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Technisches
Gebiet der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Erhalten einer
rekombinanten Pilzwirtszelle umfassend eine Nukleinsäuresequenz,
die ein heterologes Protein kodiert, wobei mindestens eine kryptische Spleißstelle
in der Nukleinsäuresequenz
modifiziert ist. Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin Verfahren zur
rekombinanten Herstellung eines Polypeptids, das von dieser Nukleinsäuresequenz
kodiert wird.
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Beschreibung
des zugehörigen
Stands der Technik
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Eukaryotische
Gene können
durch dazwischenliegende Sequenzen (Introns) unterbrochen sein,
die in Vorläufertranskripten
modifiziert sein müssen,
um funktionelle mRNAs herzustellen. Dieser Prozess der Intron-Entfernung
ist als Prä-mRNA-Spleißen bekannt.
Für gewöhnlich ist
eine Verzweigungspunktsequenz eines Introns für das Intron-Spleißen durch
die Bildung eines Lassos erforderlich. Signale zum Spleißen befinden
sich direkt an den Rändern
der Intron-Spleißstellen.
Die Ränder
der Intron-Spleißstellen
haben für
gewöhnlich
die Konsensus-Intron-Sequenzen GT und AG an ihren 5'- bzw. 3'-Endpunkten. Während von keinen von AG abweichenden
3'-Spleißstellen
berichtet wurde, gibt es Berichte über einige wenige Ausnahmen
für die
5'-GT-Spleißstelle.
Zum Beispiel gibt es Ausnahmen, bei denen CT oder GC für GT an
dem 5'-Rand ersetzt wurde.
Es gibt auch eine starke Präferenz
für die
Nukleotidbasen ANGT nach GT, wobei N gleich A, C, G oder T (primär A oder
T in Arten von Saccharomyces) ist, aber es gibt keine ausgeprägte Präferenz für bestimmte Nukleotide,
die der GT-Spleißstelle
vorangehen. Der 3'-Spleißstelle
AG geht primär
eine Pyrimidinnukleotidbase (Py), d. h. C oder T, voran.
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Die
Anzahl der Introns, die ein Pilzgen unterbrechen können, liegt
im Bereich von eins bis 12 oder mehr Introns (Rymond und Rosbash,
1992, In, E.W. Jones, J.R. Pringle und J.R. Broach, Hrsg., The Molecular and
Cellular Biology of the Yeast Saccharomyces, S. 143-192, Cold Spring
Harbor Laboratory Press, Plainview, New York; Gurr et al., 1987,
In Kinghorn, J.R. (Hrsg.), Gene Structure in Eukaryotic Microbes,
S. 93-139, IRL Press, Oxford). Sie können über ein Gen verteilt sein oder
am 5'- oder 3'-Ende eines Gens
gelegen sein. In Saccharomyces cerevisiae sind Introns primär am 5'-Ende des Gens lokalisiert.
Introns können
im Allgemeinen kleiner als 1 kb in der Größe sein und sind für gewöhnlich kleiner
als 400 bp in der Größe bei Hefe
und kleiner 100 bp bei filamentösen
Pilzen.
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Die
Intron-Verzweigungspunktsequenz von Saccharomyces cerevisiae 5'-TACTAAC-3' tritt selten genau
so in Introns filamentöser
Pilzen auf (Gurr et al., 1987, supra). Sequenzstücke, die mehr oder weniger TACTAAC ähneln, können an
entsprechenden Punkten in den Introns filamentöser Pilze mit einem allgemeinen
Konsensus NRCTRAC beobachtet werden, wobei N gleich A, C, G oder
T ist und R gleich A oder G ist. Zum Beispiel ist in den putativen
Konsensussequenzen von sowohl Neurospora crassa als auch Aspergillus nidulans
T an der vierten Position invariant. Darüber hinaus herrschen die Nukleotide
G, A und C in über
80% der Positionen 3, 6 bzw. 7 vor, obwohl Position 7 in Aspergillus
nidulans mit nur 65% C flexibler ist. Allerdings sind sowohl bei
Neurospora crassa als auch Aspergillus nidulans die Positionen 1,
2, 5 und 8 weniger strikt. Andere filamentöse Pilze haben ähnliche
Verzweigungspunktabschnitte bei entsprechenden Positionen in ihren
Introns, aber die Sammlung ist zu klein, um definitive Trends zu
erkennen.
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Die
heterologe Expression eines Gens, das ein Polypeptid in einem Pilzwirtsstamm
kodiert, könnte
in einem Wirtstamm resultieren, der eine Region innerhalb der kodierenden
Sequenz fälschlicherweise
als eine dazwischenliegende Sequenz oder ein Intron erkennt. Zum
Beispiel wurde gefunden, dass Intron enthaltende Gene filamentöser Pilze
in Saccharomyces cerevisiae nicht korrekt gespleißt werden
(Gurr et al., 1987, In Kinghorn, J.R. (Hrsg.), Gene Structure in
Eukaryotic Microbes, S. 93-139, IRL Press, Oxford). Da die Region nicht
von dem Elternstamm, aus welchem das Gen erhalten wurde, als ein
Intron erkannt wird, wird das Intron als ein kryptisches Intron
bezeichnet. Die unpassende Erkennung könnte zu einem abweichenden
Spleißen der
Vorläufer-mRNA-Moleküle führen, was
in keiner Produktion eines biologisch aktiven Polypeptids oder in der
Produktion einiger Populationen von Polypeptidprodukten mit variierender
biologischer Aktivität
resultiert.
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Es
ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Verfahren zum Entfernen
kryptischer Spleißstellen
innerhalb der kodierenden Sequenz von Genen bereitzustellen, um
ein unpassendes Spleißen
von Vorläufer-mRNA
bei heterologer Expression durch Pilzwirtszellen zu verhindern.
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Zusammenfassung
der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zum Erhalten einer rekombinanten
Pilzwirtszelle umfassend das Einführen einer Nukleinsäuresequenz,
die ein heterologes Polypeptid kodiert, in eine Pilzwirtszelle, wobei
mindestens eine kryptische Spleißstelle in der Nukleinsäuresequenz
modifiziert ist. In einer Ausführungsform
ist die kryptische Spleißstelle(n)
modifiziert, indem mindestens eine kryptische Konsensussequenz durch
eine Nichtkonsensussequenz ersetzt wird. In einer anderen Ausführungsform
ist die kryptische Spleißstelle(n)
modifiziert, indem eine erste Region, die mindestens ein kryptisches
Intron oder einen Teil hiervon umfasst, durch eine zweite Region,
die einen prozentualen G+C-Gehalt im Bereich von ungefähr 40% bis
ungefähr
70% aufweist, ersetzt wird. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform
ist die kryptische Spleißstelle(n)
modifiziert, indem die kryptische Konsensussequenz(en) durch eine
Nichtkonsensussequenz ersetzt wird und indem die erste Region, die
ein kryptisches Intron(s) oder einen Teil hiervon umfasst, durch
eine zweite Region, die einen prozentualen G+C-Gehalt im Bereich
von ungefähr
40% bis ungefähr
70% aufweist, ersetzt wird.
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Die
vorliegenden Erfindung betrifft weiterhin Verfahren zur rekombinanten
Herstellung von Polypeptiden, die von diesen Nukleinsäuresequenzen
kodiert werden.
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Definitionen
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„Intron" wird hierin als
eine nichttranslatierte, dazwischenliegende Nukleinsäuresequenz
definiert, die die kodierende Sequenz eines Gens unterbricht und
aus dem primären
mRNA-Transkript aussgeschnitten wird.
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„Exon" wird hierin als
Abschnitte eines Gens definiert, die transkribiert und in ein Polypeptid
translatiert: werden.
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„Primäres mRNA-Transkript" wird hierin als
das Vorläufer-mRNA-Produkt
eines Gens definiert, das durch Transkription produziert wird.
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„RNA-Spleißen" wird hierin als
das Ausschneiden einer transkribierten Intron-Sequenz(en) aus einem primären mRNA-Transkript,
gefolgt von dem Zusammenfügen
der verbleibenden Exons, um das mRNA-Produkt herzustellen, definiert.
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„Kryptisches
Intron" wird hierin
definiert als eine Region einer kodierenden Sequenz, die fälschlicherweise
als ein Intron erkannt wird, das aus dem primären mRNA-Transkript ausgeschnitten
wird. Ein kryptisches Intron besitzt vorzugsweise 10 bis 1500 Nukleotide,
weiter bevorzugt 20 bis 1000 Nukleotide, sogar weiter bevorzugt
30 bis 300 Nukleotide und am meisten bevorzugt 30 bis 100 Nukleotide.
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„Konsensussequenz" wird hierin als
eine Nukleinsäuresequenz
definiert, die im Allgemeinen an der 5'- oder 3'-Exon-Intron-Grenze gefunden wird, die
die Intron-Spleißstelle
enthält.
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„Kryptische
Spleißstelle" wird hierin als
eine Stelle, entweder an dem 5'-
oder 3'-Rand eines
kryptischen Introns definiert, an welcher ein abweichendes Spleißen auftritt.
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„Kryptische
Konsensussequenz" wird
hierin als eine Nukleinsäuresequenz
definiert, die im Allgemeinen entweder am 5'- oder 3'-Rand eines kryptischen Introns gefunden
wird, das die kryptische Spleißstelle
enthält.
Eine kryptische Konsensussequenz hat vorzugsweise nicht mehr als
10, weiter bevorzugt nicht mehr als 6, sogar noch weiter bevorzugt
3 und am meisten bevorzugst 2 Nukleotide.
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„Abweichendes
Spleißen" wird hierin als
das unpassende Ausschneiden einer Region einer transkribierten Sequenz
aus einem primären
mRNA-Transkript definiert, wobei die Region fälschlicherweise als eine dazwischenliegende
Nukleinsäuresequenz
erkannt wird.
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„Aminosäure-Wobble-Position" wird hierin als
ein Nukleotidrest definiert, welcher aufgrund der Degeneration des
genetischen Codes der Pilzwirtszelle durch ein anderes Nukleotid
ersetzt werden kann.
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„Rekombinante
Pilzwirtszelle" ist
hierin definiert als eine Pilzwirtszelle, umfassend eine heterologe
Nukleinsäuresequenz.
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Kurze Beschreibung
der Zeichnungen
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1 zeigt
eine Restriktionskarte von pUC19-GFP.
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2 zeigt
die Konstruktion von pShTh34.
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3 zeigt
die GFP-cDNA-Sequenz (SEQ ID Nr. 20) mit kryptischen Intron-Regionen, die als
Fragmente A bis D markiert sind.
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4 zeigt die Konstruktion von pShTh49.
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5 zeigt
die Konstruktion von pShTh58.1.
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6 zeigt
das Fluoreszenzspektrum von GFP, welches von der Transformante ShTh58l.1
hergestellt wurde.
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7 zeigt
eine Restriktionskarte von pShTh58.2.
