadas em placas de agar LB contendo 50 de ampicilina e cultivadas durante a noite a 37°C.

Isolaram-se 12 colónias transformadas

R amp e cultivaram-se individualmente em meio LB contendo

100 ug/ml de ampicilina. O DNA de plasmídeo foi preparado de acordo com o método de D.S. Holmes et al. (22). A presença do oligonucleotídeo adaptador sintético foi confirmada por sequênciação de DNA usando um fragmento de DNA de cadeia simples como iniciador que hibrida com a cadeia codificadora da hirudina. Um clone contendo o DNA adaptador na posição correcta antes do gene da hirudina foi designado pML310L.

Para o isolamento do fragmento Hgal-BamHI de 0,22 kb do gene da dessulfato-hirudina, 40 |ig do plasmídeo pML310L foi digerido totalmente com as endonucleases de restrição Pvul e BamHI (Boehringer) em 150 pl de 0,01M Tris-HCl pH 7,5, 0,1M NaCl, 0,01M MgClg, 1 mM 2-mercaptoetanol durante 2 hrs a 37°C. Separaram-se os fragmentos num gel de 1% de agarose e a fatia de gel contendo o fragmento Pvul-BamHI de 0,84 kb foi electroeluido como descrito no Exemplo 5. Após extracção com fenol/clorofórmio e precipitação com etanol, o DNA foi ressuspenso em 20 jil de tampão Hgal e totalmente digerido com a endonuclease de restrição Hgal (Biolabs). Separaram-se os fragmentos num gel de 2% de agarose e a fatia de gel contendo o fragmento Hgal-BamHI de 0,22 kb foi eluida como atrás. Após extracção com fenol/clorofórmio e precipitação com etanol, 'ressuspendeu-se o fragmento em 55 ul de água estéril (0,1 ).

Exemplo 7.6: Fusão da sequência sinal de PLI e do gene estrutural da dessulfato-hirudina

Para se conseguir um adaptador para ligar o sítio BssHII da região codificadora da sequência sinal (Exemplo 7.2) do gene PLI e o sítio Hgal do gene da dessulfato-hirudina (Exemplo 7.5) sintetizaram-se dois oligonucleotídeos conforme descrito no Exemplo 3.2.

Sequência sinal de PLI | Aminoâcidos N-terminais da

I dessulfato-hirudina

ALA ALA LEU ALA ALA ARG ALA ALA ALAI VAL VAL

I

I 5'3' I

GCC GCC CTC GCT Gcg cgc gcc gct gctIGTT GTT oligonucleotídeo 5172

CGG CGG GAG CGA CGC GCg cgg cga cgalcaa caA oligonucleotídeo 5173 3'I 5’

I1

BssHII (letras minúsculas:adaptador)

300 pmoles de cada um dos oligonucleotídeos foram sintetizados separadamente com 400 pmoles de rATP e 10 unidades de polinucleotídeo cinase de T4 (New England Nuclear) em 15 F¹ de 50 mM Tris-HCl (pH 7,8), 10 mM MgCl^, 20 mM ditiotreitol, 1,0 mM ATP, 50 jig/ml BSA. Ambos os oligonucleotídeos fosforilados são misturados numa proporção de 1:1, aquecidos a 95°C e deixados arrefecer lentamente até à temperatura ambiente para emparelhamento. Os adaptadores emparelhados sao guardados a -20°C.

