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Hintergrund
der Erfindung
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Gebiet der
Erfindung
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Die
Erfindung betrifft isolierte Nukleinsäuresequenzen, die Polypeptide
mit Oxalacetat-Hydrolase-Aktivität
kodieren. Die vorliegende Erfindung betrifft des Weiteren Mutanten
von Wirtszellen, insbesondere Mutanten von Pilzwirtszellen, wie
z.B. Zellen der Gattung Aspergillus, die in der Oxalacetat-Hydrolase-Aktivität und dadurch
in der Herstellung von Oxalsäure
einen Defekt aufweisen. Die vorliegende Erfindung betrifft ebenso
die Verwendung der Mutantenzellen zur Herstellung erwünschter
Verbindungen, wie z.B. Polypeptide, primäre und sekundäre Metabolite,
und Verfahren zur Herstellung derartiger Verbindungen in den Mutantenzellen der
Erfindung. Die Erfindung betrifft ebenso Nukleinsäurekonstrukte,
Vektoren und Wirtszellen, die die Nukleinsäuresequenzen sowie rekombinante
Verfahren zur Herstellung der Polypeptide mit Oxalacetat-Hydrolase-Aktivität umfassen.
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Beschreibung
des Stands der Technik
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Fadenpilze
werden für
die gewerbliche Herstellung einer Vielfalt von Verbindungen von
Interesse, einschließlich
homologer Verbindungen, wie z.B. von dem fraglichen Pilz normalerweise
hergestellter, primärer und
sekundärer
Metabolite und Polypeptide, oder heterologer Verbindungen, wie z.B.
heterologer Polypeptide, die von einer in den fraglichen Pilz eingeführten fremden
DNA kodiert werden, vielfach verwendet. Derartige Produkte werden
durch Fermentation des fraglichen Pilzes und Ernte des aus der Fermentation
resultierenden, gewünschten
Produkts hergestellt.
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Die
Pilzspezies A. niger wird zur gewerblichen Herstellung von gewünschten
Verbindungen, z.B. Zitronensäure
und industriellen Enzymen vielfach verwendet. Es ist bekannt, dass
diese Spezies große
Mengen Oxalsäure
herstellt. Wegen etlicher Gründe
ist die Herstellung von Oxalsäure
unerwünscht,
wenn diese Spezies für
die gewerbliche Herstellung einer Verbindung von Interesse verwendet
wird. Zum Beispiel erfordert die Herstellung von Oxalsäure eine
Menge Kohlenstoff und somit müssen
zusätzliche,
teure Kohlenstoffquellen zum Fermentationsmedium verglichen mit
dem, was nur für
die Herstellung der gewünschten
Verbindung erforderlich wäre,
zugesetzt werden; die Anwesenheit von Oxalsäure in der Fermentationsbrühe verursacht
Probleme in der mit der Gewinnung des Produkts von Interesse verbundenen,
nachgeschalteten Verarbeitung, da Oxalsäure einen in der Gewinnung
störenden
Niederschlag mit Calcium bildet; und bei Oxalsäure handelt es sich um eine
toxische Verbindung, was bedeutet, dass seine Anwesenheit als ein
Hauptproblem in der Herstellung von Produkten mit Lebensmittelqualität aus A.
niger angesehen wird.
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Es
wurden zwei mögliche
Routen für
den Weg der Oxalsäure-Biosynthese
in A. niger nahe gelegt. Die erste Route lautet Oxalacetat + Wasser → Oxalsäure + Acetat,
wobei die Reaktion durch die Oxalacetat-Hydrolase katalysiert wird
(Kubicek, C. P., Schreferl-Kunar, G., Wöhrer, W. und Röhr, M. (1988),
Appl. Environ. Microbiol. 54, 633–637). Die zweite Route umfasst
den Glycoxylat-Weg (Balmforth, A. J., Thomson, A. (1984), Biochem.
J. 218, 113–118).
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Es
wurde versucht, die Bildung der Oxalsäure während gewerblicher Fermentationen
von A. niger durch Betreiben der Fermentation bei einem niedrigen
pH-Wert, bei dem
nur wenig Oxalsäure
gebildet wird, zu regulieren. Jedoch kann die Fermentation bei niedrigem
pH-Wert nicht erwünscht
sein, da normalerweise dieser pH-Wert für das Wachstum von A. niger
und die Ausbeute des gewünschten
Fermentationsprodukts nicht optimal ist.
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Es
wurde eine teilweise gereinigte Oxalacetat-Hydrolase von A. niger
beschrieben (Lenz et al., Partial purification and some properties
of oxaloacetate from Aspergillus niger, 1976, Eur. J. Biochem. 65,
225–236), jedoch
wurde das Enzym kodierende Gen nicht beschrieben.
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Es
ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Mutanten von Zellen
bereitzustellen, wie z.B. Fadenpilzzellen, insbesondere Zellen von
A. niger, die in der Oxalacetat-Hydrolase-Herstellung und dadurch
in der Oxalsäure-Herstellung
einen Defekt aufweisen.
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Zusammenfassung
der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung betrifft isolierte Nukleinsäuresequenzen,
die Polypeptide mit Oxalacetat-Hydrolase-Aktivität kodieren, ausgewählt aus
der Gruppe, bestehend aus:
- (a) einer Nukleinsäuresequenz,
die ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz kodiert, die mit
den Aminosäuren
1 bis 341 von SEQ ID NR:2 zu mindestens 65% identisch ist,
- (b) einer Nukleinsäuresequenz,
die mit einer Nukleotidsequenz, die durch die Nukleotide 1157–1411, 1504–1651 und
1764–2383
von SEQ ID NR:1 gebildet ist, zu mindestens 65% homolog ist,
- (c) einer Nukleinsäuresequenz,
die unter mittelstringenten Bedingungen mit (i) der Nukleinsäuresequenz von
SEQ ID NR:1, (ii) der cDNA-Sequenz von SEQ ID NR:1, (iii) einer
Untersequenz von (i) oder (ii) aus mindestens 100 Nukleotiden oder
(iv) einem komplementären
Strang von (i), (ii) oder (iii) hybridisiert,
- (d) einer Allelvariante von (a), (b) oder (c), und
- (e) einer Untersequenz von (a), (b), (c) oder (d), wobei die
Untersequenz ein Polypeptidfragment kodiert, das Oxalacetat-Hydrolase-Aktivität aufweist.
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In
einer weiteren wichtigen Ausführungsform
betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer Mutante
einer fadenartigen Zelle, welches das Unterbrechen oder Deletieren
der Nukleinsäuresequenz
der Erfindung oder einer Kontrollsequenz davon umfasst, was dazu
führt,
dass die Mutante weniger Oxalacetat-Hydrolase und somit Oxalsäure als
die Zelle herstellt. Die vorliegende Erfindung betrifft ebenso eine
durch dieses Verfahren hergestellte Mutante.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft auch Nukleinsäurekonstrukte, Vektoren und
Wirtszellen, die die Nukleinsäuresequenzen
sowie rekombinante Verfahren zur Herstellung der Polypeptide umfassen.
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Kurzbeschreibung
der Figuren
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1 zeigt
die in Beispiel 4 beschriebene Konstruktion des Plasmids pHP3.
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Detaillierte
Beschreibung der Erfindung
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Isolierte, Polypeptide
mit Oxalacetat-Hydrolase-Aktivität
kodierende Nukleinsäuresequenzen
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Der
Begriff „Oxalacetat-Hydrolase-Aktivität" ist hierin als eine
Aktivität
definiert, die die folgende Reaktion katalysiert: Oxalacetat + Wasser → Oxalsäure + Acetat.
Das Enzym ist der Klasse EC 3.7.1.1. zugeordnet. Für die Zwecke
der vorliegenden Erfindung wird die Oxalacetat-Hydrolase-Aktivität gemäß dem Verfahren
bestimmt, das in dem nachstehenden Abschnitt Materialien und Verfahren
beschriebenen ist. Eine Einheit der Oxalacetat-Hydrolyse-Aktivität ist definiert
als 1,0 μmol
Oxalsäure,
die pro Minute bei 30°C
und einem pH-Wert von 7,5 hergestellt wird.
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Der
Begriff „isolierte
Nukleinsäuresequenz" wie hierin verwendet
betrifft eine Nukleinsäuresequenz, die
im Wesentlichen von anderen Nukleinsäuresequenzen frei ist, z.B.
mindestens etwa 20% rein, vorzugsweise mindestens etwa 40% rein,
stärker
bevorzugt mindestens etwa 60% rein, noch stärker bevorzugt mindestens etwa
80% rein und am stärksten
bevorzugt mindestens etwa 90% rein nach Bestimmung durch Agaroseelektrophorese.
Zum Beispiel kann eine isolierte Nukleinsäuresequenz durch in der Gentechnologie
verwendete Standardklonierungsverfahren erhalten werden, um die
Nukleinsäuresequenz
von ihrem natürlichen
Ort an einen anderen Ort zu verlagern, wo sie kopiert wird. Die
Klonierungsverfahren können
das Ausschneiden und die Isolierung eines gewünschten Nukleinsäurefragments
einschließen
und umfassen die Polypeptid kodierende Nukleinsäuresequenz, die Insertion des
Fragments in ein Vektormolekül
und die Aufnahme des rekombinanten Vektors in eine Wirtszelle, wo
mehrfache Kopien oder Klone der Nukleinsäuresequenz repliziert werden.
Bei der Nukleinsäuresequenz
kann es sich um einen genomischen, cDNA-, RNA-, halbsynthetischen, synthetischen
Ursprung oder beliebige Kombinationen davon handeln.
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In
einer ersten Ausführungsform
betrifft die vorliegende Erfindung isolierte Nukleinsäuresequenzen, die
Polypeptide kodieren, welche eine Aminosäuresequenz aufweisen, die mit
den Aminosäuren
1 bis 341 von SEQ ID NR:2 (d.h. das reife Polypeptid) einen Identitätsgrad von
mindestens etwa 65%, vorzugsweise mindestens etwa 70%, stärker bevorzugt
mindestens etwa 80%, noch stärker
bevorzugt mindestens etwa 90%, am stärksten bevorzugt mindestens
etwa 95% und noch stärker
bevorzugt mindestens 97% aufweist, und welche Oxalacetat-Hydrolase-Aktivität aufweisen
(nachstehend „homologe
Polypeptide"). In
einer bevorzugten Ausführungsform
weisen die homologen Polypeptide eine Aminosäuresequenz auf, die sich durch
fünf Aminosäuren, vorzugsweise
durch vier Aminosäuren,
stärker
bevorzugt durch drei Aminosäuren,
noch stärker
bevorzugt durch zwei Aminosäuren
und am stärksten
bevorzugt durch eine Aminosäure
von den Aminosäuren
1 bis 341 von SEQ ID NR:2 unterscheidet. Für die Zwecke der vorliegenden
Erfindung wird der Identitätsgrad
zwischen zwei Aminosäuresequenzen
durch das Clustal-Verfahren (Higgins, 1989, CABIOS 5, 151–153) unter Verwendung
der Software LASERGENETM MEGALIGNTM (DNASTAR, Inc., Madison, WI) mit einer
Identitätstabelle
und der folgenden mehrfachen Anordnungsparameter bestimmt: eine
Lückenstrafe
von 10 und eine Lückenlängenstrafe
von 10. Die paarweisen Anordnungsparameter waren: K-Tupel = 1, Lückenstrafe
= 3, Fenster = 5 und Diagonalen = 5.
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Vorzugsweise
kodieren die Nukleinsäuresequenzen
der vorliegenden Erfindung Polypeptide, die die Aminosäuresequenz
von SEQ ID NR:2 oder eine Allelvariante davon oder ein Fragment
davon mit Oxalacetat-Hydrolase-Aktivität umfassen oder daraus bestehen.
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Die
vorliegende Erfindung umfasst ebenso Nukleinsäuresequenzen, die ein Polypeptid
mit der Aminosäuresequenz
von SEQ ID NR:2 kodieren und die sich von SEQ ID NR:1 aufgrund der
Degeneration des genetischen Codes unterscheiden. Die vorliegende
Erfindung betrifft ebenso Untersequenzen von SEQ ID NR:1, die Fragmente
von SEQ ID NR:2 mit Oxalacetat-Hydrolyse-Aktivität kodieren oder die genügend lang
sind, um zur Inaktivierung eines Oxalacetat-Hydrolase-Gens in einer
mikrobiellen Zelle (wie im Abschnitt mit dem Titel „Entfernung
oder Verminderung der Oxalacetat-Hydrolase-Aktivität" beschrieben) verwendet
zu werden.
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Bei
einer Untersequenz von SEQ ID NR:1 handelt es sich um eine von SEQ
ID NR:1 umfasste Nukleinsäuresequenz,
außer
dass ein oder mehrere Nukleotide vom 5'- und/oder 3'-Ende entfernt wurden. Vorzugsweise
enthält
eine Untersequenz mindestens 2800 Nukleotide, stärker bevorzugt mindestens 3000
Nukleotide und am stärksten
bevorzugt mindestens 3200 Nukleotide. Bei einem Fragment von SEQ
ID NR:2 handelt es sich um ein Polypeptid, bei dem eine oder mehrere
Aminosäuren
vom Amino- und/oder Carboxy-Ende dieser Aminosäuresequenz entfernt sind. Vorzugsweise
enthält
ein Fragment mindestens 270 Aminosäurereste, stärker bevorzugt
mindestens 300 Aminosäurereste
und am stärksten
bevorzugt 320 Aminosäurereste.
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Eine
Allelvariante bezeichnet zwei oder mehrere beliebige alternative
Formen eines Gens, die denselben chromosomalen Lokus belegen. Die
Allelvariation entsteht normalerweise durch Mutation und kann zu
einem Polymorphismus innerhalb von Populationen führen. Bei
den Genmutationen kann es sich um stille Genmutationen handeln (keine Änderung
im kodierten Polypeptid) oder sie können Polypeptide mit veränderter Aminosäuresequenz
kodieren. Bei einer Allelvariante eines Polypeptids handelt es sich
um ein von einer Allelvariante kodiertes Gen.