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8 zeigt
das Fluoreszenzspektrum von GFP, welches von der Transformante ShTh582.1
hergestellt wurde.
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Ausführliche
Beschreibung der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zum Erhalten einer rekombinanten
Pilzwirtszelle, umfassend das Einführen einer Nukleinsäuresequenz,
die ein heterologes Polypeptid kodiert, in eine Pilzwirtszelle, wobei
mindestens eine kryptische Spleißstelle in der Nukleinsäuresequenz
modifiziert ist. Die Nukleinsäuresequenz
kann sowohl eine genomische Sequenz als auch die korrespondierenden
cDNA- und RNA-Sequenzen sein. Die Nukleinsäuresequenz ist vorzugsweise
eine cDNA-Sequenz.
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Die
kryptische Spleißstelle(n)
kann durch Vergleich der heterologen mRNA oder aus der mRNA hergestellten
cDNA, die das heterologe Polypeptid kodiert, das in der rekombinanten
Pilzwirtszelle hergestellt wurde, mit der mRNA oder aus dieser mRNA
synthetisierten cDNA, die von der Elternzelle erhalten wurde, identifiziert
werden. Die Elternzelle ist die Quelle der heterologen mRNA. Alternativ
kann die kryptische Spleißstelle(n)
aus der Aminosäuresequenz
des Polypeptids, das heterolog von der Nukleinsäuresequenz in der Pilzwirtszelle
kodiert wird, durch Vergleich mit der Nukleinsäuresequenz der Elternzelle
und seiner abgeleiteten Aminosäuresequenz
identifiziert werden. Kryptische Spleißstellen können auch unter Verwendung
der Kenntnis der Ränder
oder Konsensus-Intron-Sequenzen von authentischen Pilz-Intron-Spleißstellen
identifiziert werden (Rymond und Rosbash, 1992, supra; Gurr et al.,
1987, supra).
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Die
kryptische Spleißstelle(n)
kann modifiziert werden, indem die kryptische Konsensussequenz(en) durch
eine Nichtkonsensussequenz ersetzt wird und/oder indem eine erste
Region eines (oder mehrerer) kryptischen Introns oder Teils hiervon
durch eine zweite Region, die einen prozentualen G+C-Gehalt im Bereich von
ungefähr
40% bis ungefähr
70%, vorzugsweise ungefähr
40% bis ungefähr
60% und weiter bevorzugt ungefähr
40% bis ungefähr
50% besitzt, ersetzt wird.
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Die
5'- und 3'-kryptischen Konsensussequenzen
können
durch eine Nichtkonsensussequenz durch Verfahren, die dem Fachmann
auf dem Gebiet bekannt sind, ersetzt werden, einschließlich, ohne
darauf beschränkt
zu sein, Oligonukleotid-gerichtete Mutagenese, heterologe Rekombination,
ortsspezifische Mutagenese, PCR-Mutagenese und chemische Synthese.
In einer bevorzugten Ausführungsform
ist die 5'-kryptische Konsensussequenz
GT, GC oder CT und die 3'-kryptische
Konsensussequenz ist AG. In einer weiter bevorzugten Ausführungsform
ist die 5'-kryptische
Konsensussequenz GTANGT, GCANGT oder CTANGT, wobei N gleich A, C,
G oder T ist. In einer anderen weiter bevorzugten Ausführungsform
ist die 3'-kryptische
Konsensussequenz CAG, TAG oder AAG. Wo es mehr als ein synthetisches
Fragment gibt, können
die Fragmente durch in der Technik bekannte Vorgehensweisen zusammen
zu einem Fragment annealt werden. Die gesamte kodierende Sequenz
kann dann durch Amplifizieren der verbleibenden 5'- und 3'-Teile der Nukleinsäuresequenz, die das synthetische
Fragment umgeben, mit für
das Gen spezifischen Oligonukleotidprimern amplifiziert werden.
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Die
Wahl der Nukleotide, die die Nukleotide der kryptischen Konsensussequenz
ersetzen sollen, wird vorzugsweise auf Grundlage einer Kodonverwendungstabelle
stattfinden, wie zum Beispiel Tabelle 1, die auf der nächsten Seite
für Aspergillus,
der Pilzwirtszelle gezeigt ist. Die kryptische Konsensussequenz
wird vorzugsweise durch eine Nichtkonsensussequenz ersetzt, wobei
Nukleotide, die den Aminosäure-Wobble-Positionen entsprechen,
durch andere Nukleotide ersetzt wurden, um die gleichen Aminosäuren zu
ergeben. Tabelle
1
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Vorgehensweisen
zum Ersetzen einer ersten Region eines kryptischen Introns oder
eines Teils hiervon durch eine zweite Region können durch die gleichen Vorgehensweisen
durchgeführt
werden, die vorstehend für
das Ersetzen einer kryptischen Konsensussequenz durch eine Nichtkonsensussequenz
beschrieben sind. In einer Ausführungsform
hat die zweite Region die gleiche Anzahl von Nukleotiden wie die
erste Region. In einer bevorzugten Ausführungsform haben die erste
und die zweite Region vorzugsweise 10 bis 500 Nukleotide, weiter
bevorzugt 10 bis 200 Nukleotide und am meisten bevorzugten 10 bis
100 Nukleotide, die die 5'- und/oder
3'-Ränder des
kryptischen Introns flankieren. In einem kryptischen Intron kann
eine Verzweigungspunktsequenz vorhanden sein oder auch nicht. In
einer bevorzugten Ausführungsform
umfasst das kryptische Intron eine Verzweigungspunktsequenz von
mindestens sieben Nukleotiden a-b-c-d-e-f-g, wobei a A, C, G oder
T ist; b A oder G ist; c C ist; d T ist; e A oder T ist; f A ist
und g C ist. In einer stärker
bevorzugten Ausführungsform
enthält
die Verzweigungspunktsequenz mindestens sieben Nukleotide a-b-c-d-e-f-g,
wobei a A, C, G oder T ist; b A ist; c C ist; d T ist; e A ist,
f A ist und g C ist.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
ist die Aminosäuresequenz
des heterologen Polypeptids, das von der Pilzwirtszelle hergestellt
wird, identisch mit der Aminosäuresequenz
des Wildtyppolypeptids. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform
ist die Anzahl der Aminosäurereste
in dem heterologen Polypeptid, das von der Pilzwirtszelle hergestellt
wird, die gleiche wie die Anzahl der Aminosäurereste in dem Wildtyppolypeptid.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform haben die Nichtkonsensussequenz(en)
die gleiche Anzahl von Nukleotiden wie die kryptische(n) Konsensussequenz(en).
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Die
Aminosäuresequenz
des heterologen Polypeptids, das von der rekombinanten Pilzwirtszelle
hergestellt wird, kann sich von der Aminosäuresequenz des Wildtyppolypeptids
durch eine Insertion oder Deletion einer oder mehrerer Aminosäurereste
und/oder der Substitution von einem oder mehreren Aminosäurerest(en) durch
davon verschiedene Aminosäurereste
unterscheiden. Vorzugsweise sind die Aminosäureänderungen von geringer Natur,
das heißt,
konservative Aminosäuresubstitutionen,
die die Faltung und Aktivität
des Proteins nicht signifikant beeinflussen; kleine Deletionen,
typischerweise von einer bis ungefähr 30 Aminosäuren; eine
amino- oder carboxyterminale Verlängerung wie zum Beispiel ein
aminoterminaler Methioninrest; ein kleines Linkerpeptid von bis
zu ungefähr
20 bis 25 Resten; oder eine kleine Verlängerung, die die Aufreinigung erleichtert,
wie zum Beispiel ein Polyhistidinteil, ein antigenes Epitop oder
eine Bindedomäne.
Beispiele von konservativen Aminosäuresubstitutionen sind solche
innerhalb der Gruppe der basischen Aminosäuren (wie zum Beispiel Arginin,
Lysin, Histidin), sauren Aminosäuren
(wie zum Beispiel Glutaminsäure
und Asparginsäure),
polaren Aminosäuren
(wie zum Beispiel Glutamin und Asparagin), hydrophoben Aminosäuren (wie
zum Beispiel Leucin, Isoleucin, Valin), aromatischen Aminosäuren (wie
zum Beispiel Phenylalanin, Tryptophan, Tyrosin) und kleinen Aminosäuren (wie
zum Beispiel Glycin, Alanin, Serin, Threonin, Methionin).
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Der
Begriff „heterologes
Polypeptid" soll
hierin nicht so verstanden werden, dass er sich auf eine spezifische
Länge des
kodierten Produkts bezieht, und daher umfasst er Peptide, Oligopeptide
und Proteine. Darüber
hinaus kann der Begriff „heterologes
Polypeptid" zwei
oder mehr Polypeptide umfassen, die kombiniert werden, um das Produkt
zu bilden. Die heterologen Polypeptide können aus prokaryotischen Quellen
(z. B. Hydrolasen aus Arten von Bacillus, d. h. alpha-Amylasen,
Proteasen, Lipasen etc.), eukaryotischen Quellen (z. B. humanes
Insulin, humanes Wachstumshormon, bovines Chymosin, Faktor VIII,
grün fluoreszierendes Protein
etc.), und Pilzquellen, die andere sind als der Pilzwirt (z. B.
Myceliophthora-Laccasen, Polyporus-Laccasen, Coprinus-Peroxidasen,
Humicola-Lipasen,
Aspergillus-Amylasen etc.) erhalten werden. Heterologe Polypeptide
können
auch Hybridpolypeptide einschließen, die eine Kombination von
partiellen oder vollständigen
Polypeptidsequenzen umfassen, die aus mindestens zwei verschiedenen
Polypeptiden erhalten werden, wobei mindestens eines für den Pilzwirt
heterolog ist (z. B. eine Nukleinsäuresequenz, die eine Myceliophthora-Laccase
kodiert, fusioniert an eine Nukleinsäuresequenz, die das Glucoamylasesignalpeptid
und -propeptid von Aspergillus niger kodiert). Heterologe Polypeptide
können
weiterhin natürlich
vorkommende allelische oder technisch hergestellte Variationen der
vorstehend genannten Polypeptide einschließen.
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Vorzugsweise
ist das heterologe Polypeptid ein Hormon, ein Enzym, ein Rezeptor
oder ein Reporter. In einer weiter bevorzugten Ausführungsform
ist das heterologe Polypeptid eine Oxidoreduktase, eine Transferase,
eine Hydrolase, eine Lyase, eine Isomerase oder eine Ligase. In
einer sogar noch stärker
bevorzugten Ausführungsform
ist das heterologe Polypeptid eine Aminopeptidase, eine Amylase,
eine Carbohydrase, eine Carboxypeptidase, eine Katalase, eine Cellulase,
eine Chitinase, eine Cutinase, eine Desoxyribonuklease, eine Esterase,
eine alpha-Galaktosidase, eine beta-Galaktosidase, eine Glucoamylase,
eine alpha-Glucosidase, eine beta-Glucosidase, eine Haloperoxidase,
eine Invertase, eine Laccase, eine Lipase, eine Mannosidase, eine
Mutanase, eine Oxidase, ein pektinolytisches Enzym, eine Peroxidase,
eine Phytase, eine Polyphenoloxidase, ein proteolytisches Enzym,
eine Ribonuklease oder eine Xylanase.
