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GEBIET DER
ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung betrifft neue Pilzwirtszellen und Verfahren
zur Herstellung von Proteinen. Insbesondere betrifft die Erfindung
eine Wirtszelle, die zur Expression von heterologen Proteinen nützlich ist, wobei
die Wirtszelle derart genetisch modifiziert wurde, dass deutlich
reduzierte Gehalte an alkalischer Proteaseaktivität exprimiert
werden. Darüber
hinaus betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von
Proteinen von Interesse in hohen Ausbeuten und unter Verwendung
der Pilze der Erfindung, wobei das Verfahren das Züchten der
Wirtszelle in einem geeigneten Wachstumsmedium, gefolgt von der
Gewinnung des gewünschten
Proteins umfasst. Die Erfindung umfasst auch Verfahren zur Herstellung
derartiger Pilze und DNA-Konstrukte zur Verwendung in diesen Verfahren.
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HINTERGRUND
DER ERFINDUNG
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Pilze
und insbesondere Fadenpilze werden allgemein kommerziell als Wirtszellen
zur Expression von Proteinen verwendet, die extrazellulär sekretiert
werden. Insbesondere weisen Spezies, die zur Gattung Aspergillus
gehören,
eine lange Geschichte der kommerziellen Verwendung zur Herstellung
von endogenen und später
auch heterologen Proteinen auf.
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Ein
Nachteil der häufig
mit als Wirtszellen verwendeten Mikroorganismen anzutreffen ist,
ist die Eigenproduktion und -sekretion von hohen Gehalten an proteolytischen
Enzymen, die auf Grund der Proteolyse zu reduzierten Ausbeuten eines
Proteinprodukts von Interesse führen
können.
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Verschiedene
Lösungen,
dies zu umgehen, wurden ins Auge gefasst. Zum Beispiel könnte man
die verschiedene endogene Proteasen kodierenden Gene deletieren
oder zerstören.
WO 90/00192 (Genencor Inc.) beschreibt mutante Fadenpilzwirte, die
dazu unfähig
gemacht wurden, aktive Aspartamprotease enzymatisch zu sekretieren.
Durch eine derartige Mutation zeigte es sich, dass die Ausbeute
des heterologen Polypeptids Rinder-Chymosin erhöht war.
EP 574 347 (Ciba Geigy AG) beschreibt
einen Aspergillus-Wirt, welchem eine Serinprotease vom Subtilisin-Typ
fehlt.
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Jedoch
ist es bekannt, dass Pilze zusätzlich
zu den beiden hier erwähnten
eine große
Anzahl an Proteasen herstellen. Demzufolge werden immer noch keine
Stämme
von Fadenpilzen, die keine oder sehr niedrige Gehalte an von anderen
Proteasen stammender proteolytischer Aktivität benötigen.
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ZUSAMMENFASSUNG
DER ERFINDUNG
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Es
ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Wirtszellen von Aspergillus
oryzae (A. oryzae) zur Herstellung von heterologen Polypeptidprodukten
bereitzustellen, wobei die Zelle derart genetisch modifiziert wurde,
dass im Vergleich mit der Ausgangszelle deutlich reduzierte Gehalte
an endogener alkalischer Protease exprimiert werden.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft einen derartigen A. oryzae, wobei
die Transkription und/oder Translation mindestens eines eine alkalische
Proteaseaktivität
kodierenden Gens vollständig
oder teilweise gehemmt wurde.
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Erfindungsgemäß kann dieses
Verfahren durch die Verwendung von rekombinanter DNA-Technologie erzielt
werden, wobei alkalische Proteaseaktivität des fraglichen Pilzes kodierende
Gensequenzen deletiert oder mutiert werden, was zu reduzierten Graden
an Proteaseexpression oder Expression einer Protease mit reduzierten
Aktivitätsgehalten
führt.
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In
einer spezifischen Ausführungsform
ist das alkalische Proteasegen das alp-Gen, das in SEQ ID NR. 1
und von Murakami, K., et al., 1991, Agric. Biol. Chem. 55: 2807–2811 beschrieben
ist.
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Des
Weiteren betrifft die Erfindung Verfahren zur Herstellung derartiger
Pilze; wobei die Inaktivierung des (der) alkalischen Gens (Gene)
durch Nukleotidsubstitution, -deletion oder -einfügung in
das alkalische Proteasegen erhalten wird.
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Die
Erfindung betrifft auch Verfahren zur Herstellung von heterologen
Polypeptiden unter Verwendung von Pilzwirtszellen der Erfindung.
Insbesondere erwogen sind sekretierte Polypeptide, wobei eine Pilzwirtszelle,
die mit einem DNA-Konstrukt modifiziert und wahlweise transformiert
wurde, das mindestens eine das Polypeptid oder Genprodukt von Interesse
kodierende DNA-Sequenz umfasst, in einem geeigneten Wachstumsmedium
unter geeigneten Bedingungen gezüchtet
und das gewünschte
Genprodukt gewonnen und gereinigt wird.
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Durch
die hier beschriebenen Verfahren wurde gefunden, dass die Ausbeute
an durch Pilze der Erfindung sekretierten Polypeptiden größtenteils
verbessert ist.