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Die
Aminosäuresequenzen
der homologen Polypeptide können
sich von der Aminosäuresequenz
von SEQ ID NR:2 durch eine Insertion oder Deletion eines oder mehrerer
Aminosäurereste
und/oder die Substitution eines oder mehrerer Aminosäurereste
durch verschiedene Aminosäurereste
unterscheiden. Vorzugsweise sind die Aminosäureaustausche von untergeordneter
Natur, wobei es sich um konservative Aminosäuresubstitutionen, die die
Faltung und/oder Aktivität
des Proteins im Wesentlichen nicht beeinträchtigen, wenig Deletionen von
typischerweise ein bis etwa 30 Aminosäuren, kleine amino- oder carboxyterminale
Verlängerungen,
wie z.B. ein aminoterminaler Methioninrest, ein kleiner Peptidlinker
von bis zu etwa 20–25
Resten oder eine kleine Verlängerung,
die die Reinigung durch Ändern
der Nettoladung und einer anderen Funktion, wie z.B. ein Polyhistidintrakt,
ein antigenes Epitop oder eine Bindungsdomäne erleichtert, handelt.
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Beispiele
konservativer Substitutionen sind innerhalb der Gruppe der basischen
Aminosäuren
(wie z.B. Arginin, Lysin und Histidin), der sauren Aminosäuren (wie
z.B. Glutaminsäure
und Asparaginsäure),
der polaren Aminosäuren
(wie z.B. Glutamin und Asparagin), der hydrophoben Aminosäuren (wie
z.B. Leucin, Isoleucin und Valin), der aromatischen Aminosäuren (wie
z.B. Phenylalanin, Tryptophan und Tyrosin) und der kleinen Aminosäuren (wie
z.B. Glycin, Alanin, Serin, Threonin und Methionin). Die Aminosäuresubstitutionen,
die die spezifische Aktivität
im Allgemeinen nicht ändern,
sind auf dem Fachgebiet bekannt und zum Beispiel von H. Neurath
und R. L. Hill, 1979, in The Proteins, Academic Press, New York,
beschrieben. Bei den am häufigsten
vorkommenden Austauschen handelt es sich um Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu,
Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro,
Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu und Asp/Gly sowie diese
in umgekehrter Form.
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In
einer zweiten Ausführungsform
betrifft die vorliegende Erfindung isolierte Nukleinsäuresequenzen, die
einen Grad der Homologie zu einer Nukleotidsequenz, die durch die
Nukleotide 1157–1411,
1504–1651 und
1764–2383
von SEQ ID NR:1 gebildet ist, von mindestens etwa 65%, vorzugsweise
mindestens etwa 70%, vorzugsweise mindestens etwa 80%, stärker bevorzugt
mindestens etwa 90%, noch stärker
bevorzugt mindestens etwa 95% und am stärksten bevorzugt mindestens
etwa 97% Homologie aufweisen und die ein aktives Polypeptid kodieren
oder die genügend
lang sind, um zur Inaktivierung eines Oxalacetat-Hydrolase-Gens in einer mikrobiellen
Zelle verwendet zu werden (wie im Abschnitt mit dem Titel „Entfernung
oder Verminderung der Oxalacetat-Hydrolase-Aktivität" beschrieben), oder Allelvarianten und
Untersequenzen von SEQ ID NR:1, die Polypeptidfragmente mit Oxalacetat-Hydrolase-Aktivität kodieren
oder die genügend
lang sind, um zur Inaktivierung eines Oxalacetat-Hydrolase-Gens
in einer mikrobiellen Zelle verwendet zu werden (wie im Abschnitt
mit dem Titel „Entfernung
oder Verminderung der Oxalacetat-Hydrolase-Aktivität" beschrieben). Für die Zwecke
der vorliegenden Erfindung wird der Grad der Homologie zwischen
zwei Nukleinsäuresequenzen durch
das Computerprogramm Align, das in dem Fasta-Programmpaket (Version
v20u6) bereitgestellt ist, unter Verwenden von GAP mit den folgenden
Einstellungen für
den Nukleotidsequenzvergleich bestimmt: GAP-Erzeugungsstrafe (für den ersten
Rest) in einem GAP von –16
und GAP-Verlängerungsstrafe
(für die
zusätzlichen
Reste) von –4.
Bei Align handelt es sich um eine leicht modifizierte Version eines
von E. Myers und W. Miller übernommenen
Programms. Der Algorithmus ist in E. Myers und W. Miller, „Optimal
Alignments in Linear Space" (CABIOS
(1988) 4, 11–17)
beschrieben.
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In
einer dritten Ausführungsform
betrifft die vorliegende Erfindung isolierte Nukleinsäuresequenzen, die
Polypeptide mit Oxalacetat-Hydrolase-Aktivität kodieren und die unter mittleren
Stringenzbedingungen, stärker
bevorzugt mittelhohen Stringenzbedingungen, noch stärker bevorzugt
hohen Stringenzbedingungen und am stärksten bevorzugt sehr hohen
Stringenzbedingungen mit einer Nukleinsäuresonde hybridisieren, die unter
denselben Bedingungen mit (i) der Nukleinsäuresequenz von SEQ ID NR:1,
(ii) der cDNA-Sequenz von SEQ ID NR:1, (iii) einer Untersequenz
von (i) oder (ii) von mindestens 100 Nukleotiden oder (iv) einem
komplementären
Strang von (i), (ii) oder (iii) hybridisiert (Sambrook, J., Fritsch,
E. F. und Maniatis, T., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual,
2. Auflage, Cold Spring Harbor, New York). Bei der Untersequenz
von SEQ ID NR:1 kann es sich um mindestens 200 Nukleotide handeln.
Darüber
hinaus kann die Untersequenz ein Polypeptidfragment mit Oxalacetat-Hydrolase-Aktivität kodieren.
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Die
Nukleinsäuresequenz
von SEQ ID NR:1 oder eine Untersequenz davon, sowie die Aminosäuresequenz
von SEQ ID NR:2 oder ein Fragment davon kann zum Entwerfen einer
Nukleinsäuresonde
verwendet werden, um DNA, die Polypeptide mit Oxalacetat-Hydrolase-Aktivität von Stämmen verschiedener
Gattungen oder Spezies kodiert, gemäß den auf dem Fachgebiet bekannten
Verfahren zu identifizieren und zu klonieren. Insbesondere derartige
Sonden können
zur Hybridisierung mit der genomischen oder cDNA der Gattung oder Spezies
von Interesse gemäß den Standard-Southern-Blotting-Verfahren
verwendet werden, um die entsprechenden Gene darin zu identifizieren
und zu isolieren. Derartige Sonden können beträchtlich kürzer als die gesamte Sequenz
sein, sollten jedoch mindestens 15, vorzugsweise mindestens 25 und
am stärksten
bevorzugt mindestens 35 Nukleotide lang sein. Längere Sonden können ebenso
verwendet werden. Sowohl DNA- als auch RNA-Sonden können verwendet
werden. Die Sonden sind zum Nachweisen des entsprechenden Gens typischerweise
markiert (32P, 3H, 35S, Biotin oder Avidin). Derartige Sonden
sind von der vorliegenden Erfindung umfasst.
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Daher
kann eine aus derart anderen Organismen präparierte, genomische DNA- oder cDNA-Genbank bezüglich einer
DNA durchgemustert werden, die mit den vorstehend beschriebenen
Sonden hybridisiert und die ein Polypeptid mit Oxalacetat-Hydrolase-Aktivität kodiert.
Genomische oder andere DNA von derart anderen Organismen kann durch
Agarose- oder Polyacrylamidgelelektrophorese oder anderen Trennverfahren
aufgetrennt werden. Die DNA von den Genbanken oder die aufgetrennte
DNA kann auf Nitrocellulose oder anderem geeigneten Trägermaterial übertragen
und darauf immobilisiert werden. Um einen Klon oder eine DNA, der/die
zu SEQ ID NR:1 oder einer Untersequenz davon homolog ist, zu identifizieren,
wird das Trägermaterial in
einem Southern-Blot verwendet. Für
die Zwecke der vorliegenden Erfindung zeigt die Hybridisierung an, dass
die Nukleinsäuresequenz
an eine Nukleinsäuresonde,
die der in SEQ ID NR:1 dargestellten Nukleinsäuresequenz, seinem komplementären Strang
oder einer Untersequenz davon entspricht, unter sehr niedrigen bis
sehr hohen Stringenzbedingungen hybridisiert. Die Moleküle, an die
die Nukleinsäuresonde
unter diesen Bedingungen hybridisiert, werden unter Verwendung eines
Röntgenfilms
nachgewiesen.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
handelt es sich bei der Nukleinsäuresonde
um eine Nukleinsäuresequenz,
die das Polypeptid von SEQ ID NR:2 oder eine Untersequenz davon
kodiert. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform handelt es sich
bei der Nukleinsäuresonde
um SEQ ID NR:1. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform
handelt es sich bei der Nukleinsäuresonde
um die Nukleotide, die das durch die Aminosäurereste 123–205 gebildete
Fragment von SEQ ID NR:2 oder einen Teil dieses Fragments kodieren. In
einer anderen bevorzugten Ausführungsform
handelt es sich bei der Nukleinsäuresonde
um eine Nukleinsäuresequenz,
die im Plasmid pHP1 enthalten ist, welches in Escherichia coli DSM-12660
enthalten ist, wobei die Nukleinsäuresequnz ein Polypeptid mit
Oxalacetat-Hydrolase-Aktivität,
insbesondere den das reife Polypeptid kodierenden Bereich von SEQ
ID NR:1 kodiert.
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Für lange
Sonden mit einer Länge
von mindestens 100 Nukleotiden sind sehr niedrige bis sehr hohe Stringenzbedingungen
als Prähybridisierung
und Hybridisierung bei 42°C
in 5× SSPE,
0,3% SDS, 200 μg/ml gescherte
und denaturierte Lachssperma-DNA und entweder 25% Formamid für sehr niedrige
und niedrige Stringenz, 35% Formamid für mittlere und mittelhohe Stringenz
oder 50% Formamid für
hohe und sehr hohe Stringenz gemäß den Standard-Southern-Blotting-Verfahren definiert.
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Für lange
Sonden mit einer Länge
von mindestens 100 Nukleotiden wird das Trägermaterial schließlich dreimal
jeweils 15 Minuten unter Verwendung von 2× SSC, 0,2% SDS vorzugsweise
bei mindestens 45°C (sehr
niedrige Stringenz), stärker
bevorzugt bei mindestens 50°C
(niedrige Stringenz), stärker
bevorzugt bei mindestens 55°C
(mittlere Stringenz), stärker
bevorzugt bei mindestens 60°C
(mittelhohe Stringenz), noch stärker
bevorzugt bei mindestens 65°C
(hohe Stringenz) und am stärksten
bevorzugt bei mindestens 70°C (sehr
hohe Stringenz) gewaschen.
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Für kurze
Sonden, die etwa 15 Nukleotide bis etwa 70 Nukleotide lang sind,
sind die Stringenzbedingungen definiert als Prähybridisierung, Hybridisierung
und Posthybridisierung unter Waschen bei 5°C bis 10°C unterhalb des berechneten
Tm-Werts unter Verwendung der Berechnung
gemäß Bolton
und McCarthy (1962, Proceedings of the National Academy of Sciences
USA 48, 1390) in 0,9 M NaCl, 0,09 M Tris-HCl, pH 7,6, 6 mM EDTA,
0,5% NP-40, 1× Denhardts
Lösung,
1 mM Natriumpyrophosphat, 1 mM monobasisches Natriumphosphat, 0,1
mM ATP und 0,2 mg Hefe-RNA pro ml gemäß den Standard-Southern-Blotting-Verfahren.
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Für kurze
Sonden, die etwa 15 Nukleotide bis etwa 70 Nukleotide lang sind,
wird das Trägermaterial einmal
in 6× SSC
plus 0,1 % SDS für
eine Dauer von 15 Minuten und zweimal jeweils für eine Dauer von 15 Minuten
unter Verwendung von 6× SSC
bei 5°C
bis 10°C
unterhalb des berechneten Tm-Werts gewaschen.
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Die
durch die isolierten Nukleinsäuresequenzen
der vorliegenden Erfindung kodierten Polypeptide weisen mindestens
20%, vorzugsweise mindestens 40%, stärker bevorzugt mindestens 60%,
noch stärker
bevorzugt mindestens 80%, noch stärker bevorzugt mindestens 90%
und am stärksten
bevorzugt mindestens 100% der Oxalacetat-Hydrolase-Aktivität des reifen
Polypeptids von SEQ ID NR:2 auf.
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Die
Nukleinsäuresequenzen
der vorliegenden Erfindung können
von Mikroorganismen beliebiger Gattung erhalten werden. Für die Zwecke
der vorliegenden Erfindung soll der Begriff „erhalten von", wie er hierin in
Verbindung mit einer gegebenen Quelle verwendet wird, bedeuten,
dass das durch die Nukleinsäuresequenz
kodierte Polypeptid durch die Quelle oder durch eine Zelle, in die
die Nukleinsäuresequenz
der Quelle eingefügt
wurde, hergestellt wird.
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Die
Nukleinsäuresequenzen
können
von einer bakteriellen Quelle erhalten werden. Zum Beispiel können diese
Polypeptide von einem Gram-positiven Bakterium, wie z.B. einem Bacillus-Stamm,
z.B. Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus
brevis, Bacillus circulans, Bacillus coagulans, Bacillus lautus, Bacillus
lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus stearothermophilus,
Bacillus subtilis oder Bacillus thuringiensis oder einem Streptomyces-Stamm,
z.B. Streptomyces lividans oder Streptomyces murinus oder von einem
Gram-negativen Bakterium, z.B. E. coli oder Pseudomonas sp. erhalten
werden.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
wird die Nukleinsäuresequenz
von einer Pilzzelle erhalten. „Pilze" wie hierin verwendet
schließen
die Abteilungen Ascomycota, Basidiomycota, Chytridiomycota und Zygomycota
(wie von Hawksworth et al., in Ainsworth and Bisby's Dictionary of The
Fungi, 8. Auflage, 1995, CAB International, University Press, Cambridge,
UK, definiert) sowie die Oomycota (wie in Hawksworth et al., 1995, vorstehend,
Seite 171, zitiert) und alle mitosporische Pilze (Hawksworth et
al., 1995, vorstehend) ein.
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In
einer stärker
bevorzugten Ausführungsform
handelt es sich bei der Pilzzelle um eine Hefezelle. „Hefen" wie hierin verwendet
schließen
ascosporogene Hefen (Endomycetales), basidiosporogene Hefen und
Hefen, die zu den Fungi Imperfecti (Blastomycetes) gehören, ein.
