DE69733121T2 - Morphologische mutanten von filamentösen pilzen - Google Patents

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Description

  • Hintergrund der Erfindung
  • Gebiet der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft neue Pilze mit verbesserter Fähigkeit zur Sekretion von rekombinanten Polypeptiden und ein Verfahren zur Verbesserung einer solchen Sekretion.
  • Beschreibung des Fachgebiets
  • Fadenpilze etablierten sich als weit verbreitete Wirtszellsysteme zur Herstellung von rekombinanten Polypeptiden. In vielen Fällen jedoch weisen Pilze, die die gewünschten Merkmale der Leichtigkeit der Transformierbarkeit und heterologen Polypeptidexpression aufweisen, nicht unbedingt die wünschenswertesten Eigenschaften zur erfolgreichen Fermentation auf. Zum Beispiel ist es möglich, dass die Wachstumsmorphologie während der Fermentation nicht optimal ist, da viele Kulturen bei Zunahme der Biomasse ziemlich viskos werden. Eine erhöhte Viskosität schränkt die Fähigkeit des Mischens und Belüftens der Fermentationskultur ein, was zur Sauerstoff- und Nährstoffentkräftung der Mycelien führt, die unter Einschränkung der Ausbeute des Polypeptids von Interesse wiederum nicht lebensfähig und unproduktiv werden. Andererseits sind eine gute Fermentationsmorphologie aufweisende Fadenpilzstämme nicht unbedingt die besten Produktionsstämme in Bezug auf die Menge des hergestellten Enzyms. Deshalb besteht für wirtschaftliche Zwecke Bedarf nach Fadenpilzwirten, die die Fähigkeit zur Expression von wirtschaftlichen Mengen von rekombinantem Polypeptid mit zufrieden stellenden Wachstumseigenschaften wie schnelles Wachstum und niedrige Viskosität kombinieren, wodurch die Produktivität während der Fermentation verbessert wird.
  • Das Durchmustern von großen Anzahlen von Mutanten zur verbesserten Fermentationsmorphologie ist ziemlich schwierig und die morphologischen mutanten Stämme wurden häufig auf der Basis von unnützer Koloniemorphologie auf festem Medium isoliert. Traditionell wurden morphologische Mutanten in transformierten Stämmen isoliert, die mehrere Kopien eines heterologen Gens enthalten. Die Mutanten werden dann auf Fermentationswachstumseigenschaften und heterologe Genexpression analysiert. Obwohl dieses Verfahren beim Identifizieren von verbesserten Expressionsstämmen nützlich sein kann, wurde die Beziehung zwischen jeglicher bestimmter Pilzwachstumsmorphologie und der Fähigkeit eines Stamms zur Herstellung einer größeren Menge an sezerniertem Polypeptid noch nicht festgestellt. Morphologische Mutanten werden auch zeitweise in Durchmusterungen zur Verbesserung der Polypeptidexpression gewonnen, welchen eine Mutagenese eines transformierten Stamms folgt, jedoch führte die Untersuchung dieser Stämme wiederum nicht zu einem bemerkenswerten Einblick in die Steuerung der Morphologie. Zudem sind morphologisch „verbesserte" Stämme von parentalen Stämmen, die heterologe Genexpressionskassetten enthalten, als allgemeine Expressionswirte nicht geeignet, da sie nicht zur ausschließlichen Expression von anderen heterologen Polypeptiden verwendet werden können.
  • Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Verfahren zum Herstellen und Identifizieren von nützlichen morphologischen Mutanten zur heterologen Polypeptidherstellung bereit zu stellen.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zum Erhalt einer mutanten Zelle von einer Ausgangs- bzw. parentalen Zelle eines Fadenpilzes, umfassend: (a) Erhalt von mutanten Zellen der Ausgangszelle, (b) Identifizieren der mutanten Zelle, die einen eingeschränkteren Kolonie-Phänotyp und/oder eine ausgedehntere Hyphenverzweigung als die Ausgangszelle aufweist; und (c) Identifizieren der mutanten Zelle, die eine verbesserte Eigenschaft zur Herstellung eines heterologen Polypeptids als die Ausgangszelle aufweist, wenn die mutante und die Ausgangszelle unter den gleichen Bedingungen kultiviert bzw. gezüchtet werden.
  • Die Erfindung betrifft auch mutante Fadenpilzzellen, die durch die Verfahren der vorliegenden Erfindung hergestellt werden.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft auch Verfahren zum Herstellen eines heterologen Polypeptids, umfassend: (a) Kultivieren bzw. Züchten einer mutanten Zelle der vorliegenden Erfindung, die eine Nukleinsäuresequenz umfasst, die das heterologe Polypeptid kodiert; und (b) Gewinnen des heterologen Polypeptids.
  • Kurze Beschreibung der Figuren
  • 1 zeigt eine Restriktionsabbildung von pJeRS23.
  • 2 zeigt das Koloniewachstum von Kontrollstamm HowB425 und der Koloniemutanten JeRS316 auf festem Medium aus PDA + Uridin.
  • 3 zeigt eine grafische Darstellung der Verteilung von Lipaseexpression in den Transformanten HowB425 (Kontrolle) und JeRS316 (Mutant).
  • 4 zeigt eine grafische Darstellung der Verteilung von Lipaseexpression in den Transformanten HowB425 (Kontrolle) und JeRS317 (Mutant).
  • 5 zeigt einen Vergleich der heterologe Lipase herstellenden Phase der Fermentation von Kontrollstamm gegen Mutantstamm.
  • 6 zeigt eine Restriktionsabbildung von pCaHj418.
  • 7 zeigt eine Restriktionsabbildung von pDM148.
  • 8 zeigt eine Restriktionsabbildung von pDM149.
  • 9 zeigt eine Restriktionsabbildung von pJaL154.
  • 10 zeigt eine Restriktionsabbildung von pMT1612.
  • 11 zeigt eine Restriktionsabbildung von pJRoy30.
  • Detaillierte Beschreibung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zum Erhalt einer mutanten Zelle von einer Ausgangsfadenpilzzelle, umfassend: (a) Erhalt von mutanten Zellen der Ausgangszelle; (b) Identifizieren der mutanten Zelle, die einen eingeschränkteren Kolonie-Phänotyp und/oder ausgedehntere Hyphenverzweigung zeigt als die Ausgangszelle aufweist; und (c) Identifizieren der mutanten Zelle, die eine verbesserte Eigenschaft zur Herstellung eines heterologen Polypeptids als die Ausgangszelle aufweist, wenn die mutante und die Ausgangszelle unter den gleichen Bedingungen kultiviert bzw. gezüchtet werden.
  • Die Ausgangszelle kann durch auf dem Fachgebiet bekannte Verfahren mutagenisiert werden. Zum Beispiel kann die Mutagenese der Ausgangszelle durch Bestrahlung, z.B. UV-, Röntgen- oder Gammastrahlung der Ausgangszelle erzielt werden. Weiterhin kann eine Mutagenese durch Behandlung mit chemischen Mutagenen, z.B. salpetrige Säure, Nitrosamine, Methylnitrosoguanidin und Baseanaloga wie 5-Bromuracil erhalten werden. Am günstigsten wird das Mutagen auf Sporen der Ausgangszelle aufgebracht und die überlebenden Sporen für Wachstum auf ein festes Medium aufgestrichen. Es ist auch klar, dass Mutanten auch natürlich vorkommende Varianten in einer Population in Abwesenheit eines spezifischen Mutageneseverfahrens entweder durch Selektion, Durchmustern oder eine Kombination aus Selektion und Durchmustern sein können. Siehe z.B. Wiebe et al., 1992, Mycological Research 96: 555–562 und Wiebe et al., 1991, Mycological Research 95: 1284–1288 zum Isolieren von morphologischen Mutanten vom Fusarium-Stamm A3/5. Deshalb umfasst zum Zwecke der vorliegenden Erfindung der Begriff „Mutanten" auch natürlich vorkommende Varianten oder Mutanten ohne eine durchdachte Aufbringung von Mutagenen, d.h. spontane Mutanten.
  • Die Ausgangsfadenpilzzelle kann eine beliebige Fadenpilzzelle sein. Fadenpilze schließen alle Fadenformen der Unterabteilung Eumycota und Oomycota (wie definiert von Hawksworth et al., In, Ainsworth and Bisby's Dictionary of The Fungi, 8. Ausgabe, 1995, CAB International, University Press, Cambridge, UK) ein. Die Fadenpilze sind durch ein vegetatives Mycelium gekennzeichnet, das aus Chitin, Zellulose, Glucan, Chitosan, Mannan und anderen komplexen Polysacchariden zusammengesetzt ist. Vegetatives Wachstum erfolgt durch Hyphenverlängerung, und der Kohlenstoffkatabolismus ist verpflichtend aerob.
