DE60025467T2 - Oxalacetat-hydrolase defiziente fungale wirtszellen - Google Patents

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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
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Description

  • Hintergrund der Erfindung
  • Gebiet der Erfindung
  • Die Erfindung betrifft isolierte Nukleinsäuresequenzen, die Polypeptide mit Oxalacetat-Hydrolase-Aktivität kodieren. Die vorliegende Erfindung betrifft des Weiteren Mutanten von Wirtszellen, insbesondere Mutanten von Pilzwirtszellen, wie z.B. Zellen der Gattung Aspergillus, die in der Oxalacetat-Hydrolase-Aktivität und dadurch in der Herstellung von Oxalsäure einen Defekt aufweisen. Die vorliegende Erfindung betrifft ebenso die Verwendung der Mutantenzellen zur Herstellung erwünschter Verbindungen, wie z.B. Polypeptide, primäre und sekundäre Metabolite, und Verfahren zur Herstellung derartiger Verbindungen in den Mutantenzellen der Erfindung. Die Erfindung betrifft ebenso Nukleinsäurekonstrukte, Vektoren und Wirtszellen, die die Nukleinsäuresequenzen sowie rekombinante Verfahren zur Herstellung der Polypeptide mit Oxalacetat-Hydrolase-Aktivität umfassen.
  • Beschreibung des Stands der Technik
  • Fadenpilze werden für die gewerbliche Herstellung einer Vielfalt von Verbindungen von Interesse, einschließlich homologer Verbindungen, wie z.B. von dem fraglichen Pilz normalerweise hergestellter, primärer und sekundärer Metabolite und Polypeptide, oder heterologer Verbindungen, wie z.B. heterologer Polypeptide, die von einer in den fraglichen Pilz eingeführten fremden DNA kodiert werden, vielfach verwendet. Derartige Produkte werden durch Fermentation des fraglichen Pilzes und Ernte des aus der Fermentation resultierenden, gewünschten Produkts hergestellt.
  • Die Pilzspezies A. niger wird zur gewerblichen Herstellung von gewünschten Verbindungen, z.B. Zitronensäure und industriellen Enzymen vielfach verwendet. Es ist bekannt, dass diese Spezies große Mengen Oxalsäure herstellt. Wegen etlicher Gründe ist die Herstellung von Oxalsäure unerwünscht, wenn diese Spezies für die gewerbliche Herstellung einer Verbindung von Interesse verwendet wird. Zum Beispiel erfordert die Herstellung von Oxalsäure eine Menge Kohlenstoff und somit müssen zusätzliche, teure Kohlenstoffquellen zum Fermentationsmedium verglichen mit dem, was nur für die Herstellung der gewünschten Verbindung erforderlich wäre, zugesetzt werden; die Anwesenheit von Oxalsäure in der Fermentationsbrühe verursacht Probleme in der mit der Gewinnung des Produkts von Interesse verbundenen, nachgeschalteten Verarbeitung, da Oxalsäure einen in der Gewinnung störenden Niederschlag mit Calcium bildet; und bei Oxalsäure handelt es sich um eine toxische Verbindung, was bedeutet, dass seine Anwesenheit als ein Hauptproblem in der Herstellung von Produkten mit Lebensmittelqualität aus A. niger angesehen wird.
  • Es wurden zwei mögliche Routen für den Weg der Oxalsäure-Biosynthese in A. niger nahe gelegt. Die erste Route lautet Oxalacetat + Wasser → Oxalsäure + Acetat, wobei die Reaktion durch die Oxalacetat-Hydrolase katalysiert wird (Kubicek, C. P., Schreferl-Kunar, G., Wöhrer, W. und Röhr, M. (1988), Appl. Environ. Microbiol. 54, 633–637). Die zweite Route umfasst den Glycoxylat-Weg (Balmforth, A. J., Thomson, A. (1984), Biochem. J. 218, 113–118).
  • Es wurde versucht, die Bildung der Oxalsäure während gewerblicher Fermentationen von A. niger durch Betreiben der Fermentation bei einem niedrigen pH-Wert, bei dem nur wenig Oxalsäure gebildet wird, zu regulieren. Jedoch kann die Fermentation bei niedrigem pH-Wert nicht erwünscht sein, da normalerweise dieser pH-Wert für das Wachstum von A. niger und die Ausbeute des gewünschten Fermentationsprodukts nicht optimal ist.
  • Es wurde eine teilweise gereinigte Oxalacetat-Hydrolase von A. niger beschrieben (Lenz et al., Partial purification and some properties of oxaloacetate from Aspergillus niger, 1976, Eur. J. Biochem. 65, 225–236), jedoch wurde das Enzym kodierende Gen nicht beschrieben.
  • Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Mutanten von Zellen bereitzustellen, wie z.B. Fadenpilzzellen, insbesondere Zellen von A. niger, die in der Oxalacetat-Hydrolase-Herstellung und dadurch in der Oxalsäure-Herstellung einen Defekt aufweisen.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft isolierte Nukleinsäuresequenzen, die Polypeptide mit Oxalacetat-Hydrolase-Aktivität kodieren, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus:
    • (a) einer Nukleinsäuresequenz, die ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz kodiert, die mit den Aminosäuren 1 bis 341 von SEQ ID NR:2 zu mindestens 65% identisch ist,
    • (b) einer Nukleinsäuresequenz, die mit einer Nukleotidsequenz, die durch die Nukleotide 1157–1411, 1504–1651 und 1764–2383 von SEQ ID NR:1 gebildet ist, zu mindestens 65% homolog ist,
    • (c) einer Nukleinsäuresequenz, die unter mittelstringenten Bedingungen mit (i) der Nukleinsäuresequenz von SEQ ID NR:1, (ii) der cDNA-Sequenz von SEQ ID NR:1, (iii) einer Untersequenz von (i) oder (ii) aus mindestens 100 Nukleotiden oder (iv) einem komplementären Strang von (i), (ii) oder (iii) hybridisiert,
    • (d) einer Allelvariante von (a), (b) oder (c), und
    • (e) einer Untersequenz von (a), (b), (c) oder (d), wobei die Untersequenz ein Polypeptidfragment kodiert, das Oxalacetat-Hydrolase-Aktivität aufweist.
  • In einer weiteren wichtigen Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer Mutante einer fadenartigen Zelle, welches das Unterbrechen oder Deletieren der Nukleinsäuresequenz der Erfindung oder einer Kontrollsequenz davon umfasst, was dazu führt, dass die Mutante weniger Oxalacetat-Hydrolase und somit Oxalsäure als die Zelle herstellt. Die vorliegende Erfindung betrifft ebenso eine durch dieses Verfahren hergestellte Mutante.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft auch Nukleinsäurekonstrukte, Vektoren und Wirtszellen, die die Nukleinsäuresequenzen sowie rekombinante Verfahren zur Herstellung der Polypeptide umfassen.
  • Kurzbeschreibung der Figuren
  • 1 zeigt die in Beispiel 4 beschriebene Konstruktion des Plasmids pHP3.
  • Detaillierte Beschreibung der Erfindung
  • Isolierte, Polypeptide mit Oxalacetat-Hydrolase-Aktivität kodierende Nukleinsäuresequenzen
  • Der Begriff „Oxalacetat-Hydrolase-Aktivität" ist hierin als eine Aktivität definiert, die die folgende Reaktion katalysiert: Oxalacetat + Wasser → Oxalsäure + Acetat. Das Enzym ist der Klasse EC 3.7.1.1. zugeordnet. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung wird die Oxalacetat-Hydrolase-Aktivität gemäß dem Verfahren bestimmt, das in dem nachstehenden Abschnitt Materialien und Verfahren beschriebenen ist. Eine Einheit der Oxalacetat-Hydrolyse-Aktivität ist definiert als 1,0 μmol Oxalsäure, die pro Minute bei 30°C und einem pH-Wert von 7,5 hergestellt wird.
  • Der Begriff „isolierte Nukleinsäuresequenz" wie hierin verwendet betrifft eine Nukleinsäuresequenz, die im Wesentlichen von anderen Nukleinsäuresequenzen frei ist, z.B. mindestens etwa 20% rein, vorzugsweise mindestens etwa 40% rein, stärker bevorzugt mindestens etwa 60% rein, noch stärker bevorzugt mindestens etwa 80% rein und am stärksten bevorzugt mindestens etwa 90% rein nach Bestimmung durch Agaroseelektrophorese. Zum Beispiel kann eine isolierte Nukleinsäuresequenz durch in der Gentechnologie verwendete Standardklonierungsverfahren erhalten werden, um die Nukleinsäuresequenz von ihrem natürlichen Ort an einen anderen Ort zu verlagern, wo sie kopiert wird. Die Klonierungsverfahren können das Ausschneiden und die Isolierung eines gewünschten Nukleinsäurefragments einschließen und umfassen die Polypeptid kodierende Nukleinsäuresequenz, die Insertion des Fragments in ein Vektormolekül und die Aufnahme des rekombinanten Vektors in eine Wirtszelle, wo mehrfache Kopien oder Klone der Nukleinsäuresequenz repliziert werden. Bei der Nukleinsäuresequenz kann es sich um einen genomischen, cDNA-, RNA-, halbsynthetischen, synthetischen Ursprung oder beliebige Kombinationen davon handeln.
  • In einer ersten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung isolierte Nukleinsäuresequenzen, die Polypeptide kodieren, welche eine Aminosäuresequenz aufweisen, die mit den Aminosäuren 1 bis 341 von SEQ ID NR:2 (d.h. das reife Polypeptid) einen Identitätsgrad von mindestens etwa 65%, vorzugsweise mindestens etwa 70%, stärker bevorzugt mindestens etwa 80%, noch stärker bevorzugt mindestens etwa 90%, am stärksten bevorzugt mindestens etwa 95% und noch stärker bevorzugt mindestens 97% aufweist, und welche Oxalacetat-Hydrolase-Aktivität aufweisen (nachstehend „homologe Polypeptide"). In einer bevorzugten Ausführungsform weisen die homologen Polypeptide eine Aminosäuresequenz auf, die sich durch fünf Aminosäuren, vorzugsweise durch vier Aminosäuren, stärker bevorzugt durch drei Aminosäuren, noch stärker bevorzugt durch zwei Aminosäuren und am stärksten bevorzugt durch eine Aminosäure von den Aminosäuren 1 bis 341 von SEQ ID NR:2 unterscheidet. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung wird der Identitätsgrad zwischen zwei Aminosäuresequenzen durch das Clustal-Verfahren (Higgins, 1989, CABIOS 5, 151–153) unter Verwendung der Software LASERGENETM MEGALIGNTM (DNASTAR, Inc., Madison, WI) mit einer Identitätstabelle und der folgenden mehrfachen Anordnungsparameter bestimmt: eine Lückenstrafe von 10 und eine Lückenlängenstrafe von 10. Die paarweisen Anordnungsparameter waren: K-Tupel = 1, Lückenstrafe = 3, Fenster = 5 und Diagonalen = 5.
  • Vorzugsweise kodieren die Nukleinsäuresequenzen der vorliegenden Erfindung Polypeptide, die die Aminosäuresequenz von SEQ ID NR:2 oder eine Allelvariante davon oder ein Fragment davon mit Oxalacetat-Hydrolase-Aktivität umfassen oder daraus bestehen.
  • Die vorliegende Erfindung umfasst ebenso Nukleinsäuresequenzen, die ein Polypeptid mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID NR:2 kodieren und die sich von SEQ ID NR:1 aufgrund der Degeneration des genetischen Codes unterscheiden. Die vorliegende Erfindung betrifft ebenso Untersequenzen von SEQ ID NR:1, die Fragmente von SEQ ID NR:2 mit Oxalacetat-Hydrolyse-Aktivität kodieren oder die genügend lang sind, um zur Inaktivierung eines Oxalacetat-Hydrolase-Gens in einer mikrobiellen Zelle (wie im Abschnitt mit dem Titel „Entfernung oder Verminderung der Oxalacetat-Hydrolase-Aktivität" beschrieben) verwendet zu werden.
  • Bei einer Untersequenz von SEQ ID NR:1 handelt es sich um eine von SEQ ID NR:1 umfasste Nukleinsäuresequenz, außer dass ein oder mehrere Nukleotide vom 5'- und/oder 3'-Ende entfernt wurden. Vorzugsweise enthält eine Untersequenz mindestens 2800 Nukleotide, stärker bevorzugt mindestens 3000 Nukleotide und am stärksten bevorzugt mindestens 3200 Nukleotide. Bei einem Fragment von SEQ ID NR:2 handelt es sich um ein Polypeptid, bei dem eine oder mehrere Aminosäuren vom Amino- und/oder Carboxy-Ende dieser Aminosäuresequenz entfernt sind. Vorzugsweise enthält ein Fragment mindestens 270 Aminosäurereste, stärker bevorzugt mindestens 300 Aminosäurereste und am stärksten bevorzugt 320 Aminosäurereste.
  • Eine Allelvariante bezeichnet zwei oder mehrere beliebige alternative Formen eines Gens, die denselben chromosomalen Lokus belegen. Die Allelvariation entsteht normalerweise durch Mutation und kann zu einem Polymorphismus innerhalb von Populationen führen. Bei den Genmutationen kann es sich um stille Genmutationen handeln (keine Änderung im kodierten Polypeptid) oder sie können Polypeptide mit veränderter Aminosäuresequenz kodieren. Bei einer Allelvariante eines Polypeptids handelt es sich um ein von einer Allelvariante kodiertes Gen.
  • Die Aminosäuresequenzen der homologen Polypeptide können sich von der Aminosäuresequenz von SEQ ID NR:2 durch eine Insertion oder Deletion eines oder mehrerer Aminosäurereste und/oder die Substitution eines oder mehrerer Aminosäurereste durch verschiedene Aminosäurereste unterscheiden. Vorzugsweise sind die Aminosäureaustausche von untergeordneter Natur, wobei es sich um konservative Aminosäuresubstitutionen, die die Faltung und/oder Aktivität des Proteins im Wesentlichen nicht beeinträchtigen, wenig Deletionen von typischerweise ein bis etwa 30 Aminosäuren, kleine amino- oder carboxyterminale Verlängerungen, wie z.B. ein aminoterminaler Methioninrest, ein kleiner Peptidlinker von bis zu etwa 20–25 Resten oder eine kleine Verlängerung, die die Reinigung durch Ändern der Nettoladung und einer anderen Funktion, wie z.B. ein Polyhistidintrakt, ein antigenes Epitop oder eine Bindungsdomäne erleichtert, handelt.