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KURZE BESCHREIBUNG
DER FIGUREN
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Die
Erfindung wird des Weiteren in der Patentschrift detailliert in
Bezug auf die Beispiele und die folgenden Figuren beschrieben, wobei:
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1 den
Schritt zeigt, der an der Konstruktion von HowB101 beteiligt ist,
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2 den
Schritt zeigt, der an der Konstruktion von pJaL212 beteiligt ist,
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3 den
Schritt zeigt, der an der Konstruktion von pJaL125 von A. oryzae
beteiligt ist (alp deletiert),
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4 pSX320
zeigt und
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5 die
Herstellung einer Endoglucanase mit 45 kD in einem Wirtstamm der
Erfindung (A. oryzae JaL125) zeigt, wobei alp im Vergleich mit einem
entsprechenden Stamm von A. oryzae, in welchem alp nicht deletiert
wurde, deletiert wurde.
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DEFINITIONEN
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In
der vorliegenden Patentschrift werden die folgenden Definitionen
verwendet:
alpΔ bedeutet
einen Stamm, in welchem das alp-Gen deletiert ist.
alp– bedeutet
einen Stamm, der kein funktionelles alp-Polypeptid, d.h. ein alp-Polypeptid ohne proteolytische Aktivität herstellt.
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Der
Begriff „funktionelles
Analogon" soll wie
hier in Bezug auf die in SEQ ID NR. 1 dargestellte alp-Sequenz eine
DNA-Sequenz anzeigen, die eine alkalische Protease kodiert, die
zu der in SEQ ID NR. 1 dargestellten DNA-Sequenz unter bestimmten
spezifizierten Bedingungen, die detailliert nachstehend beschrieben sind,
hybridisiert und einen Homologiegrad von mindestens 70% aufweist.
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Geeignete
Bedingungen zum Bestimmen der Hybridisierung zwischen einer Nukleotidsonde
und einer homologen DNA- oder RNA-Sequenz beinhaltet das Voreintauchen
des die DNA-Fragmente oder RNA zum Hybridisieren enthaltenden Filters
in 5x SSC (standardmäßiges Kochsalzcitrat)
für eine
Dauer von 10 Minuten und Vorhybridisierung des Filters in einer
Lösung
von 5x SSC (Sambrook et al. 1989), 5x Denhardt-Lösung (Sambrook et al., ebd.),
0.5% SDS und 100 μg/ml
denaturierter beschallter Lachssperma-DNA (Sambrook et al., ebd.),
gefolgt von Hybridisierung in derselben Lösung, enthaltend eine statistischprimierte 32P-dCTP-markierte (spezifische Aktivität > 1 × 109 cpm/μg) Sonde
für eine
Dauer von 12 Stunden bei ca. 45°C
(Feinberg, A. P. und Vogelstein, B. 1983 Anal. Biochem. 132: 6–13). Der
Filter wird dann zweimal für
eine Dauer von 30 Minuten in 2x SSC, 0.5% SDS bei vorzugsweise nicht
höher als
50°C, stärker bevorzugt
nicht höher
als 55°C, stärker bevorzugt
nicht höher
als 60°C,
stärker
bevorzugt nicht höher
als 65°C,
noch stärker
bevorzugt nicht höher
als 70°C,
insbesondere nicht höher
als 75°C
gewaschen.
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Moleküle, an welche
die Oligonukleotidsonde unter diesen Bedingungen hybridisiert, werden
unter Verwendung eines Röntgenfilms
nachgewiesen.
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Die
DAN-Sequenzhomologie, auf welche vorstehend Bezug genommen wurde,
wird als der Identitätsgrad
zwischen den beiden Sequenzen, der eine Abweichung der ersten Sequenz
von der zweiten anzeigt, bestimmt. Die Homologie kann durch auf
dem Fachgebiet bekannte Computerprogramme wie GAP, bereitgestellt im
GCG-Programmpaket (Needleman, S.B. und Wunsch, C.D. 1970, Journal
of Molecular Biology 48: 443–453),
geeignet bestimmt werden. Unter Verwendung von GAP mit den folgenden
Einstellungen für
den DNA-Sequenzvergleich: GAP-Bildungsstrafe
5,0 und GAP-Verlängerungsstrafe
0,3, zeigt die kodierende Region der DNA-Sequenz einen Identitätsgrad von
vorzugsweise mindestens 70%, stärker
bevorzugt mindestens 80%, stärker
bevorzugt mindestens 90%, stärker
bevorzugt mindestens 95%, stärker
bevorzugt mindestens 97% mit dem das Enzym X kodierenden Teil der
in SEQ ID NR. 1 dargestellten DNA-Sequenz.
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DETAILLIERTE
BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung betrifft in ihrem ersten Aspekt einen A. oryzae,
der zur Herstellung von heterologen Peptiden nützlich ist, die durch rekombinante
DNA-Technologie
derart modifiziert wurden, dass eine oder mehrere endogene alkalische
Proteaseaktivitäten
vollständig
oder teilweise inaktiviert wurden.
