JP2011101651A - オキサロ酢酸ヒドロラーゼ欠陥真菌宿主細胞 - Google Patents

Abstract

【課題】オキサロ酢酸産生の欠損した、それ故シュウ酸産生の欠損した細胞、例えば糸状菌細胞、特にＡ．ニガーの細胞の突然変異体の提供。
【解決手段】オキサロ酢酸ヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする単離された核酸。当該核酸配列を含んで成る核酸構築体、ベクター及び宿主、並びに当該ポリペプチドを生産するための組換方法。具体的には、オキサロ酢酸ヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする単離された核酸であって：（ａ）アミノ酸１〜３４１と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列をもつポリペプチドをコードする核酸；及び（ｂ）特定のポリヌクレオチドから構成されるポリヌクレオチド配列と少なくとも９０％の相同性を有する核酸；から成る群から選ばれる核酸。
【選択図】なし

Description

発明の分野
本発明はオキサロ酢酸ヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする単離された核酸配列に関連する。本発明は更に突然変異宿主細胞、詳しくはオキサロ酢酸ヒドロラーゼ活性の欠損した、それ故シュウ酸産生能力の欠損した真菌突然変異宿主細胞、例えばアスペルギルス属の細胞に関連する。本発明は更にかかる突然変異細胞の所望の化合物、例えばポリペプチド、主要及び副次代謝物の生産のための利用、並びに本発明の突然変異細胞内でかかる化合物を生産するための方法に関連する。本発明は更に上記核酸配列を含んで成る核酸構築体、ベクター及び宿主、並びにオキサロ酢酸ヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドを生産するための組換方法に関連する。

関連技術の説明
糸状菌は様々な注目の化合物、例えば注目の真菌により通常産生される相同化合物、例えば主要又は副次代謝物及びポリペプチド、又は異種化合物、例えば注目の真菌の中に導入された外来ＤＮＡによりコードされる異種ポリペプチドの商業的生産のために幅広く利用されている。かかる産物は注目の真菌の発酵及びその発酵物から得られる所望の産物の収獲により生産される。

真菌の種、Ａ．ニガーは所望の化合物、例えばクエン酸及び工業用酵素の商業的生産のために幅広く利用されている。この種は大量のシュウ酸を産生することでよく知られている。多くの理由のため、この種を注目の化合物の商業的生産のために用いるとき、シュウ酸の産生は所望されない。例えば、シュウ酸の産生は大量の炭素を要し、従って所望の化合物の生産のためにだけ必要とされるものと比べ、余分で高価な炭素源を発酵培地に添加しなければならない。発酵ブロス内でのシュウ酸の存在は注目の産物の回収が関与する下流処理において問題を引き起こし、なぜならシュウ酸は回収を妨害するカルシウムとの沈殿物を形成してしまうからである。また、シュウ酸は毒性の化合物であり、このことはその存在が、Ａ．ニガーからの食品級製品の生産における著しい問題となることを意味する。

Ａ．ニガーにおけるシュウ酸の生合成のための経路について２通りの可能性のルートが提唱されている。第一のルートはオキサロ酢酸塩＋水→シュウ酸＋酢酸塩であり、その反応はオキサロ酢酸ヒドロラーゼにより触媒される（Ｋｕｂｉｃｅｋ，Ｃ．Ｐ．，Ｇ． ＳｃｈｒｅｆｅｒＬ−Ｋｕｎａｒ，Ｗ．Ｗｏｈｒｅｒ ａｎｄ Ｍ．Ｒｏｈｒ（１９８８）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５４，６３３−６３７）。第二のルートはグリコキシル酸経路が関与する（Ｂａｌｍｆｏｒｔｈ，Ａ．Ｊ．，Ａ．Ｔｈｏｍｓｏｎ（１９８４）：Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２１８ １１３−１１８）。

商業的Ａ．ニガー発酵の際のシュウ酸の生成の制御は、発酵を低ｐＨで実施することにより試みられており、その場合ほんのわずかなシュウ酸しか生成されない。しかしながら、低ｐＨでの発酵は望ましくないことがあり、なぜなら通常このｐＨはＡ．ニガーの増殖及び所望の発酵産物の収量にとって最適でないからである。

Ａ．ニガー由来の部分精製されたオキサロ酢酸ヒドロラーゼが発表されているが（Ｌｅｎｚら、ＰａｒｔｉａＬ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｏｍｅ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｏｘａｌｏａｃｅｔａｔｅ ｆｒｏｍ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ，１９７６，Ｅｎｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６５：２２５−２３６）、この酵素をコードする遺伝子は発表されていない。

本発明の目的は、オキサロ酢酸産生の欠損した、それ故シュウ酸産生の欠損した細胞、例えば糸状菌細胞、特にＡ．ニガーの細胞の突然変異体の提供にある。

本発明は、オキサロ酢酸ヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする単離された核酸配列であって：
（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のオキサロ酢酸ヒドロラーゼのアミノ酸配列と少なくとも６５％の同一性を有するアミノ酸配列をもつポリペプチドをコードする核酸配列；
（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のＤＮＡ配列のコード部分（ヌクレオチド１１５７〜１４１１、１５０４〜１６５１及び１７６４〜２３８３から構成）と少なくとも６５％の相同性を有する核酸配列；
（ｃ）中ストリンジェンシー条件下で（ｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の核酸配列、（ｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のｃＤＮＡ配列、（ｉｉｉ）少なくとも１００ヌクレオチドの（ｉ）もしくは（ｉｉ）のサブ配列、又は（ｉｖ）（ｉ）、（ｉｉ）もしくは（ｉｉｉ）の相補鎖とハイブリダイズする核酸配列；
（ｄ）（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のアレル変異体；及び
（ｅ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）のサブ配列、ここで当該サブ配列はオキサロ酢酸ヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドフラグメントをコードするものである；
から成る群から選ばれる核酸配列に関連する。

更なる重要な観点において、本発明は突然変異細胞を生産するための方法であって、本発明の核酸配列又はそのコントロール配列を中断又は欠失させ、もとの細胞よりも少ない量のオキサロ酢酸ヒドロラーゼを産生する突然変異体を生み出すことを含んで成る方法に関連する。本発明の方法はこの方法により生産された突然変異体にも関連する。

本発明は更に上記核酸配列を含んで成る核酸構築体、ベクター及び宿主細胞、並びに上記ポリペプチドを生産するための組換方法に関連する。

実施例４に記載のプラスミドｐＨＰ３の構築を示す。 実施例４に記載のプラスミドｐＨＰ３の構築を示す。

オキサロ酢酸ヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする単離された核酸配列
「オキサロ酢酸ヒドロラーゼ活性」とは、本明細書では
オキサロ酢酸塩＋水→シュウ酸＋酢酸塩
の反応を触媒する活性と定義する。この酵素はＥＣ３．７．１．１に属するものとして分類される。本発明の目的のため、オキサロ酢酸ヒドロラーゼ活性は以降の材料と方法の章に記載の手順に従って決定される。１単位のオキサロ酢酸ヒドロラーゼ活性は３０℃、ｐＨ７．５において１分当り１．０μモルのシュウ酸の産生と定義する。

本明細書において用いる「単離された核酸配列」とは、他の核酸配列を本質的に含まない核酸配列、例えばアガロース電気泳動による決定に従い、少なくとも約２０％の純度、好ましくは少なくとも約４０％の純度、より好ましくは少なくとも約６０％の純度、更により好ましくは少なくとも約８０％の純度、そして最も好ましくは少なくとも約９０％の純度のものを意味する。例えば、単離された核酸配列は、その核酸配列をその天然の位置からそれが再生されるであろう別の部位へと移動させる遺伝子操作において利用される標準のクローニング手順により獲得できうる。クローニング手順は当該ポリペプチドをコードする核酸配列を含んで成る所望の核酸フラグメントの切除及び単離、このフラグメントのベクター分子への挿入、そしてこの組換ベクターの宿主細胞への組込みを包含し得、その宿主細胞で当該核酸配列の複数のコピー又はクローンが複製されるようになる。この核酸配列はゲノム、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、半合成、合成起源、又は任意のそれらの組合せのものであってよい。

第一の態様において、本発明はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のアミノ酸１〜３４１（即ち、成熟ポリペプチド）と少なくとも約６５％、好ましくは少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも８０％、更により好ましくは少なくとも約９０％、最も好ましくは少なくとも約９５％、そして更に最も好ましくは少なくとも約９７％の同一性を有するアミノ酸配列をもち、且つオキサロ酢酸ヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする単離された核酸配列に関連する（以降、「相同性ポリペプチド」）。好適な態様において、この相同性ポリペプチドはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のアミノ酸１〜３４１とは５個のアミノ酸、好ましくは４個のアミノ酸、より好ましくは３個のアミノ酸、更により好ましくは２個のアミノ酸、そして最も好ましくは１個のアミノ酸で相違する。本発明の目的のため、２本のアミノ酸配列間での同一性の度合いはＬＡＳＥＲＧＥＮＥ^TMＭＥＧＡＬＩＧＮ^TMソフトウェア（ＤＮＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｌ）を用いるＣｌｕｓｔａＬ法（Ｈｉｇｇｉｎｓ，１９８９，ＣＡＢＩＯＳ ５：１５１−１５３）で、アイデンティティーテーブル及び下記のマルチプルアラインメントパラメーターを利用して決定する：１０のギャップペナルティー及び１０のギャップ長ペナルティー。対合アラインメントパラメーターはＫｔｕｐｌｅ＝１、ギャップペナルティー＝３、ウィンドウ＝５及びダイアゴナル＝５。

好ましくは、本発明の核酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のアミノ酸配列又はそのアレル変異体を含んで成る又はそれから成るポリペプチド、あるいはオキサロ酢酸ヒドロラーゼ活性を有するそのフラグメントをコードする。

本発明はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸配列であって、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１とは遺伝子コードの縮重の観点で相違するものも包含する。本発明は更にオキサロ酢酸ヒドロラーゼ活性を有するＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のフラグメントをコードする、又は微生物細胞内でのオキサロ酢酸ヒドロラーゼ遺伝子の不活化に利用するのに十分な長さのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のサブ配列にも関連する（「オキサロ酢酸ヒドロラーゼ活性の除去又は抑制」の章に記載）。

ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のサブ配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に包含される核酸配列であるが、但し５’及び／又は３’末端から１又は複数個のヌクレオチドが欠失しているものである。好ましくは、サブ配列は少なくとも２８００個のヌクレオチド、より好ましくは少なくとも３０００個のヌクレオチド、そして最も好ましくは少なくとも３２００個のヌクレオチドを含む。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のフラグメントはこのアミノ酸配列のアミノ及び／又はカルボキシ粒物から１又は複数個のアミノ酸が欠失したポリペプチドである。好ましくは、フラグメントは少なくとも２７０個のアミノ酸残基、より好ましくは少なくとも３００個のアミノ酸残基、そして最も好ましくは少なくとも３２０個のアミノ酸残基を含む。

アレル変異体とは、同一の染色体座を占めている遺伝子の２以上の択一的な形態のいずれかを意味する。アレル変異体は突然変異を通じて自然に発生し、そして集団内での多形態をもたらしうる。遺伝子の突然変異はサイレント（コードポリペプチドに変化なし）であるか、又は改変されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードしうる。ポリペプチドのアレル変異体は遺伝子のアレル変異体によりコードされるポリペプチドをいう。

相同性ポリペプチドのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のアミノ酸配列からは、１もしくは複数個のアミノ酸残基の挿入もしくは欠失、及び／又は１もしくは複数個のアミノ酸残基の別のアミノ酸残基による置換により、相違しうる。好ましくは、アミノ酸変化はささいなもの、即ち、タンパク質のフォルディング及び／又は活性に有意な影響を及ぼさない保存性アミノ酸置換；小さな欠失（典型的には１〜約３０個のアミノ酸）；小さなアミノ又はカルボキシル末端の伸長（例えば、アミノ末端メチオニン残基）；約２０〜２５残基までの小リンカーペプチド；又は正味の電荷もしくはその他の機能を変えることにより精製を助長する小さな伸長（例えばポリヒスチジントラクト、抗原エピトーブ又は結合ドメイン）である。