  • In der vorliegenden Erfindung kann die Ausgangsfadenpilzzelle eine Zelle einer Spezies von Fusarium oder Teleomorphen oder Synonymen davon sein. Bekannte Teleomorphe von Fusarium der Sektion Discolor schließen Gibberella gordonii, Gibberella cyanea, Gubberella pulicaris und Gibberella zeae ein.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Ausgangsfadenpilzzelle eine Fusarium-Zelle, z.B. eine Fusarium-Zelle der Sektion Elegans oder der Sektion Discolor. In einer anderen stärker bevorzugten Ausführungsform ist die Ausgangsfadenpilzzelle ein Fusarium-Stamm der Sektion Discolor (auch bekannt als Sektion Fusarium). Zum Beispiel kann die Ausgangsfadenpilzzelle eine Zelle von Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarum reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum. Fusarium sarcochroum, Fusarium sulphureum oder Fusarium trichothecioides sein. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist die Ausgangsfadenpilzzelle ein Fusarium-Stamm der Sektion Elegans, z.B. Fusarium oxysporum.
  • Die im ersten Schritt hergestellten mutanten Zellen werden dann auf die mutanten Zellen durchgemustert, die (a) einen eingeschränkteren Kolonie-Phänotyp und/oder eine ausgedehntere Hyphenverzweigung als die Ausgangszelle aufweisen und (b) eine verbesserte Eigenschaft zur Herstellung eines heterologen Polypeptids als die Ausgangszelle aufweisen, wenn die mutanten und die Ausgangszellen unter den gleichen Bedingungen kultiviert bzw. gezüchtet werden. In einer bevorzugten Ausführungsform werden die mutanten Zellen zuerst auf den eingeschränkteren Kolonie-Phänotyp und/oder eine ausgedehntere Hyphenverzweigung, stärker bevorzugt zuerst auf den eingeschränkteren Kolonie-Phänotyp, gefolgt von der ausgedehnteren Hyphenverzweigung überprüft.
  • Die mutanten Zellen der vorliegenden Erfindung können einen Kolonie-Phänotyp aufweisen, der eingeschränkter als die Ausgangszelle ist, wenn man die mutante und die Ausgangszelle in dem gleichen festen Medium wachsen lässt. Eine mutante Zelle mit „einem eingeschränkteren Kolonie-Phänotyp" ist hier als mutante Zelle mit einer reduzierten Radialverlängerungsgeschwindigkeit als die Ausgangszelle definiert, wenn man die mutante Zelle und die Ausgangszelle in dem festen Medium wachsen lässt. Vorzugsweise ist der Kolonie-Phänotyp der mutanten Zellen um mindestens etwa 10%, stärker bevorzugt mindestens etwa 20% und besonders bevorzugt mindestens etwa 30% eingeschränkter als die Ausgangszelle.
  • Die mutanten Zellen der vorliegenden Erfindung können auch eine ausgedehntere Hyphenverzweigung als die Ausgangszelle aufweisen. Eine mutante Zelle mit einer „ausgedehnteren Hyphenverzweigung" ist hier als mutante Zelle mit einer Hyphenwachstumseinheitslänge definiert, die um mindestens 10% geringer als die Hyphenwachstumseinheitslänge der Ausgangszelle ist. Vorzugsweise ist die Hyphenverzweigung der mutanten Zelle um mindestens etwa 20% verzweigter und stärker bevorzugt um mindestens etwa 30% verzweigter als die Ausgangszelle. Eine Messung der Hyphenwachstumseinheitslänge kann gemäß dem Verfahren von Trinci et al., 1973, Archiv für Mikrobiologie 91: 127–136 durchgeführt wer den. Ein Weg der Durchführung dieser Bestimmung ist die Messung des mittleren Abstands zwischen Verzweigungen in der Pilzhyphae (siehe z.B. Withers et al., 1994, Mycological Research 98: 95–100).
  • Die mutanten Zellen der vorliegenden Erfindung weisen auch eine verbesserte Eigenschaft zur Herstellung eines heterologen Polypeptids als die Ausgangszelle auf, wenn die mutante und die Ausgangszelle unter den gleichen Bedingungen kultiviert bzw. gezüchtet werden. Die durch die Verfahren der vorliegenden Erfindung erhaltenen Mutanten können verbesserte Wachstumseigenschaften bei der Fermentation aufweisen, wobei die Morphologie zu einer niedrigeren Viskosität im Fermentor führt, was wiederum zu einem leichteren Mischen, zu einer besseren Belüftung, besserem Wachstum und letztendlich einer erhöhten Ausbeute des durch den mutanten Stamm hergestellten heterologen Polypeptids im Vergleich zum Ausgangs- bzw. parentalen Stamm führt. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die verbesserte Eigenschaft ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus (a) einer erhöhten Ausbeute des heterologen Polypeptids, (b) verbessertem Wachstum, (c) niedrigerer Viskosität und (d) besserer Sekretion. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist die verbesserte Eigenschaft eine verbesserte Ausbeute des heterologen Polypeptids. In einer anderen besonders bevorzugten Ausführungsform ist die verbesserte Eigenschaft ein verbessertes Wachstum. In einer anderen besonders bevorzugten Ausführungsform ist die verbesserte Eigenschaft eine niedrigere Viskosität. In einer anderen besonders bevorzugten Ausführungsform ist die verbesserte Eigenschaft eine bessere Sekretion.
  • Zur Bestimmung dessen, ob eine mutante Zelle eine verbesserte Eigenschaft zur Herstellung eines heterologen Polypeptids als die Ausgangszelle aufweist, wird ein Nukleinsäurekonstrukt, das die das heterologe Polypeptid von Interesse kodierende Nukleinsäuresequenz umfasst, z.B. durch Transformation in sowohl den Ausgangs- bzw. parentalen Stamm als auch den morphologischen Mutanten eingebracht. „Nukleinsäurekonstrukt" ist hier als ein Nukleinsäuremolekül entweder in Einzelstrang- oder Doppelstrangform definiert, das von einem natürlich vor kommenden Gen isoliert oder so modifiziert wurde, dass es Nukleinsäuresegmente enthält, die in einer Weise kombiniert und nebeneinander gelegt werden, wie es sonst in der Natur nicht vorkommen würde. Die mutante Zelle wird vorzugsweise mit einem Vektor transformiert, der das Nukleinsäurekonstrukt umfasst, gefolgt von Integration des Vektors in das Wirtschromosom. „Transformation" bedeutet das Einbringen eines Nukleinsäurekonstrukts in eine Wirtszelle so, dass das Konstrukt als chromosomaler Integrant beibehalten wird. Es wird im Allgemeinen erwogen, dass die Integration von Vorteil ist, da die das heterologe Polypeptid kodierende Nukleinsäuresequenz in der Zelle wahrscheinlicher stabil beibehalten wird. Die Integration des Vektors in das Wirtschromosom erfolgt durch homologe oder nicht homologe Rekombination. Die Transformation wird unter Verwendung der Techniken erzielt, die auf den verwendeten Pilzwirt angepasst sind, wobei viele davon auf dem Fachgebiet bekannt sind. Geeignete Verfahren zur Transformation von Aspergillus-Zellen sind in EP 238 023 , Christensen et al., 1988, Bio/Technology 6: 1419–1422 und Yelton et al., 1984, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 81: 1470–1474 beschrieben. Ein geeignetes Verfahren zum Transformieren von Fusarium-Species ist von Malardier et al., 1989, Gene 78: 147–156 oder in der koabhängigen US-Serien-Nr. 08/269,449 beschrieben.
  • Nach der Transformation der mutanten und der Ausgangszelle mit einem Vektor, der ein ein heterologes Polypeptid kodierendes Gen enthält, werden von den mutanten und der Ausgangszelle geerntete Sporen zum Einimpfen in flüssiges Medium verwendet. Nach einer geeigneten Wachstumsdauer werden die Überstände auf Aktivität des Polypeptids getestet.
