JPH05501949A - 発現ベクターのマルチコピー組込みにより形質転換した真菌による蛋白質の製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発現ベクターのマルチコピー組込みにより形質転換した真菌による蛋白質の製法 主として、本発明は、酵母のゲノムに発現ベクターをマルチコピー組込みして形 質転換した酵母により同種（ｈｏｍｏｌｏｇｕ＋）または異種（ｈｅｔｅｒｏｌ ｏｇａｓ）の蛋白質を製造する方法であって、前記発現ベクターは前記蛋白質を コードする「発現可能な遺伝子」といわゆる「特定培地での酵母の増殖に必要な 欠失選択マーカー」の両方を含有している方法に関する。

大部分の実験は酵母を用いて行っているが、本発明はかびにも適用できるものと 考えている。従って、本明細書では酵母またはかびの他に真菌という用語も使用 するが、これは酵母及びかびを含んでいる。

本明細書では、「発現可能な遺伝子」という表現は、宿主生物と同種または異種 の蛋白質をコードする構造遺伝子と、構造遺伝子の適正な転写及び翻訳のための ＤＮＡ配列と、適宜、分泌シグナルＤＮＡ配列とを合わせたものを意味し、これ らのＤＮＡ配列は宿主真核細胞内で機能すべきである。

本明細書では、「特定培地での酵母またはかびの増殖に必要な欠失選択マーカー 」という表現は、プロモーターとポリペプチドまたは蛋白質をコードする構造遺 伝子を含有するマーカー遺伝子を意味するものであり、前記ポリペプチドまたは 蛋白質４は −酵母またはかびの増殖に必須な成分例えばアミノ酸、ビタミン及びヌクレオチ ド（本明細書中ではこのような成分を「必須栄養素」とも呼ぶ）の産主に必要な もの、−または培地中に存在する毒性化合物例えば抗生物質またはＣｕ　”４オ ンに対して細胞を保護するために必要なものであるが、但し、欠失選択マーカー により −　前記ポリペプチドまたは蛋白質が次善（ｓｕｂ−ｏｐｉｍａｌ）に新規合成 され、その結果必須成分が次善に産生され、または前記毒性化合物に対して次善 に保護され、 −またば前記必須成分の産生に次善の有効性を有する前記修飾ポリペプチドまた は蛋白質が新規合成される、または前記毒性化合物に対して次善に保護される。

このように「欠失コという用語は、上記のようにポリペプチドまたは蛋白質の次 善の合成と、細胞への次善の作用有効性を有するポリペプチドまたは蛋白質の合 成の両者を示すよう使われている。

このようなマーカー遺伝子の例には、栄養要求性マーカー例えばＬＥＵ２、ＴＲ ＰＩ及びＵＲＡ３遺伝子、抗生物質耐性遺伝子例えば６４１８耐性遺伝子及びタ ロラムフェニコール耐性遺伝子、並びにＨ２０２に対して細胞を保護できる酵素 カタラーゼをコードする遺伝子が含まれる。

本発明のマルチコピー組込みの面の背景いわゆる「酵母の増殖に必要な欠失選択 マーカー」の１例はＫｉｎＨｍａｎ　Ｃ，Ｓ、（参考文献上）が記載したＬＥＵ ２ｄ遺伝子である。

Ｋｉｎｇ＋１１＋ｎは転位可能なＴｙ因子Ｔ７１−１５を使用するゲノム全体に 分散するマルチコピー組込みベクターの開発を記載している（参考文献２）。こ の因子は、２つの選択可能なマーカーであるｐＭＡ３ｇからのＴＲ［’ｌ　（参 考文献３）とＬＥＵ２、及びＩＰＩＩ−α２コーディング配列（参考文献５）を 有するｐＭＡ９１　（参考文献４）由来のＰＧＫ発現シグナルを有するよう遺伝 子工学処理されている。

線状断片を使用して遺伝子工学処理されたＴ７の１つのコピーを組込み、因子の 末端間の組換えを促進して、内因性因子を置換する。形質転換体をＴＲＰＩマー カーについて選択した。１コピーのこの遺伝子では不十分な酵素しか産生されな いので、ＬＥ■２についての選択では形質転換体はほとんど得られなかった。次 に、この形質転換体を低濃度のロイシン中で増殖させて、遺伝子変換及び転移で ゲノム全体にＴＦ因子が広がったためであろうと思われるＬＥＵ２のコピー数の 増加について選択した（参考文献６）。

細胞当り　８Ｘ　１０５分子のＩＦＮを産生ずる株を構築した。これは単一コピ ーＡＲ３／ＣＥＮベクター（１０５分子／細胞）からのものとマルチコピーベク ター例えばｐＭＡ９１　（６Ｘ　１０’分子／細胞）からのものの中間である。

形質転換した酵母を使用する実用的で安定な製造システム系でのＴ７因子の使用 には欠点がある。

−例えば、Ｔ、因子は、人が消費する生成物やその製造に適した蛋白質を産生ず ることが多かれ少なかれ疑われている物質であるレトロウィルス配列と相同であ る。従って、これらの疑わしい物質を使用しない解決法を見いだすのが好ましい 。

−　もう１つの欠点は転位因子になる特性を持つことである。

その結果、得られた菌株が遺伝的に安定ではないという明かな危険性が生じる。

何故ならば、酵母の染色体に組込まれた転位Ｔｙ因子が産生過程に関わっていな いゲノムの他の部位に転位及び組込まれる可能性があり、担当会社及び機関の許 可を得る問題が生じる可能性があるからである。

−レトロウィルス特性を考えると、Ｔ７因子はウィルス様粒子となることがある 。これは、遺伝学的に修飾した生物が不安定性であることは避ける必要があるた めに、実際の製造過程では望ましくない。

−Ｔ、因子は酵母５ａｃｅｈｚ＋ｏｃ７ｃｅ＋　ｅｅｒｒｖｉ＋ｉａ＋のみで見 られる。

従って、他の酵母やさらにはかびに使用できるかが疑問である。

他の生物ので見られる転位因子が同様に使用できるかは判っていない。しかし、 使用できるにしても、上記と同じ欠点を有する。

−ＴＹ組込みで得られるコピー数は細胞当り約２０〜３０、最大で約４０である 。一般にコピー数が大きくなる程発現レベルが高くなるので、産業用製造システ ムでは細胞当り　１００〜３００コピーという高い数が非常に有利である。

従って、真菌例えば酵母及びかびに異種遺伝子をマルチコピー組込みできる他の システムが必要とされている。

本発明のマルチコピー組込みの面の概要ここで、発現可能な異種遺伝子と上記定 義の「酵母の成長に必要な欠失選択マーカー」の両方とさらにリポソームＤＮＡ 配列を含有する発現ベクターを使用してＳ、ｅｅｒｅマｉ＋ｉｘｅへの安定なマ ルチコピー組込みが得られることを発見した。ここで、上記リポソームＤＮＡ配 列は酵母ゲノムのリポソームＤＮＡ部位に前記発現ベクターを安定にマルチコピ ー組込みすることができる。驚くべきことに、このようなシステムを使用すると 細胞当り　２００コピ一以上のマルチコピー組込みが可能になり、これはバッチ 式培養及び連続培養のいずれでも７０世代以上にわたり安定であった。

驚くべきことに、公知のＬＥＵ２ｄ系のみではなく他の「欠失マーカー」も、特 にＴＲＰｌｄまたは［１１１＾３ｄ遺伝子も使用できることが発見された。

また、この手法は他の酵母特にＨ！ｃ＋ｃｎａｌｓ及びＫｌａ７ｖｅ−＋ｏｍｙ ｃｃｉ属にも適用できることも判った。

従って、上記開示のように酵母にマルチコピー組込みするために「欠失マーカー 」とリポソームＤＮＡ配列を共に含有する発現ベクターを使用する原理は、特に マルチコピー組込みベクターが宿主生物由来のリポソームＤＮＡを含有するとき には、より一般的に、例えばＰｉｃｈｉａのような他の酵母またはかび例えばＡ ＋ｐｅｒｇｉｌ１口＋　、　Ｒｈｉ＋ｏｐｏ＋またはＴｔｉｅｈｏｄｅｍｚ属に 属するかびに適用されるように思われる。従って、この原理は真菌一般に適用で きる。

本発明のマルチコピー組込みの面は、発現ベクターを真核生物のゲノムにマルチ コピー組込みして形質転換した真核生物により異種蛋白質例えばリパーゼを製造 する方法を提供し、ここで前記発現ベクターは前記異種蛋白質をコードする発現 可能な遺伝子といわゆる「真核生物の増殖に必要な欠失選択マーカー」とを含有 し、この方法では前記発現ベクターは真核生物ゲノムのリポソームＤＮＡ遺伝子 座に前記発現ベクターをマルチコピー組込みできるリポソームＤＮＡ配列を含有 している。

さらに、真菌の増殖に必要な成分全てを含有するいわゆる「完全」または非選択 的培地で、本発明に従って形質転換した真菌を増殖させたときに、本明細書に上 記の発現ベクターが高いコピー数で安定に維持されうろことも発見した。通常に は、培地中には必須成分が存在するために新規合成は必要でないと考えられるた め、全酵母集団の内のマルチコピー組込み酵母細胞の割合が減少し、従って所望 のポリペプチドまたは蛋白質の産生が減少すると予想される。驚くべきことに、 新規合成が必要ではない状況にも関わらず、マルチコピー組込みは安定に維持さ れ、ポリペプチドまたは蛋白質が比較的大量に製造された。

本発明の詳細な説明によっても限定されるものではないが、観察された効果は次 の理論に基づくものと考えられる。未知の理由から、このような系では必須成分 の取り込みが限られているようである。従って、真菌がある最低値以上の増殖速 度で増殖するときには新規合成がまだ必要とされる。このため、「欠失マーカー 」のコピー数が大きい細胞は選択の面で有利である。

恐らく、必須成分例えばロイシンの活性取り込みは培地中にペプチド及びバリン のような他の成分が存在すると悪影響を受ける。

従って、一般に、この方法は、必須成分の取り込みが律速的なある限度以下の濃 度で必須成分を含有する培地で前記形質転換真菌を増殖させ、ある最低値以上の 増殖速度を得るには前記成分の新規合成が必要な方法と記すことができる。

完全培地の例は糖蜜、乳漿、酵母抽出物及びそれらの混合物のような工業用に使 用される増殖培地である。

本発明のもう１つの実施態様は、種々の型の上記酵素または関連した宿主での１ つの発酵的製造である。このような発酵は通常のバッチ式発酵、フエツドーパッ チ（１ｅｄ−ｂｘｌｃｂ）式発酵または連続発酵のいずれでもよい。どの方法を 使用するべきかの選択は宿主株及び好ましい下流の方法による。この実施態様に よると、微生物から発酵ブロスに酵素を分泌させるのが好ましく、その後濾過ま たは遠心分離で先ず細胞を除去して酵素をブロスから回収できる。

別の面では、本発明は例えば修飾及び製造に使用できる酵素及び組換えＤＮＡ法 に関する。

特定の実施態様では、本発明のこの面は修飾した酵素特に修飾したリパーゼの製 造に関する。従って、下記に示すこの面は特にリパーゼ例えばＰ＋ｅｕｄｏｍｏ ｎ＆＋属のリパーゼ例えばＰ。

ｇｌａｆｆｌｉｅ　（別名、Ｐ、ｇｌｘｄｉｏｌｉ）からのリパーゼを製造する 手法を提供し、さらに遺伝子学的に修飾したこのようなリパーゼを提供する。

本発明のマルチコピーの面の具体的な実施態様より詳細には、本発明は宿主真核 生物のゲノムに発現ベクターをマルチコピー組込みして形質転換した真核生物に より同種または異種の蛋白質を製造する方法に関し、ここで、前記発現ベクター は前記同種または異種の蛋白質をコードする本明頗書に前記定義の「発現可能な 遺伝子」と本明細書に前記定義のいわゆる「特定培地での酵母またはかびの増殖 に必要な欠失選択マーカー」の両方を含有しており、前記発現ベクターは真核生 物ゲノムのリポソームＤＮＡ遺伝子座に前記発現ベクターをマルチコピー組込み できるリポソームＤＮＡ配列を含有している。好ましくは、前記欠失選択マーカ ーはＬＥＵＮ遺伝子、ＴＲＰｌｄ遺伝子または［ＩＲ＾３ｄ遺伝子である。真核 生物は真菌、例えば酵母好ましくは５ａｅｅｈａｒｏｌｏ７ｃｅｓ　５Ｋｌｕ７ ｙｅ＋ｏｍ７ｅｅ＋またはＲｘｎｔｅｎｕｌａ属の１つ、またはかび好ましくは 人ｓｐａ＋ｇｉｌｌｕｉ　。

Ｒｈ１ｓｏｐｏ＋及びＴ＋１ｃｈｏｄ＋ｒｍａｔ属の１つである。好まし０方法 で（よ、必須成分の取り込みが律速的なある限度以下の濃度で必須成分を含有す る培地で前記形質転換真核生物を増殖させ、従って宿主生物及び方法条件により 異なるある最低値以上の増殖速度を得るには前記成分の新規合成が必要である。

好ましくは、このような培地は真核生物の増殖に必要な全ての成分を含有する「 完全」または非選択的培地、例えば工業用増殖培地例えば糖蜜、乳漿、酵母抽出 物及びその混合物である。

選択した蛋白質を本発明方法で十分に製造するためには、形質転換真核生物が、 リボゾームＲＮＡをコードする遺伝子座にあるまたはその遺伝子座と直接結合し た染色体の１つ各こ前記蛋白質をマルチメリックなの形で発現するために必要な 遺伝子を含有しており、同時に、同じ遺伝子座に前記「必須栄養素」合成の生化 学経路に必要な蛋白質をコードする欠失遺伝子のマルチコピーも存在することが 好ましい。このような発現遺伝子の例は、酵素好ましくは加水分解酵素特にリパ ーゼまたは遺伝子学的に修飾したこのような酵素をコードするものである。本発 明方法で製造できる特に好ましいリパーゼは、Ｃｈｒｏｍｏｂａｅｔｅｒｙｉｓ ｃｏ＋ｕｍ　ｖａｔ　１ｉｐｏ１７＋ｉｅａｍ　ＮＲＲＬ　Ｂ−３６７３由来の リパーゼに対する抗血清と交差反応するリパーゼ、Ａｌｃｘｌｉｇｅａｅｓ　Ｐ Ｌ−６７９，ＡＴＣＣ３１３７１またはＦＥＲＭ−Ｐ　３７８３由来のリパーゼ に対する抗血清と交差反応するリパーゼまたはＰｓｅｎｄｏａ＋ｏｎ１＋　ｆｌ ｃｏｔｅｓｃｅｎｌｌＡＭ　＋０５７由来のリパーゼに対する抗血清と交差反応 するリパーゼ、及びこのような交差反応性リパーゼの修飾型である。

特に好ましいリパーゼは、第２図に示すヌクレオチド配列、または前記ヌクレオ チド配列で特定される同じアミノ酸配列もしくは元のリパーゼに比べて洗剤系で 全体的な性能が改良されたリパーゼが得られるような修飾型のこのアミノ酸配列 をコードする任意のヌクレオチド配列を有する遺伝子でコードされる。

本発明方法に使用する形質転換真核生物は好ましくは本明細書に定義の「必須栄 養素」の合成を欠いており、そのため欠失選択マーカーが「必須栄養素」の合成 の相補に寄与しうる真核生物である。親株の欠失は前記必須栄養素を産生ずるた めの生合成経路に有効な酵素をコードする遺伝子の置換により得られる。親株が 欠失している酵素が、必須栄養素が形成されるまで分岐しない生合成経路の一部 の反応を触媒すると特に有利である・必須栄養素の例はアミノ酸、ヌクレオチド またはビタミン、特にアミノ酸のロイシン、トリプトファンまたはウラシルの１ つである。

本発明のもう１つの実施態様は上記のような方法であって、ここで、発現ベクタ ーはベクター中に適音存在する配列の他に、（ｉ）ｄｓリポソームＤＮＡまたは その一部例えばリポソームＲＮＡをコードするｄ　５ＤＮＡ配列、及び（目）５ ’−−−＞３’方向に次の順序で（酉）（Ｉ）宿主生物で作動可能な強力プロモ ーター、（ｉｉ）　（ｂ）任意に、宿主真核生物からの前記蛋白質の分泌を促進 するシグナル配列、 （ｉｉ）　（ｃ）蛋白質をコードする構造遺伝子、（ｉｉ）　（ｄ）宿主真核生 物で作動可能な有効なターミネータ−を含有しているＤ　Ｎ　Ａ配列 を含有している方法である。

リポソームＤＮＡは、かび特にＡ＋ｐｃ＋ｇｉｌｌｏｓ　％Ｒｈ１ｘｏｐａ＋及 びＴ＋ｉｅｈｏｄｅｒｍｘ属のかびのリポソームＤＮＡ、または酵母特にＳ！ｃ ｅｂｔ＋ｏｍ７ｅｅ＋　、　Ｋｌｕｙｖｅ＋ｏｍ７ｃ＋＋　、　Ｈｇｎ＋ｅｎｕ ｌｚ及びＰｉｃｈＩ属の酵母のリポソームＤＮＡでよい。

実験は、ベクターが宿主生物の１つのリポソームＤＮＡ単位とほぼ同じ長さであ るときに最良の結果が得られることを示している。例えば、染色体ＤＮＡのリポ ソーム単位が約９ｋｂのときには、約１４ｋｂまたは５ｋｂのベクターは安定に は維持されず、約８〜ＩＧｋｂのベクターは安定に維持された。

発現可能な遺伝子を制御するプロモーターは好ましくは次のものである： （ｉ）宿主が５ｚｅｅｈ＊ｒｏｍ７ｃｅｓ属に属するときには、Ｇ１１７プロモ ーター、ＧＡＰＤＨプロモーター、またはＰＧＭプロモーター、（１１）宿主が ＫＩＢｖｅｒｏｍ７ｃｅ＋属に属するときには、イヌリナーゼプロモーター、Ｐ ＧＫプロモーターまたはＬＡＣ４プロモーター、（ｉｉｉ　）宿主がＨａｎｓｅ ｎｏｌｚ属に属するときには、［１ＨＡＳプロモーターまたはＭＯ！プロモータ ー、 （１マ）宿主が＾ｉｐ＋Ｂ１１１１１＋属のかびに属するときには、グルコアミ ラーゼプロモーター、グルコースオキシダーゼプロモーターまたはＧＡＰ［ｌｌ Ｉプロモーター、（Ｖ）宿主がＲｈ１ｘｏｐｕ＋及びＴｒｉｃｈｏｄｅｔｍｘ属 に属するときには１セルラーゼプロモーターまたはＣＡＤＰＩＩプロモーター。

構造遺伝子がオキシダーゼをコードするときには、宿主細胞は［！ｘｎｉｅａｏ １ｇまたはＰｉｃｈｉｘまたは人＋ｐｅＢｉｌｌｕ＋属に属するのが好ましい。

もう１つの好ましい実施態様は発現可能な構造遺伝子が免疫グロブリンのＬ鎖ま たはＨ鎖または好ましくは両方、または免疫グロブリンのＬ鎖またはＨ鎖の一部 、好ましくは通常ＦＡＢフラグメントと呼ばれる部分または可変部をコードする 方法に関する。この実施態様は修飾免疫グロブリンまたは触媒活性を有する免疫 グロブリン（アブザイム、　Ａｂｕｓｅ）を得る遺伝子工学処理により修飾した 遺伝子の使用にも関する。

好ましい発現ベクターはさらに宿主細胞の遺伝子から欠失または破壊された酵素 をコードする欠失遺伝子、より好ましくは必須栄養素例えばロイシン、トリプト ファンのようなアミノ酸またはウラシル、ヌクレオチドまたはビタミンを製造す る生合成経路に有効な酵素をコードする欠失遺伝子を含有している。

本発明方法は通常のバッチ式発酵、フエツドーパッチ式発酵または連続発酵とし て実施できる。染色体内で少なくとも２０゜好ましくは少なくとも５０コピーの 欠失遺伝子を維持できるような濃度で必須栄養素を培地が含有しており、前記欠 失遺伝子はその必須栄養素の生合成に関与する酵素をコードするのが好ましい。

宿主の増殖速度が、同じ発酵条件下の、前記必須栄養素を欠失していない同様な 宿主の最大の増殖速度の２０〜１００％、好ましくは８０〜１００％のときに、 形質転換真核生物が産生ずる蛋白質の収率は良好になる。

本発明のリパーゼの面の背景 リパーゼ及びプロテアーゼは両方とも洗剤及び洗浄用組成物の成分として知られ ている。プロテアーゼが広（使われている。

公知のリパーゼ含有洗剤組成物の例はＥＰＡ　Ｏ２０５２０１１及びＥＰＡ　０ ２０６３９０　（Ｕｎｉｌｒｙｅ＋）に示されており、これは免疫学的関係及び 布の洗濯での優れた洗浄力に基づき定義した種類のリパーゼに関する。好ましい 種類のリパーゼには例えばＰ。

■ｌ１ｏｔｅｓｃｅ１１５　Ｐ、　ｇｌｘｄｉｏｌｉ及びＣｈｔｏｍｏｂａｅｓ ｌｅｒ種由来のリパーゼが含まれる。

ＥＰＡ　０２１４７６１　（ＮＯＶＯ）及びＥＰＡ　０２５８０６８　（ＩＩＯ ＶＯ）　ハ各々ある種の微生物由来のリパーゼ及び記載した酵素の洗剤添加物及 び洗剤組成物への使用を詳細に説明している。ＥＰＡｏ　２１４７６１はＰ、ｃ ＋ｐｉｃ日種の生物由来のリパーゼ及びその使用について詳述している。ＥＰＡ ０２５８０６８はＴｈｓｒｍｏｍ７ｃ＋＋属の生物（以前はｔｌｎｍｉｃｏｌａ と呼ばれていた）由来のリパーゼ及びその使用について詳細に述べている。

プロテアーゼがリパーゼを攻撃する傾向があるため、洗剤組成物にリパーゼとプ ロテアーゼを同時に配合することが困難である。

これらの欠点を緩和する方法が提起されてきた。

このような試みの１つはＥＰＡ　０２７１１５４　（Ｕａｉｌｅｖｅ＋）に述べ られており、等電点が１０未満である選択したプロテアーゼはリパーゼと有利に 混合できることが示されている。

もう１つの試みはＷＯ８９１０４３６１（ＮＯ１’Ｏ）に記載されており、これ はＰ＋ｅｕｄｏｍｏａｏ＋＋［由来のリパーゼとＦｕｓｔｒｉｏｍ由来のプロテ アーゼまたはある種の方法で１６６、１６９または２２２位のアミノ酸配列を突 然変異させたサブチリシン型プロテアーゼを含有する洗剤組成物である。記載の 特定のプロテアーゼによるリパーゼに対する攻撃の程度は幾分小さいと報告され ている。