  • Beispiele konservativer Substitutionen sind innerhalb der Gruppe der basischen Aminosäuren (wie z.B. Arginin, Lysin und Histidin), der sauren Aminosäuren (wie z.B. Glutaminsäure und Asparaginsäure), der polaren Aminosäuren (wie z.B. Glutamin und Asparagin), der hydrophoben Aminosäuren (wie z.B. Leucin, Isoleucin und Valin), der aromatischen Aminosäuren (wie z.B. Phenylalanin, Tryptophan und Tyrosin) und der kleinen Aminosäuren (wie z.B. Glycin, Alanin, Serin, Threonin und Methionin). Die Aminosäuresubstitutionen, die die spezifische Aktivität im Allgemeinen nicht ändern, sind auf dem Fachgebiet bekannt und zum Beispiel von H. Neurath und R. L. Hill, 1979, in The Proteins, Academic Press, New York, beschrieben. Bei den am häufigsten vorkommenden Austauschen handelt es sich um Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu und Asp/Gly sowie diese in umgekehrter Form.
  • In einer zweiten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung isolierte Nukleinsäuresequenzen, die einen Grad der Homologie zu einer Nukleotidsequenz, die durch die Nukleotide 1157–1411, 1504–1651 und 1764–2383 von SEQ ID NR:1 gebildet ist, von mindestens etwa 65%, vorzugsweise mindestens etwa 70%, vorzugsweise mindestens etwa 80%, stärker bevorzugt mindestens etwa 90%, noch stärker bevorzugt mindestens etwa 95% und am stärksten bevorzugt mindestens etwa 97% Homologie aufweisen und die ein aktives Polypeptid kodieren oder die genügend lang sind, um zur Inaktivierung eines Oxalacetat-Hydrolase-Gens in einer mikrobiellen Zelle verwendet zu werden (wie im Abschnitt mit dem Titel „Entfernung oder Verminderung der Oxalacetat-Hydrolase-Aktivität" beschrieben), oder Allelvarianten und Untersequenzen von SEQ ID NR:1, die Polypeptidfragmente mit Oxalacetat-Hydrolase-Aktivität kodieren oder die genügend lang sind, um zur Inaktivierung eines Oxalacetat-Hydrolase-Gens in einer mikrobiellen Zelle verwendet zu werden (wie im Abschnitt mit dem Titel „Entfernung oder Verminderung der Oxalacetat-Hydrolase-Aktivität" beschrieben). Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung wird der Grad der Homologie zwischen zwei Nukleinsäuresequenzen durch das Computerprogramm Align, das in dem Fasta-Programmpaket (Version v20u6) bereitgestellt ist, unter Verwenden von GAP mit den folgenden Einstellungen für den Nukleotidsequenzvergleich bestimmt: GAP-Erzeugungsstrafe (für den ersten Rest) in einem GAP von –16 und GAP-Verlängerungsstrafe (für die zusätzlichen Reste) von –4. Bei Align handelt es sich um eine leicht modifizierte Version eines von E. Myers und W. Miller übernommenen Programms. Der Algorithmus ist in E. Myers und W. Miller, „Optimal Alignments in Linear Space" (CABIOS (1988) 4, 11–17) beschrieben.
  • In einer dritten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung isolierte Nukleinsäuresequenzen, die Polypeptide mit Oxalacetat-Hydrolase-Aktivität kodieren und die unter mittleren Stringenzbedingungen, stärker bevorzugt mittelhohen Stringenzbedingungen, noch stärker bevorzugt hohen Stringenzbedingungen und am stärksten bevorzugt sehr hohen Stringenzbedingungen mit einer Nukleinsäuresonde hybridisieren, die unter denselben Bedingungen mit (i) der Nukleinsäuresequenz von SEQ ID NR:1, (ii) der cDNA-Sequenz von SEQ ID NR:1, (iii) einer Untersequenz von (i) oder (ii) von mindestens 100 Nukleotiden oder (iv) einem komplementären Strang von (i), (ii) oder (iii) hybridisiert (Sambrook, J., Fritsch, E. F. und Maniatis, T., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbor, New York). Bei der Untersequenz von SEQ ID NR:1 kann es sich um mindestens 200 Nukleotide handeln. Darüber hinaus kann die Untersequenz ein Polypeptidfragment mit Oxalacetat-Hydrolase-Aktivität kodieren.
  • Die Nukleinsäuresequenz von SEQ ID NR:1 oder eine Untersequenz davon, sowie die Aminosäuresequenz von SEQ ID NR:2 oder ein Fragment davon kann zum Entwerfen einer Nukleinsäuresonde verwendet werden, um DNA, die Polypeptide mit Oxalacetat-Hydrolase-Aktivität von Stämmen verschiedener Gattungen oder Spezies kodiert, gemäß den auf dem Fachgebiet bekannten Verfahren zu identifizieren und zu klonieren. Insbesondere derartige Sonden können zur Hybridisierung mit der genomischen oder cDNA der Gattung oder Spezies von Interesse gemäß den Standard-Southern-Blotting-Verfahren verwendet werden, um die entsprechenden Gene darin zu identifizieren und zu isolieren. Derartige Sonden können beträchtlich kürzer als die gesamte Sequenz sein, sollten jedoch mindestens 15, vorzugsweise mindestens 25 und am stärksten bevorzugt mindestens 35 Nukleotide lang sein. Längere Sonden können ebenso verwendet werden. Sowohl DNA- als auch RNA-Sonden können verwendet werden. Die Sonden sind zum Nachweisen des entsprechenden Gens typischerweise markiert (32P, 3H, 35S, Biotin oder Avidin). Derartige Sonden sind von der vorliegenden Erfindung umfasst.
  • Daher kann eine aus derart anderen Organismen präparierte, genomische DNA- oder cDNA-Genbank bezüglich einer DNA durchgemustert werden, die mit den vorstehend beschriebenen Sonden hybridisiert und die ein Polypeptid mit Oxalacetat-Hydrolase-Aktivität kodiert. Genomische oder andere DNA von derart anderen Organismen kann durch Agarose- oder Polyacrylamidgelelektrophorese oder anderen Trennverfahren aufgetrennt werden. Die DNA von den Genbanken oder die aufgetrennte DNA kann auf Nitrocellulose oder anderem geeigneten Trägermaterial übertragen und darauf immobilisiert werden. Um einen Klon oder eine DNA, der/die zu SEQ ID NR:1 oder einer Untersequenz davon homolog ist, zu identifizieren, wird das Trägermaterial in einem Southern-Blot verwendet. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung zeigt die Hybridisierung an, dass die Nukleinsäuresequenz an eine Nukleinsäuresonde, die der in SEQ ID NR:1 dargestellten Nukleinsäuresequenz, seinem komplementären Strang oder einer Untersequenz davon entspricht, unter sehr niedrigen bis sehr hohen Stringenzbedingungen hybridisiert. Die Moleküle, an die die Nukleinsäuresonde unter diesen Bedingungen hybridisiert, werden unter Verwendung eines Röntgenfilms nachgewiesen.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei der Nukleinsäuresonde um eine Nukleinsäuresequenz, die das Polypeptid von SEQ ID NR:2 oder eine Untersequenz davon kodiert. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei der Nukleinsäuresonde um SEQ ID NR:1. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei der Nukleinsäuresonde um die Nukleotide, die das durch die Aminosäurereste 123–205 gebildete Fragment von SEQ ID NR:2 oder einen Teil dieses Fragments kodieren. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei der Nukleinsäuresonde um eine Nukleinsäuresequenz, die im Plasmid pHP1 enthalten ist, welches in Escherichia coli DSM-12660 enthalten ist, wobei die Nukleinsäuresequnz ein Polypeptid mit Oxalacetat-Hydrolase-Aktivität, insbesondere den das reife Polypeptid kodierenden Bereich von SEQ ID NR:1 kodiert.
  • Für lange Sonden mit einer Länge von mindestens 100 Nukleotiden sind sehr niedrige bis sehr hohe Stringenzbedingungen als Prähybridisierung und Hybridisierung bei 42°C in 5× SSPE, 0,3% SDS, 200 μg/ml gescherte und denaturierte Lachssperma-DNA und entweder 25% Formamid für sehr niedrige und niedrige Stringenz, 35% Formamid für mittlere und mittelhohe Stringenz oder 50% Formamid für hohe und sehr hohe Stringenz gemäß den Standard-Southern-Blotting-Verfahren definiert.
  • Für lange Sonden mit einer Länge von mindestens 100 Nukleotiden wird das Trägermaterial schließlich dreimal jeweils 15 Minuten unter Verwendung von 2× SSC, 0,2% SDS vorzugsweise bei mindestens 45°C (sehr niedrige Stringenz), stärker bevorzugt bei mindestens 50°C (niedrige Stringenz), stärker bevorzugt bei mindestens 55°C (mittlere Stringenz), stärker bevorzugt bei mindestens 60°C (mittelhohe Stringenz), noch stärker bevorzugt bei mindestens 65°C (hohe Stringenz) und am stärksten bevorzugt bei mindestens 70°C (sehr hohe Stringenz) gewaschen.
  • Für kurze Sonden, die etwa 15 Nukleotide bis etwa 70 Nukleotide lang sind, sind die Stringenzbedingungen definiert als Prähybridisierung, Hybridisierung und Posthybridisierung unter Waschen bei 5°C bis 10°C unterhalb des berechneten Tm-Werts unter Verwendung der Berechnung gemäß Bolton und McCarthy (1962, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 48, 1390) in 0,9 M NaCl, 0,09 M Tris-HCl, pH 7,6, 6 mM EDTA, 0,5% NP-40, 1× Denhardts Lösung, 1 mM Natriumpyrophosphat, 1 mM monobasisches Natriumphosphat, 0,1 mM ATP und 0,2 mg Hefe-RNA pro ml gemäß den Standard-Southern-Blotting-Verfahren.
  • Für kurze Sonden, die etwa 15 Nukleotide bis etwa 70 Nukleotide lang sind, wird das Trägermaterial einmal in 6× SSC plus 0,1 % SDS für eine Dauer von 15 Minuten und zweimal jeweils für eine Dauer von 15 Minuten unter Verwendung von 6× SSC bei 5°C bis 10°C unterhalb des berechneten Tm-Werts gewaschen.
  • Die durch die isolierten Nukleinsäuresequenzen der vorliegenden Erfindung kodierten Polypeptide weisen mindestens 20%, vorzugsweise mindestens 40%, stärker bevorzugt mindestens 60%, noch stärker bevorzugt mindestens 80%, noch stärker bevorzugt mindestens 90% und am stärksten bevorzugt mindestens 100% der Oxalacetat-Hydrolase-Aktivität des reifen Polypeptids von SEQ ID NR:2 auf.
  • Die Nukleinsäuresequenzen der vorliegenden Erfindung können von Mikroorganismen beliebiger Gattung erhalten werden. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung soll der Begriff „erhalten von", wie er hierin in Verbindung mit einer gegebenen Quelle verwendet wird, bedeuten, dass das durch die Nukleinsäuresequenz kodierte Polypeptid durch die Quelle oder durch eine Zelle, in die die Nukleinsäuresequenz der Quelle eingefügt wurde, hergestellt wird.
  • Die Nukleinsäuresequenzen können von einer bakteriellen Quelle erhalten werden. Zum Beispiel können diese Polypeptide von einem Gram-positiven Bakterium, wie z.B. einem Bacillus-Stamm, z.B. Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus coagulans, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis oder Bacillus thuringiensis oder einem Streptomyces-Stamm, z.B. Streptomyces lividans oder Streptomyces murinus oder von einem Gram-negativen Bakterium, z.B. E. coli oder Pseudomonas sp. erhalten werden.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Nukleinsäuresequenz von einer Pilzzelle erhalten. „Pilze" wie hierin verwendet schließen die Abteilungen Ascomycota, Basidiomycota, Chytridiomycota und Zygomycota (wie von Hawksworth et al., in Ainsworth and Bisby's Dictionary of The Fungi, 8. Auflage, 1995, CAB International, University Press, Cambridge, UK, definiert) sowie die Oomycota (wie in Hawksworth et al., 1995, vorstehend, Seite 171, zitiert) und alle mitosporische Pilze (Hawksworth et al., 1995, vorstehend) ein.
  • In einer stärker bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei der Pilzzelle um eine Hefezelle. „Hefen" wie hierin verwendet schließen ascosporogene Hefen (Endomycetales), basidiosporogene Hefen und Hefen, die zu den Fungi Imperfecti (Blastomycetes) gehören, ein. Da sich die Einteilung der Hefen in der Zukunft ändern kann, sollen für die Zwecke dieser Erfindung die Hefen wie in Biology and Aktivities of Yeast (Skinner, F. A., Passmore, S. M. und Davenport, R. R., Hrsg., Soc. App. Bacteriol. Symposium Series Nr. 9, 1980) beschrieben definiert sein.
  • Insbesondere können die Nukleinsäuresequenzen von einem Hefestamm, wie z.B. einem Stamm von Candida, Hansenula, Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces oder Yarrowia oder stärker bevorzugt von einem Fadenpilzstamm, wie z.B. einem Stamm von Acremonium, Aspergillus, Aureobasidium, Cryptococcus, Filibasidium, Fusarium, Humicola, Magnaporthe, Mucor, Myceliophthora, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Piromyces, Schizophyllum, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium oder Trichoderma erhalten werden.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform können die Nukleinsäuresequenzen von einem Stamm von Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces douglasii, Saccharomyces kluyveri, Saccharomyces norbensis oder Saccharomyces oviformis erhalten werden.
  • In einer anderen bevorzugten Ausführungsform werden die Nukleinsäuresequenzen von einem Stamm von Aspergillus aculeatus, Aspergillus awamori, Aspergillus foetidus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioides, Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium tri chothecioides, Fusarium venenatum, Humicola insolens, Humicola lanuginosa, Mucor miehei, Myceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Penicillium purpurogenum, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei oder Trichoderma viride erhalten werden.
  • In einer stärker bevorzugten Ausführungsform werden die Nukleinsäuresequenzen von Aspergillus niger und am stärksten bevorzugt von A. niger BO1 DSM 12665, z.B. der in SEQ ID NR:1 dargelegten Nukleinsäuresequenz erhalten. In einer anderen stärker bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei der Nukleinsäuresequenz um die Sequenz, die in Plasmid pHP1 enthalten ist, das in Escherichia coli DSM-12660 enthalten ist. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei der Nukleinsäuresequenz um eine Nukleotidsequenz, die durch die Nukleotide 1157–1411, 1504–1651 und 1764–2383 von SEQ ID NR:1 gebildet ist und die das reife Polypeptid von SEQ ID NR:2 kodiert.