  • Wird die verbesserte Eigenschaft erhalten, werden die Expressionsgrade des heterologen Polypeptids zwischen dem mutanten und dem Ausgangs- bzw. parentalen Stamm verglichen. In einem solchen Fall sollte die produktive Phase der Fermentation des Mutanten verlängert sein. In einer bevorzugten Ausführungsform stellt der morphologische Mutant um mindestens etwa 10% mehr heterologes Polypeptid als der Ausgangs- bzw. parentale Stamm her, wenn jeder Stamm unter identi schen Bedingungen kultiviert bzw. gezüchtet wird. Stärker bevorzugt stellt der Mutant um mindestens 20% und besonders bevorzugt um mindestens 30% mehr heterologes Polypeptid her. In manchen Fällen stellt der Mutant um soviel wie 50–100% mehr Polypeptid oder sogar höher her. Da erwartet wird, dass in allen Kulturen ein Bereich von Expressionsgraden beobachtet werden kann, ist es klar, dass diese Figur den mittleren, medianen oder maximalen Expressionsgrad in einer Population von Transformantstämmen darstellen kann.
  • Ist die verbesserte Eigenschaft eine reduzierte Viskosität, kann die Viskosität durch jedes beliebige auf dem Fachgebiet bekannte Mittel, z.B. Brookfield-Rotationsviskometrie (definierter oder unbeschränkter Scherabstand und ein beliebiger Spindelkonfigurationstyp), kinematische Viskositätsröhren (Durchflußröhren), Fallkugelviskometer oder Bechertypviskometer bestimmt werden. Die bevorzugten Wirtszellen für die vorliegende Erfindung zeigen etwa 90% oder weniger, vorzugsweise etwa 80% oder weniger und stärker bevorzugt etwa 50% oder weniger des Viskositätsgrads, der durch eine Ausgangszelle unter identischen Fermentationsbedingungen hergestellt wird.
  • Die vorliegenden morphologischen Mutanten können zum Exprimieren eines beliebigen prokaryotischen oder eukaryotischen heterologen Peptids oder Polypeptids von Interesse verwendet werden und werden vorzugsweise zum Exprimieren von eukaryotischen Peptiden oder Polypeptiden verwendet. Von besonderem Interesse für diese Spezies ist deren Verwendung bei der Expression von heterologen Polypeptiden, insbesondere Pilzpolypeptiden, insbesondere Pilzenzymen. Die morphologischen Mutanten können zum Exprimieren von Enzymen wie einer Hydrolase, einer Oxidoreduktase, einer Isomerase, einer Ligase, einer Lyase oder einer Transferase verwendet werden. Stärker bevorzugt ist das Enzym eine Aminopeptidase, eine Amylase, eine Carboxypeptidase, eine Katalase, eine Cellulase, eine Chitinase, eine Cutinase, eine Cyclodextringlycosyltransferase, eine Deoxyribonuklease, eine Esterase, eine Glucoamylase, eine alpha-Galactosidase, eine beta-Galactosidase, eine alpha-Glucosidase, beta-Glucosidase, eine Haloperoxida se, eine Invertase, eine Laccase, eine Lipase, eine Mannosidase, eine Mutanase, eine Oxidase, ein pektinolytisches Enzym, eine Peroxidase, eine Phenoloxidase, Phytase, ein proteolytisches Enzym, eine Ribonuklease, eine Xylanase oder eine Xyloseisomerase. Es ist dem Fachmann klar, dass der Begriff „Pilzenzyme" nicht nur native Pilzenzyme, sondern auch die Pilzenzyme einschließt, die durch zum Verbessern der Aktivität, Wärmestabilität, pH-Toleranz und dergleichen durchgeführte Aminosäuresubstitutionen, -streichungen bzw. -deletionen, -additionen oder andere -modifikationen modifiziert wurden. Andere Polypeptide, die exprimiert werden können, schließen Säugerpolypeptide wie Insulin, Insulinvarianten, Rezeptorproteine und Teile davon und Antikörper und Teile davon ein, sind jedoch nicht darauf beschränkt.
  • Die Mutanten können auch bei der rekombinanten Herstellung von für die Wirtszellen nativen Polypeptiden verwendet werden. Beispiele für eine solche Verwendung schließen das Setzen eines das Polypeptid kodierenden Gens unter die Kontrolle eines anderen Promoters zum Verbessern von Expression des Polypeptids zum Beschleunigen der Ausfuhr eines nativen Polypeptids von Interesse aus der Zelle durch Verwendung einer Signalsequenz oder zum Verbessern der Kopieanzahl eines Gens, das das gewöhnlich durch die vorliegenden Wirtszellen hergestellte Protein kodiert, ein, sind jedoch nicht darauf beschränkt. Somit umfasst die vorliegende Erfindung im Umfang des Begriffs „heterologes Polypeptid" auch eine solche rekombinante Herstellung von homologen Polypeptiden zu dem Grad, bei welchem eine solche Expression die Verwendung von für die Wirtszelle nicht nativen genetischen Elementen oder die Verwendung von nativen Elementen, die so manipuliert wurden, dass sie in einer normalerweise in der Wirtszelle nicht zu findenden Weise wirken, einschließt.
  • In der vorliegenden Erfindung ist das Nukleinsäurekonstrukt funktionsfähig an eine oder mehrere Kontrollsequenzen gebunden, die die Expression der Kodierungssequenz in der mutanten Zelle unter Bedingungen, die mit den Kontrollsequenzen verträglich sind, leiten können. Der Begriff „Kodierungssequenz", wie hier definiert, ist eine Sequenz, die in mRNA transkribiert und in ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung translatiert ist, wenn sie unter die Kontrolle der Kontrollsequenzen gesetzt wird. Die Grenzen der Kodierungssequenz werden im Allgemeinen durch ein ATG-Translationsstartkodon am 5'-Terminus und ein Translationsstoppkodon an 3'-Terminus bestimmt. Eine Kodierungssequenz kann DNA, cDNA und rekombinante Nukleinsäuresequenzen einschließen, ist jedoch nicht darauf beschränkt.
  • Der Begriff „Kontrollsequenzen" ist hier so definiert, dass er alle Bestandteile einschließt, die zur Expression der Kodierungssequenz der Nukleinsäuresequenz nötig oder vorteilhaft sind. Jede Kontrollsequenz kann für die das Polypeptid kodierende Nukleinsäuresequenz nativ oder fremd sein. Solche Kontrollsequenzen schließen einen Leader, eine Polyadenylierungssequenz, eine Propeptidsequenz, einen Promoter, eine Signalsequenz und einen Transkriptionsterminator ein, sind jedoch nicht darauf beschränkt. Zumindest schließen die Kontrollsequenzen einen Promoter und Transkriptions- und Translationsstoppsignale ein. Die Kontrollsequenzen können zum Zwecke des Einbringens von spezifischen Restriktionsstellen, die die Verknüpfung der Kontrollsequenzen mit der Kodierungsregion der ein Polypeptid kodierenden Nukleinsäuresequenz erleichtern, mit Linkern versehen sein.
  • Die Kontrollsequenz kann eine geeignete Promotersequenz, eine Nukleinsäuresequenz, die durch eine Wirtszelle zur Expression der Nukleinsäuresequenz erkannt wird, sein. Die Promotersequenz enthält Transkriptions- und Translationskontrollsequenzen, die die Expression des Polypeptids vermitteln. Der Promoter kann eine beliebige Nukleinsäuresequenz sein, die Transkriptionsaktivität in der Wirtszelle der Wahl zeigt und von Genen erhalten wird, die extrazelluläre oder intrazelluläre Polypeptide entweder homolog oder heterolog für die Wirtszelle kodieren. Beispiele für geeignete Promoter zum Leiten der Transkription der Nukleinsäurekonstrukte der vorliegenden Erfindung in einer Fadenpilzzelle sind Promoter, die von den Genen erhalten werden, die TAKA-Amylase von Aspergillus oryzae (wie beschrieben in der U.S. Patentanmeldungs-Seriennr. 08/208,092, wobei die Inhalte hier unter Bezugnahme eingebracht sind), Aspertamproteinase von Rhizomucor miehei, neutrale alpha-Amylase von Aspergillus niger, säurestabile alpha-Amylase von Aspergillus niger, Glucoamylase (glaA) von Aspergillus niger oder Aspergillus awamori, Lipase von Rhizomucor miehei, alkalische Protease von Aspergillus oryzae, Triosephosphatisomerase von Aspergillus oryzae, Acetamidase von Aspergillus nidulans, trypsinartige Protease von Fusarium oxysporum (wie beschrieben in U.S. Patent Nr. 4,288,627, das hier unter Bezugnahme eingebracht ist) und Hybriden davon kodieren. Besonders bevorzugte Promoter zur Verwendung in Fadenpilzzellen sind die TAKA-Amylase NA2-tpi (ein Hybrid der Promoter von den Genen, die neutrale α-Amylase von Aspergillus niger und Triosephosphatisomerase von Aspergillus oryzae kodieren) und glaA-Promoter.