本発明のリパーゼの面 本発明はその１つの面で、アミノ酸配列の少な（とも１つを突然変異させ、プロ テアーゼによる攻撃に対して安定性を改善した、組換えＤＮＡ手法により産生じ たリパーゼを提供する。

例えば、本発明はＣｈ＋ｏｍｏｂａｃｌｅ＋　ｖｉ＋ｅｏｔａｍ　？！１．　１ ｉｐｏ［７目ｃｏｗＮＲＲＬ　Ｂ−３６７３由来のリパーゼまたは？ｅｕｄｏｍ ｏｏａｓ　１ｌｏｏｒｅ＋ｅｅｎｓＪＡＭ　１０５７由来のリパーゼに対する抗 血清と免疫学的に交差反応性を示し、リパーゼのアミノ酸配列に影響する突然変 異を少なくとも１つ有する、組換えＤＮＡ手法により作成した遺伝子を含有する 人工的に修飾した微生物が産生ずる、プロテアーゼによる攻撃に対する安定性が 改善されたリパーゼを提供する。

人工的に修飾した微生物には、リパーゼの元の遺伝子が欠失しているＥ＋＋ｈ！ ｒｉｃｈｉｔ　＋ｏｌｉ、ＰＩｅｎｄａｍｏｎ＊ａ　ｘｅｒｎｇｉｎｏｇｘ、Ｐ 、ｐｕｔｉｄｉ及びＰ、ｇｌａｍｇｅ　、　Ｂｉｅｉｌｌｎ　＋ｕｂ＋１ｌｉｓ 及び種々の＾ｇｐｅ＋ｇｉｌｌｕｓ　、Ｒｈｉ＋ｏｐｕｘ及びＴｒｉｅｂｏｄｅ ｒｍｘ属、Ｓｇｅｅｈ＊＋ａｍ７ｃ＋＋＋ｃｒ＋ｖｉｉｉｘｅ及び関連した種、 Ｈｚｎ＋ｅ＋ａｆＩｐｏ１７ｉｏ＋ｐｈｘ、Ｐｉｃｂｉｉ及び関連した種、Ｋｌ ｕ７ｗｅｒｏｍ７ｅｅ＋　ｍａ＋ｘｉｘａａｓ及び関連した種が含まれる。これ らの宿主細胞は広範囲の種々の微生物を表し、実施例で詳述した微生物以外の微 生物も宿主細胞として同様に使用できる。

修飾したリパーゼは洗剤または洗浄用組成物の一部として使用すると活性及び安 定性の両方の点で利点がある。

このようなリパーゼでは、例えば次のものから突然変異を選択できる （ｉ）導入しないときには蛋白質分解されやすい部位への１つ以上のプロリン残 基の（例えば挿入または置換による）導入：（ｂ）（例えば正に帯電したアミノ 酸残基の挿入または中性または負に帯電したアミノ酸残基の置換による）リパー ゼ分子の正味正電荷の上昇。

（ｅ）選択した宿主細胞内でグリコジル化され、グリコジル化されたリパーゼの 蛋白質分解に対する安定性を改善できるリパーゼのアミノ酸残基の組合せのく挿 入または置換による）導入。

本発明は組換えＤＮＡ手法による酵素産生可能な修飾微生物の作成法も提供し、 この方法の特徴は、微生物に導入する酵素をコードする遺伝子を（修飾した）プ レー配列の５°末端に融合することである。

本発明の特定実施態様では、細菌起源の遺伝子を好適なプレ配列と共に真核生物 に導入する。

従って、ある面では、本発明は、酵素をコードし、元は上記生物の１つから由来 の酵素またはこれら酵素の修飾形を産生できる遺伝子を含有する組換えＤＮＡ手 法を使用して人工的に修飾した微生物、及びこのような人工的に修飾した微生物 に基づく酵素製造のための発酵法を提供する。

微生物の特別の性質とは別に発酵法自体は公知の発酵手法、慣用の発酵及び下流 加工装置に基づくものでよい。

本発明の別の面によると、プロテアーゼ消化に対する安定性を高めるように選択 したアミノ酸配列の修飾を有する、Ｐ＋ａｎｄｏｍｏｎａ＋由来の修飾（突然変 異株）リパーゼまたは他の好ましい種類のリパーゼは洗剤及び洗浄用組成物特に 例えばプロテアーゼ例えばサブチリシン型プロテアーゼと組み合わせた組成物に 有用であることが発見された。

このような突然変異の好適で現在のところ好ましい例はＨ口１５４　Ｐｒｏ突然 変異を有する？ａｅｄｏａ＋ｏｏｇｓ　ｇｌｕｉ！ｅ由来の突然変異株リパーゼ であり、これはリパーゼの三次構造のループの１つのプロテアーゼ消化を受けや すい部位をより消化されにくい部位で置換したものと考えられている。

本発明の他の面によると、リパーゼの正味の正電荷及びそのｐｌを上昇させるよ うに選択したアミノ酸配列の修飾を有する、Ｐｒｅｎｄｏ■ＱｆｉｌＳ由来の修 飾（突然変異株）リパーゼまたは他の好ましい種類のリパーゼは洗剤及び洗浄用 組成物特に例えばプロテアーゼ例えばサブチリシン型のプロテアーゼと組み合わ せた組成物に有用であることが発見された。

好ましい突然変異には、例えば、負に荷電した残基（例えばアスパルテートまた はグルタメート）の欠失、または中性の残基（例えば、セリン、グリシン及びプ ロリン）による置換または中性、または負の残基の正に荷電した残基（例えば、 アルギニンまたはりシン）での置換、または正に荷電した残基の挿入を含む。

正味の正の電荷及びｐｌを上昇させるこのような突然変異の好適例には、ＤＩ５ ７Ｒ、Ｄ５５＾及びｌｌｌ０Ｋが含まれる。選択した宿主内でグリコジル化され 、それにより蛋白質分解に対する安定性を改善できるアミノ酸残基の組合せの（ 例えば挿入または置換による）導入の好適例は突然変異Ｄ１５７Ｔ及びＮ１５５ とＮ１５６の間のＧの挿入である。

過剰なグリコジル化を避けるためまたは余り望ましくない位置のグリコジル化を 除くために、元のリパーゼのグリコジル化されつる部位を除去することができる 。

好マシイ種類のリパーゼの中で、Ｐａｅｕｄｏａｏｎｘ＋　ｇｌｕｍｔｅ　（以 前は、またより一般的にはＰＩ＋ａｄｏｍｏｎａ＋　ｇｌｘｄｉｏｌｉと呼ばれ る）が産生ずるリパーゼは本発明方法及び生成物の好ましい基盤である。好まし いリパーゼをコードする遺伝子のヌクレオチド配列もアミノ酸配列もこれまで知 られていなかった。本発明者らは下記に示すようにこの細菌の好ましいリパーゼ をコードする遺伝子を単離した。

本発明はこの遺伝子をクローニングベクターに導入することにより遺伝学的に得 られる物質並びに新しい宿主細胞を形質転換するため及びこれらの新規の宿主細 胞でリパーゼ遺伝子を発現させるためのこれらの使用を提供する。

有用な異種の新しい宿主細胞には、例えばＥ＋ｃｈ＋ｅｉｅｉｉｃｏｌｉ　、Ｐ ＋ｅａｄｏｍｏｎｚ＋　ａ＋ｒｕｇｉｎｏ＋ｔ、Ｐ、ｐｏ＋ｉｄｉが含まれる。

また、元のリパーゼ遺伝子が欠失しているＰ、　ｇｌｕｍ＋ｅも好適な宿主であ る。大量生産に好ましい宿主系はＢａｃｉｌｌｕ＋　５ａｂｔｉ１口、５ａｅｃ ｂ＋＋ｏｍＨ＋＋　ｃｅ＋ｅｖｉ＋ｉｓｅ及び関連種、ＫＩｕ７ｗｅｒｏｍ７ｃ ｅ＋ｍａｒｔｉｚｎ＋＋＋及び関連種、Ｌｎ＋ｅｎｕｌａ　ｐｏ１７ｍｏ＋ｐｂ ｘ、Ｐｉｃｈｉｘ及び関連種並びに人ｓｐｅｒｇｉｌｌｕ＋　、　Ｒｈ１ｘｏｐ ｕ＋及びＴ＋１ｃｂｏｄ＋＋ｍｇ属のものである。（突然変異）リパーゼを効率 的に分泌するように特に選択及び／または修飾したゲノム陰性菌も大量生産に好 適な宿主である。

これらの宿主細胞は広範囲の種々の微生物を表し、実施例に詳述していない他の 微生物も同様に宿主細胞として使用できる。

本発明のもう１つの実施態様は好ましい宿主の１つで上記酵素をコードするヌク レオチド配列を持つ遺伝子の発現を誘発できるベクターに係り、これは好ましく は次のものからなる：（ａ）（好ましい選択宿主用の）分泌シグナルの直接下流 にある成熟酵素またはブレー酵素をコードするｄ　ｓ　ＤＮＡ　；翻訳されるべ き遺伝子の部分がコドンＡＴＧで開始されない場合にはＡＴＧを前部に配置しな ければならない。遺伝子の翻訳された部分は常に適切な停止コドンで終わらなけ ればならない。；（ｂ）　（りのｄ　ｓ　ＤＮＡのプラスストランドの上流に位 置する（選択した宿主細胞に適切な）発現レギユロン：（ｃ）　（ｂ）のｄｓＤ ＮＡのプラスストランドの下流に位置する（選択した宿主細胞に適切な）ターミ ネータ−配列：ｆｄ＋必須栄養素を欠いた選択宿主のゲノムへの（ａ　−Ｃ）の ｄ　ｓ　ＤＮＡの組込み、好ましくはマルチコピー組込みを促進するヌクレオチ ド。マルチコピー組込みを促進するヌクレオチド配列はｄｓリポソームＤＮＡま たはこの配列の少な（とも一部である。さらに宿主細胞にない酵素をコードする 欠失遺伝子を含有するｄｓＤＮＡ配列が組込みベクターに存在しなければならな い。そして、 （ｅ）任意に、−次的な不活化または変性及び／または選択した宿主内での酵素 前駆体の１つの成熟及び／または分泌に関与する蛋白質をコードするｄｓＤＮＡ 配列。

以下の実施例で本発明を説明しよう。

実施例１、　Ｐ、　ｇｌＩｌｍａｅの（ブレ）−リパーゼをコードする遺伝子の 単離及び特徴付け。

実施例２．　リパーゼ陰性Ｐ、ｇｌａｍｘｅ株ＰＧ２及びＰＯ２の構築。

実施例３．　ｐ、ｇｌｏｍｘｅ　（ブレ）−リパーゼをコードする合成遺伝子の 構築。

実施例４．　リパーゼ陰性Ｐ０ｇｌｕｍｘｅ　ＰＯ２への（野生型）合成リパー ゼ遺伝子の導入。

実施例５．　突然変異リパーゼ遺伝子の産生及びＰＯ２への導入。

実施Ｎ６．　ｇ動複製スミドを使用すルＳ＊ｃｃｈ２ｒｏｍＩｃｅ＋ζξＩｅマ ロ目ｅでの合成リパーゼ遺伝子の発現。

実施例７．　マルチコピー組込みを使用する５ｘｅｃｈａ＋ｏｍ７ｃｅｔＣｅｄ ｅマロ目ｅでの合成リパーゼ遺伝子の発現。

実施例８．　マルチコピー組込みを使用する５ｚｅｃｂ＋ｒｏｍ７＋ｉ＋ｃｅ＋ ｅｙロＩＣでのグアーα−ガラクトシダーゼの産生。

実施例９．　他の欠失選択マーカーを使用すルＬｃｃｈａｒｏｍ７ｅｅｓｃｅｒ ｅマ目ＩＣでのマルチコピー組込み。

実施例１０．　連続培養でのマルチコピー組込み体の安定性。

実施例１１．　マルチコピー組込み体５Ｕ５０Ｂの安定性に作用するパラメータ 。

実施例！２．　Ｈｘｎ＋ｅｎ山ｐｏ１１ｍｏｒ山での合成リパーゼ遺伝子の発現 。

実施例＋３．　マルチコピー組込みを使用するＨ＋ｎ＋ｅｎｕｌａｐｏｌｙｍｏ ＋ｐｂ＋でのグアーα−ガラクトシダーゼの産生。

実施例１４．　ＫｌａｙｖｅｔｏｍｙｃｃＩでのマルチコピー組込み。

実施ｆＰ＋　１−６及び１２はリパーゼ遺伝子の４１離、クローニング及びプラ スミドベクターを使用する酵母５ｘｅｃｂ＋＋ｏｉ７ｃ＋＋ｃｅ＋ａｙｉ＋ｉａ ＋及びＨ＋ｏ＋ｅｎｕｌａ　ｐｏ１７ｍｏ＋ｐｈａでの発現に関する。

実施例７は本発明の発現ベクターをマルチコピー組込み後の酵母Ｓ＆ｃ＋ｂｉ＋ ｏｍ７ｃｅ＋　＜ｈｒｒマロＩＣでのリパーゼ遺伝子の発現に関する。

実施例９−１１はマルチコピー組込みの他の面に関する。

実施例８及び１３は酵母Ｓｚｃ＋ｈａ＋ｏｍ７ｃｅ＋　ｃｅ「ｅｙｉ＋ｉｉｅ及 びＨａｎ＋＋ｎａｌｉ　ｐｏ１７ｍｏ＋ｐｈｉでのグアーα−ガラクトシダーゼ の発現に関する。

実施例１４はマルチコピー組込みがＫｌｕ７ｙｅｒｏｍ７ｅｅｓ酵母で実施でき ることを示す。

ＬＢ培地中で一晩培養した１５ｍ　ｌの培養物の細胞を遠心分離テＪＩ１６ｆ、 　（Ｓｏ＋Ｖｚｔｌ　ＨＢ　４　ｏ−タ、Ｉｏ、００Ｏｒｐｍ　、　１０分間） 。細胞ペレットを一２０℃で一晩保存した。

細胞を解凍し、２ｍｇ／ｍｌのリゾチームを含有する５ＳＣ（０，１５Ｍ　Ｎ　 ａ　ＣＩ、　Ｑ、　ＯＬ５Ｍクエン酸ナトリウム）Ｉｌｌｍｌに再１％ｌＩすせ た。３７℃に３０分間インキュベートシタ後、ｌｏ％ＳＤ８０５ｍｌを加え、７ ０℃で１０分間インキュベートした。４５℃に冷却した後、プロテイナーゼＫ　 （Ｔ＋ｉ＋−ＭＣＩ、　ｐ　Ｈ７，０に２ｍｇ／ｍｌ、４５℃で３０分間ブレイ ンキュベート）１ｍｌを加え、混合物をさらに３０分間４５℃でインキュベート した。次に、５Ｍ　ＮａＣｌ０　３．２ｍｌを加え、ＣＨＣｌ３／イソ−Ｃ５Ｈ １１０Ｈ（２４：　ｌ）で２回抽出し、各抽出の後には遠心ステップ（Ｓｏ＋ｖ ｓｌｌ　Ｈ３４，５，０００＋ｐｏ／　１０分）を行った。エタノール１０ｍ１ を加えて上清からＤＮＡを沈澱させた。７５％エタノールで洗浄した後、ＤＮＡ ペレットを２ｍｌの水に再懸濁させた。

遺伝子バンクの調製 Ｌｎｉｔｔｉｓ　（？）が記載のように、Ｐ、　ＧｌｕｗｘｅのＤＮＡ調製物を 制限酵素Ｓ■３Ａで部分的に消化した。コスミドベクターｃ２Ｒ８（８）を、い ずれもコスミドに１つの認識部位を持つ酵素であるＳｍｓ　ｌ及びＢｇａＨｌで 完全に消化した。　（５０ｍ　Ｍ　丁ｒｉｉ−［ＩＣｔ、ｐＨ７，５、ｌＯｍ　 Ｍジチオトレイトール（ＤＴＴ）　、ｔＯｍＭＭｇＣＩ　２及び０．５ｍＭｒＡ ＴＰ中の）Ｔ４ＤＮＡリガーゼを使用して、過剰のベクター断片をＰ、　ｇｌｏ ｍｘｅ由来のＤＮＡ断片に連結した。Ｂｏｈｎ　（９）が記載のように、このよ うにして得た組換えＤＮＡをファージ粒子に充填した。この方法で得られた完全 なファージ粒子を使用し、トランスフェクションにより大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｔ　 ）　１０４６　ｍｅｔ、ｇ！ｌ　、ｔｉｃ　ｓ　ｈｓｄＲ，ｐｈ！、＋０９Ｅ、 １１＋ｄＬｒｅｃＡ　を形ｉｔ転換した。

０．４％のマルトースを含む新しいＬＢ培地５ｍｌに大腸菌（Ｅ、ｅｏｌｉ　） 　１０４６の一晩培養物０．５ｍｌを接種し、連続的に振とうしながら３７℃で ６時間インキュベートした。ファージ粒子を感染させる前に、Ｍ　ｇ　Ｃｌ　２ とＣａ　Ｃｌ　２を最終濃度１０ｍＭまで加えた。典型的な実験では、ファージ 粒子５Ｇμｍを細Ｍ＆５０μｌと混合し、混合物を３７℃で１５分間インキュベ ートし、ＬＢ培地１００μｍを加え、３７℃で３０分間インキュベーショを続け た。

細胞をアンピシリン（Ｂ＋ｏｃ！ｃｅｌ）　７５Ｍｇ／ｍ　＋含有のＬＢ−寒天 板に直接プレートした。３７℃で一晩増殖させると、約３００コロニーが得られ た。

オリゴヌクレオチド合成 リパーゼをコードするＤＮＡ断片のプローブとしては、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏ ＋７ｓ＋ｅｍｓ　Ｇｓ＋　Ｐｈｔｓｅ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　５ｅｑａｓｎｃｅｒを 使用して、エドマン分解で測定した２４個のＮ−末端アミノ酸（下記）配列に基 づくオリゴヌクレオチドを使用した。

確立されたアミノ酸配列に基づいて、アミノ酸配列をコードする可能性のある全 てのヌクレオチド配列を得た。可能なヌクレオチド配列のすべてまたは一部を含 有するデオキシ−オリゴヌクレオチド（いわゆる混合プローブ）はＰｈｏ＋ｐｈ ｏａｍｉｄｉ＋　手法（１Ｇ）を使用してＤＮＡ　＋７ｎｔｈ＋＋ｉ＋ｅ＋　（ Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｎ＋ｌｅｍ＋　３８ＯＡ）で合成した。１６％また は２０％ポリアクリルアミドゲル（７）でオリゴヌクレオチドを精製した。

放射性標識オリゴヌクレオチドプローブ一般に、精製したオリゴヌクレオチド０ １〜０．３μｇを、最終容量１５μｌの５０ｍ　Ｍ　Ｔ＋ｉ＋−［ＩＣ１、ｐＨ ７，５、ｌｏｍ　Ｍ　Ｍ　ｇ　ＣＩ　２．０．１ｍＭ　ＥＤＴＡ、　１０ｍＭ　 ＤＴＴ　、７０μＣｉ　ｒ　−３２Ｐ−ＡＴＰ（３０００Ｃｉ　／ｍｍ　ｏ　１ 　、＾ｍ＋＋ｘｈａｍ）及びＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（へｍ＋目ｈｘｍ） 　１０単位中、３７℃で３０分間インキュベートした。反応を０．５ＭεＤ丁＾ 、ｐＨ８，０１０μｌで終結させ、ＴＥノくラフｙ　（１０ｍＭＴ＋ｉ＋−ＨＣ ｌ　ｐＨ８，０及び１ｍＭＥＤＴ＾）で平衡化した２、５ｍｌの５ｃｐｈ＋ｄ＋ ｒ　Ｇ２５カラム（使い捨てシリンジ）を通した。

２５０μｍの両分を集め、そこから最初の２つの放射活性画分く通常画分４及び ５）を集め、／％イブリッド形成に使用した。

遺伝子バンクのスクリーニング 上記のように実施したいくつかの充填及びトランスフェクション実験から、全体 で約１００Ｇ個の別なコロニーが得られた。これらのコロニーを１ウエル当たり 　１５０μｍのＬＢ−培地（１００μｇアンビンリン／ｍ１）を含有するＥＬ　 Ｉ　ＳＡプレート（Ｃ＋＋ｉｎ＋＋　、　Ｆ型）に移した。３７℃で一晩増殖さ せた後、マイクロタイターウェルに合うように配列させた６８本のピンからなる 自家製のテンプレートを使用してデュブリケートを作成した。

マスタープレートのウェルに５０％グリセロール５０μｌを加え、テンプレート を使って注意深＼混合した後、これらのプレートを一８０℃で保管した。

デュプリケートを使用して遺伝子ノくンクをニトロセルロースフィルター（Ｍｉ ｌｌｉｐｏｒｅ　、　［ＩＡＴＦ型、０．４５μｍ、径１４ｃｍ）ｊこ移した。

この目的で、セルロースフィルターをアンピシリン　１００μｇ　／　ｍ　ｌ含 有ＬＢ−寒天プレート上に置いて予め湿らせた。

テンプレートを使用して細菌を移した後、コロニーを３７℃で一晩増殖させた。

０．５ＭＮａＯＨ１１，５ＭＮａＣ１で１５分間飽和させた、重ねたＷｂ＋ｌ１ ｍｔｎ　Ｓ　Ｍｌ１紙の上にフィルター上のコロニーを置いて、フィルター上の コロニーを溶解させた。フィルターを乾いた紙の上に置いて過剰な液体を除去し た後、ＩＭＴｒｉ＋−ＨＣｌ、ｐＨ７、Ｏｌｌ、５ｍＭＮａｃｌで２〜３分間飽 和させた重ねた３ＭＭ紙上にフィルターを置き、中和した。最後に、フィルター を１ＯｘＳ　Ｓ　Ｃ（１，５ＭＮ　ａ　Ｃｌ　、０．１５Ｍクエン酸ナトリウム ）に３０秒間浸し、空気乾燥させ、８０℃の真空オーブンで２時間焼−）た。

（プレ）ハイブリッド形成の前に、３ｘＳＳＣ，０，１％ＳＤＳ中、６５℃で数 回バッファを取り替えながら１６〜２４時間フィルターをよく洗う。コロニーが 見えなくなるまで洗浄を行った。