Da sich die Einteilung der Hefen in der Zukunft ändern kann, sollen für die Zwecke
dieser Erfindung die Hefen wie in Biology and Aktivities of Yeast
(Skinner, F. A., Passmore, S. M. und Davenport, R. R., Hrsg., Soc.
App. Bacteriol. Symposium Series Nr. 9, 1980) beschrieben definiert
sein.
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Insbesondere
können
die Nukleinsäuresequenzen
von einem Hefestamm, wie z.B. einem Stamm von Candida, Hansenula,
Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces oder Yarrowia
oder stärker
bevorzugt von einem Fadenpilzstamm, wie z.B. einem Stamm von Acremonium,
Aspergillus, Aureobasidium, Cryptococcus, Filibasidium, Fusarium,
Humicola, Magnaporthe, Mucor, Myceliophthora, Neocallimastix, Neurospora,
Paecilomyces, Penicillium, Piromyces, Schizophyllum, Talaromyces,
Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium oder Trichoderma erhalten
werden.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
können
die Nukleinsäuresequenzen
von einem Stamm von Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces
cerevisiae, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces douglasii,
Saccharomyces kluyveri, Saccharomyces norbensis oder Saccharomyces
oviformis erhalten werden.
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In
einer anderen bevorzugten Ausführungsform
werden die Nukleinsäuresequenzen
von einem Stamm von Aspergillus aculeatus, Aspergillus awamori,
Aspergillus foetidus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans,
Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Fusarium bactridioides, Fusarium
cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum,
Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium
oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum,
Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioides, Fusarium sulphureum,
Fusarium torulosum, Fusarium tri chothecioides, Fusarium venenatum,
Humicola insolens, Humicola lanuginosa, Mucor miehei, Myceliophthora
thermophila, Neurospora crassa, Penicillium purpurogenum, Trichoderma
harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma
reesei oder Trichoderma viride erhalten werden.
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In
einer stärker
bevorzugten Ausführungsform
werden die Nukleinsäuresequenzen
von Aspergillus niger und am stärksten
bevorzugt von A. niger BO1 DSM 12665, z.B. der in SEQ ID NR:1 dargelegten
Nukleinsäuresequenz
erhalten. In einer anderen stärker
bevorzugten Ausführungsform
handelt es sich bei der Nukleinsäuresequenz
um die Sequenz, die in Plasmid pHP1 enthalten ist, das in Escherichia
coli DSM-12660 enthalten ist. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform
handelt es sich bei der Nukleinsäuresequenz
um eine Nukleotidsequenz, die durch die Nukleotide 1157–1411, 1504–1651 und
1764–2383
von SEQ ID NR:1 gebildet ist und die das reife Polypeptid von SEQ
ID NR:2 kodiert.
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Es
wird selbstverständlich
sein, dass bei den vorstehend erwähnten Spezies die Erfindung
sowohl die perfekten als auch imperfekten Formen oder andere taxonomische
Pendants, z.B. Anamorphe umfasst, ungeachtet des Speziesnamens,
unter dem sie bekannt sind. Der Fachmann wird die Identität zugehöriger Pendants
leicht erkennen. Zum Beispiel können
die Polypeptide von Mikroorganismen erhalten werden, bei denen es
sich um taxonomische Pendants von Aspergillus niger wie von Benn
und Klich (Benn, J. W. und Klich, M. A., (1992), Aspergillus, Biology
and industrial applications, Butterworth–Heinemann, USA) definiert
handelt, ungeachtet des Speziesnamens, unter dem sie bekannt sind,
z.B. A. foetidus, A. heteromorphus, A. japonicus, A. phoenicis,
A. pulverulentus, A. tubingensis, A. helicothrix, A. atroviolaceus,
A. citricus, A. acidicus oder A. fonsecaeus.
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Die
Stämme
dieser Spezies sind in etlichen Kultursammlungen, wie z.B. American
Type Culture Collection (ATCC), Deutsche Sammlung von Mikroorganismen
und Zellkulturen GmbH (DSM), Centraalbureau Voor Schimmelcultures
(CBS) und Agricultural Research Service Patent Culture Collection,
Northern Regional Research Center (NRRL) öffentlich leicht zugänglich.
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Des
Weiteren können
derartige Nukleinsäuresequenzen
von anderen Quellen, einschließlich
der Mikroorganismen, die von der Natur (z.B. Boden, Komposte, Wasser,
usw.) unter Verwendung der vorstehend erwähnten Sonden isoliert wurden,
identifiziert und erhalten werden. Die Verfahren zum Isolieren von
Mikroorganismen von natürlichen
Lebensräumen
sind auf dem Fachgebiet bekannt. Die Nukleinsäuresequenz kann dann durch ähnliches
Durchmustern einer genomischen oder cDNA-Genbank von anderen Mikroorganismen abgeleitet
werden.
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Sobald
eine Polypeptid kodierende Nukleinsäuresequenz mit der (den) Sonde(n)
nachgewiesen wurde, kann die Sequenz unter Verwenden von Verfahren,
die einem Durchschnittsfachmann bekannt sind (siehe z.B. Sambrook
et al., 1989, vorstehend), isoliert oder kloniert werden.
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Die
verwendeten Verfahren, um eine Polypeptid kodierende Nukleinsäuresequenz
zu isolieren oder zu klonieren, sind auf dem Fachgebiet bekannt
und schließen
die Isolierung aus genomischer DNA, die Präparation aus cDNA oder eine
Kombination davon ein. Das Klonieren der Nukleinsäuresequenzen
der vorliegenden Erfindung aus derartiger genomischer DNA kann z.B.
durch Verwenden der bekannten Polymerasekettenreaktion (PCR) oder
einer Antikörperdurchmusterung
von Expressionsgenbanken bewerkstelligt werden, um die klonierten
DNA-Fragmente mit gemeinsamen strukturellen Merkmalen nachzuweisen.
Siehe z.B. Innis et al., 1990, PCR: A Guide to Methods and Application,
Academic Press, New York. Für
die PCR kann es von besonderer Bedeutung sein, einen Satz von Primern
zu verwenden, der die Aminosäuren
123–205
von SEQ ID NR:2 kodierende Nukleotidsequenz umfasst. Andere Nukleinsäureamplifikationsverfahren,
wie z.B. die Ligasekettenreaktion (LCR), die bindungsaktivierte
Transkription (LAT) und die Nukleinsäuresequenz-basierte Amplifikation
(NASBA) können
verwendet werden. Die Nukleinsäuresequenz
kann von einem Aspergillus-Stamm oder einem anderen oder verwandten
Organismus kloniert werden und somit zum Beispiel eine Allel- oder Speziesvariante
des Polypeptid kodierenden Bereichs der Nukleinsäuresequenz sein.
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Die
Modifikation einer Nukleinsäuresequenz
der vorliegenden Erfindung kann für die Synthese von Polypeptiden,
die dem Polypeptid im Wesentlichen ähnlich sind, notwendig sein.
Der Begriff dem Polypeptid „im
Wesentlichen ähnlich" betrifft nichtnatürlich vorkommende
Formen des Polypeptids. Diese Polypeptide können sich in etwas konstruierter
Weise von dem Polypeptid unterscheiden, das von seiner natürlichen
Quelle isoliert wurde, z.B. Varianten, die sich in der spezifischen
Aktivität,
Thermostabilität,
im pH-Optimum oder dergleichen unterscheiden. Die Sequenz der Variante
kann auf der Basis der Nukleinsäuresequenz,
die als der Polypeptid kodierende Teil von SEQ ID NR:1 dargestellt
ist, z.B. eine Untersequenz davon, und/oder durch Einführung von
Nukleotidsubstitutionen, die nicht zu einer anderen Aminosäuresequenz
des durch die Nukleinsäuresequenz
kodierten Polypeptids führen,
die jedoch der Codon-Verwendung des für die Herstellung des Enzyms
vorgesehenen Wirtsorganismus entsprechen, oder durch Einführung von
Nukleotidsubstitutionen, die zu einer anderen Aminosäuresequenz
führen,
konstruiert werden. Für
eine allgemeine Beschreibung einer Nukleotidsubstitution siehe z.B.
Ford et al., 1991, Protein Expression and Purification 2, 95107.
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Es
wird für
einen Fachmann offensichtlich sein, dass derartige Substitutionen
außerhalb
der Bereiche, die für
die Funktion des Moleküls
kritisch sind, vorgenommen werden können und dennoch zu einem aktiven Polypeptid
führen.
Die Aminosäurereste,
die für
die Aktivität
des durch die isolierte Nukleinsäuresequenz
der Erfindung kodierten Polypeptids wesentlich und deshalb vorzugsweise
nicht Gegenstand der Substitution sind, können gemäß den auf dem Fachgebiet bekannten
Verfahren, wie z.B. ortsspezifische Mutagenese oder Alanin-Durchmusterungsmutagenese
(siehe z.B. Cunningham und Wells, 1989, Science 244, 1081–1085) identifiziert
werden. Bei dem letzteren Verfahren werden Mutationen an jedem positiv
geladenen Rest in das Molekül eingeführt und
die so erhaltenen Mutantenmoleküle
bezüglich
der Oxalacetat-Hydrolase-Aktivität
getestet, um Aminosäurereste
zu identifizieren, die für
die Aktivität
des Moleküls
kritisch sind. Die Stellen der Substrat-Enzym-Wechselwirkung können ebenso
durch die Analyse der dreidimensionalen Struktur bestimmt werden,
wie sie z.B. durch derartige Verfahren wie Kernspinresonanz-Analyse,
Kristallographie oder Photoaffinitätsmarkierung (siehe z.B. de
Vos et al., 1992, Science 255, 306–312; Smith et al., 1992, Journal
of Molecular Biology 224, 899–904;
Wlodaver et al., 1992, FEBS Letters 309, 59–64) bestimmt wird.
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Verfahren
zur Herstellung von Nukleinsäuresequenz-Mutanten
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Die
vorliegende Erfindung betrifft ferner Verfahren zur Herstellung
einer Nukleinsäuresequenz-Mutante,
das das Einführen
von mindestens einer Mutation in die das reife Polypeptid kodierende
Sequenz von SEQ ID NR:1 oder eine Untersequenz davon umfasst, wobei
die Nukleinsäuresequenz-Mutante
ein Polypeptid kodiert, das aus den Aminosäuren 1 bis 341 von SEQ ID NR:2
oder einem Fragment davon mit Oxalacetat-Hydrolase-Aktivität besteht.
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Die
Einführung
einer Mutation in die Nukleinsäuresequenz,
um ein Nukleotid gegen ein anderes Nukleotid auszutauschen, kann
durch ortsspezifische Mutagenese unter Verwenden eines beliebigen,
auf dem Fachgebiet bekannten Verfahrens bewerkstelligt werden. Insbesondere
verwendbar ist das Verfahren, das einen superhelikalen, doppelsträngigen DNA-Vektor
mit einer Insertion von Interesse und zwei synthetische, die gewünschte Mutation
enthaltende Primer verwendet. Die Oligonukleotid-Primer, die jeweils
zu den gegenüberliegenden
Strängen
des Vektors komplementär
sind, verlängern
sich während
des Temperaturzyklus durch die Pfu-DNA-Polymerase. Nach Einbau der
Primer wird ein mutiertes Plasmid erzeugt, das versetzte Strangbrüche enthält. Im Anschluss
an den Temperaturzyklus wird das Produkt mit DpnI behandelt, das
für methylierte und
halbmethylierte DNA spezifisch ist, um die Ausgangs-DNA-Matrize
zu spalten und die Mutation enthaltende, synthetisierte DNA zu selektieren.
Andere auf dem Fachgebiet bekannte Verfahren können ebenso verwendet werden.
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Entfernung oder Verminderung
der Oxalacetat-Hydrolase-Aktivität
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Die
vorliegende Erfindung betrifft ebenso Verfahren zur Herstellung
einer Mutantenzelle einer Ausgangszelle, die das Unterbrechen oder
Entfernen einer Nukleinsäuresequenz
der vorliegenden Erfindung oder einer Kontrollsequenz davon umfassen,
was dazu führt,
dass die Mutantenzelle weniger von dem durch die Nukleinsäuresequenz
kodierten Polypeptid mit Oxalacetat-Hydrolase-Aktivität als die
Ausgangszelle und somit weniger Oxalsäure herstellt, wenn sie unter
denselben Bedingungen gezüchtet
wird.
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Die
Konstruktion von Stämmen,
die eine verminderte Herstellung der Oxalacetat-Hydrolase-Akitivität und Oxalsäure aufweisen, kann einfach
durch Modifikation oder Inaktivierung einer Nukleinsäuresequenz
bewerkstelligt werden, die für
die Expression des Polypeptids mit Oxalacetat-Hydrolase-Aktivität in der
Zelle notwendig ist. Bei der zu modifizierenden oder zu inaktivierenden
Nukleinsäuresequenz
kann es sich zum Beispiel um eine Nukleinsäuresequenz handeln, die ein
Polypeptid oder einen Teil davon kodiert, das/der für das Ausprägen der
Oxalacetat-Hydrolase-Aktivität
wesentlich ist, z.B. eine Nukleinsäuresequenz der Erfindung wie
in dem Abschnitt mit dem Titel „Isolierte, Polypeptide mit
Oxalacetat-Hydrolase-Aktivität kodierende
Nukleinsäuresequenzen" beschrieben, oder
die Nukleinsäuresequenz
kann eine regulatorische Funktion aufweisen, die für die Expression
des Polypeptids von der kodierenden Sequenz der Nukleinsäuresequenz
erforderlich ist. Ein Beispiel einer derartigen regulatorischen
oder Kontrollsequenz kann eine Promoter-Sequenz oder ein funktionsfähiger Teil
davon sein, d.h. ein Teil, der ausreichend ist, um die Expression
des Polypeptids zu beeinflussen. Andere Kontrollsequenzen für die eventuelle
Modifikation sind in diesem Abschnitt weiter beschrieben.