Exemplo 7.7: Construção de pLHK3

Para a contrução de um vector de expressão da dessulfato-hirudina (Fig. 7) compreendendo o promotor encurtado de PLI, 7 pig de DNA do pUBE5 (Exemplo 7.4) foi digerido totalmente com a endonuclease de restrição BssHI (Boehringer), extraído com fenol/clorofórmio e precipitado com etanol. 0 DNA (1,9 pmoles) foi ressuspenso em 10 pl de água estéril 300 pmoles do adaptador emparelhado 5172/5173 (Exemplo 7.6) foram ligados a 1,9 pmoles de pUBE5 cortado com BssHII usando 400 unidades de DNA ligase de T4 (Biolabs) em 60 pl de 50 mM Tris-HCl (pH 7,8), 10 mM MgClg, 20 mM ditiotreitol, 1,0 mM ATP, 50 pg/ml BSA. A ligação foi efectuada durante 15 horas a 15°C. Inactivou-se a ligase por aquecimento a 85°C durante 10 min. O tampão foi ajustado a 0,01M Tris.HCl pH 8,0, 0,lM NaCl, 0,005M MgClg, 1 mM 2-mercaptoetanol. Adicionou-se 36 unidades de BamHI (Boehringer) e fez-se a digestão durante 2 hrs a 37°C. Separaram-se os fragmentos num gel de 1% de agarose e isolou-se o fragmento BamHI-/BssHII 7HgaI-adaptador de 3,4 kb por electroeluição da fatia de gel seguido de extracção com fenol/clorofórmio e precipitação com etanol. Ressuspendeu-se o DNA em 14 pl de água estéril para uma concentração 0,1 pmole/yul. 0,2 pmoles do fragmento Hgal-BamHI de 0,22 kb da dessulfatohirudina foram ligadas a 0,1 pmole de DNA de pUBE5 digerido. A ligação decorreu durante 15 hrs a 15°C com 400 unidades de DNA ligase de T4 (Biolabs) em 10 pl de 50 mM Tris-HCl (pH 7,8), 10 mM MgClg, 20 mM ditiotreitol, 1,0 mM ATP, 50 pg/ml BSA.

pl da mistura de ligação foram usados para transformar 100 pl de células E. coli HB101 competentes (8) as quais são subsequentemente semeadas em placas de LB contendo 50 mg/1 de ampicilina (SIGMA). O DNA de 12 colónias amp foi preparado pelo método de Birnboim & Doly (17) e analisado por análise de restrição. Escolheu-se 1 clone para análise da sequência pelo método terminador de ca-56-

deias didesoxi de Sanger et al. (23). Um clone mostrando o padrão de restrição pretendido e a sequência correcta dentro junção PLI-sequência sinal-dessulfato-hirudina foi isolado e designado pLHK3.

Exemplo 7.8: Construção de pLHL5

Para a construção do vector de dessulfato-hirudina, compreendendo toda a sequência do promotor do gene PLI, diger±u-se completamente 10,0 -ug de DNA RF do fago M13mpl8-PL (Spel-EcoRI)BssHII/AC5 (Exemplo 3.3) com a endonuclease de restrição BssHII (Boehringer), extraíu-se com fenol/clorofórmio, precipitou-se com etanol e ressuspendeu-se em 10 pl de água estéril para uma concentração de

1,9 pmoles. 300 pmoles do adaptador emparelhado 5172/5176 (ver atrás) foram ligados a 1,9 pmoles de DNA fágico cortado com BssHII como descrito no Exemplo 7.7. Após inactivação da DNA ligase de T4 o tampão foi ajustado a 0,01M Tris-HC1, pH 7,6, 0,05M NaCl, 0,01M MgCl₂, 0,014M DTT. Adicionou-se 36 unidades da endonuclease de restrição HindIII (boehringer) e efectuou-se a digestão durante 2 hrs a 37°C. Os fragmentos foram separados num gel de 1% de agarose e o fragmento de 1,4 kb HindIII-/~BssHII 7HgaI-adaptador foi isolado por electroeluição como descrito no Exemplo 2.2. Ressuspendeu-se o fragmento em 15 pl de água estéril para uma concentração de 0,1 pmol/pl.

Digeriu-se totalmente 3 pg do plasmídeo pBR322 (24) com as endonucleases de restrição BamHI e HindIII (Boehringer, Mannheim) em 20 pl de 0,01M Tris.HCl pH 7,5, 0,lM NaCl, 0,01M MgCl₂, 1 mM 2-mercaptoetanol e separaram-se os fragmentos num gel de 1% de agarose. 0 fragmento maior HindIII-BamHI de 4,15 kb foi eluido como descrito no Exemplo 2.2 e ressuspenso em 8 jul de água estéril (0,1 pmole/pl).