  • Die Kontrollsequenz kann auch eine geeignete Transkriptionsterminatorsequenz, eine Sequenz, die durch eine Wirtszelle zum Terminieren der Transkription erkannt wird, sein. Die Terminatorsequenz ist funktionsfähig an den 3'-Terminus der das Polypeptid kodierenden Nukleinsäuresequenz gebunden. Jeder beliebige Terminator, der in der Wirtszelle der Wahl funktionell ist, kann in der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Bevorzugte Terminatoren für Fadenpilzzellen werden von den Genen erhalten, die TAKA-Amylase von Aspergillus oryzae, Glucoamylase von Aspergillus niger, Anthranilatsynthase von Aspergillus nidulans, alpha-Glucosidase von Aspergillus niger und trypsinartige Protease von Fusarium oxysporum kodieren.
  • Die Kontrollsequenz kann auch eine geeignete Leadersequenz, eine nicht translatierte Region einer mRNA, die für die Translation der Wirtszelle wichtig ist, sein. Die Leadersequenz ist funktionsfähig an den 5'-Terminus der das Polypeptid kodierenden Nukleinsäuresequenz gebunden. Jede beliebige Leadersequenz, die in der Wirtszelle der Wahl funktionell ist, kann in der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Bevorzugte Leader für Fadenpilzwirtszellen werden von den Ge nen erhalten, die TAKA-Amylase von Aspergillus oryzae und Triosephosphatisomerase von Aspergillus oryzae kodieren.
  • Die Kontrollsequenz kann auch eine Polyadenylierungssequenz, eine Sequenz, die funktionsfähig an den 3'-Terminus der Nukleinsäuresequenz gebunden ist und die beim Transkribieren von der Wirtszelle als Signal zum Addieren von Polyadenosinresten an transkribierte mRNA erkannt wird, sein. Jede beliebige Polyadenylierungssequenz, die in der Wirtszelle der Wahl funktionell ist, kann in der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Bevorzugte Polyadenylierungssequenzen für Fadenpilzwirtszellen werden von den Genen erhalten, die TAKA-Amylase von Aspergillus oryzae, Glucoamylase von Aspergillus niger, Anthranilatsynthase von Aspergillus nidulans und alpha-Glucosidase von Aspergillus niger kodieren.
  • Die Kontrollsequenz kann auch eine Signalpeptidkodierungsregion sein, die für eine Aminosäuresequenz kodiert, die an den Aminoterminus des Polypeptids, der das exprimierte Polypeptid in den Sekretionsweg der Zelle leiten kann, gebunden ist. Das 5'-Ende der Kodierungssequenz der Nukleinsäuresequenz kann innen eine Signalpeptidkodierungsregion enthalten, die natürlich im Translationsleserahmen mit dem Segment der das sezernierte Polypeptid kodierenden Kodierungsregion verbunden ist. In einer anderen Ausführungsform kann das 5'-Ende der Kodierungssequenz eine Signalpeptidkodierungsregion enthalten, die für den Teil der Kodierungssequenz fremd ist, der das sezernierte Polypeptid kodiert. Die fremde Signalpeptidkodierungsregion kann erforderlich sein, wo die Kodierungssequenz gewöhnlich keine Signalpeptidkodierungsregion enthält. In einer anderen Ausführungsform kann die fremde Signalpeptidkodierungsregion einfach die natürliche Signalpeptidkodierungsregion ersetzen, um eine verbesserte Sekretion des Polypeptids in Bezug auf die natürliche Signalpeptidkodierungsregion, die normalerweise mit der Kodierungssequenz verbunden ist, zu erhalten. Die Signalpeptidkodierungsregion kann von einem Glucoamylase- oder einem Amylasegen von einer Aspergillus-Spezies, einem Lipase- oder Proteinasegen von einer Rhizomucor-Spezies, dem Gen für den alpha-Faktor von Saccharomyces cerevisiae, einem Amylase- oder einem Proteasegen von einer Bacillus-Spezies oder dem Kalbs-Präprochymosingen erhalten werden. Jedoch kann jede beliebige Signalpeptidkodierungsregion, die das exprimierte Polypeptid in den Sekretionsweg einer Wirtszelle der Wahl leiten kann, in der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Eine wirksame Signalpeptidkodierungsregion für Fadenpilzwirtszellen ist die Signalpeptidkodierungsregion, die von dem TAKA-Amylasegen von Aspergillus oryzae, dem neutralen Amylasegen von Aspergillus niger, dem Aspartamproteinasegen von Rhizomucor miehei, dem Cellulasegen von Humicola lanuginosa oder dem Lipasegen von Rhizomucor miehei erhalten wird.
  • Die Kontrollsequenz kann auch eine Propeptidkodierungsregion sein, die für eine Aminosäuresequenz kodiert, die am Aminoterminus eines Polypeptids positioniert ist. Das erhaltene Polypeptid ist als Proenzym oder Propolypeptid (oder in manchen Fällen als Zymogen) bekannt. Ein Propolypeptid ist im Allgemeinen inaktiv und kann durch katalytische oder autokatalytische Abspaltung des Propeptids von dem Propolypeptid zum reifen aktiven Polypeptid umgewandelt werden. Die Propeptidkodierungsregion kann von dem alkalischen Proteasegen von Bacillus subtilis (aprE), dem neutralen Proteasegen von Bacillus subtilis (nprT), dem alpha-Faktor-Gen von Saccharomyces cerevisiae oder dem Laccasegen von Myceliophthora thermophilum (WO 95/33836) erhalten werden.
  • Der Vektor kann ein beliebiger Vektor sein, der günstigerweise rekombinanten DNA-Verfahren unterzogen wurde und die Expression der das Polypeptid kodierenden Nukleinsäuresequenz bewirken kann. Die Wahl des Vektors hängt typischerweise von der Verträglichkeit des Vektors mit der Wirtszelle, in welche der Vektor einzubringen ist, ab. Die Vektoren können lineare oder geschlossene zirkuläre Plasmide sein. Das Vektorsystem kann ein einzelner Vektor oder ein einzelnes Plasmid oder zwei oder mehrere Vektoren oder Plasmide, die zusammen die gesamte in das Genom der Wirtszelle einzubringende DNA enthalten, sein. Die Vektoren der vorliegenden Erfindung enthalten vorzugsweise (ein) Element(e), das (die) eine stabile Integration des Vektors in das Wirtszellengenom gewährt (gewähren). Zur Integration kann der Vektor von der das Polypeptid kodierenden Nukleinsäuresequenz oder einem beliebigen anderen Element des Vektors zur stabilen Integration des Vektors in das Genom durch homologe oder nicht homologe Rekombination abhängen. In einer anderen Ausführungsform kann der Vektor zusätzliche Nukleinsäuresequenzen zum Leiten der Integration durch homologe Rekombination in das Genom der Wirtszelle enthalten. Die zusätzliche Nukleinsäuresequenz ermöglicht, dass der Vektor in das Wirtszellengenom an (einer) genauen Lokalisierungen) in dem (den) Chromosomen) integriert wird. Zur Erhöhung der Wahrscheinlichkeit der Integration an einer genauen Lokalisierung sollten die Integrationselemente vorzugsweise eine ausreichende Anzahl an Nukleinsäuren wie 100 bis 1.500 Basenpaare, vorzugsweise 400 bis 1.500 Basenpaare, und stärker bevorzugt 800 bis 1.500 Basenpaare enthalten, die zu der entsprechenden Zielsequenz hoch homolog sind, um die Wahrscheinlichkeit von homologer Rekombination zu erhöhen. Die Integrationselemente können eine beliebige Sequenz sein, die zu der Zielsequenz im Genom der Wirtszelle homolog ist. Weiterhin können die Integrationselemente nicht kodierende oder kodierende Nukleinsäuresequenzen sein. Andererseits kann der Vektor durch nicht homologe Rekombination in das Genom der Wirtszelle integriert werden.