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In
einer anderen, sogar noch stärker
bevorzugten Ausführungsform
ist das heterologe Polypeptid ein grün fluoreszierendes Protein
(GFP) aus Aequorea victoria. GFP besitzt eine Anzahl von wünschenswerten Charakteristika
als ein universeller Reporter, um die Genexpression und Proteinlokalisation
in vivo in einer großen
Bandbreite von Organismen sichtbar zu machen, einschließlich Escherichia
coli, Hefe, Pflanzenzellen, Wurm, Fliege und Säugern (Chalfie et al., 1994,
Science 263: 802-805; Delagrave et al., 1995, Bio/Technology 13:
151-154; Heim et al., 1995, Nature 373: 663-664; Sheen et al., 1995,
Plant Journal 8: 777-784; Prasher, 1995, TIG 8: 320-323; Haseloff
und Amos, 1995, TIG 8: 328-329). Die Verwendung von GFP als ein
Reporter für
die Genexpression in filamentösen
Pilzen wurde bisher noch nicht beschrieben.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft auch (eine) isolierte Nukleinsäuresequenz(en)
mit einer modifizierten kryptischen Spleißstelle(n), die durch die Verfahren
der vorliegenden Erfindung hergestellt wird. Die Nukleinsäuresequenz(en)
mit einer modifizierten kryptischen Spleißstelle(n) umfasst weiterhin
sowohl die genomische Sequenz wie auch die korrespondierenden cDNA-
und RNA-Sequenzen, und der Ausdruck „Nukleinsäuresequenzen", wie er hierin verwendet
wird, soll so verstanden werden, dass er alle diese Varianten, einschließlich synthetischer
DNA, umfasst.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft auch Nukleinsäurekonstrukte, die diese Nukleinsäuresequenz(en) umfassen. „Nukleinsäurekonstrukt" soll im Allgemeinen
so verstanden werden, dass ein Nukleinsäuremolekül, entweder einzel- oder doppelsträngig, das
von einem natürlich
vorkommenden Gen isoliert wird oder das so modifiziert wurde, dass
es Abschnitte von Nukleinsäure
enthält,
die in einer Weise kombiniert und nebeneinander positioniert werden,
die sonst in der Natur nicht existieren würde. In einem Nukleinsäurekonstrukt
der vorliegenden Erfindung kann die Nukleinsäuresequenz genomischen, cDNA-,
semisynthetischen oder synthetischen Ursprungs sein.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft auch rekombinante Expressionsvektoren,
die Nukleinsäurekonstrukte
der vorliegenden Erfindung umfassen. Der rekombinante Expressionsvektor
kann jeder beliebige Vektor sein, der einfach rekombinanten Vorgehensweisen
unterzogen werden kann und die Expression der Nukleinsäuresequenz
mit mindestens einer modifizierten kryptischen Spleißstelle
bewirken kann. Die Wahl eines Vektors wird typischerweise von der
Kompatibilität
des Vektors mit der Pilzwirtszelle, in welche der Vektor eingeführt werden
soll, abhängen.
Der Vektor kann ein lineares oder ein geschlossen ringförmiges Plasmid
sein. Das Vektorsystem kann ein einzelner Vektor oder einzelnes
Plasmid oder zwei oder mehr Vektoren oder Plasmide sein, die zusammen
die Gesamt-DNA enthalten, die in das Genom des Pilzwirts einzuführen ist.
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Der
Vektor kann ein autonom replizierender Vektor sein, d. h. ein Vektor,
der als eine extrachromosomale Einheit existiert, dessen Replikation
unabhängig
von der chromosomalen Replikation ist, z. B. ein Plasmid, ein extrachromosomales
Element, ein Minichromosom oder ein künstliches Chromosom. Der Vektor
kann jedes beliebige Mittel zur Sicherstellung der Selbstreplikation
enthalten. Alternativ kann der Vektor ein solcher sein, der, wenn
er in die Pilzzelle eingeführt
wird, in das Genom integriert und zusammen mit dem/den Chromosom(en),
in welches) er integriert wurde, repliziert wird. Zur Integration
kann der Vektor auf Nukleinsäuresequenzen
mit mindestens einer modifizierten kryptischen Spleißstelle
oder jedes beliebige andere Element des Vektors zur stabilen Integration
des Vektors in das Genom durch homologe oder nicht homologe Replikation
angewiesen sein. Alternativ kann der Vektor zusätzlich Nukleinsäuresequenzen
zur Steuerung der Integration durch homologe Rekombination in das
Genom der Pilzzelle enthalten. Die zusätzlichen Nukleinsäuresequenzen
ermöglichen
es dem Vektor, in das Wirtszellgenom an (einer) genauen Stelle(n)
in dem/den Chromosomen) integriert zu werden. Um die Wahrscheinlichkeit
der Integration an einer präzisen
Stelle zu erhöhen, sollten
vorzugsweise zwei Nukleinsäuresequenzen
vorhanden sein, die einzeln eine ausreichende Anzahl von Nukleinsäuren enthalten,
vorzugsweise 400 bp bis 1500 bp, weiter bevorzugt 800 bp bis 1000
bp, die hoch homolog zu der entsprechenden Zielsequenz sind, um
die Wahrscheinlichkeit der homologen Rekombination zu erhöhen. Diese
Nukleinsäuresequenzen
können
jede beliebige Sequenz sein, die homolog zu der Zielsequenz in dem
Genom der Pilzwirtszelle ist, und sie können darüber hinaus nicht kodierende
oder kodierende Sequenzen sein.
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Zur
autonomen Replikation kann der Vektor darüber hinaus einen Replikationsursprung
enthalten, der es dem Vektor ermöglicht,
autonom in der in Frage stehenden Wirtszelle repliziert zu werden.
Beispiele von Replikationsursprüngen
zur Verwendung in einer Hefewirtszelle sind der 2 Mikrometer-Replikationsursprung und
die Kombination von CEN3 und ARS1. Jeder beliebige Replikationsursprung
kann verwendet werden, der mit der Pilzwirtszelle der Wahl kompatibel
ist.
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Die
Vektoren der vorliegenden Erfindung enthalten vorzugsweise einen
oder mehrere selektierbare Marker, die eine leichte Selektion der
transformierten Zellen erlauben. Ein selektierbarer Marker ist ein
Gen, dessen Produkt eine Biozid- oder virale Resistenz, Resistenz
gegenüber
Schwermetallen, Prototrophie bei Auxotrophen und Ähnliches
bereitstellt. Der selektierbare Marker kann ausgewählt sein
aus der Gruppe, einschließend – ohne darauf
beschränkt
zu sein – amdS
(Acetamidase), argB (Ornithincarbamoyltransferase), bar (Phosphinothricinacetyltransferase),
hygB (Hygromycinphosphotransferase), niaD (Nitratreduktase), pyrG (Orotidin-5'-Phosphatdecarboxylase)
und sC (Sulfatadenyltransferase) und trypC (Anthranilatsynthase).
Bevorzugt zur Verwendung in einer Aspergillus-Zelle sind die Marker
amdS und pyrG von Aspergillus nidulans oder Aspergillus oryzae und
der Marker bar von Streptomyces hygroscopicus. Darüber kann
die Selektion durch Co-Transformation durchgeführt werden, z. B. wie in WO
91/17243 beschrieben, wo der selektionierbare Marker auf einem getrennten
Vektor ist.
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In
dem Vektor ist die Nukleinsäuresequenz,
die mindestens eine modifizierte Spleißstelle umfasst, funktionsfähig mit
Kontrollsequenzen verknüpft,
die für
die Expression der kodierenden Sequenz der Nukleinsäuresequenz
erforderlich sind, an welche sie ligiert sind. Der Ausdruck „Kontrollsequenzen" soll hierin so verstanden
werden, dass er alle Bestandteile einschließt, deren Gegenwart für die Expression
der kodierenden Sequenz der Nukleinsäuresequenz notwendig oder vorteilhaft
ist. Die Kontrollsequenzen können
zu der Nukleinsäuresequenz,
die das heterologe Polypeptid kodiert, nativ sein, oder sie können aus
fremden Quellen erhalten werden. Solche Kontrollsequenzen schließen ein,
ohne darauf beschränkt
zu sein, einen Leader, eine Polyadenylierungssequenz, eine Propeptidsequenz,
einen Promotor, eine Signalsequenz und einen Transkriptionsterminator.
Im Minimalfall schließen
die Kontrollsequenzen einen Promotor und transkriptionale und translationale
Stoppsignale ein. Zur Expression unter der Steuerung der Kontrollsequenzen
wird ein Gen, das gemäß der vorliegenden
Erfindung verwendet wird, funktionsfähig mit Kontrollsequenzen in
einer solchen Weise verbunden, dass die Expression der kodierenden
Sequenz unter Bedingungen erreicht wird, die mit den Kontrollsequenzen
kompatibel sind. Der Ausdruck „kodierende
Sequenz", wie er
hierin definiert ist, ist eine Sequenz, die in mRNA transkribiert
und in ein heterologes Polypeptid translatiert wird, wenn sie unter
die Kontrolle der vorstehend genannten Kontrollsequenzen gestellt
wird. Die Ränder
der Kontrollsequenzen werden durch ein Translationsstartkodon am
5'-Terminus und
ein Translationsstoppkodon am 3'-Terminus
bestimmt. Eine kodierende Sequenz kann, ohne darauf beschränkt zu sein,
DNA, cDNA und rekombinante Nukleinsäuresequenzen, einschließen.
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Wie
vorstehend erwähnt,
kann die Nukleinsäuresequenz
der vorliegenden Erfindung funktionsfähig mit einer geeigneten Promotorsequenz
verknüpft
sein. Die Promotorsequenz ist eine Nukleinsäuresequenz, die von der Pilzwirtszelle
zur Expression der Nukleinsäuresequenz
erkannt wird. Die Promotorsequenz enthält Transkriptions- und Translationskontrollsequenzen,
die die Expression des heterologen Polypeptids vermitteln. Der Promotor
kann jede beliebige Nukleinsäuresequenz
sein, die transkriptionale Aktivität in der Pilzwirtszelle der
Wahl zeigt, und kann von Genen erhalten werden, die Polypeptide
kodieren, die entweder homolog oder heterolog für die Wirtszelle sind. Beispiele geeigneter
Promotoren zur Steuerung der Transkription eines erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzkonstrukts
in einem filamentösen
Pilzwirt sind Promotoren, die von den Genen erhalten werden, die
kodieren für
TAKA-Amylase aus Aspergillus oryzae, Aspartylproteinase aus Rhizomucor
miehei, neutrale α-Amylase
aus Aspergillus niger, Säure
stabile alpha-Amylase aus Aspergillus niger, Glucoamylase (glaA)
aus Aspergillus niger oder Aspergillus awamori, Lipase aus Rhizomucor
miehei, alkalische Protease aus Aspergillus oryzae, Triosephosphatisomerase
aus Aspergillus oryzae, Acetamidase aus Aspergillus nidulans und
Hybride hiervon. In einer Hefewirtszelle ist ein verwendbarer Promotor
der Enolase- (eno-I) -Promotor aus Saccharomyces cerevisiae. Besonders
bevorzugte Promotoren sind die TAKA-Amylase-, NA2-tpi- (einem Hybrid
der Promotoren aus den Genen, die die neutrale α-Amylase aus Aspergillus niger und
die Triosephosphatisomerase aus Aspergillus oryzae kodieren) und
glaA-Promotoren.