保存性置換の例は、塩基性アミノ酸（例えば、アルギニン、リジン及びヒスチジン）、酸性アミノ酸（例えばグルタミン酸及びアスパラギン酸）、極性アミノ酸（例えばグルタミン及びアスパラギン）、疎水性アミノ酸（例えばロイシン、イソロイシン及びバリン）、芳香族アミノ酸（例えばフェニルアラニン、トリプトファン及びチロシン）、並びに小アミノ酸（例えばグリシン、アラニン、セリン、トレオニン及びメチオニン）の群内のものである。比活性を概して改変しないアミノ酸置換は当業界において公知であり、そしてＨ．Ｎｅｕｒａｔｈ ａｎｄ Ｒ．Ｌ．Ｈｉｌｌ，１９７９，Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋに記載されている。最もよくある交換はＡｌａ／Ｓｅｒ，Ｖａｌ／Ｉｌｅ，Ａｓｐ／Ｇｌｕ，Ｔｈｒ／Ｓｅｒ，Ａｌａ／Ｇｌｙ，Ａｌａ／Ｔｈｒ，Ｓｅｒ／Ａｓｎ，Ａｌａ／Ｖａｌ，Ｓｅｒ／Ｇｌｙ，Ｔｙｒ／Ｐｈｅ，Ａｌａ／Ｐｒｏ，Ｌｙｓ／Ａｒｇ，Ａｓｐ／Ａｓｎ，Ｌｅｕ／Ｉｌｅ，Ｌｅｕ／Ｖａｌ，Ａｌａ／Ｇｌｕ及びＡｓｐ／Ｇｌｙ、並びにそれらの逆である。

第二の態様において、本発明はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の成熟ポリペプチドコード配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のヌクレオチド１１５７−１４１１，１５０４−１６５１及び１７６４−２３８３から構成）と少なくとも約６５％、好ましくは約７０％、好ましくは約８０％、より好ましくは約９０％、更により好ましくは約９５％、そして最も好ましくは約９７％の相同性の度合いを有し、活性ポリペプチドをコードする、又は微生物細胞内でのオキサロ酢酸ヒドロラーゼ遺伝子の不活化に利用するのに十分な長さを有する単離された核酸配列（「オキサロ酢酸ヒドロラーゼ活性の除去又は抑制」の章に記載）；又はオキサロ酢酸ヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドフラグメントをコードする又は微生物内でのオキサロ酢酸ヒドロラーゼの不活化に利用するのに十分な長さのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアレル変異体及びサブ配列（「オキサロ酢酸ヒドロラーゼ活性の除去及び抑制」の章に記載）に関連する。本発明の目的のため、２本の核酸間の相同性の度合いはＦａｓｔａプログラムパッケージ（Ｖｅｒｓｉｏｎ Ｖ２０ｕ６）中のコンピュータープログラムＡｌｉｇｎにより、ヌクレオチド配列対比のための下記の設定によりＧＡＰを用いて決定する：−１６のＧＡＰにおけるＧＡＰ構築ペナルティー（第一残基について）及びー４のＧＡＰ伸長（他の残基について）ペナルティー。ＡｌｉｇｎはＥ．Ｍｙｅｒｓ ａｎｄ Ｗ．Ｍｉｌｌｅｒ由来のプログラムの若干改良されたバージョンである。アルゴリズムはＥ．Ｍｙｅｒｓ ａｎｄ Ｗ．Ｍｉｌｌｅｒ「ＯｐｔｉｍａＬ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ ｉｎ Ｌｉｎｅａｒ Ｓｐａｃｅ」（ＣＡＢＩＯＳ（１９８８）４：１１−１７）に記載されている。

第三の態様において、本発明は（ｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の核酸配列、（ｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のｃＤＮＡ配列、（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）のサブ配列、又は（ｉｖ）（ｉ）、（ｉｉ）もしくは（ｉｉｉ）の相補鎖のサブ配列と中ストリンジェンシー条件下、より好ましくは中高ストリンジェンシー条件下、更により好ましくは高ストリンジェンシー条件下、そして最も好ましくは超高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする核酸プローブと同一条件下でオキサロ酢酸ヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする単離された核酸配列に関連する（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ ａｎｄ Ｔ．Ｍａｎｉａｔｕｓ，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ＭａｎｕａＬ，第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のサブ配列は少なくとも１００ヌクレオチド、又はより好ましくは少なくとも２００ヌクレオチドであってよい。更に、このサブ配列はオキサロ酢酸ヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドフラグメントをコードしうる。

ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の核酸配列又はそのサブ配列、並びにＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のアミノ酸配列又はそのフラグメントは、当業界周知の方法に従って別の属又は種の株からオキサロ酢酸ヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを同定及びクローニングするための核酸プローブのデザインに利用されうる。詳しくは、かかるプローブは対応の遺伝子の同定及び単離のため、標準のサザンプロット手順に従い、注目の属又は種のゲノム又はｃＤＮＡとのハイブリダイゼーションのために利用されうる。かかるプローブは配列全体よりは相当に短くてよいが、長さは少なくとも１５、好ましくは少なくとも２５、そしてより好ましくは少なくとも３５ヌクレオチドであるべきである。より長めのプローブを利用してもよい。ＤＮＡ及びＲＮＡプローブの双方が使用できる。これらのプローブは典型的には対応の遺伝子の検出のためにラベル化しておく（例えば、³²Ｐ，³Ｈ，³⁵Ｓ、ビオチン又はアビジンで）。かかるプローブは本発明により包含される。

従って、かかるその他の生物から調製したゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡライブラリーは、上記のプローブとハイブリダイズし、且つオキサロ酢酸ヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡについてスクリーニングされうる。かかるその他の生物に由来するゲノム又はその他のＤＮＡはアガロースもしくはポリアクリルアミドゲル電気泳動、又はその他の分離技術により分離されうる。ライブラリー由来のＤＮＡ又は分離したＤＮＡはニトロセルロース又はその他の担体材料に転写して固定することができる。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１又はそのサブ配列と相同性であるクローン又はＤＮＡを同定するため、この担体材料をサザンブロットに使用する。本発明の目的のため、ハイブリダイゼーションとは当該核酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示す核酸配列、その相補鎖又はそのサブ配列に対応する核酸プローブと、超低乃至超高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズすることを示す。これらの条件下で核酸プローブがハイブリダイズする分子はＸ線フィルムを用いて検出する。

好適な態様において、この核酸プローブはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のポリペプチドをコードする核酸配列又はそのサブ配列である。別の好適な態様において、この核酸プローブはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１である。別の好適な態様において、この核酸プローブはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のアミノ酸残基１２３−２０５から成るフラグメント又はこのフラグメントの一部をコードするヌクレオチドである。別の好適な態様において、この核酸プローブは大腸菌株ＤＳＭ−１２６６０の中に収容されたプラスミドｐＨＰ１の中に含まれている核酸配列であり、ここでこの核酸配列はオキサロ酢酸ヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードし、特にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の成熟ポリペプチドコード領域である。

長さが少なくとも１００ヌクレオチドの長いプローブの場合、超低乃至超高ストリンジェンシー条件は４２℃にて、５×ＳＳＰＥ、０．３％のＳＤＳ、２００μｇ／ｍｌの剪断変性サケ精子ＤＮＡ、並びに超低及び低ストリンジェンシーでは２５％のホルムアミド、中及び中高ストリンジェンシーでは３５％のホルムアミド、又は高及び超高ストリンジェンシーでは５０％のホルムアミドの中でのプレハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーション、それに続くサザンブロット手順と定義する。

長さ少なくとも１００ヌクレオチドの長いプローブの場合、担体材料を最後に３回、１５分づつ、２×ＳＳＣ、０．２％のＳＤＳを用いて、好ましくは少なくとも４５℃（超低ストリンジェンシー）、より好ましくは少なくとも５０℃（低ストリンジェンシー）、より好ましくは少なくとも５５℃（中ストリンジェンシー）、より好ましくは少なくとも６０℃（中高ストリンジェンシー）、更により好ましくは少なくとも６５℃（高ストリンジェンシー）、そして最も好ましくは少なくとも７０℃（超高ストリンジェンシー）にて洗浄する。

長さが約１５ヌクレオチド乃至約７０ヌクレオチドである短いプロブの場合、ストリンジェンシー条件は、標準のサザンブロット手順に従い、ｍｌ当り０．９ＭのＮａＣｌ、０．０９ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．６、６ｍＭのＥＤＴＡ、０．５％のＮＰ−４０、１ＸのＤｅｎｈａｒｄｔ溶液、１ｍＭのピロリン酸ナトリウム、１ｍＭの一リン酸ナトリウム、０．１ｍＭのＡＴＰ及び０．２ｍｇの酵母エキスＲＮＡ中でのＢｏｌｔｏｎ ａｎｄ ＭｃＣａｒｔｈｙ（１９６２，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ ＮａｔｉｏｎａＬ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ＵＳＡ ４８：１３９０）に従う計算を利用してもとめたＴｍより５℃〜１０℃低い温度でのプレハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーション及び洗浄後ハイブリダイゼーションと定義する。

長さが約１５ヌクレオチド乃至約７０ヌクレオチドの短めのプローブの場合、担体材料を６ＸのＳＳＣ＋０．１％のＳＤＳの中で１５分間１回、そして６ＸのＳＳＣを用いて１５分づつ２回、もとめたＴｍより５℃〜１０℃低い温度で洗浄する。

本発明は更に、（ａ）ＤＮＡを中、中高、高又は超高ストリンジェシー条件下でＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の配列、もしくはその相補鎖、又はそれらのサブ配列とハイブリダイズさせ；そして（ｂ）核酸配列を単離することにより；生産された単離された核酸配列に関連する。このサブ配列は好ましくは少なくとも１００ヌクレオチドの配列、例えばオキサロ酢酸ヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする配列、又は微生物細胞内でのオキサロ酢酸ヒドロラーゼ遺伝子の不活化に利用するために十分に長い配列である（「オキサロ酢酸ヒドロラーゼ活性の除去又は抑制」の章に記載）。

本発明の単離された核酸配列によりコードされるポリペプチドはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の成熟ポリペプチドの少なくとも２０％、好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも６０％、更により好ましくは少なくとも８０％、更により好ましくは少なくとも９０％、そして最も好ましくは少なくとも１００％のオキサロ酢酸ヒドロラーゼ活性を有する。

本発明の核酸配列は任意の属の微生物から獲得できうる。本発明の目的のため、一定の起源との関係で本明細書で用いる「から獲得した」とは、当該核酸配列によりコードされるポリペプチドがその起源により産生されたか、又はその起源に由来する核酸配列が挿入された細胞により産生されたことを意味しうる。

当該核酸配列は微生物起源から獲得できうる。例えば、これらのポリペプチドはグラム陽性菌、例えばバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）株、例えばＢａｃｉｌｌｕｓ ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｕｔｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｅｎｔｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ又はＢａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ；又はストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）株、例えばＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ又はＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｍｕｒｉｎｕｓ；又はグラム陰性菌、例えば大腸菌又はシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種から獲得できうる。

好適な態様において、この核酸配列は真菌細胞から獲得できる。本明細書でいう「真菌」はＡｓｃｏｍｙｃｏｔａ、Ｂｕｓｉｄｉｏｍｙｃｏｔａ、Ｃｈｙｔｒｉｄｉｏｍｙｃｏｔａ及びＺｙｇｏｍｙｃｏｔａの間（Ｈａｗｋｓｗｏｒｔｈら、Ａｉｎｓｗｏｒｔｈ ａｎｄ Ｂｉｓｂｙ’ｓ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｔｈｅ Ｆｕｎｇｉ，第８版 １９９５，ＣＡＢ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫに規定）並びにＯｏｍｙｃｏｔａ（Ｈａｗｋｓｗｏｒｔｈら、１９９５、前掲、ｐｐ．１７１）並びに全ての分裂胞子（ｍｉｔｏｓｐｏｒｉｃ）真菌（Ｈａｗｋｓｗｏｒｔｈら、１９９５、前掲）を含む。