  • Es wird selbstverständlich sein, dass bei den vorstehend erwähnten Spezies die Erfindung sowohl die perfekten als auch imperfekten Formen oder andere taxonomische Pendants, z.B. Anamorphe umfasst, ungeachtet des Speziesnamens, unter dem sie bekannt sind. Der Fachmann wird die Identität zugehöriger Pendants leicht erkennen. Zum Beispiel können die Polypeptide von Mikroorganismen erhalten werden, bei denen es sich um taxonomische Pendants von Aspergillus niger wie von Benn und Klich (Benn, J. W. und Klich, M. A., (1992), Aspergillus, Biology and industrial applications, Butterworth–Heinemann, USA) definiert handelt, ungeachtet des Speziesnamens, unter dem sie bekannt sind, z.B. A. foetidus, A. heteromorphus, A. japonicus, A. phoenicis, A. pulverulentus, A. tubingensis, A. helicothrix, A. atroviolaceus, A. citricus, A. acidicus oder A. fonsecaeus.
  • Die Stämme dieser Spezies sind in etlichen Kultursammlungen, wie z.B. American Type Culture Collection (ATCC), Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM), Centraalbureau Voor Schimmelcultures (CBS) und Agricultural Research Service Patent Culture Collection, Northern Regional Research Center (NRRL) öffentlich leicht zugänglich.
  • Des Weiteren können derartige Nukleinsäuresequenzen von anderen Quellen, einschließlich der Mikroorganismen, die von der Natur (z.B. Boden, Komposte, Wasser, usw.) unter Verwendung der vorstehend erwähnten Sonden isoliert wurden, identifiziert und erhalten werden. Die Verfahren zum Isolieren von Mikroorganismen von natürlichen Lebensräumen sind auf dem Fachgebiet bekannt. Die Nukleinsäuresequenz kann dann durch ähnliches Durchmustern einer genomischen oder cDNA-Genbank von anderen Mikroorganismen abgeleitet werden.
  • Sobald eine Polypeptid kodierende Nukleinsäuresequenz mit der (den) Sonde(n) nachgewiesen wurde, kann die Sequenz unter Verwenden von Verfahren, die einem Durchschnittsfachmann bekannt sind (siehe z.B. Sambrook et al., 1989, vorstehend), isoliert oder kloniert werden.
  • Die verwendeten Verfahren, um eine Polypeptid kodierende Nukleinsäuresequenz zu isolieren oder zu klonieren, sind auf dem Fachgebiet bekannt und schließen die Isolierung aus genomischer DNA, die Präparation aus cDNA oder eine Kombination davon ein. Das Klonieren der Nukleinsäuresequenzen der vorliegenden Erfindung aus derartiger genomischer DNA kann z.B. durch Verwenden der bekannten Polymerasekettenreaktion (PCR) oder einer Antikörperdurchmusterung von Expressionsgenbanken bewerkstelligt werden, um die klonierten DNA-Fragmente mit gemeinsamen strukturellen Merkmalen nachzuweisen. Siehe z.B. Innis et al., 1990, PCR: A Guide to Methods and Application, Academic Press, New York. Für die PCR kann es von besonderer Bedeutung sein, einen Satz von Primern zu verwenden, der die Aminosäuren 123–205 von SEQ ID NR:2 kodierende Nukleotidsequenz umfasst. Andere Nukleinsäureamplifikationsverfahren, wie z.B. die Ligasekettenreaktion (LCR), die bindungsaktivierte Transkription (LAT) und die Nukleinsäuresequenz-basierte Amplifikation (NASBA) können verwendet werden. Die Nukleinsäuresequenz kann von einem Aspergillus-Stamm oder einem anderen oder verwandten Organismus kloniert werden und somit zum Beispiel eine Allel- oder Speziesvariante des Polypeptid kodierenden Bereichs der Nukleinsäuresequenz sein.
  • Die Modifikation einer Nukleinsäuresequenz der vorliegenden Erfindung kann für die Synthese von Polypeptiden, die dem Polypeptid im Wesentlichen ähnlich sind, notwendig sein. Der Begriff dem Polypeptid „im Wesentlichen ähnlich" betrifft nichtnatürlich vorkommende Formen des Polypeptids. Diese Polypeptide können sich in etwas konstruierter Weise von dem Polypeptid unterscheiden, das von seiner natürlichen Quelle isoliert wurde, z.B. Varianten, die sich in der spezifischen Aktivität, Thermostabilität, im pH-Optimum oder dergleichen unterscheiden. Die Sequenz der Variante kann auf der Basis der Nukleinsäuresequenz, die als der Polypeptid kodierende Teil von SEQ ID NR:1 dargestellt ist, z.B. eine Untersequenz davon, und/oder durch Einführung von Nukleotidsubstitutionen, die nicht zu einer anderen Aminosäuresequenz des durch die Nukleinsäuresequenz kodierten Polypeptids führen, die jedoch der Codon-Verwendung des für die Herstellung des Enzyms vorgesehenen Wirtsorganismus entsprechen, oder durch Einführung von Nukleotidsubstitutionen, die zu einer anderen Aminosäuresequenz führen, konstruiert werden. Für eine allgemeine Beschreibung einer Nukleotidsubstitution siehe z.B. Ford et al., 1991, Protein Expression and Purification 2, 95107.
  • Es wird für einen Fachmann offensichtlich sein, dass derartige Substitutionen außerhalb der Bereiche, die für die Funktion des Moleküls kritisch sind, vorgenommen werden können und dennoch zu einem aktiven Polypeptid führen. Die Aminosäurereste, die für die Aktivität des durch die isolierte Nukleinsäuresequenz der Erfindung kodierten Polypeptids wesentlich und deshalb vorzugsweise nicht Gegenstand der Substitution sind, können gemäß den auf dem Fachgebiet bekannten Verfahren, wie z.B. ortsspezifische Mutagenese oder Alanin-Durchmusterungsmutagenese (siehe z.B. Cunningham und Wells, 1989, Science 244, 1081–1085) identifiziert werden. Bei dem letzteren Verfahren werden Mutationen an jedem positiv geladenen Rest in das Molekül eingeführt und die so erhaltenen Mutantenmoleküle bezüglich der Oxalacetat-Hydrolase-Aktivität getestet, um Aminosäurereste zu identifizieren, die für die Aktivität des Moleküls kritisch sind. Die Stellen der Substrat-Enzym-Wechselwirkung können ebenso durch die Analyse der dreidimensionalen Struktur bestimmt werden, wie sie z.B. durch derartige Verfahren wie Kernspinresonanz-Analyse, Kristallographie oder Photoaffinitätsmarkierung (siehe z.B. de Vos et al., 1992, Science 255, 306–312; Smith et al., 1992, Journal of Molecular Biology 224, 899–904; Wlodaver et al., 1992, FEBS Letters 309, 59–64) bestimmt wird.
  • Verfahren zur Herstellung von Nukleinsäuresequenz-Mutanten
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ferner Verfahren zur Herstellung einer Nukleinsäuresequenz-Mutante, das das Einführen von mindestens einer Mutation in die das reife Polypeptid kodierende Sequenz von SEQ ID NR:1 oder eine Untersequenz davon umfasst, wobei die Nukleinsäuresequenz-Mutante ein Polypeptid kodiert, das aus den Aminosäuren 1 bis 341 von SEQ ID NR:2 oder einem Fragment davon mit Oxalacetat-Hydrolase-Aktivität besteht.
  • Die Einführung einer Mutation in die Nukleinsäuresequenz, um ein Nukleotid gegen ein anderes Nukleotid auszutauschen, kann durch ortsspezifische Mutagenese unter Verwenden eines beliebigen, auf dem Fachgebiet bekannten Verfahrens bewerkstelligt werden. Insbesondere verwendbar ist das Verfahren, das einen superhelikalen, doppelsträngigen DNA-Vektor mit einer Insertion von Interesse und zwei synthetische, die gewünschte Mutation enthaltende Primer verwendet. Die Oligonukleotid-Primer, die jeweils zu den gegenüberliegenden Strängen des Vektors komplementär sind, verlängern sich während des Temperaturzyklus durch die Pfu-DNA-Polymerase. Nach Einbau der Primer wird ein mutiertes Plasmid erzeugt, das versetzte Strangbrüche enthält. Im Anschluss an den Temperaturzyklus wird das Produkt mit DpnI behandelt, das für methylierte und halbmethylierte DNA spezifisch ist, um die Ausgangs-DNA-Matrize zu spalten und die Mutation enthaltende, synthetisierte DNA zu selektieren. Andere auf dem Fachgebiet bekannte Verfahren können ebenso verwendet werden.
  • Entfernung oder Verminderung der Oxalacetat-Hydrolase-Aktivität
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ebenso Verfahren zur Herstellung einer Mutantenzelle einer Ausgangszelle, die das Unterbrechen oder Entfernen einer Nukleinsäuresequenz der vorliegenden Erfindung oder einer Kontrollsequenz davon umfassen, was dazu führt, dass die Mutantenzelle weniger von dem durch die Nukleinsäuresequenz kodierten Polypeptid mit Oxalacetat-Hydrolase-Aktivität als die Ausgangszelle und somit weniger Oxalsäure herstellt, wenn sie unter denselben Bedingungen gezüchtet wird.
  • Die Konstruktion von Stämmen, die eine verminderte Herstellung der Oxalacetat-Hydrolase-Akitivität und Oxalsäure aufweisen, kann einfach durch Modifikation oder Inaktivierung einer Nukleinsäuresequenz bewerkstelligt werden, die für die Expression des Polypeptids mit Oxalacetat-Hydrolase-Aktivität in der Zelle notwendig ist. Bei der zu modifizierenden oder zu inaktivierenden Nukleinsäuresequenz kann es sich zum Beispiel um eine Nukleinsäuresequenz handeln, die ein Polypeptid oder einen Teil davon kodiert, das/der für das Ausprägen der Oxalacetat-Hydrolase-Aktivität wesentlich ist, z.B. eine Nukleinsäuresequenz der Erfindung wie in dem Abschnitt mit dem Titel „Isolierte, Polypeptide mit Oxalacetat-Hydrolase-Aktivität kodierende Nukleinsäuresequenzen" beschrieben, oder die Nukleinsäuresequenz kann eine regulatorische Funktion aufweisen, die für die Expression des Polypeptids von der kodierenden Sequenz der Nukleinsäuresequenz erforderlich ist. Ein Beispiel einer derartigen regulatorischen oder Kontrollsequenz kann eine Promoter-Sequenz oder ein funktionsfähiger Teil davon sein, d.h. ein Teil, der ausreichend ist, um die Expression des Polypeptids zu beeinflussen. Andere Kontrollsequenzen für die eventuelle Modifikation sind in diesem Abschnitt weiter beschrieben.
  • Die Modifikation oder Inaktivierung der Nukleinsäuresequenz kann durchgeführt werden, indem die Zellen der Mutagenese und der Selektion oder Durchmusterung nach Zellen, in denen die Fähigkeit zur Herstellung der Oxalacetat-Hydrolase vermindert wurde, unterzogen werden. Die Mutagenese, die spezifisch oder zufällig sein kann, kann zum Beispiel durch Verwenden eines geeigneten physikalischen oder chemischen mutagenisierenden Mittels, durch Verwenden eines geeigneten Oligonukleotids oder durch Unterziehen der DNA-Sequenz einer durch PCR erzeugten Mutagenese durchgeführt werden. Des Weiteren kann die Mutagenese durch Verwenden einer beliebigen Kombination dieser mutagenisierenden Mittel durchgeführt werden.
  • Beispiele eines physikalischen oder chemischen mutagenisierenden Mittels, das für den vorliegenden Zweck geeignet ist, schließen Ultraviolett- (UV-)Bestrahlung, Hydroxylamin, N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin (MNNG), O-Methylhydroxylamin, salpetrige Säure, Ethylmethansulfonat (EMS), Natriumbisulfit, Ameisensäure und Nukleotidanaloga ein.
  • Wenn derartige Mittel verwendet werden, wird die Mutagenese typischerweise durch Inkubieren der zu mutagenisierenden Zelle in Anwesenheit des mutagenisierenden Mittels der Wahl unter geeigneten Bedingungen und Selektieren von Zellen durchgeführt, die eine verminderte Oxalacetat-Hydrolase-Aktivität oder -Herstellung zeigen. Die verminderte oder eliminierte Oxalacetat-Hydrolase-Aktivität kann durch Verwenden des Testverfahrens bestimmt werden, das in dem Abschnitt Beispiele nachstehend beschrieben ist.
  • Die Modifikation oder Inaktivierung der Herstellung eines Polypeptids, das durch eine Nukleinsäuresequenz der vorliegenden Erfindung kodiert ist, kann durch die Einführung, Substitution oder Entfernung von einem oder mehreren Nukleotiden in der das Polypeptid kodierenden Nukleinsäuresequenz oder einem regulatorischen Element, das für deren Transkription oder Translation erforderlich ist, bewerkstelligt werden. Zum Beispiel können Nukleotide eingefügt oder entfernt werden, um zur Einführung eines Stopp-Codons, zur Entfernung des Start-Codons oder zu einer Änderung des offenen Leserahmens zu führen. Eine derartige Modifikation oder Inaktivierung kann durch ortsspezifische Mutagenese oder durch PCR erzeugte Mutagenese gemäß der im Fachgebiet bekannten Verfahren bewerkstelligt werden. Obwohl grundsätzlich die Modifikation in vivo durchgeführt werden kann, d.h. direkt in der Zelle, die die zu modifizierende Nukleinsäuresequenz exprimiert, ist es bevorzugt, dass die Modifikation in vitro wie nachstehend beispielhaft erläutert durchgeführt wird.
  • Ein Beispiel einer einfachen Weise, die Herstellung durch eine Wirtszelle der Wahl zu eliminieren oder zu vermindern, basiert auf Verfahren des Genaustauschs oder der Genstörung. Zum Beispiel wird bei dem Genstörungsverfahren eine Nukleinsäuresequenz, die dem endogenen Gen oder Genfragment von Interesse entspricht, in vitro mutagenisiert, um eine defekte Nukleinsäuresequenz herzustellen, die dann in die Wirtszelle transformiert wird, um ein defektes Gen herzustellen. Durch homologe Rekombination ersetzt die defekte Nukleinsäuresequenz das endogene Gen oder Genfragment. Es kann erwünscht sein, dass das defekte Gen oder Genfragment ebenso einen Marker kodiert, der zur Selektion von Transformanten, in denen das Polypeptid kodierende Gen modifiziert oder zerstört wurde, verwendet werden kann.