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Genetische Modifikationen
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Der
A. oryzae der Erfindung kann unter Verwendung von Standardtechniken
der dem Fachmann bekannten rekombinanten DNA-Technologie modifiziert
werden. Die für
die Herstellung von alkalischen Proteasen verantwortliche Gensequenz
kann teilweise inaktiviert oder vollständig eliminiert werden.
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Mit
anderen Worten exprimiert der A. oryzae der vorliegenden Erfindung
eine alkalische Proteaseaktivität
mit reduzierten Gehalten oder exprimiert überhaupt keine alkalische Proteaseaktivität oder exprimiert
(eine) enzymatisch inaktive alkalische Protease(n). In einem Aspekt
der Erfindung kann eine derartige Inaktivierung oder können reduzierte
Gehalte an alkalischer Proteaseaktivität durch Nukleotiddeletion,
-einfigung oder -substitution in einer) ein alkalisches Proteasegenprodukt
kodierende(n) Sequenz erzielt werden.
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In
einer besonderen Ausführungsform
wird die Inaktivierung durch Modifikation der Struktursequenz oder
regulatorischen Sequenz, die die fragliche(n) alkalische(n) Protease(n)
kodiert (kodieren), z.B. durch Stören der Regulation der die
Expression des alkalischen Proteasegens regulierenden Expressionssignale
erhalten.
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Bekannte
und nützliche
Techniken schließen
spezifische oder zufällige
Mutagenese, PCR-gebildete Mutagenese, ortsspezifische DNA-Deletion,
-einfügung
und/oder -substitution, Genzerstörungs-
oder Genersatztechniken, Anti-Sense-Techniken oder eine beliebige
Kombination davon ein, sind jedoch nicht darauf beschränkt.
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Eine
Mutagenese kann unter Verwendung eines geeigneten physikalischen
oder chemischen Mutagenisierungsmittels durchgeführt werden. Beispiele für ein physikalisches
oder chemisches Mutagenisierungsmittel, das für den vorliegenden Zweck geeignet
ist, schließt
Ultraviolett(UV)-Strahlung, Hydroxylamin, N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin
(MNNG), O-Methylhydroxylamin, salpetrige Säure, Ethylmethansulfonat (EMS), Natriumbisulfit,
Ameisensäure
und Nukleotidanaloga ein. Werden derartige Mittel verwendet, wird
die Mutagenese typischerweise durch In kubieren der Zelle zum Mutagenisieren
in Gegenwart des Mutagenisierungsmittels der Wahl unter geeigneten
Bedingungen zum Stattfinden der Mutagenese und Selektieren auf mutierte Zellen,
die deutlich reduzierte Gehalte an alkalischer (alkalischen) Protease(n)
herstellen, durchgeführt.
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Eine
Modifikation, die zur Inaktivierung oder zu einer reduzierten alkalischen
Proteaseaktivität
führt, kann
auch durch das Einbringen, die Substitution oder die Entfernung
von einem oder mehreren Nukleotid(en) in der/die alkalische Protease
kodierende/n Sequenz oder eines regulatorischen Elements, das zur
Transkription oder Translation davon nötig ist, erzielt werden. Nukleotide
können
z.B. derart eingefügt
oder deletiert werden, dass die Einbringung eines Stoppcodons, die
Entfernung eines Startcodons oder die Änderung des offenen Leserahmens
erhalten wird. Die Modifikation oder Inaktivierung der Struktursequenz
oder eines regulatorischen Elements kann durch ortsgerichtete Mutagenese
oder PCR-gebildete Mutagenese gemäß auf dem Fachgebiet bekannte
Verfahren erzielt werden. Obwohl die Modifikation prinzipiell in
vivo, d.h. direkt an der das alkalische Proteasegen tragenden Zelle
durchgeführt
werden kann, ist es gegenwärtig
bevorzugt, dass die Modifikation in vitro durchgeführt wird.
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Ein
günstiges
Verfahren zum Inaktivieren oder reduzieren der alkalischen Proteaseherstellung
einer Pilzwirtszelle der Wahl basiert auf den Prinzipien der Genzerstörung. Dieses
Verfahren beinhaltet die Verwendung einer DNA-Sequenz, die das endogene
Gen oder Genfragment, auf welches zum Mutieren gezielt wird, kodiert.
Die DNA-Sequenz wird in vitro mutiert, was zu einem defekten Gen
führt,
das dann in den Pilz transformiert wird. Durch homologe Rekombination
ersetzt das defekte Gen das endogene Gen oder Genfragment. Es kann
erwünscht
sein, eine genetische Markierung einzuschließen, die zur Selektion von
Transformanten von Interesse zu verwenden ist.
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Verfahren
zur Gendeletion oder -zerstörung
sind spezifisch in Miller et al., 1985, Mol. Cell. Biol. 5: 1714–1721; WO
90/00192 (Genencor); May G., 1992, Applied Molecular Genetics of
Filamentous Fungi Seite 1–25,
J.R. Kinghorn und G. Turner, Hrgb., Blackie Academic und Professional;
und in G. Turner, 1994, Vectors for genetic manipulation, Seite
641–665,
S.D. Martinelli und J.R. Kinghorn, Hrgb., Elsevier beschrieben.
