JPH10506787A - アスペルギルス・ニゲルのシグナル認識粒子をコードする遺伝子 - Google Patents

アスペルギルス・ニゲルのシグナル認識粒子をコードする遺伝子

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JPH10506787A JP8512103A JP51210396A JPH10506787A JP H10506787 A JPH10506787 A JP H10506787A JP 8512103 A JP8512103 A JP 8512103A JP 51210396 A JP51210396 A JP 51210396A JP H10506787 A JPH10506787 A JP H10506787A
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Abstract

(57)【要約】 本発明は、糸状菌シグナル認識粒子の要素をコードする核酸配列を含む核酸構成物に関する。

Description

【発明の詳細な説明】 アスペルギルス・ニゲルのシグナル認識粒子をコードする遺伝子 発明の分野 本発明は、真核細胞内の蛋白質トランスロケーションに関連する蛋白質をコー ドする遺伝子に関する。更に詳しくは、本発明は、糸状菌のシグナル認識粒子の 構成物をコードする遺伝子に関する。 発明の背景 細胞内における経路、それに続く分泌は原核生物、イースト及び哺乳動物細胞 で研究されている。分泌された蛋白質は最初にその目的地を標的としなければな らず、次に標的オルガネラ膜を横切ることができなければならない。近年、細胞 質から小胞体(ER)内への蛋白質の標的づけ又はトランスロケーションの過程に ついて極めて多くが研究されている。最初のアミノ酸配列における分泌シグナル ペプチドは分泌のための蛋白質を標的とする。ER内への分泌蛋白質のトランスロ ケーション過程は、細胞質中のリボソーム上で始まる。シグナルペプチドが合成 され、リボソームから出た後、サイトゾルの因子、シグナル認識粒子、又はSRP は、シグナルペプチドに、そしてリボソームに結合し、翻訳停止を引きおこす。 新生のペプチド/SRP/リボソーム複合体はER膜中のSRP レセプター(SRPドッキ ング蛋白質)により認識され、それに結合し;次にそのシグナルペプチドはGTP 加水分解を要求するステップにおいてSRP から置き換えられる。次に蛋白質合成 が続き、そして新生の蛋白質はERに入る(Walter and Lingappa,Ann.Rev.Cel l Biol.2 : 499-516,1986; Simon,Current Opinion in Cell Biology 5 : 58 1-588,1993) 。 SRP は、単一のRNA 分子(7SRNA)、及びそれらの分子量:9kDa,14kDa,19 kDa,54kDa,68kDa、及び72kDa により同定される6のポリペプチドからなるリボ 核蛋白質である(Walter and Blobel,Nature 299 : 691-698,1982; Siegel and Walter,J.Cell Biol.100 : 1913-1921,1989)。SRP の54kDa サブユニット をコードする遺伝子は、より高度な真核生物(ネズミ及びイヌ;各々 Bernstein et al.,Nature 340 : 482-486,1989; Romisch et al.Nature 340 : 478-482 ,1989)、サッカロマイセス・セレビシアエSaccharomyces cerevisiae)及びスキゾサッカロマイセス・ポンベ (Schizosaccaromyces pombe)(Hann et al.J. Cell Biol.109 : 3223-3230);並びにアラビドプシス・チアリアナ(Arabidopsis thaliana )(Lindstrom et al.,Plant Molecular Biology 23: 1265-1272,1993 )からクローンされている。これらの遺伝子の分析は、その蛋白質が2つの機能 的ドメインからなることを示していた。SRP への新生の分泌ペプチド鎖のための 高分解能架橋を用いて、その蛋白質のC末端半分がシグナルペプチドに結合する ことが証明されている(Kurzhchalia et al.,Nature 320 : 634 〜636,1986; K rieg et al.,Proc.Nat.Acad.Sci.83: 8604〜8606,1986)。このドメイン は、その高い割合のメチオニン残基のためM−ドメインとして言及される。その 蛋白質のN末端半分は、共通GTP 結合モチーフと相同なアミノ酸に基づいてGTP 結合ドメインとして同定されている(Bernstein et al.,Nature 340 : 482 〜4 86,1989; Romisch et al.Nature 340 : 478 〜482,1989)。 糸状菌のSRP に基づく先の研究はない。糸状菌は、組換え蛋白質の発現のため の宿主細胞として現在一般的に用いられ、関心の蛋白質の分泌のレベルを増強す るための手段について進行中の研究があ る。分泌経路の重大なユニットをコードする遺伝子の単離はこの過程を容易にす るだろう。このために、本発明は、SRP サブユニットをコードする遺伝子を提供 し、これにより糸状菌宿主細胞における異種蛋白質の分泌を増加する手段も提供 する。 発明の概要 本発明は、糸状菌シグナル認識ペプチド(SRP)の因子をコードする核酸配列を 含む核酸構成物に関する。好ましい実施形態において、その因子はSRP サブユニ ットであり、最も好ましくはSRP54 である。