DE60036647T2

DE60036647T2 - Klonierung und expression einer extrazellulären säurebeständigen lipase aus yarrowia lipolytica

Info

Publication number: DE60036647T2
Application number: DE60036647T
Authority: DE
Inventors: Michel Seman; Georges Pignede; Franck Fudalej; Jean-Marc Nicaud; Claude Gaillardin
Original assignee: Laboratories Mayoly Spindler SAS
Current assignee: Laboratories Mayoly Spindler SAS
Priority date: 2000-04-28
Filing date: 2000-04-28
Publication date: 2008-07-17
Anticipated expiration: 2020-04-29
Also published as: EP1276874B1; ES2200728T3; HK1053145B; WO2001083773A1; CY1107119T1; ATE375525T1; DE60036647D1; DE00925351T1; ATE374823T1; EP1276874A1; ES2200728T1; PT1276874E; HK1053145A1; AU2000244105A1; DK1276874T3

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die gentechnologische Herstellung von Lipasen aus Hefen, die zur Herstellung von Medikamenten verwendet weden können.
Die täglich vom Menschen aufgenommenen Nahrungsmittel bestehen im Wesentlichen aus Lipiden, Proteinen und Zuckern. Alle diese Bestandteile durchlaufen vor ihrer Absorption eine Hydrolyse, die von den Enzymen des Verdauungstrakts katalysiert werden. Ein Mangel an dem einen oder anderen dieser Enzyme kann daher Verdauungsstörungen verursachen und zu erheblicher Unterernährung führen. Dies ist beispielsweise bei manchen pathologischen Situationen der Fall, wie Mukoviszidose oder exokriner Pankreasinsuffizienz, die von einem Mangel an Pankreaslipase begleitet sind. Zur Behebung dieses Mangels wird klassischerweise die orale Verabreichung von Pankreasextrakten vorgeschlagen. Die Wirksamkeit dieses Therapeutikums ist jedoch durch die Tatsache eingeschränkt, dass die in diesen Extrakten enthaltenen Enzyme (Lipasen, Amylasen oder Proteasen) durch das saure Milieu des Magens inaktiviert werden.
Es wurde daher vorgeschlagen, Präparate von Lipasen zu verwenden, die unter den Magenbedingungen resistent sind, wie beispielsweise gentechnisch hergestellte Präparate einer Lipase von Säugern, wie sie in der unter der Nr. 2 699 179 veröffentlichten französischen Patentanmeldung beschrieben ist, oder Präparate von Lipasen von Mikroorganismen, die in saurem Milieu eine korrekte Aktivität besitzen [ZENTLER-MONRO et al., Pankreas, 7, 311–319 (1992)].
Von den in saurem Milieu aktiven Lipasen von Mikroorganismen sind insbesondere Lipasen von Pilzen zu nennen, wie die von Candida ernobii [YOSHIDA et al., Biochim. Biophys. Acta,; 154, 586–588, (1968)], von Trichosporon asteroide [DHARMSTHITI et al., Biotechnol. Appl. Biochem., 26, 111–116 (1997)], von Rhizopus javanicus [UYTTENBROECK et al., Biol. Chem. Hoppe Seyler, 374, 245–254, (1993)] oder von Yarrowia lipolytica [HADEBALL, Acta Biotechnol., 2, 159–167 (1991); NOVOTNY et al., J. Basic Microbiol. 28, 221–227 (1988)]. Neben ihrer Aktivität bei saurem pH haben diese Lipasen die Eigenschaften gemein, dass sie in Gegenwart ihres Substrats gegenüber Verdau durch Proteasen (Trypsin, Chymotrypsin und Pepsin) resistent sind und dass sie gegenüber der Einwirkung von Gallensäuren resistent sind (ihre Aktivität bleibt in Gegenwart von 10 mM Natriumtaurocholat erhalten).
Die natürliche Produktion dieser Mikroorganismen von Lipasen reicht jedoch im Allgemeinen nicht aus, um diese im großtechnischen Maßstab und zu vernünftigen Kosten herstellen zu können.
Die Erfinder haben nun versucht, das Gen für eine bei saurem pH aktive Pilzlipase zu isolieren und zu klonieren und so ihre Überexpression in Wirtszellen zu ermöglichen.
Es ist ihnen auf diese Weise gelungen, das Gen zu klonieren, das für eine säureresistente extrazelluläre Lipase von Yarrowia lipolytica codiert (nachfolgend auch als LIP2 oder LIP2w29a bezeichnet).
Die Expression dieses Gens in Wirtszellen ermöglichte es ihnen, dieses Enzym in aktiver Form zu erhalten.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein isoliertes Nukleinsäurefragment, das eine Sequenz umfasst, die für den intrazellulären Vorläufer einer säureresistenten extrazellulären Lipase aus Hefe codiert, dadurch gekennzeichnet, dass der intrazelluläre Vorläufer dieser Lipase auf Ebene der Polypeptidsequenz wenigstens 30% Identität und wenigstens 39% Ähnlichkeit mit dem durch die Sequenz SEQ ID NO: 2 definierten intrazellulären Vorläufer der extrazellulären Lipase von Yarrowia lipolytica aufweist.
Unter „Nukleinsäurefragement, das für eine extrazelluläre Lipase codiert" wird jedes Nukleinsäurefragment verstanden, das wenigstens eine Sequenz umfasst, die für die reife Form dieser Lipase codiert; daneben kann es die ganze Sequenz oder einen Teil der Sequenzen umfassen, die für die „Prä-" und „Pro"-Abschnitte ihres intrazellulären Vorläufers codieren.
Erfindungsgemäße Nukleinsäuremoleküle sind beispielsweise durch die Nukleotidsequenz SEQ ID NO: 1 des anliegenden Sequenzprotokolls dargestellt.
In der Sequenz SEQ ID NO: 1 entsprechen die Nukleotide 3737 bis 4741 der Sequenz, die für den intrazellulären Vorläufer der extrazellulären Lipase von Y. lipolytica codiert, und die Nukleotide 3836 bis 4741 codieren für das von den Zellen sezernierte reife Enzym.
Das Polypeptid mit der Sequenz SEQ ID NO: 2 umfasst insgesamt 335 Aminosäuren, und die von seiner Sequenz abgeleitete theoretische Molmasse beträgt 36782 Dalton. Das reife Protein umfasst 301 Aminosäuren.
Gemäß einer vorteilhaften Ausführungsform des Nukleinsäurefragments umfasst es wenigstens eine Sequenz, die für ein Polypeptid codiert, das die Aminosäuren 34 bis 334 des durch die Sequenz SEQ ID NO: 2 definierten Polypeptids umfasst. In diesem Fall umfasst das Fragment vorteilhaft die Sequenz, die den Nukleotiden 3836 bis 4738 der SEQ ID NO: 1 entspricht.
Gemäß einer vorteilhaften Variante dieser Ausführungsform umfasst das Nukleinsäurefragment außerdem eine Sequenz, die für ein Polypeptid codiert, das die Sekretion dieser Lipase ermöglicht. In diesem Fall umfasst das Fragment vorteilhaft eine Sequenz, die für die Aminosäuren 1 bis 33 des durch die Sequenz SEQ ID NO: 2 definierten Polypeptids codiert.