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In
einer anderen Ausführungsform
kann die Modifikation und/oder Inaktivierung der DNA-Sequenz durch
die Verwendung von etablierten Anti-Sense-Techniken unter Verwendung
einer Nukleotidsequenz, die zu der die alkalische Protease kodierenden
Sequenz, z.B. der in SEQ ID NR. 1 dargestellten alp-Gennukleotidsequenz
oder einem funktionellen Analogon davon komplementär ist, durchgeführt werden.
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Die
Anti-Sense-Technologie und ihr Einsatz sind detailliert in US-Patent
Nr. 5,190,931 (University of New York) beschrieben.
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Infolge
der vorstehend erwähnten
genetischen Modifikation exprimieren die Pilze der Erfindung deutlich
reduzierte Gehalte an alkalischer Proteaseaktivität. In einer
bevorzugten Ausführungsform
wird der Gehalt an alkalischer Proteaseaktivität um mehr als etwa 50%, vorzugsweise
mehr als etwa 85%, stärker
bevorzugt mehr als etwa 90%, besonders bevorzugt mehr als etwa 95%
reduziert. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist die Wirtszelle
im Wesentlichen frei von nachweisbarer alkalischer Proteaseaktivität.
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Die
Pilze der Erfindung weisen das alkalische Proteasegen auf, das mit
einer Selektionsmarkierung wie dem pyrG-Gen, argB-Gen, sC-Gen oder
dem hph-Gen, ersetzt ist.
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In
einer spezifischen Ausführungsform
der Erfindung umfasst das alkalische Proteasegen die in SEQ ID NR.
1 dargestellte alp-Gensequenz oder ein funktionelles Analogon davon.
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alp
ist eine Serinprotease mit maximaler enzymatischer Aktivität im neutralen
bis alkalischen pH-Bereich. Wie aus der Nukleotidsequenz gefolgert,
ist das reife alp-Protein
eine Serinprotease vom Subtilisintyp, die aus 282 Aminosäuren und
einer Präpro-Region
von 121 Aminosäuren
in der Nähe
des N-Terminals besteht. Ein Vergleich der Aminosäuresequenz
zwischen alp und anderen Serinproteasen vom Subtilisintyp legt nahe,
dass drei Reste in alp (Asp41, His72 und Ser228) die katalytische
Stelle bilden. Dass Ser228 Teil der katalytischen Stelle ist, wird
durch den Verlust an proteolytischer Aktivität unterstützt, der beobachtet wird, wenn
Ser282 mit einem Alaninrest ersetzt wird (Tatsumi et al., 1991,
Agri. Biol. Chem. 55: 3099–3101).
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Der Wirtspilz
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Erfindungsgemäß ist der
Pilz Aspergillus oryzae.
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Normalerweise
wird der Pilz der Erfindung transformiert, um den Pilz dazu zu befähigen, dass
gewünschte
Proteinprodukt herzustellen.
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Verfahren
zum Transformieren von Pilzen sind auf dem Fachgebiet bekannt, vgl.
z.B.
EP 0 184 438 A2 (Gist-Brocades
N.V.) und die EP-Anmeldung NR. 87103806 (Novo Nordisk A/S).
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Sind
die Genprodukte von Interesse für
die Wirtszelle indigen, ist eine Transformation nicht nötig, jedoch
kann es zum Erhöhen
der Produktion vorteilhaft sein, mehrere Kopien des das Protein
von Interesse kodierenden Gens in die Pilze der Erfindung einzubringen.
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Verfahren zur Herstellung
des Wirtspilzes
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Ein
anderer Aspekt der Erfindung umfasst ein Verfahren zur Herstellung
des Pilzes des ersten Aspekts der Erfindung, wobei die Inaktivierung
des alkalischen Proteasegens durch die folgenden Schritte erhalten wird:
- i) Klonen von Homologen des alkalischen Proteasegens
von einer Pilzwirtszelle,
- ii) Herstellen eines das alkalische Proteasegen umfassenden
DNA-Konstrukts,
wobei ein Teil einer inneren Sequenz durch Nukleotidsubstitution,
-deletion oder -einfügung
modifiziert wurde,
- iii) Transformieren des Pilzes mit dem DNA-Kosntrukt und
- iv) Isolieren der Transformanten, die
1) keine bestimmbare
alkalische Proteaseaktivität,
2)
einen reduzierten Gehalt an alkalischer Proteaseaktivität oder
3)
(eine) alkalische inaktive Protease(n)
aufweisen.
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Der
Begriff „reduzierte" alkalische Proteaseaktivität bedeutet,
dass der Aktivitätsgrad
geringer ist als der Grad, der von einem nicht mutierten entsprechenden
Pilz gezeigt wird.