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Die
Modifikation oder Inaktivierung der Nukleinsäuresequenz kann durchgeführt werden,
indem die Zellen der Mutagenese und der Selektion oder Durchmusterung
nach Zellen, in denen die Fähigkeit
zur Herstellung der Oxalacetat-Hydrolase
vermindert wurde, unterzogen werden. Die Mutagenese, die spezifisch
oder zufällig
sein kann, kann zum Beispiel durch Verwenden eines geeigneten physikalischen
oder chemischen mutagenisierenden Mittels, durch Verwenden eines
geeigneten Oligonukleotids oder durch Unterziehen der DNA-Sequenz
einer durch PCR erzeugten Mutagenese durchgeführt werden. Des Weiteren kann
die Mutagenese durch Verwenden einer beliebigen Kombination dieser
mutagenisierenden Mittel durchgeführt werden.
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Beispiele
eines physikalischen oder chemischen mutagenisierenden Mittels,
das für
den vorliegenden Zweck geeignet ist, schließen Ultraviolett- (UV-)Bestrahlung,
Hydroxylamin, N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin
(MNNG), O-Methylhydroxylamin,
salpetrige Säure,
Ethylmethansulfonat (EMS), Natriumbisulfit, Ameisensäure und
Nukleotidanaloga ein.
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Wenn
derartige Mittel verwendet werden, wird die Mutagenese typischerweise
durch Inkubieren der zu mutagenisierenden Zelle in Anwesenheit des
mutagenisierenden Mittels der Wahl unter geeigneten Bedingungen
und Selektieren von Zellen durchgeführt, die eine verminderte Oxalacetat-Hydrolase-Aktivität oder -Herstellung
zeigen. Die verminderte oder eliminierte Oxalacetat-Hydrolase-Aktivität kann durch
Verwenden des Testverfahrens bestimmt werden, das in dem Abschnitt
Beispiele nachstehend beschrieben ist.
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Die
Modifikation oder Inaktivierung der Herstellung eines Polypeptids,
das durch eine Nukleinsäuresequenz
der vorliegenden Erfindung kodiert ist, kann durch die Einführung, Substitution
oder Entfernung von einem oder mehreren Nukleotiden in der das Polypeptid
kodierenden Nukleinsäuresequenz
oder einem regulatorischen Element, das für deren Transkription oder
Translation erforderlich ist, bewerkstelligt werden. Zum Beispiel
können
Nukleotide eingefügt
oder entfernt werden, um zur Einführung eines Stopp-Codons, zur
Entfernung des Start-Codons oder zu einer Änderung des offenen Leserahmens
zu führen.
Eine derartige Modifikation oder Inaktivierung kann durch ortsspezifische
Mutagenese oder durch PCR erzeugte Mutagenese gemäß der im
Fachgebiet bekannten Verfahren bewerkstelligt werden. Obwohl grundsätzlich die
Modifikation in vivo durchgeführt
werden kann, d.h. direkt in der Zelle, die die zu modifizierende
Nukleinsäuresequenz
exprimiert, ist es bevorzugt, dass die Modifikation in vitro wie
nachstehend beispielhaft erläutert
durchgeführt
wird.
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Ein
Beispiel einer einfachen Weise, die Herstellung durch eine Wirtszelle
der Wahl zu eliminieren oder zu vermindern, basiert auf Verfahren
des Genaustauschs oder der Genstörung.
Zum Beispiel wird bei dem Genstörungsverfahren
eine Nukleinsäuresequenz,
die dem endogenen Gen oder Genfragment von Interesse entspricht,
in vitro mutagenisiert, um eine defekte Nukleinsäuresequenz herzustellen, die
dann in die Wirtszelle transformiert wird, um ein defektes Gen herzustellen.
Durch homologe Rekombination ersetzt die defekte Nukleinsäuresequenz
das endogene Gen oder Genfragment. Es kann erwünscht sein, dass das defekte
Gen oder Genfragment ebenso einen Marker kodiert, der zur Selektion
von Transformanten, in denen das Polypeptid kodierende Gen modifiziert
oder zerstört
wurde, verwendet werden kann.
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In
einer anderen Ausführungsform
kann die Modifikation oder Inaktivierung der Nukleinsäuresequenz durch
etablierte Antisense-Verfahren unter Verwenden einer zur Polypeptid
kodierenden Sequenz komplementären
Nukleotidsequenz durchgeführt
werden. Insbesondere kann die Herstellung des Polypeptids durch eine
Zelle durch Einführen
einer zur Polypeptid kodierenden Nukleinsäuresequenz komplementären Nukleotidsequenz,
die in der Zelle transkribiert werden kann und die an die in der
Zelle hergestellte Polypeptid-mRNA hybridisieren kann, vermindert
oder eliminiert werden. Unter diesen Bedingungen, die es ermöglichen,
dass die komplementäre
Antisense-Nukleotidsequenz an die Polypeptid-mRNA hybridi siert,
wird die Menge des translatierten Polypeptids somit vermindert oder
eliminiert.
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Es
ist bevorzugt, dass die gemäß den Verfahren
der vorliegenden Erfindung zu modifizierende Zelle mikrobiellen
Ursprungs, insbesondere eine beliebige von den Spezies ist, die
in dem vorstehenden Abschnitt mit dem Titel „Isolierte, Polypeptide mit
Oxalacetat-Hydrolase-Aktivität
kodierende Nukleinsäuresequenzen" als Quellen für die Polypeptid
mit Oxalacetat-Hydrolase-Aktivität
kodierende Nukleinsäuresequenz
der Erfindung aufgelistet sind. Vorzugsweise handelt es sich bei
der Zelle um einen Pilzstamm, der für die Herstellung gewünschter
Produkte, wie z.B. Polypeptide oder primärer oder sekundärer Metabolite,
die entweder homolog oder heterolog zur Zelle sind, geeignet ist.
Noch stärker
bevorzugt handelt es sich bei der Zelle um eine Aspergillus-Zelle,
insbesondere A. niger.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft ferner eine Mutantenzelle der Ausgangszelle,
die eine Unterbrechung oder Deletion einer das Polypeptid kodierenden
Nukleinsäuresequenz
oder einer Kontrollsequenz davon umfasst, die dazu führt, dass
die Mutantenzelle weniger von dem Polypeptid als die Ausgangszelle
herstellt.
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Die
so erzeugten Mutantenzellen mit einem Polypeptid-Defekt sind insbesondere
als Wirtszellen zur Expression homologer und/oder heterologer Expressionsprodukte
verwendbar, wie z.B. homologer oder heterologer Polypeptide oder
primärer
oder sekundärer
Metabolite. Daher betrifft die vorliegende Erfindung ferner Verfahren
zur Herstellung eines homologen oder heterologen Produkts, das (a)
das Züchten
der Mutantenzelle unter für
die Herstellung des Produkts förderlichen
Bedingungen und (b) das Gewinnen des Produkts umfasst.
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Die
zur Züchtung
und Reinigung des Produkts von Interesse verwendeten Verfahren können durch
die auf dem Fachgebiet bekannten Verfahren, z.B. wie vorstehend
im Abschnitt mit dem Titel „Herstellungsverfahren" weiter beschrieben
durchgeführt
werden.
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Die
Verfahren der vorliegenden Erfindung zur Herstellung eines im Wesentlichen
Oxalsäure-freien Produkts
sind von besonderem Interesse in der Herstellung von primären Metaboliten,
insbesondere Produkten mit Lebensmittelqualität, wie z.B. Zitronensäure und
anderen Säuren
des Krebs-Zyklus und homologen oder heterologen Polypeptiden, insbesondere
eukaryotischen Polypeptiden.
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Bei
dem Polypeptid kann es sich um ein beliebiges, zur Mutantenzelle
heterologen oder homologen Polypeptid handeln. Es ist hierin nicht
beabsichtigt, dass der Begriff „Polypeptid" eine bestimmte Länge des kodierten
Produkts bezeichnet, und er umfasst daher Peptide, Oligopeptide
und Proteine. Der Begriff „heterologes
Polypeptid" ist
hierin als ein Polypeptid, das für
die Mutantenzelle nicht natürlich
ist, ein natürliches
Protein, in dem Modifikationen vorgenommen wurden, um die natürliche Sequenz
zu verändern,
oder ein natürliches
Protein, dessen Expression als Folge einer Manipulation der Mutantenzelle
durch rekombinante DNA-Verfahren quantitativ verändert ist, definiert. Die Mutantenzelle
kann eine oder mehrere Kopien der Nukleinsäuresequenz enthalten, die das
homologe oder heterologe Polypeptid kodiert. In einer bevorzugten
Ausführungsform
handelt es sich bei dem heterologen Polypeptid um ein extrazellulär sezerniertes
Polypeptid.
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Vorzugsweise
handelt es sich bei dem herzustellenden Polypeptid um ein Hormon,
eine Hormonvariante, ein Enzym, einen Rezeptor oder einen Teil davon,
einen Antikörper
oder einen Teil davon oder einen Reporter. Das Enzym kann aus einem
amylolytischen Enzym, lipolytischen Enzym, proteolytischen Enzym,
cellulolytischen Enzym, einer Oxidoreduktase oder einem Pflanzenzellwand
abbauenden Enzym ausgewählt sein.
Beispiele derartiger Enzyme schließen eine Aminopeptidase, Amylase,
Amyloglucosidase, Carbohydrase, Carboxypeptidase, Katalase, Cellulase,
Chitinase, Cutinase, Cyclodextrin-Glykosyltransferase, Desoxyribonuklease,
Esterase, Galactosidase, beta-Galactosidase, Glucoamylase, Glucose-Oxidase,
Glucosidase, Haloperoxidase, Hemicellulase, Invertase, Isomerase,
Laccase, Ligase, Lipase, Lyase, Mannosidase, Oxidase, ein pektinolytisches
En zym, eine Peroxidase, Phytase, Phenol-Oxidase, Polyphenol-Oxidase,
ein proteolytisches Enzym, eine Ribonuklease, Transferase, Transglutaminase
oder Xylanase ein. Die Zellen mit einem Oxalacetat-Hydrolase-Defekt
können
auch verwendet werden, um heterologe Proteine von pharmazeutischem
Interesse, wie z.B. Hormone, Wachstumsfaktoren, Rezeptoren und dergleichen
zu exprimieren.
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Die
das heterologe Polypeptid kodierende Nukleinsäuresequenz, die in einer Mutantenzelle
der Erfindung, insbesondere einer Fadenpilz-Mutantenzelle exprimiert
werden kann, kann von einer beliebigen prokaryotischen, eukaryotischen
oder anderen Quelle erhalten werden. Für die Zwecke der vorliegenden
Erfindung soll der Begriff „erhalten
von", wie er hierin
in Verbindung mit einer gegebenen Quelle verwendet wird, bedeuten,
dass das Polypeptid durch die Quelle oder durch eine Zelle, in die
ein Gen von der Quelle eingefügt
wurde, hergestellt wird.
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In
den Verfahren der vorliegenden Erfindung kann die Mutantenzelle,
insbesondere eine Mutanten-Fadenpilzzelle auch zur rekombinanten
Herstellung von Polypeptiden oder anderen Produkten, wie z.B. primären und
sekundären
Metaboliten, die für
die Zelle natürlich
(oder „homolog") sind, verwendet
werden.
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Die
verwendeten Verfahren, um eine ein heterologes Polypeptid kodierende
Nukleinsäuresequenz
zu isolieren oder zu klonieren, sind auf dem Fachgebiet bekannt
und schließen
die Isolierung aus genomischer DNA, die Präparation aus cDNA oder eine
Kombination davon ein.
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Die
Klonierung der Nukleinsäuresequenz
von derartiger genomischer DNA kann z.B. durch Verwenden der bekannten
Polymerasekettenreaktion (PCR) bewerkstelligt werden. Siehe zum
Beispiel Innis et al., 1990, PCR Protocols: A Guide to Methods and
Application, Academic Press, New York. Die Klonierungsverfahren
können
das Ausschneiden und die Isolierung eines gewünschten Nukleinsäurefragments
einschließen und
umfassen die Polypeptid kodierende Nukleinsäuresequenz, die Insertion des
Fragments in ein Vektormolekül
und die Aufnahme des rekombinanten Vektors in die Mutantenzelle,
wo mehrfache Kopien oder Klone der Nukleinsäuresequenz repliziert werden.
Bei der Nukleinsäuresequenz
kann es sich um einen genomischen, cDNA-, RNA-, halbsynthetischen,
synthetischen Ursprung oder beliebige Kombinationen davon handeln.
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Bei
den Verfahren der vorliegenden Erfindung können heterologe Polypeptide
ebenso fusionierte oder Hybridpolypeptide einschließen, bei
denen ein anderes Polypeptid an den N-Terminus oder C-Terminus des Polypeptids
oder ein Fragment davon fusioniert ist. Ein fusioniertes Polypeptid
wird durch Fusionieren einer ein Polypeptid kodierenden Nukleinsäuresequenz
(oder ein Teil davon) an eine ein anderes Polypeptid kodierende
Nukleinsäure
(oder ein Teil davon) hergestellt. Die Verfahren zur Herstellung
von Fusionspolypeptiden sind auf dem Fachgebiet bekannt und schließen das
Ligieren der kodierenden, die Polypeptide kodierenden Sequenzen
ein, so dass sie sich im Leserahmen befinden und die Expression
des fusionierten Polypeptids unter der Kontrolle desselben (derselben)
Promoters (Promotoren) und desselben Terminators steht. Die Hybridpolypeptide
können
eine Kombination von Teil- oder kompletten Polypeptidsequenzen umfassen,
die aus mindestens zwei verschiedenen Polypeptiden erhalten wurden,
wobei eines oder mehrere zur Mutantenzelle heterolog sind.
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Eine
isolierte Nukleinsäuresequenz,
die ein heterologes Polypeptid von Interesse kodiert, kann in vielfältiger Weise
manipuliert werden, um sie zur Expression des Polypeptids bereitzustellen.
Die Expression wird selbstverständlich
einen beliebigen, in die Herstellung des Polypeptids einbezogenen
Schritt einschließen,
einschließlich
der Transkription, posttranskriptionalen Modifikation, Translation,
posttranslationalen Modifikation und Sekretion, ist jedoch nicht
darauf beschränkt.
Die Manipulation der Nukleinsäuresequenz
vor ihrer Insertion in einen Vektor kann abhängig vom Expressionsvektor
erwünscht
oder notwendig sein. Die Verfahren zur Modifizierung von Nukleinsäuresequenzen
unter Verwendung von Klonierungsverfahren sind auf dem Fachgebiet
bekannt.