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Die
Nukleinsäuresequenz
der vorliegenden Erfindung kann auch an ihrem 3'-Ende funktionsfähig mit einer Terminatorsequenz
verknüpft
sein. Die Terminatorsequenz kann für die Nukleinsäuresequenz,
die das heterologe Polypeptid kodiert, nativ sein oder kann aus
fremden Quellen erhalten werden. Jeder beliebige Terminator, der
in der Pilzwirtszelle der Wahl funktional ist, kann in der vorliegenden
Erfindung verwendet werden, aber besonders bevorzugte Terminatoren
werden von Genen erhalten, die kodieren für TAKA-Amylase aus Aspergillus oryzae, Glucoamylase
aus Aspergillus niger, Anthranilatsynthase aus Aspergillus nidulans,
alpha-Glucosidase aus Aspergillus niger und Enolase aus Saccharomyces
cerevisiae.
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Die
Nukleinsäuresequenz
der vorliegenden Erfindung kann auch funktionsfähig mit einer geeigneten Leadersequenz
verknüpft
sein. Eine Leadersequenz ist eine nicht translatierte Region einer
mRNA, die für
die Translation durch den Pilzwirt wichtig ist. Die Leadersequenz
ist funktionsfähig
mit dem 5'-Terminus
der Nukleinsäuresequenz
verknüpft,
die das heterologe Polypeptid kodiert. Die Leadersequenz kann für die Nukleinsäuresequenz,
die das heterologe Polypeptid kodiert, nativ sein oder aus fremden
Quellen erhalten werden. Jede beliebige Leadersequenz, die in der
Pilzwirtszelle der Wahl funktional ist, kann in der vorliegenden
Erfindung verwendet werden, aber besonders bevorzugte Leader werden
erhalten aus den Genen, die kodieren für TAKA-Amylase aus Aspergillus
oryzae und Triosephosphatisomerase aus Aspergillus oryzae.
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Eine
Polyadenylierungssequenz kann auch funktionsfähig mit dem 3'-Terminus der Nukleinsäuresequenz
der vorliegenden Erfindung verknüpft
sein. Die Polyadenylierungssequenz ist eine Sequenz, die, wenn sie
transkribiert wird, von dem Pilzwirt erkannt wird, damit Polyadenosinreste
an die transkribierte mRNA angefügt
werden. Die Polyadenylierungssequenz kann für die Nukleinsäuresequenz,
die das heterologe Polypeptid kodiert, nativ sein oder kann aus
fremden Quellen erhalten sein. Jede beliebige Polyadenylierungssequenz,
die in dem Pilzwirt der Wahl funktional ist, kann in der vorliegenden
Erfindung verwendet werden, aber besonders bevorzugte Polyadenylierungssequenzen
werden von Genen erhalten, die für
TAKA-Amylase aus Aspergillus oryzae, Glucoamylase aus Aspergillus
niger, Anthranilatsynthase aus Aspergillus nidulans und alpha-Glucosidase
aus Aspergillus niger kodieren.
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Um
die Notwendigkeit der Zerstörung
der Zelle zu vermeiden, um das heterolog exprimierte Polypeptid zu
erhalten und um die Menge des möglichen
Abbaus des exprimierten Polypeptids innerhalb der Zelle zu minimieren,
ist es bevorzugt, dass die Expression des Polypeptidgens zu einem
Produkt führt,
das nach außerhalb
der Zelle sekretiert wird. Dafür
kann das heterologe Polypeptid der vorliegenden Erfindung mit einem
Signalpeptid verknüpft
werden, das an den Aminoterminus des Polypeptids geknüpft wird.
Ein Signalpeptid ist eine Aminosäuresequenz,
die die Sekretion des heterologen Polypeptids aus dem Pilzwirt heraus
in das Kulturmedium erlaubt. Die Signalsequenz kann für das erfindungsgemäße heterologe
Polypeptid nativ sein oder kann aus fremden Quellen erhalten werden.
Das 5'-Ende der
kodierenden Sequenz der Nukleinsäuresequenz der
vorliegenden Erfindung kann inhärent
ein Signalpeptid enthalten, das die Region kodiert, die natürlicherweise
im Leserahmen mit dem Abschnitt der kodierenden Region verknüpft ist,
die das sekretierte heterologe Polypeptid kodiert. Alternativ kann
das 5'-Ende der
kodierenden Sequenz ein Signalpeptid enthalten, das die Region kodiert,
die für
den Teil der kodierenden Sequenz, die das sekretierte heterologe
Polypeptid kodiert, fremd ist. Das fremde Signalpeptid kann dort
erforderlich sein, wo die kodierende Sequenz normalerweise keine
Signalpeptid kodierende Region enthält.
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Alternativ
kann das fremde Signalpeptid einfach das natürliche Signalpeptid ersetzen,
um eine gesteigerte Sekretion des gewünschten heterologen Polypeptids
zu erhalten. Die das fremde Signalpeptid kodierende Region kann
aus einem Glucoamylase- oder einem Amylasegen aus einer An von Aspergillus,
einem Lipase- oder Proteinasegen aus Rhizomucor miehei, dem Gen
für den α-Faktor von
Saccharomyces cerevisiae oder dem Präprochymosingen des Kalbs erhalten
werden. Ein wirksames Signalpeptid für Pilzwirtszellen ist das TAKA-Amylasesignal
aus Aspergillus oryzae, das neutrale Amylasesignal aus Aspergillus
niger, das Aspartylproteinasesignal aus Rhizomucor miehei, das Cellulasesignal
aus Humicola lanuginosus oder das Lipasesignal aus Rhizomucor miehei.
Allerdings kann jedes beliebige Signalpeptid, das die Sekretion
des heterologen Polypeptids in einem Pilzwirt der Wahl erlaubt,
in der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
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Die
Nukleinsäuresequenz
der vorliegenden Erfindung kann auch an eine Propeptid kodierende
Region geknüpft
werden. Ein Propeptid ist eine Aminosäuresequenz, die am Aminoteminus
eines Propolypeptids oder Proenzyms gefunden wird. Die Spaltung
des Propeptids aus dem Propolypeptid ergibt ein reifes biochemisch aktives
Polypeptid. Das resultierende Polypeptid ist als Propolypeptid oder
Proenzym (oder in einigen Fällen als
ein Zymogen) bekannt. Propolypeptide sind im Allgemeinen inaktiv
und können
durch katalytische oder autokatalytische Spaltung des Propeptids
in reife aktive Polypeptide umgewandelt werden. Die Propeptid kodierende
Region kann zu dem heterologen Polypeptid nativ sein oder kann aus
fremden Quellen erhalten werden. Die fremde Propeptid kodierende
Region kann aus dem α-Faktorgen
von Saccharomyces cerevisiae oder dem Laccasegen von Myceliophthora
thermophila (WO 95/33836) erhalten werden.
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Die
Vorgehensweisen zur Ligation der vorstehend beschriebenen Elemente
zur Konstruktion des rekombinanten Expressionsvektors der vorliegenden
Erfindung sind dem Fachmann gut bekannt (siehe zum Beispiel Sambrook
et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Aufl., Cold Spring
Harbor, New York, 1989).
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Die
vorliegende Erfindung betrifft auch rekombinante Pilzwirtszellen,
die durch die Verfahren der vorliegenden Erfindung hergestellt werden,
die vorteilhafterweise zusammen mit dem rekombinanten Vektor der vorliegenden
Erfindung verwendet werden. Die Zelle ist vorzugsweise mit einem
Vektor transformiert, der eine erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz enthält, gefolgt
von der Integration des Vektors in das Wirtschromosom. „Transformation" bedeutet das Einführen eines
Vektors, der eine Nukleinsäuresequenz
mit mindestens einer modifizierten kryptischen Spleißstelle
enthält,
in eine Pilzwirtszelle, so dass der Vektor chromosomal integriert
wird oder als ein selbstreplizierender extrachromosomaler Vektor
erhalten bleibt. Die Integration wird im Allgemeinen als ein Vorteil
betrachtet, da die Nukleinsäuresequenz
mit höherer
Wahrscheinlichkeit stabil in der Zelle verbleibt. Die Integration
des Vektors in das Wirtschromosom kann durch homologe oder nicht
homologe Rekombination, wie vorstehend beschrieben, auftreten.
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Die
Wahl der Pilzwirtszellen wird in einem großen Ausmaß von dem Gen, das das heterologe
Polypeptid kodiert, und seiner Quelle abhängen. Die Pilzwirtszelle kann
eine Hefezelle oder eine Zelle eines filamentösen Pilzes sein.
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„Hefe", wie hierin verwendet,
schließt
Ascosporen bildende Hefe (Endomycetales), Basidiosporen bildende
Hefe und Hefe, die zu den Fungi Imperfecti (Blastomycetes) gehört, ein.
Die Ascosporen bildenden Hefen werden in die Familie Spermophthoraceae
und Saccharomycetaceae eingeteilt. Die letztgenannte umfasst vier
Unterfamilien, Schizosaccharomycoideae (zum Beispiel die Gattung
Schizosaccharomyces), Nadsonioideae, Lipomycoideae und Saccharomycoideae
(zum Beispiel die Gattungen Pichia, Kluyveromyces und Saccharomyces).
Die Basidiosporen bildenden Hefen schließen die Gattungen Leucosporidim,
Rhodosporidium, Sporidiobolus, Filobasidium und Filobasidiella ein.
Hefen, die zu den Fungi Imperfecti gehören, werden in zwei Familien
eingeteilt, Sporobolomycetaceae (zum Beispiel die Gattungen Sorobolomyces
und Bullera) und Cryptococcaceae (zum Beispiel die Gattung Candida).
Da die Klassifikation der Hefen zukünftigen Veränderungen unterliegen kann,
werden die Hefen für
die Zwecke der vorliegenden Erfindung definiert, wie beschrieben
in Biology and Activities of Yeast (Skinner, F.A., Passmore, S.M.
und Davenport, R.R., Hrsg., Soc. App. Bacteriol. Symposium, Serien-Nr.