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Die
alkalische Proteaseaktivität,
einschließlich
alp-Aktivität,
kann mit dem synthetischen Substrat in N-Succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe-p-nitroanilid
(Sigma Chemical Co.) getestet werden. Die Aktivität wird bei
25°C mit 1
mM Substrat in 20 mM Tris-HCl, pH 8,0, in einem Reaktionsvolumen
von 1 ml gemessen. Die Freisetzung p-Nitroanilin wird bei 410 nm überwacht
(Ramesh et al., 1994, Infection and Immunity, Jan. 79–85).
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Homologe
des fraglichen alkalischen Proteasegens im vorstehend erwähnten Schritt
i) können
entweder durch Kreuzhybridisierung mit einem vorher identifizierten
Gen für
alkalische Protease oder durch Komplementierung von alkalischen
Proteasemutanten kloniert werden.
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Die
Abwesenheit von messbarer alkalischer Proteaseaktivität kann aus
einer Deletion in einer Sequenz, die für die Synthese eines alkalischen
Proteasegenprodukts essentiell ist, erhalten werden.
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Ein
reduzierter Grad an alkalischer Proteaseaktivität kann aus einer unvollständigen Inaktivierung
der gesamten alkalischen Proteasegene herrühren oder zur Expression von
alkalischen Proteasegenprodukten mit reduzierter Funktionalität führen.
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In
Verbindung mit dem vorstehend erwähnten Klonieren können DNA-Konstrukte
konstruiert werden, die in das alkalische Proteasegen zu integrieren
sind, oder alternativ dazu kann das alkalische Proteasegen deletiert
und mit einem anderen Gen wie dem pyrG-Gen, argB-Gen, sC-Gen, oder
hph-Gen substituiert werden.
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Ist
das Gen das alp-Gen, können
die isolierten Transformanten alp– oder
alpΔ sein.
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Ein
anderer Aspekt der Erfindung betrifft das Verfahren zur Herstellung
der Pilze, wobei die Inaktivierung unter Verwendung von Antisense-Technologie
erhalten wird, wobei ein derartiges Verfahren die folgenden Schritte
umfasst:
- i) Konstruktion eines Expressionsplasmids,
das bei der Synthese eines RNA-Moleküls, das
zu dem aus dem alkalischen Proteasegen transkribierten mRNA-Molekül komplementär ist, erhalten
wird,
- ii) Transformation der Wirtspilzzelle mit dem Expressionsplasmid
und einer geeigneten Markierung, entweder auf separaten Plasmiden
oder auf demselben Plasmid
- iii) Selektion von Transformanten unter Verwendung der Markierung
und
- iv) Durchmustern von Transformanten auf einer Reduktion bei
der Synthese des alkalischen Proteaseprodukts.
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Ein
weiterer Aspekt der Erfindung umfasst DNA-Konstrukte zur Verwendung
in den vorstehend erwähnten
Verfahren.
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In
Bezug auf die Verfahren, die DNA-Konstrukte der Erfindung betreffen,
können
die DNA-Konstrukte das alkalische Proteasegen wie das alp-Gen umfassen,
wobei ein Teil einer internen Sequenz durch Nukleotidsubstitution,
-deletion oder -einfügung
modifiziert wurde.
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Das
DNA-Konstrukt kann weiterhin auch DNA-Sequenzen umfassen, die ein
Polypeptidprodukt von Interesse kodieren, wie diejenigen, die hier
nachstehend erwähnt
sind.
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In
Bezug auf die vorstehend erwähnten
Anti-Sense-Verfahren kann das DNA-Konstrukt eine umgekehrte DNA-Sequenz
eines alkalischen Proteasegens, verbunden mit einem funktionellen
Promoter umfassen, wobei die mRNA zumindest teilweise zu einer aus
einem alkalischen Proteasegen hergestellten mRNA komplementär ist.
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Das Verfahren
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Ein
weiterer Aspekt der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung
von heterologen Polypeptiden, vorzugsweise ein sekretiertes Genprodukt,
wobei der A. oryzae der Erfindung in einem geeigneten Wachstumsmedium
bei geeigneten Bedingungen gezüchtet
wird, wodurch das gewünschte
Genprodukt gewonnen und gereinigt wird.
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Bei
der Herstellung von heterologen Polypeptiden, z.B. Enzymen, hängt die
Wahl des Fermentations-pH-Werts häufig von Faktoren wie der zu
verwendenden Wirtszelle, dem von der Wirtszelle benötigten Wachstumsmedium
und der Stabilität
des Polypeptids ab. Demzufolge ist es vorteilhaft, obwohl der A.
oryzae der Erfindung für
ein beliebiges bei einem beliebigen pH-Wert durchgeführten Fermentationsverfahren
verwendet werden kann, dass das Fermentationsverfahren bei einem
pH-Wert durchgeführt
wird, bei welchem die Aktivitäten
der endogenen sauren und/oder neutralen Proteasen, die durch die
Wirtszelle hergestellt werden, inaktiviert oder zumindest deutlich
reduziert werden. Folglich wird, wenn das Fermentationsverfah ren
bei einem pH-Wert z.B. von 5 bis 11 wie 6 bis 10,5, 7 bis 10 oder
8 bis 9,5 durchgeführt
wird, der Aktivitätsgehalt von
sauren Proteasen (wie Aspartam- und Serinproteasen) sowie von neutralen
Proteasen im pH-Bereich über 7
reduziert und kann inaktiv werden. Damit weist die Entfernung von
Aspartamproteasen, wie beschrieben in WO 90/00197, nur eine beschränkte Wirkung
auf die Produktionsausbeute auf.