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Das „Nukleinsäurekonstrukt" ist hierin als ein
entweder einzel- oder doppelsträngiges
Nukleinsäuremolekül definiert,
das von einem natürlich
vorkommenden Gen isoliert oder modifiziert wurde, so dass sie Nukleinsäuresegmente
enthält,
die in einer Weise kombiniert und aneinander gesetzt sind, die in
der Natur sonst nicht existieren würde. Der Begriff Nukleinsäurekonstrukt
ist mit dem Begriff Expressionskassette gleichbedeutend, wenn das
Nukleinsäurekonstrukt
alle Kontrollsequenzen enthält,
die für
die Expression einer kodierenden Sequenz erforderlich sind. Bei
dem Begriff „kodierende
Sequenz" wie hierin
definiert handelt es sich um eine Sequenz, die in mRNA transkribiert
und in ein Polypeptid translatiert wird. Die Grenzen der kodierenden Sequenz
sind im Allgemeinen durch das ATG-Startcodon, das sich unmittelbar
stromaufwärts
des offenen Leserahmens am 5'-Ende
der mRNA befindet, und eine Transkriptionsterminatorsequenz, die
sich unmittelbar stromabwärts
des offenen Leserahmens am 3'-Ende
der mRNA befindet, festgelegt. Eine kodierende Sequenz kann genomische
DNA, cDNA, RNA, semisynthetische, synthetische, rekombinante DNA
oder beliebige Kombinationen davon einschließen, ist aber nicht darauf
beschränkt.
Bei der kodierenden Sequenz des hierin beschriebenen Nukleinsäurekonstrukts
kann es sich um die Nukleotidsequenz der Erfindung handeln, die
ein Polypeptid mit Oxalacetat-Hydrolase-Aktivität (wie in
dem vorstehenden Abschnitt mit dem Titel „Isolierte, Polypeptide mit
Oxalacetat-Hydrolase-Aktivität
kodierende Nukleinsäuresequenzen" definiert) kodiert,
wobei in diesem Fall das Nukleinsäurekonstrukt zur Herstellung
eines Polypeptids mit Oxalacetat-Hydrolase-Aktivität wie in
dem Abschnitt definiert oder für
eine andere, die Nukleinsäuresequenz
einbeziehende Manipulation verwendet wird, oder bei der kodierenden
Sequenz kann es sich um eine kodierende Sequenz handeln, die ein
heterologes, in einer Mutantenzelle der Erfindung herzustellendes
Polypeptid handeln.
-
Der
Begriff „Kontrollsequenzen" ist hierin so definiert,
dass der alle Komponenten einschließt, die für die Expression eines heterologen
Polypeptids notwendig oder vorteilhaft sind. Jede Kontrollsequenz
kann für die
Polypeptid kodierende Nukleinsäuresequenz
natürlich
oder fremd sein. Derartige Kontrollsequenzen schließen einen
Leader, eine Polyadenylierungssequenz, eine Propeptidsequenz, einen
Promoter, eine Signalpeptidsequenz und einen Transkriptionsterminator
ein, sind aber nicht darauf beschränkt. Mindestens schließen die
Kontrollsequenzen einen Promoter und Transkriptions- und Translationsstoppsignale
ein. Die Kontrollsequenzen können
mit Linkern für
den Zweck des Einführens
bestimmter Restriktionsstellen, die die Ligation der Kontrollsequenzen
mit dem kodierenden Bereich der ein heterologes Polypeptid kodierenden
Nukleinsäuresequenz
erleichtern, bereitgestellt sein. Der Begriff „funktionsfähig verbunden" ist hierin definiert
als eine Anordnung, bei der eine Kontrollsequenz an eine Position
bezüglich
der kodierenden Sequenz der DNA-Sequenz in geeigneter Weise gesetzt
wird, derart dass die Kontrollsequenz die Herstellung eines heterologen
Polypeptids steuert.
-
Bei
der Kontrollsequenz kann es sich um eine geeignete Promoter-Sequenz,
eine Nukleinsäuresequenz
handeln, die von einer Zelle, insbesondere einer Fadenpilzzelle
zur die Expression der Nukleinsäuresequenz
erkannt wird. Die Promoter-Sequenz
enthält
Transkriptionskontrollsequenzen, die die Expression des heterologen
Polypeptids vermitteln. Bei dem Promoter kann es sich um eine beliebige
Nukleinsäuresequenz handeln,
die eine Transkriptionsaktivität
in der Zelle zeigt, einschließlich
mutanter, verkürzter
oder Hybridpromotoren, und kann von Genen erhalten werden, die extrazelluläre oder
intrazelluläre
Polypeptide kodieren, die entweder homolog oder heterolog zur Zelle
sind.
-
Beispiele
geeigneter Promotoren zur Steuerung der Transkription der Nukleinsäurekonstrukte
in einer Fadenpilzzelle in den Verfahren der vorliegenden Erfindung
sind Promotoren, die von den Genen erhalten werden, die die TAKA-Amylase
von Aspergillus oryzae, die Aspartat-Proteinase von Rhizomucor miehei,
die neutrale alpha-Amylase von Aspergillus niger, die säurestabile
alpha-Amylase von Aspergillus niger, die Glucoamylase von Aspergillus
niger oder Aspergillus awamori (glaA), die Lipase von Rhizomucor
miehei, die alkalische Protease von Aspergillus oryzae, die Triosephosphat-Isomerase
von Aspergillus oryzae, die Acetamidase von Aspergillus nidulans,
die Acetamidase von Aspergillus oryzae (amdS), die Trypsin-ähnliche
Protease von Fusarium oxysporum (U.S.-Patent-Nr. 4,288,627) kodieren,
und mutante, verkürzte
und Hybridpromotoren davon. Bei den besonders bevorzugten Promotoren
handelt es sich um die NA2-tpi- (ein Hybrid der Promotoren von den
Genen, die die neutrale alpha-Amylase von Aspergillus niger und
die Triosephosphat-Isomerase von Aspergillus oryzae kodieren), Glucoamlyase-
und TAKA-Amylase-Promotoren.
-
Bei
der Kontrollsequenz kann es sich ebenso um eine geeignete Transkriptionsterminatorsequenz, eine
Sequenz handeln, die von der fraglichen Wirtszelle erkannt wird,
um die Transkription zu beenden. Die Terminatorsequenz ist mit dem
3'-Ende der das
heterologe Polypeptid kodierenden Nukleinsäuresequenz funktionsfähig verbunden.
Es kann ein beliebiger Terminator, der in der Wirtszelle funktionsfähig ist,
in der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
-
Bevorzugte,
in den Fadenpilzzellen funktionsfähige Terminatoren werden von
den Genen erhalten, die die TAKA-Amylase von Aspergillus oryzae,
die Glucoamylase von Aspergillus niger, die Anthranilat-Synthetase von
Aspergillus nidulans, die alpha-Glucosidase von Aspergillus niger
und die Trypsin-ähnliche
Protease von Fusarium oxysporum kodieren.
-
Bei
der Kontrollsequenz kann es sich ebenso um eine geeignete Leader-Sequenz,
einen nicht translatierten Bereich einer mRNA handeln, der für die Translation
durch die Zelle bedeutend ist. Die Leader-Sequenz ist mit dem 5'-Ende der das heterologe
Polypeptid kodierenden Nukleinsäuresequenz
funktionsfähig verbunden.
Es kann eine beliebige Leader-Sequenz, die in der Zelle funktionsfähig ist,
in der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
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Bevorzugte
Leader werden von den Genen erhalten, die die TAKA-Amylase von Aspergillus
oryzae und die Triosephosphat-Isomerase von Aspergillus nidulans
kodieren.
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Bei
der Kontrollsequenz kann es sich ebenso um eine Polyadenylierungssequenz
handeln, eine Sequenz, die mit dem 3'-Ende der Nukleinsäuresequenz funktionsfähig verbunden
ist und die, wenn sie transkribiert wird, von einer Zelle als Signal
zum Anhängen
von Polyadenosin-Resten an die transkribierte mRNA erkannt wird.
Es kann eine beliebige Polyadenylierungssequenz, die in der Zelle
funktionsfähig
ist, in der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
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Bevorzugte,
in den Fadenpilzzellen funktionsfähige Polyadenylierungssequenzen
werden von den Genen erhalten, die die TAKA-Amylase von Aspergillus
oryzae, die Glucoamylase von Aspergillus niger, die Anthranilat-Synthase
von Aspergillus nidulans und die alpha-Glucosidase von Aspergillus
niger kodieren.
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Bei
der Kontrollsequenz kann es sich ebenso um einen Signalpeptid kodierenden
Bereich handeln, der eine Aminosäuresequenz
kodiert, die mit dem Aminoende des heterologen Polypeptids verbunden
ist und das kodierte Polypeptid in den Sekretionsweg der Zelle leitet.
Das 5'-Ende der
kodierenden Sequenz der Nukleinsäuresequenz
kann von Natur aus einen Signalpeptid kodierenden Bereich enthalten,
der natürlicherweise
im Translationsleserahmen mit dem Segment des kodierenden Bereichs,
der das sezernierte Polypeptid kodiert, verbunden ist. In einer
anderen Ausführungsform
kann das 5'-Ende
der kodierenden Sequenz einen Signalpeptid kodierenden Bereich enthalten,
der für
die kodierende Sequenz fremd ist. Der das fremde Signalpeptid kodierende
Bereich kann erforderlich sein, wo die kodierende Sequenz natürlicherweise
keinen Signalpeptid kodierenden Bereich enthält. In einer anderen Ausführungsform
kann der das fremde Signalpeptid kodierende Bereich einfach den
das natürliche
Signalpeptid kodierenden Bereich ersetzen, um die Sekretion des
Polypeptids zu steigern. Der Signalpeptid kodierende Bereich kann
von einem Glucoamylase- oder Amylase-Gen von einer Aspergillus-Spezies
oder einem Lipase- oder Proteinase-Gen von einer Rhizomucor-Spezies
erhalten werden. Jedoch kann ein beliebiger Signalpeptid kodierender Bereich,
der das exprimierte heterologe Polypeptid in den Sekretionsweg einer
Zelle leitet, in der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
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Bei
einem kodierenden Bereich eines wirksamen Signalpeptids in einer
Fadenpilzzelle handelt es sich um den Signalpeptid kodierenden Bereich,
der von den Genen erhalten wird, die die TAKA-Amylase von Aspergillus
oryzae, die neutrale Amylase von Aspergillus niger, die Aspartat-Proteinase
von Rhizomucor miehei und die Cellulase von Humicola lanuginosa
kodieren.
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Bei
der Kontrollsequenz kann es sich ebenso um einen Propeptid kodierenden
Bereich handeln, der die am Aminoende eines Polypeptids positionierte
Aminosäuresequenz
kodiert. Das resultierende Polypeptid ist als Proenzym oder Propolypeptid
(oder Zymogen in manchen Fällen)
bekannt. Ein Propolypeptid ist im Allgemeinen inaktiv und kann in
ein reifes aktives Polypeptid durch katalytische oder autokatalytische
Abspaltung des Propeptids vom Propolypeptid umgewandelt werden.
Der Propeptid kodierende Bereich kann von den Genen erhalten werden,
die die Aspartat-Proteinase von Rhizomucor miehei und die Laccase
von Myceliophthora thermophila (WO 95/33836) kodieren.
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Wenn
sowohl Signalpeptid- als auch Propeptidbereiche am Aminoende eines
Polypeptids vorliegen, ist der Propeptidbereich neben dem Aminoende
des Polypeptids und der Signalpeptidbereich neben dem Aminoende
des Propeptidbereichs positioniert.
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Die
Nukleinsäurekonstrukte
können
ebenso ein oder mehrere Nukleinsäuresequenzen
umfassen, die ein oder mehrere Faktoren kodieren, die für die Steuerung
der Expression heterologer Polypeptide vorteilhaft sind, z.B. ein
Transkriptionsaktivator (z.B. ein in trans wirkender Faktor), ein
Chaperon und eine verarbeitende Protease. Es kann ein beliebiger
Faktor, der in der Wirtszelle, insbesondere in einer Fadenpilzzelle
funktionsfähig
ist, in der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Die Nukleinsäuren, die
einen oder mehrere dieser Faktoren kodieren, befinden sich nicht
notwendigerweise in Reihe mit der das heterologe Polypeptid kodierenden
Nukleinsäuresequenz.
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Es
kann ebenso erwünscht
sein, regulatorische Sequenzen hinzuzufügen, die die Regulation der
Expression des heterologen Polypeptids bezüglich des Zellwachstums ermöglichen.
Beispiele regulatorischer Systeme sind jene, die die Expression
des an- oder abzuschaltenden Gens als Antwort auf einen chemischen oder
physikalischen Reiz einschließlich
der Anwesenheit einer regulatorischen Verbindung veranlassen. Der TAKA-alpha-Amylase-Promoter,
der Glucoamylase-Promoter von Aspergillus niger und der Glucoamylase-Promoter
von Aspergillus oryzae können
als regulatorische Sequenzen in Fadenpilzzellen verwendet werden.
Andere Beispiele regulatorischer Sequenzen sind jene, die die Genamplifikation
ermöglichen,
z.B. die Metallothionein-Gene ein, die mit Schwermetallen amplifiziert
werden. In diesen Fällen
wäre die
das heterologe Polypeptid kodierende Nukleinsäuresequenz mit der regulatorischen
Sequenz funktionsfähig
verbunden.
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Die
verschiedenen, vorstehend beschriebenen Nukleinsäure- und Kontrollsequenzen
können
zusammengefügt
werden, um einen rekombinanten Expressionsvektor herzustellen, der
eine oder mehrere günstige Restriktionsstellen
einschließt,
die die Insertion oder Substitution der das heterologe Polypeptid
kodierenden Nukleinsäuresequenz
an derartigen Stellen zu ermöglichen.
In einer anderen Ausführungsform
kann die das heterologe Polypeptid kodierende Nukleinsäuresequenz
durch Insertion der Sequenz oder eines die Sequenz umfassenden Nukleinsäurekonstrukts
in einen geeigneten Vektor zur Expression exprimiert werden. Durch
Erzeugen des Expressionsvektors ist die kodierende Sequenz im Vektor
so lokalisiert, dass die kodierende Sequenz funktionsfähig mit
den geeigneten Kontrollsequenzen zur Expression und möglicherweise
Sekretion verbunden ist.