より好適な態様において、真菌細胞は酵母細胞である。本明細書でいう酵母とは、子嚢胞子酵母（Ｅｎｄｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ）、担子胞子酵母、及び不完全菌類に属する酵母（Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｔｅｓ）を含む。酵母の分類は将来にわたって変わりうるため、本発明の目的のため、酵母はＢｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ Ｙｅａｓｔ （Ｓｋｉｎｎｅｒ，Ｆ．Ａ．，Ｐａｓｓｍｏｒｅ，Ｓ．Ｍ．，ａｎｄ Ｄａｖｅｎｐｏｒｔ，Ｒ．Ｒ．，ｅｄｓ，Ｓｏｃ．Ａｐｐ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｓｅｒｉｅｓ Ｎｏ．９，１９８０）に記載の定義に従う。

より詳しくは、この核酸配列は酵母株、例えば、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｉｃｈｉａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、又はＹａｒｒｏｗｉａ株；又はより好ましくは糸状菌株、例えばＡｃｒｅｍｏｎｉｕｍ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｆｉｌｉｂａｓｉｄｉｕｍ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ、Ｈｕｍｉｃｏｌａ、Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ、Ｍｕｃｏｒ、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ、Ｎｅｏｃａｌｌｉｍａｓｔｉｘ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ、Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ、Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ、Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ、Ｔｈｉｅｌａｖｉａ、Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ又はＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ株から獲得できうる。

好適な態様において、この核酸配列はＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｄｏｕｇｌａｓｉｉ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｋｌｕｙｖｅｒｉ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｎｏｒｂｅｎｓｉｓ又はＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｏｖｉｆｏｒｍｉｓ株から獲得される。

別の好適な態様において、この核酸配列はＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｃｕｌｅａｔｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｗａｍｏｒｉ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｏｅｔｉｄｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｊａｐｏｎｉｃｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｂａｃｔｒｉｄｉｏｉｄｅｓ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｃｅｒｅａｌｉｓ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｃｒｏｏｋｗｅｌｌｅｎｓｅ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｃｕｌｍｏｒｕｍ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｇｒａｍｉｎｕｍ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｈｅｔｅｒｏｓｐｏｒｕｍ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｎｅｇｕｎｄｉ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｒｅｔｉｃｕｌａｔｕｍ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｒｏｓｅｕｍ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓａｍｂｕｃｉｎｕｍ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓａｒｃｏｃｈｒｏｕｍ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｉｏｉｄｅｓ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｕｌｐｈｕｒｅｕｍ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｔｏｒｕｌｏｓｕｍ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｔｒｉｃｈｏｔｈｅｃｉｏｉｄｅｓ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｖｅｎｅｎａｔｕｍ、Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｉｎｓｏｌｅｎｓ、Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ、Ｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｐｕｒｐｕｒｏｇｅｎｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｈａｒｚｉａｎｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｋｏｎｉｎｇｉｉ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ又はＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｖｉｒｉｄｅ株から獲得される。

より好適な態様において、この核酸配列はアスペルギルス・ニガー、そして最も好ましくはＡ．ニガー株ＢＯ１ ＤＳＭ １２６６５から獲得され、例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示す核酸配列である。別のより好適な態様において、この核酸配列は大腸菌株ＤＳＭ−１２６６０の中に収容されたプラスミドｐＨＰ１に含まれる配列である。別の好適な態様において、この核酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の成熟ポリペプチドをコードする、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のヌクレオチド１１５７−１４１１、１５０４−１６５１及び１７６４−２３８３から構成されるヌクレオチド配列である。

上記の種に関し、本発明は完全及び不完全な状態の双方、並びにその他の異名均等物、例えばその種名が知られていようと関係なくアナモルフを包含するものと解されるべきであろう。当業者は適当な均等物の種類を容易に認定できるであろう。例えば、このポリペプチドは、種名が知られていようと関係なく、Ｂｅｎｎ ａｎｄ Ｋｌｉｃｈ（Ｂｅｎｎ Ｊ．Ｗ ａｎｄ Ｍ．Ａ．Ｋｌｉｃｈ（１９９２）Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ，Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ−Ｈｅｉｎｅｍａｎｎ，ＵＳＡ）による定義に従いアスペルギルス・ニガーの異名均等物、例えばＡ．ａｃｕｌｅａｔｕｓ、Ａ．ａｗａｍｏｒｉ、Ａ．ｃａｒｂｏｎｉａｒｕｓ、Ａ．ｅｌｌｉｐｔｉｃｕｓ、Ａ．ｆｉｃｕｕｍ、Ａ．ｆｏｅｔｉｄｕｓ、Ａ．ｈｅｔｅｒｏｍｏｒｐｈｕｓ、Ａ．ｊａｐｏｎｉｃｕｓ、Ａ．ｐｈｏｅｎｉｃｉｓ、Ａ．ｐｕｌｖｅｒｕｌｅｎｔｕｓ、Ａ．ｔｕｂｉｎｇｅｎｓｉｓ、Ａ．ｈｅｌｉｃｏｔｈｒｉｘ、Ａ．ａｔｒｏｖｉｏｌａｃｅｕｓ、Ａ．ｃｉｔｒｉｃｕｓ、Ａ．ａｃｉｄｉｃｕｓ又はＡ．ｆｏｎｓｅｃａｅｕｓである微生物から獲得できうる。

これらの種の株は数多くの培養物寄託機関、例えばＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ （ＡＴＣＣ）、Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨ （ＤＳＭ）、Ｃｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ Ｖｏｏｒ Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ （ＣＢＳ）及びＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ Ｐａｔｅｎｔ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｒｅｇｉｏｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ （ＮＲＲＬ）で公共的に容易に入手できる。

更に、かかる核酸配列はその他の起源、例えば上記のプローブを用いて自然（例えば、土壌、堆肥、水、等）から単離した微生物から同定及び獲得できうる。自然環境から微生物を単離する技術は当業界周知である。

当該核酸配列はその他の微生物のゲノム又はｃＤＮＡライブラリーの同様のスクリーニングによりかくして誘導できうる。ポリペプチドをコードする核酸配列がプローブで検出できたなら、その配列を当業者が公知の技術を利用して単離又はクローニングすることができうる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９、前掲）。

ポリペプチドをコードする核酸配列を単離又はクローニングするのに用いる技術は当業界において公知であり、そしてゲノムＤＮＡからの単離、ｃＤＮＡからの調製又はそれらの組合せが挙げられる。かかるゲノムＤＮＡからの本発明の核酸配列のクローニングは、例えば周知のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）又は共有の構造特性を有するクローニングされたＤＮＡフラグメントを検出するための発現ライブラリーの抗体スクリーニングによって行うことができる。例えば、Ｉｎｎｉｓら、１９９０，ＰＣＲ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ参照のこと。ＰＣＲの場合、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のアミノ酸１２３−２０５をコードするヌクレオチド配列に広がる一連のプライヤーを利用することが特に関係しうる。その他の核酸増幅手順、例えばリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、ライゲーション活性化転写（ＬＡＴ）及び核酸配列系増幅（ＮＡＳＢＡ）が利用されうる。核酸配列はアスペルギルスの株、又はその他のもしくは近縁の生物からクローンでき、そして例えば当該核酸配列のポリペプチドコード領域のアレル又は種変異体であってよい。

本発明の核酸配列の修飾は当該ポリペプチドに実質的に類似するポリペプチドの合成のために必要でありうる。当該ポリペプチドに「実質的に類似する」とは、ポリペプチドの非天然形態を意味する。このようなポリペプチドは天然起源から単離したポリペプチドとは若干操作された態様で相違することがあり、例えば変異体は比活性、熱安定性、至適ｐＨ、等で相違する。この変異配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のポリペプチドコード部分、例えばそのサブ配列として示す核酸配列に基づいて構築されたものでよく、及び／又は当該核酸配列によりコードされるポリペプチドとは異なるアミノ酸配列は供しないが、当該酵素を生産させるつもりの宿主生物のコドン用法に対応するヌクレオチド置換の導入により、又は異なるアミノ酸配列を供しうるヌクレオチド置換の導入により構築されうる。ヌクレオチド置換の一般的な説明については、例えばＦｏｒｄら、１９９１，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ２：９５−１０７を参照のこと。

かかる置換は、分子の機能にとって重要な領域外にあり、且つ活性ポリペプチドを未だもたらすように施してよいことが当業者に明らかであろう。本発明の単離された核酸配列によりコードされるポリペプチドの活性に必須であり、それ故置換を施すことが好ましくないアミノ酸残基は、当業界公知の手順、例えば部位特異的突然変異誘発又はアラニン走査突然変異誘発に従って同定されうる（例えば、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ ａｎｄ Ｗｅｌｌｓ，１９８９，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４；１０８１−１０８５参照のこと）。後者の技術では、突然変異を分子内の全ての正に帯電した残基に導入し、そして得られる突然変異分子をオキサロ酢酸ヒドロラーゼ活性について試験し、この分子の活性に重要なアミノ酸残基を同定する。基質酵素相互作用の部位は核磁気共鳴解析、結晶学又は光親和性ラベリングの如き技術による決定に従い、三次元構造の解析によって決定することもできる（例えば、ｄｅ Ｖｏｓら、１９９２，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５５：３０６−３１２；Ｓｍｉｔｈら、１９９２，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２２４：８９９−９０４；Ｗｌｏｄａｖｅｒら、１９９２，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ３０９：５９−６４を参照のこと）。

突然変異核酸配列を生産するための方法 本発明は更に突然変異核酸配列を生産するための方法であって、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の成熟ポリペプチドコード配列又はそのサブ配列の中に少なくとも一の突然変異を導入することを含んで成り、ここでこの突然変異核酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のアミノ酸１〜３４１から成るポリペプチド又はオキサロ酢酸ヒドロラーゼ活性を有するそのフラグメントをコードする。

一のヌクレオチドを別のヌクレオチドで変換するための当該核酸配列への突然変異の導入は当業界公知の任意の方法を利用する部位特異的突然変異誘発により達成される。特に有用なのは、注目のインサートと所望の突然変異を含む２本の合成プライマーによるスーパーコイル二本鎖ＤＮＡベクターを利用する手順である。各々ベクターの対立鎖に相補性であるオリゴヌクレオチドプライマーはＰｆｕＤＮＡポリメラーゼにより温度サイクリングの間に伸長する。プライマーの合体により、ゆらぎニックを含む突然変異プラスミドができ上がる。温度サイクリングを経て、この産物をメチル化及びヘミメチル化ＤＮＡに特異的なＤｐｎＩで処理して親ＤＮＡ鋳型を消化し、突然変異含有合成ＤＮＡを選別する。その他の当業界公知の技術も利用してよい。

オキサロ酢酸ヒドロラーゼ活性の除去又は抑制 本発明は親細胞から突然変異した細胞を生産するための方法にも関連し、この方法は本発明の核酸配列又はそのコントロール配列を中断又は欠失させ、同一条件で培養したときに親細胞よりも少ない量の当該核酸によりコードされるオキサロ酢酸ヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドを産生する、それ故少ない量のシュウ酸を産生する突然変異細胞を得ることを含んで成る。

オキサロ酢酸ヒドロラーゼ活性及びシュウ酸産生能の低まった株の構築は、細胞内のオキサロ酢酸ヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドの発現に必要な核酸配列の修飾又は不活化により簡単に達成されうる。修飾又は不活化すべき核酸配列は、例えば当該ポリペプチド又はオキサロ酢酸ヒドロラーゼ活性を発揮するのに必須なその一部をコードする核酸配列、例えば「オキサロ酢酸活性を有するポリペプチドをコードする単離された核酸配列」の章に記載の本発明の核酸配列であってよく、又は当該核酸配列はそのコード配列からのポリペプチドの発現のために必要な調節機能を有するものであってよい。かかる調節又はコントロール配列の例は、プロモーター配列又はその機能性部分、即ち、ポリペプチドの発現を及ぼすのに十分な部分であってよい。考えられる修飾のためのその他のコントロール配列をこの章の中で更に説明する。