0,2 pmoles do fragmento Hgal-BamHI de 0,2 kb da dessulfato-hirudina e 0,2 pmoles do fragmento de

1,4 kb promotor de PLI-sequência sinal HindIII-/~BssHIl7HgaI -adaptador foram ligadas a 0,1 pmole de pBR322 cortado com HindIII/BamHI durante 15 hrs a 15°C. A ligação foi efectuada com 400 unidades de DNA ligase de T4 (Biolabs) em 10 pl de 50 mM Tris-HCl (pH 7,8), 10 mM MgCl₂, 20 mM ditiotreitol, 1,0 mM ATP, 50 pg/ml de BSA. Usou-se 1 pl da mistura de ligação para transformar 100 pl de células competentes E. coli HB101 (8). Isolaram-se 12 colónias amp e analisou-se o DNA como descrito no Exemplo 7.7. Escolheu-se um clone para posteriores experiências e designou-se pLHL5 (Fig. 8).

Exemplo 7,9: Construção de pLHLT7

Para dotar o sistema de expressão de PLI-dessulfato-hirudina de uma região de terminador, o fragmento de 0,7 kb PstI-Nhel do plasmídeo pPL35-5 foi fundido ao extremo 3' do gene da dessulfato-hirudina conforme ilustrado na Fig. 9.

Digeriu-se completamente 10 pg de pPL35· -5 com PstI (Boehringer). O DNA foi extraído com fenol/clotofórmio e precipitado com etanol. Os fragmentos foram ressuspensos em 0,033M Tris-acetato pH 7,9, 0,066M potássio-acetato, 0,01M magnésio-acetato, 0,5 mM DTT e 100 ng/ml de BSA. Adicionou-se 10 unidades de DNA polimerase de T4 (Boehringer) e a reacção decorreu a 37°C durante 180 segundos. Colocou-se a mistura de reacção em gelo, adicionou-se dATP, dCTP e dTTP, 20 mmoles de cada, ajustou-se o tampão às condições acima referidas e a reacção decorreu a 37°C durante 35 min. Após extracção com fenol/clorofórmio e precipitação com etanol, o DNA foi ressuspenso em 10 pl de água estéril (1,9 pmoles = 11,4 pmoles de extremos cegos). Juntou-se 900 pmoles de adaptadores BamHI (Biolabs) fosforilados e emparelhados (Exemplo 7.6) e a ligação fez-se durante 15 hrs a

15°C com 400 unidades de DNA ligase de T4 (Biolabs) em 60 pl de 50 mM Tris-HCl (pH 7,8), 10 mM MgCl₂, 20 mM ditiotreitol, 1,0 mM ATP, 50 ug de BSA. Após inactivação de ligase por aquecimento a 85°C durante 10 min, o tampão foi ajustado a 0,01M Tris-HCl pH 8,0, 0,lM NaCl, 5 mM MgCl₂, 1 mM 2-mercaptoetanol. Adicionou-se 20 unidades da endonuclease ) de restrição Nhel (Biolabs) e fez-se a digestão durante 2 hrs a 37°C. Os fragmentos foram separados num gel de 1,2% de agarose e o fragmento NheI-/~PstI 7BamHI de 0,7 kb foi isolado por electroeluição conforme descrito no Exemplo 2.2. O fragmento ressuspendeu-se em 15 pl de água estéril para

I dar uma concentração de 0,1 pmole/|il.

A ligação foi feita com 0,2 pmoles do fragmento terminador NheI-/~PstI 7-BamHI de 0,7 kb, 0,2 pmoles do fragmento promotor Hind III-/~BsòHII 7HgaI (Exemplo 7.4), 0,2 pmoles do fragmento da dessulfato-hirudina de 0,2 kb Hgal-BamHI (Exemplo 7.5) e 0,1 pmoles do vector pUC18 (25) linearizado com HindlII e Xbal. A reacção foi feita com 400 unidades de DNA ligase de T4 (Biolabs) durante 15 hrs a 15°C em 10 /11 de 50 mM Tris-HCl (pH 7,8), 10 mM MgCl₂, 20 mM ditiotreitol, 1,0 mM ATP, 50 pg/ml de BSA. Usou-se 2 pl da ligação para transformar células E. coli p

HB101. 12 transformantes amp foram analisados conforme descrito no Exemplo 7.6 e o plasmídeo que apresentou as sequências de fusão correctas foi referido como pLHLT7.