本明細書に用いられる場合、“核酸 構成物”は、一本鎖又は二本鎖であり得、そして自然に発生する遺伝子からの完 全もしくは部分的な形態において単離され得るか、又はさもなければ自然に存在 しないであろう様式で組み合わされ、近接して並べられた核酸セグメントを含む よう改変されている核酸セグメントを示すことが意図される。その構成物は他の 核酸セグメントを任意に含み得る。好ましい実施形態において、その構成物は スペルギルス(Aspergillus) SRP54 サブユニットをコードする核酸配列を含む。 本発明の構成物はそのサブユニットの発現を増加させるのに役立つ新しいベク ターを形成するのに役立つ。そしてこのようなベクターは、関心の蛋白質の発現 のために宿主細胞、好ましくは糸状菌宿主細胞を形質転換するために、関心の蛋 白質をコードする遺伝子と組み合わせて用いられ得る。関心の蛋白質をコードす る遺伝子を含む宿主細胞内の分泌構成物の産生の増加の組み合わせは、宿主細胞 による関心の蛋白質の収率を増加させることができる。これにより、本発明は、 蛋白質の組換え産生のための方法であって、同じ条件下で培養された野生型株よ り大量の真核生物の分泌経路の1以上の構成物を産生する糸状菌宿主株が、関心 の分泌構成物及び蛋白質の 発現に資する条件下で培養されることを特徴とする方法も提供する。好ましい実 施形態において、その構成物はSRP54 である。 図面の簡単な記載 図1は、2のSRP54 のPCR 産物によりコードされた予測された蛋白質のアライ ンメントを示す。 図2は、アスペルギルス・ニゲル(Aspergillus niger) Bol ゲノムクローンの ヌクレオチド及び予測されるアミノ酸配列を示す。 図3は、アスペルギルス・ニゲルSFAG2 cDNAクローンのヌクレオチド及び予測 されるアミノ酸配列を示す。 発明の詳細な記載 アスペルギルスSRP54 遺伝子を単離するための試みにおいて、先にクローンさ れたSRP54 遺伝子についての保存性の領域に相補的な4つの縮退オリゴヌクレオ チドプライマーをデザインし、A.オリザエ(A.oryzae)ゲノムDNA とのPCR 反 応に用いた。これらのプライマーの2つの組合せとの反応によりつくつかの反応 生成物を生ずる。成功したプライマーの大きく増幅された産生物は、SRP54 につ いて予測される大きさである約500bp である。このフラグメントを精製し、その フラグメントが出版されているイーストアミノ酸配列に基づきSRP54 に特異的で あるか否かを決定するための異なる対のプライマーでの更なるPCR 実験のための テンプレートとして用いる。予測される大きさに相当する390bp 産物を得る。次 に500bp 産物をサブクローニングして、5のサブクローンを配列決定する。先に 単離されたSRP54 遺伝子に対する相同性に基づく2のサブクローンはアスペルギ ルス SRP54 遺伝子をコードするようである。しかしながら、その配列は同一では なく、これは2つのSRP54 遺伝子の可能 性を示唆する(図1)。2つの異なるアスペルギルス種のゲノムDNA での500bp 産物のサザンハイブリダイゼーションは各々の消化物において単一バンドを示し 、これは単一の遺伝子又は2つの密接に結合した遺伝子を示す。 ゲノム配列をクローンするために、Bo-1 A.ニゲルラムダEMBLライブラリー を500bp PCR 産物でスクリーニングする。4つの精製された陽性のものからのDN A を制限酵素マッピングし;4つは同じ大きさのBamHI,HindIII及びSalIフラ グメントを含んでいる。その7.5kb HindIIIフラグメントをサブクローニングし てキャラクタライズする。SRP54 のハイブリダイゼーションが4.5kb ClaIフラ グメントに制限することが見い出される。このフラグメントに基づくオープン読 枠がS.セレビシアエ(S.cerevisiae)のSRP54 N末端に67%の同一性である26 アミノ酸N末端をコードする配列を有することが見い出される。そのゲノムクロ ーンの完全な配列を図2に示す。 cDNAクローンの単離も行なう。SRP54 cDNAの全長の複製をA.ニゲルSFAG2 cD NAライブラリーから同定する。cDNAクローンの配列を図3に示す;DNA レベルに おいて、A.ニゲル Bol SRP54 遺伝子に関連するゆらぎ位置内にいくつかの塩 基変換があり、これは2つの株からの配列間に98%の相同性を供する。C末端近 くの挿入はSFAG2 内に2の更なるグリシン残基を供する。 アスペルギルス・ニゲルSRP54 蛋白質は、49bpイントロンと共に78及び1587bp の2つのエキソンによりコードされる。S.セレビシアエのSRP54 遺伝子と全 体で53%のアミノ酸同一性がある;しかしながら、GTP 結合領域において、相同 性は63%であり、Mドメインにおいて、43%のみの同一性である。 本発明は、図2及び図3に開示される配列、又は本明細書内に示 されるコーディング領域の使用に限定されない。同じ種の2つの株について示さ れる配列における差は、単一種の配列内のバリエーションが許容され、本明細書 に記載される技術を用いて、このような変異体が直ちに同定され得る。それゆえ 、“A.ニゲル”が本文脈において言及される場合、それは全てのこのような変 異体を含むことが理解されるだろう。更に、単離された遺伝子は、他のアスペル ギルス(Aspergillus) 種、例えばA.オリザエ(A.oryzae)A.ホエチドゥス(A .foetidus)A.ジアポニクス(A.japonicus)A.アクレアトゥス(A.acul eatus 、又はA.ニジュランス(A.nidulans)のような他の糸状菌から相同の遺 伝子を単離するための手段を提供する。他の非アスペルギルス糸状菌種は、F. グラミネアルム(F.graminearum)F.オキシスポルム(F.oxysporum) .