５ｘ　Ｓ　Ｓ　Ｃ，５ｘＤ＋ｎｂａ＋ｄ＋＋　（１０ｘＤｅｎｈａｒｄｔ＋　＝ 　０．２％フィコール、　０２％ポリビニル−ピロリドン、　０，２％牛血清ア ルブミン）、［１，１％ＳＤＳ、５０ｍＭ燐酸ナトリウムｐＨ７，５，１％グリ シン、牛胸線ＤＮＡ　（せん断し、熱変性させた）１００μｇ／ｍｌ、ｔＲＮＡ 　５００μｇ／ｍｌ及び５０％脱イオンホルムアミド中、３７℃で２時間、フィ ルターをブレ１１イブリツド形成させた。

（上記の）放射活性標識した混合プローブ（ｖｉｓ０２．３２ヌクレオチド）に よるノ＼イブリッド形成は、　５ＸＳＳＣ，ＬＸＤｓｎｈｘ＋ｄｌｉ　、０．１ ％ＳＤＳ、２０ｍＭ燐酸ナトリウムｐＨ７，５、牛胸線ＤＮＡ　１００μｇ／ｍ 　ＩＳ’ｔ　ＲＮＡ　５００μｇ／ｍ　ｌ及び５０％脱イオンホルムアミド中、 ３９℃で１６時間実施した。／１イブ「ノット形成後、フィルターを次のように 洗った：　５ｘ　Ｓ　Ｓ　Ｃ，室温で１５分３回、２ｘＳＳＣ，０，１％ＳＤＳ 、室温で１５分１回、オリゴヌクレオチドプローブの性質に応じて続けた。ｖｉ ｓ０２では、予熱した０、１ＳＳＣＯ，１％ＳＤＳ中、３７℃で１５分間さらに 洗浄した。

上記の遺伝子バンクのスクリーニングで、いくつかのコスミドクローンを単離し た。以降の研究用にクローン５Ｇ３（本明細書以下には、［１Ｒ６０００とする ）を選択した。

リパーゼ遺伝子の配列決定 ｐＵＲ６０００をＲａｍ）Ｉｆで消化して得られたＤＮＡ断片をＢｘｍＨｌで切 断したプラスミドｐＥＭＢＬ９　ｆｉｌ）に連結し、得られた組換えＤＮＡを使 用して、Ｃａ　Ｃｌ　２法で大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ　）　ＩＭｌｆｌｌ（１２） を形質転換し、Ｘ−ｇｉｌ　トＩＰＴＧ（７）　ヲ補ツｔ−Ｌ　Ｂ　＊天板ｉ、 ニブレートした。

６８個の白いコロニーをマイクロタイター板に移し、コスミドバンクについて記 載したものと同じスクリーニング手順を行った。いくつかの陽性クローンを単離 できた。これらのコロニーの１つから単離した代表的プラスミドを第１図に示す 。これをｐ０１１６００２と呼ぶ。このプラスミドをＥｃｏＲＩで消化すると、 各々〜４．ｌｋｂ及び〜２．ｌｋｂの長さの２つの断片がゲル上に認められた。

もう１つのプラスミドｐＵＲ６００１は反対の配向にＢａｍＨＩ断片を含有して いた。ＥｃｏＲｌで消化した後、このプラスミドは各々長さ〜６．Ｉｋ、ｂ及び 〜？Ｏｂ　ｐの断片が得られた。

本質的に同じ方法で、ｐ［１Ｒ６００６を構築した。この場合、ｐ［１Ｒ５００ ０をＥｃｏＲＩで消化し、次に断片をプラスミドｐＬＡＦＲｌ　（１３）のＥｃ ｏＲｆ部位に連結させた。形質転換体をスクリーニングした後、〜６　ｋ、　ｂ のＥｃｏＲＩ断片を含有するｐＵＲ６００６（第１図）と表す陽性クローンを選 択した。９ＵＲ６０［＋１及びｐＵＲ６００２の精製ＤＮＡは、ａ−３５Ｓ−ｄ ＡＴＰ　（２０００Ｃｉ／ｍｍｏ　ｌ）及びフレノウ酵素（＾ｃｅ＋＋ｈｘｍ） 、ｄｄＮＴＰ　（ｊｂ！＋ｍａｃｉｉ−ＰＬ　Ｂｉｏｃｂｅｍｉｃ＋ｌ＋）及び ｄＮＴＰ　（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅ＋）を使用する、Ｂｉｇｇｉｎら（１５）が記 載のような変更を加えたＳｚｎｇｅｔのジデオキシチェインターミネータ−手順 （１４）によるヌクレオチド配列決定に使用した。ｄＧＴＰを　７−ジアザ−ｄ ＧＴＰで置換した５ｅｑｏ＋ｎ１＋ｅキツト（ＵｎｉｔｅｄＳ自ｔｅ＋　Ｂｉｏ ｃｈｅｌｌｉｅａｌ　Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）も使用した。配列決定の反応生 成物は、Ｂｉｇｇｉｏら（１５）の記載のようにバンファ勾配を使用する変性ポ リアクリルアミドゲルで分離した。

Ｐ、ｇｌｏｍ＋ｅ　リパーゼ（本明細書以下にはｇｌｕｍ！ｅリパーゼともに示 す。

ヌクレオチド配列は停止コドンが続＜３５８個のアミノ酸残基をコードする読み 取り枠を含んでいる。

推論したアミノ酸配列を第２図のヌクレオチド配列の下にＩＵＰＡＣの１文字表 示で示す。

Ｐ、　ｇｌａｆｆｉ＆ｅ培養ブロスから精製したリパーゼ酵素のＮＨ２−末端ア ミノ酸配列はＡｌａＡ＋ｐＴｈ＋Ｔｙ＋＾ｔ＋ＡｌｔＴｈ＋Ａ＋ｇＴ７ｒＰ＋ｏ Ｖ＆１ｌｌａＬｅｏＶｔｌｆ１ｉ＋Ｇ１７Ｌ＋ｕＡｌａＧ１７ＴｂｒＡ＋ｐＬ７ ｉ　（＝　ＡＤＴＹＡＡ丁ＲＹＰＹＩ１４ＨＧＬＡＧＴＤＫ）と同定された。こ のアミノ酸配列はヌクレオチド１１８〜１８３がコードするものである（第２図 ）。先ず、これらの知見から、成熟したリパーゼ酵素は３１９個のアミノ酸残基 からなり、分子量の計算値は３３．０９２ダルトンであると結論できる。第二に 、酵素は３９個のアミノ酸残基のＮ−末端延長（第２図の−３９から−１）を持 つ前駆体として合成される。

科学文献から、分泌される蛋白質の大部分は前駆体蛋白賀として細胞内で作られ ることがよく知られている（１６）。最も一般的には、これらの酵素はＮ−末端 延長を有しており、いわゆるリーダーペプチドまたはシグナル配列を有している 。このペプチドは細菌の膜との最初の相互作用に関与している。

ゲノム陰性菌で見られるシグナル配列の一般的特徴は次の通りである： １、（平均して）２個の正に荷電したアミノ酸残基を含有するアミノ−末端領域 ： ２．１２〜１５残基の疎水性配列； ３、セリン、アラニンまたはグリシンで終わる切断部位領域；４、全長約２３個 のアミノ酸。

驚くべきことに、リパーゼのシグナル配列はむしろ長い３９個のアミノ酸からな る。さらに、リノく−ゼのシグナル配列ζｉＮ−末端に４個の正に荷電したアミ ノ酸を含有している。

ゲノム陰性菌では、これは例外的な型のシグナル配列と思われる。

他の生物からの関連リパーゼをコードする遺伝子の単離前記のように、Ｐ、ｇｌ ｕＩｌｌｚｅ　リパーゼは免疫学的に関連するリパーゼの群に属している。この ことから、これらの酵素は異なる生物で産生されるにも関わらず、極めて保存さ れた一連のアミノ酸配列を含有していると考えられる。

その結果、ＤＮＡ配列にはある程度の相同性がなけれｉｆならない。

本出願人らはＰ、ｇｌａｍｇ＋　リパーゼ遺伝子を自由に使用できるため、他の 生物から関連したリパーゼ遺伝子を単離することは容易である。

これは本質的に上記と同じ方法で実施できる。

重要な生物から（例えばコスミドまたはλフアージ中の）遺伝子バンクを作成す る。このゲノムバンクはプローブとして（上記の）〜２．２　ｋ　ｂ　ＢａｍＨ １断片（その一部）を使用してスクリーニングできる。陽性のシグナルを与える コロニーを単離し、より詳細に特徴付けできる。

実施例２．リパーゼ陰性Ｐ、ｇｌａｍｓｅ株ＰＧ２及びＰＯ２の構築リパーゼ遺 伝子が欠失しているＰＯ２の構築；及びリパーゼ遺伝子がテトラサイクリン耐性 （Ｔｃ−ｒｅ＋）遺伝子で置換されているＰＯ２の構築は３つの主要ステップか らなる・Ａ　−ｐ［ｌＲ６００１からのｐＵ１１６１０６及びｐＵＲ６１０７の 構築（大腸菌（Ｅ。

Ｃｏ１１　）中）（実施例１参照）。

ｐＵＲ６００１は〜２．２ｋｂのＰ９ｇｌｏａ！ｓ染色体のＩｌｔｍｌｌｌ断片 を含有している。この断片上にあるリパーゼ遺伝子（１０７４塩基対）は各々〜 ４８Ｇ及び〜６６０塩基対の５°　−及び３°−フランキング配列を持っている 。続く構築ステップは次の通りであった；ａ、Ｅ、Ｃｏ１１　ＫＡ８１６　ｄｚ ｍ−３、ｄｃｍ−６、＋ｈｒ　、ｌｅａ　５ｔｈｉ　、ＬＩＣＹ。

ｇｉｌＫ２　、ｇｔｌＴ２２、ｔａｌ−１４、ｔｏｌｌ＾３１、ｔ＋ｘ−７８、 ＋ｕｐＥ４４から単離した（Ｇ１４１ｇとも呼ぶ［１７］）のＩＩＵＲ６００１ をＣＩ！＋で部分消化して線状プラスミドを得た す、ＤＮＡをフェノール抽出及びエタノール沈澱１）し、次１こＰ目１により消 化した Ｃ、ゲル電気泳動後に透析バッグ中で電気溶出して（７）アガロースゲルから（ ＣＩ＋　Ｉ及び？ｌ　ｌ付着末端を有する）　４．５ｋｂプラスミドＤＮＡ断片 、及び〜６７０ｂ　ｐのＰａｔ　ｌ断片を単離した ｄ、　Ｃ１１１及びＰｓｔｌ付着末端を宵する得られたプラスミドＤＮＡ断片を Ｃ１１１とＰＨＩ付着末端を有する（下記の）合成リンカ−断片に連結した Ｃ１ｚｌ　ＣＧＡＴＧＡＧ＾丁ＣＴＴＧＡＴＣＡＣＴＧＣＡ　Ｐ＋１ｌＴＡＣＴ ＣＴＡＧＡＡＣＴＡＧＴＧ この合成断片は制限酵素Ｂｅ１ｌ及びＢｇｌｌｌを認識する部位を含有している 。連結混合物をＥ、ｃｏｌｉ　５ＡＳＬＯＩ　（ｒｅｃＡ、　ｈｄ＋Ｒを持つ１ １１０１　）に形質転換し、ＬＢ−Ａｐ（アンピンリン　１００μｇ／ｍｌ）寒 天板で選択し、得られた形質転換細胞から制限酵素分析でプラスミドをスクリー ニングした後、次の構築ステップ用に適正なプラスミドを選択した。この適正な プラスミドをＢａｍＨＩ及びＩ（ｉｎｄｌｌｌで消化すると、〜４ｋｂのベクタ ー断片と〜５００ｂ　ｐの挿入断片が認められた。

ｅ、ｄに記載のように得られたプラスミド構築物をＰＩｔｌで消化し、Ｃに記載 のように単離した〜６７０ｂ　ｐ　Ｐ＋ｔｌ断片と連結した。

ｆ、連結混合物をＥ、ｅｏｌｉ　Ｓ＾５１０１に形質転換し、ＬＢ−Ａｐ（アン ピシリン　１００μｇ　／　ｍ　ｌ　）寒天板で選択し、得られた形質転換細胞 からプラスミドをスクリーニングした。Ｐｉｌｌ断片は２つの異なる配向を持ち うるので、制限酵素分析により分析する必要があった。目的とする構築では、配 向はこのように、ＢｇｍＨｌによる消化の結果〜４ｂのベクター断片と〜１．２ ｋｂの挿入断片が得られるものでなければならない。

適正プラスミドの代表例は第３図に示すが、ｐ　Ｕ　Ｒ６１０２と呼んだ。

ｇ、　ｐＵＲ６１０２をＢｇｌｌｌで完全に消化したｈ　、　ｐＢＲ３２２（１ ８）をＡｖａ！及びＥｃｏＲｌで完全に消化した後、ＤＮＡ断片をアガロースゲ ル電気泳動で分離した。テトラサイクリン耐性遺伝子を含有する、〜［４３５塩 基対の断片を電気溶出によりゲルから単離した。

ｉ、Ｔｃ−ｒｅｓ遺伝子を含有するＤＮＡ断片の付着末端（７ｍ　Ｍ　ｔｒｉ＋ −ＨＣｌ、ｐＨ７，５、０，１ｍ　Ｍ　ＥＤＴＡ、　５　ｍ　Ｍβ−メルカプト エタノール、７ｍＭＭｇＣｌ　、０．０５ｍＭｄＮＴＰｓ及びＯ［φ／μｍ７μ ｍフレノウポリメラーゼび線状ｐＵＲ６ｊ０２１こ充填すると、連結された。

ｊ、連結混合物でＥ、ｃｏｌｉ　５ＡＳＬＯＩを形質転換し、ＬＢ−Ｔｃ（テト ラサイクリン２５μｇ　／　ｍ　Ｉ　）寒天板で選択し、得られた形質転換細胞 からのプラスミドを制限酵素分析でスフ１ノーニングした。

ｐＵＲ６１０２及びｐＵＲ６ｉ０３の構築ルートは第３図に示す。

ｋ、　ｐ［１Ｒ６１０２をＢｘｍ［ｌＩで消化し、９［ｌＲ６１０３をＢａｗｌ （Ｉで部分的Ｉこ消化した。得られた断片をアガロースゲル電気泳動で分離し、 所望の画分（各々、〜１１４５ｂ　ｐ及び〜２５５０ｂ　ｐ　）を電気溶出でゲ ルから単離した。

１　、　ｐＲＨ０２＋１９）をＢｘｍｌ（ｌで完全に消化し、７．　ｆ−／ブに で得られたＢｌｉ［１１断片に連結した。

ｍ、連結混合物をＥ、ｃｏｌｉ　３１７−１　（２０）に形質転換し、Ｉ、Ｂ− ｋｍ、Ｔｃ　（各々２５μ／　ｍ　ｌ　）で選択し、得られた形質転換細胞から のプラスミドを制限酵素分析でスクリーニングした。得られたプラスミドは各々 ｐＵＲ６１０６及びｐＵＲ６１０７（第４図）と呼ａ、　Ｅ、ｃｏｌｉ　５１７ −１　（ｐ［ｌＲ６１０６）　（プラスミドｐＵＲ６１０６を含有するＥ、ｅｏ ｌｉ　５１７−１　）による二親接合（ｂｉｐａｒｅｎｔａｌｃｏｎｊｕｇａｔ ｉｏｎ　）を介したｐ［１Ｒ６１０６の導入。

Ｐ、　ｇｌｏｃｉｅのコロニーをＭＭＥプレート（０，２ｇ／ＩＭ　ｇ　Ｓ　Ｏ ７ＨＯ１２ｇ　／　ｌクエン酸塩−Ｒ２０，１０ｇ／ＩＫ　ＨＰｏ　、３．５ｇ ／ｌＮａＮＨ４ＨＰＯ４，４Ｈ２０゜０．５％グルコース及び１５％寒天）から ルリアブロス（Ｌ　Ｂ）培地２０ｍ１に移し、３０℃で一晩培養した。Ｅ、ｃｏ ｌｉ　５１７−１（ｐＵＲ６１ｏ６　）を３ｍｌのＬＢ培地、２！ｌ　ｇ／ｍ　 ｌ　Ｋｍ、　３７℃で一晩培養した。

翌日、Ｐ、ｇ［ａｍ１ｅ培養物を１：１に希釈し、００６６０が２．０〜２５に なるまで３０℃で４〜５時間培養した。Ｅ、ｃｏｌｉ　５１７−１（ｐＵＲ６１ ０６）を１＝５０に希釈し、００６６０が１．５〜２．０になるまで３７℃で４ 〜５時間培養した。

接合させるために、５００Ｄの単位（１単位＝ＯＤ１を１ｍｌ）（２０〜２５ｍ 　ｌ　）のＰ、　ｇｌｕｍｘｅ細胞と　２５０Ｄ単位（１，２〜１．６ｍ１）の Ｅ、ｃｏｌｉ　３１７−１　（ｐ［ｌＲ６１０６）を混合し、５．０（１（ｌｒ ｐｍ（Ｒ３４−ローター）で１０分間回転させて沈澱させた。細胞ペレットを３ 枚のＬＢプレートに分け、３０℃で一晩インキユベートした。次に、細胞物質を プレートから除き、０，９％ＮａＣ１溶液３ｍｌに再懸濁させ、遠心分離（ＲＴ 、ＨＢ４−ローター、４ｋｒｐｍで１０分間）によりペレット化した。

細胞ベレットを０．９％Ｎ　ａ　ＣＩ溶液に再懸濁させ、３枚のプレート、ＭＭ Ｅ、（１，５％グルコース、　１５％寒天、５０μｇ／ｍ１カナマイシン（Ｋｍ ）に分け、３０℃で培養した。

ｐ［ｌ１１６１０６はＰ、　ｇｌａｉｘ＋内では複製されないので、Ｋｍ耐性ト ランス−接合体は組み込みによってのみ得られる。これらの株では、５゛　−ま たは３゛　−フランキング領域での１つの組換えによりプラスミド９［ｌＲ６１ ０６は細菌の染色体に組み込まれる。これらの株が機能性リパーゼ遺伝子をまだ 有しているために、その表現型はリパーゼ陽性である。

ｂ、別の実験用に２つのこのような株（ＰＧ−Ｒ２２＋及びＰＧ−Ｒ２２５）を 選択した。染色体ＤＮＡからプラスミド及び機能性リパーゼ遺伝子を欠失させる ために、２回目の組換えを行わなければならない。これは、前記株をＫｍを含ま ないＬＢ−培地（選択的な圧力なし）で数日間培養し、ＢＹＰＯ−プレート（１ ０ｇ／ｌトリブチカーゼペプトン、３ｇ／ｌ酵母抽出物、５ｇ／Ｉ牛抽出物、５ ｇ／１Ｎａｃｌ、７　ｇ　／　Ｉ　Ｋ　Ｈ２Ｐ　Ｏ４，５０ｍ　ｌ　／　ｌオリ ーブ油エマル″）ヨン及び１．５％寒天）にコロニーを完全に分離できる密度で 細胞を載せ、リパーゼ陰性のコロ−ニーをスクリーニングすることにより実施で きる。これらのリパーゼ陰性コロニーを選択的プレート（ＭＭＥ−ＫＭ５０μｇ ／ｍｌ）に載せると、増殖しない。この方法で得た株はＰＧ−２と呼ぶことがで きる。

Ｃ−Ｐ、　ｇｌｏｍｉ＋染色体のリパーゼ遺伝子のＴｃ−ｒｅｓ遺伝子による置 換 ａ、Ｉ３＋、：記載したように、Ｅ、ｃｏｌｉ　３１７−１　（ｐ（ｌＲ６１０ ７）による接合を介しテＰ、ｇｌｏｍｓｅにｐＵ１１６１０７を導入した。５０ μｇ／ｍ１Ｔｃ含有ＭＭＥ培地、３０℃で、トランス−接合の選択を実施した。

ｂ、このようにして得たトランス−接合体を、５０μｇ　／　ｍ　ＩＴｃを含有 するＢＹＰＯ−プレートと　１００μｇ／ｍ　ｌ　Ｋｍを含有するＭＭＥプレー トの２組に分けた。いくつかのトランス−接合体はＫｍ感受性（ＭＭＥ　Ｋｍ　 １００プレートで増殖しない）及びリパーゼ隙性表現型（ＢＹＰＯプレートにク リアリングゾーンなし）を示した。二重交差（５°　−及び３′　−フランキン グ領域）により、リパーゼ遺伝子がＴｃ耐性遺伝子と置き換わっていた。

１つの代表的な株を次の研究用に選択し、ＰＧ−３と呼んだ。

実施例３．　Ｐ、　ｇｌＩａｅ　（ブレ）−リパーゼをコードする合成遺Ｐ、ｇ ｌ＋ｌｌｉ＋　（ブレ）−リパーゼ遺伝子のヌクレオチド配列に基づいて、いく つかのサイレント突然変異を含有する新しい遺伝子を考案した。これらの突然変 異により、酵素のアミノ酸配列は変化しなかった。しかし、ＧＣ含量を低下させ ることはでき、それにより酵素の遺伝子操作が促進され、種々の非相同宿主系で 合成遺伝子を使用できるようになった。

酵素の遺伝子操作を促進するもう１つの点は、遺伝子の好都合な位置に制限酵素 認識部位を導入できることであった。

新しい遺伝子の配列を第５（Ａ）図に示す。

新しい遺伝子は約２００個のヌクレオチドの制限断片、いわゆるカセットに分け た。このようなカセットの一例を第６図に示す。

各カセットは５°　−及び３゛　−末端で延長し各々ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄｌ １１部位を形成した。

これらのカセットのコーディングストランドは平均３３塩基長のオリゴヌクレオ チド（オリゴ）に分けた。非コーディングストランドのオリゴがコーディングス トランドのオリゴの〜５０％重なるように、非コーディングストランドも同様に 処理した。

オリゴは実施例１に記載のように合成した。

断片を構成する前に、連結を促進するために合成オリゴの５゜末端を燐酸化しな ければならなかった。燐酸化は次のように実施した： 当モル量（５０ｐｍｏｌ）のオリゴを集め、３７℃で８単位のポリヌクレオチド キナーゼを含む反応バッファ４０μｌで３０〜４５分間キネートした。７０℃に ５分間加熱し、エタノール沈澱させて反応を止めた。

７　ｍ　ｍ　ｏ　Ｉ　／　Ｉ　Ｔｒｉ＋−ＨＣｌ、ｐＨ７，５、ＩＱｍｍｏ　＋ ／　１　２−メルカプトエタノール、５ｍｍｏ　１／ＩＡＴＰを加えたバッファ ３０μｍ中にベレットを溶解してアニーリングを行った。