Exemplo 8: Construção de um sistema de contransformação para A. niger

Exemplo 8.1: Preparação de pCG59DT contendo o gene pyrA de Aspergillus niger

300 ng de um fragmento HindlII de 1,1 kb de pJDB2 (26) portador de parte do gene pyr4 de N. crassa foram marcadas radioactivamente por nick-translation

segundo Manniatis et al.,(8 ). As réplicas em filtro da biblioteca de genes (Exemplo 3.1) foram molhadas em 6xNET e pré-hibridadas em 6xNET, lxss Denhardt, 0,1% de SDS durante hrs a 50°C. 0 fragmento HindIII marcado foi adicionado (300 ng/80 filtros) e a hibridação efectuada durante 15 hrs a 50°C. Após hibridação os filtros foram lavados lx durante min. em 4xSSC, 0,1% de SDS a 50°C. Após secagem ao ar exposeram-se os filtros a filmes KODAK X-Omat SO282 durante 3 dias. Isolou-se uma colónia que deu hibridação forte, designada Escherichia coli BJ5183/pCG59D7 (abreviatura 59D7) e feita uma preparação de plasmídeo em larga escala a partir dela (14). O plasmídeo foi referido como pCG59D7 e usado na transformação do Exemplo 9.2.

Exemplo 8.2: Mutação de A. niger N756 e isolamento de mutantes auxotróficos para a uridina

A selecção de mutantes de A. niger estirpe N756 especificamente sem actividade de orotidina-5¹-fosfato descarboxilase, pode ser conseguida por selecção positiva contra o análogo tóxico ácido fluoro-orótico (27) na presença de uridina. Semearam-se 3x10 esporos de conídios de A. niger estirpe N756 em placas com 10 ml de meio mínimo suplementado com 1 g/1 de arginina e 50 mg/1 de uridina. Os esporos foram sujeitos a irradiação com luz UV de pequeno comprimento de onda (2600 8), numa dosagem que resulta em 0,5% de colónias sobreviventes. Após 2 dias de incubação a 28°C, quando o micélio aéreo é ligeiramente visível, adicionaram-se 10 mg de ácido fluoro-orótico a cada placa e a incubação continuou durante mais 2-3 dias. As colónias resistentes ao ácido fluoro-orótico surgem com crescimento forte e colónias esporulantes num crescimento de fundo de micélio esbranquiçado sensível. Entre cerca de 40.000 sobreviventes do tratamento mutagénico isolaram-se 8 mutantes. 2 deles que são resistentes ao ácido fluoro-orótico sem necessidade de uridina não foram seguidos.6 deles tinham uma

auxotrofia para a uridina. Obtiveram-se heterocariotas através do crescimento de uma mistura de esporos conidiais de dois mutantes resistentes ao ácido fluoro-orótico em meio completo durante ã noite. Transferiram-se blocos de micélio para meio mínimo. Os mutantes complementares uns dos outros na sua mutação mostram crescimento de micélio aéreo heterocariótico prototrófico nas pontas, as estirpes com uma mutação no mesmo alelo não apresentam. Os 6 mutantes que necessitam de uridina da estirpe N756 caem em 2 grupos de complementação como em\S. cerevisiae (27). Um de cada -An 8 e An 10foi usado na transformação.

Exemplo 8.3: Preparação de protoplastos e transformação dos mutantes uridina An 8 e An 10 de A. niger N756