ソラーニ(F.solani)F.クルモルム(F.culmorum)(又は対応するテレオモ ルフ)のようなフサリウム種、ニューロスポーラ・クラッサ(Neurospora crassa )トリコダーマ・レッセイ(Trichoderma reesei)T.ビリダエ(T.virida e)T.ハルジアヌム(T.harzianum)T.ロンジブランキアトウム(T.lon gibranchiatum)ペニシリウム・ジアンチネルム(Penicillium janthinellum)P.ノタトウム(P.notatum)P.キリソゲヌム(P.chrysogenum)P. カメムベルチ(P.camemberti)P.ロクエホルチ(P.roqueforti)ヒュミコー ラ・インソレン(Humicola insolen) 、H.グリセア(H.grisea)変異体サー モイデア(thermoidea)H.ラヌギノーサ(H.lanuginosa)シタリジウム・ サーモフィルム(Scytalidium thermophilum)マイセリオフトーラ・サーモフ ィラ(Myceliophthora thermophila) 、及びチエラビア・テレストリス(Thiela via terrestris) を含む。その遺伝子、先に記載される500bp フラグメント、又 はそれに基づいてオリゴヌ クレオチドは、これらの他の種の相同的な遺伝子を単離するためのサザンハイブ リダイゼーションにおけるプローブとして用いられ得る。特に、このようなプロ ーブは、関心の種のゲノム又はcDNAとのハイブリダイゼーションのための低〜高 ストリンジェンシー条件(例えば、5×SSPE,0.3%SDS,200μg/mlのせん断 され、変性されたサーモン精子DNA、及び各々高、中及び低ストリンジェンシー のための50,35又は25%のいずれかのホルムアミド中で42℃でのプレハイブリダ イゼーション及びハイブリダイゼーション)下で用いられ得、次にその中の対応 するSRP54 遺伝子を同定し単離するための標準的サザンブロッティング手順に用 いられ得る。本明細書に言及される縮退プローブ、及び糸状菌からのゲノムDNA 又は第1鎖cDNAを用いるPCR 反応により、後に対応するゲノム又はcDNAをクロー ンするためのプローブとして用いられ得るSRP54 特異的産物も産生し得る。好ま しい実施形態において、相同性のある遺伝子は、少くとも約60%の相同性、更に 好ましくは少くとも70%の相同性、そして最も好ましくは少くとも80%の相同性 を有する蛋白質をコードし、そのアミノ酸配列は図2及び3に示される。 本発明の遺伝子は、真核宿主細胞の分泌経路を最適化することにより宿主細胞 中の関心の蛋白質の組み換え体発現を増強することに役立つ。特定の実施形態に おいて、SRP の量は、SRP 遺伝子もしくはそのサブユニット、及び関心の蛋白質 をコードする遺伝子の1以上の更なる複製を含む宿主細胞を形成し、関心の蛋白 質の収率かSRP 複製数が増加されていない宿主細胞に対して増加されるように、 遺伝子の発現に資する条件下で宿主細胞を培養することにより、増加される。こ れは、宿主細胞に対して同種又は異種のSRP で達成され得る。複製数を増加させ ることは、1以上の回数、発現構成物で株を形質転換することにより達成され得 る。あるいは、それは、全 体の細胞の変異誘発により増加され得る。SRP54 蛋白質の量の増加は、構造的( Constitutive)又は制御的のいずれかの強力なプロモーターの制御下にSRP54 遺 伝子をおくことによっても達成される。このようなプロモーターの1つの例はグ ルコアミラーゼプロモーターである。 このようなストラテジーは、分泌機構の他の構成物の発現を増加することによ って収率を増加させるためにも適用され得る。例えば、このような増強は糸状真 菌のシグナル認識粒子の全てのサブユニットのいずれか1つ又はその組合成を用 いて達成され得る。他の真菌のサブユニットの単離及び同定は、SRP54 サブユニ ット蛋白質に対するポリクローナル又はモノクローナル抗体の産生により達成さ れ得、その抗体は、かわりに、細胞の材料からシグナル認識粒子を析出させるた めに用いられ得る。このような材料はその複合体中の他のサブユニットのキャラ クタリゼーション及びクローニングのための基礎を供する。シグナル認識粒子に 加えて、ER膜のチャンネルを導く蛋白質(BioEssays 14: 535〜540)、ERドッキン グ蛋白質又はレセプター、BiP 蛋白質(Nature 355 : 35〜45)、一連のSec 遺伝 子(例えば Sec-14, Sec-59, Sec-61, Sec-62、及び Sec-63)並びにシグナルペプ チターゼの過剰発現。更に先の蛋白質の変異配列は、このような変異体が野生型 蛋白質に対して増加された活性を有し得ることにおける蛋白質過剰発現にも用い られ得る(Perez-Perez,et al.Bio/Technology 12: 178〜180,1994)。 本発明の構成物を含む宿主細胞は、異種蛋白質の発現に特に役立つ。好ましい 宿主細胞は先に同定されるこのような種のような糸状菌である。好ましい実施形 態において、宿主細胞はアスペルギルス属のメンバーである。しかしながら、同 様の分泌メカニズムを用いる真核宿主細胞がこの目的のために用いられ得る。他 の有用な宿主 細胞は、イースト細胞、昆虫細胞、及び哺乳動物細胞を含む。本文脈における“ 異種蛋白質”は、宿主細胞に対してネイティブでない蛋白質、ネイティブの配列 を変えるために改変が行われているネイティブ蛋白質又はその発現が組換えDNA 技術による宿主細胞の操作の結果として定量的に変えられているネイティブ蛋白 質を意味する。