次に、混合物を６５℃の水浴に５分装置いた後、３０’Ｃに１時間冷却した。Ｍ ｇＣｌ２を最終濃度１０ｍｍ　ｏ　１　／　Ｉになるように加えた。Ｔ４　ＤＮ Ａ−リガーゼ（２，５単位）を加え、混合物を３７℃に３０分間または１６℃に ｏ　／　ｎ　Ｉいた。この後、反応混合物を７０℃に１０分間加熱した。

エタノールで沈澱させた後、ペレットを消化バッファに溶解し、ｇｅｏＲｌ及び ｌ１ｉｎｄｌｌ！で切断した。

混合物を２％アガロースゲルで分離し、正確に構成したカセットに対応する長さ の断片を電気溶出で単離した。

実施例１に記載のように断片を（ＥｃｏＲｌ　／Ｈｉｎｄｌｌｌで消化した）　 ｐＥＭＢＬ９に連結し、配列分析によりその正確さを調べた。次のクローニング ステップでは、種々のカセットを正しい順序で合わせるとｐ［Ｉｌｔ６０３ｇが 得られた。これは完全な合成リパーゼ遺伝子を含有するｐＥＭＢＬ９誘導体であ る。

実施例４に記載のような構築を可能にするように、断片５を置換して合成遺伝子 の第２のバージョンを作成した。この方法で、’１０９１位の代わりに１０６９ 位に３°ＰＨ１部位を有する構築物ｐ［ｌＲ６６００が作成された。

実施例４．リパーゼ陰性Ｐ、　ｇｌｕｍｘ＋　Ｐ　Ｇ　３への（野生型）合成リ パーゼ遺伝子の導入 合成リパーゼ遺伝子がＰ、　ｇｌｕｍｚｅで機能性であるかを調べるために、遺 伝子を株ＰＧ３に導入した。

発酵手順を簡略化するために、プラスミドに導入するよりもＰＧ３染色体のこの 遺伝子を安定に組み込むことに決めた◇この理由から、合成リパーゼ遺伝子は元 のＰ、ｇｌｎｍｘｅ　リパーゼ遺伝子の５′及び３°ボ一ダー配列を持たなけれ ばならない。

これは次のように実施した（第７図参照）：ａ、実施例２に記載と同様に、（Ｅ 、ｃｏｌｉ　ＫＡ８１６からの）ｐ［ｌＲ６０［１２からＣ１ａｌ及びＰ＋ｔｌ 付着末端を有するベクターを製造した。

ｂ、（Ｅ、　ｃｏｌｉ　ＫＡ８１６からの）　ｐＵＲ８６００をＣ１ａｌで完全 に、Ｐｓ口で部分的に消化した。アガロースゲル電気泳動により断片を分離した 後、〜１０５０ｂ　ｐの断片を単離した。

Ｃ１このように得た断片をｐＵ１６００２由来のバクターに連結し、これを使用 してＥ、ｃｏｌｉ　５ＡＩＯＩを形質転換した。この方法で、構築物ｐＵＲ６６ ０３が得られた。

ｄ、　ｐＵＲ６６０３をＢｘｍｔｌｌで完全に消化した。アガロースゲル電気泳 動により断片を分離した後、〜２２ｋｂの断片を単離した。

この断片は野生型のＰ、　ｇｌｌｄｉｏｌｉ　リパーゼ遺伝子の５゛及び３′フ ランキング領域を有する合成リパーゼ遺伝子を含有している。

ｅ、　ｐｌＨ１０２もＢｇｍＨＩで完全に消化した。

ｆ、　ｄで得られた　２．２ｋｂ断片を実施例２に記載のようにｐ１１ｚＩＧ２ に連結した。

ｇ、得られた構築物ｐＵＲ６１３１をＥ、ｅｏｌｉ　３１７−１に移した。

この構築物のＰＧ３の染色体への組込みは、実施例２のＢ−ａに９１１Ｒ６０１ ６について記載したものと同じ方法で実施した。

得られたＫｍ−耐性トランス−接合体のい（つかをＢＹＰＯプレートに移した。

クリアリングゾーンがコロニーの周りに生じるため、これら全てはリパーゼ陽性 の表現型を有すると思われた。典型的な代表例をＰＧＬ２６と呼んだ。

明らかに、同じ経路を実施して、構築物（ｐＵＲ６１３１）をリパーゼ陰性Ｐ、 ｇｌａｍｘｅ　ＰＧ２　（実施例２Ｂ−ｂ参照）株に組込むことができる。

実施例２及び４から、Ｐ、ｇｌＩｉｅ株ＰＣＩ　Ｃ及びその誘導体、例えばＰＧ ２及びＰＧ３　、または慣用の突然変異を介して得たリパーゼ産生能が改良され たＰＣＩの誘導体）は細菌の染色体の（相同または非相同の）ＤＮＡ断片を欠失 または導入することにより容易に操作できることが明かであろう。

これらの手法を使用して、リパーゼ産生の最適な株を構築することができる。こ の点で、次のことが考えられたニーより強力な（誘導可能な）プロモーターによ る元のリパーゼプロモーターの置換、 ＝１コピー以上のリパーゼ遺伝子の導入（最終的に、種々のリパーゼ突然変異を コードする）、 一元のプロモーターの置換、またはリパーゼ遺伝子の産生及び分泌に関与する機 能をコードする遺伝子の複数のコピーの導入（例えば、チャペロン蛋白質、リパ ーゼ酵素の輸送に関与する「ヘルパー蛋白質」）、 一細胞外プロチアーゼをコードする遺伝子の欠失（クリアリングゾーンまたはス キムミルクプレートを産生しないＰＧＩのＴ＋＋５突然変異株（ＰＧＴ８９　） は寄託しである）、−ラムノリピド産生を行う。

リパーゼを改善するために、蛋白質のアミノ酸配列によく定義された変化を導入 できる可能性がなければならない。

これを行う好ましい方法は野生型のリパーゼをコードする合成遺伝子または野生 型のＰ、ｇｌｏｔｘｘｅ　リパーゼ遺伝子の遺伝子断片を、対応の所望の突然変 異を含有する化学合成断片で置き換えることによる。

合成の野生型リパーゼ遺伝子の場合、カセット（またはその断片）を所望の突然 変異を含有する対応のカセット（またはその断片）で置換できる。

該当のアミノ酸のコドンを含有するカセットを（実施例３に記載のように）もう 一度構成した。しかし、このとき、該当のコドンを含むコーディングまたは非コ ーディングＤＮＡストランドのオリゴを所望の突然変異を持つオリゴマーで置換 した。

新しいオリゴを実施例１に記載のように合成した。

このように得た突然変異カセットまたはその断片をｐσＲ６０３ｇ又はｐＵＲ６ ６０３のような構築物の合成野生型リパーゼ遺伝子の対応の位置に導入した。

ＰＧ２またはＰＧ３に合成突然変異リパーゼ遺伝子を導入するために、ステップ ｄから出発して実施例４に記載のような経路を取る必要がある。

突然変異遺伝子の作成の典型例を下記に示す。この場合、野生型リパーゼ遺伝子 の　１５４位のＨｉ＋を？０で置き換えた。これを実施するために、２つの新し いオリゴマーを合成した。成熟したリパーゼのアミノ酸　１５４をコードするコ ドンをＣＣＴに変える。

これらのオリゴマーを使用して実施例３に記載のように断片３　（Ｈ１５４Ｐ　 ）を構成した。ｐＥ１１ＢＬ９に断片をクローニングした後、実施例１に記載の ようにＤＮＡ配列を決定した。このように得た構築物をＵＲ６０７１と呼んだ。

プラスミドｐＵＲ６０７１をＦ＋ｐｌ及び５ａｌｌで完全に消化した。得られた ＤＮＡ断片を（実施例２に記載のように）ゲル電気泳動で分離すると、アガロー スゲルから〜９０ｂｐの断片が単離された。

ｐ［ｌＲ６００２をＦ＋ｐｌで部分的に及びＳ！１１で部分的に消化した。ゲル 電気泳動後、実施例２のアガロースゲルから〜６０００ヌクレオチドのベクター を単離した。

単離した〜９０ｂ　ｐ断片をｐＵＲ６００２ベクターに連結してｐＵＲ６０７７ Ａを得た。

ｐ［ｌＲ６０７７ＡのＢ１１Ｈ１断片（〜２２ＧＯｂｐ）を実施例３及び４に記 載のようにｐ１１Ｈｔ１２に連結した。この方法でｐ［ｌＲ６１２７を得た。

この構築物は実施例４に記載のようにＰＧ３の染色体へ導入した。Ｐ、ｇｌＩｌ ｍｉｅ　トランス−接合体を産生ずる得られたリパーゼをＰＧＬ２４と呼んだ。

この株が産生ずる修飾リパーゼは本当の洗剤システムで親リパーゼより顕著に安 定であることが証明された（第８図）。

本質的に同じ方法で、いくつかの他の突然変異リパーゼ遺伝子も作成した。場合 によっては、コードされた蛋白質の正味電荷が変化した（例えば、ＤＩ５７Ｒｆ ＋２＞　、Ｄ５５Ａ（＋１）、ｌｌｌ０Ｋ　ｆ＋ｌ）、Ｒ６１Ｐ（−１）、Ｔｌ （１９ＤＣ−１）　、Ｒ１１ｌ）（−２）　）。他の場合には、アミノ酸が導入 または欠失された（例えば、ＰＧＬ４０では＋２５ｓ−１５４）１をＡｌａＬｅ ｏＳ＋＋ＧｌｙＨｉ＋Ｐ＋ｏ＝　ＡＬＳＧ［ＩＰで置き換えた）。さらに、グリ コジル化の可能性のある部位が除去され（例えば、Ｎ４８Ｓ及び／または１１２ ３８ｓ　）及び／または導入された（例えば、［１１５７Ｔ及びＮ１５５とＮ１ ５６の間へのＧ挿入）。

実施例６．自律複製プラスミドの使用による５Ｉｅｃｈｚ＋ｏｍ７ｃｅ＋ｃ＋ｒ ＋ｖｉｔＩＣでの合成リパーゼ遺伝子の発現真核微生物によるＰ、ｇｌｏｍｚｅ 　リパーゼの産生を説明するために、ＧＡＬ７プロモーター（２１）を使用して 酵母３．　Ｃｌｒｅｖ口目Ｃでのｐ、ｇｌｕｍｘ＋　リパーゼの発現に適したベ クターを構築した。

Ｐ、ｇｌｕｍｔｅ　リパーゼは２つの異なる発現系を使用して酵母Ｓ。

Ｃｅｒｅマｉ＋ｉｉｅにより産生される。すなわり、リパーゼ発現カセットを有 する自律複製プラスミドに基づく発現系と宿主ゲノム内のリパーゼ発現カセット のマルチコピー組込みに基づく発現系であった。

プラスミドｐＵＲ２７３０（２１）はリパーゼ発現プラスミドの源として使用し た。プラスミドｐ［ｌＲ２７３０はＧＡＬ７プロモーター、Ｓｃ＋＋＋ｖｉ＋ｉ ａｅインベルターゼシグナル配列、α−ガラクトシダーゼ遺伝子（α−ガラクト ンダーゼ発現カセット）、Ｓ。

ｃｅ＋ｓｖｉ＋ｉｉｅでの複製用の２μｍ配列、Ｓ、ｃｅｒｅｙｉｓｉｘｅでの 選択用ＬＥ［］２ｄ遺伝子及びＥ、　ｃｏｌｉでの複製及び選択用のｐＢＲ３２ ２配列からなる。

プラスミドｐ［１Ｒ６０３８をリパーゼ遺伝子源として使用した。

次のものをコードする下記のＳ、ｃｓ＋マロｉａｅ発現プラスミドを構築した： １、インベルターゼシグナル配列を前に持つ成熟リバー　セ（ｐＵ１６８０１　 ）、 ２、　ＫＥＸ２切断部位、グリコジル化部位及びインベルターゼシグナル配列を 前に持つ成熟リパーゼｆｐＵＲ６８０２）。

上記構築物を得るために、下記の経路を行った（第９図、使用した制限認識部位 は星印で示す）： １及び２ ａ、プラスミドｐＵＲ２７３Ｇを５ＩＣＩ及びＨｉｎｄｌｌｌで消化し、ベクタ −断片を単離した。

ｂ、プラスミドｐσＲ６０３ｇをＥｅｏＲＶ及びＨｉｎｄｌｌｌで消化し、リパ ーゼ遺伝子を持つ断片を単離した。

Ｃ１実施例３に記載のように、合成５ａｃｌ−εｃｏＲＶＤ　Ｎ　Ａ断片を合成 し、構築した。それは下記の配列からなる。

ｐＵＲ５８０１の場合： ■。

−ＴｒＣＣＣＴＧＧＴＴｒＴにＣＡＣＣＣＡＡＡＡＴＡＴＣＴにＣＣＧ；ＣＧＧ ＡＣＡＣＡＴＡＴＧ；ＣＡにＣＴＡＣｆｌ；、’Ｇ；Ａ７　R′ −ＭＣＣＣ，ＡＣＣＩｌＩＡＡＡＣＣＴＣＣＧＴＴＴＴＡＴＡＣＡＣＣ，ｃＣＣ ＣＣＴにＴＣＴＡＴＡＣＣＴＣＣ，ＡＴＣ，ＣＴＣＴＡ　５f この断片はインベルターゼシグナル配列をコードする配列の間にＧＡＬ７プロモ ーターとリパーゼ遺伝子を正しく分岐する。

ｐＵＲ６８０２の場合 ■。

−ＧＡＧＡＴにＡＡにＣにＡＡにＣＴＣＣＴＧＡＣＡＣＡＴＡＴＧＣＡＧＣＴＡ ＣＧＡＧＡＴ　３’−ＣＴＣＴＣＴＴＣにＡＣＴｒＣＣＡＣＧＡＣＴ（：ＴＧＴ ＡＴＡＣ（：ＴＣＣＡＴＧＣＴＣＴＡ　５’この断片は、ＫＥＸ２切断部位、グ リコジル化部位をコードする配列とインベルターゼシグナル配列の間にＧＡＬ７ プロモーターとリパーゼ遺伝子を正しく分岐する。

ｄ、　５ｓｃｌ−ＥｃａＲＶ合成断片（１）の１つ、５ｚｅｉ−Ｈｉａｄｌ１１ ベクター断片とリパーゼ遺伝子を持つＥｃｏＲＶ−Ｈｉｎｄｌｌｌ　Ｄ　Ｎ　Ａ 断片を連結した。ｐＵＲ６８０１の構築については第９図に示す（ｐ［１１６ｇ ［１２は合成断片ＩＩを使用して同じ方法で構築する）。

ｅ、連結混合物をε　ｅｏｌｉに形質転換した。培養後、単一のコロニーからプ ラスミドＤＮＡを単離し、制限酵素分析で判断した適正なプラスミドを選択し、 大量に単離した。

ｆ、プラスミドｐ［１Ｒ６８０１及びｐ［１Ｒ６８０２を、ＬＥＵ２ｄ遺伝子産 物の存在についての選択を使用するスフェロプラスト手法（２２）を使用して、 Ｓ、ｃｒｔｅｖ口日ｅ株５Ｕ１０（２１）に形質転換した。

ｇ、形質転換細胞を合成培地（０６８％酵母窒素ベースｗ　／　ｏアミノ酸、２ ％グルコース、ヒスチジン及びウラシル）で−晩培養し、誘導培地（１％酵母抽 出物、２％バクトペブトン、５％ガラクトース）で１：１０に希釈し、４０時間 培養した。

ｈ、細胞を遠心分離して単離し、細胞抽出物を調製した（２３）。

１、細胞抽出物を５ＤＳ−ゲル電気泳動（７）で分析し、ニトロセルロースにプ ロットした。

ｊ、ニトロセルロースプロット（７）をリパーゼ抗体と共に、次に１１２５標識 蛋白質入と共にインキユベートシ、次にフルオログラフィーにかけた（第１０図 ）。

第１０図に示すように、プラスミドｐσＲ６８０１を含有するＳ［ＩｌＯ細胞は 、ｐ、ｇｌｏｍａｅ由来のリパーゼを比較して正しい分子量を持つリパーゼ酵素 を産生ずる。正しい蛋白質に加え、処理及びグリコジル化されていないリパーゼ 蛋白質も認められる。５ｃｅｒｅｖＨ目ｅが産生ずるＰ、ｇｌｏω！ｅリパーゼ は酵素学的に活性である。

実施例７．マルチコピー組込みを使用するＳ、　ｃｅｒｅマロ目ｅによるＰ、　 ｇｌｏｌａｔｓ　リバーゼノ産生マルチコピー組込みベクターは、３３５ｂｐ酵 母ＲＮＡポリメラーゼ■プロモータ因子をＳ、　ｅｅｒｅｙｉｓｉｘｅ　ｒ　Ｄ 　Ｎ　Ａ　（２５）の４．５８ｇ１ｌｌ　Ｂ断片で置換することにより、プラス ミドｐＡｌｔＥｓ６（２４）から得られた。また、２μｍ複製起源を除去し、Ｓ 。

ｏｌ　ｉｇｏｒｈｉｒｇ由来のクロロプラストＤＮＡを含むＢｇｌｌｌ−Ｈｉｎ ｄｌｌｌＤＮＡ断片をポリリンカーＤＮＡ配列で置換した。この結果プラスミド ｐＵＲ２７９Ｇが得られ、この詳細図は第１１図に示す。

ｐＵＲ２７９０の酵母ゲノムへのマルチコピー組込みに必須の配列は次の通りで ある：１．酵母ゲノムへのマルチコピー組込み用ｒＤＮＡ配列、２．欠失プロモ ーターを有するＬＥＵ２遺伝子であるＳ、＋ｔ＋ｃｖｉ＋ｉｉ＋　ＬＥＵ２遺伝 子（２６）。

特に、次のものをコードする下記のマルチコピー組込み発現プラスミドを構築し た： １、インベルターゼシグナル配列を前に持つ成熟リパーゼ（ｐＵＲ６８０３）、 ２、ＫＥＸ２切断部位、グリコジル化部位及びインベルターゼシグナル配列を前 に持つ成熟リパーゼ（ｐＵＲ６８０４）。

上記構築物を得るために、下記の経路を行った（第１２図；使用した制限認識部 位は星印で示す）： １及び２ ａ、プラスミドｐＵＲ２７９Ｇを［ｌ１ｎｄｌｌｌで部分的に消化した。線状プ ラスミドを単離し、Ｂｇｌｌｌで完全に消化し、アガロースゲル電気泳動及び電 気溶出によりＨｉｎｄｌｌｌ−Ｂｇｌｌｌベクター断片を単離した。

ｂ、プラスミドｐ［１ｌ１６８［１１をＢｇｌｌｌで部分的に、Ｈｉｎｄｌｌｌ で完全に消化し、リパーゼ遺伝子を持つＢｇｌｌｌ−Ｈｉｎｄｌｌｌ　Ｄ　Ｎ　 Ａ断片を単離した（　ｐＵＲ６８０１の代わりにプラスミドｐ［ｌＲ６８０２を 使用して、同じ方法でｐＵＲ６８０４も構築する）。

Ｃ，ｐ［１Ｒ２７９ＧのＢｇ　ｌ　１１−［ｉｉロｄｌ１１ベクター断片及びリ パーゼ遺伝子を持つ８ｇ１１１−Ｈｉ口ｄ１１１断片を連結し、プラスミド、［ ｌＲ６８０３を得た。

ｄ、連結混合物をＥ、ｃｏｌｉに形質転換した。培養後、単一コロニーから、プ ラスミドＤＮＡを単離し、制限酵素分析で判定した適正なプラスミドｐ［ｌ１１ ６Ｈ１３及びｐ［１６１１ｆ１４を選択し、大量に単離した。

ｅ、プラスミドｐＵ２６８０３及びｐ［ｌＲ６８０４を、ＬＥｔ１２ｄ　遺伝子 産物）存在について選択するスフ二ロブラスト手Ｈ（２２）により、Ｓｃｃ＋ｅ ｙｉｔｉｔｅ株ＹＴ６−２−Ｉ　Ｌ　（２６）　＝　Ｓ　Ｕ　５０に形質転換し た。宿主株５Ｕ５０は必須栄養素ロイシン（ＬＥυ２）を欠失しており、このこ とは株５Ｕ５０はロイシンを産生できないことを意味する。従って、５Ｕ５０は 増殖培地が十分量のロイシンを含有しているときにのみ増殖できる。

ベクターｐＵＲ６８０３及びｐ［ｌＲ６８０４に存在するＬＥ［Ｉ２遺伝子の欠 失プロモータは酵母ゲノムへのプラスミドベクターへのマルチコピー組込みに必 須である。プラスミドのｒＤＮＡ配列ト酵母ゲノムのｒ　ＤＮＡ配列の相同的組 換えにより酵母ゲノムのｒ　Ｄ　Ｎ　Ａ遺伝子座でマルチコピー組込みが起こる 。

１１組込み細胞を合成培地（０，６８％酵母窒素ベースｗ　／　ｏアミノ酸、２ ％グルコース、ヒスチジン及びウラシル）で−晩増殖させ、誘導培地（１％酵母 抽出物、２％バクトベプトン、５％ガラクトース）で　［：１０に希釈し、４０ 時間培養した。

ｇ、細胞を遠心分離で単離し、細胞抽出物を調製した（２３）。

ｈ、細胞抽出物を５ＤＳ−ゲル電気泳動（７）で分析し、ニトロセルロースフィ ルターにプロットした。

１、ニトロセルロースプロットをリパーゼ抗体と、次にＩ　１２５ａｍ蛋白質Ａ とインキュベートし、次にフルオログラフィーにかけたく第【３図）。

第１３図に示すように、プラスミドｐＵｉ１６８Ｑ３を持っ５Ｕ５０の組込み細 胞はＰ、ｙｌａ＋Ｊｅ由来のリパーゼと比較して正しい分子量を持つリパーゼを 産生ずる。正しい蛋白質の他に、処理及びグリコジル化されていないリパーゼ蛋 白質も認められる。Ｓ。

ｃ！ｒｌｖ口ｉａ＋が産生ずるＰ、　ｇｌｏｍ＊ｅ　リパーゼは酵素的に活性で ある。

この方法で、（リパーゼ発現カセットを含む）プラスミドｐＵＲ６８０３または ｐＵＲ６８０４の（ハブロイドゲノム当り　１０ロコピーまでの）マルチコピー 組込みを実施することにより、活性なＰｇｌａＩＩｌｘｅリパーゼを産生ずる酵 母株が得られた。このマルチコピー組込み系は非選択的条件下でも安定である。