Esporos de conídios dos mutantes An 8 e An 10 foram cultivados separadamente em agar inclinado durante 4-5 dias a 28°C em meio completo. 2x10° conidiósporos de An8 e de An 10 foram usados para inocular separadamente 200 ml de meio mínimo suplementado com 1 g/1 de arginina e uridina (Exemplo 8.2). Após 20 hrs de crescimento a 28°C e 180 rpm. colheu-se o micélio por filtração através de Mitacloth, lavou-se duas vezes com 10 ml de 0,8M KC1, 50 mM CaClg e ressuspendeu-se em 20 pl de 0,8M KC1, 50 mM CaClg, 0,5 mg/ml de Novozym 234 (Novo Industries). A mistura foi incubada num banho-maria com agitação (30°C, 50 rpm) até libertação máxima de protoplastos poder ser detectada microscopicamente (90-120 min.). A suspensão de protoplastos foi filtrada através de uma almofada de lã de vidro num funil para reter os detritos de micélio. Sedimentaram-se os protoplastos por centrifugação suave (10 min., 2000 rpm) à temperatura ambiente e lavaram-se duas vezes com 10 ml de 0,8M KC1, 50 mM CaClg. Os protoplastos foram finalmente ressuspensos em 200-500 jal de 0,8M KC1, 50 mM CaCl„ para dar uma concentração de 1x10 /ml.

Para a transformação quantitativa de

200 μΐ de suspensão de protoplastos (An 8 e An 10) foram incubadas separadamente juntamente com solução consistindo em 10 pg/20 pl de DNA de pCG59D7, 50 pl de PCT, (10 mM Tris-HC1, pH 7,5, 50 mM CaClg, 25% PEG 6000). As misturas de incubação foram mantidas em gelo durante 20 min. adicionou-se | mais 2,0 ml de PCT e incubaram-se as misturas durante mais min. à temperatura ambiente. Adicionou-se 4 ml de 0,8M KC1, 50 mM CaClg e quantidades de 1 ml destas soluções de transformação finais foram misturadas com meio mínimo de agar liquefeito (MM + 1 g/1 de arginina + 10 g/1 de Bacto) -Agar (Difco)) estabilizado com 0,8M KC1. Verteram-se as misturas imediatamente sobre placas de agar do mesmo meio e incubou-se a 28°C.

Após 3 dias de crescimento a 28°C os transformantes estáveis surgiram como colónias de forte crescimento e esporulação contra um crescimento de fundo de muitas centenas de pequenos transformantes, presumivelmente abortivos.

A transformação com pCG59D7 só tem êxito no mutante An8, não no An 10, An 8 é portanto consideraI | do sem actividade de ornitina-5'-fosfato descarboxilase, a qual é complementada pela sequência genética completa do plasmídeo de selecção pCG59D7. Em An 8 obtiveram-se cerca de 20-30 transformantes por pg de pCG59D/.

| Repicaram-se dez transformantes de An 8, subcultivaram-se em meio mínimo e o DNA foi isolado e analisado quanto à presença de sequências de pCG59D7.

O DNA dos transformantes foi isolado após redução a pó do micélio congelado em azoto líquido de acordo com um processo publicado (7). 1 pg de DNA de cada um dos transformantes foi digerido totalmente com Xhol, fraccionado por electroforese em géis de 1% de agarose e

transferido para filtros de nitrocelulose segundo Maniatis (8), p. 382-386. As tranferências foram hibridadas com DNA de pUN121 marcado com Γ e/ - P 7 de acordo com processos convencionais como descrito por Maniatis et al. (8), p. 387-389. Os vários padrões de hibridação obtidos indicaram integração cromossómica transformante pCG59D7 em vários sítios do genoma do hospedeiro.

Exemplo 9: Expressão do gene da dessulfato-hirudina sob o controle do promotor de PLI em A. niger

Exemplo 9.1: Cotransformação do mutante An 8 com pCG59D7, pLHK3, pLHL5 ou pLHL17

Preparam-se protoplastos do mutante An 8 de acordo com o Exemplo 8.2 e cotransformaram-se com 5 pg do plasmídeo de selecção pCG59D7 e ainda com 10 pg do plasmídeo pLHK.3 (Exemplo 7.7) ou 10 pg do plasmídeo pLHLõ (Exemplo 7.8) ou 10 pg do plasmídeo pLHLT? (Exemplo 7.9), seguindo o processo descrito no Exemplo 8.2.

As células An 8 transformadas foram seleccionadas em meio mínimo quanto à prototrofia relativamente a uridina como descrito no Exemplo 8.2. Repicaram-se ao acaso 50 transformantes de cada uma das experiências de cotransformação e analisaram-se quanto à expressão de dessulf ato-hirudina . A actividade de dessulfato-hirudina foi testada num ensaio de inibição da trombina de acordo com as instruções do fornecedor do substracto peptídico cromogénico (Boehringer, Mannheim, FRG).