9, 1980). Die Biologie der Hefe und die Manipulation der Hefegenetik
sind in der Technik gut bekannt (siehe zum Beispiel Biochemistry
and Genetics of Yeast, Bacil, M., Horecker, B.J. und Stopani, A.O.M.,
Hrsg., 2. Aufl., 1987; The Yeasts, Rose, A.H. und Harrison, J.S.,
Hrsg., 2. Aufl., 1987; und The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces,
Strathern et al. Hrsg., 1981).
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„Pilze", wie hierin verwendet,
schließt
die Stämme
Ascomycota, Basidiomycota, Chytridiomycota und Zygomycota (wie definiert
von Hawksworth et al., In. Ainsworth and Bisby's Dictionary of the Fungi, B. Aufl., 1995.
CAB International, University Press, Cambridge, UK) wie auch die
Oomycota (wie zitiert in Hawksworth et al., 1995, supra, S. 171)
und alle mitosporischen Pilze (Hawksworth et al., 1995, supra) ein.
Repräsentative Gruppen
der Ascomycota schließen
zum Beispiel ein Neurospora, Eupenicillium (= Penicillium), Emericella
(= Aspergillus), Eurotium (= Aspergillus) und die oben aufgeführten echten
Hefen ein. Beispiele von Basidiomycota schließen Hutpilze (engl. mushrooms),
Roste und Brände
ein. Repräsentative
Gruppen der Chytridiomycota schließen zum Beispiel Allomyces,
Blastocladiella, Coelomomyces und aquatische Pilze ein. Repräsentative
Gruppen der Oomycota schließen
zum Beispiel aquatische Pilze der Saprolegniomycetidae (Wasserschimmelpilze)
wie zum Beispiel Achlya ein. Beispiele von mitosporischen Pilzen
schließen
Aspergillus, Penicillium, Candida und Alternaria ein. Repräsentative
Gruppen der Zygomycota schließen
zum Beispiel Rhizopus und Mucor ein.
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„Filamentöse Pilze" schließen alle
filamentösen
Formen der Unterabteilung Eumycota und Oomycota (wie definiert von
Hawksworth et al., 1995, supra) ein. Die filamentösen Pilze
sind durch ein vegetatives Mycel charakterisiert, das aus Chitin,
Cellulose, Glucan, Chitosan, Mannan und anderen komplexen Polysacchariden gebildet
wird. Das vegetative Wachstum erfolgt durch Hyphenverlängerung
und der Kohlenstoffstoffwechsel ist obligatorisch aerob. Im Gegensatz
dazu erfolgt das vegetative Wachstum von Hefen wie zum Beispiel
Saccharomyces cerevisiae durch Ausknospung eines einzelligen Thallus
und der Kohlenstoffstoffwechsel kann fementativ sein.
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In
einer Ausführungsform
ist die Pilzwirtszelle eine Hefezelle. In einer bevorzugten Ausführungsform ist
die Hefewirtszelle eine Zelle der Arten von Candida, Kluyveromces,
Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Pichia und Yarrowia. In einer
bevorzugten Ausführungsform
ist die Hefewirtszelle eine Zelle von Saccharomyces cerevisiae,
eine Zelle von Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces diastaticus,
eine Zelle von Saccharomyces douglasii, eine Zelle von Saccharomyces
kluyveri, eine Zelle von Saccharomyces norbensis oder eine Zelle
von Saccharomyces oviformis. In einer anderen Ausführungsform
ist die Hefewirtszelle eine Zelle von Kluyveromyces lactis. In einer
weiteren am meisten bevorzugten Ausführungsform ist die Hefewirtszelle
eine Zelle von Yarrowia lipolytica.
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In
einer anderen Ausführungsform
ist die Pilzwirtszelle eine Zelle eines filamentösen Pilzes. In einer bevorzugten
Ausführungsform
ist die Wirtszelle des filamentösen
Pilzes – ohne
darauf beschränkt
zu sein – eine
Zelle der Arten von Acremonium, Aspergillus, Fusarium, Humicola,
Myceliophthora, Mucor, Neurospora, Penicillium, Thielavia, Tolypocladium
und Trichoderma. In einer weiter bevorzugten Ausführungsform
ist die Wirtszelle des filamentösen
Pilzes eine Zelle von Aspergillus. In einer weiteren bevorzugten
Ausführungsform ist
die Wirtszelle des filamentösen
Pilzes eine Zelle von Acremonium. In einer anderen weiter bevorzugten Ausführungsform
ist die filamentöse
Pilzwirtszelle eine Zelle von Fusarium. In einer anderen weiter
bevorzugten Ausführungsform
ist die Wirtszelle des filamentösen
Pilzes eine Zelle von Humicola. In einer weiteren stärker bevorzugten
Ausführungsform
ist die Wirtszelle des filamentösen
Pilzes eine Zelle von Myceliophthora. In einer anderen sogar noch
stärker
bevorzugten Ausführungsform
ist die Wirtszelle des filamentösen
Pilzes eine Zelle von Mucor. In einer weiteren noch stärker bevorzugten
Ausführungsform
ist die Wirtszelle des filamentösen
Pilzes eine Zelle von Neurospora. In einer weiteren noch stärker bevorzugten
Ausführungsform
ist die Wirtszelle des filamentösen
Pilzes eine Zelle von Penicillium. In einer weiteren noch stärker bevorzugten
Ausführungsform
ist die Wirtszelle des filamentösen
Pilzes eine Zelle von Thielavia. In einer weiteren noch stärker bevorzugten
Ausführungsform
ist die Wirtszelle des filamentösen
Pilzes eine Zelle von Tolypecladium. In einer anderen noch stärker bevorzugten
Ausführungsform
ist die Wirtszelle des filamentösen
Pilzes eine Zelle von Trichoderma. In einer am meisten bevorzugten
Ausführungsform
ist die Wirtszelle des filamentösen
Pilzes eine Zelle von Aspergillus oryzae, eine Zelle von Aspergillus
niger, eine Zelle von Aspergillus foetidus oder eine Zelle von Aspergillus
japonicus. In einer am meisten bevorzugten Ausführungsform ist die Wirtszelle
des filamentösen
Pilzes eine Zelle von Fusarium oxysporum oder eine Zelle von Fusarium
graminearum. In einer weiteren am meisten bevorzugten Ausführungsform
ist die Wirtszelle des filamentösen
Pilzes eine Zelle von Humicola insolens oder eine Zelle von Humicola
lanuginosus. In einer weiteren am meisten bevorzugten Ausführungsform
ist die Wirtszelle des filamentösen
Pilzes eine Zelle von Myceliophthora thermophila. In einer weiteren
am meisten bevorzugten Ausführungsform
ist die Wirtszelle des filamentösen
Pilzes eine Zelle von Mucor miehei. In einer weiteren am meisten
bevorzugten Ausführungsform
ist die Wirtszelle des filamentösen
Pilzes eine Zelle von Neurospora crassa. In einer weiteren am meisten
bevorzugten Ausführungsform
ist die Wirtszelle des filamentösen
Pilzes eine Zelle von Penicillium purpurogenum. In einer weiteren
am meisten bevorzugten Ausführungsform
ist die Wirtszelle des filamentösen
Pilzes eine Zelle von Thielavia terrestris. In einer weiteren am meisten
bevorzugten Ausführungsform
ist die Wirtszelle des filamentösen
Pilzes eine Zelle von Trichoderma, eine Zelle von Trichoderma reesei,
eine Zelle von Trichoderma viride, eine Zelle von Trichoderma longibrachiatum,
eine Zelle von Trichoderma harzianum oder eine Zelle von Trichoderma
koningii.
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Die
rekombinanten Pilzwirtszellen der vorliegenden Erfindung können eine
oder mehrere Sequenzen umfassen, die einen oder mehrere Faktoren
kodieren, die für
die Expression des heterologen Polypeptids vorteilhaft sind, zum
Beispiel einen Aktivator (z. B. einen transaktivierenden Faktor),
ein Chaperon und eine prozessierende Protease. Die Nukleinsäuren, die
einen oder mehrere dieser Faktoren kodieren, sind vorzugsweise nicht
funktionsfähig
mit der Nukleinsäuresequenz
verknüpft,
die das heterologe Polypeptid kodiert. Ein Aktivator ist ein Protein,
das die Transkription einer Nukleinsäuresequenz aktiviert, die ein
Polypeptid kodiert (Kudla et al., 1990, EMBO Journal 9: 1355-1364;
Jarai und Buxton, 1994, Current Genetics 26: 2238-244; Verdier,
1990, Yeast 6: 271-297). Die Nukleinsäuresequenz, die einen Aktivator
kodiert, kann aus den Genen erhalten werden, die kodieren für das Hämaktivatorprotein
1 (hapl) von Saccharomyces cerevisiae, das Galaktose-metabolisierende
Protein 4 (gal4) von Saccharomyces cerevisiae und das Ammoniakregulationsprotein (areA)
von Aspergillus nidulans. Für
weitere Beispiele siehe Verdier, 1990, supra, und MacKenzie et al.,
1993, Journal of General Microbiology 139: 2295-2307. Ein Chaperon
ist ein Protein, das ein anderes Polypeptid bei der richtigen Faltung
unterstützt
(Hart1 et al., 1994, TIBS 19: 20-25; Bergeron et al., 1994, TIBS
19: 124-128; Demolder et al., 1994, Journal of Biotechnology 32:
179-189; Craig, 1993, Science 260: 1902-1903; Gething und Sambrook,
1992, Nature 355: 33-45; Puig und Gilbert, 1994, Journal of Biological
Chemistry 269: 7764-7771; Wang und Tsou, 1993, The FASEB Journal
7: 1515-11157; Robinson et al., 1994, Bio/Technology 1: 381-384).
Die Nukleinsäuresequenz,
die ein Chaperon kodiert, kann aus Genen erhalten werden, die kodieren
für die
Proteindisulfidisomerase aus Aspergillus oryzae, Calnexin aus Saccharomyces
cerevisiae, BiP/GRP78 aus Saccharomyces cerevisiae und Hsp70 aus
Saccharomyces cerevisiae. Für
weitere Beispiele siehe Gething und Sambrook, 1992, supra, und Hartl
et al., 1994, supra. Eine prozessierende Protease ist eine Protease,
die ein Propeptid spaltet, um ein reifes biologisch aktives Polypeptid
zu erzeugen (Enderlin und Ogrydziak, 1994, Yeast 10: 67-79, Fuller
et al., 1989, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 86:
1434-1438; Julius et al, 1984, Cell 37: 1075-1089; Julius et al.,
1983, Cell 32: 839-852). Die Nukleinsäuresequenz, die eine prozessierende
Protease kodiert, kann aus Genen erhalten werden, die kodieren für Kex2 aus
Aspergillus niger, die Dipeptidylaminopeptidase aus Saccharomyces
cerevisiae, Kex2 aus Saccharomyces cerevisiae und der dibasischen
prozessierenden Endoprotease (xpr6) aus Yarrowia lipolytica. Jeder
beliebige Faktor, der in der Pilzwirtszelle der Wahl funktional
ist, kann in der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
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Pilzzellen
können
durch ein Verfahren transformiert werden, das Protoplastenbildung,
Transformation der Protoplasten und Regeneration der Zellwand in
einer an sich bekannten Weise einschließt. Geeignete Vorgehensweisen
zur Transformation von Aspergillus-Wirtszellen sind beschrieben in
EP 238 023 und Yelton et al.,
1984, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 81: 1470-1474.