この言葉の中には、宿主細胞内の発現か、その宿主細胞に対して ネイティブでない遺伝要素の使用、又は宿主細胞に通常見られない様式で機能す るように操作されているネイティブ要素の使用を含むネイティブ蛋白質が含まれ る。 本発明の宿主細胞は、技術認識された方法を用いる組換え蛋白質産生に用いら れ得る。SRP54 遺伝子、SRP サブユニット、又は他の分泌構成物は、関心の蛋白 質であろうものとして発現ベクターを用いて活性形態において発現され得る。有 用な発現ベクターは、宿主細胞ゲノム内へのベクターの安定な一体化、又は宿主 細胞のゲノムと独立しての宿主細胞内のベクターの自己複製、並びに好ましくは 形質転換された宿主細胞の容易な選択を許容する1以上の表現型マーカーを含む 。発現ベクターは、プロモーターをコードする制御配列リボソーム結合部位、転 写開始シグナル、並びに任意に、レプレッサー遺伝子又は種々のアクティベータ ー遺伝子も含み得る。関心の蛋白質の分泌を許容するために、シグナル配列をコ ードするヌクレオチドは、遺伝子のコーディング配列の前に挿入され得る。制御 配列の方向下での発現のために、本発明に従って用いられるべき遺伝子は、正確 な読み枠内にその制御配列に作用的に結合される。 発現ベクターは、組換えDNA 手順が便利に行われ得るいずれかのベクターであ り得、ベクターの選択は、それが導入されるべき宿主細胞に典型的に依存する。 本発明の好ましい実施形態において、宿主細胞は、アスペルギルス属の株である 。これにより、ベクターは 、自己複製ベクター、即ち染色体外存在物として存在するベクターであり得、そ の複製は、染色体の複製から独立したもの、例えばプラスミド、又は染色体外因 子、ミニ染色体もしくは人工の染色体であり得る。あるいは、ベクターは、宿主 細胞内に導入される場合、その宿主細胞ゲノム内に一体化して、その中に一体化 されている染色体と共に複製されるものである。 ベクター内において、関心の蛋白質をコードする遺伝子は適切なプロモーター 配列に作用的に結合するべきである。プロモーターは、選択された宿主細胞中で 転写活性を示すいずれかのDNA 配列であり得、宿主細胞に対して同種又は異種の いずれかの蛋白質をコードする遺伝子から得られ得る。真菌宿主中の転写のため に、有用なプロモーターの例は、A.オリザエ TAKA アミラーゼ、リゾムコール ・ミエヘイ(Phizomucor miehei) アスパラギン酸プロテイナーゼ、A.ニゲル中 性α−アミラーゼ、A.ニゲル酸安定α−アミラーゼ、A.ニゲルもしくはA. アワモリ(A.awamori) グルコアミラーゼ(glaA)、リゾムコール・ミエヘイリ パーゼ、A.オリザエアルカリプロテアーゼ、A.オリザエトリオースホスフェ ートイソメラーゼ又はA.ニジュランスアセトアミダーゼをコードする遺伝子か ら得られるものである。好ましいのは、TAKA−アミラーゼ及びglaAプロモーター である。 本発明の発現ベクターは、適切な転写ターミネーター、及び真核生物において は関心の蛋白質をコードするDNA 配列に作用的に結合されたポリアデニル化配列 も含み得る、ターミネーション及びポリアデニレーション配列は、適切には、プ ロモーターと同じソースから得られうる。そのベクターは、該ベクターが問題の 宿主細胞中で複製することを可能にするDNA 配列を更に含む。 ベクターは、選択マーカー、例えばその産物が宿主細胞における 欠損を捕捉する遺伝子、又はアンピシリン、カナマイシン、クロラムフェニコー ル又はテトラサイクリン耐性を供するものも含み得る。アスペルギルス選択マー カーの例は、amdS, pyrG, argB, niaD, sC、及び hygB、ヒグロマイシン耐性を 生じさせるマーカーを含む。アスペルギルス宿主細胞に用いるために好ましいの は、A.ニジュランス又はA.オリザエ amdS 及び pyrG マーカーである。更 に、選択は、同時形態転換により、例えばWO91/17243に記載されるように行われ 得る。 関心の蛋白質の発現が細胞外である産物を発生させることが一般的に好ましい 。これにより関心の蛋白質は、培養培地内への発現された蛋白質の分泌を許容す るプレ領域を含み得る。必要に応じて、このプレ領域は本発明の蛋白質に対して ネイティブであり得、又は異なるプレ領域もしくはシグナル配列で置換され得、 便利には、各々のプレ領域をコートするDNA 配列の置換により行われる。例えば 、プレ領域はアスペルギルス種からのグルコアミラーゼもしくはアミラーゼ遺伝 子、バチルス種からのアミラーゼ遺伝子、リゾムコール・ミエヘイからのリパー ゼもしくはプロテイナーゼ遺伝子、サッカロマイセス・セレビシアエからのα− 因子のための遺伝子又はウシプレプロキモトリプシン遺伝子から得られ得る。特 に好ましいのは、宿主が真菌細胞である場合、A.オリザエ TAKA アミラーゼ、A.ニゲル 中性アミラーゼ、バチルスNCIB11837 からのマルトジエニックアミラ ーゼ、B.ステアロサーモフィルスα−アミラーゼ又はバチルス・リキエニホル ミス ズブチリシンのためのプレ領域である。有効なシグナル配列は、A.オリザ TAKA アミラーゼシグナル、リゾムコール・ミエヘイアスパラギン酸プロテイ ナーゼシグナル及びリゾムコール・ミエヘイリパーゼシグナルである。 本発明のDNA 構成物、プロモーター、ターミネーター及び他の因 子各々の連結するため、及び複製に必要な情報を含む適切なベクター内にそれら を挿入するために用いられる手順は当業者に公知である(例えば、Sambrook et a l.Molecular Cloning,1989)。 増強された分泌構成物を含む宿主は、原核又は真核生物のいずれかの関心の蛋 白質を発現するために用いられ得、好ましくは、真核生物蛋白質を発現するのに 用いられる。