当該核酸配列の修飾又は不活化は、細胞を突然変異誘発にかけ、そしてオキサロ酢酸ヒドロラーゼ産生能力の低下した細胞を選別又はスクリーニングすることにより実施できうる。特異的又はランダムでもよいこの突然変異誘発は、例えば適当な物理又は化学突然誘発因子の利用により、適当なオリゴヌクレオチドの利用により、又はこのＤＮＡ配列をＰＣＲ系突然変異誘発にかけることにより実施してよい。更に、この突然変異誘発はこれらの突然変異誘発因子の任意の組合せを利用することにより実施してよい。

本目的のために適当な物理又は化学突然変異誘発因子の例には紫外線（ＵＶ）照射、ヒドロキシルアミン、Ｎ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＭＮＮＧ）、Ｏ−メチルヒドロキシルアミン、亜硝酸、エチルメタンスルホネート（ＥＭＳ）、亜硫酸水素ナトリウム、ギ酸及びヌクレオチド類似体が挙げられる。

かかる因子を使用する場合、その突然変異誘発は典型的には突然変異すべき細胞を選定の突然変異誘発因子の存在下で適当な条件下でインキュベーションし、そして低下したオキサロ酢酸ヒドロラーゼ活性又は生産能を発揮する細胞を選定することにより実施される。オキサロ酢酸ヒドロラーゼ活性の低下又は消失は以降の実施例に記載のアッセイの利用により決定されうる。

本発明の核酸配列によりコードされるポリペプチドの生産の修飾又は不活性化は、当該ポリペプチドをコードする核酸配列又はその転写もしくは翻訳のために必要な調節要素内の１又は複数のヌクレオチドの導入、置換又は除去により達成されうる。例えば、ヌクレオチドは、停止コドンの導入、開始コドンの除去、又はオープンリーディングフレームの改変をもたらすように挿入又は除去してよい。かかる修飾又は不活化は当業界公知の方法に従って部位特異的突然変異誘発又はＰＣＲ系突然変異誘発により成し遂げることができうる。原理的には、この修飾はｉｎ ｖｉｖｏで、即ち、修飾すべき核酸配列を発現する細胞に対して直接実施してよいが、修飾は下記に例示の通りｉｎ ｖｉｔｒｏで行うのが好ましい。

選定の宿主細胞による生産能の消失又は抑制を行う好都合な方法の例は遺伝子置換又は遺伝子中断の技術を基礎とする。例えば、遺伝子中断技術では、注目の内因性遺伝子又は遺伝子フラグメントに対応する核酸をｉｎ ｖｉｔｒｏで突然変異させて欠陥核酸配列を作り、それを宿主細胞に形質転換させて欠陥遺伝子を産生させる。相同性組換によると、欠陥核酸配列を内因性遺伝子又は遺伝子フラグメントと置き換えている。欠陥遺伝子又は遺伝子フラグメントは当該ポリペプチドをコードする遺伝子が修飾又は破壊されている形質転換体の選別のために利用されうるマーカーもコードするが所望されうる。

他方、核酸配列の修飾又は不活化はポリペプチドコード配列に相補性のヌクレオチド配列を用いる確立されたアンチーセンス技術により実施してよい。より詳しくは、細胞によるポリペプチドの産生は、細胞の中で転写され得、且つ細胞により産生されるポリペプチドｍＲＮＡにハイブリダイズすることのできる当該ポリペプチドをコードする核酸配列に相補性なヌクレオチド配列を導入することにより抑制又は消失されうる。相補性アンチセンスヌクレオチド配列がポリペプチドｍＲＮＡにハイブリダイズすることを可能にする条件下で、翻訳されるポリペプチドの量はかくして抑制又は消失する。

本発明の方法に従って修飾する細胞は微生物起源のもの、特にオキサロ酢酸ヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする本発明の核酸配列についての起源として「オキサロ酢酸ヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする単離された核酸配列」の章で上記した種のいずれかである。好ましくは、この細胞は、それに対して相同又は異種のいずれかの所望の産物、例えばポリペプチド又は主要もしくは副次代謝物の産生に適する真菌株である。更により好ましくは、この細胞はアスペルギルス、特にＡ．ニガーの細胞である。

本発明は更に当該ポリペプチドをコードする核酸配列又はそのコントロール配列の中断又は欠失を含んで成る親細胞の突然変異細胞に関連し、ここでこの中断又は欠失は親細胞よりも少ない量のポリペプチドを産生する突然変異細胞をもたらすものである。

このようにして構築したこのポリペプチド欠陥突然変異細胞は相同及び／又は異種発現産物、例えば相同又は異種ポリペプチド又は主要もしくは副次代謝物の発現のための宿主細胞として特に有用である。従って、本発明は更に相同又は異種産物を産生するための方法であって、（ａ）当該突然変異細胞を当該産物の産生を誘導する条件下で培養し、そして（ｂ）この産物を回収することを含んで成る方法に関する。

注目の産物の培養及び精製のために利用する方法は当業者に周知方法、例えば下記の「生産方法」の章に記載の通りにして実施できうる。

本質的にシュウ酸を含まない産物を生産するための本発明の方法は、主要代謝物、特に食品級クエン酸及びその他のクレブス回路酸、並びに相同又は異種ポリペプチド、特に真核生物ポリペプチドの生産において特に注目される。

このポリペプチドは突然変異細胞にとって相同又は異種の任意のポリペプチドであってよい。「ポリペプチド」とは、ここでは特定の長さのコード産物を意味するものではなく、それ故ペプチド、オリゴペプチド及びタンパク質を包含する。「異種」ペプチドとはここではこの突然変異細胞にとって天然ではないポリペプチド（又は天然配列を改変するように修飾の施されたタンパク質、又は組換ＤＮＡ技術による突然変異細胞の操作の結果として発現が定量的に改変された天然タンパク質）をいう。この突然変異細胞は相同又は異種ポリペプチドをコードする核酸配列の１又は複数のコピーを含んでよい。好適な態様において、この異種ポリペプチドは細胞外分泌ポリペプチドである。

好ましくは、生産すべきポリペプチドはホルモン、ホルモン変異体、レセプターもしくはその一部、抗体もしくはその一部、又はリポーターである。この酵素は例えばデンプン分解酵素、脂肪分解酵素、タンパク質分解酵素、セルロース分解酵素、酵化還元酵素又は植物細胞壁分解酵素から選択され得る。そのような酵素の例は、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、アミログルコシダーゼ、カルボヒドラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、クチナーゼ、シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エステラーゼ、ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコシダーゼ、ハロペルオキシダーゼ、ヘミセルラーゼ、インペルターゼ、イソメラーゼ、ラッカーゼ、リガーゼ、リパーゼ、リアーゼ、マンノシダーゼ、オキシダーゼ、ペクチン分解酵素、ペルオキシダーゼ、フィターゼ、フェノールオキシダーゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、タンパク質分解酵素、リボヌクレアーゼ、トランスフェラーゼ、トランスグルタミナーゼ、又はキシラナーゼを包含する。このオキサロ酢酸ヒドロラーゼ欠損性細胞はまた、医薬的興味の異種タンパク質、たとえばホルモン、成長因子、受容体及び同様のものを発現するためにも使用され得る。

本発明の突然変異細胞、特に糸状菌突然変異細胞において発現されうる異種ポリペプチドをコードする核酸配列は任意の原核、真核生物又はその他の起源から獲得できうる。本発明の目的のため、一定の起源との関係で本明細書で用いる「から獲得」とは、当該ポリペプチドがその起源から産生される又は当該起源に由来する遺伝子の挿入された細胞により産生されることを意味する。

本発明の方法において、突然変異細胞、特に突然変異糸状菌細胞は、その細胞にとって天然（又は「相同」）であるポリペプチド又はその他の産物、例えば主要もしくは副次代謝物の組換生産のためにも利用できうる。

異種ポリペプチドをコードする核酸配列を単離又はクローニングするのに用いる技術は当業界において公知であり、そしてゲノムＤＮＡからの単離、ｃＤＮＡからの調製又はそれらの組合せが含まれる。かかるゲノムＤＮＡからの核酸配列のクローニングは例えば周知のポリメラーゼ連鎖反応を利用して行うことができる。例えば、Ｉｎｎｉｓら、１９９０，ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照のこと。このクローニング手順は当該ポリペプチドをコードする核酸配列を含んで成る所望の核酸フラグメントの切除及び単離、このフラグメントをベクター分子への挿入、並びにこの組換ベクターの突然変異細胞への組込みを含んで成り、その細胞で当該核酸配列の複数のコピー又はクローンが複製されうる。この核酸配列はゲノム、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、半合成、合成起源、又はそれらの組合せであってよい。

本発明の方法において、異種ポリペプチドは更に、別のポリペプチドが本発明のポリペプチド又はそのフラグメントのＮ末端又はＣ末端に融合した融合又はハイブリドポリペプチドを含む。融合ポリペプチドは一のポリペプチドをコードする核酸配列（又はその一部）を別のポリペプチドをコードする核酸配列（又はその一部）と融合させることにより作られる。融合ポリペプチドを生産するための技術は当業界において公知であり、そして例えばこれらのポリペプチドをコードするコード配列同志を、それらがイン・フレームとなり、且つ同一のプロモーター及びターミネーターのコントロール下でその融合ポリペプチドが発現されるようにライゲーションすることが挙げられる。ハイブリドポリペプチドは少なくとも２種のポリペプチドから獲得した部分又は完全ポリペプチド配列の組合せを含んで成り、ここでその１又は複数は突然変異細胞にとって異種のものであってよい。

注目の異種ポリペプチドをコードする単離された核酸配列はポリペプチドの発現を供するように様々な態様で操作されうる。発現はポリペプチドの生産に関与するあらゆる工程、例えば限定することなく、転写、後転写修飾、翻訳、後翻訳修飾及び分泌等が含まれるものと理解されるであろう。ベクターに挿入する前の核酸配列の操作は発現ベクターに依存して所望又は必須となりうる。クローニング方法を利用して核酸配列を修飾するための技術は当業界において周知である。

「核酸構築体」は、天然に存在する遺伝子から単離されるか、又は本来は天然に存在しない態様で組合され、そして並置される、核酸のセグメントを含むよう修飾されている、一本鎖又は二本鎖での核酸分子として本明細書においては定義される。用語、核酸構築体とは、その核酸構築体が本発明のコード配列の発現のために必要とされるすべてのコントロール配列を含む場合、用語、発現カセットと類似する。用語“コード配列”は、本明細書において定義される場合、コントロールｍＲＮＡ中に転写され、そして本発明のポリペプチドに翻訳される配列である。コード配列の境界は一般的に、ｍＲＮＡの５′−末端でのオープンリーディングフレームのすぐ上流にある翻訳開始コドンＡＴＧ及び３′−末端でのオープンリーディングフレームのすぐ下流にある翻訳終止コドンにより決定される。コード配列は、ゲノム、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、半合成、合成、組換又はその組合せを包含するが、但しそれらだけには限定されない。本明細書に記載の核酸構築体のコード配列はオキサロ酢酸ヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする本発明のヌクレオチド配列であってよく（「オキサロ酢酸ヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする単離された核酸配列」の章に定義）、それにおいてはこの核酸構築体は上記の章又は当該核酸配列の関与するその他の操作で規定するオキサロ酢酸ヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドの生産のために利用されうる。又は、このコード配列は本発明の突然変異細胞内で産生される異種ポリペプチドをコードするものであってよい。

用語、“コントロール配列”とは、異種ポリペプチドの発現のために必要であるか又は好都合であるすべての成分を包含するよう本明細書において定義される。個々のコントロール配列は、前記ポリペプチドをコードする核酸配列に対して生来のものであり、又は外来性であり得る。そのようなコントロール配列は、リーダー、ポリアデニル化配列、ペプチド配列、プロモーター、シグナル配列、及び転写ターミネーターを包含するが、但しそれらだけには限定されない。最少では、コントロール配列は、プロモーター、及び転写及び翻訳停止シグナルを包含する。コントロール配列は、異種ポリペプチドをコードする核酸配列のコード領域とのコントロール配列の連結を促進する特異的制限部位を導入するためのリンカーを供給され得る。用語、“作用可能的式に連結される”とは、コントロール配列が、異種ポリペプチドの生成を指令するよう ＤＮＡ配列のコード配列に対して一定の位置に適切に置かれている配置（ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ）として本明細書で定義される。