Ein geeignetes Verfahren zum Transformieren von Arten von Fusarium
ist von Malardier et al., 1989, Gene 78: 147-156 oder in der parallelen
US-Anmeldung Seriennummer 08/269,449 beschrieben. Hefe kann unter
Verwendung von Vorgehensweisen transformiert werden, die beschrieben
sind von Becker und Guarente, In Abelson, J.N. und Simon, M.I. (Hrsg.),
Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology,
Band 194, S. 182-187, Academic Press, Inc., New York; Ito et al.,
1983, Journal of Bacteriology 153: 163; und Hinnen et al., 1978,
Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75: 1920.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft auch Verfahren zum Herstellen des
heterologen Polypeptids, die das Kultivieren der rekombinanten Pilzwirtszellen
unter Bedingungen umfassen, die der Expression des heterologen Proteins
zuträglich
sind. Die Pilzzellen der vorliegenden Erfindung werden in ein Nährmedium,
das für
die Herstellung des heterologen Polypeptids geeignet ist, unter
Verwendung bekannter Verfahren kultiviert. Zum Beispiel kann die
Zelle durch Schüttelflaschenkultivierung,
Fermentation in kleinem oder großem Maßstab (einschließlich kontinuierlichem,
Batch-, Fed-Batch- oder Festphasenfermentationen) in Labor- oder
Industriefermentern in einem geeigneten Medium und unter Bedingungen
durchgeführt
werden, die es erlauben, dass das heterologe Polypeptid exprimiert
und/oder isoliert wird, kultiviert werden. Die Kultivierung findet
in einem geeigneten Nährmedium
statt, das Kohlenstoff- und Stickstoffquellen und anorganische Salze
umfasst, wobei bekannte Vorgehensweisen verwendet werden (siehe
zum Beispiel Bennett, J.W. und LaSure, L., Hrsg., More Gene Manipulations
in Fungi, Academic Press. CA, 1991). Geeignete Medien sind von kommerziellen
Anbietern erhältlich
oder können
nach veröffentlichten
Zusammensetzungen hergestellt werden (z. B. in den Katalogen der
American Type Culture Collection). Wenn das heterologe Polypeptid
in das Nährmedium
sekretiert wird, kann das Polypeptid direkt aus dem Medium gewonnen
werden. Wenn das heterologe Polypeptid nicht sekretiert wird, wird
es aus Zelllysaten gewonnen.
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Das
exprimierte heterologe Polypeptid kann unter Verwendung von im Stand
der Technik bekannten Verfahren nachgewiesen werden, die spezifisch
für das
bestimmte Polypeptid sind. Diese Nachweisverfahren können die
Verwendung spezifischer Antikörper,
die Bildung eines Enzymprodukts oder das Verschwinden eines Enzymsubstrats
einbeziehen. Zum Beispiel kann ein Enzymtest verwendet werden, wenn
das heterologe Polypeptid enzymatische Aktivität besitzt. Alternativ können Immunoassays
unter Verwendung von Antikörpern
gegen das Polypeptid eingesetzt werden, wenn für das heterologe Polypeptid
spezifische polyklonale oder monoklonale Antikörper verfügbar sind. Die Techniken von
Enzymtests und Immunoassays sind dem Fachmann auf dem Gebiet gut
bekannt.
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Das
resultierende heterologe Polypeptid kann durch im Stand der Technik
bekannte Verfahren gewonnen werden. Zum Beispiel kann das Polypeptid
aus dem Nährmedium durch
konventionelle Vorgehensweisen gewonnen werden, einschließlich – ohne darauf
beschränkt
zu sein – Zentrifugation,
Filtration, Extraktion, Sprühtrocknung,
Evaporation oder Präzipitation.
Das gewonnene Polypeptid kann dann durch eine Vielzahl chromatographischer
Vorgehensweisen, zum Beispiel Ionenaustauschchromatographie, Gelfiltrationschromatographie,
Affinitätschromatographie
oder Ähnlichem
weiter gereinigt werden.
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Die
vorliegende Erfindung wird weiter durch die folgenden Beispiele
beschrieben, die nicht als den Schutzbereich der Erfindung beschränkend ausgelegt
werden sollten.
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Beispiele
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Beispiel 1: Oligonukleotidprimer
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Die
folgenden Oligonukleotidprimer werden mittels eines „Applied
Biosystems Model 394 DNA/RNA Synthesizer" (Applied Biosystems, Inc., Foster City,
CA) nach den Anleitungen des Herstellers synthetisiert:
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Beispiel 2: DNA-Sequenzierung
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Die
Nukleotidsequenzen werden mit einem „Applied Biosystems Model
373A Automatic DNA Sequencer" (Applied
Biosystems, Inc., Foster City, CA) auf beiden Strängen unter
Einsatz einer Taq-Polymerase-Zyklussequenzierung mit Fluoreszenz
markierten Didesoxynukleotiden (Giesecke et al., 1992, Journal of
Virol. Methods 38: 47-60) unter Verwendung des M13-Rückwärts- (-48)
und M13- (-20) -Vorwärtsprimers
(New England Biolabs, Beverly, MA) und Primern, die für die zu
sequenzierende DNA einzigartig sind, bestimmt.
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Beispiel 3: Analyse des
grün fluoreszierenden
Proteins (GFP aus Aequorea victoria)
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Die
Produktion von GFP wird unter Verwendung eines „Perkin-Elmer Cetus LS5OB"-Fluorimeters (Perkin-Elmer Corp., Norwalk,
CT) bestimmt. Genauer werden 100 Mikroliter eines Proteinextrakts
in eine Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen platziert, die wiederum
in das „Perkin-Elmer
Cetus LS5OB"-Plattenlesegerät platziert
wird. Die Extrakte werden Licht von 395 nm ausgesetzt und das Emissionsspektrum
zwischen 400 nm und 600 nm wird ausgelesen.
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Ein „Zeiss
Axioplan"-Mikroskop
(Carl Zeiss, Inc., Thornwood, NY) mit einem GFP-Filtersatz (Chroma Technology Corp.,
Brattleboro. VT) wird verwendet, um die Myzele für GFP-Fluoreszenz sichtbar
zu machen.
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Beispiel 4: Konstruktion
des Expressionsvektors pShTh34
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Ein
Expressionsvektor für
filamentöse
Pilze pShTh34 wird konstruiert, um das GFP-Strukturgen unter die Kontrolle des/der
TAKA-Amylase-Promotors, -Signalsequenz und -Terminators zu stellen.
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Die
Gesamt-RNA, die aus Aequoria victoria durch Standardverfahren (Sambrook
et al., 1989, supra) isoliert wurde, wird unter Verwendung der AMV
reversen Transkriptase (Promega, Madison, WI), wie vom Hersteller
empfohlen, in cDNA überführt. Die
cDNA wird dann unter Verwendung von PCR-Primern, die auf Grundlage
einer zuvor veröffentlichten
GFP-Sequenz hergestellt wurden (Prasher et al., 1992, Gene 111:
229-233; GenBank Zugangs-Nr. M62653), zusammen mit der UITmaTM-Polymerase (Perkin Elmer, Foster City,
CA) PCR-amplifiziert. Die Sequenzen der Primer sind als SEQ ID Nr.
18 und 19 gezeigt.
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Restriktionsendonukleaseschnittstellen
werden in den 5'-
(eine HindIII-Schnittstelle) und 3'- (EcoRI- und BamHI-Schnittstellen)
-Primer insertiert, um das Klonieren der PCR-amplifizierten GFP-cDNA in einen leicht
modifizierten pUC19-Vektor zu ermöglichen. Die Einzelheiten der
Konstruktion sind LacZ Shine-Dalgarno AGGA, unmittelbar gefolgt
von der 5'-HindIII-Schnittstelle
plus einem extra T und dem GFP-ATG-Kodon, was die folgende DNA-Sequenz
an dem LacZ-Promotor-GFP-Fusionspunkt ergibt: PLacZ-AGGAAAGCTTTATG-GFP.
Am 3'-Ende der GFP-cDNA
ist das Basenpaar, das dem Nukleotid 770 in der veröffentlichten GFP-Sequenz
entspricht, an die EcoRI-Schnittstelle der „multiple cloning site" (MCS) von pUC19
durch eine PCR-erzeugte BamHI-, EcoRI-Linkerregion, wie in 1 gezeigt,
fusioniert.
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Das
GFP-Strukturgen wird unter Verwendung von pUC19-GFP als ein Template
mit den Oligonukleotidprimern 95-448 und 95-449, die in Beispiel
1 beschrieben sind, PCR-amplifiziert. Die Amplifikationsreaktion enthält die folgenden
Bestandteile: 200 Mikromole von jeweils dATP, dCTP, dGTP und dTTP,
50 ng Template, 30 Pikomole eines jeden Primers, 1 × Taq-Polymerasepuffer
und 0,5 Einheiten Taq-Polymerase (Stratagene Cloning Systems, La
Jolla, CA). Die Reaktion wird in einem „Ericomp Thermal Cycler", der wie folgt programmiert
wurde, inkubiert: 1 Zyklus bei 94°C
für 5 Minuten;
30 Zyklen jeweils bei 94°C
für 1 Minute,
60°C für 1 Minute
und 74°C
für 1 Minute;
und 1 Zyklus bei 74°C
für 15
Minuten. Die Verwendung dieser Primer resultiert in der Hinzufügung einer
SfiI-Restriktionsschnittstelle unmittelbar stromabwärts des
ATG-Startkodons
und einer NsiI-Schnittstelle unmittelbar stromaufwärts des
Stoppkodons von GFP. Das Fragment wird unter Verwendung von Standardverfahren
der Agaroseelektrophorese isoliert. Das resultierende Fragment wird
in pMWR1 subkloniert, um pShTh34, wie in 2 gezeigt,
herzustellen.
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Beispiel 5: Transformation
von pShTh34 in filamentösen
Pilzen
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pShTh34
wird mit pPyrG (Fungal Genetics Stock Center, Kansas City, KS) in
HowB104pyrG-Protoplasten von Aspergillus oryzae co-transformiert.