  • Die Vektoren enthalten vorzugsweise eine oder mehrere selektierbare Markierungen, die eine leichte Selektion von transformierten Zellen gewähren. Eine selektierbare Markierung ist ein Gen, von welchem das Produkt Biozidresistenz, Resistenz gegenüber Schwermetallen, Prototrophie gegenüber Auxotrophen und dergleichen bereitstellt. Eine selektierbare Markierung zur Verwendung in einer Fadenpilzwirtszelle kann ausgewählt werden aus der Gruppe, einschließend, jedoch nicht beschränkt auf amdS (Acetamidase), argB (Ornithincarbamoyltransferase), bar (Phosphinothricinacetyltransferase), hygB (Hygromycinphosphotransferase), niaD (Nitratreduktase), pyrG (Orotidin-5'-phosphatdecarboxylase), sC (Sulfatadenyltransferase), trpC (Anthranilatsynthase) und Glufosinatresistenzmarkierungen sowie Äquivalente von anderen Spezies. Bevorzugt zur Verwendung in einer Aspergillus-Zelle sind die amdS- und pyrG-Markierungen von Aspergillus nidu lans oder Aspergillus oryzae und die bar-Markierung von Streptomyces hygroscopicus. Weiterhin kann die Selektion durch Co-Transformation z.B. wie beschrieben in WO 91/17243 erzielt werden, wobei die selektierbare Markierung auf einem separaten Vektor vorliegt.
  • Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird der Wirt mit einem einzelnen DNA-Vektor, einschließend sowohl die Selektionsmarkierung als auch die einzubringende übrige heterologe DNA, einschließlich Promoter, das Gen für das gewünschte Polypeptid und Transkriptionsterminator und Polyadenylierungssequenzen, transformiert.
  • Die zum Verknüpfen der vorstehenden Elemente mit den Nukleinsäurekonstrukten und Vektoren verwendeten Verfahren sind dem Fachmann bekannt (siehe z.B.: Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York). 1989, vorstehend).
  • Die vorliegende Erfindung betrifft auch Verfahren zum Herstellen eines heterologen Polypeptids, umfassend (a) Kultivieren bzw. Züchten einer mutanten Zelle der vorliegenden Erfindung, die eine Nukleinsäuresequenz umfasst, die das heterologe Polypeptid kodiert; und (b) Gewinnen des heterologen Polypeptids.
  • Die Zellen werden in einem Nährstoffmedium kultiviert, das zur Herstellung des Polypeptids unter Verwendung von auf dem Fachgebiet bekannten Verfahren geeignet ist. Zum Beispiel kann die Zelle durch Schüttelkolbenzüchtung, Fermentation in kleinem oder großem Maßstab (einschließlich kontinuierliche, Chargen-, Zufuhrchargen- oder Festzustandsfermentationen) in Labor- oder Industriefermentatoren, durchgeführt in einem geeignetem Medium und unter das Exprimieren und/oder Isolieren des Polypeptids gewährenden Bedingungen gezüchtet werden. Die Züchtung findet in einem geeigneten Nährstoffmedium, umfassend Kohlenstoff- und Stickstoffquellen und anorganische Salze, unter Verwendung von auf dem Fachgebiet bekannten Verfahren statt (siehe z.B. Bezugnahmen auf Bakterien und Hefe, Bennett, J. W. und LaSure, L., Hrsg., More Gene Manipulations in Fungi, Academic Press, CA, 1991). Geeignete Medien sind von kommerziellen Lieferanten erhältlich oder können gemäß veröffentlichten Zusammensetzungen hergestellt werden (z.B. in Katalogen der American Type Culture Collection). Wird das Polypeptid in das Nährstoffmedium sezerniert, kann das Polypeptid direkt von dem Medium gewonnen werden. Wird das Polypeptid nicht sezerniert, wird es von Zellysaten gewonnen.
  • Die Polypeptide können unter Verwendung von auf dem Fachgebiet bekannten Verfahren, die für die Polypeptide spezifisch sind, nachgewiesen werden. Diese Nachweisverfahren können die Verwendung von spezifischen Antikörpern, die Bildung eines Enzymprodukts oder das Verschwinden eines Enzymsubstrats einschließen. Zum Beispiel kann ein Enzymtest zum Bestimmen der Aktivität des Polypeptids verwendet werden. Verfahren zum Bestimmen von Enzymaktivität sind auf dem Fachgebiet bekannt.
  • Das erhaltene Polypeptid kann durch auf dem Fachgebiet bekannte Verfahren gewonnen werden. Zum Beispiel kann das Polypeptid durch herkömmliche Verfahren, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf Zentrifugation, Filtration, Extraktion, Sprühtrocknen, Verdampfen oder Ausfällung von dem Nährstoffmedium gewonnen werden. Das gewonnene Polypeptid kann dann weiter durch eine Vielzahl von chromatografischen Verfahren, z.B. Ionenaustauschchromatografie, Gelfiltrationschromatografie, Affinitätschromatografie oder dergleichen gereinigt werden.
  • Die Polypeptide der vorliegenden Erfindung können durch eine Vielzahl von auf dem Fachgebiet bekannten Verfahren, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf Chromatografie (z.B. Ionenaustausch-, Affinitäts-, hydrophobe, Chromatofokussieren und Größenausschluss), elektrophoretische Verfahren (z.B. präparatives isoelektrisches Fokussieren), differentielle Löslichkeit (z.B. Ammoniumsulfataus fällung) oder Extraktion gereinigt werden (siehe z.B. Protein Purification, J.-C. Janson und Lars Ryden, Hrsg., VCH Publishers, New York 1989).
  • Beispiele
  • Stämme und Medien
  • Die Ausgangs- bzw. parentalen Stämme sind alpha-Amylase-armer, pyrG-negativer HowB425 von Aspergillus oryzae und A3/5 von Fusarium. Morphologische Mutanten von Fusarium A3/5, bezeichnet CC1-3, CC2-3 und MC3-5 (Wiebe et al., 1992, Mycological Research 96: 555–562; Wiebe et al., 1991, Mycological Research 95: 1284–1288; Wiebe et al., 1991, Mycological Research 96: 555–562) sind hoch verzweigte Kolonievarianten.
  • PDA-Platten enthalten 39 g/l Kartoffeldextroseagar (Difco) und sind ergänzt mit 10 mM Uridin für pyrG- Auxotrophe, wenn nicht anders angegeben.
  • MY50N Medium ist zusammengesetzt aus 62,5 g Nutriose, 2,0 g MgSO4-7H2O, 2,0 g KH2PO4, 4,0 g Zitronensäure, 8,0 g Hefeextrakt, 2,0 g Harnstoff, 0,1 g CaCl2 und 0,5 ml Spurenmetalllösung, pH 6,0 pro Liter. MY50N-Schüttelkolbenmedium ist 1:100 mit Glas-destilliertem Wasser zur Verwendung in Mikrotiterwachstumsversuchen verdünnt (MY50N/100). Man lässt die Kulturen bei einer Temperatur zwischen 28–37°C wachsen.
  • Minimal-Mediumplatten sind zusammengesetzt aus 6,0 NaNO3, 0,52g KCl, 1,52 g KH2PO4, 1,0 ml Spurenmetalllösung, 20 g Nobel-Agar (Difco), 20 ml 50%iger Glucose, 20 ml Methionin (50 g/l), 20 ml Biotin (200 mg/l), 2,5 ml 20%igem MgSO4-7H2O und 1,0 ml von mg/ml Streptomycin pro Liter. Das Agarmedium wird vor dem Autoklavieren auf pH 6,5 eingestellt, und dann werden Glucose, Methionin, Biotin, MgSO4-7H2O und Streptomycin als sterile Lösungen zu dem gekühlten autoklavierten Medium gegeben und auf Platten gegossen.
  • Die Spurenmetalllösung (1000 ×) ist zusammengesetzt aus 22 g ZnSO4-7H2O, 11 g H3BO3, 5 g MnCl2-4H2O, 5 g FeSO4-7H2O, 1,6 g CoCl2-5H2O, 1,6 g (NH4)6Mo7O2a und 50 g Na4EDTA pro Liter.
  • COVE-Platten sind zusammengesetzt aus 343,3 g Saccharose, 20 ml COVE-Salzlösung, 10 ml 1 M Acetamid, 10 ml 3 M CsCl und 25 g Nobel-Agar pro Liter. Die COVE-Salzlösung (50 ×) ist zusammengesetzt aus 26 g KCl, 26 g MgSO4-7H2O, 76 g KH2PO4 und 50 ml COVE-Spurenmetalllösung. Die COVE-Spurenmetalllösung ist zusammengesetzt aus 0,04 g NaB4O7-10H2O, 0,040 g Cu-SO4-5H2O, 0,70 g FeSO4-H2O, 0,80 g Na2MoO2-2H2O und 10 g ZnSO4 pro Liter.