  • In einer anderen Ausführungsform kann die Modifikation oder Inaktivierung der Nukleinsäuresequenz durch etablierte Antisense-Verfahren unter Verwenden einer zur Polypeptid kodierenden Sequenz komplementären Nukleotidsequenz durchgeführt werden. Insbesondere kann die Herstellung des Polypeptids durch eine Zelle durch Einführen einer zur Polypeptid kodierenden Nukleinsäuresequenz komplementären Nukleotidsequenz, die in der Zelle transkribiert werden kann und die an die in der Zelle hergestellte Polypeptid-mRNA hybridisieren kann, vermindert oder eliminiert werden. Unter diesen Bedingungen, die es ermöglichen, dass die komplementäre Antisense-Nukleotidsequenz an die Polypeptid-mRNA hybridi siert, wird die Menge des translatierten Polypeptids somit vermindert oder eliminiert.
  • Es ist bevorzugt, dass die gemäß den Verfahren der vorliegenden Erfindung zu modifizierende Zelle mikrobiellen Ursprungs, insbesondere eine beliebige von den Spezies ist, die in dem vorstehenden Abschnitt mit dem Titel „Isolierte, Polypeptide mit Oxalacetat-Hydrolase-Aktivität kodierende Nukleinsäuresequenzen" als Quellen für die Polypeptid mit Oxalacetat-Hydrolase-Aktivität kodierende Nukleinsäuresequenz der Erfindung aufgelistet sind. Vorzugsweise handelt es sich bei der Zelle um einen Pilzstamm, der für die Herstellung gewünschter Produkte, wie z.B. Polypeptide oder primärer oder sekundärer Metabolite, die entweder homolog oder heterolog zur Zelle sind, geeignet ist. Noch stärker bevorzugt handelt es sich bei der Zelle um eine Aspergillus-Zelle, insbesondere A. niger.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ferner eine Mutantenzelle der Ausgangszelle, die eine Unterbrechung oder Deletion einer das Polypeptid kodierenden Nukleinsäuresequenz oder einer Kontrollsequenz davon umfasst, die dazu führt, dass die Mutantenzelle weniger von dem Polypeptid als die Ausgangszelle herstellt.
  • Die so erzeugten Mutantenzellen mit einem Polypeptid-Defekt sind insbesondere als Wirtszellen zur Expression homologer und/oder heterologer Expressionsprodukte verwendbar, wie z.B. homologer oder heterologer Polypeptide oder primärer oder sekundärer Metabolite. Daher betrifft die vorliegende Erfindung ferner Verfahren zur Herstellung eines homologen oder heterologen Produkts, das (a) das Züchten der Mutantenzelle unter für die Herstellung des Produkts förderlichen Bedingungen und (b) das Gewinnen des Produkts umfasst.
  • Die zur Züchtung und Reinigung des Produkts von Interesse verwendeten Verfahren können durch die auf dem Fachgebiet bekannten Verfahren, z.B. wie vorstehend im Abschnitt mit dem Titel „Herstellungsverfahren" weiter beschrieben durchgeführt werden.
  • Die Verfahren der vorliegenden Erfindung zur Herstellung eines im Wesentlichen Oxalsäure-freien Produkts sind von besonderem Interesse in der Herstellung von primären Metaboliten, insbesondere Produkten mit Lebensmittelqualität, wie z.B. Zitronensäure und anderen Säuren des Krebs-Zyklus und homologen oder heterologen Polypeptiden, insbesondere eukaryotischen Polypeptiden.
  • Bei dem Polypeptid kann es sich um ein beliebiges, zur Mutantenzelle heterologen oder homologen Polypeptid handeln. Es ist hierin nicht beabsichtigt, dass der Begriff „Polypeptid" eine bestimmte Länge des kodierten Produkts bezeichnet, und er umfasst daher Peptide, Oligopeptide und Proteine. Der Begriff „heterologes Polypeptid" ist hierin als ein Polypeptid, das für die Mutantenzelle nicht natürlich ist, ein natürliches Protein, in dem Modifikationen vorgenommen wurden, um die natürliche Sequenz zu verändern, oder ein natürliches Protein, dessen Expression als Folge einer Manipulation der Mutantenzelle durch rekombinante DNA-Verfahren quantitativ verändert ist, definiert. Die Mutantenzelle kann eine oder mehrere Kopien der Nukleinsäuresequenz enthalten, die das homologe oder heterologe Polypeptid kodiert. In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem heterologen Polypeptid um ein extrazellulär sezerniertes Polypeptid.
  • Vorzugsweise handelt es sich bei dem herzustellenden Polypeptid um ein Hormon, eine Hormonvariante, ein Enzym, einen Rezeptor oder einen Teil davon, einen Antikörper oder einen Teil davon oder einen Reporter. Das Enzym kann aus einem amylolytischen Enzym, lipolytischen Enzym, proteolytischen Enzym, cellulolytischen Enzym, einer Oxidoreduktase oder einem Pflanzenzellwand abbauenden Enzym ausgewählt sein. Beispiele derartiger Enzyme schließen eine Aminopeptidase, Amylase, Amyloglucosidase, Carbohydrase, Carboxypeptidase, Katalase, Cellulase, Chitinase, Cutinase, Cyclodextrin-Glykosyltransferase, Desoxyribonuklease, Esterase, Galactosidase, beta-Galactosidase, Glucoamylase, Glucose-Oxidase, Glucosidase, Haloperoxidase, Hemicellulase, Invertase, Isomerase, Laccase, Ligase, Lipase, Lyase, Mannosidase, Oxidase, ein pektinolytisches En zym, eine Peroxidase, Phytase, Phenol-Oxidase, Polyphenol-Oxidase, ein proteolytisches Enzym, eine Ribonuklease, Transferase, Transglutaminase oder Xylanase ein. Die Zellen mit einem Oxalacetat-Hydrolase-Defekt können auch verwendet werden, um heterologe Proteine von pharmazeutischem Interesse, wie z.B. Hormone, Wachstumsfaktoren, Rezeptoren und dergleichen zu exprimieren.
  • Die das heterologe Polypeptid kodierende Nukleinsäuresequenz, die in einer Mutantenzelle der Erfindung, insbesondere einer Fadenpilz-Mutantenzelle exprimiert werden kann, kann von einer beliebigen prokaryotischen, eukaryotischen oder anderen Quelle erhalten werden. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung soll der Begriff „erhalten von", wie er hierin in Verbindung mit einer gegebenen Quelle verwendet wird, bedeuten, dass das Polypeptid durch die Quelle oder durch eine Zelle, in die ein Gen von der Quelle eingefügt wurde, hergestellt wird.
  • In den Verfahren der vorliegenden Erfindung kann die Mutantenzelle, insbesondere eine Mutanten-Fadenpilzzelle auch zur rekombinanten Herstellung von Polypeptiden oder anderen Produkten, wie z.B. primären und sekundären Metaboliten, die für die Zelle natürlich (oder „homolog") sind, verwendet werden.
  • Die verwendeten Verfahren, um eine ein heterologes Polypeptid kodierende Nukleinsäuresequenz zu isolieren oder zu klonieren, sind auf dem Fachgebiet bekannt und schließen die Isolierung aus genomischer DNA, die Präparation aus cDNA oder eine Kombination davon ein.
  • Die Klonierung der Nukleinsäuresequenz von derartiger genomischer DNA kann z.B. durch Verwenden der bekannten Polymerasekettenreaktion (PCR) bewerkstelligt werden. Siehe zum Beispiel Innis et al., 1990, PCR Protocols: A Guide to Methods and Application, Academic Press, New York. Die Klonierungsverfahren können das Ausschneiden und die Isolierung eines gewünschten Nukleinsäurefragments einschließen und umfassen die Polypeptid kodierende Nukleinsäuresequenz, die Insertion des Fragments in ein Vektormolekül und die Aufnahme des rekombinanten Vektors in die Mutantenzelle, wo mehrfache Kopien oder Klone der Nukleinsäuresequenz repliziert werden. Bei der Nukleinsäuresequenz kann es sich um einen genomischen, cDNA-, RNA-, halbsynthetischen, synthetischen Ursprung oder beliebige Kombinationen davon handeln.
  • Bei den Verfahren der vorliegenden Erfindung können heterologe Polypeptide ebenso fusionierte oder Hybridpolypeptide einschließen, bei denen ein anderes Polypeptid an den N-Terminus oder C-Terminus des Polypeptids oder ein Fragment davon fusioniert ist. Ein fusioniertes Polypeptid wird durch Fusionieren einer ein Polypeptid kodierenden Nukleinsäuresequenz (oder ein Teil davon) an eine ein anderes Polypeptid kodierende Nukleinsäure (oder ein Teil davon) hergestellt. Die Verfahren zur Herstellung von Fusionspolypeptiden sind auf dem Fachgebiet bekannt und schließen das Ligieren der kodierenden, die Polypeptide kodierenden Sequenzen ein, so dass sie sich im Leserahmen befinden und die Expression des fusionierten Polypeptids unter der Kontrolle desselben (derselben) Promoters (Promotoren) und desselben Terminators steht. Die Hybridpolypeptide können eine Kombination von Teil- oder kompletten Polypeptidsequenzen umfassen, die aus mindestens zwei verschiedenen Polypeptiden erhalten wurden, wobei eines oder mehrere zur Mutantenzelle heterolog sind.
  • Eine isolierte Nukleinsäuresequenz, die ein heterologes Polypeptid von Interesse kodiert, kann in vielfältiger Weise manipuliert werden, um sie zur Expression des Polypeptids bereitzustellen. Die Expression wird selbstverständlich einen beliebigen, in die Herstellung des Polypeptids einbezogenen Schritt einschließen, einschließlich der Transkription, posttranskriptionalen Modifikation, Translation, posttranslationalen Modifikation und Sekretion, ist jedoch nicht darauf beschränkt. Die Manipulation der Nukleinsäuresequenz vor ihrer Insertion in einen Vektor kann abhängig vom Expressionsvektor erwünscht oder notwendig sein. Die Verfahren zur Modifizierung von Nukleinsäuresequenzen unter Verwendung von Klonierungsverfahren sind auf dem Fachgebiet bekannt.
  • Das „Nukleinsäurekonstrukt" ist hierin als ein entweder einzel- oder doppelsträngiges Nukleinsäuremolekül definiert, das von einem natürlich vorkommenden Gen isoliert oder modifiziert wurde, so dass sie Nukleinsäuresegmente enthält, die in einer Weise kombiniert und aneinander gesetzt sind, die in der Natur sonst nicht existieren würde. Der Begriff Nukleinsäurekonstrukt ist mit dem Begriff Expressionskassette gleichbedeutend, wenn das Nukleinsäurekonstrukt alle Kontrollsequenzen enthält, die für die Expression einer kodierenden Sequenz erforderlich sind. Bei dem Begriff „kodierende Sequenz" wie hierin definiert handelt es sich um eine Sequenz, die in mRNA transkribiert und in ein Polypeptid translatiert wird. Die Grenzen der kodierenden Sequenz sind im Allgemeinen durch das ATG-Startcodon, das sich unmittelbar stromaufwärts des offenen Leserahmens am 5'-Ende der mRNA befindet, und eine Transkriptionsterminatorsequenz, die sich unmittelbar stromabwärts des offenen Leserahmens am 3'-Ende der mRNA befindet, festgelegt. Eine kodierende Sequenz kann genomische DNA, cDNA, RNA, semisynthetische, synthetische, rekombinante DNA oder beliebige Kombinationen davon einschließen, ist aber nicht darauf beschränkt. Bei der kodierenden Sequenz des hierin beschriebenen Nukleinsäurekonstrukts kann es sich um die Nukleotidsequenz der Erfindung handeln, die ein Polypeptid mit Oxalacetat-Hydrolase-Aktivität (wie in dem vorstehenden Abschnitt mit dem Titel „Isolierte, Polypeptide mit Oxalacetat-Hydrolase-Aktivität kodierende Nukleinsäuresequenzen" definiert) kodiert, wobei in diesem Fall das Nukleinsäurekonstrukt zur Herstellung eines Polypeptids mit Oxalacetat-Hydrolase-Aktivität wie in dem Abschnitt definiert oder für eine andere, die Nukleinsäuresequenz einbeziehende Manipulation verwendet wird, oder bei der kodierenden Sequenz kann es sich um eine kodierende Sequenz handeln, die ein heterologes, in einer Mutantenzelle der Erfindung herzustellendes Polypeptid handeln.
  • Der Begriff „Kontrollsequenzen" ist hierin so definiert, dass der alle Komponenten einschließt, die für die Expression eines heterologen Polypeptids notwendig oder vorteilhaft sind. Jede Kontrollsequenz kann für die Polypeptid kodierende Nukleinsäuresequenz natürlich oder fremd sein. Derartige Kontrollsequenzen schließen einen Leader, eine Polyadenylierungssequenz, eine Propeptidsequenz, einen Promoter, eine Signalpeptidsequenz und einen Transkriptionsterminator ein, sind aber nicht darauf beschränkt. Mindestens schließen die Kontrollsequenzen einen Promoter und Transkriptions- und Translationsstoppsignale ein. Die Kontrollsequenzen können mit Linkern für den Zweck des Einführens bestimmter Restriktionsstellen, die die Ligation der Kontrollsequenzen mit dem kodierenden Bereich der ein heterologes Polypeptid kodierenden Nukleinsäuresequenz erleichtern, bereitgestellt sein. Der Begriff „funktionsfähig verbunden" ist hierin definiert als eine Anordnung, bei der eine Kontrollsequenz an eine Position bezüglich der kodierenden Sequenz der DNA-Sequenz in geeigneter Weise gesetzt wird, derart dass die Kontrollsequenz die Herstellung eines heterologen Polypeptids steuert.
  • Bei der Kontrollsequenz kann es sich um eine geeignete Promoter-Sequenz, eine Nukleinsäuresequenz handeln, die von einer Zelle, insbesondere einer Fadenpilzzelle zur die Expression der Nukleinsäuresequenz erkannt wird. Die Promoter-Sequenz enthält Transkriptionskontrollsequenzen, die die Expression des heterologen Polypeptids vermitteln. Bei dem Promoter kann es sich um eine beliebige Nukleinsäuresequenz handeln, die eine Transkriptionsaktivität in der Zelle zeigt, einschließlich mutanter, verkürzter oder Hybridpromotoren, und kann von Genen erhalten werden, die extrazelluläre oder intrazelluläre Polypeptide kodieren, die entweder homolog oder heterolog zur Zelle sind.