Die Transformation wird mit Protoplasten bei einer Konzentration
von 2 × 107 Protoplasten pro ml durchgeführt. Einhundert μl Protoplasten
werden in 10 μg
DNA für
30 Minuten auf Eis platziert. Ein ml SPTC (40% PEG 4000, 0,8 M Sorbit,
0,05 M Tris pH 8,0, 0,05 M CaCl2) wird zugegeben
und die Protoplasten werden bei 34°C für 20 Minuten inkubiert. Die
Protoplasten werden direkt auf Platten platziert, die Minimalmedium
(pro Liter: 6 g NaNO3, 0,52 g KCl, 1,52
g KH2PO4, 1 ml Spurenmetalllösung, 1
g Glukose, 500 mg MgSO4·7 H2O,
342,3 g Saccharose und 20 g Noble Agar bei pH 6,5) enthalten. Die Spurenmetalllösung (1000X)
umfasst 22 g ZnSO4·7 H2O,
11 g H3BO3, 5 g
MnCl2·4
H2O, 5 g FeSO3·7 H2O, 1,6 g CoCl·5 H2O,
1,6 g (NH4)6Mo7O24 und 50 g Na4EDTA pro Liter. Die Platten werden 5 bis
7 Tage bei 37°C
inkubiert. Die Transformanten werden auf Platten mit demselben Medium
ohne Saccharose transferiert und 3 bis 5 Tage bei 37°C inkubiert.
Die Transformanten werden durch Ausstreichen der Sporen und Picken
isolierter Kolonien unter Verwendung der gleichen Platten unter
den gleichen Bedingungen gereinigt. Die resultierenden Transformanten
werden mit Aspergillus oryzae ShTh340 bezeichnet.
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Beispiel 6: Extraktion
von GFP
-
Die
Transformanten Aspergillus oryzae ShTh340, die in Beispiel 5 beschrieben
sind, werden auf die Gegenwart von GFP-Expression durch fluorometrische
Analyse, wie in Beispiel 3 beschrieben, gescreent. Zehn Transformanten
Aspergillus oryzae ShTh340-19 werden in Mikrotiterplatten mit 12
Vertiefungen für
1 bis 5 Tage bei 37°C
statisch in 4 ml MY51-Medium wachsen gelassen, das die folgenden
Bestandteile pro Liter enthält:
50 g Maltose, 2 g MgSO4·7 H2O,
10 g KH2PO4, 2 g
K2SO4, 2 g Zitronensäure, 10
g Hefeextrakt, 0,5 ml Spurenmetalllösung, wie in Beispiel 5 beschrieben,
1 g Harnstoff und 2 g (NH4)2SO4. Die Myzelienmatte wird geerntet, in 1,5
ml-Eppendorfgefäße überführt und
für 5 Minuten
auf Trockeneis platziert. Die Eppendorfgefäße werden dann in einer Speed-Vac® (Savant
Instruments, Inc., Farmingdale, NY) platziert und über Nacht
bei Raumtemperatur unter Vakuum getrocknet. Die getrocknete Kultur
wird unter Verwendung einer sterilen Lanzette in dem Röhrchen zerdrückt. Die
pulverförmige
Kultur wird in 400 Mikroliter 50 mM Natriumphosphat-0,5 M NaCl pH
5,5, enthaltend 1 mM PMSF und 0,1 mM Pepstatin resuspendiert. Die
myzeliale Debris wird in einer „Sorvall Microcentrifuge Model
MC12V" (DuPont Instruments,
Inc., Newtown, CT) bei maximaler Geschwindigkeit für 20 Minuten
pelletiert. Ein Volumen von 200 Mikrolitern des Überstands wird in ein neues
Eppendorfgefäß überführt und
nach der in Beispiel 3 beschriebenen Vorgehensweise getestet.
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Keiner
der Transformanten Aspergillus oryzae ShTh340-19 produziert nachweisbare
Fluoreszenz.
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Beispiel 7: mRNA-Analyse
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Die
Gesamt-DNA aus der Transformante Aspergillus oryzae ShTh340-19,
die in Beispiel 6 beschrieben ist, wird durch die Vorgehensweise
von Timberlake und Barnard (1981, Cell 26: 29-37) isoliert.
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Spezifische
GFP-cDNA wird unter Verwendung eines „3'-Race-Kits" (Bethesda Research Laboratories, Gaithersburg,
MD) nach den Anweisungen des Herstellers synthetisiert. Ein Mikrogram
Gesamt-RNA aus der Transformante wird in der Reaktion mit 3'-UAP-Oligonukleotidprimer
zusammen mit dem spezifischen 5'-Oligonukleotidprimer
95-1202, der in Beispiel 1 beschrieben ist, verwendet. Die Amplifikationsreaktion
enthält
die folgenden Bestandteile: 200 Mikromol von jeweils dATP, dCTP,
dGTP und dTTP, 1 Pikomol eines jeden Primers, 50 ng Template, 1 × Taq-Polymerasepuffer
und 0,5 Einheiten Taq-Polymerase. Die Reaktion wird in einem „Ericomp
Thermal Cycler" inkubiert,
der wie folgt programmiert wurde: Ein Zyklus bei 94°C für 5 Minuten; dreißig Zyklen
jeweils bei 94°C
für 1 Minute,
50°C für 1 Minute
und 72°C
für 1 Minute;
und ein Zyklus bei 74 °C
für 5 Minuten.
Die cDNA-Produkte werden einer verschachtelten PCR-Amplifikation
unter Verwendung von Senseoligonukleotidprimern 95-1202 oder 95-88
in Kombination mit entweder Antisenseprimer 95-89 oder 95-656, die
in Beispiel 1 beschrieben sind, unterzogen. Die PCR-Bedingungen
sind die gleichen, wie vorstehend beschrieben. Die PCR-Produkte
werden in pCRII unter Verwendung des „TA Cloning Kits" nach den Anweisungen
des Herstellers kloniert. Die Transformanten werden dann durch Extrahieren
der Plasmid-DNA aus den Transformanten unter Verwendung eines „QIAwell-8
Plasmid Kits" (Qiagen,
Chatsworth, CA) nach den Anweisungen des Herstellers und Sequenzieren
des Plasmidinserts nach dem in Beispiel 2 beschriebenen Verfahren
gescreent.
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Beispiel 8: Identifikation
kryptischer Introns
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Die
sequenzierten Subklone, die in Beispiel 7 beschrieben sind, fallen
in drei Gruppen und sind in Tabelle 1, wie nachfolgend gezeigt,
aufgeführt
(
3, SEQ ID Nr. 20). Die erste Gruppe enthält innerhalb
der GFP-kodierenden Sequenz zwei Deletionen, die mit Fragment A
und Fragment D bezeichnet sind. Fragment A beginnt bei Nukleotid
347 mit der Sequenz GTG (ATG-Nukleotide entsprechend 1, 2, 3 in
der GFP-kodierenden Sequenz) und endet bei Nukleotid 397 mit AAG;
Fragment D beginnt bei Nukleotid 448 mit der Sequenz GTA und endet
bei Nukleotid 503 mit TAG. Die zweite Gruppe enthält eine
einzelne Deletion, bezeichnet mit Fragment B. Fragment B beginnt
bei Nukleotid 380 mit der Sequenz GTA und endet bei Nukleotid 463
mit der Sequenz CAG. Die dritte Gruppe enthält ebenfalls eine einzelne
Deletion, bezeichnet mit Fragment C. Fragment C beginnt bei Nukleotid
380 mit GTA und endet bei Nukleotid 503 mit TAG. Diese deletierten
Fragmentsequenzen, die von den vorstehend aufgeführten Nukleotiden flankiert werden,
entsprechen den Kriterien, um als Intron eines filamentösen Pilzes
mit dem erwarteten Konsensus 5'-
und 3'-Spleißstellen
erkannt zu werden, und sind wahrscheinlich kryptische Introns, die
fälschlicherweise
aus der GFP-mRNA in Aspergillus oryzae gespleißt wurden. Tabelle
2: Verteilung der kryptischen Introns
| Intron | Nummer |
| A&D | 15 |
| B | 1 |
| C | 5 |
| D | 3 |
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Beispiel 9: Konstruktion
des Expressionsvektors pShTh49
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Um
das GFP-Gen in einem Aspergillus-Wirt zu exprimieren, werden die
identifizierten putativen kryptischen Spleißstellen modifiziert. pShTh49,
ein E. coli-Expressionsvektor, wird konstruiert, um das korrigierte GFP-Gen
zu umfassen. Genauer wird das 5'-Ende
des GFP-Gens aus pUC19-GFP unter Verwendung der gleichen Bedingungen,
die in Beispiel 4 beschrieben sind, mit den Oligonukleotidprimern
95-1422 und 95-1457, die in Beispiel 1 beschrieben sind, amplifiziert.
Die Verwendung dieser Primer führt
eine XhoI-Schnittstelle 323 bp stromabwärts des ATG-Startkodons ein.
Das Fragment wird unter Verwendung von Standardverfahren der Agaroseelektrophorese
isoliert und dann in pCRII unter Verwendung des „TA Cloning Kits" (Invitrogen Corp.,
La Jolla, CA) nach den Anweisungen des Herstellers subkloniert,
um pShTh46 herzustellen. Das 3'-Ende
des GFP-Gens wird aus pUC19-GFP unter den gleichen Bedingungen,
die in Beispiel 4 beschrieben sind, mit den Oligonukleotidprimern
95-1464 und 95-1458, die in Beispiel 1 beschrieben sind, amplifiziert,
um eine PvuI-Schnittstelle stromaufwärts zu Stoppkodons einzuführen. Das
PCR-Produkt wird dann in pCRII unter Verwendung des „TA Cloning
Kits" nach den Anweisungen
des Herstellers kloniert, um pShTh47 herzustellen. Die verbleibende
interne kodierende Sequenz von den Basen 323 bis 565, die für die Konstruktion
benötigt wird,
wird mit einem „Applied
Biosystems Model 394 DNA/RNA Synthesizer" nach den Anweisungen des Herstellers
(Applied Biosystems, Foster City, CA) unter Verwendung einer Kodonverwendungskarte
für Aspergillus (siehe
Tabelle 1, supra) synthetisiert. Drei 84 Basen lange Oligonukleotidfragmente
und ein einzelnes 50 Basen langes Oligonukleotidfragment werden
synthetisiert (95-1411, 95-1412, 95-1413 und 95-1414), zusammen annealt
und mit T4-DNA-Polymerasen (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN)
doppelsträngig
gemacht. Das resultierende Fragment wird durch PCR unter Verwendung
der gleichen Bedingungen, die in Beispiel 4 beschrieben sind, mit
den Oligomeren 95-1414 und 95-1415, die in Beispiel 1 beschrieben
sind, amplifiziert. Das amplifizierte Fragment wird dann unter Verwendung
von Standardverfahren der Agaroseelektrophorese isoliert und dann
in pCRII unter Verwendung des „TA
Cloning Kits" nach
den Anweisungen des Herstellers kloniert, um pShTh45 herzustellen.