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Bei
dem rekombinanten Expressionsvektor kann es sich um einen beliebigen
Vektor (z.B. ein Plasmid oder Virus) handeln, der in einfacher Weise
den rekombinanten DNA-Verfahren unterzogen werden kann und der die
Expression der das heterologe Polypeptid kodierenden Nukleinsäuresequenz
bewirken kann. Die Wahl des Vektors wird typischerweise von der
Verträglichkeit
des Vektors mit der Zelle, in die der Vektor eingeführt werden
soll, abhängen.
Bei dem Vektor kann es sich um ein lineares oder geschlossenes zirkuläres Plasmid handeln.
Bei dem Vektor kann es sich um einen selbstständig replizierenden Vektor
handeln, d.h. einen Vektor, der als eine extrachromosomale Einheit
vorliegt, deren Replikation von der chromosomalen Replikation unabhängig ist,
z.B. ein Plasmid, ein extrachromosomales Element, ein Minichromosom
oder ein künstliches
Chromosom. Der Vektor kann beliebige Einrichtungen enthalten, um
die Selbstreplikation sicherzustellen. In einer anderen Ausführungsform
kann es sich bei dem Vektor um einen Vektor handeln, der nach Einführung in
die Zelle in das Genom integriert und zusammen mit dem (den) Chromosom(en),
in das (die) er integriert wurde, repliziert wird. Bei dem Vektorsystem
kann es sich um einen/ein einzelnen/s Vektor oder Plasmid oder zwei oder
mehrere Vektoren oder Plasmide, die zusammen die gesamte, in das
Genom der Zelle einzuführende DNA
enthalten, oder ein Transposon handeln.
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Der
Vektor enthält
vorzugsweise einen oder mehrere selektierbare Marker, die eine einfache
Selektion der transformierten Zellen ermöglichen. Bei einem selektierbaren
Marker handelt es sich um ein Gen, dessen Produkt Biozid- oder virale
Resistenz, Resistenz gegen Schwermetalle, Prototrophie für Auxotrophe,
und dergleichen bereitstellt. Ein selektierbarer Marker zur Verwendung
in einer Fadenpilz-Wirtszelle kann aus der Gruppe ausgewählt sein,
die amdS (Acetamidase), argB (Ornithin-Carbamoyltransferase), bar
(Phosphinothricin-Acetyltransferase), hygB (Hygromycin-Phosphotransferase),
niaD (Nitrat-Reduktase), pyrG (Orotidin-5'-phosphat-Decarboxylase), sC (Sulfat-Adenyltransferase)
und trpC (Anthranilat-Synthase) sowie Pendants davon einschließt, ist
aber nicht darauf beschränkt.
Zur Verwendung in einer Fadenpilzzelle bevorzugt sind die amdS- und pyrG-Gene von
Aspergillus nidulans oder Aspergillus oryzea und das bar-Gen von Streptomyces
hygroscopicus.
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Der
Vektor enthält
vorzugsweise ein Element(e), das (die) eine stabile Integration
des Vektors in ein Zellgenom oder eine selbstständige Replikation des Vektors
in der Zelle unabhängig
vom Zellgenom ermöglicht
(ermöglichen).
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Die „Einführung" bedeutet das Einführen eines
die Nukleinsäuresequenz
umfassenden Vektors in eine Zelle, so dass der Vektor als ein chromosomaler
Bestandteil oder als ein selbstreplizierender extrachromosomaler
Vektor aufrechterhalten wird. Die Integration gilt im Allgemeinen
als ein Vorteil, da die Nukleinsäuresequenz
eher stabil in der Zelle aufrechterhalten wird. Die Integration
des Vektors in das Chromosom erfolgt durch homologe Rekombination,
nicht homologe Rekombination oder Transposition.
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Die
Einführung
eines Expressionsvektor in eine Zelle kann ein Verfahren umfassen,
das aus der Protoplastenbildung, der Transformation der Protoplasten
und der Regeneration der Zellwand in einer an sich bekannten Weise
besteht. Geeignete Verfahren zur Transformation von Aspergillus-Wirtszellen
sind in
EP 238 023 und
Yelton et al., 1984, Proceedings of the National Academy of Sciences
USA 81, 1470–1474,
beschrieben. Ein geeignetes Verfahren zur Transformation von Fusarium-Spezies
ist von Malardier et al., 1989, Gene 78, 147–156, oder in WO 96/00787 beschrieben.
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Zur
Integration in das Genom einer Zelle kann der Vektor auf die das
heterologe Polypeptid kodierende Nukleinsäuresequenz oder ein beliebiges
anderes Element des Vektors zur stabilen Integration des Vektors ins
Genom durch homologe oder nicht homologe Rekombination angewiesen
sein. In einer anderen Ausführungsform
kann der Vektor zusätzliche
Nukleinsäuresequenzen
zur Steuerung der Integration durch homologe Rekombination ins Genom
der Zelle enthalten. Die zusätzlichen
Nukleinsäuresequenzen
ermöglichen,
dass der Vektor ins Genom an einer bestimmten Stelle(n) in dem (den)
Chromosom(en) integriert wird. Um die Wahrscheinlichkeit der Integration
an einer bestimmten Stelle zu erhöhen, sollten die Integrationselemente vorzugsweise
eine ausreichende Anzahl von Nukleinsäu ren enthalten, z.B. 100 bis
1500 Basenpaare, vorzugsweise 400 bis 1500 Basenpaare und am stärksten bevorzugt
800 bis 1500 Basenpaare, die mit der entsprechenden Zielsequenz
hochgradig homolog sind, um die Wahrscheinlichkeit der homologen
Rekombination zu steigern. Bei den Integrationselementen kann es
sich um beliebige Sequenzen handeln, die mit der Zielsequenz im
Zellgenom homolog sind. Des Weiteren kann es sich bei den Integrationselementen
um nicht kodierende oder kodierende Nukleinsäuresequenzen handeln. Andererseits
kann der Vektor ins Zellgenom durch nicht homologe Rekombination
integriert werden.
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Für die selbstständige Replikation
kann der Vektor ferner einen Ursprungspunkt der Replikation umfassen,
der es ermöglicht,
dass der Vektor selbstständig
in der fraglichen Fadenpilzzelle repliziert.
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Es
wird selbstverständlich
sein, dass die Verfahren der vorliegenden Erfindung nicht auf eine
bestimmte Reihenfolge beschränkt
sind, um die Mutantenzelle zu erhalten. Die Modifikation eines Gens,
die in die Herstellung eines Polypeptids mit Oxalacetat-Hydrolase-Aktivität einbezogen
ist, kann in die Ausgangszelle an einem beliebigen Schritt in der
Konstruktion der Zelle zur Herstellung eines heterologen Polypeptids
eingeführt werden.
Es ist bevorzugt, dass die Zelle vor der Einführung eines ein heterologes
Polypeptid kodierenden Gens mit einem Oxalacetat-Hydrolase-Defekt
unter Verwendung der Verfahren der vorliegenden Erfindung versehen
wurde.
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Die
zur Ligation der hierin beschriebenen Elemente verwendeten Verfahren,
um die rkombinaten Expressionsvektoren zu konstruieren, sind einem
Fachmann bekannt (siehe z.B. Sambrook, J., Fritsch, E. F. und Maniatis,
T., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Auflage, Cold
Spring Harbor, New York).
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Die
vorliegende Erfindung betrifft ebenso Verfahren zum Erhalten von
Mutantenzellen mit einem Oxalacetat-Hydrolase-Defekt, insbesondere
Fadenpilz- Mutantenzellen,
umfassend (a) das Einführen
einer ersten Nukleinsäuresequenz,
die eine Modifikation von mindestens einem der Gene umfasst, die
an der Herstellung einer Oxalacetat-Hydrolase beteiligt sind, in
eine Ausgangszelle, insbesondere eine Fadenpilz-Ausgangszelle, und
einer zweiten, ein heterologes Polypeptid kodierenden Nukleinsäuresequenz,
und (b) das Identifizieren der Mutante von Schritt (a), die die
modifizierte Nukleinsäuresequenz
umfasst, wobei die Mutantenzelle weniger Oxalacetat-Hydrolase als
die Ausgangszelle der Mutantenzelle herstellt, wenn sie unter denselben
Bedingungen gezüchtet
wird.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft ebenso Mutanten von Zellen mit einem
Oxalacetat-Hydrolase-Defekt, insbesondere Fadenpilzzellen, zur Herstellung
eines heterologen Polypeptids, die eine erste Nukleinsäuresequenz,
welche eine Modifikation von mindestens einem der Gene umfasst,
die an der Herstellung eines Polypeptids mit Oxalacetat-Hydrolase-Aktivität beteiligt
sind, und eine zweite, das heterologe Polypeptid kodierende Nukleinsäuresequenz
umfassen, wobei die Mutante weniger Polypeptid mit Oxalacetat-Hydrolase-Aktivität als die
Ausgangszelle der Mutantenzelle herstellt, wenn sie unter denselben
Bedingungen gezüchtet
wird.
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In
einer anderen Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung kann die Mutantenzelle zusätzlich Modifikationen
einer oder mehrerer Nukleinsäuresequenzen
enthalten, die Proteine kodieren, welche für die Herstellung, Gewinnung
und/oder Anwendung des gewünschten
Produkts, wie z.B. des heterologen Polypeptids von Interesse nachteilig
sind. Die Modifikation vermindert oder eliminiert die Expression
von einer oder mehreren dritten Nukleinsäuresequenzen, was zu einer
Mutantenzelle mit einer modifizierten dritten Nukleinsäuresequenz
führt,
die mehr heterologes Polypeptid als die Mutantenzelle ohne Modifikation
der dritten Nukleinsäuresequenz
herstellen kann, wenn sie unter denselben Bedingungen gezüchtet wird.
Die dritte Nukleinsäuresequenz
kann ein beliebiges Protein oder Enzym kodieren. Zum Beispiel kann
es sich bei dem Enzym um eine Aminopeptidase, Amylase, Carbohydrase,
Carboxypeptidase, Katalase, Cellulase, Chitinase, Cutinase, Cyclodextrin-Glycosyltransferase,
Desoxyribonuklease, Esterase, alpha- Galactosidase, beta-Galactosidase, Glucoamylase,
alpha-Glucosidase, beta-Glucosidase,
Invertase, Laccase, Lipase, Mannosidase, Mutanase, Oxidase, ein
pektinolytisches Enzym, eine Peroxidase, Phospholipase, Phytase,
Polyphenol-Oxidase,
ein proteolytisches Enzym, eine Ribonuklease, Transglutaminase und
Xylanase handeln. Die dritte Nukleinsäuresequenz kodiert vorzugsweise
ein proteolytisches Enzym, z.B. eine Aminopeptidase, eine Carboxypeptidase oder
eine Protease.
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In
einer weiteren Ausführungsform
betrifft die vorliegende Erfindung ein Proteinprodukt, das im Wesentlichen
frei von Oxalacetat-Hydrolase-Aktivität ist und das durch ein Verfahren
der vorliegenden Erfindung hergestellt wird.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft ebenso Nukleinsäurekonstrukte, rekombinante
Expressionsvektoren und Wirtszellen, die die Nukleinsäuresequenz
von SEQ ID NR:1, Untersequenzen oder Homologe davon (wie in dem
Abschnitt mit dem Titel „Isolierte,
Polypeptide mit Oxalacetat-Hydrolase-Aktivität kodierende Nukleinsäuresequenzen" beschrieben) enthalten,
zur Expression der Sequenzen. Die Konstrukte und Vektoren können wie
hierin beschrieben konstruiert werden. Bei der Wirtszelle kann es
sich um eine beliebige, für
die Expression der Nukleinsäuresequenz
geeignete Zelle handeln, insbesondere eine beliebige der Zellen,
die in dem Abschnitt mit dem Titel „Isolierte, Polypeptide mit
Oxalacetat-Hydrolase-Aktivität kodierende
Nukleinsäuresequenzen" als Quelle für die Nukleinsäuresequenzen
der Erfindung erwähnt
sind. Insbesondere kann es sich bei der Wirtszelle um eine Fadenpilzzelle
handeln, z.B. eine Aspergillus- Zelle, wie A. niger oder A. oryzae, oder
eine Fusarium-Zelle.
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Pilzzellen
können
durch ein Verfahren transformiert werden, das die Protoplastenbildung,
die Transformation der Protoplasten und die Regeneration der Zellwand
in einer an sich bekannten Weise umfasst. Geeignete Verfahren zur
Transformation von Aspergillus-Wirtszellen sind in
EP 238 023 und Yelton et al., 1984, Proceedings
of the National Academy of Sciences USA 81, 1470–1474, beschrieben. Geeignete
Verfahren zur Transformation von Fusarium-Spezies sind von Malardier
et al., 1989, Gene 78, 147–156,
und in WO 96/00787 beschrieben. Hefen können durch Verwenden der Verfahren,
die von Becker und Guarente, in Abelson, J. N. und Simon, M. I.,
Hrsg., Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in
Enzymology, Band 194, S. 182–187,
Academic Press, Inc., New York; Ito et al., 1983, Journal of Bacteriology
153, 163; und Hinnen et al., 1978, Proceedings of the National Academy
of Sciences USA 75, 1920, beschrieben wurden, transformiert werden.
-
Herstellungsverfahren
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Die
vorliegende Erfindung betrifft ebenso Verfahren zur Herstellung
eines durch eine Nukleotidsequenz der Erfindung kodierten Polypeptids,
die (a) das Züchten
der Wirtszelle, die eine Nukleotidsequenz der Erfindung trägt, unter
für die
Herstellung des Polypeptids geeigneten Bedingungen und (b) das Gewinnen
des Polypeptids umfassen.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft ebenso Verfahren zur Herstellung
eines Polypeptids der vorliegenden Erfindung, umfassend (a) das
Züchten
der Wirtszelle unter für
die Herstellung des Polypeptids förderlichen Bedingungen, wobei
die Wirtszelle eine Nukleinsäuresequenzvariante
mit mindestens einer Mutation in dem das reife Polypeptid kodierenden
Bereich von SEQ ID NR:1 umfasst, wobei die Nukleinsäuresequenzvariante ein
aus den Aminosäuren
1 bis 341 von SEQ ID NR:2 bestehendes Polypeptid kodiert, und (b)
das Gewinnen des Polypeptids.