  • Beispiele geeigneter Promotoren zur Steuerung der Transkription der Nukleinsäurekonstrukte in einer Fadenpilzzelle in den Verfahren der vorliegenden Erfindung sind Promotoren, die von den Genen erhalten werden, die die TAKA-Amylase von Aspergillus oryzae, die Aspartat-Proteinase von Rhizomucor miehei, die neutrale alpha-Amylase von Aspergillus niger, die säurestabile alpha-Amylase von Aspergillus niger, die Glucoamylase von Aspergillus niger oder Aspergillus awamori (glaA), die Lipase von Rhizomucor miehei, die alkalische Protease von Aspergillus oryzae, die Triosephosphat-Isomerase von Aspergillus oryzae, die Acetamidase von Aspergillus nidulans, die Acetamidase von Aspergillus oryzae (amdS), die Trypsin-ähnliche Protease von Fusarium oxysporum (U.S.-Patent-Nr. 4,288,627) kodieren, und mutante, verkürzte und Hybridpromotoren davon. Bei den besonders bevorzugten Promotoren handelt es sich um die NA2-tpi- (ein Hybrid der Promotoren von den Genen, die die neutrale alpha-Amylase von Aspergillus niger und die Triosephosphat-Isomerase von Aspergillus oryzae kodieren), Glucoamlyase- und TAKA-Amylase-Promotoren.
  • Bei der Kontrollsequenz kann es sich ebenso um eine geeignete Transkriptionsterminatorsequenz, eine Sequenz handeln, die von der fraglichen Wirtszelle erkannt wird, um die Transkription zu beenden. Die Terminatorsequenz ist mit dem 3'-Ende der das heterologe Polypeptid kodierenden Nukleinsäuresequenz funktionsfähig verbunden. Es kann ein beliebiger Terminator, der in der Wirtszelle funktionsfähig ist, in der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
  • Bevorzugte, in den Fadenpilzzellen funktionsfähige Terminatoren werden von den Genen erhalten, die die TAKA-Amylase von Aspergillus oryzae, die Glucoamylase von Aspergillus niger, die Anthranilat-Synthetase von Aspergillus nidulans, die alpha-Glucosidase von Aspergillus niger und die Trypsin-ähnliche Protease von Fusarium oxysporum kodieren.
  • Bei der Kontrollsequenz kann es sich ebenso um eine geeignete Leader-Sequenz, einen nicht translatierten Bereich einer mRNA handeln, der für die Translation durch die Zelle bedeutend ist. Die Leader-Sequenz ist mit dem 5'-Ende der das heterologe Polypeptid kodierenden Nukleinsäuresequenz funktionsfähig verbunden. Es kann eine beliebige Leader-Sequenz, die in der Zelle funktionsfähig ist, in der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
  • Bevorzugte Leader werden von den Genen erhalten, die die TAKA-Amylase von Aspergillus oryzae und die Triosephosphat-Isomerase von Aspergillus nidulans kodieren.
  • Bei der Kontrollsequenz kann es sich ebenso um eine Polyadenylierungssequenz handeln, eine Sequenz, die mit dem 3'-Ende der Nukleinsäuresequenz funktionsfähig verbunden ist und die, wenn sie transkribiert wird, von einer Zelle als Signal zum Anhängen von Polyadenosin-Resten an die transkribierte mRNA erkannt wird. Es kann eine beliebige Polyadenylierungssequenz, die in der Zelle funktionsfähig ist, in der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
  • Bevorzugte, in den Fadenpilzzellen funktionsfähige Polyadenylierungssequenzen werden von den Genen erhalten, die die TAKA-Amylase von Aspergillus oryzae, die Glucoamylase von Aspergillus niger, die Anthranilat-Synthase von Aspergillus nidulans und die alpha-Glucosidase von Aspergillus niger kodieren.
  • Bei der Kontrollsequenz kann es sich ebenso um einen Signalpeptid kodierenden Bereich handeln, der eine Aminosäuresequenz kodiert, die mit dem Aminoende des heterologen Polypeptids verbunden ist und das kodierte Polypeptid in den Sekretionsweg der Zelle leitet. Das 5'-Ende der kodierenden Sequenz der Nukleinsäuresequenz kann von Natur aus einen Signalpeptid kodierenden Bereich enthalten, der natürlicherweise im Translationsleserahmen mit dem Segment des kodierenden Bereichs, der das sezernierte Polypeptid kodiert, verbunden ist. In einer anderen Ausführungsform kann das 5'-Ende der kodierenden Sequenz einen Signalpeptid kodierenden Bereich enthalten, der für die kodierende Sequenz fremd ist. Der das fremde Signalpeptid kodierende Bereich kann erforderlich sein, wo die kodierende Sequenz natürlicherweise keinen Signalpeptid kodierenden Bereich enthält. In einer anderen Ausführungsform kann der das fremde Signalpeptid kodierende Bereich einfach den das natürliche Signalpeptid kodierenden Bereich ersetzen, um die Sekretion des Polypeptids zu steigern. Der Signalpeptid kodierende Bereich kann von einem Glucoamylase- oder Amylase-Gen von einer Aspergillus-Spezies oder einem Lipase- oder Proteinase-Gen von einer Rhizomucor-Spezies erhalten werden. Jedoch kann ein beliebiger Signalpeptid kodierender Bereich, der das exprimierte heterologe Polypeptid in den Sekretionsweg einer Zelle leitet, in der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
  • Bei einem kodierenden Bereich eines wirksamen Signalpeptids in einer Fadenpilzzelle handelt es sich um den Signalpeptid kodierenden Bereich, der von den Genen erhalten wird, die die TAKA-Amylase von Aspergillus oryzae, die neutrale Amylase von Aspergillus niger, die Aspartat-Proteinase von Rhizomucor miehei und die Cellulase von Humicola lanuginosa kodieren.
  • Bei der Kontrollsequenz kann es sich ebenso um einen Propeptid kodierenden Bereich handeln, der die am Aminoende eines Polypeptids positionierte Aminosäuresequenz kodiert. Das resultierende Polypeptid ist als Proenzym oder Propolypeptid (oder Zymogen in manchen Fällen) bekannt. Ein Propolypeptid ist im Allgemeinen inaktiv und kann in ein reifes aktives Polypeptid durch katalytische oder autokatalytische Abspaltung des Propeptids vom Propolypeptid umgewandelt werden. Der Propeptid kodierende Bereich kann von den Genen erhalten werden, die die Aspartat-Proteinase von Rhizomucor miehei und die Laccase von Myceliophthora thermophila (WO 95/33836) kodieren.
  • Wenn sowohl Signalpeptid- als auch Propeptidbereiche am Aminoende eines Polypeptids vorliegen, ist der Propeptidbereich neben dem Aminoende des Polypeptids und der Signalpeptidbereich neben dem Aminoende des Propeptidbereichs positioniert.
  • Die Nukleinsäurekonstrukte können ebenso ein oder mehrere Nukleinsäuresequenzen umfassen, die ein oder mehrere Faktoren kodieren, die für die Steuerung der Expression heterologer Polypeptide vorteilhaft sind, z.B. ein Transkriptionsaktivator (z.B. ein in trans wirkender Faktor), ein Chaperon und eine verarbeitende Protease. Es kann ein beliebiger Faktor, der in der Wirtszelle, insbesondere in einer Fadenpilzzelle funktionsfähig ist, in der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Die Nukleinsäuren, die einen oder mehrere dieser Faktoren kodieren, befinden sich nicht notwendigerweise in Reihe mit der das heterologe Polypeptid kodierenden Nukleinsäuresequenz.
  • Es kann ebenso erwünscht sein, regulatorische Sequenzen hinzuzufügen, die die Regulation der Expression des heterologen Polypeptids bezüglich des Zellwachstums ermöglichen. Beispiele regulatorischer Systeme sind jene, die die Expression des an- oder abzuschaltenden Gens als Antwort auf einen chemischen oder physikalischen Reiz einschließlich der Anwesenheit einer regulatorischen Verbindung veranlassen. Der TAKA-alpha-Amylase-Promoter, der Glucoamylase-Promoter von Aspergillus niger und der Glucoamylase-Promoter von Aspergillus oryzae können als regulatorische Sequenzen in Fadenpilzzellen verwendet werden. Andere Beispiele regulatorischer Sequenzen sind jene, die die Genamplifikation ermöglichen, z.B. die Metallothionein-Gene ein, die mit Schwermetallen amplifiziert werden. In diesen Fällen wäre die das heterologe Polypeptid kodierende Nukleinsäuresequenz mit der regulatorischen Sequenz funktionsfähig verbunden.
  • Die verschiedenen, vorstehend beschriebenen Nukleinsäure- und Kontrollsequenzen können zusammengefügt werden, um einen rekombinanten Expressionsvektor herzustellen, der eine oder mehrere günstige Restriktionsstellen einschließt, die die Insertion oder Substitution der das heterologe Polypeptid kodierenden Nukleinsäuresequenz an derartigen Stellen zu ermöglichen. In einer anderen Ausführungsform kann die das heterologe Polypeptid kodierende Nukleinsäuresequenz durch Insertion der Sequenz oder eines die Sequenz umfassenden Nukleinsäurekonstrukts in einen geeigneten Vektor zur Expression exprimiert werden. Durch Erzeugen des Expressionsvektors ist die kodierende Sequenz im Vektor so lokalisiert, dass die kodierende Sequenz funktionsfähig mit den geeigneten Kontrollsequenzen zur Expression und möglicherweise Sekretion verbunden ist.
  • Bei dem rekombinanten Expressionsvektor kann es sich um einen beliebigen Vektor (z.B. ein Plasmid oder Virus) handeln, der in einfacher Weise den rekombinanten DNA-Verfahren unterzogen werden kann und der die Expression der das heterologe Polypeptid kodierenden Nukleinsäuresequenz bewirken kann. Die Wahl des Vektors wird typischerweise von der Verträglichkeit des Vektors mit der Zelle, in die der Vektor eingeführt werden soll, abhängen. Bei dem Vektor kann es sich um ein lineares oder geschlossenes zirkuläres Plasmid handeln. Bei dem Vektor kann es sich um einen selbstständig replizierenden Vektor handeln, d.h. einen Vektor, der als eine extrachromosomale Einheit vorliegt, deren Replikation von der chromosomalen Replikation unabhängig ist, z.B. ein Plasmid, ein extrachromosomales Element, ein Minichromosom oder ein künstliches Chromosom. Der Vektor kann beliebige Einrichtungen enthalten, um die Selbstreplikation sicherzustellen. In einer anderen Ausführungsform kann es sich bei dem Vektor um einen Vektor handeln, der nach Einführung in die Zelle in das Genom integriert und zusammen mit dem (den) Chromosom(en), in das (die) er integriert wurde, repliziert wird. Bei dem Vektorsystem kann es sich um einen/ein einzelnen/s Vektor oder Plasmid oder zwei oder mehrere Vektoren oder Plasmide, die zusammen die gesamte, in das Genom der Zelle einzuführende DNA enthalten, oder ein Transposon handeln.
  • Der Vektor enthält vorzugsweise einen oder mehrere selektierbare Marker, die eine einfache Selektion der transformierten Zellen ermöglichen. Bei einem selektierbaren Marker handelt es sich um ein Gen, dessen Produkt Biozid- oder virale Resistenz, Resistenz gegen Schwermetalle, Prototrophie für Auxotrophe, und dergleichen bereitstellt. Ein selektierbarer Marker zur Verwendung in einer Fadenpilz-Wirtszelle kann aus der Gruppe ausgewählt sein, die amdS (Acetamidase), argB (Ornithin-Carbamoyltransferase), bar (Phosphinothricin-Acetyltransferase), hygB (Hygromycin-Phosphotransferase), niaD (Nitrat-Reduktase), pyrG (Orotidin-5'-phosphat-Decarboxylase), sC (Sulfat-Adenyltransferase) und trpC (Anthranilat-Synthase) sowie Pendants davon einschließt, ist aber nicht darauf beschränkt. Zur Verwendung in einer Fadenpilzzelle bevorzugt sind die amdS- und pyrG-Gene von Aspergillus nidulans oder Aspergillus oryzea und das bar-Gen von Streptomyces hygroscopicus.
  • Der Vektor enthält vorzugsweise ein Element(e), das (die) eine stabile Integration des Vektors in ein Zellgenom oder eine selbstständige Replikation des Vektors in der Zelle unabhängig vom Zellgenom ermöglicht (ermöglichen).
  • Die „Einführung" bedeutet das Einführen eines die Nukleinsäuresequenz umfassenden Vektors in eine Zelle, so dass der Vektor als ein chromosomaler Bestandteil oder als ein selbstreplizierender extrachromosomaler Vektor aufrechterhalten wird. Die Integration gilt im Allgemeinen als ein Vorteil, da die Nukleinsäuresequenz eher stabil in der Zelle aufrechterhalten wird. Die Integration des Vektors in das Chromosom erfolgt durch homologe Rekombination, nicht homologe Rekombination oder Transposition.
  • Die Einführung eines Expressionsvektor in eine Zelle kann ein Verfahren umfassen, das aus der Protoplastenbildung, der Transformation der Protoplasten und der Regeneration der Zellwand in einer an sich bekannten Weise besteht. Geeignete Verfahren zur Transformation von Aspergillus-Wirtszellen sind in EP 238 023 und Yelton et al., 1984, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 81, 1470–1474, beschrieben. Ein geeignetes Verfahren zur Transformation von Fusarium-Spezies ist von Malardier et al., 1989, Gene 78, 147–156, oder in WO 96/00787 beschrieben.
  • Zur Integration in das Genom einer Zelle kann der Vektor auf die das heterologe Polypeptid kodierende Nukleinsäuresequenz oder ein beliebiges anderes Element des Vektors zur stabilen Integration des Vektors ins Genom durch homologe oder nicht homologe Rekombination angewiesen sein. In einer anderen Ausführungsform kann der Vektor zusätzliche Nukleinsäuresequenzen zur Steuerung der Integration durch homologe Rekombination ins Genom der Zelle enthalten. Die zusätzlichen Nukleinsäuresequenzen ermöglichen, dass der Vektor ins Genom an einer bestimmten Stelle(n) in dem (den) Chromosom(en) integriert wird. Um die Wahrscheinlichkeit der Integration an einer bestimmten Stelle zu erhöhen, sollten die Integrationselemente vorzugsweise eine ausreichende Anzahl von Nukleinsäu ren enthalten, z.B. 100 bis 1500 Basenpaare, vorzugsweise 400 bis 1500 Basenpaare und am stärksten bevorzugt 800 bis 1500 Basenpaare, die mit der entsprechenden Zielsequenz hochgradig homolog sind, um die Wahrscheinlichkeit der homologen Rekombination zu steigern. Bei den Integrationselementen kann es sich um beliebige Sequenzen handeln, die mit der Zielsequenz im Zellgenom homolog sind. Des Weiteren kann es sich bei den Integrationselementen um nicht kodierende oder kodierende Nukleinsäuresequenzen handeln. Andererseits kann der Vektor ins Zellgenom durch nicht homologe Rekombination integriert werden.