Die Ergebnisse des Vergleichs der Sequenz SEQ ID NO: 2, die dem intrazellulären Vorläufer entspricht, mit Sequenzen aus der Datenbank SWISSPROT unter Verwendung des Programms GCG-gap [Version 9.1-UNIX (Sept.97)] und der BLOSUM 62-Matrix (GENETICS COMPUTER GROUP, Universität Wisconsin) sind in der nachfolgenden Tabelle I dargestellt. TABELLE I

Nr. SWISS-PROT	Organismus	Y. lipolytica
		% Identität	% Ähnlichkeit
	Yarrowia lipolytica	100	100
	Candida ernobii	30,3	39,2
P47145	Saccharomyces cerevisiae^a	28,6	38,2
P25234	Penicillium camenbertii	26,8	33,6
P21811	Rhizopus delemar	31,5	38,6
P19515	Rhizomuco mieheir	27,4	34,1
JX0343	Fusarium heterosporum	29	36

a: hypothetische Lipase

Die Erfindung umfasst ferner Expressionskassetten für eine säureresistente extrazelluläre Lipase aus Hefe, umfassend:

– ein erfindungsgemäßes Nukleinsäurefragment;
– Sequenzen, die es ermöglichen, die Expression der Lipase in einer Wirtszelle zu regulieren.