コントロール配列は、適切なプロモーター配列、すなわち核酸配列の発現のために細胞、特に糸状菌細胞により認識される核酸配列であり得る。プロモーター配列は、異種ポリペプチドの発現を仲介する転写コントロール配列を含む。プロモーターは、突然変異細胞等の細胞において転写活性を示すいずれかの核酸配列であり得、突然変異、切断された及びハイブリッドのプロモーターを包含し、そして細胞に対して相同であるか又は異種の細胞外又は細胞内ポリペプチドをコードする遺伝子から得られる。

糸状菌宿主おいて本発明の核酸構築体の転写を指令するための適切なプロモーターの例は、アスペルギルス・オリザ ＴＡＫＡ アミラーゼ、リゾムコル・ミエヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ）のアスパラギン酸プロティナーゼ、アスペルギルス・ニガーの中性α−アミラーゼ、アスペルギルス・ニガーの酸性安定性α−アミラーゼ、アスペルギルス・ニガー又はアスペルギルス・アワモリのグルコアミラーゼ（ｇｌａＡ）、リゾムコル・ミエヘイのリパーゼ、アスペルギルス・オリザのアルカリ プロテアーゼ、アスペルギルス・オリザのトリオース ホスフェート イソメラーゼ、アスペルギルス・ニジュランスのアセトアミダーゼ、アスペルギルス・オリザのアセトアミダーゼ（ａｍｄＳ）、フサリウム・オキシスポラムのトリプシン様プロテアーゼ（米国特許第 ４，２８８，６２７号に記載される）をコードする遺伝子から得られたプロモーター、及びその変異体、切断された及びハイブリッドプロモーターである。特に好ましいプロモーターは、ＴＡＫＡアミラーゼ、ＮＡ２−ｔｐｉ（アスペルギルス・ニガーの中性α−アミラーゼ及びアスペルギルス・オリザのトリオースホスフェート イソメラーゼをコードする遺伝子からのプロモーターのハイブリッド）、及びグルコアミラーゼプロモーターである。

コントロール配列はまた、適切な転写ターミネーター配列、すなわち転写を終止するために宿主細胞により認識される配列でもあり得る。ターミネーター配列は、異種ポリペプチドをコードする核酸配列の３’末端に作用可能式に連結される。宿主細胞において機能的であるいずれかのターミネーターが、本発明において使用され得る。

糸状菌宿主細胞のための好ましいターミネーターは、アスペルギルス・オリザの ＴＡＫＡ アミラーゼ、アスペルギルス・ニガーのグルコアミラーゼ、アスペルギルス・ニジュランスのアントラニレート シンターゼ、アスペルギルス・ニガーのα−グルコシダーゼ、及びフサリウム・オキシスポラムのトリプシン株プロテアーゼをコードする遺伝子から得られる。

コントロール配列はまた、適切なリーダー配列、すなわち細胞による翻訳のために重要であるｍＲＮＡの非翻訳領域であり得る。リーダー配列は、異種ポリペプチドをコードする核酸配列の５’末端に作用可能式に連結される。細胞において機能的であるいずれかのリーダー配列が、本発明において使用され得る。

糸状菌宿主細胞のための好ましいリーダーは、アスペルギルス・オリザの ＴＡＫＡ アミラーゼ及びアスペルギルス・ニジュランスのトリオース ホスフェート イソメラーゼをコードする遺伝子から得られる。

コントロール配列はまた、ポリアデニル化配列、すなわち核酸配列の３’末端に作用可能式に連結され、そして転写される場合、転写されたｍＲＮＡにポリアデノシン残基を付加するためにシグナルとして宿主細胞により認識される配列であり得る。細胞において機能的であるいずれかのポリアデニル化配列が、発明において使用され得る。

糸状菌宿主細胞のための好ましいポリアデニル化配列は、アスペルギルス・オリザの ＴＡＫＡ アミラーゼ、アスペルギルス・ニガーのグルコアミラーゼ、アスペルギルス・ニジュランスのアントラニレート シンターゼ、及びアスペルギルス・ニガーのα−グルコシダーゼをコードする遺伝子から得られる。

コントロール配列はまた、細胞分泌路中にコードされたポリペプチドを誘導することができるポリペプチドのアミノ末端に連結されるアミノ酸配列をコードする、シグナルペプチドコード領域でもあり得る。核酸配列のコード配列の５’末端は、分泌されたポリペプチドをコードするコード領域のセグメントにより翻訳読取り枠においｔを整合して天然において連結されるシグナルペプチドコード領域を本来含むことができる。他方では、コード配列の５’末端は、そのコード配列に対して外来性であるシグナルペプチドコード領域を含むことができる。外来性シグナルペプチドコード領域は、コード配列が通常、シグナルペプチドコード領域を含まない場合に必要とされる。他方では、外来性シグナルペプチドコード領域は、ポリペプチドの増強された分泌を得るために天然のシグナルペプチドコード領域を単純に置換することができる。シグナルペプチドコード領域は、アスペルギルス種からのグルコアミラーゼ又はアミラーゼ遺伝子、リゾムコール種からのリパーゼ又はプロティナーゼ遺伝子から得られる。しかしながら、細胞の分泌路中に発現されたポリペプチドを誘導するいずれかのシグナルペプチドコード領域が、本発明において使用され得る。

糸状菌宿主細胞のための効果的なシグナルペプチドコード領域は、アスペルギルス・オリザの ＴＡＫＡ アミラーゼ遺伝子、アスペルギルス・ニガーの中性アミラーゼ遺伝子、リゾムコール・ミエヘイのアスパラギン酸プロティナーゼ遺伝子及びヒュミコラ・ラヌギノサのセルラーゼ遺伝子から得られるシグナルペプチドコード領域である。

コントロール配列は、ポリペプチドのアミノ末端で位置するアミノ酸配列をコードするぺプチドコード領域でもあり得る。得られるポリペプチドは、プロ酵素又はプロポリペプチド（多くの場合、チモーゲン）として知られている。プロポリペプチドは一般的に不活性であり、そしてプロポリペプチドからのプロペプチドの触媒的又は自己触媒的分解により成熟した活性ポリペプチドに転換され得る。プロペプチドコード領域は、リゾムコール・ミエヘイプロテナーゼ及びマイセリオフソラ・サーモフィラのラッカーゼコード遺伝子（ＷＯ ９５／３３８３６）から得られる。

シグナルペプチド及びプロペプチドの双方がポリペプチドのアミノ末端にある場合、このプロペプチド領域はポリペプチドのアミノ末端の隣に位置し、そしてシグナルペプチド領域はプロペプチド領域のアミノ末端の隣に位置する。

本発明の核酸構築体はまた、ポリペプチドの発現を指令するために好都合である１又は複数の因子、たとえば転写活性化因子（たとえばトランス−作用因子）、カペロン（ｃｈａｐｅｒｏｎｅ）及びプロセッシング プロテアーゼをコードする１又は複数の核酸配列を含んで成る。選択の宿主細胞において機能するいずれかの因子が本発明において使用され得る。１又は複数のそれらの因子をコードする核酸は、異種ポリペプチドをコードする核酸配列と必ずしもタンデムで存在しない。

宿主細胞の増殖に関して異種ポリペプチドの発現の調節を可能にする調節配列を付加することがまた所望される。調節システムの例は、調節化合物の存在を包含する、化学的又は物理的剌激に応答して遺伝子の発現のターンオン又はターンオフを可能にするものである。糸状菌においては、ＴＡＫＡα−アミラーゼプロモーター、アスペルギルス・ニガーのグルコアミラーゼ プロモーター、及びアスペルギルス・オリザのグルコアミラーゼ プロモーターが、調節配列として使用される得る。調節配列の他の例は、遺伝子増幅を可能にするものである、重金属により増幅されるメタロチオネイン遺伝子を包含する。それらの場合、異種ポリペプチドをコードする核酸配列は、調節配列により作用可能式に連結される。

上記の種々の核酸及びコントロール配列は、異種ポリペプチドをコードする核酸配列の挿入又は置換を可能にするための１又は複数の便利な制限部位を含むことができる組換え発現ベクターを生成するために一緒に連結され得る。他方では、異種ポリペプチドをコードする核酸配列は、前記核酸配列、又は前記配列を含んで成る核酸構築体を、発現のための適切なベクター中に挿入することによって発現され得る。発現ベクターを創造する場合、前記コード配列は、そのコード配列が発現及びたぶん分泌のために適切なコントロール配列と作用可能式に連結されるよう、ベクターに位置する。

組換え発現ベクターは、組換え ＤＮＡ方法に簡単にゆだねられ得、そして核酸配列の発現をもらたすことができるいずれかのベクター（たとえばプラスミド又はウィルス）であり得る。ベクターの選択は典型的には、ベクターが導入されるべき細胞とベクターとの適合性に依存するであろう。ベクターは線状化された又は環状化された環状プラスミドであり得る。ベクターは、自主的に複製するベクター、すなわち染色体外実在物として存在するベクター（この複製は染色体複製に無関係である）、たとえばプラスミド、染色体外要素、ミニ染色体、又は人工染色体であり得る。ベクターは自己複製を確保するためのいずれかの手段を含むことができる。他方では、ベクターは、宿主細胞中に導入される場合、ゲノム中に組込まれ、そしてそれが組込まれている染色体と共に複製されるものであり得る。ベクターシステムは、宿主細胞のゲノム中に導入されるべき全体の ＤＮＡ、又はトランスポゾンを一緒に含む、単一のベクター又はプラスミド、又は複数のベクター又はプラスミドであり得る。

本発明のベクターは好ましくは、形質転換された細胞の容易な選択を可能にする１又は複数の選択マーカーを含む。選択マーカーは、殺生物性又は耐ウィルス性、重金属に対する耐性、原栄養体の独立栄養生物への変換、等を提供する遺伝子生成物である。糸状菌宿主細胞への使用のための選択マーカーは、ａｍｄＳ（アセトアミダーゼ）、ａｒｇＢ（オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ）、ｂａｒ（ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ）、ｈｙｇＢ（ヒグロマイシンホスホトランスフェラーゼ）、ｎｉａＤ（硝酸レダクターゼ）、ｐｙｒＧ（オロチジン−５’−リン酸デカルボキシラーゼ）、ｓＣ（硫酸アデニルトランスフェラーゼ）及びｔｒｐＣ（アントラニル酸シンターゼ）、並びにその同等物を包含する群から選択され得るが、但しこれらだけには限定されない。アスペルギルス・ニジュランス又はアスペルギルス・オリザのａｍｄＳ及びｐｙｒＧ遺伝子、及びストレプトマイセス・ヒグロスコピカスの ｂａｒ遺伝子が、アスペルギルス細胞への使用のために好ましい。

本発明のベクターは好ましくは、細胞ゲノム中へのベクターの安定した組込み、又は細胞のゲノムに無関係の細胞におけるベクターの自主的複製を可能にする要素を含む。

導入とは、核酸配列を含んでなるベクターを細胞に、そのベクターが染色体組み込み物又は自己複製式染色体外ベクターとして維持されるように導入することを意味する。組み込むが一般に有利と考えられ、なぜなら核酸配列は細胞内でより安定でありがちだからである。染色体へのベクターの組み込みは相同組換え、非相同組換え又はトランス転移により起こる。

発現ベクターの細胞への導入は、周知の態様に従うプロトプラストの形式、プロトプラストの形質転換及び細胞壁の再生から成る工程を包括する。アスペルギルスの形質転換のための適当な手法は、ヨーロッパ特許２３８０２３号及びＹｅｌｔｏｎなど．，１９８４，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ＵＳＡ ８ １：１４７０−１４７４に記載されている。フサリウム種を形質転換する適切な方法は、 Ｍａｌａｒｄｉｅｒなど．，１９８９，Ｇｅｎｅ ７８：１４７−１５６、又はＷＯ９６／００７８７に記載される。