  • M400Da-Medium ist zusammengesetzt aus 50 g Maltodextrin, 2,0 g MgSO4-7H2O, 2,0 g KH2PO4, 4,0 g Zitronensäure, 8,0 g Hefeextrakt, 2,0 g Harnstoff und 0,5 ml Spurenmetalllösung pro Liter. Das Medium wird mit 5 N NaOH auf pH 6,0 eingestellt. Die Spurenmetalllösung ist zusammengesetzt aus 14,3 g ZnSO4-7H2O, 2,5 g CuSO4-5H2O, 0,5 g NiCl2-6H2O, 13,8 g FeSO4-7H2O, 8,5 g MnSO4-H2O und 3,0 g Zitronensäure pro Liter.
  • Bezugsbeispiel 1: Mutagenese vom Stamm HowB425 von Aspergillus oryzae
  • Sporen des Stamms HowB425 von Aspergillus oryzae werden von festem Medium geerntet und in 0,01%igem Tween 80 auf eine Konzentration von 2,2 × 107/ml suspendiert. Fünf ml Sporensuspension werden in eine Kunststoffpetrischale mit 90 mm pipettiert und die Sporen für eine Dauer von einer Minute mit Ultraviolettlicht auf eine etwa 5%ige Überlebensrate bestrahlt. Die mutagenisierten Sporen werden für eine Dauer von einer Stunde im Dunklen gehalten und dann auf Platten aus PDA + 50 mg/l Uridin aufgestrichen.
  • Die Häufigkeiten der durch diese Mutagenesebehandlung erhaltenen Sporenfarbmutanten betragen 8,8 × 10–5 für weiße und 5,9 × 10–5 für gelbe Sporenmutanten.
  • Insgesamt etwa 34.000 lebensfähige bzw. zuverlässige Kolonien (250 bis 800 pro Platte) werden visuell auf einen eingeschränkten Kolonie-Phänotyp durchgemustert. 88 eingeschränkte Kolonien werden ausgewählt. Die Kanten der auf der Platte wachsenden eingeschränkten Kolonien werden unter einem Mikroskop (200 ×) auf einen hoch mycelial verzweigten Phänotyp untersucht. 36 der ausgewählten Kolonien werden so ausgewählt, dass sie ein ausgedehnteres Hyphenverzweigungsmuster als der Kontrollstamm HowB425 von Aspergillus oryzae aufweisen und dann durch Wiederaufstreichen der Sporen auf Platten aus PDA + Uridin gereinigt. Nach Wachstum und Sporenbildung werden die Stämme in einer ähnlichen Weise wieder gereinigt. Die 36 Mutanten werden wieder auf die Kolonie- und Hochverzweigungs-Phänotypen untersucht. Zwölf der 36 wieder getesteten sind in beiden Versuchen positiv und werden zur heterologen Polypeptidexpressionsanalyse ausgewählt. Die Häufigkeit der gewonnenen Mutanten beträgt 12/34.000 oder etwa 3,5 × 10–4. Die Koloniemutanten werden durch Untersuchung ihrer Hyphenverzweigungs-Phänotypen klassifiziert (Tabelle 1). Die Koloniemorphologie des Kontrollstamms und eine der Mutanten auf festem Medium aus PDA + Uridin sind in 2 dargestellt.
  • Tabelle 1 – Phänotypen von morphologischen Mutanten
    Figure 00210001
  • Bezugsbeispiel 2: Lipaseexpressionsplasmid
  • Eine Abbildung des Lipaseexpressionsplasmids pJeRS23 ist in 1 dargestellt. pJeRS23 enthält das amdS-Gen von Aspergillus nidulans mit den Basen –118 bis 2191 (in Bezug auf das ATG-Startkodon), die pTAKA-TPI/Lipolase/AMGt-Lipaseexpressions-Kassette von pMHan37, das pyrG-Gen von Aspergillus oryzae und pUC19-Sequenzen.
  • Bezugsbeispiel 3: Transformation von Aspergillus oryzae
  • Man lässt zu transformierende Kulturen in 20 ml 1% Hefeextrakt-2% Pepton (Difco)-2,5% Glucose bei 37°C für eine Dauer von 16–20 Stunden unter Rühren wachsen. Jede Kultur wird mit 10 ml 1,2 M MgSO4 gemischt, und das Mycelium wird durch Filtration auf Miracloth (CalBiochem, La Jolla, CA) oder durch Zentrifugation gewonnen, mit 1,2 M MgSO4 gewaschen und dann wieder in 10 ml 5 mg/ml NOVOZYM 234 (Novo Nordisk A/S, Bagsværd, Dänemark) in 1,2 M MgSO4 resuspendiert. Die Suspension wird unter sanften Rühren für eine Dauer von etwa einer Stunde bei 37°C zum Bilden von Protoplasten inkubiert. Unaufgeschlossenes Mycelium wird durch Filtration durch eine Schicht von sterilem Miracloth entfernt. Protoplaste werden durch Zentrifugation mit 3600 × g gewonnen. Sie werden dann mit 10 ml ST (1 M Sorbit-10 mM Tris, pH 7,5) gewaschen, zentrifugiert, mit 10 ml STC (1 M Sorbit-10 mM Tris, pH 7,5–10 mM CaCl2) gewaschen, zentrifugiert und dann in 1,0 ml STC resuspendiert. Die Konzentration der Protoplasten wird bestimmt und die Endkonzentration zwischen 2 × 106 und 1 × 107/ml mit STC eingestellt. Ein Aliquot von 0,1 ml Protoplasten wird mit 5 μl pJeRS23 DNA (etwa 5 μg) in einem Polypropylenröhrchen des Typs Falcon 2059 gemischt und bei Raumtemperatur für eine Dauer von 20 Minuten inkubiert. Ein ml SPTC (0,8 M Sorbit-40% Polyethylenglykol 4000–50 mM CaCl2-50 mM Tris, pH 8) wird zugesetzt und die Suspension unter sanftem Schütteln gemischt. Die Suspension wird bei Raumtemperatur für eine Dauer von 20 Minuten inkubiert, und dann werden 7 ml geschmolzener Deckagar (1 × COVE Salze, 0,8 M Saccharose, 1% niedrig schmelzende Agarose) zugesetzt und die Suspension auf eine COVE-Platte gegossen. Die Platten werden bei 37°C inkubiert.
  • Bezugsbeispiel 4: Lipasetest
  • Testsubstrat wird durch Verdünnen des Stammsubstrats (10 μl p-Nitrophenylbutyrat/ml DMSO) in MC-Puffer (3 mM CaCl2-0,1 M MOPS, pH 7,5) auf 1:5 unmittelbar vor der Verwendung hergestellt. Standard-Lipolase® enthält 1000 LU/ml 50% Glyzerin-0,66 mM CaCl2-33 mM Tris, pH 7,5 und wird bei –20°C aufbewahrt. Standard-Lipolase wird in MC-Puffer direkt vor der Verwendung auf 1/100 verdünnt. Brüheproben werden in MC-Puffer verdünnt, und Aliquote von 100 μl der verdünnten Brüheproben werden in Mikrotiterplatten mit 96 Mulden pipettiert, gefolgt von 100 μl verdünntem Substrat. Die Absorption in nm wird als Zeitfunktion aufgezeichnet. Brühelipaseeinheiten/ml (LU/ml) werden in Bezug auf einen Lipolase®-Standard berechnet.
  • Bezugsbeispiel 5: Lipolase®-Expression
  • Jeder der zwölf Mutanten wird mit dem in Beispiel 2 beschriebenen Lipolase®-Expressionsplasmid pJeRS23 transformiert und die Transformanten durch ihre Prototrophie für Uridin und Fähigkeit zum Wachsen unter Verwendung von Acetamid als einzige Stickstoffquelle ausgewählt. Eine Paralleltransformation wird mit dem Ausgangs- bzw. parentalen Stamm HowB425 von Aspergillus oryzae durchgeführt. Die konidiierten Transformanten werden einmal auf COVE-Platten wieder aufgestrichen, und Sporen von einzelnen Kolonien werden zum Beimpfen einer COVE-Platte mit 90 mm verwendet. Nach der Sporenbildung werden die Sporen in 0,01%igem Tween 80 geerntet. Ein Aliquot von 10 μl jeder Sporensuspension wird zum Beimpfen einer Mulde in einer Mikrotiterplatte mit 24 Mulden, die 1 ml MY50N/100 Flüssigmedium enthält, verwendet. Die Versuche werden an zwei verschiedenen Tagen (Versuche A und B) gestartet, wobei an jedem Tag der gesamte Satz an HowB425-Kontrolltransformanten von Aspergillus oryzae eingeschlossen war. Man lässt die Mikrotiterplatten für eine Dauer von 3 bis 5 Tagen bei 37°C, unter Rühren mit 100 UpM wachsen, und die Kulturüberstände werden wie in Beispiel 4 beschrieben auf Lipase-Aktivität getestet.
  • Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 dargestellt. Eine grafische Darstellung von zwei der Mutanten ist in den 3 und 4 dargestellt. Obwohl es typisch ist, dass einzelne Transformanten, die nach dem Einbringen von DNA-Expressionsplasmiden in einen beliebigen vorgegebenen Wirt von Aspergillus oryzae erhalten werden, in ihrer Fähigkeit zum Herstellen und Sezernieren eines heterologen Polypeptids variieren und die Anzahl an Transformanten in jedem Mutantstamm ziemlich klein ist, erscheinen die Expressionsprofile für die Mutanten JeRS316 (3) und JeRS317 (4) verglichen mit der Kontrolle weiter zu höheren Lipaseexpressionswerten verschoben zu sein.
  • Tabelle II – Lipolase®-Expression in morphologischen Mutanten
    Figure 00240001
  • Bezugsbeispiel 6: Fermentation von Mutant JeRS316 von Aspergillus oryzae
  • Zum Bestimmen dessen, ob die Morphologiemutanten ein überwältigendes Fermentationsverhalten im Vergleich zu dem parentalen Morphologiestamm vom Wildtyp zeigen, lässt man einen Transformant von jedem des Ausgangs- bzw. parentalen Stamms HowB425 von Aspergillus oryzae und des mit Plasmid pJeRS23 transformierten mutanten Stamms JeRS316, in einem Tankfermentator unter Fermentationsbedingungen wachsen.
  • Die Morphologie der Kontrollkultur am Ende der Fermentation ist für das Wachstum für Aspergillus oryzae unter diesen Bedingungen typisch. Die Kultur ist mit einem dicken und körnerförmigen langsamen Mischerscheinungsbild sehr viskos. Große Luftblasen sind im Tank sichtbar. Im Gegensatz dazu zeigt der JeRS316-Transformant eine geringe Viskosität, Fadenförmigkeit, leichte Mischmorphologie mit einem geringen Grad an Pelletbildung während der Fermentation. Große Luftblasen werden routinemäßig nicht im Tank beobachtet. Die Expression der heterologen Lipase wird bestimmt und die Ergebnisse sind in 5 dargestellt. Ist der Mutant gegenüber dem Parentalen in der Fermentation höherwertig, wird erwartet, dass die produktive Phase der Fermentation für den Mutanten verlängert ist. Die Ergebnisse sind als Verhältnis von [Lipasetiter in der Kulturbrühe zum Zeitpunkt (x)]/[Lipasetiter zum Zeitpunkt (42 Stunden)] angegeben. Diese Analyse normiert die Expressionsdaten aufgrund der Tatsache, dass nicht alle Transformanten in ihrem absoluten Expressionsgrad gleich sind. Wie für einen verbesserten Morphologiemutanten vorhergesagt, ist die produktive Phase für das heterologe Polypeptid der Fermentation im Stamm JeRS316 verglichen mit der Kontrolle deutlich verlängert. Die Endexpression der Lipase in der Brühe der Morphologiemutantkultur weist einen etwa fünf Mal höheren Titer als die Kontrolle auf.
  • Beispiel 1: Konstruktion von Fusarium-Expressionsvektor pJRoy30
  • Die EcoRV-Stelle an –15 im Trypsingenpromoter von Fusarium oxysporum von pJRoy20 (Royer et al., 1995, Bio/Technology 13: 1479–1483) und die NcoI-Stelle, die an +243 in der Cellulasekodierungsregion CAREZYMETM (Novo Nordisk A/S, Bagsværd, Dänemark) vorliegt, werden zum Bilden einer genauen Fusion zwischen dem Trypsingenpromoter von Fusarium oxysporum und dem Cellulasegen CAREZYMETM verwendet. Ein PCR-Fragment, enthaltend –18 bis –1 des Trypsin-Genpromoters von Fusarium oxysporum, direkt gefolgt von –1 bis +294 des Cellulasegens CAREZYMETM, wird aus dem CAREZYMETM-Vektor pCaHj418 (sh. 6) unter Verwendung der folgenden Primer gebildet:
  • VORWÄRTS EcoRV
    Figure 00260001
  • RÜCKWÄRTS
    Figure 00260002
  • Klein gedruckte Buchstaben im Vorwärtsprimer sind bp –24 bis –1 des Trypsingenpromoters von Fusarium oxysporum, während groß gedruckte Buchstaben bp 1 bis 20 von CAREZYMETM sind.
  • Die verwendeten PCR-Bedingungen lauten 95°C für eine Dauer von 5 Minuten, gefolgt von 30 Zyklen jeweils bei 95°C für eine Dauer von 30 Sekunden, 50°C für eine Dauer von 1 Minute und 72°C für eine Dauer von 1 Minute. Das erhaltene Fragment mit 0,32 kb wird in Vektor pCRII unter Verwendung des TA-Cloning-Bausatzes von Invitrogen (Invitrogen, La Jolla, CA) geklont, wodurch pDM148 (sh. 7) erhalten wird. Das EcoRV/NcoI-Fragment mit 0,26 kb wird von pDM148 isoliert und an das NcoI/BgIII-Fragment mit 0,69 kb von pCaHj418 gebunden und in EcoRV/BamHI, aufgeschlossenes pJRoy20 zum Bilden von pDM149 (sh. 8) gebunden.
  • pMT1612 wird durch Einbringen eines BamHI-BamHI-Fragments, enthaltend das Bar-Gen von pBIT (Straubinger et al., 1992, Fungal Genetics Newsletter 39: 82–83) in pIC19H (Marsh et al., 1984, Gene 32: 481–485), geschnitten mit BamHI/BglII, konstruiert. Das bar-Gen wird dann als BamHI-XhoI-Fragment isoliert und in BamHI-XhoI-geschnittenes pJaL154 (9) zum Bilden von pMT1612 (10) isoliert. Die EcoRI-CAREZYMETM-Cellulaseexpressionskassette mit 3,2 kb wird von pDM149 in EcoRI-geschnittene Basta-Markierung pMT1612 zum Bilden von pJRoy30 (11) überführt.
  • Beispiel 2: Transformation von Fusarium
  • Fusarium-Stamm A3/5 (ATCC 20334) und die hochverzweigten morphologischen Mutanten CC1-3, CC1-8, CC2-3 und MC3-5 vom Fusarium-Stamm A3/5 (Wiebe et al., 1992, Mycological Research 96: 555–562) lässt man auf Petriplatten mit 10 × 15 mm mit Vogels-Medium (Vogel, 1964, Am. Nature 98: 435–446) plus 1,5% Glucose und Agar für eine Dauer von 3 Wochen bei 25°C wachsen. Konidiale und/oder myceliale Fragmente (etwa 108 pro Platte) werden in 10 ml sterilem Wasser unter Verwendung einer Übertragungsschlinge entfernt und durch Filtration durch 4 Schichten Käsestoff und schließlich durch eine Schicht Miracloth gereinigt. Konidiale und/oder myceliale Suspensionen werden durch Zentrifugation konzentriert. Fünfzig ml YPG-Medium, zusammengesetzt aus 1% Hefeextrakt, 2% Bactopepton, und 2% Glucose, werden mit 108 konidialen und/oder mycelialen Fragmenten beimpft und für eine Dauer von 14 Stunden bei 24°C, 150 UpM, inkubiert. Die erhaltenen Hyphae werden auf einem sterilen Filter mit 0,4 μm aufgefangen und nacheinander mit sterilem destilliertem Wasser und 1,0 MgSO4 gewaschen. Die Hyphee werden in 10 ml Lösung aus NOVOZYM 234TM (2–10 mg/ml in 1,0 M MgSO4) resuspendiert und für eine Dauer von 15 bis 30 Minuten bei 34°C unter Rühren mit 80 UpM aufgeschlossen. Nicht aufgeschlossenes Hyphen-Material wird von der erhaltenen Protoplast-Suspension durch aufeinander folgende Filtration durch 4 Schichten Käsestoff und durch Miracloth entfernt. Zwanzig ml 1 M Sorbit werden durch den Käsestoff und Miracloth geleitet und mit der Protoplast-Lösung vereinigt. Nach Mischen werden die Protoplaste (etwa 5 × 108) durch Zentrifugation in Pelletform gebracht und nacheinander durch Resuspension und Zentrifugation in 20 ml 1 M Sorbit und in 20 ml STC gewaschen. Die gewaschenen Protoplaste werden in 4 Teilen STC und 1 Teil SPTC mit einer Konzentration von 1–2 × 108/ml resuspendiert. Einhundert μl Protoplast-Suspension werden zu 5 μg pJRoy30 und 5 μl Heparin (5 mg/ml in STC) in Polypropylenröhrchen (17 × 100 mm) zugesetzt und auf Eis für eine Dauer von 30 Minuten inkubiert. Ein ml SPTC wird sanft in die Protoplast-Suspension gemischt, und es wird weiter bei Raumtemperatur für eine Dauer von 20 Minuten inkubiert. Fünfundzwanzig ml Schmelzlösung (gekühlt auf 40°C), bestehend aus COVE-Salzen, 25 mM NaNO3, 0,8 M Saccharose und 1% niedrig schmelzende Agarose (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO) werden mit den Protoplasten gemischt und dann auf eine leere Petrischale mit 150 mm aufgestrichen. Es wird weiter bei Raumtemperatur für eine Dauer von 10 bis 14 Tagen inkubiert. Nach Inkubation bei Raumtemperatur für eine Dauer von 24 Stunden werden 25 ml des identischen Mediums plus Basta (5 mg/ml) auf die Petrischale übergelegt. Basta wird aus AgrEvo (Hoechst Schering, Rodovre, Dänemark) erhalten und zwei Mal mit Phenol:Chloroform:Isoamylalkohol (25:24:1) und ein Mal mit Chloroform:Isoamylalkohol (24:1) vor der Verwendung extrahiert.