実施例８、マルチコピー組込みを使用したＳａ＋ｅｂａｒｏｍ７ｃ＋５ｃｅｒｅ Ｂｒｉｚｅでのグアーα−ガラクトシダーゼの産生この実施例では、マルチコピ ー組込みを使用した５ａｃｃｈａ＋ｏｍ７ｃ＋＋　ｃｅ＋ｅｖｉ＋ｉａｅでの異 種蛋白質、グアー（Ｃ７ａｍｏｐｓｉ＋ＩｅｌｒＢｔｒｏｏｌｏｌ＋ａ）由来の α−ガラクトシダーゼの発現を説明する。Ｏｖｅ＋ｂｅｅｌｅ　（２１）が記載 したように、グアーα−ガラクトシダーゼをコードする遺伝子を同種の発現シグ ナルと融合させると発現ベクター、ＵＲ２７３０が得られた。ｐ［ｌｌ１２７３ ０のα−ガラクトシダーゼ発現カセットはＳ、ｃｅｔｅマｉ＋ロｅ　ＧＡＬ７プ ロモーター、Ｓ、ｃｅｒｅマロ目ｅインベルターゼシグナル配列及び成熟α−ガ ラクトシダーゼをコードするα−ガラクトシダーゼ遺伝子からなる。使用したマ ルチコピー組込みベクターはｐＵＲ２７７０であり、これはｐＭＩＲＹ２．　ｌ 　（２７）と同じである。α−ガラクトンダーゼ発現カセットを単離し、マルチ コピー組込みベクターｐＵＲ２７７Ｇに挿入すると９［１１２７７４が得られた 。このマルチコピー組込みベクターはα−ガラクトシダーゼ発現ベクター、ｓ。

ｃＩｔｅｖロ目ｅリポソームＤＮＡ配列及びＳ、ｃｅ＋ｅｙｉｓｉａｃ欠失ＬＥ ［Ｉ２遺伝子（ＬＥＵ２ｄ　）を選択マーカーとして含有している。マルチコピ ー組込みベクターをＳ、　ｅｅｒｅｖｉ＋ｉｉｃに形質転換させ、マルチコピー 組込み細胞を得た。マルチコピー組込み細胞は有糸分裂的に安定で、マルチコピ ー組込み細胞は植物蛋白質であるα−ガラクトシダーゼを発現し、分泌した。こ の実施例は、ｓ。

ｃｅ＋ｅｖｉ＋ｉｉｅのゲノムにマルチコピー組込みできること、そして蛋白質 の製造にマルチコピー組込みが使用できることを明確に示している。全てのＤＮ Ａの操作はＭＡｆ１口１０（７）に記載のように実施した。

１、マルチコピー組込みベクターｐＵＲ２７７４の構築マルチコピー組込みベク ターｐＵＲ２７７ＧをＨｉｎｄｌｌｌで部分的に消化し、線状化したベクター断 片を単離した。線状ベクター断片をＢｇｍＨｌで完全に消化し、得られた８ｋｂ ベクタ一断片を単離した。Ｈｉｎｄｌｌｌ及びＢｇｌｌ＋で消化し、１．９ｋｂ ＤＮＡ断片を単離することによりｐＵＲ２７３Ｇからα−ガラクトシダーゼ発現 カセットを単離した。α−ガラクトシダーゼ発現カセットをｐＵＲ２７７Ｇの単 離ベクター断片に連結すると、マルチコピー組込みベクターｐ［ｌＲ２７７４が 得られた（第１４図も参照）。連結混合物をＥ、ｅｏｌｉに形質転換した。培養 後、単一コロニーからプラスミドＤＮＡを単離し、制限酵素分析で判定した正し いプラスミドを選択し、大量に単離した。ＬＥＵ２ｄ遺伝子産物の存在について 選択することによるスフ二ロブラスト法（２２）を使用して、Ｓｉｘ　ｌで線状 化したマルチコピー組込みベクターｐＵｌ１２７７４を５ｃｅｒ＋ｖｉｔｉｘｅ 株ＹＴ６−２−Ｉ　Ｌ　ｆ２６）に形質転換した。

２、マルチコピー組込み細胞の組込みパターンの分析Ｓ、ｅｅ＋ｅｖｉ＋ｉｉｅ のリポソームＤＮＡはｒ　ＤＮＡ単位の土１５０個の同一のコピーで存在し、Ｓ 、　ｃｅｒｅマ■目のリポソームの１７ｓ。

５．８Ｓ及び２５ＳｒＲＮＡ成分を特性化する遺伝子からなる。これらのｒＤＮ Ａ単位はＳ、ｃｅｔｔマロｉｃｅの染色体ＸＩＴの大きな遺伝子クラスター中で 縦に繰り返されている。ｒＤＮＡの完全な配列は公知であり、ｒＤＮＡ単位は９ ．０ｋｂの大きさで、２つのＢｇ１１部位を含有している（２８．２９．３０） 　。Ｓ、ｅｅ＋ｅｖｉ＋ｉｉ＋から単離した染色体ＤＮＡをＢｇｌｔｌで消化す ると、ｒＤＮＡ遺伝子クラスターは４．５ｋｂ長の２つの断片を生じた。この遺 伝子の構成を第１５Ａ図に図式的に示す。ハブロイドゲノム中に沢山のリポソー ム単位が存在するために、リポソームＤＮＡ断片に相当する　４．５ｋｂのバン ドは臭化エチジウムで染色したアガロースゲル上の制限パターンで検出できる。

プラスミドｐＵＲ２７７４は９．ｌ１ｋｂの長さを持ち、１つの単一のＢｇｌｌ ＋制限酵素認識部位を含有している。プラスミドｐ［ｌＲ２７７４が高いコピー 数で縦に組込まれるときには、染色体ＤＮＡをＢｇｌｔｌで消化すると　９．８ ｋｂのＤＮＡ断片が生じる。臭化エチジウム染色したアカロースゲルを使用して 、土１５０コピーのリボゾームＤＮＡ配列に対応する　４．５ｋｂＤＮＡバンド の強度を組込みプラスミド由来の　９．８に、ｂＤＮＡバンドと比較できる。こ の遺伝子クラスターの構成を第１５Ｂ図に示す。この比較により、組込まれたｐ ＵＲ２７７４プラスミドの数を合理的に推定できょう。ｐＵＲ２７７４を線状化 し、酵母株ＹＴ６−２−Ｉ　Ｌ　（Ｓ　Ｕ３０）　、ＬＥＵ２−　ｔ：形１ｉｔ 転ｔｌた。形質転換体をロイシンを含有しないＭＭ（合成）培地上に条斑にし、 ざらにＬＥＵ２　表現型を調べた。マルチコピーベクター　ｐ［１Ｒ２７７４の 組込みが本当に起こるかを調べるために、独立した組込み細胞５Ｕ５０Ａ、５Ｕ ５ＱＢ１ＳＵ５０Ｃ及び５Ｕ５０Ｄから染色体ＤＮＡを単離した。全ＤＮＡをＢ ｇｌ［Ｉで消化し、ゲル電気泳動で分析した。このような臭化エチジウム染色し たゲルの例を第１６図に示す。予想通り、組込み細胞５Ｕ５ｉ及び５Ｕ５（Ｉｃ の制限パターンでは、４．５ｋｂと　９．８ｋｂに２つの主要なバンドが識別で きる。親株はｒＤＮＡの４．５ｋｂの単一のバンドのみを示す。従って、驚くべ きことに、複数のリポソームＤＮＡ単位の他に、これらの組込み細胞は９．８ｋ ｂプラスミドｐ［ｌＲ２７７＋の複数の組込みコピーも含有していると結論でき る。

種々のマルチコピー組込み細胞はプラスミドＵＲ２７７４のコピーを１０〜＋０ ０の種々の数含有していることが判った。α−ガラクトシダーゼ遺伝子の存在を 確認するために、放射性標識したプローブとのハイブリッド形成を実施した。α −ガラクトシダーゼ遺伝子用プローブは、α−ガラクトシダーゼ遺伝をＰｖｏｌ ｌ及びＨｉｎｄｌｌｌで消化し、α−ガラクトシダーゼ遺伝子を含有する　１． ４ｋｂ断片を単離することにより、９ＵＲ２７３０誘導体、ｐ［１Ｒ２７３ｉか ら単離した。ｒＤＮＡ配列を同定するために、ｐＵＲ２７７０をＳｍｘｌ及び） Ｉｉｎｄｌｌｌで消化した後、２．Ｏｋｂ断片を単離、標識してプローブを作成 した。α−ガラクトシダーゼプローブとのハイブリッド形成（第１７図参照）す ると、臭化エチジウム染色したゲルで検出される　９．１ｌｋｂのバンドは実際 にα−ガラクトシダーゼ遺伝子に対応することが判った。それは、ＴＴ６−２− Ｉ　Ｌ親株からの消化した全ＤＮＡを含むレーンにはハイブリッド形成シグナル は検出されなかったのに対し、この単一のバンドがオートラジオグラフィーに存 在していたためである。　９．８ｋｂのバンドが検出できたため、組込みの過程 では大きな再配列及び／または欠失は起こらなかったはずである。

ｒ　Ｄ　Ｎ　Ａプローブとのハイブリッド形成により、４．５ｋｂのバンドと　 ｇ８ｋｂのバンドに対応するシグナルが得られ、従って実際に４．５ｋｂのバン ドは予期されたリポソームＤＮＡ配列を含有することになる。α−ガラクトシダ ーゼプローブで証明されたように、９．８ｋｂのバンドがｐＵＲ２７７４のマル チコピー組込みから生じる。ｐＵＲ２７７４もリボゾームＤＮＡ配列を含有する ため、この９．８ｋｂのＤＮＡバンドもｒ　ＤＮＡプローブで陽性のシグナルを 提供する。第１８図に示す結果から、４．５ｋｂのリポソームＤＮＡバンドが１ ５０コピーのｒＤＮＡを表すとすると、ｐＵＲ２２７４を含有する　９．８ｋｂ のバンドは５０〜１００コピーを含有すると算定できる。従って、マルチコピー 組込みプラスミド９０Ｒ２７７４の形質転換により、α−ガラクトシダーゼ発現 カセットを細胞当り５０〜１０ＧコピーＳ、ｅｅｒｅマ目目ｅに向けることが実 際可能である。

３、マルチコピー組込み細胞によるα−ガラクトシダーゼの産生 組込みプラスミドを高いコピー数有していることから選択したマルチコピー組込 み細胞５Ｕ５０Ａ、５Ｕ５０Ｂ、５Ｕ５ＧＣ及び５Ｕ５ＧＤを０．６７％７％酵 母窒素ペース／　Ｏアミノ酸、２％グルコースで一晩培養し、１％酵母抽出物、 ２％８ａｃｔｏ−ｐ＋ｐｌｏｎ。

２％ガラクトース（ＹＰＧａ　ｌ　）で１１０に希釈してＧＡＬ７プロモーター を誘導してα−ガラクトシダーゼ活性を調べた。

０マｅｒｂｅｅｋｃ　ら（２１）が記載のように酵素活性テストで、誘導開始後 ２４時間及び４８時間に培養物上清のα−ガラクトシダーゼ活性を測定した。結 果は次の表に示す： ２４時間誘導　４８時間誘導 組込み細胞　０Ｄ６６Ｑ　ａ　−ｇａｌ　０Ｄ６６０　ａ　−０１３ｇ／　ｌ　 ｍｇ／　］ ５Ｕ５０Ａ２％ｇａｌ　９　５８　８　８２ＳＵ５０Ｂ２％ｇｉｌ　１５　１０ １　１３　２３５ＳＵ５０Ｃ２％ｇｘｌ　６　４５　４　１０１ＳＵ５．ＯＤ２ ％ｇｘｌ　１４　４１　１．［ｌ　５４表に示す結果は、マルチコピー組込みを 使用して外来遺伝子を高いレベルで発現できることを明らかに示している。さら に、Ｓ　Ｕ　５０Ｂ　ｆ２３５ｍ　ｇ　／　Ｉ　）は染色体外のプラスミドを持 つ発現系に比べより高レベルのα−ガラクトシダーゼを産生ずる（参考文献２１ のｐＵＲ２７３０参照）。４つの全てのマルチコピー組込み細胞は高いコピー数 の組込みα−ガラクトシダーゼ発現カセットを持つことで選んだが、その発現レ ベルは５４〜２３５ｍｇ／ｌと異なる。

４．５Ｕ５０Ｂマルチコピー組込み細胞の遺伝的安定性複数のコピーのα−ガラ クトシダーゼ発現プラスミドのＳ。

Ｃｅｒｌ目目ｅへの組込みが遺伝的に安定かどうかを調べるために、非選択的条 件下で完全なテスト手順を繰り返した。組込み細胞５Ｕ５ＯＢをＹＰ［ｌ−寒天 培地に広げ、予め培養したものを接種し、３０℃のＹＰＤ内で一晩培養した。次 に、プレー培養物をＹＰＧｓ　ｌで１＝１０に希釈した。サンプルを採り、光学 密度を６６０ｎｍで測定し、培養ブロスのα−ガラクトシダーゼ含量を酵素活性 アッセイで測定した。驚くべきことに、α−ガラクトシダーゼの発現レベルは全 実験の間安定であった。この実験は、実際にマルチコピー組込み発現ベクターは 非選択的条件下で多世代にわたり非常に安定していることを示す。もう１つの重 要な発見はマルチコピー組込み細胞は４℃に維持した非選択的ＹＰＤ−寒天板で 数カ月にわたり安定であったことである。５Ｕ５０Ｂ組込み細胞のプレ培養物を ２％ガラクトース含有ＹＰで１＋１０００に希釈し、等しい００６６０　ｎ　ｍ になるまで３０℃で培養すると、α−ガラクトシダーゼの発現は２５０ｍ　ｇ／ 　ｌである。この実験で、マルチコピー組込み細胞５Ｕ５０Ｂのプレ培養物をＹ ＰＧｇ　ｌでより広範に希釈し、これに関連して　１：１０希釈でα−ガラクト シダーゼが産生されるものと同じバイオマスになる前に誘導した培養物の細胞は さらに分けなければならない。従って、α−ガラクトシダーゼ産生の安定性、従 ってマルチコピー組込み細胞の遺伝的安定性は非選択的条件下で細胞外のプラス ミドに比べて非常に良好であると結論できる。

また、マルチコピー組込み及びマルチコピー組込み細胞の遺伝的安定性にはマル チコピー組込みベクターの長さが重要なパラメータであることも発見した。約１ ２ｋ　ｂのマルチコピー組込みベクターを使用するとゲノム内の組み込みベクタ ーのコピー数が低下し、また非常に相応なものではあるが遺伝的安定性が減少す る傾向にある。比較的小さいマルチコピー組込みベクター（±３ｋｂ）を使用す ると、高いコピー数を持つが遺伝的安定性が低下した組込みベクターが得られる 。これらの結果は、高いコピー数の、遺伝的安定性の良好なベクターが得られる マルチコピー組込みベクターの最適な長さはほぼ単一のリポソームＤＮＡ単位の 長さであり、Ｓ、ｃｅ＋ｅｙｉ＋１ａａｅでは約９ｋｂであることを示している 。

この実施例は、蛋白質の製造にＳ、ｃｅｔｅマロ目ｅへのマルチコピー組込みが 使用できることをはっきりと示している。マルチコピー組込み細胞の高い遺伝的 安定性は、選択的な圧力下で細胞を培養しなければならない細胞外プラスミド系 と比べて重要な利点を付与する。マルチコピー組込み細胞は多世代にわたり、Ｙ ＰＤ−及びＹＰＧａｌ培地での培養中と同様にＹＰＤ寒天培地でも非常に安定で あるように思われた。α−ガラクトシダーゼ酵素の発現レベルが高く、組込まれ たα−ガラクトシダーゼ発現カセットの有糸分裂安定性が良好なことを考えると 、この組込み系はα−ガラクトシダーゼまたは任意の他の蛋白質の大量生産にと っての現実的な選択肢である。

酵母へのマルチコピー組込みにはマルチコピー組込みベクタ−についての２つの 必須条件があることを発見した。すなわち、マルチコピー組込みベクターはリポ ソームＤＮＡ配列及び特定の程度の欠失を有する選択マーカーを有していなけれ ばならない。前の実施例では、リポソームＤＮＡ配列と選択マーカーとして欠失 ＬＥＵ２遺伝子（ＬＥＵ２ｄ　）を持つマルチコピー組込みベクターを使用して マルチコピー組込みを得た。この実施例では、酵母でマルチコピー組込みを得る ための（ＬＥＵ２ｄ以外の）他の選択マーカーの使用を示している。この実施例 では、Ｌ、ＥＵ２ｄ遺伝子の代わりに欠失ＴＲＰＩまたは欠失ＵＲＡ３を有する マルチコピー組込みベクターを使用した。これら遺伝子両方の発現はその５′フ ランキング領域の大部分を除去すると非常に減少した。これらのマルチコピー組 込みベクターを使用すると、約２００コピーのベクターが組込まれたマルチコピ ー組込み体が得られた。この実施例は、マルチコピー組込みが他の欠失選択マー カーでも実施できることを明らかに示している。全ての標準的なりＮＡ操作はＭ ＩＯ口１ｉｔ（７）　に記載のように実施した。

１、選択マーカーとして欠失ＴＲＰＩ遺伝子を含有するｐＭＩＲＹプラスミドの 構築と分析 形質転換の間に種々の型の選択圧を使用してゲノムへのマルチコピー組込みが得 られる可能性を調べるために、選択マーカーとして慣用されている２つの遺伝子 、Ｓ、ｃｅｒｅＢｓ日ｅのＴＲＰＬ及びＵＲＡ３遺伝子の欠失対立遺伝子を含有 する一連のｐＭＩＲＹ２．１アナ口−グプラスミド（ｐＭＩＲＹ２．　ＩはｐＵ Ｒ２１７Ｄと同一である）を構築した。ＴＲＰＩ遺伝子は、トリプトファン生合 成の第３ステツプを触媒する酵素Ｎ−（５°−ホスホリボシル−１）−アントラ ニレート（ＰＲ＾）イソメラーゼをコードする（３１）。ＴＲＰ１遺伝子の転写 は、１つはＡＴＧ開始コドンに対して約−２００位にあり、他方はこのコドンの すぐ上流にある２つのクラスターにある（第１９図）複数部位で開始される（３ ２）。２つのクラスターの各々の前にはプロモーター因子として機能しつる（ｄ Ａ′ｄＴ　）の多い領域（３）と推定のＴＡＴＡ因子がある。ＴＲＰＩ遺伝子の 上流部分が一１０２位のＥｃｏＲ１部位（Ｔ△１）まで欠失されているときには 、転写開始部位の最初のクラスターが除去され、遺伝子の発現レベルはその野生 型のものの２０〜２５％まで低下する（３１）。この特定の欠失ＴＲＰＩ対立遺 伝子は現在いくつかの酵母ベクターで選択マーカーとして使用されている。我々 の仮説では、この欠失の程度は不十分であり、従って５゛フランキング配の欠失 は＾丁Ｇコドンの一３０位（Ｔ△２）または−６位（Ｔ△３）上流まで伸ばされ た。Ｔ△２遺伝子は転写開始部位の下流のクラスターの部分をまだ含有している 。Ｔ△３欠失突然変異体では、全てのポリｄＡ：ｄＴストレッチ及び推定のＴＡ ＴＡ因子の両方のクラスターを欠失している。これらの２つの突然変異体ＴＲＰ Ｉ遺伝子も元のＴΔ１遺伝子と同様にｐＭＩＲＹ６−Ｔフリーズのプラスミドの 構築に使用した。このシリーズの構築は次のように行ったぐ第２０図）：最初に 、ＴＲＰＩコード領域と３Ｑｂｐの５°　−フランキング配列を含有する　７６ ６ｂ　ｐ　Ａｃｃｌ−Ｐｘｔｌ　（第１９図）の断片をｐＵＩｌ１９のＳｍ３１ 部位と？ｔ１部位の間にクローニングして、プラスミドｐＵｃＩ９−Ｔ△２を得 た（Ｔ４ポリメリラーゼを使用して３°　−末端に充填してＡｅｅ１部位をプラ ントにした）。次に、Ｂｇｌｌｌ−ＢｒＤＮＡ断片（２７）を含有するｐＵｃ１ ８サブクローン由来の３．５ｋ　ｂ　５ｐｈｌ断片をｐＵｃ１９−Ｔ△２ポリリ ンカーの５ｐｂ１部位に挿入してプラスミドｐＭＩＲＹ６−Ｔ△２を得た。プラ スミドｐＭＩＲＹ６−Ｔ△ｌ及びｐＨ１ＲＹ６−Ｔ△３はｐＨ１ＲＹ６−Ｔ△２ の誘導体である。ｐＭＩＲＹ６−ＴΔｌを得るために、８６７ｂ　ｐ　ＥｃｏＲ ｌ−Ｂｇｌｌｌ　丁ＲＰＩ断片を先ずｐＵｃ１９　ｔｖＥｃｏＲ１部位とＢａｍ ｆ１１部位の間にクローニングしてプラスミドｐ［Ｉｃｌ９−Ｔ△１を得た。次 のステップでは、ＴＲＰＩ遺伝子の部分とｐＵｃ１９配列の一部を含有するｐＭ ＩＲＹ６−ＴΔ２の　１．２ｋ　ｂ　５ＣＩＩ−ＥｃｏＲＹ断片（第２０図）を ｐＵＲ１９−Ｔ△１からの　１．３ｋ　ｂ　５ｃＪｌ−ＥｔｏＲＶ　ＩＦｒ片で 置換して、ＴＲＰΣ遺伝子の５゛　フランキング配列を１０２ｂｐに回復した。

ｐＭｌｌｌＹ６−Ｔ△３も同様に構築した。先ず、ＴＲＰＩ遺伝子からの４０５ ｂ　ｐ　Ａｌｕｌ断片をｐＵｃＩ９の５ｍｇ１部位にクローニングし、ｐＯｃ１ ９−Ｔ△３を得た。次に、ｐＨ１ＲＹ６−τ△２の１２ｋ　ｂ　５ｅａｌ−Ｅｃ ｏＲＶ断片をｐＵＲ１９−Ｔ△３からの　１．２ｋ　ｂ　５ｃ１１−ＥｅｏＲＶ 断片で置換してｐＭＩＲＹ６−Ｔ△３を得た。組込みをｒＤＮＡの遺伝子座に向 けるために、ｒＤＮＡ内でＨａｐｌで線状化した後、プラスミド、ｐＭＩＲＹ６ −Ｔ△１　、ｐＨ１ＲＹ６−Ｔ△２及びｐＭＩＲＹ６−Ｔ△３で酵母を形質転換 した。第２１図には、ｐＭＩＲＹ６−Ｔ△ｌの場合にはＥｃｏＲＹ　、　ｐＭ［ ＲＹ６−Ｔ△２及びｐＨ１ＲＹ６づ△３の場合にはＳｇｃｌで消化した後の２つ の別々に単離した形質転換体についての全ＤＮＡのゲル電気泳動分析を示す。ｐ Ｈ１ＲＹ６−Ｔ△２　（レーン３と４）及びｐＭＩＲＹ６−τ△３　（レーン５ と６）形質転換細胞の場合には、ｒＤＮＡバンド及びプラスミドバンドの強度は 同じ位である。