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Jedoch
können
im alkalischen pH-Bereich alkalische Proteasen in einer unmodifizierten
Wirtszelle aktiv und der Hauptgrund für einen Abbau der Polypeptidprodukts
von Interesse sein. Demzufolge ist in derartigen Fällen die
Inaktivierung eines (von) Gens (Genen), das (die) alkalische Proteaseaktivität kodiert
(kodieren), besonders vorteilhaft.
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Die
Inaktivierung eines (von) alkalischen Proteasegens (-genen) der
Erfindung ist auch besonders vorteilhaft für bestimmte Wirte, da die saure,
neutrale und alkalische Proteaseaktivität unter den verschiedenen Pilzspezies
variiert. Zum Beispiel ist die alkalische Proteaseaktivität in Aspergillus
oryzae höher
als in Aspergillus niger.
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Beispiele
für Enzyme,
die unter Fermentationsbedingungen im vorstehend beschriebenen alkalischen pH-Bereich
hergestellt werden können,
schließen
Endoglucanasen, Phytasen, Proteasen, Lipasen, Cutinasen, Cellulasen,
Chymosine, Peroxidasen und Proteindisulfideisomerasen ein.
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Das
gewünschte
heterologe Polypeptid kann durch herkömmliche Verfahren, einschließlich Abtrennen der
Zellen von dem Medium durch Zentrifugation oder Filtration, falls
nötig nach
Zerstörung
der Zellen, Ausfällen
der proteinhaltigen Bestandteile des Überstands oder Filtrats mittels
eines Salzes, z.B. Ammoniumsulfat, gefolgt von Reinigung durch beliebige
einer Vielzahl von chromatographischen Verfahren, z.B. Ionenaustauschchromatografie,
Affinitätschromatografie
und dergleichen aus dem Medium gewonnen werden.
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Das heterologe Polypeptid
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Im
Kontext der vorliegenden Erfindung ist das gewünschte Polypeptid ein „heterologes
Polypeptid", was
ein Polypeptid bedeutet, das für
die Pilzwirtszelle der Erfindung nicht nativ ist, oder ist ein natives
Polypeptid, in welchem Modifikationen durchgeführt wurden, um die native Sequenz
abzuändern
(d.h. genetische Varianten), oder ist ein natives Polypeptid, dessen
Expression infolge einer Manipulation einer nativen regulatorischen
Sequenz, die zur Expression des nativen Polypeptids erforderlich
ist, oder infolge einer beliebigen anderen Manipulation des Pilzes
der Erfindung durch rekombinante DNA-Techniken quantitativ abgeändert wurde.
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Das
durch den Pilz der Erfindung exprimierte heterologe Polypeptid kann
auch ein Vorläuferprotein, z.B.
ein Zymogen, ein Hybridprotein, ein Protein, das als Pro-Sequenz oder Präpro-Sequenz
erhalten wird oder in einer anderen unreifen Form vorliegt, sein.
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In
einer anderen bevorzugten Ausführungsform
ist das Produkt ein Enzym, insbesondere ein Glycosidaseenzym, z.B.
eine Amylase, insbesondere eine α-Amylase
oder eine β-Amylase;
eine Cellulase, insbesondere eine Endo-1,4-β-glucanase (EC 3.2.1.4) oder
eine Endo-1,3-β-glucanase
(3.2.1.6); eine Xylanase, insbesondere eine Endo-1,4-β-xylanase
(EC 3.2.1.8) oder eine Xylanendo-1,3-β-xylosidase (EC 3.2.1.32); eine α-Galactosidase
(EC 3.2.1.22); eine Polygalacturonase (EC 3.2.1.15); eine Cellulose
1,4-β-Cellobiosidase
(EC 3.2.1.91); und eine Endoglucanase, insbesondere eine Endo-1,6-β-glucanase
(EC 3.2.1.75), eine Endo-1,2-β-glucanase
(EC 3.2.1.71), eine Endo-1,3-β-glucanase
(EC 3.2.1.39) oder eine Endo-1,3-α-glucanase (EC
3.2.1.59).
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
ist das Produkt ein eukariontisches Polypeptid wie Insulin, Wachstumshormon,
Glucagon, Somatostatin, Interferon, PDGF, Fak tor VII, Faktor VIII,
Urokinase, Erythropoetin, Chymosin, Gewebeplasminogenaktivator,
Serumalbumin oder Thrombopoetin.
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In
einer anderen bevorzugten Ausführungsform
ist das Produkt ein Protein pilzlichen Ursprungs. In einer bevorzugten
Ausführungsform
ist das Produkt ein Pilzenzym, z.B. ein amylolytisches Enzym wie
eine α-Amylase,
eine β-Amylase,
eine Glucoamylase, eine β-Galactosidase,
eine Phytase, ein cellulytisches Enzym, ein lipolytisches Enzym,
ein xylanolytisches Enzym, ein proteolytisches Enzym, eine Oxidoreduktase
wie eine Peroxidase oder eine Laccase, eine Pektinase, eine Cutinase
und eine Proteindisulfidisomerase.