  • Für die selbstständige Replikation kann der Vektor ferner einen Ursprungspunkt der Replikation umfassen, der es ermöglicht, dass der Vektor selbstständig in der fraglichen Fadenpilzzelle repliziert.
  • Es wird selbstverständlich sein, dass die Verfahren der vorliegenden Erfindung nicht auf eine bestimmte Reihenfolge beschränkt sind, um die Mutantenzelle zu erhalten. Die Modifikation eines Gens, die in die Herstellung eines Polypeptids mit Oxalacetat-Hydrolase-Aktivität einbezogen ist, kann in die Ausgangszelle an einem beliebigen Schritt in der Konstruktion der Zelle zur Herstellung eines heterologen Polypeptids eingeführt werden. Es ist bevorzugt, dass die Zelle vor der Einführung eines ein heterologes Polypeptid kodierenden Gens mit einem Oxalacetat-Hydrolase-Defekt unter Verwendung der Verfahren der vorliegenden Erfindung versehen wurde.
  • Die zur Ligation der hierin beschriebenen Elemente verwendeten Verfahren, um die rkombinaten Expressionsvektoren zu konstruieren, sind einem Fachmann bekannt (siehe z.B. Sambrook, J., Fritsch, E. F. und Maniatis, T., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbor, New York).
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ebenso Verfahren zum Erhalten von Mutantenzellen mit einem Oxalacetat-Hydrolase-Defekt, insbesondere Fadenpilz- Mutantenzellen, umfassend (a) das Einführen einer ersten Nukleinsäuresequenz, die eine Modifikation von mindestens einem der Gene umfasst, die an der Herstellung einer Oxalacetat-Hydrolase beteiligt sind, in eine Ausgangszelle, insbesondere eine Fadenpilz-Ausgangszelle, und einer zweiten, ein heterologes Polypeptid kodierenden Nukleinsäuresequenz, und (b) das Identifizieren der Mutante von Schritt (a), die die modifizierte Nukleinsäuresequenz umfasst, wobei die Mutantenzelle weniger Oxalacetat-Hydrolase als die Ausgangszelle der Mutantenzelle herstellt, wenn sie unter denselben Bedingungen gezüchtet wird.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ebenso Mutanten von Zellen mit einem Oxalacetat-Hydrolase-Defekt, insbesondere Fadenpilzzellen, zur Herstellung eines heterologen Polypeptids, die eine erste Nukleinsäuresequenz, welche eine Modifikation von mindestens einem der Gene umfasst, die an der Herstellung eines Polypeptids mit Oxalacetat-Hydrolase-Aktivität beteiligt sind, und eine zweite, das heterologe Polypeptid kodierende Nukleinsäuresequenz umfassen, wobei die Mutante weniger Polypeptid mit Oxalacetat-Hydrolase-Aktivität als die Ausgangszelle der Mutantenzelle herstellt, wenn sie unter denselben Bedingungen gezüchtet wird.
  • In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann die Mutantenzelle zusätzlich Modifikationen einer oder mehrerer Nukleinsäuresequenzen enthalten, die Proteine kodieren, welche für die Herstellung, Gewinnung und/oder Anwendung des gewünschten Produkts, wie z.B. des heterologen Polypeptids von Interesse nachteilig sind. Die Modifikation vermindert oder eliminiert die Expression von einer oder mehreren dritten Nukleinsäuresequenzen, was zu einer Mutantenzelle mit einer modifizierten dritten Nukleinsäuresequenz führt, die mehr heterologes Polypeptid als die Mutantenzelle ohne Modifikation der dritten Nukleinsäuresequenz herstellen kann, wenn sie unter denselben Bedingungen gezüchtet wird. Die dritte Nukleinsäuresequenz kann ein beliebiges Protein oder Enzym kodieren. Zum Beispiel kann es sich bei dem Enzym um eine Aminopeptidase, Amylase, Carbohydrase, Carboxypeptidase, Katalase, Cellulase, Chitinase, Cutinase, Cyclodextrin-Glycosyltransferase, Desoxyribonuklease, Esterase, alpha- Galactosidase, beta-Galactosidase, Glucoamylase, alpha-Glucosidase, beta-Glucosidase, Invertase, Laccase, Lipase, Mannosidase, Mutanase, Oxidase, ein pektinolytisches Enzym, eine Peroxidase, Phospholipase, Phytase, Polyphenol-Oxidase, ein proteolytisches Enzym, eine Ribonuklease, Transglutaminase und Xylanase handeln. Die dritte Nukleinsäuresequenz kodiert vorzugsweise ein proteolytisches Enzym, z.B. eine Aminopeptidase, eine Carboxypeptidase oder eine Protease.
  • In einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Proteinprodukt, das im Wesentlichen frei von Oxalacetat-Hydrolase-Aktivität ist und das durch ein Verfahren der vorliegenden Erfindung hergestellt wird.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ebenso Nukleinsäurekonstrukte, rekombinante Expressionsvektoren und Wirtszellen, die die Nukleinsäuresequenz von SEQ ID NR:1, Untersequenzen oder Homologe davon (wie in dem Abschnitt mit dem Titel „Isolierte, Polypeptide mit Oxalacetat-Hydrolase-Aktivität kodierende Nukleinsäuresequenzen" beschrieben) enthalten, zur Expression der Sequenzen. Die Konstrukte und Vektoren können wie hierin beschrieben konstruiert werden. Bei der Wirtszelle kann es sich um eine beliebige, für die Expression der Nukleinsäuresequenz geeignete Zelle handeln, insbesondere eine beliebige der Zellen, die in dem Abschnitt mit dem Titel „Isolierte, Polypeptide mit Oxalacetat-Hydrolase-Aktivität kodierende Nukleinsäuresequenzen" als Quelle für die Nukleinsäuresequenzen der Erfindung erwähnt sind. Insbesondere kann es sich bei der Wirtszelle um eine Fadenpilzzelle handeln, z.B. eine Aspergillus- Zelle, wie A. niger oder A. oryzae, oder eine Fusarium-Zelle.
  • Pilzzellen können durch ein Verfahren transformiert werden, das die Protoplastenbildung, die Transformation der Protoplasten und die Regeneration der Zellwand in einer an sich bekannten Weise umfasst. Geeignete Verfahren zur Transformation von Aspergillus-Wirtszellen sind in EP 238 023 und Yelton et al., 1984, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 81, 1470–1474, beschrieben. Geeignete Verfahren zur Transformation von Fusarium-Spezies sind von Malardier et al., 1989, Gene 78, 147–156, und in WO 96/00787 beschrieben. Hefen können durch Verwenden der Verfahren, die von Becker und Guarente, in Abelson, J. N. und Simon, M. I., Hrsg., Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, Band 194, S. 182–187, Academic Press, Inc., New York; Ito et al., 1983, Journal of Bacteriology 153, 163; und Hinnen et al., 1978, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75, 1920, beschrieben wurden, transformiert werden.
  • Herstellungsverfahren
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ebenso Verfahren zur Herstellung eines durch eine Nukleotidsequenz der Erfindung kodierten Polypeptids, die (a) das Züchten der Wirtszelle, die eine Nukleotidsequenz der Erfindung trägt, unter für die Herstellung des Polypeptids geeigneten Bedingungen und (b) das Gewinnen des Polypeptids umfassen.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ebenso Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids der vorliegenden Erfindung, umfassend (a) das Züchten der Wirtszelle unter für die Herstellung des Polypeptids förderlichen Bedingungen, wobei die Wirtszelle eine Nukleinsäuresequenzvariante mit mindestens einer Mutation in dem das reife Polypeptid kodierenden Bereich von SEQ ID NR:1 umfasst, wobei die Nukleinsäuresequenzvariante ein aus den Aminosäuren 1 bis 341 von SEQ ID NR:2 bestehendes Polypeptid kodiert, und (b) das Gewinnen des Polypeptids.
  • Bei den Herstellungsverfahren der vorliegenden Erfindung werden die Zellen in einem Nährmedium gezüchtet, das für die Herstellung des Polypeptids unter Verwendung von auf dem Fachgebiet bekannten Verfahren geeignet ist. Zum Beispiel kann die Zelle durch eine Schüttelkolbenzüchtung, eine Fermentation im Klein- oder Großmaßstab (einschließlich kontinuierlicher, Chargen-, Zulauf- oder Festbett-Fermentationen) in Labor- oder Industriefermentern gezüchtet werden, die in einem geeigneten Medium und unter Bedingungen durchgeführt werden, die es ermöglichen, das Polypeptid zu exprimieren und/oder zu isolieren. Die Züchtung erfolgt in einem geeigneten Nährmedium, das Kohlenstoff- und Stickstoffquellen und anorganische Salze umfasst, unter Verwendung von auf dem Fachgebiet bekannten Verfahren. Geeignete Medien sind im Handel erhältlich oder können gemäß den veröffentlichten Zusammensetzungen (z.B. in Katalogen der American Type Culture Collection) präpariert werden. Wenn das Polypeptid in das Nährmedium sezerniert wird, kann das Polypeptid direkt aus dem Medium gewonnen werden. Wenn das Polypeptid nicht sezerniert wird, kann es aus Zelllysaten gewonnen werden.
  • Die Polypeptide können unter Verwendung von auf dem Fachgebiet bekannten Verfahren, die für die Polypeptide spezifisch sind, nachgewiesen werden. Diese Nachweisverfahren können die Verwendung spezifischer Antikörper, die Bildung eines Enzymprodukts oder das Verschwinden eines Enzymsubstrats einschließen. Zum Beispiel kann ein Enzymtestverfahren verwendet werden, um die Aktivität des Polypeptids wie hierin beschrieben zu bestimmen.
  • Das so erhaltene Polypeptid kann durch auf dem Fachgebiet bekannte Verfahren gewonnen werden. Zum Beispiel kann das Polypeptid aus dem Nährmedium durch herkömmliche Verfahren gewonnen werden, einschließlich der Zentrifugation, Filtration, Extraktion, Sprühtrocknung, Verdampfung oder Ausfällung, ist jedoch nicht darauf beschränkt.
  • Die Polypeptide können durch eine Vielfalt auf dem Fachgebiet bekannter Verfahren, einschließlich der Chromatographie (z.B. Ionenaustausch-, Affinitäts-, hydrophobe, Chromatofokussierung und Größenausschluss-), elektrophoretischer Verfahren (z.B. präparative isoelektrische Fokussierung), differenzieller Löslichkeit (z.B. Ammoniumsulfatfällung), SDS-PAGE oder Extraktion (siehe z.B. Protein Purification, Janson, J.-C., und Ryden, Lars, Hrsg., VCH Publishers, New York, 1989), gereinigt werden, sind jedoch nicht darauf beschränkt.
  • Verwendungen
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ebenso Verfahren zur Verwendung von Polypeptiden mit Oxalacetat-Hydrolase-Aktivität.
  • Die Polypeptide der vorliegenden Erfindung können zum Nachweis von Oxalsäure in Nahrungsmitteln und anderen Produkten verwendet werden.
  • Die Nukleotidsequenzen der vorliegenden Erfindung können zur Modifikation der Herstellung der Oxalacetat-Hydrolase und somit der Oxalsäure durch eine Zelle, wie z.B. eine mikrobielle Zelle, die normalerweise die Hydrolase herstellt, verwendet werden. Insbesondere können die Nukleotidsequenzen dazu verwendet werden, die Herstellung der Oxalacetat-Hydrolase und somit der Oxalsäure durch die fragliche Zelle zu reduzieren oder zu eliminieren.
  • Die vorliegende Erfindung ist durch die folgenden Beispiele weiter beschrieben, die nicht als Begrenzung des Umfangs der Erfindung ausgelegt werden sollten.
  • Beispiele
  • Bei den als Puffer und Substrate verwendeten Chemikalien handelte es sich um Handelsprodukte von mindestens Reagenzqualität.
  • Stämme:
    • Aspergillus niger BO1 (DSM 12665)
    • Escherichia coli DH5α, Woodcock, D. M. et al. (1989), Nucleic Acids Res. 17, 3469–3478
  • Medien und Testverfahren:
    • Puffer A: 50 mM Tris/HCl, pH 7,5, 2 mM MnCl2, 20 mM DTT, 5% Sucrose.
    • Oxalacetat-Hydrolase-Aktivität-Testverfahren: 1000 ml 0,1 M MOPS, pH 7,5, 2 mM MnCl2, 25 ml 40 mM Oxalacetat, 5 auf 100 ml Probe. Die Absorption wurde bei 255 nm gemessen. Die Aktivität wurde aus der Geschwindigkeit der Absorptionsabnahme und dem Absorptionskoeffizienten von Oxalacetat (1,1 mM–1 cm–1, Lenz et al., Partial purification and some properties of oxalacetase from Aspergillus niger. 1976, Eur. J. Biochem. 65, 225–236) bestimmt. Das Testverfahren wurde bei 30°C durchgeführt.
    • Protein-Testverfahren: Die Proteinkonzentrationen wurden durch Verwenden des „BioRad Protein Assays" von BioRad (Hercules, CA, USA), Kat.-Nr. 55-0006, nach den Herstellerangaben und mit Rinderserumalbumin als Standard gemessen.
  • Beispiel 1
  • Reinigung der Oxalacetat-Hydrolase (EC 3.7.1.1)
  • Aspergillus niger BO1 wurde in Schüttelkolben bei 30°C in folgendem Medium fermentiert: Sucrose 20 g/l, NaNO3 15 g/l, KH2PO4 1,5 g/l, MgSO4·7 H2O 1 g/l, NaCl 1 g/l, CaCl2·2 H2O 0,1 g/l, Spuren(elemente)-Lösung 0,5 ml/l. Spuren(elemente)-Lösung: ZnSO4·7 H2O 14,3 g/l, CuSO4·5 H2O 2,5 g/l, NiCl2·6 H2O 0,5 g/l, FeSO4·7 H2O 13,8 g/l, MnCl2 6 g/l. Der pH-Wert lag bei 2,5 bis eine Biomassenkonzentration von etwa 0,5 g/l erreicht wurde. Dann wurde der pH-Wert auf 6 durch Zugabe von 2 M NaOH verschoben und die Zellen wurden gezüchtet bis die Biomassenkonzentration etwa 5 g/l erreichte. Die Zellen wurden durch Filtration geerntet, mit 0,9%igem (Gew./Vol.) NaCl gewaschen und dann in flüssigem Stickstoff eingefroren. Die eingefrorenen Zellen wurden in einem Mörser unter flüssigem Stickstoff aufgebrochen und dann in Puffer A suspendiert. Die Suspension wurde zentrifugiert (15 Min., 40,000 × g, 4°C) und der Überstand iso liert. Ammoniumsulfat wurde bis zur 45%igen Sättigung (277 g/l) zugesetzt und die gebildete Suspension zentrifugiert (15 Min., 40,000 × g, 4°C) und der Überstand verworfen. Der Niederschlag wurde in Puffer A gelöst und durch ein Filter von 0,45 μm filtriert.