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Bei
den Herstellungsverfahren der vorliegenden Erfindung werden die
Zellen in einem Nährmedium gezüchtet, das
für die
Herstellung des Polypeptids unter Verwendung von auf dem Fachgebiet
bekannten Verfahren geeignet ist. Zum Beispiel kann die Zelle durch
eine Schüttelkolbenzüchtung,
eine Fermentation im Klein- oder
Großmaßstab (einschließlich kontinuierlicher,
Chargen-, Zulauf- oder Festbett-Fermentationen) in Labor- oder Industriefermentern
gezüchtet
werden, die in einem geeigneten Medium und unter Bedingungen durchgeführt werden,
die es ermöglichen,
das Polypeptid zu exprimieren und/oder zu isolieren. Die Züchtung erfolgt
in einem geeigneten Nährmedium,
das Kohlenstoff- und Stickstoffquellen und anorganische Salze umfasst,
unter Verwendung von auf dem Fachgebiet bekannten Verfahren. Geeignete
Medien sind im Handel erhältlich
oder können
gemäß den veröffentlichten
Zusammensetzungen (z.B. in Katalogen der American Type Culture Collection)
präpariert
werden. Wenn das Polypeptid in das Nährmedium sezerniert wird, kann
das Polypeptid direkt aus dem Medium gewonnen werden. Wenn das Polypeptid
nicht sezerniert wird, kann es aus Zelllysaten gewonnen werden.
-
Die
Polypeptide können
unter Verwendung von auf dem Fachgebiet bekannten Verfahren, die
für die Polypeptide
spezifisch sind, nachgewiesen werden. Diese Nachweisverfahren können die
Verwendung spezifischer Antikörper,
die Bildung eines Enzymprodukts oder das Verschwinden eines Enzymsubstrats
einschließen.
Zum Beispiel kann ein Enzymtestverfahren verwendet werden, um die
Aktivität
des Polypeptids wie hierin beschrieben zu bestimmen.
-
Das
so erhaltene Polypeptid kann durch auf dem Fachgebiet bekannte Verfahren
gewonnen werden. Zum Beispiel kann das Polypeptid aus dem Nährmedium
durch herkömmliche
Verfahren gewonnen werden, einschließlich der Zentrifugation, Filtration,
Extraktion, Sprühtrocknung,
Verdampfung oder Ausfällung,
ist jedoch nicht darauf beschränkt.
-
Die
Polypeptide können
durch eine Vielfalt auf dem Fachgebiet bekannter Verfahren, einschließlich der
Chromatographie (z.B. Ionenaustausch-, Affinitäts-, hydrophobe, Chromatofokussierung
und Größenausschluss-),
elektrophoretischer Verfahren (z.B. präparative isoelektrische Fokussierung),
differenzieller Löslichkeit
(z.B. Ammoniumsulfatfällung),
SDS-PAGE oder Extraktion (siehe z.B. Protein Purification, Janson,
J.-C., und Ryden, Lars, Hrsg., VCH Publishers, New York, 1989),
gereinigt werden, sind jedoch nicht darauf beschränkt.
-
Verwendungen
-
Die
vorliegende Erfindung betrifft ebenso Verfahren zur Verwendung von
Polypeptiden mit Oxalacetat-Hydrolase-Aktivität.
-
Die
Polypeptide der vorliegenden Erfindung können zum Nachweis von Oxalsäure in Nahrungsmitteln und
anderen Produkten verwendet werden.
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Die
Nukleotidsequenzen der vorliegenden Erfindung können zur Modifikation der Herstellung
der Oxalacetat-Hydrolase und somit der Oxalsäure durch eine Zelle, wie z.B.
eine mikrobielle Zelle, die normalerweise die Hydrolase herstellt,
verwendet werden. Insbesondere können
die Nukleotidsequenzen dazu verwendet werden, die Herstellung der
Oxalacetat-Hydrolase und somit der Oxalsäure durch die fragliche Zelle
zu reduzieren oder zu eliminieren.
-
Die
vorliegende Erfindung ist durch die folgenden Beispiele weiter beschrieben,
die nicht als Begrenzung des Umfangs der Erfindung ausgelegt werden
sollten.
-
Beispiele
-
Bei
den als Puffer und Substrate verwendeten Chemikalien handelte es
sich um Handelsprodukte von mindestens Reagenzqualität.
-
Stämme:
-
- Aspergillus niger BO1 (DSM 12665)
- Escherichia coli DH5α,
Woodcock, D. M. et al. (1989), Nucleic Acids Res. 17, 3469–3478
-
Medien und Testverfahren:
-
- Puffer A: 50 mM Tris/HCl, pH 7,5, 2 mM MnCl2,
20 mM DTT, 5% Sucrose.
- Oxalacetat-Hydrolase-Aktivität-Testverfahren:
1000 ml 0,1 M MOPS, pH 7,5, 2 mM MnCl2,
25 ml 40 mM Oxalacetat, 5 auf 100 ml Probe. Die Absorption wurde
bei 255 nm gemessen. Die Aktivität
wurde aus der Geschwindigkeit der Absorptionsabnahme und dem Absorptionskoeffizienten
von Oxalacetat (1,1 mM–1 cm–1,
Lenz et al., Partial purification and some properties of oxalacetase
from Aspergillus niger. 1976, Eur. J. Biochem. 65, 225–236) bestimmt.
Das Testverfahren wurde bei 30°C
durchgeführt.
- Protein-Testverfahren: Die Proteinkonzentrationen wurden durch
Verwenden des „BioRad
Protein Assays" von BioRad
(Hercules, CA, USA), Kat.-Nr. 55-0006, nach den Herstellerangaben
und mit Rinderserumalbumin als Standard gemessen.
-
Beispiel 1
-
Reinigung der Oxalacetat-Hydrolase
(EC 3.7.1.1)
-
Aspergillus
niger BO1 wurde in Schüttelkolben
bei 30°C
in folgendem Medium fermentiert: Sucrose 20 g/l, NaNO3 15
g/l, KH2PO4 1,5
g/l, MgSO4·7 H2O
1 g/l, NaCl 1 g/l, CaCl2·2 H2O
0,1 g/l, Spuren(elemente)-Lösung
0,5 ml/l. Spuren(elemente)-Lösung:
ZnSO4·7
H2O 14,3 g/l, CuSO4·5 H2O 2,5 g/l, NiCl2·6 H2O 0,5 g/l, FeSO4·7 H2O 13,8 g/l, MnCl2 6
g/l. Der pH-Wert lag bei 2,5 bis eine Biomassenkonzentration von
etwa 0,5 g/l erreicht wurde. Dann wurde der pH-Wert auf 6 durch Zugabe von 2 M NaOH
verschoben und die Zellen wurden gezüchtet bis die Biomassenkonzentration
etwa 5 g/l erreichte. Die Zellen wurden durch Filtration geerntet,
mit 0,9%igem (Gew./Vol.) NaCl gewaschen und dann in flüssigem Stickstoff
eingefroren. Die eingefrorenen Zellen wurden in einem Mörser unter
flüssigem
Stickstoff aufgebrochen und dann in Puffer A suspendiert. Die Suspension
wurde zentrifugiert (15 Min., 40,000 × g, 4°C) und der Überstand iso liert. Ammoniumsulfat
wurde bis zur 45%igen Sättigung
(277 g/l) zugesetzt und die gebildete Suspension zentrifugiert (15
Min., 40,000 × g,
4°C) und
der Überstand
verworfen. Der Niederschlag wurde in Puffer A gelöst und durch
ein Filter von 0,45 μm
filtriert.
-
Ammoniumsulfat
wurde zur Probe bis zu einer Leitfähigkeit von 50 mS/cm zugesetzt.
Die Probe wurde dann auf eine Säule „Phenyl
Sepharose High Performance" (Amersham
Pharmacia Biotech, Uppsala), die mit in Puffer A gelöstem Ammoniumsulfat
von 0,5 M äquilibiert
war, nach den Herstellerangaben aufgetragen. Die Säule wurde
mit demselben Puffer gewaschen und dann unter Verwendung eines linearen
Salzgradienten von in Puffer A gelöstem Ammoniumsulfat von 0,5
M bis zum reinen Puffer A eluiert.
-
Die
Fraktionen mit Oxalacetat-Hydrolase-Aktivität wurden vereinigt. Diese Lösung wurde
mit 2 mM MnCl2, 20 mM DTT, 5% Sucrose bis
zu einer Leitfähigkeit
von 4 mS/cm verdünnt
und dann auf eine Säule „Q Sepharose
High Performance" (Amersham
Pharmacia Biotech, Uppsala) aufgetragen, die mit Puffer A äquilibriert
war. Die Säule
wurde mit Puffer A gewaschen und dann unter Verwenden eines linearen
Salzgradienten von 0 M bis 0,5 M NaCl, das in Puffer A gelöst war,
eluiert. Die Fraktionen mit Oxalacetat-Hydrolase-Aktivität wurden
vereinigt.
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Die
Proben wurden auf eine PD-10-Säule
(Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala), die mit 10 mM NaH2PO4, pH 7,2, 0,1
mM MnCl2, 5% Sucrose, 10 mM DTT äquilibriert
war, aufgetragen und mit demselben Puffer eluiert. Die Proben wurden
auf eine Säule „Econo-Pac
HTP" (BioRad, Hercules,
CA, USA) aufgetragen, die mit 10 mM NaH2PO4, pH 7,2, 0,1 mM MnCl2,
5% Sucrose, 10 mM DTT äquilibriert
war. Die Säule
wurde mit 10 mM NaH2PO4,
pH 6,8, 0,1 mM MnCl2, 5% Sucrose, 10 mM
DTT gewaschen und dann mit einem linearen Gradienten von 10 mM NaH2PO4, pH 6,8, 0,1
mM MnCl2, 5% Sucrose, 10 mM DTT bis 400
mM NaH2PO4, pH 6,8,
0,1 mM MnCl2, 5% Sucrose, 10 mM DTT eluiert.
Die Proben mit Oxalacetat-Hydrolase-Aktivität wurden für die SDS-PAGE verwendet.
-
Beispiel 2
-
Proteinsequenzbestimmung
von Oxalacetat-Hydrolase-Fragmenten
-
Die
gereinigte Oxalacetat-Hydrolase von Beispiel 1 wurde der SDS-PAGE-Gelelektrophorese
in einem 12,5%igen Gel unter Verwendung von Standardverfahren (Laemmli,
U. K., 1970. Cleavage of structural proteins during the assembly
of the head of bacteriophage T4. Nature 227, 680–685) unterzogen. Die Proteine
wurden auf eine PVDF-Membran durch das Elektroblot-Verfahren übertragen
und die Membran wurde mit „Coomassie
Brilliant Blue R-250" wie
von Plough et al. (Plough, M., Jensen, A. L. und Barkholt, V. 1989,
Anal. Biochem. 181, 33–39)
beschrieben gefärbt.
4 Proteinbanden im Bereich eines apparenten Molekulargewichts von 38
bis 40 kD wurden ausgeschnitten und für die aminoterminale Sequenzanalyse
unter Verwenden eines „Procise – 494 protein
sequencers" von
Perkin Elmer, Applied Biosystems, Norwalk, CT, USA, nach den Herstellerangaben
verwendet. Es wurden die folgenden Sequenzen erhalten:
- 1. MKVDTPDSASTISMTN (SEQ ID NR: 3)
- 2. TNTITITVEQDGIYE (SEQ ID NR: 4)
- 3. VEQDGIYEIN (SEQ ID NR: 5)
- 4. GARQEPVVNLNMVTG (SEQ ID NR: 6).
-
Beispiel 3
-
Klonierung
des Oxalacetat-Hydrolase kodierenden Gens
-
Die
in Beispiel 2 bestimmten Proteinsequenzen wurden für Datenbanksuchen
verwendet und eine EST-Sequenz von Aspergillus niger wurde abgerufen
(EMBL, T82752, AN752). Diese EST-Sequenz kodiert eine Proteinsequenz,
die mit den vier Sequenzen von Beispiel 2 mit 100%iger Identität angeordnet
werden konnte. Die EST-Sequenz wurde verwendet, um die folgenden
PCR-Primer zu entwerfen:
Oxalac EST Sense: 5' AAA GTT GAT ACC
CCC GAT TCT 3' (SEQ
ID NR: 7)
Oxalac EST Antisense: 5' ATG GCA ATA CGG GGA CAG ACC 3' (SEQ ID NR: 8).
-
Diese
Primer wurden verwendet, um die DNA von A. niger BO1, die im Wesentlichen
wie von Leach et al. (Leach, J., Finkelstein, D. B. und Rambosek,
J. A. (1986) Fungal gent. newsl. 33, 32–33) beschrieben präpariert
wurde, unter Verwendung der Taq-Polymerase „amplitaq" von Perkin Elmer (Norwalk, CT, USA) nach
den Herstellerangaben zu amplifizieren. Die PCR-Reaktion wurde in
einem „MJ
PCT 150 capillary PCR cycler" (MJ
research, Watertown, MA, USA) in einem Volumen von 10 μl betrieben,
indem 30 Zyklen mit einer Denaturierungstemperatur von 94°C für eine Dauer
von 10 Sek., einer Hybridisierungstemperatur von 55°C für eine Dauer
von 10 Sek. und einer Verlängerungstemperatur
von 72°C
für eine
Dauer von 30 Sek. mit einem Temperaturgradienten von der Denaturierung
bis zur Hybridisierung von –0,5°C/Sek. ausgeführt wurden.
-
Das
erhaltene Fragment von 219 Bp wurde in den pCR II-Vektor (Invitrogen,
Carlsbad, CA, USA) nach den Herstellerangaben ligiert und in Escherichia
coli DH5α wie
von Sambrook (Sambrook, J. et al. (1989), Molecular cloning, a laboratory
manual, zweite Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press) beschrieben
transformiert. Ein Klon, der eine Insertion der erwarteten Größe enthielt,
wurde unter Verwenden der folgenden Primer sequenziert:
M13-Rückwärts-Primer:
5' CAG GAA ACA GCT
ATG AC 3' (SEQ ID
NR: 9)
M13-Vorwärts-(–20)-Primer:
5' GTA AAA CGA CGG
CCA G 3' (SEQ ID
NR: 10).