Exemplo 9.2: Expressão da dessulfato-hirudina sob o control do promotor PLI em transformantes do mutante An 8

Os esporos conidiais dos transformantes obtidos de acordo com o Exemplo 8.3 foram pré-cultivados individualmente em 50 ml de um meio de pré-cultura (Pectin Slow Set L (Unipectin, S.A., Redon, França) 3 g/1, NH₄C1 2 g/1, KH₂PO₄ 0,5 g/1, NaCl 0,5 g/1, Mg₂SO₄x7 H₂O 0,5 g/1, Ca₂SO₄x2 H₂O 0,5 g/1, pH 7,0). A pré-cultura foi incubada durante 72 hrs a 250 rpm e 28°C. Usou-se 10% da pré-cultura para inocular 50 ml de meio de cultura principal (farinha de;soja 20 g/1, pectina Slow Set 5 g/1). A cultura cresceu durante 72-96 h (taxa mais elevada de produção de pectina liase) a 250 rpm e 28°C (referido como condições de inclusão). Os transformantes do mutante An 8 foram também cultivados em condições não indutoras em peptona Phytone 10 g/1, glucose 10 g/1 em vez de meio de cultura principal.

A vários tempos (de 20 em 20 hrs) retiraram-se amostras, as células foram sedimentadas por centrifugação e rebentadas por desintegração com ultras-sons. O sobrenadante e os extractos celulares foram ambos testados quanto à actividade de dessulfato-hirudina como descrito no Exemplo 9.1. Não se detectou actividade de dessulfato-hirudina após cotransformàção com o plasmídeo pLHLK3. pLHL5 e pLHL7 contendo o promotor de PLI de tamanho completo são ambos capazes de conduzirem a expressão de dessulfato-hirudina no mutante An 8 e A. niger. Dos 50 transformantes extraídos das experiências de cotransformação (Exemplo 9.1) 10 mostraram actividade de dessulfato-hirudina no meio.

A expressão de dessulfato-hirudina no mutante An 8 sob o control do promotor de PLI de tamanho completo e ao mesmo tempo fazendo uso do peptídeo sinal de PLI é portanto regulada pelo substracto indutor pectina e conduz à secreção da dessulfato-hirudina para o meio.

Depósito de microorganismos

Os microorganismos que se seguem foram depositados sob o tratado de Budapeste com Deutsche Sammlung von Mikroorganismen, Grisebachstr. 8, D-3400 Gottingen:

Microorganismos

Data do Dep.

Escherichia coli BJ5183/pCG3Bll

Aspergillus niger An 8

Escherichia coli BJ5183/pCG59D7

DSM 3916

DSM 3917

DSM 3968 de Dezembro de 1986 de Dezembro de 1986 de Fevereiro de 1987

Referências :

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28) Norrander, J. et al., Gene 26, 101-106 (1983)

Claims (23)

1. REIVINDICAÇÕES la. - Processo para a preparação de uma molécula de DNA recombinante contendo sequências de DNA codificadoras do sistema de expressão da pectina liase (PL) ou um seu derivado, caracterizado por se proceder à cultura de um hospedeiro transformado com uma molécula de DNA contendo uma sequência de DNA codificadora do sistema de expressão da pectina liase ou um seu derivado e isolamento da molécula de DNA recombinante pretendida ou seu derivado ou sua preparação através de uma sintese in vitro.
2. 2â. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se preparar uma molécula de DNA recombinante compreendendo o promotor, a sequência sinal e o gene estrutural com ou sem o terminador do sistema de expressão PLI.
3. 3â. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se preparar uma molécula de DNA recombinante, compreendendo uma sequência de DNA da fórmula I ou um seu derivado.
4. 4^. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se preparar uma molécula de DNA recombinante que é pCG3Bll.
5. 5§. _ Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se preparar uma molécula de DNA recombinante compreendendo a sequência de promotor entre os nucleotídeos -1 e -688.
6. 6â. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se preparar uma molécula de DNA recombinante, compreendendo a sequência sinal entre os nucleotídeos 1 e 57.
7. 7ê. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se preparar uma molécula de DNA recombinante, compreendendo o gene estrutural PLI entre os nucleotídeos 58 e 1366.
8. 8i. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se preparar uma molécula de DNA recombinante compreendendo o gene estrutural PLI sem intrões.
9. 9â. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se preparar uma molécula de DNA recombinante compreendendo o terminador estendendo-se entre os nucleotídeos 1367 e qualquer um dos nucleotídeos 1570 até 2029.