従って、２つのプラスミドの各々のコピー数はハブロイド当りのｒ　ＤＮＡ単位 の数、すなわち約１５０　（３３）まで高い。ｐＭＩＲＹ６−Ｔ△２及び−Ｔ△ ３プラスミドのコピー数も同程度である。対照的に、ｐＨ１ＲＹ６−Ｔ△１によ る形質転換では高いコピー数の形質転換体は生じなかった。第２１図（レーン１ と２）に示すように、ｐｉｌｌＲＹ−丁△１形賀転換細胞からの全ＤＮＡをＳ！ ＋Ｉで消化すると、線状化ｐＭＩＲＹ６−Ｔ△ｌプラスミドに対応する　６．９ に、ｂのバンドは認められない。上記の結果は、酵母のｒ　Ｄ　Ａ　Ｎ遺伝子座 へのマルチコピー組込みは必ずしもベクター内にＬＥ［］２ｄ遺伝子選択マーカ ーの存在を必要とするわけではないことを明らかに示している。代わりに、欠失 ＴＲＰＩ対立遺伝子の発現レベルが臨界レベルより低い場合にはこれも使用でき る。

２゜選択マーカーとして欠失［ＩＲＡ３遺伝子を有しているｐＭＩＩＩＹプラス ミドの構築及び分析 ＬＥ［Ｉ２及びＴＲＰＩ遺伝子に次いで、ＵＲ＾３遺伝子が酵母ベクターで最も 広く使用されている選択マーカーの１つである（３４）。［１ＲＡ３遺伝子はオ ロチジン−５“　−ホスフェートカルボキシラーゼ（ＯＭＰデカルボキシラーゼ ）をコードする。この遺伝子の発現は正の制御因子として作用するＰＰＲＩ遺伝 子産物による転写レベルで制御される（３５）。欠失分析から、ＯＲ＾３のＰＰ ＭＩ誘導に必要な配列は人ＴＧ翻訳開始コドンのすぐ上流にある９７ｂｐ長の領 域にあることが示唆される（３６）。所望の程度の欠失を持つＵＲ＾３遺伝子の プロモーターを得るために、＾丁Ｇ開始コドンの！６ｂｐ上流に位置するＰ＋ｔ １部位を使用してこの領域の大部分を欠失させた。

その目的で、ＡＴＧ翻訳開始シグナルに対して＋　８８０位のＵＲＡ３遺伝子の ３′　フランキング領域に位置するｐＦＬｌ　（３６Ｂ）のＳｓｕ　１部位にＢ ｇｌｌｌ　リンカ−を挿入して、ｐＦＬｌ−Ｂｇｌｌｌを得た。Ｂｇｌ＋１部位 に隣接したフランキング３°領域とＰｉｎ部位に隣接した５′フランキング領域 の１６ｂｐのみと共にＵＲＡ３コード領域を含有する　０．９ｋ　ｂ　Ｐ＋ｔｌ −Ｂｇｌｌｌ断片をｐＵｃ１９のＰＩ１１部位とＢｉｍＨ１部位の間にクローニ ングして、ｐＵｃ１９−Ｕを得た（第２２図）。

Ｂｇｌｌｌ−Ｂ　ｒ　Ｄ　Ｎ　Ａ断片の部分を含有する　２．８ｋ　ｂ　Ｓ！ｃ ｌ−５ｔａｌｒＤＮＡ断片をｐ［Ｉｃ−ＢＲから単離し、ｐ［Ｉｃｌ９−Ｕ△の Ｓ１１部位と５ａｄ１部位の間に挿入し、プラスミドｐ１１１１１Ｙ７−１１△ を得た。２つの別々に単離したｐｉｌｌＲＹ７−Ｕ△形質転換体のコピー数分析 を第２３図に示す。プラスミドバンドとｒＤＮＡバンドは同様の強度を有し、こ れはプラスミドが細胞当り約２００コピー組込まれることを意味しており、プラ スミドｐＭＩＩＩＹ６−Ｔ△２及びｐＭｌｌｌＹ６づ△３で得た結果と同様であ る。この実施例は、酵母リポソームＤＮＡ遺伝子座へのマルチコピー組込みは選 択マーカーとしてＬＥＵ２ｄ以外の遺伝子を使用しても実施されることを明らか に示している。実際、必須栄養素の生合成に関与する任意の遺伝子は、発現され るがその発現レベルが臨界レベル以下の場合には、ｐＭＩＲＹプラスミドに選択 マーカーとして使用されるとこの過程を支持するようである。

これは、驚くべきことに、必須遺伝子を欠いた５ｃｅｒｅマｉ＋ｉａｅ株にこの マルチコピー組込みベクターをマルチコピー組込みするためには、マルチコピー 組込みベクター上にリポソームＤＮＡ配列の他に、欠失しているが必須である遺 伝子がなければならないこと、そして得られたマルチコピー組込み細胞は多世代 にわたり安定でありうることを発見したことを意味している。従って、マルチコ ピー組込みの原理は全ての５ｃｅｒ＋マ目目色栄養要求性株にも適応でき、任意 特定の遺伝子の発現に広い宿主株からの選択が可能になる。このような選択は酵 母での異種遺伝子発現を最適化するために重要な要素である。

十分に規定されていない培地（非合成培地）であっても加熱滅菌によりトリプト ファンを容易に欠失できるために、特にＴａｐ栄養要求性は工業用プロセスに使 用するために魅力的なマーカーである。

実施例１０　連続培養でのマルチコピー組込み体５Ｕ５０の安定性希釈速度０． Ｉｈ’（平均滞留時間１０時間）で、作動容量８００ｍ１の連続培養（ｃｈ＋ｍ ｏ＋ｔａｌ　）でマルチコピー組込み体を培養した。組込み体５Ｕ５０Ｂは株５ ｘｃｃｈ＋ｏｃ７ｃｅ＋　ｃ＋＋＋ｖｉ＋ｉａｅ　ＣＢ５２３５、９０のマルチ コピー組込みベクターｐＵＲ２７７＋　（実施例８参照）による形質転換体であ る。１０％ＮＨ４ＯＨを使用してｐＨを５．０に調整した。シリコン油をベース とする消泡剤ｆＲｂｏｄｏ＋＋１１４２６　ＲＲｂｏｎｅ−Ｐｏｕｌｅｏｃ）を 使用して起泡を抑制した。使用した供給組成物はＡであった。バイオマスの乾燥 重量濃度１１．０６ｇ／ｌで、α−ガラクトシダーゼを３６０ｍ　ｇ　／　ｌで 安定に発現し、１２０時間定常状態を維持した。他の実験では同様な条件は５０ ０時間以上安定であった。残留グルコース濃度は０．０５ｇ／ｌの検出限度以下 であった。残留ガラクトース濃度は４．２＋／−０，１ｇ／Ｉであった。人口で は酵母抽出物及びＤＨＷ由来のロイシン１７０ｍｇ／］を含有していた。これに より、アミノ酸分析機で測定して２．０＋／−０，４ｍｇ／Ｉのロイシン濃度の 定常状態が得られた。しばらくした後、供給物Ａにロイシン５０ｍｇ／ｌを加え た。驚くべきことに、培養物中の残留ロイシン濃度は０．７＋／　−０，２ｍ　 ｇ／　１に低下した。これとともに、８０時間以内にα−ガラクトシダーゼ活性 は　１４４ｍ　ｇ　／　ｌまで顕著に低下した（第２４図）。東２５図には、実 験の種々の段階でのコピー数の測定値を示している。サンプルを採り、染色体Ｄ ＮＡを単離し、Ｂｇｌｌ＋で消化し、次に実施例８に記載のようにリポソームＤ ＮＡプローブを使用してサザンブロツティングを実施した。

５Ｕ５０Ｂｌは振とうフラスコ内で培養した正の対照である。より大きなハイブ リッド形成りＮＡ断片（組込まれたベクター）とより小さいハイブリッド形成り ＮＡ断片（染色体ｒＤＮＡ単位：±　１５０コピー）を比べると、組込まれたベ クターのコピー数は約　１００であることが明確に判明する。これは、ロイシン 添加前に採取したサンプルのサザンプロットである５Ｕ５０Ｂ　２についても同 じである。ロイシンを添加し、α−ガラクトシダーゼの発現が低下した後に採取 したサンプルである５Ｕ５０Ｂ３のコピー数は約１０まで低下した。この実験は 、α−ガラクトシダーゼ発現の低下がα−ガラクトシダーゼ遺伝子のコピー数の 低下を伴うものであることを示している。培養物のロイシン取り込みはロイシン 添加後に高くなる。

上記の実験は非常に驚くべきことに組込まれたプラスミドの遺伝的安定性は、細 胞外ロイシンがかなりの量存在するにもかかわらず、増殖には細胞内ロイシンの 産生が必要であるという事実によることを示している。ＬＥＵ２ｄプロモーター が非効率的であるため、染色体上に多数のＬＥＵ２ｄ遺伝子が存在するときのみ に十分量のロイシンの産生が可能である。

組込み部位がリポソームＤＮＡ遺伝子座にあるまたは直接結合しており、適正な 増殖速度条件及び培地組成があるときにのみこのように多数の組込まれた遺伝子 が安定に保持される。

培地　組成　ｇ／ｌ 化合物　Ａ　Ｂ　ＣＤ ＮＨ４Ｃｌ　７．６　７．６　７．６ ＫＨ２ＰＯ４２，８４，０４，Ｏ Ｍｇ　Ｓ　Ｏ４，７ａ　ｑ　０．６　０．６　０．６微量金属　１０１Ｇ 酵母抽出物　５１０ （Ｄｉｌｃｏ）Ｈ ペプトン　０．０　０．０　２０ ＤＨＷ（ＵＦ）　１２５　０．０ グルコース　５．５　２０　２０ ガラクトース　１０　２０　１０ ヒスチジン　０．０５　０．２　’０．２ビタミン溶液　２　１　１ （添加した）ロイシン　０．０５ ｐＨ５，０５，０５，０５，０ ＤＨＷ：ＤＭＶ（オランダ）製の蛋白質を除去し、加水分解した乳漿 ＵＦ、限外濾過、分子量カットオフｌ０ｋＤ＃＃：酵母抽出物は８〜９％Ｗ　／ 　Ｗのロイシンを含有している。

（実施例１Ｇに記載の）ＳＵ５０Ｂ株を培地Ｃ及びＤ中で振とうフラスコ内で培 養した。これは複合富裕培地と最少培地の２つの極端な培地である。培地Ｃ（Ｙ ＰＧＡＬ）は５２４ｍｇ／ｌのロイシンを含有している。驚くべきことに、組込 み体は多くのサブ培養についてＹＰＧＡＬ培地で安定であった（実施例８参照） 。培地り及びロイシン含有の他の最少培地では、発現は急速に減少した。培地Ｃ 中の（酵母抽出物及びペプトン由来の）ロイシンの残留濃度は５２４ｍｇ／ｌか ら　３９３ｍｇ／ｌに低下した。培地り中のロイシン濃度は５Ｇから約Ｈｍｇ／ ｌに低下した。

最少培地中での株の増殖速度は約０．Ｉｈ’であったが、培地Ｃでの増殖速度は ０．２７ｈ’であった。酵母抽出物を添加することにより、増殖速度は０．２７ ｈ−１まで上昇し、さらにα−ガラクトンダーセ産生の安定性も改善された。複 合培地では増殖速度が高まるだけではなく、培養中のα−ガラクトンダーゼ濃度 も上昇した。

これらの実験は、ロイシンの存在下ではマルチコピー組込み細胞は高い増殖速度 で安定であったことをはっきりと示している。この知見から、効率的な発酵過程 が得られ、１時間当り培養容量当りにかなりの蛋白質量が得られる。

実施例１２　ｔｌｉｏｉ＋ａｕｌａ　ｐｏ１７ｍｏ＋ｐｈａでの合成リパーゼ遺 伝子の発揚 次の手順を使用して、合成リパーゼ遺伝子を［１，ｐｏ１７ａ＋ｏｒｐｈ＊ゲノ ムに組込んだ（第２５１１！ｌ：この実施例の各図では、使用した制限酵素認識 部位は星印で記す；クローニング手順によりカッコに挟まれた制限認識部位を除 去する）：ａ、プラスミドｐ［ＪＲ６０３８（第２７図）を制限酵素ＥｃａＲＩ 及びＥｃｏＲＶで完全に消化した。アガロースゲル電気泳動で断片を分離した後 、実施例２に記載のようにベクター断片を単離した。

ｂ、実施例３に記載のようにいくつかの異なる合成カセットをアセンブルした。

これらのカセットは、種々の長さの未成熟すバーゼ遺伝子とインベルターゼシグ ナル配列を正確に合せるために必要な多くのアミノ酸をコードした。その結果、 リパーゼ酵素の発現、プロセッシング及び輸送について最適な構築物が確立され た。さらに、これらのカセットはＥｃｏＲＩ及びＥｃｏＲＶ末端を有した。

典型例を第２６図に示す。

Ｃ，アセンブルしたカセットをａで調製したベクターに連結した。

ｄ、このように得たプラスミド（ｐＵ１６８５０．６８５１及び６８５２、第２ ８図）を制限酵素Ｘｂｏｌで部分的に消化し、線状化プラスミドを単離した。

ｅ、プラスミドｐＯＲ３５０１（２１、第２９図）をＸｈｏｌで部分的に消化し た。アガロースゲル電気分解後、Ｈ，ｐｏｌＢｏｒｐｈ！メタノールオキシダー ゼ（ＩＩＯ！　）プロモーターとＳ、ｃｅｚマ■ロｅインベルターゼシグナル配 列の最初のアミノ酸を含有する約１５ＧＱｂ　Ｉ）のＤＮＡ断片（ｐＵＲ３５０ １カラノ０〜ｆ５００位）ＸｂｏｌＤＭＡ　断片）　ヲ単離した。

ｆ、ｅからの　１５ｋｂ断片をｄで調製したベクター断片に連結すると、プラス ミドＵＲ６８６０，６８６１及び６８６２、第３０図が得られた。

ｇ、連結混合物でＥ、ｅｏｌｉを形質転換した。単一コロニーから培養後にプラ スミドＤＮＡを単離し、制限酵素分析で判定した正しいプラスミドを選択し、大 量に単離した。

ｈ、ステップｇで得られた正しいプラスミド（例えば、ｐ［１Ｒ６８６０，６９ ６１，６８６２、第３０図）を８ｉｍＨ１で完全に消化し、次に接着末端をフレ ノウポリメラーゼで充填した（実施例２）。

次のステップで、線状プラスミドをＥｃｏＲＩで消化し、約２５ｋｂ長の、ＭＯ Ｋプロモーター、インベルターゼシグナル配列及び合成リパーゼ遺伝子を含むＢ ａｍＨｌ−ＥｅｏＲＩ　Ｄ　Ｎ　Ａ断片に充填し、アガロースゲルから単離した 。

１、プラスミドｐ［１Ｒ３５１１（第３１図、ｐＥｉｌＢＬ９の３１１１１１　 、　Ｈｉｎｃｌｌ制限部位にクローニングしたＩｌ、Ｐｏ１Ｙ＠ｏｔｐｂｚメタ ノールオキシダーゼ（Ｍｏｘ）ターミネータ−）を５ｍｇ１及びＥｃｏＲＩで消 化し、次にアガロースゲルからベクターを単離した。

ｊ、　ｐＵＲ３５１１ベクターとｈで得た２、５ｋｂ断片を連結し、Ｅ。

＋ｏｌｉでクローニングした。得られた構築物では、リパーゼ遺伝子にＭｏｘ転 写ターミネータ−が続く。これらの構築物の典型例はｐ［ｌＲ６８７０，６８７ １及び６８７２　（第３２図）である。

ｋ、これらのプラスミドをＥＣ０ＲＩ及びＨｉｏｄｌｌｌで消化し、次に、約３ 　ｋ、　ｂの断片をアガロースゲルから単離した。接着末端をフレノウポリメラ ーゼで充填した。

１、プラスミドＹＥｐ１３　（３７）から５ｅｌｌ断片を除去して２ｔｔｍの配 列を欠失させたプラスミドｐＵＲ３５１３（第３３図）をＰｖｕｌｌで消化した 。

ｍ、線状プラスミドｐＵＲ３５１３とｋで得た断片を連結して、ｐ［ＩＲ６ｇ８ ０．６８８１及び６８８２　（第３４図）の最終構築物を得た。

１’ｌ、ｐｏｌｙｍｏ＋ｐｈｘゲノムへの発現カセットの導入（２１，３８，３ ９）に記載のように、ＬＥ［Ｉ　表現型の選択を使用して、プラスミドＤＮＡで Ｈａｏ＋ｅｎａｌｓ　ｐｏ１７ｍｏｒｐｈａ株Ａ１６を形質転換できる。

組込み体の分析はサザンプロット手順（７）を使用して実施できる。

実施例１３　マルチコピー組込みを使用したＨｔｎｔｅｎｕｔ＋ｐｏ１７ｉｏ＋ ｐｈｕでのグアーα−ガラクトシダーゼの産生この実施例では、Ｈｊ＋ｚｅｎａ １ｐｏ１７ｍｏｒｐｈ１へのマルチコピー組込みを使用する、異種蛋白質、グア ーＣＢ３ｏｐ＋ｉｓｌｅｌｒｘｇｏｎｏｌｏｂｘ由来のα−ガラクトシダーゼの 発現を記載する。

Ｏｖｅ＋ｂ＋ｅｋｅ　ｆ２１）が記載するように、α−ガラクトシダーゼをコー ドする遺伝子を同種発現シグナルに融合すると、発現ベクター　ｐ［ｌＲ３５１ ０が得られた。９［ｌＲ３５１０のα−ガラクトシダーゼ発現カセットはｔ（、 ｐｏｌｙｍｏｒｐｂ＋　メタノールオキシダーゼプロモーター、Ｓ、ｃ＋＋＋ｖ ｉ＋ｉａｅインベルターゼングナル配列、（成熟α−ガラクトシダーゼをコード する）α−ガラクトシダーゼ遺伝子、及びＨ，ｐｏｌｙｍｏ＋ｐｈａメタノール オキシダーゼターミネータ−からなる。この発現カセットを単離し、マルチコピ ー組込みベクターｐｔ＋Ｒ２７９Ｑに挿入すると、ｐＵＲ３５４０が得られた。

マルチコピー組込みベクターｐＵＲ３５４０でＨ，ｐｏ１７ｍｏｒｐｂ＋を形質 転換すると、驚くべきことに、マルチコピー組込み体が得られた。得られたマル チコピー組込み体は植物蛋白質α−ガラクトシダーゼを発現し、分泌した。この 実施例は、Ｉ（、ｐｏ１７ｍｏｒｐｈｔでマルチコピー組込み体を得られること 及びこれらのマルチコピー組込み体を蛋白質産生に使用できることを明確に示し ている。また、Ｓ。

Ｃｅ１ｌマロＩＣリポソームＤＮＡ配列及びＳ、ｅｅ＋ｅｗｉｔ目ｅ欠失選択マ ーカーを使用してｆｌ、Ｐｏ１７Ｉｌｏｒｐｈ＊でマルチコピー組込み体が得ら れるようであった。全てのＤＮＡ操作はＭｘｎｉ１＋口（７）が記載の標準手法 を使用して実施した。

プラスミド９［ｌＲ３５１Ｇ　（２１）を［Ｉｉ口ｄｌ１１及びＢＡ、ｍ［１１ で消化し、α−ガラクトシダーゼ発現カセットを含有するＤＮＡ断片を単離した 。マルチコピー組込みベクターｐ［１Ｒ２７９（ｌは、Ｓ。

ｏ１ｉｇｏｒｈｉ＋ｓＤ　Ｎ　Ａと　１００ｂ　ｐ　Ｓ、　ｅｅ＋ｅｖｉｓｉｘ ｔ　リポソームＤＮＡを含有する　Ｂｇｌｌｌ−ｆｌｉｎｄｌｌｉ　５００ｂ　 Ｉ）断片を複数のクローニング部位を含有するＢｇｌｆｌｔｌｉｎｄｌｌｌポリ リンカー配列で置換することによりｐＵＲ２７４Ｇから得る。マルチコピー組込 みベクター　ｐ［ｌｌ１２７９ｆｌをＢｉｎｄｌｌｌで部分的に消化し、Ｂｇｌ ｌｌで完全に消化して、次にベクター断片を単離した。Ｂｇｌｌｌ−ｔｌｉｎｄ ｌｌｌベクター断片及びα−ガラクトシダーゼ発現カセットを含有するＨｉｎｄ ｌｌｌ−ＢｓｍＨ１断片を連結すると、マルチコピー組込みベクター　ｐ［ｌＲ ３５４０が得られた（第３５図も参照；使用した制限認識部位はすべて星印で示 す）。連結混合物でε　ｃｏｌｉを形質転換した。

培養後に単一コロニーからプラスミドＤＮＡを単離し、制限酵素分析で判定して 正しいプラスミドを選択し、大量に単離した。

マルチコピー組込みベクターｐ［Ｉｌ！３５４０を５ＩＩｌｉｌで線状化し、線 状化したベクターｐ［ｌＲ３５４０でＲｏｇｇｅｎｋＪｍｐら（３９）が記載し た手順を使用してＨ，ｐｏ１７ｍｏ＋ｐｈｚ＾＋６　（ＬＥ［Ｉ２−　）を形質 転換した。マルチコピー組込み体であるＬＥＵ２　を単離し、別の実験に使用し た。マルチコピー組込み体と対照としての親株＾１６を非選択的条件（１％酵母 抽出物、２％Ｂｇｃ＋ｏ−ｐｅｐｌｏｎｓ　２％グルコース、４０時間、３７℃ ）で培養し、Ｉｘｎｏｖｉｃ！ら（４９）が記載のように染色体ＤＮＡを単離し た。全ＤＮＡをＢｉｎｄｌｌｌで消化し、消化した染色体ＤＮＡをサザンハイブ リッド形成（７）で分析した。メタノールオキシダーゼプロモータ一部分Ｃ−１ ３１３位から−４３５位、ｌｅｄ＋ｈｏｅ＋　ｆ４１）　］を含有する　ｘｈｏ 　ｌ　８７８ｂ　Ｉ）断片を３２Ｐで標識し、プローブとして使用した。このハ イブリッド形成実験の結果を第３６図に示す（レーン２は親株、レーン１はマル チコピー組込み体）。レーン２の親株では、約１４ｋｂのＤＮＡ断片がメタノー ルオキシダーゼプロモーターとハイブリッド形成でき、その断片はゲノムの単一 コピーに存在する完全なメタノールオ千シダーゼ遺伝子を含有するＤＮＡ断片に 対応するようである。レーン１のマルチコピー組込み体では、約８ｋｂのＤＮＡ 断片に対応する別のハイブリッド形成シグナルが得られた。この断片は、特にα −ガラクトシダーゼ発現カセット及びメタノールオキシダーゼプロモーターを含 有する［１ｉｏｄｌｌｌ断片である組込まれたベクターｐＵＲ３５４０の部分で ある。レーン２のハイブリッド形成シグナルの強度を比較すると、２０コピ一以 上のマルチコピー組込みベクターがＨ，ｐｏｌｙｍｏ＋ｐｈａゲノムに組込まれ たと算定できる。