これらの細胞のために特に関心のあるのは、カタラーゼ、ラッカー ゼ、フェノールオキシダーゼ、オキシダーゼ、オキシドレダクターゼ、セルラー ゼ、キシラナーゼ、ペルオキシダーゼ、リパーゼ、ヒドロラーゼ、エステラーゼ 、クチナーゼ、プロテアーゼ及び他の蛋白質分解酵素、アミノペプチダーゼ、カ ルボキシペプチダーゼ、フィターゼ、リアーゼ、ペクチナーゼ及び他のペクチン 分解酵素、アミラーゼ、グルコアミラーゼ、α−ガラクトシダーゼ、β−ガラク トシダーゼ、α−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ、マンノシダーゼ、イソ メラーゼ、インベルターゼ、トランスフェラーゼ、リボヌクレアーゼ、キチナー ゼ、並びにデオキシリボヌクレアーゼのような真菌酵素の発現におけるそれらの 作用である。“真菌酵素”という言葉はネイティブの真菌酵素ばかりでなく、活 性、熱安定性及びpH耐性等を増強するために行われ得るアミノ酸置換、欠失、付 加、又は他の改変により修飾されているこれらの真菌酵素も含むことが当業者に 理解されよう。宿主細胞は、ホルモン、成長因子、及びレセプター等のような医 薬的関心の異種蛋白質を発現するのにも用いられ得る。 本発明は、以下の非限定の実施例により更に詳説されるだろう。 実施例 I.材料及び方法 株−次の株を以下に記載される実験に用いる:大腸菌 K802(el4 -(mrcA),mrcB,hsdR2,galK2,GalT22,supE44,metB1),大腸菌SOLR(el4-(mc rA),D(mcrCB-hsdSMR-mrr)171,sbcC,recB,recJ,uvrC,umuC::Tn5(Kanr),la c,gyrA96,relA1,thi-1,endA1,1R[F′proABlacIqZDM15]Su,E.coli JM101s upE,thi-1,Δ(lac-proAB),[F′traD36,proAB,lacIQZDM15],E.coli XL-1 Blu e recA1,endA1,gyrA96,thi-1,hsdR17,supE44,relA1,lac,[F′proAB,la cqZDM15,Tn10(tetr)],A ニゲル ATCC1040, Aニゲル Bol,A ニゲル SFA G, Aオリザエ HowB104。 SRP54 のPCR 増幅アスペルギルス・オリザエゲノムDNA からのSRP54 遺伝子 の増幅を次の条件下で行う:0.4ユニットのTaq ポリメラーゼ、1μモルDNA プ ライマー、100mg・DNA テンプレート、1×緩衝液中各々 200μモルのdATP,dCT P,dGTP,TTP(Boehringer Mannheim,Indianapolis,IN)。94℃/5分の1サ イクル、次に94℃/1分、50℃/1分、72℃/1分の30サイクルをEricomp PCR 機内での反応に次のものを用いる。 プライマー A(93−840): CARGGNWSSGGKAARACNAC プライマー B(93−843): TTYGAYCARYTSAARCARAA プライマー C(93−842): TTYTGYTTSARYTGRTCRAA プライマー D(93−837): TTYTCSCCNGTSCCDARTAA 先のプライマーにおいて、Sはイノシンを表し、Yはデオキシリボヌクレオチ ドC又はTを表し、RはヌクレオチドA又はGを表し、DはヌクレオチドA,G 又はTを表し、そしてNはデオキシリボヌクレオチドG,A,T又はCを表す。 PCR 産物のサブクローニング−製造元のプロトコルに続いてTAクローニングキ ット(Invitrogen,San Diego,CA)、を用いて配列決定するためにPCR 産物をサ ブクローニングする。 ラムダライブラリーA.ニゲル SFAG2mRNAをPharmacia cDNAキ ットを用いて調製する。そのライブラリーは、全部で 830,000(84%組み換え) の約 700,000組換えファージを含む。BluescriptプラスミドをStratagene(Lajol olla,CA)により供されるプロトコルに従ってSRP54 ラムダZap クローンから保 護する。 A.ニゲルBol ゲノムライブラリーを、Sau3A でBol ゲノムDNA を部分的に消 化し、10kbより大きいDNA フラグメントを単離することにより調製する。これら のDNA フラグメントを、BamHIで消化されたラムダEMBL4 アーム(Clontech,Pal o Alto,CA)内に連結する。そのライブラリーを標準的プロトコルに従って増幅 する。 DNA 配列決定−蛍光標識ジデオキシヌチレオチドと共にTaq ポリメラーゼサイ クル−シーケンシングを用いてヌクレオチド配列を決定する。そのシーケンシン グ反応物をApplied Biosystems自動DNA シーケンサー(Model 373A,Version 1.2 .0)に基づいて電気泳動する。SRP54 特異的プライマーに加えて、M13リバース (−48)及びM13(−20)フォワードプライマーを用いる(Sanger et al.,J.M ol.Biol. 143: 163〜178)。 II .結果及び議論 周知のSRP54 遺伝子中に見い出された3の保存性の領域に基づく縮退オリゴヌ クレオチドの4のプールを、テンプレートとしてA.オリザエHow B104ゲノムDN A を用いるPCR 実験に用いる。プライマーA及びDの組合せでの反応はいくつか の反応産物を製造した。他のプライマーの組合せはいずれの産物を作るのにも失 敗する。プライマーA及びDでの実験における主要な増幅産物は、周知のSRP54 配列に従う予測された大きさである約 500bpである。その 500bp増幅フラグメン トを精製して、それがSRP54 遺伝子に特異的であることを確認するためのプライ マーC及びDを用いる2回目のPCR 反応におけるテンプレートとして用いる。予 測された大きさに相当する 単一 390bp産物をこの反応において合成する。