本発明のベクターは、細胞ゲノム中に導入される場合、宿主細胞ゲノム中に組込まれ得る。組込みのためには、ベクターは、異種ペプチドをコードする核酸配列、又は相同又は非相同組換えによるゲノム中へのベクターの安定した組込みのためのベクターのいずれか他の要素に依存することができる。他方では、ベクターは、細胞のゲノム中への相同組換えによる組込みを指令するための追加の核酸配列を含むことができる。その追加の核酸配列は、染色体中の正確な位置での宿主細胞ゲノム中へのベクターの組込みを可能にする。正確な位置での組込みの傾向を高めるためには、組込み要素は好ましくは、十分な数の核酸、たとえば１００〜１，５００個の塩基対、好ましくは４００〜１，５００個の塩基対、及び最とも好ましくは８００〜１，５００個の塩基対を含むべきであり、ここでそれらの要素は相同組換えの確立を高めるためにその対応する標的配列とひじょうに相同性である。その組込み要素は、宿主細胞のゲノムにおける標的配列と相同であるいずれかの配列であり得る。さらに、組込み要素は、非コード又はコード核酸配列であり得る。他方では、ベクターは、非相同組換えにより宿主細胞のゲノム中に組込まれ得る。

自主複製のためには、ベクターはさらに、問題の宿主細胞においてベクターの自主的な複製を可能にする複製起点を含んで成る。

本発明の方法は当該突然変異細胞を獲得するための特定の順序に限定されない。オキサロ酢酸ヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドの生産に関与する遺伝子の修飾は、異種ポリペプチドの生産のための細胞の構築における任意の段階において親細胞の中に導入することができうる。細胞は異種ポリペプチドをコードする遺伝子の導入の前に本発明の方法を利用してオキサロ酢酸ヒドロラーゼ欠陥に既にされていることが好ましい。

組換発現ベクターを構築するために本明細書に記載の要素をライゲーションするために用いる手順は当業者に周知である（例えば、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ，ａｎｄ Ｔ．Ｍａｎｉａｔｕｓ，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ参照のこと）。

本発明はまた、オキサロ酢酸ヒドロラーゼ欠陥突然変異細胞、特に糸状菌突然変異細胞を獲得するための方法であって、（ａ）親細胞、特に親糸状菌細胞にオキサロ酢酸ヒドロラーゼの産生に関与する遺伝子の少なくとも一つの修飾を含んで成る第一核酸配列及び異種ポリペプチドをコードする第二核酸配列を導入し；そして（ｂ）同一条件下で培養したときに親細胞よりも少ない量のオキサロ酢酸ヒドロラーゼを産生するこの修飾核酸配列を含んで成る工程（ａ）由来の突然変異体を同定することを含んで成る方法に関連する。

本発明はまた、異種ポリペプチドを産生するための細胞、特に糸状菌細胞のオキサロ酢酸ヒドロラーゼ突然変異体に関連し、ここでこの細胞はオキサロ酢酸ヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドの産生に関与する遺伝子の少なくとも一の修飾を含んで成る第一核酸配列及び異種ポリペプチドをコードする第二核酸配列を含んで成り、ここで当該突然変異体は同一条件下で培養したときにその親細胞よりも少ない量のオキサロ酢酸ヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドを産生するものである。

本発明の別の観点において、この突然変異細胞は更に所望の産物、例えば注目の異種ポリペプチドの産生、回収及び／又は用途にとって有害でありうるタンパク質をコードする１又は複数の核酸配列の修飾を含みうる。この修飾は１又は複数の第三の核酸配列の発現を抑制又は消失させ、同一条件下で培養したときにこの第三の核酸配列が修飾されていない突然変異細胞よりも多い量の異種ポリペプチドを産生しうる修飾第三核酸配列を有する突然変異細胞をもたらす。この第三の核酸配列は任意のタンパク質又は酵素をコードしうる。例えば、この酵素はアミノペプチダーゼ、アミラーゼ、カルアミヒドラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、クチナーゼ、シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エステラーゼ、アルファ−ガラクトシダーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、アルファ−グルコシダーゼ、ベータ−グルコシダーゼ、インベルターゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、マンノシダーゼ、ムタナーゼ、オキシダーゼ、ペクチン分解酵素、ペルオキシダーゼ、ホスホリパーゼ、フィターゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、タンパク質分解酵素、リボヌクレアーゼ、トランスグルタミナーゼ及びキシラナーゼであってよい。この第三の核酸配列は好ましくはタンパク質分解酵素、例えばアミノペプチダーゼ、カルボキシペプチダーゼ、又はプロテアーゼをコードする。

更なる観点において、本発明は本発明の方法により産生されるオキサロ酢酸ヒドロラーゼ活性を本質的に有さないタンパク質産物に関連する。

本発明は更に、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の核酸配列、そのサブ配列又はその相同体（「オキサロ酢酸ヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする単離された核酸配列」の章に記載）を含む、当該配列の発現のための核酸構築体、組換発現ベクター及び宿主細胞に関連する。この構築体及びベクターは本明細書に記載の通りにして構築できうる。この宿主細胞は核酸配列の発現のために適当な任意の細胞、特に本発明の核酸配列の起源として「オキサロ酢酸ヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする単離された核酸配列」の章に記載の任意の細胞であってよい。特に、宿主細胞は糸状菌細胞、例えばアスペルギルスの細胞、例えばＡ．ニガー又はＡ．オリザ、又はフサリウムの細胞である。

真菌細胞は、プロトプラスト形成、そのプロトプラストによる形質転換、及びそれ自体既知である態様での細胞壁の再生を含有する方法により形質転換され得る。アスペルギルス宿主細胞の形質転換のための適切な方法は、ヨーロッパ特許２３８０２３号及びＹｅｌｔｏｎなど．，１９８４，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ＵＳＡ ８ １：１４７０−１４７４に記載されている。フサリウム種を形質転換する適切な方法は、Ｍａｌａｒｄｉｅｒなど．，１９８９，Ｇｅｎｅ ７８：１４７−１５６、又はＷＯ９６／００７８７に記載される。酵母は、Ｂｅｃｋｅｒ ａｎｄ Ｇｕａｒｅｎｔｅ，Ａｂｅｌｓｏｎ，Ｊ．Ｎ．ａｎｄ Ｓｉｍｏｎ，Ｍ．Ｉ．，ｅｄｉｔｏｒｓ，Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏ１ｕｍｅ １９４，ｐｐ１８２−１８７，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｉｔｏなど．，１９８３，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ １５３：１６３；及びＨｉｎｎｅｎなど．，１９７８，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ＵＳＡ ７５：１９２０により記載される方法を用いて形質転換され得る。

生成方法
本発明はまた、（ａ）本発明のヌクレオチド配列を保有する宿主細胞を当該ポリペプチドの生産を誘導する条件下で培養し；そして（ｂ）前記ポリペプチドを回収することを含んで成る、本発明のヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドを生産するための方法にも関する。

本発明はまた、（ａ）宿主細胞を、当該ポリペプチドの生産を誘導する条件下で培養し、ここで当該宿主はＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：１の成熟ポリペプチドコード領域内に少なくとも一の突然変異を有する突然変異核酸配列を含んでなり、ここで当該突然変異核酸配列はＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：２のアミノ酸１〜３４１から成るポリペプチドをコードし；そして（ｂ）前記ポリペプチドを回収することを含んで成る、本発明のポリペプチドを生産するための方法にも関する。

本発明の生産方法において、細胞は、当業界において知られている方法を用いて、ポリペプチドの生成のために適切な栄養培地において培養される。たとえば、細胞は、適切な培地において、及びポリペプチドの発現及び／又は単離を可能にする条件下で行なわれる実験室用又は産業用発酵器において、振盪フラスコ培養、小規模又は大規模発酵（連続、バッチ、供給−バッチ、又は固体状態発酵を包含する）により培養され得る。培養は、当業界において知られている方法を用いて、炭素及び窒素源、及び無機塩を含んで成る適切な栄養培地において行なわれる（たとえば、細菌及び酵母についての参考文献；Ｂｅｎｎｅｔｔ，Ｊ．Ｗ．ａｎｄ ＬａＳｕｒｅ，Ｌ．，ｅｄｉｔｏｒｓ，Ｍｏｒｅ Ｇｅｎｅ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｆｕｎｇｉ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，ＣＡ，１９９１を参照のこと）。適切な培地は、商業的供給者から入手でき、又は公開された組成（たとえば、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎのカタログにおける）に従って調製され得る。ポリペプチドが栄養培地中に分泌される場合、ポリペプチドは培地から直接的に回収され得る。ポリペプチドが分泌されない場合、それは細胞溶解物から回収される。

ポリペプチドは、そのポリペプチドに対して特異的である、当業界において知られている方法を用いて検出され得る。それらの検出方法は、特異的抗体の使用、酵素生成物の形成、又は酵素基質の消出を包含する。たとえば、酵素アッセイは、ポリペプチドの活性を決定するために使用され得る。

得られるポリペプチドは、当業界において知られている方法により回収され得る。たとえば、ポリペプチドは、従来の方法、たとえば遠心分離、濾過、抽出、噴霧−乾燥、蒸発又は沈殿（但し、それらだけには限定されない）により栄養培地から回収され得る。

得られるポリペプチドは、当業界において知られている種々の方法、たとえばクロマトグラフィー（たとえば、イオン交換、アフィニティー、疎水性、クロマトフォーカシング、及びサイズ排除）、電気泳動法（たとえば分離用等電点電気泳動）（ＩＥＦ）、示差溶解性（たとえば硫酸アンモニウム沈殿）、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、又は抽出（たとえば、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｊ．−Ｃ．Ｊａｎｓｏｎ ａｎｄ Ｌａｒｓ Ｒｙｄｅｎ，ｅｄｉｔｏｒｓ，ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９を参照のこと）（但し、それらだけには限定されない）により精製され得る。

用途
本発明は更にオキサロ酢酸ヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドを利用する方法に関連する。

本発明のポリペプチドは診断用酵素として、例えば食品又はその他の製品におけるシュウ酸の検出のために利用されうる。

本発明のヌクレオチド配列は細胞、例えばヒドロラーゼを通常産生する微生物細胞によるオキサロ酢酸ヒドロラーゼ、それ故シュウ酸の生産の改変のために利用されうる。特に、このヌクレオチド配列は注目の細胞のオキサロ酢酸ヒドロラーゼ、それ故シュウ酸の生産能を抑制又は消失させるために利用されうる。

本発明を以下の非限定的な実施例で更に詳しく説明する。

実施例
緩衝剤及び基質として用いた化学品は少なくとも同薬級の商品とした。

株：
アスペルギルス・ニガーＢＯ１（ＤＳＭ １２６６５）
大腸菌ＤＨ５αＤ．Ｍ．Ｗｏｏｄｃｏｃｋら、（１９８９）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１７，３４６９−３４７８

培地及びアッセイ
バッファーＡ：５０ｍＭのトリス／ＨＣｌ ｐＨ７．５，２ｍＭのＭｎＣｌ₂，２０ｍＭのＤＴＴ，５％のスクロース

オキサロ酢酸ヒドロラーゼ活性アッセイ：１０００ｍｌの０．１ＭのＭＯＰＳ、ｐＨ７．５、２ｍＭのＭｎＣｌ₂ ２５ｍｌの４０ｍＭのオキサロ酢酸塩、５〜１００ｍｌのサンプル。吸収は２５５ｎｍで測定した。活性は吸収の低下速度及びオキサロ酢酸塩の吸収係数からもとめた（１．１ｍＭ−１ｃｍ−１，Ｌｅｎｚら、Ｐａｒｔｉａｌ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｏｍｅ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｏｘａｌａｃｅｔａｓｅ ｆｒｏｍ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ．１９７６，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６５：２５５−２３６）。アッセイは３０℃で実施した。

タンパク質アッセイ：タンパク質濃度はＢｉｏＲａｄ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ）ｃａｔ．Ｎｏ．５００−０００６を用い、製造者の仕様書に従い、且つ標準品として牛血清アルブミンを用いて測定した。