０マｅｔｂｅｅｋｅ　ｆＨ，）が記載するように、マルチコピー組込み細胞をα −ガラクトシダーゼ発現について分析した。メタノールで誘導すると、酵素活性 アッセイで培地中にα−ガラクトンダーゼが検出された。

この実施例は、Ｈ，ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｘへのマルチコピー組込みが可能なこと 、従って、Ｈ，ｐｏ１７ｃｏｒｐｈｘでの（例えば異種の）蛋白賀の産生にマル チコピー組込みシステムを使用できることを明確に示している。この実施例は、 ２つの必須要件、すなわちリポソームＤＮＡ配列及び欠失選択マーカーを使用し て、酵母（例えば、Ｉｌ、ｐｏ１７ｍｏ＋ｐｈｉ）のゲノムに発現ベクターをマ ルチコピー組込みできることも示している。このような選択マーカーは、欠失遺 伝子の発現レベルが臨界レベル以下であれば、同種または他の宿主（例えばＳ、 ｃｅｄｅマロ目ｅ）由来であってよい口実施例ｔ４　ＫｌｏＹｙｅ＋ｏｎ７ｃｔ ｘへのマルチコピー組込みこの実施例では、Ｋｌｃｙｗｅ＋ｏｍ７ｅｅ＋　ｍｓ ｒ！Ｉｎｌ１ｓ　ｙｔ＋、１ｘｅｌｉｓのゲノムでプラスミドベクターのマルチ コピー組込みを得る手順を述べる。Ｓ、ｃｅｄｅマ目ロｅ由来のリポソームＤＮ Ａ配列及びマルチコピー組込みベクター（ｐＭＩＲＹ６−Ｔ△ｆ　、ｐＭＩＲＹ ６−Ｔ△２及びｐＭＩＲＹ６づ△３）由来の欠失選択マーカーを含有するマルチ コピー組込みベクターを構築した。マルチコピー組込みベクターでＴＲＩ”　Ｋ 、ｍ＋ｒｒｌｎｕｓ株を形質転換すると、驚くべきことに、Ｋｌｕ７ｖ＋＋ｏｍ ｙｃ＋＋株のゲノムに複数のコピーのベクターを組込んだ形質転換体が得られた 。この実施例も、同種または異壇の欠失選択マーカーを使用して酵母でマルチコ ピー組込みが得られることをはっきりと示している。

５Ｐｈｌで消化し、ベクター断片を単離し、次にベクター断片を連結して、マル チコピー組込みベクターｐＭＩＲＹ６−Ｔ△１、ｐＭＩＲＹ６−Ｔ△２及びｐＭ ＩＲＹ６−Ｔ△３　（実施例９参照）からＳ。

ｅｌｅ！ｉ＋ｉｔ＋リポソームＤＮＡを除去した。得られたベクターで、４４０ ０ｂ　ｐεｃｏＲＩ　Ｋ、　ｍｔｒｘｉａｎｕ＋リポソームＤＮＡ断片（４２、 第３７図）をＥｃｏＲ１部位にクローニングすると、マルチコピー組込みベクタ ーｐＭＩＲＫ７△ＴＬ　ｐＭＩＲＫ７ΔＴ２及び９ＭＩＲＫ７△Ｔ３が得られた （第３８図）。Ｓｇｃｌで線状化した後マルチコピー組込みベクターで、ＬｉＡ ｃ手順（４４）を使用して、Ｋ、　ｍｔｒｒｉｘｎｉｓ株ＭＳＫ　１１０（ｇ　 、［１ＲＡ−Ａ　５ＴＲＰＩ：：ＵＲＡ３）　（４３）を形質転換した。形質転 換体を丁ＲＰ　表現型について選択した。得られた組込み体を非選択的条件（０ ，６７％アミノ酸含有Ｙｅ！ｓｔ　Ｎｉｔｒｏｇｅｎ　Ｂ■ｅ、　２％グルコー ス、３０℃）で６〜７．３０〜３５及び６０〜７０世代培養した。これは、組込 み体をＯＤ５５０ｎｍで２〜３まで増殖させ、新しい非選択的培地で０Ｄ５５０ ｎ、ｍＯ川まで希釈し、○Ｄ５５０ｎｍ２〜３まで増殖させて実施した。このサ イクルを数回繰り返した。

これらの組込み体から全ＤＮＡを単離しく４５）、ＰＨＩで消化し、　０８％ア ガロースゲルで分離し、次にプローブとしてＫ。

１ｓｃｌｉｓリポソームＤＮＡ　（第３７図）のＥｃｏＲＩ−ＰＳＴＩ断片を使 用するサザン分析を行った。策３９図にｐＭＩＲＫ７△Ｔｌの組込み体について 得られた結果を示す。レーン５には、ｒＤＮＡプローブと宿主株の消化した染色 体ＤＮＡのハイブリッド形成を示し、ｒＤＮＡプローブは±１５０反復コピーの ｒＤＮＡ単位とハイブリッド形成する。レーン１には、ｐＶＩＲＫ７△丁１組込 み体を示す。

親株についてと同様にｒ　Ｄ　Ｎ　Ａコピーとのハイブリッド形成が見られたが 、さらにマルチコピー組込みベクターの反復組込みコピーも見られる。対照とし て、線状化マルチコピー組込みベクターとｒ　Ｄ　Ｎ　Ａプローブをハイブリッ ド形成させたものも示す（レーン６）。ハイブリッド形成シグナルの相対強度は 組込まれたベクターのコピー数の算定に使用できる。ｒＤＮＡ単位とのハイブリ ッド形成シグナルは土＋５０　コピーに相当する。ベクターの組込まれたコピー のハイブリッド形成シグナルの強度とｒ　ＤＮＡ単位とのハイブリッド形成シグ ナルの強度を比較すると、コピー数は少なくとも５０と算定される。この結果は 、驚くべきことに、酵母ＫｌｕｙマｅＩＯｍ７＋ｅｌ属でもマルチコピー組込み が得られることを示している。レーン２．３及び４には、レーン１でも使用した マルチコピー組込み体を非選択的に各々６〜７．３０〜３５及び６０〜７０世代 培養した後の組込みパターンを示す。

組込まれたベクターとのハイブリッド形成シグナルの相対強度は減少りないこと が明確に示される。この驚くべき知見は、非選択的条件での長期培養後でさえマ ルチコピー組込みは完全に安定であることを証明する。ｐＭＩＲＫ７△Ｔ２及び ｐＭＩＲＫ７△Ｔ３のマルチコピー組込み体を使用しても同様の結果が得られた 。

この実施例は、２つの必須要件、リポソームＤＮＡ配列とこの実施例では異種選 択マーカーであった欠失選択マーカーとを有するマルチコピー組込みベクターを 使用するとＫＩＢマｅｒＯＪｅｅｉでマルチコピー組込みが得られることを明確 に示している。マルチコピー組込み体は非選択的条件下で少なくとも６０世代に わたり安定である。実施例８及び１３の同様の方法で、産業上重要な蛋白質をコ ードする遺伝子を有する発現カセットをマルチコピー組込みベクターに挿入し、 発現カセットを含む得られたベクターで形質転換することにより、マルチコピー 組込みを使用してＫｌｕｙｖｅ＋ｏｎ７ｃ＋＋で蛋白質を製造できる。これらの マルチコピー組込み体は産業上重要な蛋白質の製造に使用できる。マルチコピー 組込みシステムの特有の特性、高いコピー数及び高い遺伝的安定性から、これら のマルチコピー組込み形質転換体は産業上重要な蛋白質の任意公知の発酵生産過 程に使用できる。

下記の文献は明細書中に引用されたものである・３、Ｔｓｃｈｕｍｐｅｒ、　Ｇ 、　ａｎｄ　Ｃａｒｂｏｎ、　Ｊ、、　（１９８０）、　Ｇｅｎｅ、　話。

２５、　５ｚｏｓｔａｋ、　、：ｒ、Ｗ、　ｅｔ　ａｌ−、（１９７９）、　Ｐ ｌａｓｍｉｄ、　２．５３６−５５４゜図面の説明 種々のプラスミドの図面では、長さのオーダーが示されている。

第１図　Ｐ、ｇｌｕｍ＋ｅ　リパーゼ遺伝子を含むプラスミドｐＵＲ６００２の 略図。

第２図　ｐ９ｇｌｕｍａｅ　リパーゼ遺伝子の完全なヌクレオチド配列；詳細は 本文参照。

第３図　ｐｌ［［１１０３の構築の略図：詳細は本文参照。

第４図　プラスミドｐ［ｌＲ６１０７及び、［ｌＲ６１０８の構築の略図；詳細 は本文参照。

第５図 Ａ、ｐＵＲ６（１３ｇの合成リパーゼ遺伝子の完全ヌクレオチド配列。

Ｂ、ｐＵＲ５６Ｈの合成リパーゼ遺伝子の３′　フランキング領域のヌクレオチ ド配列。

第６図　合成リパーゼ遺伝子のカセットの構築の例。

第７図　プラスミドｐ［ｌＲ６１３１の構築の略図；詳細は本文参照。

第８図　洗剤系での耐性の改善された突然変異リパーゼの例。

第９図　プラスミドｐＵＲ６８０１の構築の略図。プラスミド９０Ｒ６８０１は 酵母発現及び分泌配列と共に合成リパーゼ遺伝子を含むＳ、ｃ＋＋＋ｙｉ＋ｉ１ ｅ／Ｅ、ｃｏｌｉ　シャトルベクターテアル。

第１０図　ｐＯＲ６ｇＮを使用したＳ、ｅ＋＋ｅｗｉ＋ｉａ＋　ｔ”、（７）リ パーゼの発現のウェスタン分析。対応のプロットをリパーゼ特異性抗体と共にイ ンキュベートした。

標　準＝１μｇ及びＱ、２５ｔｔｇのＰ、ｇｌａｍａｅ　リパーゼ。

Ｓ　Ｕ　１０　：宿主株５ＵＩＯの全細胞内蛋白質。

Ｔ　Ｆ　１７細胞：　ｐ［ｌＲ６８０１で形質転換した５ＤＩＯの全細胞内蛋白 質。

ＴＦＩ７上清：　１＋［１Ｉ１６８Ｇ１で形質転換した５ＤＩＯの全細胞外蛋白 質。

第１１図　マルチコピー組込みベクターｐＵＲ２７９０の略図。

１１！１２図　ｐＵｌ１６８０３　）構築の略図。プラスミドｐＵＲ６８０３ハ リパーゼ発現カセットを含むマルチコピー組込みベクターである。

第１３図　マルチコピー組込み体のリパーゼ発現のウェスタン分析。マルチコピ ー組込み体はＳ、ａｃｒｅマ目ｉｘｅ株５Ｕ５０をマルチコピー組込みベクター ９ＵＲ６１１０３で形質転換して得た；７つの独立したマルチコピー組込み体を 示す。対応のプロットをリパーゼ特異性抗体と共にインキュベートした。

標　準：１μｇ及び０．２５ｇｇのＰ、ｇｌａｍｌｅ　リパーゼ。

５Ｕ５０：宿主株５Ｕ５０の全細胞内蛋白質。

１−７＋７つの独立したマルチコピー組込み体の全細胞内蛋白質。

第１４図　α−ガラクトンダーゼ発現カセットを含むマルチコピー組込みベクタ ーｐ［ｌｌ１２７７４の略図。

第１５図 Ａ、Ｓ、ｃｅｒｅｖｉＳＩａｅのリポソームＤＮＡ遺伝子座の遺伝子構成の略図 。

Ｂ、Ｓ、ｃ＋＋ｅｖｉ＋ｉｇｅ　（？ルチコピー組込み体５Ｕ５０Ｂ）のリポソ ームＤＮＡ遺伝子座でのｐｔｌＲ２７７４のマルチコピー組込みの遺伝子構成の 略図。

第１６図　マルチコピー組込み体５Ｕ５ＱＢ及び５０５０Ｃの未消化及びＢｇｌ ｌ＋消化全ＤＮＡの臭化エチジウム染色アガロースゲル。

第１７図　α−ガラクトシダーゼプローブを使用したマルチコピー組込み体の全 ＤＮＡのサザンプロット。

Ｓ　Ｕ　５１ＨＢｇｌｌｌ　：　Ｂｇｌｌｌで消化した親株ＹＴ６−２−Ｉ　Ｌ 　（ＳＵ５Ｇ）の全ＤＮＡ。

Ｃ本Ｂｇｌｌｌ　：　Ｂｇｌｌｌで消化したマルチコピー組込み体５Ｕ５０Ｃの 全ＤＮＡ。

Ｂ　＊Ｂｇｌｌｌ　：　Ｂ（ＩＩＩで消化したマルチコピー組込み体５Ｕ５０Ｂ の全ＤＮＡ。

Ｃコマルチコピー組込み体５Ｕ５０Ｃの未消化全ＤＮＡ。

第１８図　リポソームＤＮＡプローブを使用したマルチコピー組込み体のサザン プロット。

５Ｕ５０本Ｂｇｔｌｌ　＋　Ｂｇｌｌｌで消化した親株ＹＴ６−２−Ｉ　Ｌ　（ ＳＵ５０）の全ＤＮＡ０ Ｃ＊Ｂｇｌｌｌ　：　Ｂｇｌｌｌで消化したマルチコピー組込み体５Ｕ５０Ｃの 全ＤＮＡ０ Ｂ　＊Ｂｇｌｌｌ　：　Ｂｇｌｌｌで消化したマルチコピー組込み体５Ｕ５０Ｂ の全ＤＮＡ。

Ｃ，マルチコピー組込み体５Ｕ５０Ｃの未消化全ＤＮＡ。

第１９図　（３２）によるＴＲＰＩ遺伝子の構造。ＦＡＴ］　・ポリ（ｄＡ　： 　ｄＴ）ストレッチ、（ＵＡＳ）、部分的な一般制御上流活性化部位。実際の配 列は推測の丁Ａτ人因子について示す。

ＴＲＰＩコード配列は黒棒で示す。種々のｍＲＮＡ種は矢印で示す。

大きさは塩基対で示す。プロモーター欠失の構築に使用した制限部位を示す。

第２０図　種々のプロモーター欠失を持つＴＲＰＩ対立遺伝子を含有するプラス ミド９ＭＩＲＹ６−丁±ｌ　、ｐＨ１ＲＹ６−Ｔ±２及びｐＨ１ＲＹ６−Ｔ±３ の構築。いくつかの制限部位について示す座標はＡＴＧ開始コドンについての位 置を示している（Ａは＋１位）。各プラスミドについてＴＲＰＩ遺伝子の５°末 端の位１１（−６、−３０または−１０２）を示す。種々のｐＨ１ＲＹ６プラス ミドに存在するｒＤＮＡ断片のより詳細な地図は右上に示す。非転写ｒ　ＤＮＡ スペーサは［Ｎ］　と略す。

第２１図　９ＭＩＲＹ６−Ｔ△１　（レーン１及び２）　、ｐＭＩＲＹ６−Ｔ△ ２　（レーン３及び４）及びｐＭＩＲＹ６−Ｔ△３　（レーン５及び６）形質転 換体のプラスミドコピー数。全ＤＮＡを形質転換細胞から単離し、ｐＭＩＲＹ６ −丁△１の場合にはＥ＋ｏＲＹ　テ、９１１１ＲＹ６−Ｔ△２及びｐＨ１ＲＹ６ −Ｔ△３の場合には５ｚｃｌで消化した。断片を０．８％ゲル上での電気泳動で 分離した。Ｄ　Ｎ　ＡをＥｔＢｒで染色した。プラスミド及びｒ　ＤＮＡバンド を示す。

第２２図　プロモーターの大部分を欠失させたＵＲＡ３遺伝子を含有するｐＭ＋ ＲＹ−７Ｕ△の構築。いくつかの制限部位について示す座標はＡＴＧ開始コドン に対する位置として示す（Ａは＋１位）。

ＵＲ＾３士の５゛−末端の位置を示す（Δ１６）。ｐＭＩＲＹ７−ＵΔに存在す るｒＤＮＡ断片のより詳細な地図は右上に示す。非転写スペーサは［Ｎ］と略す 。

第２３図　ｐＨ１ＲＹ６−Ｕ△形質転換体のプラスミドコピー数。形質転換細胞 から全ＤＮＡを単離し、５ｉｃｌで消化した。断片を０８％ゲル上での電気泳動 で分離した。９．１ｋｂｒＤＮＡ及び６４ｋｂプラスミドバンドを示す。

第２４図　連続培養でのマルチコピー組込み体５Ｕ５０Ｂの安定性詳細は本文参 照。

第２５図　連続培養の種々の段階で単離したマルチコピー組込み体５Ｕ５０Ｂの Ｂｇｌｌｌで消化した全ＤＮＡのサザンプロット。

５Ｕ５０Ｂ　ｌ：　振とうフラスコで培養した５Ｕ５０Ｂ０ＳＵ５０Ｂ　２・　 連続培養の開始時の５Ｕ５０Ｂ。

５Ｕ５ＧＢ　３：　ロイシン添加後の５Ｕ５ＱＢ。

第２６図　Ｆｌ、ｐａｌｌｌｌｏｒｐｂｘのリパーゼ発現ベクターｐ［ｌＲ６８ ８０。

ｐＵＲ６８８（及びｐＵｌ１６８８２の構築経路の略図。構築経路の各段階は別 の図（第２７図から策３４図）に示す。詳細は本文参照。

”ＩＥ　２７図ｐＵＲ６０３８の略図。

第２８図　ｐＵＲ６８５２の略図。

第２９図　ｐＵＲ３５０１の略図。

第３０図　ｐ［ｌＲ６８６２の略図。

第３１図　、［１Ｒ３５１１の略図。

第３２図　ｐＵＲ６８７２の略図。

第３３図　ｐ［１Ｒ３５１３の略図。

第３４図　ｐＵＲ６８ｇ２の略図。

第３５図　α−ガラクトシダーゼ発現カセットを含むＨ３ｐｏｌｕｍｏｒｐｂａ 　？ルチコピー組込みベクターｐ［ｌＲ３５４０の略図。使用した全ての制限酵 素部位は星印で示す。

第３６図　ｐＵＩ１３５４０を使用して得たＨ、ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｘ　？ルチ コピー組込み体のＨｉｎｄｆｌｌで消化した全ＤＮＡのサザン分析。

レーン１．　マルチコピー組込み体。

レーン２：　非形質転換宿主株。

第３７図　クローニングしたに、ｌｉｃ＋ｉ＋のリポソームＤＮＡを示す（４２ ）。コノヘクターカラ指示しりＢｓｍＨＩ−３ｚｃｌ断片をｐ　Ｔ　ｌ　１９　 Ｕ　ニサブクローニングした（４６）。得られたベクターから、ｐＭＩＲＫ７Δ 丁１、ｐＭＩＲＫ７△Ｔ２及びｐＭＩＲＫ７△Ｔ３の構築にＥｃｏＲＩ断片を使 用した。

ハブリッド形成実験のプローブとしてＥｅｏＲＩ−ＰｇＮ断片を使用した。

第３８図　マルチコピー組込みベクターｐＭＩＲＫ７△Ｔ１、ｐＭＩＲに７Δ丁 ２及びｐＭＩＲＫ？ΔＴ３の略図。

第３９図　非選択的条件下で培養した後のマルチコピー組込み体の消化した染色 体ＤＮＡとリポソームＤＮＡプローブのノ＼イブリッド形成。レーン１−４＝マ ルチコピー組込み体ＭＩＲＫ７△月。

レーン５：親株１１ＳＫＩＩＯ：レーン６：線状化マルチコピー組込みベクター ｐＭＩＲＫ７△Ｔ１゜染色体ＤＮＡは実験開始時（レーン１）、６〜７世代後（ レーン２）、３０〜３５世代後（レーン３）及び６０〜７０世代後（レーン４） に単離した。

１　・−−・−・−−−！−−・・−・−・・〒−−−・−−・−−＋−・−− −・・−・＋−−−−−−−・・Φ−・・・−・・−・Ｔ６O ．３９ＭＶＲ５ＭＲ５ＲＩノＡＡＲＡＶＡｕＡＬＡＶ・６１　−、−−−−−− −＋−−−−−−−４−−−−１−−−−’ｐ−−−−−＝−−＋−−−−−− −、−÷−−−−−−−、、＋　１Q０ ８１ｇ、＋ｓ＠ｑ、　−Ｉ　Ｔ１ １２１−・−−一−−・−＋・−・・−−−−−＋・−−−一−・−一◆・−− −−・・・・＋−・−・・−−・−＋−−・・・・・・・＋@１８０ ＣτにＴＧＧＡＴＣＣＧＣＣＧＣＴＧＣＧＣにＡＴＡＧＧＣＣＡＣＴＡＧＧＡＧ ＣＡＧＧＴにＣＣにＧＡＧＣにＣＣＣＧＴＣＧＣ丁ＧＤＴＹＡＡＴλＹ？λ１１ ．Ｌ入’）ｌＧＬＡＧ丁９・１８１−−・−−・−−−◆−−・−−−−−−＋ −−−−−＝−４−−−一・・−＋−−一−−−−−・＋−−−−一−−−・今 ２４０ＴＴＣＡＡＧＣＣＣＴＴＧＣＡＣＣＡＣＣ丁にＡＴＡＡＣＣＡＴＧＣＣＴ ＴｊｌＣＣＴＣＴＣＧＣ丁ＡＧＡＣＧＴＴＡＧＣＧＴＡＣＣＧ：ＫＦ　Ａ　ＮＶ ＶＤＹＩＪＹＧＩＱＳＤＬＱＳＨに　・ＣＧＣＴＴＣＣＡＣＡＴＣＣＡＧＣにＣ ＴＴＡＧＡＧＡにＣＣＣＴＡＡα汀ＣＴＣＧＣＴＧＣＴＧＣＣＣＧにＣＴＴにＣ ＣにＧＣＧＡ　Ｋ　Ｖ　Ｙ　Ｖ　Ａ　Ｎ　Ｌ　Ｓ　Ｇ　Ｆ　Ｑ　Ｓ　Ｄ　Ｄ　Ｇ 　Ｐ　Ｎ　Ｇ　Ｐ。