プライマーA及びDで合成された 500産物を、TAクローニングキットを用いてサブクローニングする。5のサブク ローンをM13リバース及びM13プライマーを用いてDNA 配列決定する。先にクロ ーンされたSRP54 遺伝子への相同性に基づくと、そのクローンの2つはSRP54 を コードしているようであった(S.セレビシアエのSRP54 に対して71%の同一性 )。しかしながら、これら2つのサブクローンの配列は同一でなく、2つのSRP5 4 遺伝子の可能性を示す。 アスペルギルス内のSRP54 遺伝子の数を決定するために、A.ニゲルATCC1040 及びA.オリザエHowB104 からのゲノムDNA のサザン・ブロットを 500bp:PCR 産物プールでプロービングした。ハイブリダイゼーション条件は42℃で15分、2 ×SSC で、15分、1×SSC,0.1%SDS で、そして15分、0.5×SSC,0.1%SDS で 洗浄された42℃における5×SSPE,0.3 %SDS,200μg/mlせん断サーモン精子 DNA 及び50%,35%、又は25%ホルムアミドである。各々の消化物中で1つのみ のバンドがSRP54 プローブとハイブリダイズする;これによりA.オリザエ及びA.ニゲル がSRP54 遺伝子の単一のコピーを含むことが結論づけられる。しかし ながら、2つの密接に結合した遺伝子の可能性は除外され得ない。その配列の差 の他の説明は、PCR 増幅の間のTaq DNA ポリメラーゼによるヌクレオチドエラー の導入である。 SRP54 のためのゲノム配列をクローンするために、A.ニゲルBol ラムダEMBL 4 ライブラリー(26,500組換え体)を、プローブとして 500bp SRP54PCR産物を 用いてスクリーニングする。30,000起のプラークをプロービングして、6の陽性 を単離する。精製の後、もとの陽性クローンの5つをSRP54 プローブとハイブリ ダイズし続ける。これらをサザン・ブロットにより更に分析する。これらのクロ ーンの4つは、そのプローブとハイブリダイズする同じサイズのBamHI,HindII I、及びSalIフラグメントを含む。全てのクローンに共通する7.5kb HindIIIフ ラグメントをサブクローニングして(pDSY16)、更にキャラクタライズする、pD SY16 へのSRP54 プローブのハイブリダイゼーションは 4.5kb ClaIフラグメン トに位置する。このフラグメントのDNA シーケンシングは、ClaI部位の1つか らにおける 150bpで始まるオープン読み枠を表す。この供されたオープン読み枠 は、A.セレビシアエSRP54 蛋白質のN末端と67%の同一性を有する26アミノ酸 をコードし、これによりA.ニゲルSRP54 相同体としてそれを同定する。Bol SR P54 遺伝子の完全なDNA 配列を、コーディング及び非コーディング鎖について決 定し、これを図1に示す。その蛋白質は49bpイントロンにより分離された各々78 及び1587bpの2つのエキソンによりコードされる。その蛋白質はS.セレビシア からのSRP54 蛋白質と53%アミノ酸同一性を有する。GTP 結合ドメイン(アミ ノ酸1〜277)のみをS.セレビシアエの対応するドメインと比較した場合、相同 性は63%に増加する。対照的に、メチオニン・リッチなM−ドメイン(アミノ酸2 78〜533)はS.セレビシアエのそれと43%だけの同一性である。しかしながら、 両M−ドメインについてのメチオニン成分は、11%で保存されている(S.セレ ビシアエ において29残基、A.ニゲルにおいて30残基)。 ラムダ ZapII中のA.ニゲルSFAG2 cDNAライブラリーを、先に列記されるハイ ブリダイゼーション条件を用いてSRP54 をコードするA.ニゲルcDNAクローンを 単離するための試みにおいて、A.オリザエ 500bp PCRフラグメントプールでプ ロービングする。42,000超のプラークをスクリーニングして5の陽性を同定する 。精製の後、4のクローンをそのプローブとハイブリダイズし続ける。プラスミ ドDNA をこれらのクローンの2つから単離してDNA 配列決定によりキャラクタラ イズする(第4のクローンは更に分析しない)。第1の消化されたpShTh24 は スペルギルス SRP54 の全長コピーをコードする。第2のクローン、ShTh6.2 はSR P54 のアミノ酸残基230 で始まる不完全なcDNAをコードする。pshTh24 のオープ ン読み枠の完全なDNA 配列を、コーディング及び非コーディング鎖の両方につい て決定する。これを図2に示す。DNA レベルにおいて、SFAG2 SRP54 はBol・SRP 54 のそれと比較してDNA 配列の98%の相同性を形成するゆらぎ位置においてい くつかの塩基変換を含む。SFAG72 SRP74 コーディング配列のC末端近く6bpの 挿入は、更に2のグリシン残基を導入する。 SRP54 発現構成物は、その遺伝子を、ベクターpTOC68を用いてTAKAプロモータ ー及びAMG ターミネーターの制御下におくことにより作られる。最初に、BamHI 制限部位を、次のPCR プライマー(94〜648): TAGGATCCCCAATGGTCCTTCAGGATCTCGG の端にBamHI部位を付加することによりSFAG2 コーディング配列のすぐ上流に おく。このプライマーをATG 開始コドンの下流塩基 448〜467 と相同である第2 のプライマー(94〜678): TTGGCTTTGGTGGCATTCTGと組み合わせて用いる。PCR 反 応を次の条件下で行う:1×Taq 緩衝液中の 100mgpShTh24(Bluescript ベクタ ー中のcDNAクローン)、1μモルDNA プライマー、各々 200mモルのdATP,dCTP ,dGTP,TTP,0.4μのTaq DNA ポリメラーゼ(Boehringer Mannheim,Indianapol ys,IN)を一緒に混合して94℃/1分、58℃/1分、72℃/1分で30サイクル増 幅する。