実施例１
オキサロ酢酸ヒドロラーゼの精製（ＥＣ ３．７．１．１）
アスペルギルス・ニガーＢＯ１を振濁フラスコの中で、３０℃にて、以下の培地の中で発酵させた：スクロース２０ｇ／Ｌ，ＮａＮＯ₃ １５ｇＬ，ＫＨ₂ＰＯ₄ １．５ｇ／Ｌ，ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ １ｇ／Ｌ，ＮａＣｌ １ｇ／Ｌ，ＣａＣｌ₂・２Ｈ₂Ｏ ０．１ｇ／Ｌ，微量溶液０．５ｍｌ／Ｌ。微量溶液：ＺｎＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ １４．３ｇ／Ｌ，ＣｕＳＯ₄・５Ｈ₂Ｏ ２．５ｇ／Ｌ，ＮｉＣｌ₂・６Ｈ₂Ｏ ０．５ｇ／Ｌ，ＦｅＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ １３．８ｇ／Ｌ，ＭｎＣｌ₂ ６ｇ／Ｌ。ｐＨは約０．５ｇ／Ｌのバイオマス濃度が達成されるまで２．５とした。次いでｐＨを２ＭのＮａＯＨの添加により６にシフトさせ、そして細胞をバイオマス濃度が約５ｇ／Ｌに達するまで増殖させた。細胞を濾過により集め、０．９％（Ｗ／Ｖ）のＮａＣｌで洗い、そして液体窒素の中で凍結させた。凍結細胞を乳鉢の中で液体窒素を伴って破壊し、次いでバッファーＡに懸濁した。その懸濁物を遠心分離し（１５ｍｉｎ、４０，０００ｇ、４℃）、そしてその上清液を単離した。硫酸アンモニウムを４５％飽和となるまで加え（２７７ｇ／Ｌ）、そして形成された懸濁物を遠心分離し（１５ｍｉｎ、４０，０００ｇ、４℃）、そしてその上清液は廃棄した。そのパレットをバッファーＡに溶解し、そして０．４５μｍのフィルターで濾過した。

硫酸アンモニウムをサンプルに５０ｍＳ／ｃｍの導電率となるまで加えた。次にそのサンプルをバッファーＡに溶解した０．５ｍの硫酸アンモニウムで平衡にしたＰｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｕｐｐｓａｌａ）に、その製造者の仕様書に従って載せた。このカラムを同バッファーで洗い、次いでバッファーＡに溶解した０．５ｍの硫酸アンモニウムから純粋なバッファーＡに至る線形塩勾配を用いて溶出させた。

オキサロ酢酸ヒドロラーゼ活性を有する画分をプールした。この溶液を２ｍＭのＭｎＣｌ₂、２０ｍＭのＤＴＴ、５％のスクロースで４ｍＳ／ｃｍの導電率にまで希釈し、次いでバッファーＡで平衡にしたＱ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｕｐｐｓａｌａ）に載せた。このカラムをバッファーＡで洗い、次いでバッファーＡと溶解した０Ｍから０．５Ｍに至るＮａＣｌの線形塩勾配を用いて溶出させた。オキサロ酢酸ヒドロラーゼ活性を有する画分をプールした。

これらのサンプルを１０ｍＭのＮａＨ₂ＰＯ₄ ｐＨ７．２、０．１ｍＭのＭｎＣｌ₂、５％のスクロース、１０ｍＭのＤＴＴで平衡にしておいたＰＤ−１０カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｕｐｐｓａｌａ）に載せ、そして同バッファーで溶出させた。そのサンプルを１０ｍＭのＮａＨ₂ＰＯ₄ ｐＨ７．２、０．１ｍＭのＭｎＣｌ₂、５％のスクロース、１０ｍＭのＤＴＴで平衡にしたＥｃｏｎｏ−Ｐａｃ ＨＴＰカラムに載せた。そのカラムを１０ｍＭのＮａＨ₂ＰＯ₄ ｐＨ６．８、０．１ｍＭのＭｎＣｌ₂、５％のスクロース、１０ｍＭのＤＴＴで洗い、次いで１０ｍＭのＮａＨ₂ＰＯ₄ ｐＨ６．８、０．１ｍＭのＭｎＣｌ₂、５％のスクロース、１０ｍＭのＤＴＴから４００ｍＭのＮａＨ₂ＰＯ₄ ｐＨ６．８、０．１ｍＭのＭｎＣｌ₂、５％のスクロース、１０ｍＭのＤＴＴに至る線形勾配で溶出させた。オキサロ酢酸ヒドロラーゼ活性を有するサンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥのために用いた。

実施例２
オキサロ酢酸ヒドロラーゼの画分のタンパク質配列の決定
実施例１の精製オキサロ酢酸ヒドロラーゼを標準の方法を利用して１２．５％のゲル上でのＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動にかけた（Ｌａｅｍｍｌｉ，Ｕ．Ｋ．１９７０．Ｃｌｅａｖａｇｅ ｏｆ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｄｕｒｉｎｇ ｔｈｅ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｏｆ ｔｈｅ ｈｅａｄ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ Ｔ４．Ｎａｔｕｒｅ．２２７：６８０−６８５）。タンパク質をエレクトロブロッティングによりＰＶＤＦ膜にブロットし、そしてその膜をクマジ−ブリリアントブルーＲ−２５０により、Ｐｌｏｕｇｈら（Ｐｌｏｕｇｈ Ｍ，Ｊｅｎｓｅｎ ＡＬ ａｎｄ Ｂａｒｋｈｏｌｔ Ｖ．１９８９：Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ，１８１：３３−３９）に記載の通りにして染色した。３８〜４０ｋＤの見かけ上の分子量の範囲内の４本のタンパク質バンドを切り出し、そしてＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ−Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ，ＵＳＡ由来のＰｒｏｃｉｓｅ−４９４タンパク質シーケンサーを用い、その製造者の仕様書に従ってアミノ末端配列決定した。以下の配列が得られた。

実施例３
オキサロ酢酸ヒドロラーゼをコードする遺伝子のクローニング
実施例２で決定されたタンパク質配列をデーターベースサーチのために用い、そしてアスペルギルス・ニガーＥＳＴ配列が回収できた（ＥＭＢＬ，Ｔ８２７５２，ＡＮ７５２）。このＥＳＴは実施例２由来の４本の配列と１００％の同一性をもってアライニングできるタンパク質配列をコードする。このＥＳＴ配列を下記のＰＣＲプライマーのデザインのために用いた。

これらのプライマーをＬｅａｃｈら（Ｊ．Ｌｅａｃｈ，Ｄ．Ｂ．Ｆｉｎｋｅｌｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｊ．Ａ．Ｒａｍｂｏｓｅｋ（１９８６）Ｆｕｎｇａｌｇｅｎｔ．ｎｅｗｓｌ．，３３，３２−３３）に本質的に記載の通りにして、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ（Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ，ＵＳＡ）由来のａｍｐｌｉｔａｑ ｔａｑポリメラーゼを用いてその製造者の仕様に従い調製したＡ．ニガーＢＯ１からＤＮＡを増幅するために用いた。ＰＣＲ反応はＭＪ ＰＣＴ １５０キャピラリーＰＣＲサイクラー（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｗａｔｅｒｔｏｗｎ，ＭＡ，ＵＳＡ）の中で、１０μｌの容量において、９４℃で１０秒の変性温度、５５℃で１０秒のアニーリング温度及び７２℃で３０秒の伸長温度のサイクルを３０回運転して、変性温度からアニーリング温度に至る温度勾配を−０．５℃／秒として、行った。

得られる２１９ｂｐのフラグメントをｐＣＲＩＩベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）の中に、その製造者の仕様書に従ってライゲーションし、そして大腸菌ＤＨ５αにＳａｍｂｒｏｏｋ（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）に記載の通りにして形質転換させた。予測のサイズのインサートを含むクローンを次のプライマーを用いて配列決定した。

ＤＮＡ配列分析はＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３７７ ＤＮＡシーケンサーをＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ，ＵＳＡ）と共に、その製造者の推奨に従って用いることで行った。その配列はフラグメントが所望の配列であることを確証した。

制限地図はＳａｍｂｒｏｏｋらのプロトコールに従い、プローブとして２１９ｂｐのインサートを用いるサザンブロット分析により確立した。この制限地図から、この遺伝子は５ｋｂのＢｇＬＩＩフラグメント上にあると考えられた。

次にこの遺伝子を逆ＰＣＲによりクローニングした。Ａ．ニガーＢＯ１由来のゲノムＤＮＡをＢｇＬＩＩで消化し、そして４ｋｂから６ｋｂに範囲するフラグメントをアガロースゲルから回収した。そのＤＮＡをＴ４ ＤＮＡリガーゼを用いて１６℃でライゲーションした。このライゲーション混合物を下記のプライマーを用いるＰＣＲ反応において鋳型として用いた。

増幅のためにＥｘｐａｎｄ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙポリメラーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）をその製造者の推奨に従って用いた。反応におけるＭｇＣｌ₂の濃度は１ｍＭとした。その他の条件は上記の通りである。５ｋｂのフラグメントができた。このフラグメントをＢｇＬＩＩで消化し、そしてその消化したフラグメントをＢａｍＨＩ及びＨｉｎｃＩＩで消化したｐＵＣ１９（Ｃ．Ｖａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎら（１９８５）Ｇｅｎｅ ３３，１０３−１１９）にライゲーションした。そのライゲーション混合物を大腸菌ＤＨ５αに形質転換させた。１．３ｋｂ及び３．７ｋｂのインサートサイズを有するコロニーが認められた。各クラスのコロニー一つをＭＢリバースプライマー及びＭ１３フォワード（−２０）プライマーを用いて配列決定した。このようにして、ＢｇＬＩＩ近位配列が決定され、そして下記のプライマーをこの５ｋｂＢｇＬＩＩフラグメントのＰＣＲ増幅のためにデザインした。

これらのプライマーを逆ＰＣＲと同じＰＣＲ条件を利用してゲノムＡ．ニガーＢＯ１ＤＮＡを増幅するのに用いた。作製された５ｋｂフラグメントをｐＣＲＩＩにライゲーションし、ｐＨＰＩを作った。オキサロ酢酸ヒドロラーゼ遺伝子を鋳型としてのｐＨＰＩと、下記のプライマーを用いて配列決定した。

そのＤＮＡ配列をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示す。この配列をコード配列について及びイントロンの存在についてコンピューターソフトウェアＮｅｔｇｅｎｅ ２（Ｓ．Ｍ．Ｈｅｂｓｇａａｒｄ，Ｐ．Ｇ．Ｋｏｒｎｉｎｇ，Ｎ．Ｔｏｌｓｔｒｕｐ，Ｊ．Ｅｎｇｅｌｂｒｅｃｈｔ，Ｐ．Ｒｏｕｚｅ，Ｓ．Ｂｒｕｎａｋ，１９９６，Ｎｕｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２４：３４３９−３４５２）を用いて解析し、３つのエキソンの存在を示唆した（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の備考を参照のこと）。これら３つのイントロンから推定した３４１残基タンパク質配列をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示す。

疑問配列としてこのタンパク質配列（ｏａｈ）を用いるデーターベースサーチは、アスペルギルス・ニジュランス（Ｓｗｉｓｓ ｐｒｏｔ Ｐ２８２９８）及びニューロスポラ・クラッサ（Ｓｗｉｓｓ ｐｒｏｔ Ｐ２８２９９）由来のイソクエン酸イソメラーゼ、並びにストレプトマイセスヒグロスコピカス（Ｓｗｉｓｓ ｐｒｏｔ Ｐ１１４３５）由来のカルボキシビニルカルボキシホスホネートホスホリルムターゼ及びバチルス・スプリチス（Ｓｗｉｓｓ ｐｒｏｔ Ｐ５４５２８）由来のヒポセティカルタンパク質との配列相同性を示した。

プラスミドｐＨＰＩを保有する大腸菌株はＤＳＭ １２６６０として寄託した。

実施例４
オキサロ酢酸ヒドロラーゼ遺伝子の中断
ｐＨＰＩをＮｒｕＩ及びＢｓｔＥＩＩで消化し、そして６．６ｋｂのフラグメントが単離された。アスペルギルス・ニガーｐｙｒＧ遺伝子を保有するプラスミド、ｐＪＲｏｙ１０（図１）をＮｃｏＩで消化し、そして５’へこみ末端をＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメントで埋め、次にＢｓｔＥＩＩで消化した。２９４８ｂｐのフラグメントが単離され、そしてｐＨＰＩのフラグメントにライゲーションした。そのライゲーション混合物を大腸菌ＤＨ５αの形質転換のために用いた。所望のプラスミドを保有するコロニーを同定し、そしてそのプラスミドをｐＨＰ３と命名した（図２）。プラスミドｐＨＰ３を保有する大腸菌株をＤＳＭ １２６６１として寄託した。