  • Ammoniumsulfat wurde zur Probe bis zu einer Leitfähigkeit von 50 mS/cm zugesetzt. Die Probe wurde dann auf eine Säule „Phenyl Sepharose High Performance" (Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala), die mit in Puffer A gelöstem Ammoniumsulfat von 0,5 M äquilibiert war, nach den Herstellerangaben aufgetragen. Die Säule wurde mit demselben Puffer gewaschen und dann unter Verwendung eines linearen Salzgradienten von in Puffer A gelöstem Ammoniumsulfat von 0,5 M bis zum reinen Puffer A eluiert.
  • Die Fraktionen mit Oxalacetat-Hydrolase-Aktivität wurden vereinigt. Diese Lösung wurde mit 2 mM MnCl2, 20 mM DTT, 5% Sucrose bis zu einer Leitfähigkeit von 4 mS/cm verdünnt und dann auf eine Säule „Q Sepharose High Performance" (Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala) aufgetragen, die mit Puffer A äquilibriert war. Die Säule wurde mit Puffer A gewaschen und dann unter Verwenden eines linearen Salzgradienten von 0 M bis 0,5 M NaCl, das in Puffer A gelöst war, eluiert. Die Fraktionen mit Oxalacetat-Hydrolase-Aktivität wurden vereinigt.
  • Die Proben wurden auf eine PD-10-Säule (Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala), die mit 10 mM NaH2PO4, pH 7,2, 0,1 mM MnCl2, 5% Sucrose, 10 mM DTT äquilibriert war, aufgetragen und mit demselben Puffer eluiert. Die Proben wurden auf eine Säule „Econo-Pac HTP" (BioRad, Hercules, CA, USA) aufgetragen, die mit 10 mM NaH2PO4, pH 7,2, 0,1 mM MnCl2, 5% Sucrose, 10 mM DTT äquilibriert war. Die Säule wurde mit 10 mM NaH2PO4, pH 6,8, 0,1 mM MnCl2, 5% Sucrose, 10 mM DTT gewaschen und dann mit einem linearen Gradienten von 10 mM NaH2PO4, pH 6,8, 0,1 mM MnCl2, 5% Sucrose, 10 mM DTT bis 400 mM NaH2PO4, pH 6,8, 0,1 mM MnCl2, 5% Sucrose, 10 mM DTT eluiert. Die Proben mit Oxalacetat-Hydrolase-Aktivität wurden für die SDS-PAGE verwendet.
  • Beispiel 2
  • Proteinsequenzbestimmung von Oxalacetat-Hydrolase-Fragmenten
  • Die gereinigte Oxalacetat-Hydrolase von Beispiel 1 wurde der SDS-PAGE-Gelelektrophorese in einem 12,5%igen Gel unter Verwendung von Standardverfahren (Laemmli, U. K., 1970. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227, 680–685) unterzogen. Die Proteine wurden auf eine PVDF-Membran durch das Elektroblot-Verfahren übertragen und die Membran wurde mit „Coomassie Brilliant Blue R-250" wie von Plough et al. (Plough, M., Jensen, A. L. und Barkholt, V. 1989, Anal. Biochem. 181, 33–39) beschrieben gefärbt. 4 Proteinbanden im Bereich eines apparenten Molekulargewichts von 38 bis 40 kD wurden ausgeschnitten und für die aminoterminale Sequenzanalyse unter Verwenden eines „Procise – 494 protein sequencers" von Perkin Elmer, Applied Biosystems, Norwalk, CT, USA, nach den Herstellerangaben verwendet. Es wurden die folgenden Sequenzen erhalten:
    • 1. MKVDTPDSASTISMTN (SEQ ID NR: 3)
    • 2. TNTITITVEQDGIYE (SEQ ID NR: 4)
    • 3. VEQDGIYEIN (SEQ ID NR: 5)
    • 4. GARQEPVVNLNMVTG (SEQ ID NR: 6).
  • Beispiel 3
  • Klonierung des Oxalacetat-Hydrolase kodierenden Gens
  • Die in Beispiel 2 bestimmten Proteinsequenzen wurden für Datenbanksuchen verwendet und eine EST-Sequenz von Aspergillus niger wurde abgerufen (EMBL, T82752, AN752). Diese EST-Sequenz kodiert eine Proteinsequenz, die mit den vier Sequenzen von Beispiel 2 mit 100%iger Identität angeordnet werden konnte. Die EST-Sequenz wurde verwendet, um die folgenden PCR-Primer zu entwerfen:
    Oxalac EST Sense: 5' AAA GTT GAT ACC CCC GAT TCT 3' (SEQ ID NR: 7)
    Oxalac EST Antisense: 5' ATG GCA ATA CGG GGA CAG ACC 3' (SEQ ID NR: 8).
  • Diese Primer wurden verwendet, um die DNA von A. niger BO1, die im Wesentlichen wie von Leach et al. (Leach, J., Finkelstein, D. B. und Rambosek, J. A. (1986) Fungal gent. newsl. 33, 32–33) beschrieben präpariert wurde, unter Verwendung der Taq-Polymerase „amplitaq" von Perkin Elmer (Norwalk, CT, USA) nach den Herstellerangaben zu amplifizieren. Die PCR-Reaktion wurde in einem „MJ PCT 150 capillary PCR cycler" (MJ research, Watertown, MA, USA) in einem Volumen von 10 μl betrieben, indem 30 Zyklen mit einer Denaturierungstemperatur von 94°C für eine Dauer von 10 Sek., einer Hybridisierungstemperatur von 55°C für eine Dauer von 10 Sek. und einer Verlängerungstemperatur von 72°C für eine Dauer von 30 Sek. mit einem Temperaturgradienten von der Denaturierung bis zur Hybridisierung von –0,5°C/Sek. ausgeführt wurden.
  • Das erhaltene Fragment von 219 Bp wurde in den pCR II-Vektor (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) nach den Herstellerangaben ligiert und in Escherichia coli DH5α wie von Sambrook (Sambrook, J. et al. (1989), Molecular cloning, a laboratory manual, zweite Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press) beschrieben transformiert. Ein Klon, der eine Insertion der erwarteten Größe enthielt, wurde unter Verwenden der folgenden Primer sequenziert:
    M13-Rückwärts-Primer: 5' CAG GAA ACA GCT ATG AC 3' (SEQ ID NR: 9)
    M13-Vorwärts-(–20)-Primer: 5' GTA AAA CGA CGG CCA G 3' (SEQ ID NR: 10).
  • Die DNA-Sequenzanalyse wurde unter Verwenden eines „ABI PRISM 377 DNA Sequencers" zusammen mit dem „ABI PRISM BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit" (Perkin Elmer Applied Biosystems, Foster city, CA, USA) nach den Empfehlungen des Herstellers durchgeführt. Die Sequenzen bestätigten, dass es sich bei dem Fragment um die gewünschte Sequenz handelt.
  • Es wurde eine Restriktionskarte durch Southern-Blot-Analyse unter Verwenden der 219-Bp-Insertion als Sonde gemäß den Protokollen von Sambrook et al. erstellt. Aus dieser Restriktionskarte wurde geschlossen, dass das Gen auf einem BglII-Fragment von 5 kB lokalisiert ist.
  • Das Gen wurde dann durch inverse PCR kloniert: Die genomische DNA von A. niger BO1 wurde mit BglII gespalten und die Fragmente, die sich über einen Bereich von 4 kB bis 6 kB erstreckten, wurden aus einem Agarosegel gewonnen. Die DNA wurde unter Verwenden der T4-DNA-Ligase bei 16°C ligiert. Dieses Ligationsgemisch wurde als Matrize in einer PCR-Reaktion unter Verwenden der folgenden Primer verwendet:
    OXEST1 5' GAC GGT CTG TCG CCG TAT TGC 3' (SEQ ID NR: 11)
    OXEST2 5' GGA AGC AGA ATC GGG GGT ATC 3' (SEQ ID NR: 12).
  • Die „Expand high fidelity polymerase" (Boehringer Mannheim, Mannheim, Deutschland) wurde zur Amplifikation nach den Empfehlungen des Herstellers verwendet. Die MgCl2-Konzentration in der Reaktion war 1 mM. Ansonsten entsprachen die Bedingungen wie vorstehend. Es wurde ein Fragment von 5 kB erzeugt. Dieses Fragment wurde mit BglII gespalten und das gespaltene Fragment wurde in den mit BamHI und HincII gespaltenen pUC 19 (Yanisch-Perron, C. et al. (1985) Gene 33, 103–119) ligiert. Das Ligationsgemisch wurde in E. coli DH5α transformiert. Es wurden Kolonien mit Insertionsgrößen von 1,3 kB und 3,7 kB gefunden. Eine Kolonie von jeder Klasse wurde unter Verwenden des M13-Rückwärts-Primers und des M13-Vorwärts-(–20)-Primers sequenziert. Auf diese Art und Weise wurden die benachbarten Sequenzen von BglII bestimmt und die folgenden Primer entworfen, um das BglII-Fragment von 5 kB durch PCR zu amplifizieren.
    Flank 1: 5' GCG GCC GCG CGC CAA TAA CGT CCG ATT C 3' (SEQ ID NR: 13)
    Flank 2: 5' GCG GCC GCC TAC AAA TAC ATT GAC CTC CC 3' (SEQ ID Nr: 14).
  • Diese Primer wurden verwendet, um die genomische DNA von A. niger BO1 unter Verwenden derselben PCR-Bedingungen wie für die inverse PCR zu amplifizieren. Das erzeugte Fragment von 5 kB wurde in pCR II ligiert, um pHP I zu bilden. Das Oxalacetat-Hydrolase-Gen wurde unter Verwenden von pHP I als Matrize mit den folgenden Primern sequenziert.
    Oxalac EST Sense: 5' AAA GTT GAT ACC CCC GAT TCT 3' (SEQ ID NR: 15)
    Oxalac EST Antisense: 5' ATG GCA ATA CGG CGA CAG ACC 3' (SEQ ID NR: 16)
    OXEST 1: 5' GAC GGT CTG TCG CCG TAT TGC 3' (SEQ ID NR: 17)
    OXEST 2: 5' GGA AGC AGA ATC GGG GGT ATC 3' (SEQ ID NR: 18)
    OXEST 3: 5' GCC GGA GTC GCG GGA TTC CAC 3' (SEQ ID NR: 19)
    OXEST 4: 5' GGC GGA CTA TGA TTT GTG CC 3' (SEQ ID NR: 20)
    OX5: 5' TGA TGG TCG CCC GTT CCG TT 3' (SEQ ID NR: 21)
    OX6: 5' TGC CAT TCA ATT TTC TTG GCC 3' (SEQ ID NR: 22)
    OX7: 5' TGA TCT TCG ATG TGG AAT CCC 3' (SEQ ID NR: 23)
    OX8: 5' GAT GGC GTC GAT TGA CCA TTT 3' (SEQ ID NR: 24)
    OX9: 5' GGA GAT GGG TTT GCT AAT GGT GTT 3' (SEQ ID NR: 25)
    OX10: 5' TTA GCA AAC CCA TCT CCA CC 3' (SEQ ID NR: 26)
    OX11: 5' CGA ATT ACT GGT CAT TAG CCC 3' (SEQ ID NR: 27)
    OX12: 5' CGA GAG AAG TAT TCT AGA CCC 3' (SEQ ID NR: 28)
    OX13: 5' TGA CTG TCG ATC AGG GTG TT 3' (SEQ ID NR: 29)
    OX14: 5' GTG TGC GGA TTG ATG GAC TC 3' (SEQ ID NR: 30)
    OX15: 5' CAA CCC AAC TCA ACA ACT CT 3' (SEQ ID NR: 31)
    FLANKE1: 5' GCG GCC GCG CGC CAA TAA CGT CCG ATT C 3' (SEQ ID NR: 32)
    FLANKE2: 5' GCG GCC GCC TAC AAA TAC ATT GAC CTC CC 3' (SEQ ID NR: 33)
  • Die DNA-Sequenz ist in SEQ ID NR:1 dargestellt. Die Sequenz wurde bezüglich der kodierenden Sequenz und bezüglich der Anwesenheit von Introns unter Verwendung der Computer-Software Netgene 2 (Hebsgaard, S. M., Korning, P. G., Tolstrup, N., Engelbrecht, J., Rouze, P., Brunak, S. (1996) Nucleic Acids Research 24: 3439–3452) analysiert und legt die Existenz von 3 Exons nahe (siehe Anmerkungen für SEQ ID NR:1). Die von diesen 3 Introns abgeleitete Proteinsequenz mit 341 Resten ist in SEQ ID NR:2 dargestellt.
  • Datenbanksuchen unter Verwenden dieser Proteinsequenz (oah) als Abfragesequenz offenbarte eine Sequenzhomologie mit der Isocitrat-Lyase von Aspergillus nidulans (Swiss Prot P28298) und Neurospora crassa (Swiss Prot P28299) sowie der Carboxyvinyl-Carboxyphosphonat-Phosphorylmutase von Streptomyces hygroscopicus (Swiss Prot P11435) und einem hypothetischen Protein von Bacillus subtilis (Swiss Prot P54528).
  • Figure 00450001
  • Ein Stamm von E. coli, der das Plasmid pHP1 trägt, wurde als DSM 12660 hinterlegt.
  • Beispiel 4:
  • Unterbrechung des Oxalacetat-Hydrolase-Gens
  • pHP I wurde mit NruI und BstEII gespalten und das Fragment von 6,6 kB isoliert. Ein Plasmid, das das pyrG-Gen von Aspergillus niger trägt, pJRoy 10 (1), wurde mit NcoI gespalten und die rezessiven 5'-Enden wurden dann mit dem Klenow-Fragment der DNA-Polymerase I aufgefüllt und dann mit BstEII gespalten. Das Fragment von 2948 Bp wurde isoliert und mit dem Fragment von pHP I ligiert. Das Ligationsgemisch wurde verwendet, um E. coli DH5α zu transformieren. Es wurde eine Kolonie identifiziert, die das gewünschte Plasmid trägt, und das Plasmid wurde als pHP 3 (2) bezeichnet. Ein das Plasmid pHP 3 tragender Stamm von E. coli wurde als DSM 12661 hinterlegt.