そのPCR 産物を精製して、BamHI,AatIで消化し、次にBamHI,XhoI で消化されたpTOC68、並びに標準条件下でpShTh24 AatI,XhI精製された2kb フラグメントに連結する。結果として生ずるプラスミドShTh29をXhoIで消化し た後、SfuIで部分的に 消化する。その 6.2kbフラグメントを他のフラグメントからゲルで単離し、T4 D NAポリメラーゼklenowフラグメントで処理する。次にその反応を自己連結してDH 5αマンピテント細胞内に形質転換する。その結果として生ずるプラスミドを p ShTh29Δと命名する。 ラッカーゼの増加された発現のために先にpDSY10で形質転換されたアスペルギ ルス 株の形質転換に発現プラスミドを用いる。ラッカーゼプラスミドpDSY10はTA KAプロモーター及びAMG ターミネーターと共にポリポルス・ピンシトウスPoly porus pinsitus )からのシグナル配列を含む全長のラッカーゼcDNA遺伝子を含む 。amdS又はpyrGのいずれかの選択マーカーを含む更なるプラスミドを形質転換に 加える。 形質転換のために、500mlYEG+1Mスクロース培地に株の 100μlの分生子の 懸濁液を接腫して形質転換して37℃で一晩インキュベートする。その培地をマッ トから除去し、500μlOM(1.2M MgSo4 ml)を加える。その真菌のマットを数回その混合物をピペッティングすることに より粉砕する。そのプレートを90rpm にセットされた34℃シェーカー内におく。 プロトプラスト形成を約1時間で完了する。そのプロトプラスト混合物をエッペ ンドルフチューブ内に入れ、1ml STCを加えて混合する。その混合物を6000rpm で8分、セントリフェージ内で回転させる。その上清を注ぎ出し、1mlのSTC(0 .8Mソルビトール、50mM Tris pH8,50mM CaCl2)を加えて混合する。その混合 物を5分間、3000rpm で回転させた後、その手順をくり返す。そのプロトプラス トを収集して2〜5×107プロトプラスト/mlの濃度でSTC 内に再懸濁する。 プロトプラスト懸濁液100μlを10μlのSTC 中の適切なDNA 5〜10μgと混 合する。1mlのPTC(40% PEG4000,50mM Tris pH8, 50mM CeCl2)を加えて全体を混合する。その混合物を20分間、室温でインキュベ ートする。次にプロトプラストを形質転換に用いられる選択マーカーのための適 切な培地を含む寒天プレート上にプレートする。 形質転換体をラッカーゼの増加された産生のために最初にスクリーニングする 。これは、ABTS寒天プレート(アスペルギルス最小培地中1%グルコース、1μ m ABTS)上に形質転換体をプレートし、未形質転換の親株のそれを超える増加し た緑の輪の大きさを捜すことにより行う。次により大きい輪のこれらの形質転換 体をABTSアッセイによりラッカーゼの産生についてアッセイする(1mlブイヨン サンプルを 100mM酢酸緩衝液 pH5.0中で1mM ABTS で1分間、アッセイする。ア ッセイの結果は、ml当りの分当りの 418nmにおける吸光度の変化として記録され る)。ラッカーゼの上位から4つの産生体からのDNA を単離し、EcoRIで消化し 、SRP54 及びOliCコーディング配列の両方でのプロービングによるサザン分析に かける。OliC(アスペルギルス内の単一コピー遺伝子)とハイブリダイズするOl iCプローブにより作られたシグナルと比較したSRP54 へのSRP54 プローブのハイ ブリダイゼーションにより作られるシグナルの定量は、各々の形質転換体中のSR P54 の遺伝子コピー数を表す。 生物材料の寄託 以下の生物材料を、Agricultural Research・Service Patent Culture Collec tion,Northern Regional Research Center,1815 University Street,Peoria ,Illinois,61604 にブタベスト条約下で寄託し、次の受託番号を得た。
【手続補正書】特許法第184条の8 【提出日】1996年11月13日 【補正内容】 請求の範囲 1.(a)図2又は図3に示されるアミノ酸配列を有するSRP の蛋白質サブユ ニットをコードする核酸配列; (b)(i)図3に示される核酸配列、(ii)その相補的な鎖、又は(iii) (i)又は(ii)の部分的配列と、高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイ ズすることができるSRP の蛋白質サブユニットをコードする核酸; (c)高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズすることができる図2又 は図3に記載されるアミノ酸配列をコードする核酸配列の相同配列 からなる群から選択される糸状菌シグナル認識粒子(SRP)をコートする核酸配 列を含む核酸構成物。 2.前乱SRP がSRP54 であることを特徴とする請求項1に記載の構成物。 3.前記SRP がアスペルギルス(Aspergillus)SRP であることを特徴とする請 求項1に記載の構成物。 4.前記SRP がアスペルギルス・ニゲル(Aspergillus niger)SRP であること を特徴とする請求項1に記載の構成物。 5.前記核酸配列が、図2に示されるアミノ酸配列と少くとも60%の同一性を 有する蛋白質をコードすることを特徴とする請求項1に記載の構成物。 6.