Das erfindungsgemäße DNA-Fragment umfasst die Sequenz, die für die reife Form der säureresistenten Lipase codiert, allein oder in Verbindung mit Sequenzen, die für Sekretionssignale codieren. Diese Sekretionssignale können entweder die natürlicherweise mit dieser Lipase verbundenen Signale oder heterologe Signale sein.
Sequenzen, die die Regulation der Expression ermöglichen, sind insbesondere Sequenzen wie Promotoren und Transkriptionsterminatoren, die in der Wirtszelle funktionsfähig sind, in der die Lipase exprimiert werden soll.
Geeignete Regulationssequenzen können abhängig von der gewünschten Wirtszelle, den gewünschten Bedingungen (beispielsweise induzierbar oder konstitutiv) und dem gewünschten Expressionsniveau gewählt werden.
Man kann Regulationssequenzen verwenden, die natürlicherweise mit der für die Lipase codierenden Sequenz verbunden sind, und/oder heterologe Sequenzen. Es können Sequenzen verwenden werden, die von unterschiedlichen Genen stammen und in unterschiedlichen Kombinationen miteinander verknüpft sind.
Man kann auf diese Weise beispielsweise eine Kassette konstruieren, die einen intrazellulären Vorläufer exprimiert, bei dem die reife Form einer von einem erfindungsgemäßen Nukleinsäurefragment codierten Lipase mit ihren eigenen Sekretionssignalen oder mit Sekretionssignalen heterologer Herkunft verknüpft ist; die für diesen Vorläufer codierende Sequenz kann unter transkriptioneller Kontrolle ihres eigenen Promoters und Terminators stehen oder mit einem heterologen Promoter und/oder einem heterologen Terminator verknüpft sein.
Es ist daher möglich, im Rahmen einer erfindungsgemäßen Expressionskassette den Promoter und/oder den Transkriptionsterminator des Gens für die extrazelluläre Lipase von Y. lipolytica sowie die für die ganze oder einen Teil der Prä/Pro-Region der extrazellulären Lipase von Y. lipolytica codierende Sequenz zu verwenden.
Andererseits kann die Sequenz, die für die reife Form der von einem erfindungsgemäßen Nukleinsäurefragment codierten Lipase von Y. lipolytica codiert, mit einem heterologen Promoter und/oder einem heterologen Terminator und/oder heterologen Signalsequenzen verknüpft sein. Zur Expression der extrazellulären Lipase von Y. lipolytica in einer Hefe kann man beispielsweise die Signalsequenz dieser Lipase und den Promoter und/oder den Terminator des LIP2-Gens verwenden, oder auch andere Promotoren und/oder andere Terminatoren, wie beispielsweise den ACO2-Promoter von Y. lipolytica [LE CLAINCHE, Doktorarbeit des Institut National Agronomique Paris Grignon, eingereicht am 2. Juli 1997], der wie der der LIP2-Lipase durch Triglyceride und Fettsäuren induzierbar ist.
Um eine von einem erfindungsgemäßen Nukleinsäurefragment codierte Lipase in anderen Wirtszellen zu exprimieren, wird man die für das reife Protein codierende Sequenz mit in dieser Wirtszelle funktionsfähigen Kontrollsequenzen für die Transkription und die Sekretion verknüpfen.
Die vorliegende Erfindung umfasst auch rekombinante Vektoren, die durch Insertion wenigstens eines erfindungsgemäßen Nukleinsäurefragments und vorteilhaft wenigstens einer erfindungsgemäßen Expressionskassette in einen Wirtsvektor erhalten werden können.
Als Wirtsvektoren wählt man vorzugsweise Vektoren, die die Replikation der in die Wirtszelle eingeschleusten genetischen Information in mehreren Kopien und vorteilhaft ihren Erhalt in stabiler Form erlauben. Dabei kann es sich um extrachromosomale Vektoren, wie stabile Multicopy-Plasmide, oder um episomale Vektoren handeln; ebenso kann es sich um Integrationsvektoren handeln.
Als beispielhafte Wirtsvektoren, die sich zur Klonierung und Expression einer von einem erfindungsgemäßen Nukleinsäurefragment codierten säureresistenten extrazellulären Lipase eignen, sind beispielsweise die in der PCT-Anmeldung WO 00/12729 im Namen von INRA beschriebenen Vektoren zu nennen.
Ein E. coli-Stamm, der einen dieser Vektoren mit der Bezeichnung JMP10 trägt, der eine Insertion umfasst, die der Region 1715-4806 der Sequenz SEQ ID NO: 1 entspricht und den Promoter, den codierenden Abschnitt und den Transkriptionsterminator der Lipase von Y. lipolytica enthält, wurde am 12. Mai 1998 unter der Nummer I-2013 bei der Collection Nationale de Culture der Microorganismes (CNCM), INSTITUT PASTEUR, 25, Rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cédex 15, Frankreich, hinterlegt.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind auch eukariotische oder prokariotische Zellen, die mit wenigstens einem erfindungsgemäßen Nukleinsäurefragment transformiert sind.