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Die
DNA-Sequenzanalyse wurde unter Verwenden eines „ABI PRISM 377 DNA Sequencers" zusammen mit dem „ABI PRISM
BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit" (Perkin Elmer Applied Biosystems,
Foster city, CA, USA) nach den Empfehlungen des Herstellers durchgeführt. Die
Sequenzen bestätigten,
dass es sich bei dem Fragment um die gewünschte Sequenz handelt.
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Es
wurde eine Restriktionskarte durch Southern-Blot-Analyse unter Verwenden
der 219-Bp-Insertion als Sonde gemäß den Protokollen von Sambrook
et al. erstellt. Aus dieser Restriktionskarte wurde geschlossen,
dass das Gen auf einem BglII-Fragment von 5 kB lokalisiert ist.
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Das
Gen wurde dann durch inverse PCR kloniert: Die genomische DNA von
A. niger BO1 wurde mit BglII gespalten und die Fragmente, die sich über einen
Bereich von 4 kB bis 6 kB erstreckten, wurden aus einem Agarosegel
gewonnen. Die DNA wurde unter Verwenden der T4-DNA-Ligase bei 16°C ligiert.
Dieses Ligationsgemisch wurde als Matrize in einer PCR-Reaktion
unter Verwenden der folgenden Primer verwendet:
OXEST1 5' GAC GGT CTG TCG
CCG TAT TGC 3' (SEQ
ID NR: 11)
OXEST2 5' GGA
AGC AGA ATC GGG GGT ATC 3' (SEQ
ID NR: 12).
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Die „Expand
high fidelity polymerase" (Boehringer
Mannheim, Mannheim, Deutschland) wurde zur Amplifikation nach den
Empfehlungen des Herstellers verwendet. Die MgCl2-Konzentration
in der Reaktion war 1 mM. Ansonsten entsprachen die Bedingungen
wie vorstehend. Es wurde ein Fragment von 5 kB erzeugt. Dieses Fragment
wurde mit BglII gespalten und das gespaltene Fragment wurde in den
mit BamHI und HincII gespaltenen pUC 19 (Yanisch-Perron, C. et al.
(1985) Gene 33, 103–119)
ligiert. Das Ligationsgemisch wurde in E. coli DH5α transformiert.
Es wurden Kolonien mit Insertionsgrößen von 1,3 kB und 3,7 kB gefunden.
Eine Kolonie von jeder Klasse wurde unter Verwenden des M13-Rückwärts-Primers
und des M13-Vorwärts-(–20)-Primers
sequenziert. Auf diese Art und Weise wurden die benachbarten Sequenzen
von BglII bestimmt und die folgenden Primer entworfen, um das BglII-Fragment
von 5 kB durch PCR zu amplifizieren.
Flank 1: 5' GCG GCC GCG CGC
CAA TAA CGT CCG ATT C 3' (SEQ
ID NR: 13)
Flank 2: 5' GCG
GCC GCC TAC AAA TAC ATT GAC CTC CC 3' (SEQ ID Nr: 14).
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Diese
Primer wurden verwendet, um die genomische DNA von A. niger BO1
unter Verwenden derselben PCR-Bedingungen wie für die inverse PCR zu amplifizieren.
Das erzeugte Fragment von 5 kB wurde in pCR II ligiert, um pHP I
zu bilden. Das Oxalacetat-Hydrolase-Gen wurde unter Verwenden von
pHP I als Matrize mit den folgenden Primern sequenziert.
Oxalac
EST Sense: 5' AAA
GTT GAT ACC CCC GAT TCT 3' (SEQ
ID NR: 15)
Oxalac EST Antisense: 5' ATG GCA ATA CGG CGA CAG ACC 3' (SEQ ID NR: 16)
OXEST
1: 5' GAC GGT CTG
TCG CCG TAT TGC 3' (SEQ
ID NR: 17)
OXEST 2: 5' GGA
AGC AGA ATC GGG GGT ATC 3' (SEQ
ID NR: 18)
OXEST 3: 5' GCC
GGA GTC GCG GGA TTC CAC 3' (SEQ
ID NR: 19)
OXEST 4: 5' GGC
GGA CTA TGA TTT GTG CC 3' (SEQ
ID NR: 20)
OX5: 5' TGA
TGG TCG CCC GTT CCG TT 3' (SEQ
ID NR: 21)
OX6: 5' TGC
CAT TCA ATT TTC TTG GCC 3' (SEQ
ID NR: 22)
OX7: 5' TGA
TCT TCG ATG TGG AAT CCC 3' (SEQ
ID NR: 23)
OX8: 5' GAT
GGC GTC GAT TGA CCA TTT 3' (SEQ
ID NR: 24)
OX9: 5' GGA
GAT GGG TTT GCT AAT GGT GTT 3' (SEQ
ID NR: 25)
OX10: 5' TTA
GCA AAC CCA TCT CCA CC 3' (SEQ
ID NR: 26)
OX11: 5' CGA
ATT ACT GGT CAT TAG CCC 3' (SEQ
ID NR: 27)
OX12: 5' CGA
GAG AAG TAT TCT AGA CCC 3' (SEQ
ID NR: 28)
OX13: 5' TGA
CTG TCG ATC AGG GTG TT 3' (SEQ
ID NR: 29)
OX14: 5' GTG
TGC GGA TTG ATG GAC TC 3' (SEQ
ID NR: 30)
OX15: 5' CAA
CCC AAC TCA ACA ACT CT 3' (SEQ
ID NR: 31)
FLANKE1: 5' GCG
GCC GCG CGC CAA TAA CGT CCG ATT C 3' (SEQ ID NR: 32)
FLANKE2: 5' GCG GCC GCC TAC
AAA TAC ATT GAC CTC CC 3' (SEQ
ID NR: 33)
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Die
DNA-Sequenz ist in SEQ ID NR:1 dargestellt. Die Sequenz wurde bezüglich der
kodierenden Sequenz und bezüglich
der Anwesenheit von Introns unter Verwendung der Computer-Software
Netgene 2 (Hebsgaard, S. M., Korning, P. G., Tolstrup, N., Engelbrecht,
J., Rouze, P., Brunak, S. (1996) Nucleic Acids Research 24: 3439–3452) analysiert
und legt die Existenz von 3 Exons nahe (siehe Anmerkungen für SEQ ID NR:1).
Die von diesen 3 Introns abgeleitete Proteinsequenz mit 341 Resten
ist in SEQ ID NR:2 dargestellt.
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Datenbanksuchen
unter Verwenden dieser Proteinsequenz (oah) als Abfragesequenz offenbarte
eine Sequenzhomologie mit der Isocitrat-Lyase von Aspergillus nidulans
(Swiss Prot P28298) und Neurospora crassa (Swiss Prot P28299) sowie
der Carboxyvinyl-Carboxyphosphonat-Phosphorylmutase von Streptomyces hygroscopicus
(Swiss Prot P11435) und einem hypothetischen Protein von Bacillus
subtilis (Swiss Prot P54528).
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Ein
Stamm von E. coli, der das Plasmid pHP1 trägt, wurde als DSM 12660 hinterlegt.
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Beispiel 4:
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Unterbrechung
des Oxalacetat-Hydrolase-Gens
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pHP
I wurde mit NruI und BstEII gespalten und das Fragment von 6,6 kB
isoliert. Ein Plasmid, das das pyrG-Gen von Aspergillus niger trägt, pJRoy
10 (1), wurde mit NcoI gespalten und die rezessiven
5'-Enden wurden
dann mit dem Klenow-Fragment der DNA-Polymerase I aufgefüllt und
dann mit BstEII gespalten. Das Fragment von 2948 Bp wurde isoliert
und mit dem Fragment von pHP I ligiert. Das Ligationsgemisch wurde
verwendet, um E. coli DH5α zu
transformieren. Es wurde eine Kolonie identifiziert, die das gewünschte Plasmid
trägt,
und das Plasmid wurde als pHP 3 (2) bezeichnet.
Ein das Plasmid pHP 3 tragender Stamm von E. coli wurde als DSM
12661 hinterlegt.
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Der
Abkömmling
JRoy3 von A. niger BO1 mit defektem pyrG (BO1 wurde durch Transformieren
mit einem Deletionsfragment des pyrG-Genbereichs und Selektieren
auf FOA pyrG-negativ gemacht) wurde mit dem EcoRI-NotI-Fragment von pHP3
von 5 kB unter Verwenden der in dem EP-Patent
EP 0 531 372 B1 beschriebenen
Verfahren transformiert. 275 Transformanten wurden zweimal erneut
isoliert und dann in 96-Loch-Mikrotiterplatten bei 34°C, pH 6,0
für eine
Dauer von 48 Std. in dem folgenden Medium gezüchtet: Glucose 20 g/l, NaNO
3 15 g/l, KH
2PO
4 1,5 g/l, MgSO
4·7 H
2O 1 g/l, NaCl 1 g/l, CaCl
2·2 H
2O 0,1 g/l, Spuren(elemente)lösung 0,5
ml/l. Spuren(elemente)lösung:
ZnSO
4·7
H
2O 14,3 g/l, CuSO
4·5 H
2O 2,5 g/l, NiCl
2·6 H
2O 0,5 g/l, FeSO
4·7 H
2O 13,8 g/l, MnCl
2 6
g/l. Die Überstände wurden
bezüglich
Oxalat unter Verwendung des Oxalat-Kits (Kat.-Nr. 591-C) von Sigma
(St. Louis, MO, USA) getestet. Es wurden 8 Transformanten gefunden,
die Oxalat nicht herstellen. 6 von jenen wurden der Southern-Blot-Analyse
zusammen mit 2 Oxalat herstellenden Transformanten, BO1 und JRoy3
als Positivkontrollen, unterzogen. Das in Beispiel 3 beschriebene EST-PCR-Fragment
von 219 Bp wurde als Sonde verwendet. Ein separater Blot mit denselben
Proben wurde mit dem NcoI-BstEII-Fragment von pJRoy 10 untersucht.
Die Southern-Blots offenbarten, dass die 6 Oxalat-negativen Stämme in dem
Oxalacetat-(Hydrolase-)Gen unterbrochen wurden, während die
Positivkontrollen intakte Oxalacetat-(Hydrolase-)Gene enthielten.
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Beispiel 5
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Fermentation
eines Oxalat-negativen Stamms
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Einer
der Oxalat-negativen Stämme
wurde in einem Chargen-Fermenter gezüchtet, der mit einer Rührvorrichtung,
Temperaturkontrolle, pH-Wert-Kontrolle und Belüftung ausgestattet war. Bei
dem Medium handelte es sich um Glucose 16 g/l, (NH4)2SO4 7,5 g/l, KH2PO4 1,5 g/l, MgSO4·7
H2O 1 g/l, NaCl 1 g/l, CaCl2·2 H2O 0,1 g/l, Spuren(elemente)lösung 0,5
ml/l. Spuren(elemente)lösung:
ZnSO4·7
H2O 14,3 g/l, CuSO4·5 H2O 2,5 g/l, NiCl2·6 H2O 0,5 g/l, FeSO4·7 H2O 13,8 g/l, MnCl2 6
g/l. Der pH-Wert lag bei 2,5, bis die Biomasse eine Konzentration
von 0,5 g/l erreicht hatte. An diesem Punkt wurde der pH-Wert auf
pH-Wert 6,0 verschoben. Die Fermentationsbrühe wurde bezüglich Oxalat,
Citrat, Pyruvat, Succinat, Acetat, Glycerin, Ethanol und Glucose analysiert
(Nissen, T. L., Schulze, U., Nielsen, J. und Villadsen, J., 1997.
Flux distributions in anaerobic, glucoselimited continuous cultures
of Saccharomyces cerevisiae. Microbiol. 143, 203–218). Von den Abfallprodukten
konnten nur Citrat, Pyruvat, Succinat und Glycerin nachgewiesen
werden und die maximalen Konzentrationen dieser Abfallprodukte lagen
jeweils bei 0,74 g/l, 0,18 g/l, 0,14 g/l und 0,13 g/l. Die Biomasseausbeute
mit Glucose lag bei 0,58 g/g und die spezifische Wachstumsgeschwindigkeit
bei 0,23 h–1.
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Hinterlegung des biologischen
Materials
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Das
folgende biologische Material wurde gemäß dem Budapester Vertrag mit
der DSMZ, Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen
GmbH, Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig, Deutschland, hinterlegt
und mit den folgenden Zugangsnummern bezeichnet:
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Der
Stamm wurde unter Bedingungen hinterlegt, die sicherstellen, dass
der Zugang zu der Kultur während
der Anhängigkeit
dieser Patentanmeldung für
jemanden zur Verfügung
steht, der von dem Beauftragten für Patente und Markenzeichen
bestimmt wird, um gemäß 37 C.F.R. §1.14 und
35 U.S.C. §122
dazu berechtigt zu sein. Die Hinterlegung stellt eine im Wesentlichen
reine Kultur des hinterlegten Stamms dar. Die Hinterlegung steht
wie von ausländischen
Patentgesetzen gefordert in Ländern
zur Verfügung,
in denen Duplikate des Anmeldungsgegenstands oder dessen Abkömmlinge
archiviert werden. Jedoch sollte es selbstverständlich sein, dass die Verfügbarkeit
einer Hinterlegung keine Lizenz begründet, den Erfindungsgegenstand
unter Schmälerung
der durch die Regierung gewährten
Patentrechte zu betreiben.
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Die
hierin beschriebene und beanspruchte Erfindung soll durch die hierin
offenbarten, spezifischen Ausführungsformen
nicht beschränkt
sein, da diese Ausführungsformen
als Veranschaulichungen der einzelnen Ausführungsformen der Erfindung
vorgesehen sind. Beliebige gleichwertige Ausführungsformen sind dafür bestimmt,
im Umfang dieser Erfindung zu sein. In der Tat werden verschiedene
Modifikationen der Erfindung zusätzlich
zu jenen hierin dargestellten und beschriebenen für den Fachmann
aus der vorstehenden Beschreibung offensichtlich werden. Derartige
Modifikationen sind ebenso dafür
bestimmt, in den Umfang der angefügten Patentansprüche zu fallen.
Im Streitfall wird es die vorliegende Offenbarung einschließlich der
Definitionen regeln.
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Verschiedene
Dokumente sind hierin zitiert, deren Offenbarungen durch Bezugnahme
in vollem Umfang aufgenommen sind.
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