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In
noch einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist das Produkt
ein bakterielles Protein. In einer bevorzugten Ausführungsform
ist das Produkt ein bakterielles Enzym; insbesondere ein amylotytisches
Enzym, z.B. eine α-Amylase
oder eine β-Amylase; eine Glucoamylase;
eine β-Galactosidase;
ein cellulytisches Enzym; ein lipolytisches Enzym und ein proteolytisches
Enzym.
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Bevorzugte
Hybridpolypeptide sind Prochymosin und pro-Trypsin-artige Proteasen.
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Die
Erfindung wir detaillierter in den nachstehend angegebenen Beispielen
erklärt.
Diese sollten jedoch in keinster Weise als Einschränkung des
wie in den anhängigen
Ansprüchen
definierten Umfangs der Erfindung angesehen werden. BEISPIELE Materialien
und Verfahren Stämme
Aspergillus
oryzae IFO 4177: | erhältlich vom
Institute for Fermention, Osaka; 17–25 Juso |
| Hammachi
2-Chome Yodogawa_ku, Osaka, Japan. |
JaL125: | Die
Konstruktion dieses Stamms ist in den Beispielen beschrieben. |
Gene
alp: | Dieses
Gen kodiert für
die in SEQ ID NR. 1 dargestellte alkalische Protease |
pyrG: | Dieses
Gen kodiert für
Orotidin-5'-phosphatdecaroxylase,
ein Enzym, das bei der Biosynthese von Uridin beteiligt ist. |
Plasmide
pSO2: | Hergestellt
gemäß Beispiel
1. |
pSO5: | Hergestellt
aus SO2 gemäß Beispiel
1. |
pSRe403: | Hergestellt
gemäß Beispiel
1. |
pSX320: | Die
Konstruktion dieses Plasmids ist in der EP-Anmeldung NR. 0 531 372
B1 beschrieben. |
pToC90: | Ein
Subklon von p3SR2, das das amdS-Gen von Aspergillus nidulans als
XbaI-Fragment mit 2,7 kb (Corrick et al., 1987, Gene 53: 63–71), auf
einem pUC19-Vektor (Yannisch-Perron et al., 1985, Gene 33: 103–119), hergestellt
wie in WO 91/17243 beschrieben, beherbergt. |
Bluescript
SK- | M.A.
Alting-Mees and Short, J.M.,1989, Nucleic Acids Res. 17: 9494–9494 |
pUC18
und pUC118: | Viera
and Messing, 1987, J. Meth. Enzymol. 153: 3–11 |
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BEISPIEL 1
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Genomische
Deletion der alkalischen Protease von Aspergillus oryzae
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Das
alp-Gen wurde durch ein einstufiges Genersatzverfahren (G. May in
Applied Molecular Genetics of Filamentous Fungi, 1992, Seite 1–25. J.
R. Kinghorn und G. Turner, Hrgb.; Blackie Academic and Professional)
deletiert. Die verwendete Markierung war das pyrG-Gen von A. oryzae,
der Stamm von A. oryzae, der verwendet wurde, war ein pyrG-Stamm.
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Klonieren des pyrG-Gens
von Aspergillus oryzae
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Das
pyrG-Gen von A. oryzae wurde durch Kreuzhybridisierung mit einem
pyrG-Gen von A.
niger kloniert (W. van Hartingsveldt et al., 1987, Mol. Gen. Genet.
206: 71–75).
Eine Lambdabibliothek von teilweise mit SauIIIA verdauter DNA von
A. oryzae IFO 4177 wurde mit niedriger Stringenz mit einem DNA-Fragment
mit 1 kb aus dem pyrG-Gen von A. niger sondiert. DNA von einem positiven
Klon wurde in einen pUC118-Vektor subkloniert. Es zeigte sich, dass
das erhaltene Plasmid pSO2 durch Komplementation mit einer pyrG-Mutante von
A. niger das pyrG-Gen enthielt.
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Konstruktion eines pyrG-minus-Stamms
von Aspergillus oryzae
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Ein
pyrG-Deletionsplasmid pSO5, enthaltend etwa 1 kb pyrG-Flankierungssequenzen
an jedem Ende, wurde aus dem Plasmid pSO2 konstruiert. A. oryzae
IFO 4177 wurde mit diesem Konstrukt transformiert, und die Transformanten
wurden durch Resistenz gegen 5-Fluororotinsäure, einem für pyrG-Mutanten
charakteristischen Phenotyp selektiert. Es zeigte sich durch Southern-Analyse,
dass ein Transformant, HowB101, die erwartete Deletion am pyrG-Ort
aufwies. Indem er eine pyrG-Mutante ist, benötigt HowB101 Uridin zum Wachstum.
HowB101 kann mit dem pyrG-Gen vom Wildtyp durch Selektion auf die
Fähigkeit
zum Wachsen ohne Uridin transformiert werden.