  • Der Abkömmling JRoy3 von A. niger BO1 mit defektem pyrG (BO1 wurde durch Transformieren mit einem Deletionsfragment des pyrG-Genbereichs und Selektieren auf FOA pyrG-negativ gemacht) wurde mit dem EcoRI-NotI-Fragment von pHP3 von 5 kB unter Verwenden der in dem EP-Patent EP 0 531 372 B1 beschriebenen Verfahren transformiert. 275 Transformanten wurden zweimal erneut isoliert und dann in 96-Loch-Mikrotiterplatten bei 34°C, pH 6,0 für eine Dauer von 48 Std. in dem folgenden Medium gezüchtet: Glucose 20 g/l, NaNO3 15 g/l, KH2PO4 1,5 g/l, MgSO4·7 H2O 1 g/l, NaCl 1 g/l, CaCl2·2 H2O 0,1 g/l, Spuren(elemente)lösung 0,5 ml/l. Spuren(elemente)lösung: ZnSO4·7 H2O 14,3 g/l, CuSO4·5 H2O 2,5 g/l, NiCl2·6 H2O 0,5 g/l, FeSO4·7 H2O 13,8 g/l, MnCl2 6 g/l. Die Überstände wurden bezüglich Oxalat unter Verwendung des Oxalat-Kits (Kat.-Nr. 591-C) von Sigma (St. Louis, MO, USA) getestet. Es wurden 8 Transformanten gefunden, die Oxalat nicht herstellen. 6 von jenen wurden der Southern-Blot-Analyse zusammen mit 2 Oxalat herstellenden Transformanten, BO1 und JRoy3 als Positivkontrollen, unterzogen. Das in Beispiel 3 beschriebene EST-PCR-Fragment von 219 Bp wurde als Sonde verwendet. Ein separater Blot mit denselben Proben wurde mit dem NcoI-BstEII-Fragment von pJRoy 10 untersucht. Die Southern-Blots offenbarten, dass die 6 Oxalat-negativen Stämme in dem Oxalacetat-(Hydrolase-)Gen unterbrochen wurden, während die Positivkontrollen intakte Oxalacetat-(Hydrolase-)Gene enthielten.
  • Beispiel 5
  • Fermentation eines Oxalat-negativen Stamms
  • Einer der Oxalat-negativen Stämme wurde in einem Chargen-Fermenter gezüchtet, der mit einer Rührvorrichtung, Temperaturkontrolle, pH-Wert-Kontrolle und Belüftung ausgestattet war. Bei dem Medium handelte es sich um Glucose 16 g/l, (NH4)2SO4 7,5 g/l, KH2PO4 1,5 g/l, MgSO4·7 H2O 1 g/l, NaCl 1 g/l, CaCl2·2 H2O 0,1 g/l, Spuren(elemente)lösung 0,5 ml/l. Spuren(elemente)lösung: ZnSO4·7 H2O 14,3 g/l, CuSO4·5 H2O 2,5 g/l, NiCl2·6 H2O 0,5 g/l, FeSO4·7 H2O 13,8 g/l, MnCl2 6 g/l. Der pH-Wert lag bei 2,5, bis die Biomasse eine Konzentration von 0,5 g/l erreicht hatte. An diesem Punkt wurde der pH-Wert auf pH-Wert 6,0 verschoben. Die Fermentationsbrühe wurde bezüglich Oxalat, Citrat, Pyruvat, Succinat, Acetat, Glycerin, Ethanol und Glucose analysiert (Nissen, T. L., Schulze, U., Nielsen, J. und Villadsen, J., 1997. Flux distributions in anaerobic, glucoselimited continuous cultures of Saccharomyces cerevisiae. Microbiol. 143, 203–218). Von den Abfallprodukten konnten nur Citrat, Pyruvat, Succinat und Glycerin nachgewiesen werden und die maximalen Konzentrationen dieser Abfallprodukte lagen jeweils bei 0,74 g/l, 0,18 g/l, 0,14 g/l und 0,13 g/l. Die Biomasseausbeute mit Glucose lag bei 0,58 g/g und die spezifische Wachstumsgeschwindigkeit bei 0,23 h–1.
  • Hinterlegung des biologischen Materials
  • Das folgende biologische Material wurde gemäß dem Budapester Vertrag mit der DSMZ, Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig, Deutschland, hinterlegt und mit den folgenden Zugangsnummern bezeichnet:
  • Figure 00480001
  • Der Stamm wurde unter Bedingungen hinterlegt, die sicherstellen, dass der Zugang zu der Kultur während der Anhängigkeit dieser Patentanmeldung für jemanden zur Verfügung steht, der von dem Beauftragten für Patente und Markenzeichen bestimmt wird, um gemäß 37 C.F.R. §1.14 und 35 U.S.C. §122 dazu berechtigt zu sein. Die Hinterlegung stellt eine im Wesentlichen reine Kultur des hinterlegten Stamms dar. Die Hinterlegung steht wie von ausländischen Patentgesetzen gefordert in Ländern zur Verfügung, in denen Duplikate des Anmeldungsgegenstands oder dessen Abkömmlinge archiviert werden. Jedoch sollte es selbstverständlich sein, dass die Verfügbarkeit einer Hinterlegung keine Lizenz begründet, den Erfindungsgegenstand unter Schmälerung der durch die Regierung gewährten Patentrechte zu betreiben.
  • Die hierin beschriebene und beanspruchte Erfindung soll durch die hierin offenbarten, spezifischen Ausführungsformen nicht beschränkt sein, da diese Ausführungsformen als Veranschaulichungen der einzelnen Ausführungsformen der Erfindung vorgesehen sind. Beliebige gleichwertige Ausführungsformen sind dafür bestimmt, im Umfang dieser Erfindung zu sein. In der Tat werden verschiedene Modifikationen der Erfindung zusätzlich zu jenen hierin dargestellten und beschriebenen für den Fachmann aus der vorstehenden Beschreibung offensichtlich werden. Derartige Modifikationen sind ebenso dafür bestimmt, in den Umfang der angefügten Patentansprüche zu fallen. Im Streitfall wird es die vorliegende Offenbarung einschließlich der Definitionen regeln.
  • Verschiedene Dokumente sind hierin zitiert, deren Offenbarungen durch Bezugnahme in vollem Umfang aufgenommen sind.
  • Sequenz Liste
    Figure 00500001
  • Figure 00510001
  • Figure 00520001
  • Figure 00530001
  • Figure 00540001
  • Figure 00550001
  • Figure 00560001
  • Figure 00570001
  • Figure 00580001
  • Figure 00590001
  • Figure 00600001
  • Figure 00610001
  • Figure 00620001
  • Figure 00630001
  • Figure 00640001
  • Figure 00650001
  • Figure 00660001
  • Figure 00670001
  • Figure 00680001

Claims (21)

  1. Isolierte Nukleinsäuresequenz, die ein Polypeptid mit Oxalacetat-Hydrolase-Aktivität kodiert, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: (a) einer Nukleinsäuresequenz, die ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz, die mit den Aminsäuren 1 bis 341 von SEQ ID NR:2 zu mindestens 65% identisch ist, kodiert, (b) einer Nukleinsäuresequenz, die mit einer Nukleotidsequenz, die durch die Nukleotide 1157–1411, 1504–1651 und 1764–2383 von SEQ ID NR: 1 gebildet ist, zu mindestens 65% homolog ist, (c) einer Nukleinsäuresequenz, die unter mittelstringenten Bedingungen mit (i) der Nukleinsäuresequenz von SEQ ID NR: 1, (ii) der cDNA-Sequenz von SEQ ID NR:1, (iii) einer Untersequenz von (i) oder (ii) aus mindestens 100 Nukleotiden oder (iv) einem komplementären Strang von (i), (ii) oder (iii) hybridisiert, (d) einer Allelvariante von (a), (b) oder (c), (e) einer Untersequenz von (a), (b), (c) oder (d), wobei die Untersequenz ein Polypeptidfragment kodiert, das Oxalacetat-Hydrolase-Aktivität aufweist.
  2. Nukleinsäuresequenz nach Anspruch 1, die (a) ein Polypeptid, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID NR:2 umfasst, kodiert oder (b) mit der Nukleinsäuresequenz von SEQ ID NR:1 zu mindestens 65% homolog ist oder (c) die Nukleinsäuresequenz von SEQ ID NR1 aufweist oder (d) im Plasmid pHP 1 enthalten ist, das in Escherichia coli DSM 12660 enthalten ist.
  3. Nukleinsäurekonstrukt, umfassend die funktionsfähig mit einer oder mehreren Kontrollsequenzen verbundenen Nukleinsäuresequenz nach einem der Ansprüche 1–2, die die Herstellung des Polypeptids in einem geeigneten Expressionswirt steuert.
  4. Rekombinanter Expressionsvektor, umfassend das Nukleinsäurekonstrukt nach Anspruch 3, einen Promoter und Transkriptions- und Translationsstoppsignale.
  5. Rekombinante Wirtszelle, umfassend das Nukleinsäurekonstrukt nach Anspruch 3.
  6. Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids mit Oxalatacetat-Hydrolase-Aktivität, umfassend (a) Züchten der Wirtszelle nach Anspruch 5 unter zur Herstellung des Polypetids geeigneten Bedingungen und (b) Gewinnen des Polypeptids.
  7. Verfahren zur Herstellung einer Mutante einer Fadenpilzzelle, umfassend das Unterbrechen oder Deletieren der Nukleinsäuresequenz nach einem der Ansprüche 1–2 oder einer Kontrollsequenz davon, was dazu führt, dass die Mutante weniger Oxalatacetat-Hydrolase als die Zelle herstellt.
  8. Verfahren nach Anspruch 7, umfassend: (a) Einbringen einer Nukleinsäuresequenz, die eine Modifikation der Nukleinsäuresequenz nach einem der Ansprüche 1–2 oder einer Kontrollsequenz davon umfasst, in eine Ausgangs-Fadenpilzzelle und (b) Identifizieren des Mutanten von Schritt (a), wobei die Mutante beim Züchten unter denselben Bedingungen weniger Oxalatactetat-Dehydrolase als die Ausgangszelle herstellt.
  9. Mutantenzelle, die durch das Verfahren nach einem der Ansprüche 7 oder 8 hergestellt wird.
  10. Mutante nach Anspruch 9, bei welcher es sich um eine Aspergillus-Zelle wie ein Stamms A. niger, Acremonium, Aureobasidium, Cryptococcus, Filibasidium, Fusarium, Gibberella, Humicola, Magnaporthe, Mucor, Myceliophthora, Myrothecium, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Piromyces, Schizophyllium, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium oder Trichoderma handelt.
  11. Mutante nach einem der Ansprüche 9–10, wobei die Mutantenzelle beim Züchten unter identischen Bedingungen mindestens etwa 25% weniger Oxalatacetat-Hydrolase oder Oxalsäure als die Ausgangszelle oder keine Oxalatacetat-Hydrolase oder Oxalsäure herstellt.
  12. Mutante nach einem der Ansprüche 9–11, wobei die Mutantenzelle des Weiteren eine oder mehrere Modifikationen von einer oder mehreren dritten Nukleinsäuresequenzen umfasst, wobei die Modifikation die Expression von einer oder mehreren dritten Nukleinsäuresequenzen vermindert oder eliminiert.
  13. Mutante nach Anspruch 12, wobei die dritte Nukleinsäuresequenz ein Enzym, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einer Aminopeptidase, Amylase, Carbohydrase, Carboxypeptidase, Katalase, Cellulase, Chitinase, Cutinase, Cyclodextrin-Glykosyltransferase, Desoxyribonuklease, Esterase, alpha-Galactosidase, beta-Galactosidase, Glucoamylase, alpha-Glucosidase, beta-Glucosidase, Invertase, Laccase, Lipase, Mannosidase, Mutanase, Oxidase, einem pektinolytischen Enzym, einer Peroxidase, Phytase, Polyphenol-Oxidase, einem proteolytischen Enzym, einer Ribonuklease, Transglutaminase und Xylanase, kodiert.
  14. Mutante nach einem der Ansprüche 9–13, wobei die Mutantenzelle des Weiteren eine Modifikation von einem oder mehreren Genen umfasst, die eine Protease kodieren.
  15. Verfahren zur Herstellung eines homologen Produkts, umfassend (a) Züchten der Mutante nach einem der Ansprüche 9–14 unter für die Herstellung des Produkts förderlichen Bedingungen und (b) Gewinnen des Produkts.
  16. Verfahren nach Anspruch 15, wobei das homologe Produkt Zitronensäure ist.
  17. Mutant nach einem der Ansprüche 9–14, der des Weiteren eine Nukleinsäuresequenz umfasst, die ein heterologes Polypeptid kodiert.
  18. Verfahren zur Herstellung eines heterologen Polypeptids, umfassend (a) Züchten des Mutanten nach Anspruch 17 unter für die Herstellung des Polypeptids förderlichen Bedingungen und (b) Gewinnen des Polypeptids.
  19. Verfahren nach Anspruch 18, wobei das heterologe Polypeptid ein Hormon, eine Hormonvariante, ein Enzym wie eine Oxidoreduktase, eine Transferase, eine Hydrolase, eine Lysase, eine Isomerase oder eine Ligase, vorzugsweise eine Aminopeptidase, Amylase, Carbohydrase, Carboxypeptidase, Catalase, Cellulase, Chitinase, Cutinase, Cyclodextringlycosyltransferase, Deoxyribonuklease, Esterase, alpha-Galactosidase, beta-Galactosidase, Glucoamylase, alpha-glucosidase, beta-Glucosidase, Invertase, Laccase, Lipase, Mannosidase, Mutanase, Oxidase, ein pektinolytisches Enzym, Peroxidase, Phytase, Polyphenoloxidase, proteolytisches Enzym, Ribonuklease, Transglutaminase oder Xylanase, ein Rezeptor oder ein Teil davon, ein Antikörper oder ein Teil davon oder ein Reporter ist.
  20. Verwendung einer durch eine Nukleinsäuresequenz nach einem der Ansprüche 1–2 kodierten Oxalacetatdehydrolase zum Nachweis von Oxalsäure in Nahrungsmitteln.
  21. Im Wesentlichen reine Kultur von E. coli DSM 12660 oder DSM 12661.
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