   lOê. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se preparar uma molécula de DNA recombinante, compreendendo uma sequência de DNA da fórmula I que é degenerada.

   lia. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se preparar uma molécula de DNA recombinante que é um vector híbrido recombinante.
10. 12^. _ Processo de acordo com a reivin-69- dicação 1, caracterizado por se preparar uma molécula de DNA recombinante que é um vector hibrido compreendendo o gene estrutural PLI ou um gene homólogo da pectina liase ou gene estrutural heterólogo.
11. 13a. _ Processo de acordo com a reivin· dicação 1, caracterizado por se preparar uma molécula de DNA recombinante que é um vector hibrido compreendendo o gene marcador pyr A.
12. 14â. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se preparar uma molécula de DNA recombinante que é o vector híbrido pLHL5.
13. 15§. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se preparar uma molécula de DNA recombinante que é o vector híbrido pLHLT7.
14. 16â. - Método para a preparação de um hospedeiro transformado contendo uma molécula de DNA recombinante de acordo com a reivindicação 1, compreendendo o tratamento de um hospedeiro, em condições de transformação, com uma molécula de DNA recombinante de acordo com a reivindicação 1, facultativamente em conjunção com um gene marcador e selecção dos transformantes.
15. 17â. - Método de acordo com a reivindicação 16, caracterizado por se preparar Escherichia coli B35183/pCG3Bll (DSM 3916).
16. 18a. _ Método de acordo com a reivindicação 16, caracterizado por Aspergillus niger An 8 (DSM 3917) ser transformado com uma molécula de DNA recombinante de acordo com a reivindicação 1 e o plasmídeo com marca selectiva pCG59D7.
17. 19^a. - Método de acordo com a reivindicação 16, caracterizado por Aspergillus niger An 8 (DSM 3917) ser transformado com pLHK3, pLHL5 ou pLHLT7 e o plasmídeo com marca selectiva pCG59D7.
18. 20ê. - Método para a preparação de um polipeptídeo caracterizado por um vector hibrido de acordo com a reivindicação 19 ser expresso num hospedeiro transformado com ele e isolado o polipeptídeo.
19. 21a. - Método de acordo com a reivindicação 20 para a super-produção de PLI em espécies de Aspergillus caracterizado por compreender a cultura de um hospedeiro Aspergillus com um vector híbrido de expressão para a expressão e secreção de PLI e colheita da PLI a partir do meio nutritivo.
20. 22^a. - Processo para a preparação de uma molécula de DNA recombinante contendo a sequência de DNA codificadora de um gene pyrA de Aspergillus niger, caracterizado por se proceder à cultura de um hospedeiro transformado com uma molécula de DNA contendo a sequência de DNA codificadora do gene pyrA e isolamento da molécula de DNA recombinante pretendida.
21. 23^a. - Processo de acordo com a reivindicação 22, caracterizado por se preparar o plasmídeo pCG59D7 contendo o gene pyrA.

    -7124â. - Método para a preparação de um hospedeiro transformado contendo uma molécula de DNA recombinante de acordo com a reivindicação 22, caracterizado por se proceder ao tratamento de um hospedeiro, em condições de transformação, com a referida molécula de DNA recombinan te.
22. 25â. - Método de acordo com a reivindicação 24, caracterizado por se preparar Escherichia coli BY5183/pCG59D7 (DSM 3968).
23. 26â. - Método para a preparação de Aspergillus niger An8 (DSM 3917) deficiente em pyrA, caracterizado por os conidiósporos de Aspergillus niger N756 serem tratados com irradiação de CJV mutagenizante e seleccionadas as colónias sobreviventes na presença de ácido fluoro-orótico e uridina.