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Die
Schritte, die an der Konstruktion von HowB101 beteiligt sind, sind
in 1 veranschaulicht.
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Konstruktion eines alp-minus-Stamms
von Aspergillus oryzae
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Ein
al–-Stamm
von Aspergillus oryzae wurde durch Transformieren des Stamms HowB101
von A. oryzae mit dem alp-Deletionsplasmid pJaL212 konstruiert.
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Konstruktion des Zerstörungsplasmids
pJaL212 der alkalischen Proteaase
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Eine
genomische Bibliothek von A. oryzae IFO 4177 wurde durch teilweises
Verdauen von genomischer DNA mit Sau3A etabliert. Fragmente wurden
an mit BamHI verdautes pUC19 ligiert. Die Bibliothek wurde unter
Verwendung von degenerierten Oligonukleotiden auf bekannte Proteinsequenzfragmente
des alkalischen Proteasegenprodukts durchgemustert. Ein Plasmid,
enthaltend ein Sau3A-Fragment mit 3,9 kb, wurde auf diese Weise
isoliert. Dieses Plasmid wurde als pSRe403 bezeichnet.
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pSRe403
wurde mit SacII verdaut, und das Fragment mit 5,6 kb wurde isoliert
und unter Bildung von pSRe403_SacII religiert. Dieses Plasmid wurde
teilweise mit HindIII verdaut, die Enden wurden unter Verwendung
von Klenow-Polymerase gefüllt
und religiert, um die HindIII-Stelle in pUC19 zu entfernen. Das
erhaltene Plasmid wurde als pJaL173 bezeichnet. pJaL173 wurde mit
HindIII verdaut, und das HindIII-Fragment mit 3,8 kb, enthaltend
das pyrG-Gen von pSO2, wurde in pJaL173 unter Bildung von pJaL212
eingefügt.
Die Konstruktion von pJaL212 ist in 2 umrissen.
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Isolation eines alp-minus-Stamms
von A. oryzae
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A.
oryzae HowB101 wurde mit dem SacI-SphI-Fragment mit 6,8 kb von pJaL212
unter Verwendung von Standardverfahren transformiert. Dieses Fragment
besteht aus 1,5 kb des alp-Promoters, dem pyrG-Gen und 1,5 kb des
3'-Endes das alp-Gens.
Die Transformanten wurden auf ihre Fähigkeit zum Wachsen in Abwesenheit
von Uridin selektiert. Nach Reisolation wurde chromosomale DNA aus
12 Transformanten hergestellt, die DNA wurde mit PstI geschnitten
und durch Southern-Analyse mit einem PstI/SacII-Fragment mit 599
bp von pJaL173 enthaltenden Teils des alp-Gens als radioaktive Markierungssonde
analysiert. Transformanten, die eine Deletion des alp-Gens tragen,
werden durch die Verschiebung der PstI-Bande vom Wildtyp von 1,0 kb
zu einer Bande von 1,9 kb leicht erkannt.
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In
vier Transformanten verschob sich die PstI-Bande mit 1,0 kb zu der
Bande mit 1,9 kb. Einer dieser Transformanten wurde als JaL125 bezeichnet.
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Die
an der Konstruktion von JaL125 beteiligten Schritte sind in 3 veranschaulicht.
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BEISPIEL 2
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Herstellung einer Endoglucanase
mit 45 kD im Stamm JaL125 von A. oryzae
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Die
Stämme
IFO 4177 und JaL125 von A. oryzae wurden mit dem Plasmid pSX320
(
4), bei welchem es sich um ein Pilzexpressionsplasmid
für die
Endoglucanase mit 45 kD von Humicola insolens handelt, durch Kotransformation
mit pToC90 transformiert. Die Konstruktion des Plasmids pSX320 wurde
früher
in
EP 0 531 372 beschrieben.
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Die
Transformanten wurden auf Wachstum auf Minimalmedium, enthaltend
10 mM Acetamid, selektiert und auf die Gegenwart von pSX320 durch
die Fähigkeit
zur Herstellung von Carezyme® durchgemustert.
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Ein
Transformant von jedem Stamm wurde selektiert, und man ließ ihn bei
30°C in
Schüttelkolben,
enthaltend 100 ml Maltodextrin, Sojabohnenmehl und Pepton für eine Dauer
von 5 Tagen wachsen. Proben der Fermentationsbrühe wurden jeden Tag entnommen
und durch SDS-PAGE analysiert. Die Ausbeute der Endoglucanase mit
45 kD wurde aus den mit Coomassie Blue gefärbten Proteinbanden unter Verwendung
des Gelabtastsystems Biolmage (Biolmage System, UK) quantifiziert.
Die Ergebnisse sind in 5 dargestellt. Die Ergebnisse
zeigen an, dass mehr Endoglucanase mit 45 kD in der Fermentationsbrühe der Stämme, in
welchen das alp-Gen
deletiert wurde, als im Stamm vom Wildtyp, der das alp-Gen enthält, vorliegt.
Dies gibt an, dass die Stabilität
der Endoglucanase durch Deletieren des alp-Gens verbessert wird.
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