  • Beispiel 3: Expression von Cellulaseaktivität
  • Transformanten von Fusarium A3/5, CC1-3, CC2-3 und MC3-5 werden auf M400Da-Medium in Mikrotiterplatten und Schüttelkolben für eine Dauer von 7 Tagen bei 37°C gezüchtet. Ein Transformant jeweils von Fusarium A3/5, CC1-3, CC2-3 und MC3-5 wird in Fermentatoren unter geeigneten Fermentationsbedingungen in einem Medium, enthaltend typische Kohlenstoff- und Stickstoffquellen sowie Mineralsalze und Spurenmetalle, gezüchtet.
  • Cellulaseaktivität wird unter Verwendung des folgenden Verfahrens gemessen. Volumen von 5 μl verschiedener Verdünnungen eines Cellulase-Standards und Proben mit 1–5 μl werden in eine Platte mit 96 Mulden pipettiert. Der Cellulase-Standard (CAREZYMETM, Novo Nordisk A/S, Bagsværd, Dänemark) wird in 100 mM MOPS, pH 7,0, auf 150, 100, 50, 25, 12,5 und 6,25 ECU/ml verdünnt. Das Substrat wird durch Lösen von Azocarboxymethylcellulose (Azo-CMC) mit 2% G/V in 100 mM MOPS, pH 7,0, und Rühren bei 80°C für eine Dauer von 10 Minuten hergestellt. Ein Volumen mit 65 Mikroliter der Azo-CMC-Substratlösung wird in jede der Probenmulden pipettiert und gemischt. Die Platte mit 96 Mulden wird in einem Wasserbad bei 45°C für eine Dauer von 30 Minuten inkubiert und dann für eine Dauer von 2 Minuten auf Eis gegeben. Ein Volumen von 175 Mik rolitern Stoppreagenz wird jeder Mulde zugesetzt und gut gemischt. Das Stoppreagenz wird durch Suspendieren von 0,2 g ZnCl2 in 20 ml 0,25 M MOPS, pH 7,0, und Zugabe der Suspension zu 80 ml angesäuertem Ethanol, enthaltend 1,1 ml konzentrierte HCl pro Liter Ethanol, hergestellt. Die Platte mit 96 Mulden wird mit 3.000 UpM für eine Dauer von 10 Minuten in einer Zentrifuge des Typs Sorval RT 6000B zentrifugiert. Nach Beendigung der Zentrifugation werden 50 μl jedes Überstands in eine neue Platte mit 96 Mulden, enthaltend 50 μl Wasser pro Mulde, überführt. Die Absorption bei 600 nm wird gemessen.
  • Die Ergebnisse für die Mikrotiterplatte, den Schüttelkolben und die Fermentatorkulturen sind in Tabelle III angegeben, wobei die maximale Cellulaseausbeute auf 1,0 normiert ist. In der Mikrotiterplattenkultur stellen Transformante von CC2-3 und MC3-5 Cellulasegehalte her, die, verglichen mit dem Ausgangs- bzw. parentalen Stamm um 22% bzw. 46% höher sind. In der Schüttelkolbenkultur stellen die Transformanten von CC1-3, CC2-3 5 und MC3-5 Cellulasegehalte her, die, verglichen mit dem Ausgangs- bzw. parentalen Stamm um 85%, 54% bzw. 7% höher sind. In Fermentatoren stellen Transformante von CC1-3, CC2-3 5 und MC3-5 Cellulasegehalte her, die, verglichen mit dem Ausgangs- bzw. parentalen Stamm, um 136%, 3% bzw. 8% höher sind. Tabelle III Herstellung von Cellulase durch Transformanten des Wildtypstamms (A3/5) und morphologische Mutanten (CC1-3, CC2-3 und MC3-5)
    Figure 00290001
    • ° Die maximale Cellulaseausbeute des Ausgangs- bzw. parentalen Stamms Fusarium A3/5 wird für die höchste Aktivität, die unter jedem Satz an Wachstumsbedingungen beobachtet wurde, auf 1,0 normiert.
    • * n stellt die Anzahl an analysierten Transformanten dar.

Claims (11)

  1. Verfahren zum Herstellen eines heterologen Peptides, umfassend: (a) Kultivieren einer mutanten Zelle einer Fusarium Ausgangszelle, wobei die mutante Zelle eine Nukleinsäuresequenz umfasst, die das heterologe Polypeptid kodiert, und wobei die mutante Zelle einen eingeschränkteren Kolonie-Phänotyp und/oder eine ausgedehntere Hyphenverzweigung als die Ausgangszelle aufweist, und wobei die mutante Zelle eine oder mehrere verbesserte Eigenschaften aufweist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus (i) mehr heterologes Polypeptid als die Ausgangszelle produziert, (ii) eine geringere Viskosität als die Ausgangszelle aufweist und (iii) mehr heterologes Polypeptid als die Ausgangszelle sezerniert bei Kultivieren unter den gleichen Bedingungen; und (b) Gewinnen des heterologen Polypeptides.
  2. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei in Schritt (a) die mutante Zelle einen eingeschränkteren Kolonie-Phänotyp und eine ausgedehntere Hyphenverzweigung als die aufweist.
  3. Verfahren gemäß Anspruch 2, wobei die mutante Zelle, die einen eingeschränkteren Kolonie-Phänotyp aufweist, identifiziert wird vor der mutanten Zelle mit einer ausgedehnteren Hyphenverzweigung als die Ausgangszelle.
  4. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die mutanten Zellen durch Bestrahlung der Ausgangszelle erhalten werden.
  5. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die mutanten Zellen durch chemische Mutagenese der Ausgangszelle erhalten werden.
  6. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die mutanten Zellen spontane Mutanten der Ausgangszelle sind.
  7. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei der Kolonie-Phänotyp der mutanten Zelle wenigstens 10% eingeschränkter ist als derjenige der Ausgangszelle.
  8. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Hyphenverzweigung der mutanten Zelle wenigstens ungefähr 10% verzweigter ist als die Ausgangszelle.
  9. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die mutante Zelle eine Viskosität erzeugt, die nicht größer ist als ungefähr 90% der Viskosität, die durch die Ausgangszelle erzeugt wird.
  10. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die mutante Zelle wenigstens ungefähr 10% mehr heterologes Polypeptid als die Ausgangszelle erzeugt.
  11. Eine mutante Zelle einer Fusarium-Zelle, umfassend eine Nukleinsäuresequenz, die ein heterologes Polypeptid kodiert, wobei die mutante Zelle einen eingeschränkteren Kolonie-Phänotyp, eine ausgedehntere Hyphenverzweigung, und ein oder mehrere verbesserte Eigenschaften aufweist, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus (i) mehr heterologes Polypeptid erzeugt als die Ausgangszelle, (ii) eine geringere Viskosität als die Ausgangszelle aufweist, und (iii) mehr heterologes Polypeptid als die Ausgangszelle sezerniert, bei Kultivieren unter den gleichen Bedingungen.
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