Die GFP-Fragmente
aus pShTh45, pShTh46 und pShTh47 werden zusammengefügt und das
synthetische Allel von GFP, gfp49, in ein pUC19-Derivat eingeführt, das
die lacZ-Shine-Delgarno-Sequenz,
gefolgt von HindIII-, BamHI-, EcoRI-Schnittstellen enthält, um pShTh49
herzustellen (4).
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Folglich
werden Veränderungen
an jeder der 5'-
und 3'-Spleißstellen
durchgeführt,
die in den identifizierten kryptischen Introns beobachtet wurden.
Zusätzlich
wird der G+C-Gehalt über
die gesamte Länge
des gewünschten
Fragments erhöht,
wo immer es an den Kodon-Wobble-Positionen
möglich
ist. Insgesamt wird der G+C-Gehalt des Gens von 38,5% auf 44,5%
erhöht
(innerhalb des synthetisch entwickelten Fragments steigt er von
33,3% auf 51%).
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Beispiel 10: Transformation
von pShTh49
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pShTh49
wird in E. coli DHSα (Bethesda
Research Laboratories, Gaithersburg, MD) nach den Anweisungen des
Herstellers transformiert und die Transformanten werden unter einem
Fluoreszenzmikroskop, wie in Beispiel 3 beschrieben, beobachtet.
Die Transformanten werden bei 37°C
unter Schütteln
in 5 ml Luria-Bertani-Medium, das mit Isopropyl-β-D-thiolgalactopyranosid (IPTG)
supplementiert ist, wachsen gelassen. Nach 14 Stunden der Induktion
von gfp49 mit IPTG werden fluoreszierende E. coli mit einem Zeiss-Mikroskop,
wie in Beispiel 5 beschrieben, beobachtet, was zeigt, dass gfp49
ein funktionierendes Protein ist, das unter den gleichen Bedingungen
wie authentisches GFP zur Fluoreszenz in der Lage ist.
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Beispiel 11: Konstruktion
des Expressionsvektors pShTh58.1
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pShTh58.1,
ein Expressionsvektor eines filamentösen Pilzes, wird zuerst durch
Amplifizieren eines Fragments aus pShTh49 unter Verwendung der gleichen
Bedingungen, die in Beispiel 4 beschrieben sind, mit den Primern
96-67 und 96-68, die in Beispiel 1 beschrieben sind, konstruiert.
Das Fragment wird unter Standardverfahren der Agaroseelektrophorese
isoliert. Das resultierende GFP-kodierende Fragment enthält einzigartige
SwaI- und PacI-Restriktionsschnittstellen an dem 5'- bzw. 3'-Ende. Dieses Fragment
wird dann mit SwaI und PacI verdaut, unter Verwendung von Standardverfahren
der Agaroseelektrophorese isoliert und in pBANel3-Vektor-DNA ligiert,
um pShTh58.1 herzustellen (5).
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Beispiel
12: Transformation von pShTh58.1 pShTh58.1 wird in Aspergillus oryzae
HowB425 unter Verwendung des gleichen Protokolls, das in Beispiel
5 beschrieben ist, transformiert. Die resultierenden Transformanten
werden als pShTh58.1-Stämme
bezeichnet.
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Beispiel 13: Expression
von gfp49
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Fünf ShTh581-Transformanten
werden in MY51-Medium enthaltenden Mikrotiterplatten, wie in Beispiel
6 beschrieben, wachsen gelassen, um den TAKA-Promotor für GFP-Produktion zu induzieren.
Die Myzelien werden an Tag 3 und Tag 4 gesammelt. Das intrazelluläre Protein
aus den Myzelien wird dann, wie in Beispiel 4 beschrieben, isoliert
und auf die Gegenwart von GFP, wie in Beispiel 3 beschrieben, analysiert.
Vier der 5 getesteten Transformanten emittierten einen Lichtpeak
bei 509 nm, der dem von GFP entsprach, wenn sie mit Licht von 395
nm angeregt wurden (6). Diese Ergebnisse zeigen,
dass die Korrekturen in der mRNA von gfp49 in der korrekten Expression
von GFP in Aspergillus oryzae resultieren, was die Herstellung von
fluoreszierendem GFP ermöglicht.
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Beispiel 14: Konstruktion
des Expressionsvektors pShTh58.2
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Der
Pilzexpressionsvektor pShTh58.2 wird durch Behandeln von pShTh58.1
mit dem „Morph
Mutagenesis Kit" (5-Prime
3-Prime, Boulder, CO) konstruiert. Der Primer 96-83 wird mit 14
ng pShTh58.1 nach den Anweisungen des Herstellers kombiniert, um
pShTh58.2 herzustellen, was eine W57C-Mutation bewirkt (7).
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Beispiel 15: Expression
von gfp58.2
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Eine
ShTh58.2-Transformante wird in einer MY51-Medium enthaltenden Mikrotiterplatte,
wie in Beispiel 4 beschrieben, wachsen gelassen. Die Myzelien werden
an Tag 3 und Tag 4 gesammelt. Das intrazelluläre Protein aus den Myzelien
wird dann, wie in Beispiel 4 beschrieben, isoliert und auf die Gegenwart
von GFP, wie in Beispiel 6 beschrieben, analysiert. Von der Transformanten
wird gefunden, dass sie ein Material herstellt, das eine Spitzenfluoreszenz
bei 509 nm entsprechend der von GFP emittiert, wenn sie mit Licht
von 395 nm angeregt wird (8). Diese
Ergebnisse zeigen, dass die Korrekturen der mRNA von gfp49 in der
korrekten Expression von GFP in Aspergillus oryzae resultieren,
was die Produktion von GFP ermöglicht.
-
Beispiel 16: Southern
Analyse von GFP-Transformanten
-
Sporen
der Transformanten ShTh582.1 (GFP mit Veränderung von kryptischem Intron
und GC-Gehalt) und ShTh581.1 (GFP mit Veränderung von kryptischem Intron
und GC-Gehalts und einer W57C-Mutation) wie auch ShTh590.1 (Wildtyp-GFP)
und BANel30.1 (pBANel3 ohne GFP) als Kontrollen werden in YEG-Medium über Nacht
bei 37°C
wachsen gelassen. Die Myzelien werden durch Miracloth filtriert
und dreimal mit destilliertem Wasser gespült. Das zusätzliche Wasser wird ausgequetscht.
Die Myzelien werden in flüssigem
Stickstoff gefroren und unter Verwendung von Mörser und Pistill zu feinem
Pulver gemahlen. Der „Purgene
DNA Isolation Kit" (Gentra
Systems Inc., Research Triangle Park, NC) wird verwendet, um genomische
DNA zu isolieren.
-
Zwei
Mikrogramm genomischer DNA jeder Probe werden mit PmeI verdaut und
auf 1% Agarosegel größenfraktioniert.
Das Gel wird denaturiert, neutralisiert und in 20X SSC für 10 Minuten
bei jedem Schritt eingeweicht. Die verdaute DNA wird für 3 Stunden
auf Nitrocellulosemembran unter Verwendung eines Schleicher & Schuell „TurboBlotters" übertragen und DNA mit UV und
Stratalinker fixiert. Das „Boehringer
Mannheim Genius System" (Boehringer
Mannheim, Indianapolis, IN) wird verwendet, um die Membranen mit
einer Sonde in Kontakt zu bringen. Die Membran wird unter Verwendung
von Easy Hyb (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) bei 42°C für eine Stunde
vorhybridisiert. Die GFP-Sonde wird unter Verwendung von pShTh58.2-DNA, den
Oligonukleotiden 96-67
und 96-68 und dem Boehringer Mannheim Dig DNA Markierungsmix (Boehringer Mannheim,
Indianapolis, IN) DIG-markiert. Die Sonde wird quantifiziert und
nach ihrer Denaturierung mit 1 ng/ml zugefügt. Die Membran wird dann über Nacht
mit Sonde behandelt. Diese Sonde wird dekantiert und die Membran
zweimal für
5 Minuten in 2X SSC-0,1% SDS bei Raumtemperatur und zweimal für 15 Minuten
in 0,1X SSC-0,1% SDS bei 65°C
gewaschen. Der Nachweis der Dig-markierten Nukleotide wird unter
Verwendung von Lumi-Phos 530 durchgeführt, indem man dem Protokoll
folgt, das von Boehringer Mannheim zur Verfügung gestellt wird (Boehringer
Mannheim, Indianapolis, IN). Die Membranen werden für 20 Minuten
einem Film ausgesetzt.
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Die
Ergebnisse zeigen, dass GFP-Banden in den Transformanten ShTh582.1,
ShTh581.1 und ShTh590.1 beobachtet werden, wohingegen keine GFP-Banden
in der BANe130.1-Transformante
beobachtet werden.
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Hinterlegung
von Mikroorganismen
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Die
folgenden Stämme
werden nach dem Budapester Vertrag in der „Agricultural Research Service Patent
Culture Collection" (NRRL),
Northern Regional Research Laboratory, 1815 University Street, Peoria,
Illinois 61604, USA, hinterlegt.
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Der
Stamm wurde unter Bedingungen hinterlegt, die sicherstellen, dass
der Zugang zur Kultur über
die Dauer der Anhängigkeit
dieser Patentanmeldung jemandem verfügbar ist, der von dem „Commissioner
of Patents and Trademarks" als
nach 37 C.F.R. § 1.14
und 35 U.S.C. § 122
berechtigt bestimmt wurde. Die Hinterlegung stellt eine im Wesentlichen
reine Kultur jedes hinterlegten Stamms dar. Die Hinterlegung ist
wie von ausländischen
Patentgesetzen gefordert, in den Ländern zugänglich, in denen Parallelanmeldungen
der vorliegenden Anmeldung oder ihre Nachkommen eingereicht wurden.
Allerdings sollte verstanden werden, dass die Zugänglichkeit
zu einer Hinterlegung nicht eine Lizenz zur Ausübung des Gegenstands der Erfindung
zur Schmälerung
der Patentrechte, die durch eine staatliche Handlung verliehen wurden,
darstellt.
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Die
hierin beschriebene und beanspruchte Erfindung wird nicht in ihrem
Umfang durch die spezifischen Ausführungsformen, die hierin offenbart
sind, beschränkt,
da diese Ausführungsformen
zur Veranschaulichung einzelner Aspekte der Erfindung beabsichtigt
sind. Jegwelche äquivalente
Ausführungsformen
sind auch als im Schutzumfang dieser Erfindung beabsichtigt. In
der Tat werden viele Modifikationen der Erfindung, zusätzlich zu
jenen hierin Gezeigten und Beschriebenen, dem Fachmann in dem Gebiet
aus der vorangegangenen Beschreibung offensichtlich werden. Von
solchen Modifikationen ist auch beabsichtigt, dass sie in den Umfang
der angefügten
Ansprüche
fallen.
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Verschiedene
Literaturstellen sind hierin zitiert, deren Offenbarung durch Bezugnahme
in ihrer Gesamtheit aufgenommen wird. SEQUENZPROTOKOLL