前記核酸配列が、図3に示されるアミノ酸配列と少くとも60%の同一性を 有する蛋白質をコードすることを特徴とする請求項1に記載の構成物。 7.請求項1に記載の核酸構成物を含む組換えベクター。 8.SRP の要素をコードする配列の1超の複製を含むことを特徴 とする請求項7に記載のベクター。 9.前記SRP がSRP54 であることを特徴とする請求項8に記載のベクター。 10.前記SRP がアスペルギルスSRP であることを特徴とする請求項8に記載の ベクター。 11.前記SRP がアスペルギルス・ニゲルSRP であることを特徴とする請求項8 に記載のベクター。 12.請求項1に記載の核酸構成物を含む組換え宿主細胞。 13.前記SRP をコードする配列の1超の複製を含むことを特徴とする請求項12 に記載の細胞。 14.関心の異種蛋白質をコードする核酸配列を更に含むことを特徴とする請求 項12に記載の細胞。 15.糸状菌細胞であることを特徴とする請求項12に記載の細胞。 16.アスペルギルス細胞であることを特徴とする請求項15に記載の細胞。 17.蛋白質の組換え体産生のための方法であって、前記蛋白質の発現に資する 条件下で、同じ条件下で培養された野生型細胞より多い量の糸状菌分秘成分を産 生する宿主細胞を培養するステップであって、該宿主細胞が請求項1に記載の核 酸配列も含むステップと、その培養物から前記蛋白質を回収するステップと、を 含むことを特徴とする方法。 18.前記宿主細胞が糸状菌シグナル認識粒子(SRP)の要素をコードする核酸配 列を含む核酸構成物を含むことを特徴とする請求項17に記載の方法。 19.前記宿主細胞が、前記SRP の要素をコードする核酸配列の1超の複製を含 むことを特徴とする請求項18に記載の方法。 20.前記宿主細胞がSRP54 をコードする核酸配列を含む構成物を 含むことを特徴とする請求項17に記載の方法。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 EP(AT,BE,CH,DE, DK,ES,FR,GB,GR,IE,IT,LU,M C,NL,PT,SE),OA(BF,BJ,CF,CG ,CI,CM,GA,GN,ML,MR,NE,SN, TD,TG),AP(KE,MW,SD,SZ,UG), AM,AU,BB,BG,BR,BY,CA,CN,C Z,EE,FI,GE,HU,IS,JP,KG,KP ,KR,KZ,LK,LR,LT,LV,MD,MG, MK,MN,MX,NO,NZ,PL,RO,RU,S G,SI,SK,TJ,TM,TT,UA,UZ,VN

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 1.糸状菌シグナル認識粒子(SRP)の1以上の要素をコードする核酸配列を含 む核酸構成物。 2.前記要素がSRP の蛋白質サブユニットであることを特徴とする請求項1に 記載の構成物。 3.前記要素が 7SRNAであることを特徴とする請求項1に記載の構成物。 4.前記SRP がSRP54 であることを特徴とする請求項1に記載の構成物。 5.前記SRP がアスペルギルス(Aspergillus)SRPであることを特徴とする請 求項1に記載の構成物。 6.前記SRP がアスペルギルス・ニゲル(Aspergillus niger)SRPであること を特徴とする請求項1に記載の構成物。 7.前記核酸配列が、図2に示される核酸配列、又はそのコーディング領域、 又は図2に示されるアミノ酸配列と少くとも60%の同一性を有する蛋白質をコー ドする相同体であることを特徴とする請求項1に記載の構成物。 8.前記核酸配列が、図3に示される核酸配列、そのコーディング領域、又は 図3に示されるアミノ酸配列と少くとも60%の同一性を有する蛋白質をコードす る相同体であることを特徴とする請求項1に記載の構成物。 9.糸状菌シグナル認識粒子(SRP)の1以上の要素をコードする核酸配列を含 む核酸構成物を含む組換えベクター。 10.SRP の要素をコードする配列の1超の複製を含むことを特徴とする請求項 9に記載のベクター。 11.前記SRP がSRP54 であることを特徴とする請求項9に記載の ベクター。 12.前記SRP がアスペルギルスSRP であることを特徴とする請求項9に記載の ベクター。 13.前記SRP がアスペルギルス・ニゲルSRP であることを特徴とする請求項9 に記載のベクター。 14.糸状菌シグナル認識粒子(SRP)をコードする核酸配列を含む核酸構成物を 含む組換え宿主細胞。 15.前記SRP をコードする配列の1超の複製を含むことを特徴とする請求項14 に記載の細胞。 16.関心の異種蛋白質をコードする核酸配列を更に含むことを特徴とする請求 項14に記載の細胞。 17.糸状菌細胞であることを特徴とする請求項14に記載の細胞。 18.アスペルギルス細胞であることを特徴とする請求項17に記載の細胞。 19.蛋白質の組換え体産生のための方法であって、前記蛋白質の発現に資する 条件下で、同じ条件下で培養された野生型細胞より多い量の糸状菌分泌成分を産 生する宿主細胞を培養するステップであって、該宿主細胞が前記蛋白質をコード する核酸配列も含むステップと、その培養物から前記蛋白質を回収するステップ と、を含むことを特徴とする方法。 20.前記宿主細胞が糸状菌シグナル認識粒子(SRP)の要素をコードする核酸配 列を含む核酸構成物を含むことを特徴とする請求項19に記載の方法。 21.前記宿主細胞が、前記SRP の要素をコードする核酸配列の1超の複製を含 むことを特徴とする請求項20に記載の方法。 22.前記宿主細胞がSRP54 をコードする核酸配列を含む構成物を含むことを特 徴とする請求項20に記載の方法。
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