ＧＥＱＬＬＡＹＶＫＱＶＬＡＡＴＧＡＴＫ’％ｌ　。

ｒ＋　Ｌ　Ｚ　Ｇ　）Ｉ　Ｓ　Ｑ　Ｇ　Ｇ　Ｌ　Ｔ　Ｓ　ｇ　Ｙ　Ｖ　Ａ　Ａ　 Ｖ　Ａ　！’　・ＱＬＶＡＳ、ＶＴＴＺＣＴＰＨＲ＋：５ＥＦＡＤ・Ｆ　ｖＱ　 Ｄ　’ｊ　Ｌ　Ｋ　Ｔ　Ｄ　Ｐ　Ｔ　Ｇ　Ｌ　Ｓ　５　Ｔ　Ｖ　Ｉ　Ａ　Ａ　− ＦＶＮＶＦＧＴＬＶＳＳＳ）ＩＮＴＤＱＤＡＬ　・ＡＡＬＲＴＬＴＴＡＱＴＡＴ ＹＮＲＮＦＰＳ・ＡＧＬＧＡＰＧＳＣＱＴＧＡＡＴＥＴＶＧＣ−５ＱＨＬＬＹＳ ｕＧＧＴＡＩＱＰＴＳＴ、ＶＬ　−ＧＶＴＧＡＴＤ１’５ＴＧＴＬＤＶＡＮＶＴ Ｄ　・ＰＳＴＬＡＬＬＡＴＧＡＶＭＩＮＲＡＳ’ＧＱ　・Ｎ　Ｄ　Ｇ　Ｌ　Ｖ　 ５　Ｐ、　ＣＳ　Ｓ　Ｌ　Ｆ　Ｇ　Ｑ　Ｖ　Ｉ　Ｓ　丁　ｓ’、゛　。

Ｐ ■ ■ １（１−ＩＮＨＬＤＥＩＮＱＬＬＧ；ＶＲＧＡＮＡＥ　・ＤＰＶＡＶＩＲＴＨＶ ＮＲＬＫＬＱＧＶ＊−：、ｐｕＲ６０３８つ＊Ｉｉ　・ｈ？−ｔ’４＜ｆ−’？ 　ｔ＋　ｏＮＡ　ｌｉｔ、ｆ゛ｊ１−−−−φ−−−＋−−−−−−−−斗−− −−−−＋−−−−−−−＋−−、−−−−−−◆−、−−−、−−＋　６０Ｃ ＴＴＡＡにＴＡＣＣＡＡＴＣＴＡＣＣＴＡＣＣＣＡＴＣにＧＣＡＣＡＡＣＧＴｃ ｃＡτＣτｃｃｃｃ＾ＧＣにＴＡＣＣＣに’Ｃ，Ａ丁ＭＶＲ５ＭＲ５ＲＶＡＡＲ ＡＶＡｕＡＬ　・６１　−−−、−−−−−＋−・−・−−−−＋−・−・−− −−＋−−・−一−−−−＋・−−一−−−−−今−−−−−−−・−＋１２K ｃｃＡｃλＡｒＡｃｃｃτＡＡＴＣにＡＣＣτＣＣＴＣにＴＣＣＴＡＡＴＴにＴ ＴＡＣＣにＡＣＣＣＡＧＡＧＧＡＣにＴＣＣＣＣＡＣＡ　Ｖ　Ｍ　Ｐ　Ｌ　Ａ　 に　Ａ　Ａ　Ｇ　Ｌ　Ｔ　Ｍ　Ａ　Ａ　Ｓ　Ｐ　Ａ　Ａ　Ｖ　−ＡＡＤＴＹＡＡ ＴＲＹＰＶＩＬＶ）ＩＧＬＡＣ。

ＴにＣＣＴにＴＴＣＡＡＡＣＧ　ＣＴＴＡＣＡにＱ’ＡＣ丁にＡＴにＡＣＣＡＴ ＡＣＣＡＴＡＧＧＴＣＡにＴＣＴＡＧＡＡにＴＴＡＧＡ。

ＴＤＫＦ、ＡＮＶＸ７ＤＹｕＹＧｒＱＳＤＬＱＳ−にＴにＣＣＴＣＧＡＴτＣＣ ＡＡＡＴにＣＡＣＣＣ！−’：　ＴＡＡＡＣＴＣに　ＣＣＴＡＡＧｃＴＣＡＧＡ ＣＴＧ　ＣＴＡＣＣＣにＣＴＴsＧ １（１：ＡＫＶＹ）Ａ？ＩＬＳＧＦＱＳＤＤ（：？曳：。

３０：　−−−−−−・−〒−・・−ｍ−・・−・・・−−−−−・−・−・・ ・・−・−ヰ一一−・・−−−ｍ−・−・−・・・・−二６O ＣＣＣＦ：、Ｃ５ＣＣλＣＴＴＧＴＣＣＡＣＧλＡＣＺＣＡＴにＣＡＧＴＴτＣ τ丁Ｃ八ＴＧＡＡＣＧＴへＣＡＴＧＣＣＣτＣＣ；ＡＴＧＣＧＲＧ三ＱＬＬＡＹ ＶＫＱ＼’Ｌｒ’、Ａ−、Ｇ、ＡＴ−ＡＡにＧＴＣλＡＣＴＴＧＡＴＣＣＣＣＣ ＡＣＴＣＴＣＡＡＧＧＴＣＧＣＣＴＴＡＣＡＴＣＴＡＧＡＴＡＣ（１；ＴＴＧＣ ＴＯこＣにＴＧ３６１　・−・−−−・−・＋−−−一−−・−・−−−・・− ・・−＋−一−・−−−４−＝−−−−−＋−・・・−・−４−２０ττＣＣＡ ＧＴＴにＡＡＣＴＡにＣＣ！−ＣＴにＡＧＡＧＴＴＣＣＡＣＣＧＧＡＡＴＧＴＡ ＧＡＴＣＴＡＴＧ；ＣＡＡＣにＡＣＳＣＣＡＣにＶＮＬＩＧＨ５ＱＧＧＬＴＳＲ ＹＶＡＡｌ〕・ＧＣＴＣＣＴＣＡＧＴＴＧＧＴＣ（：ＣＣＡＧＣＣ；τＴＡＣＴ ＡＣ（１；μ＝ＴＣＣＧＴＡＣＧＣＣＴＣＡＣＡＧＡ（Ｇ；ＣＴＣＴにＡＣsＴ Ｃ １１＋２′Ｌ−−−−−−−−・−−＝・・・・−−一−−−−−−・・−・↓ ・・・−・−・・−＋−−−−−−・−−◆・−−・−、、|、＋　＋ＥＯ ＣＧＡにＧＡＧＴＣＡＡＣＣＡＧＣ（：にＴＣＣＣＡＡＴＧＡＴＧＣＴＡＧ；Ｃ ＣＡτＧＣＧＧＡＧＴＧＴＣＴＣＣにＡＣＡ、ＣＴＣλｆｉ|Ｇ ＡＰＱＬＶＡＳＶＴＴｉにＴＰ）ＩＲＧｓＥＦ　−ＣＣτＧＡＣＴＴＴにＴにＣ ＡＡにＡＣにＴＣＴＴＧＡＡＣＡＣＴＧＡＣＣＣＡＡＣＡＧＧＡＣｍＣＧ；丁Ｃ ＧＡＣ（、；ＴＴＡＴ丁４８１　−−−−・−−−−＋−−一・−・−・−＋− −−−−−−−−＋−−−・−−−−４−−−−−一〜−−雫−−−・−−−− −４TＩ＋０ ＣＧＡＣＴＧＡＡＡＣＡＣＣＴＴＣＴＧＣＡＧＡＡＣＴＴＣＴＧ；ＡＣＴＣＧＣ Ｉ；ＴＴにＴＣＣＴＣ；ｋＡＡにＣＡＧＣＴＧＣＣ＆Ａτλ` Ａ　Ｄ　Ｆ　Ｖ　Ｑ　Ｄ　Ｖ　Ｌ　Ｋ　Ｔ　Ｄ　Ｐ　Ｔ　ＣＬ　Ｓ　Ｓ　Ｔ　’ ｉ’　工。

ＧＣＧにＣＴＴＴＣにＴＴＡＡＣＣＴＴＴＴＣＧＧＣＡＣＡＴＴＧＧＴＴＴＣＴ ＡＧＣＴＣＴＣＡＣＡＡＴＡＣＧＧＡＴＣＡＧＧＡＣ５４１−−−−−−−＋− −−−−−−−−十−−−−−−−−＋−−−−−−−−−＋−−−−−−−− −＋−−−−−＋　６００ＣＧＣＣＧＡＡＡＩＩ；ＣＡＡＴＴ（：ＣＡＡＡＡＧ ＣＣにＴＧＴＡＡＣＣ思ＧＡＴＣＧＡＧＡＧτＧＴＴＡＴＧＣＣ丁ＡＣτＣＣτ ＧＡＡＦ”’ＪＮＶＦＧ　τ　ＬＶ５ＳＳＨＮＴＤＱＤ　。

ＧＣＣＣＴＴ（：ＣＴＩＩ；ＣＡＴＴＧＣＧＣＡＣ（：ＣＴＴＡＣＡＡＣににＣ ＴＣＡＧＡＣＴＧＣＣＡＣＧＴＡＴＡＡＴＡＧＡＡＡＣＴＴs ６０１　・−一一一−・−＋−−・−・−・−ヰー−−−−−・・−＋・−一− −−−・−＋−−−−−−・−４−・−−−−・−＋　６６O ＣにＧＧＡＡＣＧＡＣＧＴＡＡＣにＣＣＴＧＣにＡＡＴにＴＴＧＣＣＧＡＧＴＣ ＴＧＡＣＣＧτＧＣＡτＡＴＴＡτＣＴＴＴにＡＡＪ＾ＬＡへＬＲＴＬτＴＡＱ ＴＡτＹ二：Ｒご；：＝ＣＣＡＡＧＣＣ；ＣＴＧＣＣＴＴＧＧｓＡｃｃ：ｃｃｒ ｃｃｒｒｃｌ　ＴＣＴＣＡＣ−ＡＣＣ；ＣＣＣＣＣＡＣＣＴＡＣＡＧＡＧＡＣｃ Ｃτ■ ６６Ｌ　−−−・−−−−−十−−・−・・・−・−−−−−−−−一・−−・ −・−−ｍ−・＋−−一−・−−−・！−−−−−−−・・■@′：２０ ＣＧττＣにＣ（：ＡＣＣＧＡＡＣＣＣＴＣＧＡ、にＧＡＣＣＡＡにＡＡＣＡに τＣＴにＣＣＣＧ；ＣＧτＣＣ＾フＧＴＣＴＣτｃｃｃ、ｔ■ ＰＳＡＧＬＧ　八　：’　Ｇ　Ｓ　ＣＱ　Ｔ　Ｇ　Ａ　Ａ　Ｔ　ε　Ｔ　Ｖ　。

ＣＣ３ＱＨＬＬＹＳ　冨　（、ＣＴ　Ａ　ＩＱ？ＴＳＴ　−Ｖ　’−Ｇ　Ｖ　Ｔ 　Ｇ　Ａ　Ｔ　Ｄ　Ｔ　Ｓ　Ｔ　に　Ｔ　Ｌ　Ｄ　”ｒ　Ａ　Ｎ　Ｖ　−丁　Ｄ ＰＳＴＬＡＬＬＡＴＧＡＶＭＩＮＲＡＳ　・ＧＱＮＤにＬＶＳＲＣ５ＳＬｒＧＱ ＶＩＳＴ　＋５Ｙ）ＩｕＮＨＬＤＥＩＮＱＬＬ（：ＶＲＣＡＮ　＋；、ｒ［）Ｄ Ｉノ、１．ｒ工Ｒ７Ｈ＋、ｌ＼？二ＫＬＱＣ”−１０８ｉ　−−−−・−−−− ＋−−−一・−−−−〒−−−−−−−−・＋−−−−−−−１１１７’　ｐＬ ＩＲ６６０ｏの番、ｙ　、　、　、、ｏ−ゼ゛１ベナｅ＞　ｓ′、ｖ＜　ＯＮＡ 　Ｍ？ｙｌ’１１０２二　−−−−−−−−−＋−−−−−−−−−＋−−−− −−−−＝−−−−−−−−＋−−−−−−−−−＝−−−−−−−−−ｆnＢ 。

ＡＥＤＰＶＡＶＩＲＴＨＶＮＲＬＫＬＱＧ、”−ＴＧＡＡＧＣＴＴ ＣｐＬｉＲ６０２Ｂ　（２６ム　ｂｐ１３Ｂ（３３）　・ｘ−３Ｄ＋３］） ３Ｈ（３６）　−ｘ−３Ｍ（コ３）　・×−−×−３Ｒ（３６）　−ｘ ３Ｆ＋’３３）−ｘ・コＳ４３６１ ｘ　５ａｃ１．／　ＨＩｎｃｌｌｌｌ ベア７一時片つ牟紹。

５Ｕ５０Ｂ　Ｓ［Ｊ５０Ｃ ｉ１＋ｇ４Ｌｔ含ベパーリＳυ５０Ｂつ安良櫨ａ　Ｄ＝０．１１／ｈ 口發酵情Ｆ＠’ｌ　／情「・１ ａ　ｇａｌ　シＫ　ｍｇ／ｌ　−１−！、＠＊乞ｄ、ｗ、ｇ／ｌ大１０＋　７〜 ：ｃ；　〔−イｙ゛７〕　ｍｇ／　！　÷　ｃｒイｐ−、すｒｙ−ｋｑ　ｍｇ／ ｇＸ／ｈｒＤＮＡ　−＋’クーブ 国際調査報告 国際調査報告 ｌｓｌａｒｐａｗａｍ　Ａｅｓｍ＋ｍ。＋ｉ−ＰＣＴ／ＥＰ　９０１０１１３Ｂ 国際調査報告

Claims (27)

【特許請求の範囲】
1. １．宿主真核生物のゲノムに発現ベクターをマルチコピー組込みして形質転換し た真核生物により同種または異種の蛋白質を製造する方法であって、前記発現ベ クターは本明細書に定義の、前記同種または異種の蛋白質をコードする「発現可 能な遺伝子」と本明細書に定義の「特定培地中での酵母またはかびの増殖に必要 な欠失選択マーカー」の両方を含有しており、前記発現ベクターは、真核生物ゲ ノムのリボソームＤＮＡ遺伝子座への前記発現ベクターのマルチコピー組込みを 可能にするリボソームＤＮＡ配列を含有している該方法。
2. ２．前記欠失選択マーカーをＬＥＵ２ｄ遺伝子、ＴＲＰ１ｄ遺伝子及びＵＲＡ３ ｄ連伝子からなる群から選択する請求の範囲第１項の方法。
3. ３．真核生物が真菌である請求の範囲第１項の方法。
4. ４．真菌が、好ましくはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃ ｅｓ及びＨａｏｓｅｍｕｌ２属からなる群から選択した酵母、または好ましくは Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ｒｈｉｓｏｐｕｓ及びＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属から なる群から選択したかびである請求の範囲第３項の方法。
5. ５．前記形質転換した真核生物を、真核生物の増殖に必須の成分を、この成分の 取り込みが律速的である濃度で含有している培地で培養し、従って、宿主生物及 び反応条件によって異なるある最小値以上の増殖速度を得るためには前記成分の 新規の合成が必要となる請求の範囲第１項の方法。
6. ６．形質転換した真核生物を、真核生物の増殖に必要な全ての成分を含有してい る、いわゆる「完全」または非選択的培地で培養する請求の範囲第５項の方法。
7. ７．完全培地が、好ましくは糖蜜、乳漿、酵母抽出物及びそれらの混合物からな る群から選択した工業用に使用される増殖培地である請求の範囲第６項の方法。
8. ８．形質転換した真核生物が、リボソームＲＮＡをコードする遺伝子座にあるま たは直接結合している染色体の１つに、マルチメリックな形で、前記蛋白質を発 現するために必要な遺伝子を含有し、同時に、同じ遺伝子座に前記「必須栄養素 」の合成に生化学経路で必要な蛋白質をコードする欠失遺伝子のマルチコピーも 存在する請求の範囲第１項の方法。
9. ９．発現可能な遺伝子が酵素、好ましくは加水分解酵素、特にリパーゼまたは遺 伝子学的に修飾したこのような遺伝子をコードする請求の範囲第８項の方法。
10. １０．リパーゼを、Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅ　ｖｉｓｃｏｍ　ｖａｒ　ｌｉｐｏ ｌｙｔｉｃｏｍＮＲＲＬ　Ｂ−３６７３　由来のリパーゼに対する抗血清と交差 反応性のあるリパーゼ、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ　ＰＬ−６７９、ＡＴＣＣ３１ ３７１またはＦＥＲＭ−Ｐ３７８３由来のリパーゼに対する抗血清と交差反応す るリパーゼ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ　ＩＡＭ　１０ ５７由来のリパーゼに対する抗血清と交差反応するリパーゼ及びこれらの交差反 応性リパーゼの修飾型からなる群から選択する請求の範囲第９項の方法。
11. １１．第２図に示すヌクレオチド配列またはそのヌクレオチド配列で特定される 同じアミノ酸配列もしくは元のリパーゼと比べて洗剤系で全体的な性能が改良さ れたりパーゼが得られるような修飾型のこのアミノ酸配列をコードする任意のヌ クレオチド配列を有する遺伝子でリパーゼがコードされる請求の範囲第９項の方 法。
12. １２．真核生物が本明細書に定義のような「必須栄養素」の合成を欠失しており 、従って、欠失選択マーカーが「必須栄養素」の合成の相補に寄与しうる請求の 範囲第１項の方法。
13. １３．前記必須栄養素を製造する生合成経路に有効な酸素をコードする遺伝子を 置換して親株を欠失させる請求の範囲第１２項の方法。
14. １４．親株が欠失している酵素が、必須栄養素が形成されるまで分岐しない生合 成経路の一部の反応を触媒する請求の範囲第１３項の方法。
15. １５．必須栄養素がアミノ酸、ヌクレオチドまたはビタミン、特にアミノ酸のロ イシン、　トリプトファンまたはウラシルの１つである請求の範囲第１２項の方 法。
16. １６．発現ベクターが、ベクターに通常存在する配列の他に、（ｉ）　ｄｓリボ ソームＤＮＡまたはその一部例えばリボソームＲＮＡをコードするｄｓＤＮＡ配 列、及び（ｉｉ）５′−−−＞３′の方向に次の順序で：（ｉｉ）（ａ）宿主生 物中で作動可能な強力プロモーター、（ｉｉ）（ｂ）任意に、宿主真核生物から の前記蛋白質の分泌を促進させるシグナル配列、 （ｉｉ）　（ｃ）　蛋白質をコードする構造遺伝子、（ｉｉ）（ｄ）宿主真核生 物で作動可能な有効なターミネーターを含有しているＤＮＡ配列 を含有している請求の範囲第１項の方法。
17. １７．リボソームＤＮＡを、かび特にＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ｒｈｉｚｏｐｕ ｓ及びＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属のかび、及び酵母特にＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃ ｅｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ及びＰｉｃｈｉａ属の 酵母にあるリボソームＤＮＡからなる群から選択することを特徴とする請求の範 囲第１６項の方法。
18. １８．ベクターが宿主生物の１つのリボソームＤＮＡ単位とほぼ同じ長さである 請求の範囲第１６項の方法。
19. １９．プロモーターを、 （ｉ）宿主がＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属に属するときには、Ｇａｌ７プロモ ーター、ＧＡＰＤＨプロモーターまたはＰＧＫプロモーター、（ｉｉ）宿主がＫ ｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ属に属するときには、イヌリナーゼプロモーター、Ｐ ＧＫプロモーターまたはＬＡＣ４プロモーター、（ｉｉｉ）　宿主がＨａｎｓｅ ｎｕｌａ属に属するときには、ＤＨＡＳプロモーターまたはＭＯＸプロモーター 、 （ｉｖ）　宿主がＡｓｐｅｒｇｉｆｉｕｇ属のかびに属するときには、グルコア ミラーゼプロモーター、グルコースオキシダーゼプロモーターまたはＧＡＰＤＨ プロモーター、 （ｖ）宿主がＲｂｉｚｏｐｕｓ及びｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属のかびに属すると きには、セルラーゼプロモーターまたはＧＡＰＤＨプロモーターからなる群から 選択する請求の範囲第１６項の方法。
20. ２０．蛋白質がオキシダーゼであり、宿主細胞がＨａｎｓｅｎｕｌａまたはｐｉ ｃｈｉａまたはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属に属する請求の範囲第１９項の方法。
21. ２１．蛋白質をコードする構造遺伝子が免疫グロブリンのＬ鎖またはＨ鎖、また は好ましくは両方、または免疫グロブリンのＬ鎖またはＨ鎖の一部、好ましくは 通常ＦＡＢフラグメントと呼ばれる部分、または可変部をコードする請求の範囲 第１６項の方法。
22. ２２．遺伝子を遺伝子工学処理により修飾して、修飾免疫グロブリンまたは触媒 活性を有する免疫グロブリン（アブザイム）が得られる請求の範囲第２１項の方 法。
23. ２３．発現ベクターがさらに宿主細胞染色体から欠失または破壊された酵素をコ ードする欠失遺伝子を含有する請求の範囲第１６項の方法。
24. ２４．欠失遺伝子が必須栄養素例えばロイシン、トリブトファンのようなアミノ 酸またはウラシル、ヌクレオチドまたはビタミンを製造する生合成経路に有効な 酸素をコードする請求の範囲第２３項の方法。
25. ２５．方法を、通常のパッチ式発酵、フェッドーバッチ式発酵及び連続発酵から なる群から選択する請求の範囲第１項の方法。
26. ２６．培地が、染色体内に少なくとも２０好ましくは少なくとも５０コピーの欠 失遺伝子が維持される濃度で必須栄養素を含有しており、前記欠失遺伝子が必須 栄養素の生合成に関与する酵素をコードする請求の範囲第２５項の方法。
27. ２７．宿主の増殖速度が、同じ発酵条件下の、必須栄養素を欠失していない同様 な宿主の最高増殖速度の２０〜１００％、好ましくは８０〜１００％であること を特徴とする請求の範囲第２６項の方法。