ｐｙｒＧ欠陥Ａ．ニガーＢＯ１誘導体ＪＲｏｙ３（ＢＯ１はｐｙｒＧ遺伝子領域の欠失フラグメントによる形質転換及びＦＯＡでの選別によりｐｙｒＧネガティブとなっている）をｐＨＰ３の５ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＮｏｔＩフラグメントでＥＰ特許ＥＰ０５３１３７２Ｂ１に記載の方法に従い形質転換した。２７５の形質転換体を２回再単離し、次いで９６穴マイクロタイター皿の中で３４℃にして、ｐＨ６．０で４８ｈｒかけ、培地、グルコース２０ｇ／Ｌ，ＮａＮＯ₃ １５ｇ／Ｌ，ＫＨ₂ＰＯ₄ １．５ｇ／Ｌ，ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ １ｇ／Ｌ，ＮａＣｌ １ｇ／Ｌ，ＣａＣｌ₂・２Ｈ₂Ｏ ０．１ｇ／Ｌ，微量溶液０．５ｍｌ／Ｌの中で増殖させた。微量溶液：ＺｎＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ １４．３ｇ／Ｌ，ＣｕＳＯ₄・５Ｈ₂Ｏ ２．５ｇ／Ｌ，ＮｉＣｌ₂・６Ｈ₂Ｏ ０．５ｇ／Ｌ，ＦｅＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ １３．８ｇ／Ｌ，ＭｎＣｌ₂ ６ｇ／Ｌ。その上清液をＳｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）シュウ酸（ｃａｔ．Ｎｏ．５９１−Ｃ）キットを用いてシュウ酸についてアッセイした。８の形質転換体がシュウ酸を生産しないことがわかった。そのうち６つをサザンブロット分析に、２つのシュウ酸産生形質転換体ＢＯ１及びＪＲｏｙを陽性コントロールとして一緒にかけた。実施例３に記載の２１９ｂｐのＥＳＴ ＰＣＲフラグメントをプローブとして用いた。同じサンプルの別のブロットをｐＪＲｏｙ１０のＮｃｏＩ−ＢｓｔＥＩＩフラグメントでプロービングした。サザンブロットは６つのシュウ酸陰性株がオキサロ酢酸遺伝子内で中断されており、陽性コントロールは完全なオキサロ酢酸遺伝子を含むことを示した。

実施例５
オキサロ酢酸陰性株の発酵
オキサロ酢酸陰性株の一つを、攪拌、温度制御、ｐＨ制御及び通気の備ったバッチ発酵槽の中で増殖させた。その培地はグルコース１６ｇ／Ｌ，（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄ ７．５ｇ／Ｌ，ＫＨ₂ＰＯ₄ １．５ｇ／Ｌ，ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ １ｇ／Ｌ，ＮａＣｌ １ｇ／Ｌ，ＣａＣｌ₂・２Ｈ₂Ｏ ０．１ｇ／Ｌ，微量溶液０．５ｍｌ／Ｌである。微量溶液：ＺｎＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ １４．３ｇ／Ｌ，ＣｕＳＯ₄・５Ｈ₂Ｏ ２．５ｇ／Ｌ，ＮｉＣｌ₂・６Ｈ₂Ｏ ０．５ｇ／Ｌ，ＦｅＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ １３．８ｇ／Ｌ，ＭｎＣｌ₂ ６ｇ／Ｌ。そのｐＨをバイオマスが０．５ｇ／Ｌの濃度に達するまで２．５とした。この時点でｐＨをｐＨ６．０にシフトさせた。発酵ブロスをシュウ酸塩、クエン酸塩、ピルビン酸塩、コハク酸塩、酢酸塩、グリセロール、エタノール及びグルコースについて分析した（Ｎｉｓｓｅｎ，Ｔ．Ｌ．，Ｕ．Ｓｃｈｕｌｚｅ，Ｊ．Ｎｉｅｌｓｅｎ，ａｎｄ Ｊ．Ｖｉｌｌａｄｓｅｎ．１９９７．Ｆｌｕｘ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎｓ ｉｎ ａｎａｅｒｏｂｉｃ，ｇｌｕｃｏｓｅ−ｌｉｍｉｔｅｄ ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｏｆ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１４３：２０３−２１８）。副産物のうち、クエン酸塩、ピルビン酸塩、コハク酸塩およびグリセロールのみが検出でき、そしてこれらの副産物の最大濃度はそれぞれ０．７４ｇ／Ｌ，０．８１ｇ／Ｌ，０．１４ｇ／Ｌ及び０．１３ｇ／Ｌであった。グルコースに基づくバイオマス収率は０．５８ｇ／ｇであり、比増殖速度は０．２３ｈ^-1であった。

微生物材料の寄託
下記の生物材料をブダペスト条約に従い、ＤＳＭＺ−Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨ，Ｍａｓｃｈｅｒｏｄｅｒ Ｗｅｇ １ｂ，Ｄ−３８１２４ Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に寄託し、そして以下の受託番号が付与された：寄託ｒｅｆ． 受託番号 寄託日ＮＮ０４９４５４ ＤＳＭ １２６６０ １９９９−０２−０３ＮＮ０４９４５５ ＤＳＭ １２６６１ １９９９−０２−０３ＮＮ０４９０４７ ＤＳＭ １２６６５ １９９９−０２−０３

Claims (24)

1. オキサロ酢酸ヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする単離された核酸であって：
   （ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のアミノ酸１〜３４１と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列をもつポリペプチドをコードする核酸；及び
   （ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のヌクレオチド１１５７〜１４１１、１５０４〜１６５１及び１７６４〜２３８３から構成されるヌクレオチド配列と少なくとも９０％の相同性を有する核酸；
   から成る群から選ばれる核酸。
2. ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のアミノ酸配列を含んで成るポリペプチドをコードする、又は
   ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の核酸配列と少なくとも９０％の相同性を有する配列から成る、又は
   ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の核酸配列から成る、又は
   大腸菌株ＤＳＭ１２６６０に収容されたプラスミドpHＰ１の中に含まれている、
   請求項１記載の核酸。
3. オキサロ酢酸ヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする単離された核酸であって、（ａ）ＤＮＡを高ストリンジェンシー条件下で（ｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の核酸、（ii）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のｃＤＮＡ、（iii）少なくとも１００ヌクレオチドの（ｉ）もしくは（ii）のサブ配列の核酸、又は（iv）（ｉ）、（ii）もしくは（iii）の相補鎖とハイブリダイゼーションさせ；そして（ｂ）当該核酸を単離することにより生産された核酸。
4. 適当な発現宿主内での前記ポリペプチドの産生を指令する１又は複数のコントロール配列に作用可能式に連結された請求項１〜３のいずれか１項記載の核酸を含んで成る核酸構築体。
5. 請求項４記載の核酸構築体、プロモーター、並びに転写及び翻訳停止シグナルを含んで成る組換発現ベクター。
6. 請求項４記載の核酸構築体を含んで成る組換宿主細胞。
7. オキサロ酢酸ヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドを生産するための方法であって、（ａ）請求項６記載の宿主細胞を当該ポリペプチドの産生に適した条件下で培養し、そして（ｂ）当該ポリペプチドを回収することを含んで成る方法。
8. 糸状菌細胞の突然変異細胞を生産するための方法であって、請求項１〜３のいずれか１項記載の核酸を中断又は欠失させ、もとの細胞よりも少ない量のオキサロ酢酸ヒドロラーゼを産生する突然変異体を生み出すことを含んで成る方法。
9. （ａ）親糸状菌細胞に、オキサロ酢酸デヒドロラーゼの産生を司る少なくとも一の遺伝子の修飾を含んで成る核酸を導入し；そして
   （ｂ）同一条件下で親細胞よりも少ない量のオキサロ酢酸デヒドロラーゼを産生する工程（ａ）由来の突然変異細胞を同定する；
   ことを含んで成る請求項８記載の方法。
10. 請求項８又は９記載の方法により生産された突然変異細胞。
11. アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、アクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）、オーレオバシジウム（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ）、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、フィリバシジウム（Ｆｉｌｉｂａｓｉｄｉｕｍ）、フサリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、ジッベレラ（Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ）、ヒュミコラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、マグナポルテ（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ）、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）、ミセリオフソラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）、ミロセシウム（Ｍｙｒｏｔｈｅｃｉｕｍ）、ネオカリマスティックス（Ｎｅｏｃａｌｌｉｍａｓｔｉｘ）、ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、ペシロマイセス（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ）、ペニシリウム（ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、ピロマイセス（Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾフィルム（Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ）、タラロマイセス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）、サーモアスカス（Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ）、チエラビア（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ）、トリポクラジウム（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ）、又はトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）株の細胞である、請求項１０記載の突然変異細胞。
12. アスペルギルス・ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）株の細胞である、請求項１１記載の突然変異細胞。
13. 前記突然変異細胞が親細胞よりも、同一条件下で培養したときに少なくとも約２５％少ない量のオキサロ酢酸ヒドロラーゼ又はシュウ酸を産生する、請求項１０〜１２のいずれか１項記載の突然変異細胞。
14. 前記突然変異細胞が１又は複数の第三の核酸配列の１又は複数の修飾を更に含んで成り、ここで当該修飾は当該１又は複数の第三の核酸配列の発現を抑制又は消失させるものである、請求項１０〜１３のいずれか１項記載の突然変異細胞。
15. 前記第三の核酸がアミノペプチダーゼ、アミラーゼ、カルボヒドラーゼ、カルボキシペプチターゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、クチナーゼ、シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エステラーゼ、アルファ−ガラクトシダーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、アルファ−グルコシダーゼ、ベータ−グルコシダーゼ、インベルターゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、アンノシダーゼ、ムタナーゼ、オキシダーゼ、ペクチン分解酵素、ペルオキシダーゼ、フィターゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、タンパク質分解酵素、リボヌクレアーゼ、トランスグルタミナーゼ及びキシラナーゼから成る群から選ばれる酵素をコードする、請求項１４記載の突然変異細胞。
16. 前記突然変異細胞が更にプロテアーゼをコードする１又は複数の遺伝子の修飾を含んで成る、請求項１０〜１５のいずれか１項記載の突然変異細胞。
17. 天然物を生産するための方法であって、（ａ）請求項１０〜１６のいずれか１項記載の突然変異細胞を当該天然物の産生が誘導される条件下で培養し、そして（ｂ）当該天然物を回収することを含んで成る方法。
18. 前記天然物がクエン酸である、請求項１７記載の方法。
19. 異種ポリペプチドをコードする核酸を更に含んで成る、請求項１０〜１６のいずれか１項記載の突然変異細胞。
20. 異種ポリペプチドを生産するための方法であって、（ａ）請求項１９記載の突然変異細胞を当該ポリペプチドの産生が誘導される条件下で培養し、そして（ｂ）当該ポリペプチドを回収することを含んで成る方法。
21. 前記異種ポリペプチドがホルモン、ホルモン変異体、酵素、レセプター又はその一部、抗体又はその一部、又はリポーターである、請求項２０記載の方法。
22. 前記酵素がオキシドリダクターゼ、トランスフェラーゼ、ヒドロラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼ、又はリガーゼ、好ましくはアミノペプチターゼ、アミラーゼ、カルボヒドラーゼ、カルボキシペプチターゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、クチナーゼ、シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エステラーゼ、アルファ−ガラクトシダーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、アルファ−グルコシダーゼ、ベータ−グルコシダーゼ、インベルターゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、アンノシダーゼ、ムタナーゼ、オキシダーゼ、ペクチン分解酵素、ペルオキシダーゼ、フィターゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、タンパク質分解酵素、リボヌクレアーゼ、トランスグルタミナーゼ又はキシラナーゼである、請求２１記載の方法。
23. 食品におけるシュウ酸の検出のための請求項１〜３のいずれか１項記載の核酸によりコードされるオキサロ酢酸デヒドロラーゼの使用。
24. 大腸菌株ＤＳＭ １２２６０又はＤＳＭ １２６６１の実質的に純粋な培養物。

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