Erfindungsgemäße transformierte Zellen können beispielsweise ausgehend von Bakterienzellen, Hefe- oder Pilzzellen oder Tierzellen (beispielsweise Säuger- oder Insektenzellen) erhalten werden.
Die Erfinder haben ausgehend von Zellen von Y. lipolytica, die mit einem erfindungsgemäßen Nukleinsäurefragment transformiert waren, insbesondere einen Stamm erhalten, der ein Überproduzent dieser Lipasen ist.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft daher diesen Y. lipolytica-Stamm, der am 24. August 1999 gemäß Budapester Vertrag unter der Nummer I-2294 bei der Collection Nationale de Culture der Microorganismes (CNCM), INSTITUT PASTEUR, 25, Rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cédex 15, Frankreich, hinterlegt wurde.
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung rekombinanter Lipase, wobei das Verfahren dadurch gekennzeichnet ist, dass es wenigstens einen Schritt umfasst, bei dem man erfindungsgemäße transformierte Zellen kultiviert und einen Schritt, bei dem man die von diesen Zellen produzierte rekombinante Lipase erntet.
Gemäß einer bevorzugten Durchführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens sind diese transformierten Zellen Zellen des Stamms I-2294.
Diese rekombinante Lipase kann entweder nach Zelllyse oder, vorteilhaft, aus dem Kulturmedium erhalten werden, in das sie von den Zellen sezerniert wurde, und zwar mit klassischen, an sich bekannten Methoden, beispielsweise durch fraktionierte Fällung gefolgt von ein oder mehreren chromatographischen Schritten.
Die vorliegende Erfindung wird durch die folgende ergänzende Beschreibung besser verständlich, die Beispiele betrifft, die die Klonierung des für die extrazelluläre Lipase von Y. lipolytica codierenden Gens und den Erhalt von transformierten Hefestämmen beschreiben, die dieses Gen exprimieren.
Es versteht sich jedoch, dass diese Beispiele lediglich der Veranschaulichung des Gegenstands der Erfindung dienen und diesen in keiner Weise einschränken.
BEISPIEL 1: ISOLIERUNG UND CHARAKTERISIERUNG DES GENS FÜR DIE LIPASE VON YARROWIA LIPOLYTICA
Isolierung der cDNA:
Eine cDNA-Bank von Yarrowia lipolytica wurde mit Nukleinsäuresonden gescreent, die sich von der für die Lipase von Candida ernobii codierenden Sequenz ableiteten.
Ausgehend von positiven Klonen wurde das Gen für die Lipase von Yarrowia lipolytica (LIP2W29a) mittels PCR mit Hilfe des Paares konvergierender Oligonukleotide Lip ATG/Lip STOP amplifiziert: Lip ATG:
Lip STOP:
und an der EcoRV-Stelle in das Plasmid pBLUESCRIPT KS+ (STRATAGENE, La Jolla) kloniert.
Das erhaltene rekombinante Plasmid wird als pKS-LIP2W29a bezeichnet. Es enthält eine Insertion von 1118 bp (entsprechend 3737 bis 4806 der Sequenz SEQ ID NO: 1) mit den Restriktionsstellen SmaI und SfiI, gefolgt von einer Konsensussequenz der Umgebung von ATG (CACAATG), der Sequenz des Leserahmens der Prolipase, der Terminatorsequenz bis zur Polyadenylierungsstelle und den Restriktionsstellen BamHI, EcoRI und NotI.
Isolierung der genomischen DNA:
Die sechs Pools einer genomischen DNA-Bank von Y. lipolytica [XUAN et al., C. Curr. Genet., 14, 15–21, (1988)] wurden mit Hilfe des Paares konvergierender Oligonukleotide Ylip04 und Ylip05 getestet.
Für Pool 2 wurde eine Amplifikation erhalten. Die Bakterienkolonien dieses Pools wurden durch Hybridisierung mit dem wie oben unter 1) beschriebenen erhaltenen LIP2W29a-Gen als Sonde getestet. Dieses Screening ermöglichte es, das Plasmid pINA- LIP2 zu erhalten, das ein Genomfragment von etwa 6,5 kb enthält (1-C). Dieses Fragment wurde mit verschiedenen Restriktionsenzymen verdaut. Die so erhaltenen Fragmente EcoRV (E1), PstI (P1, P2, P3 und P4) und BgIII (B1) wurden an den Stellen EcoRV, PstI bzw. BamHI in das Plasmid pBLUESCRIPT KS+ kloniert. Die Analyse des Plasmids pINA-LIP2 ergab, dass es die Promotorregionen und einen Teil der für die Lipase codierenden Sequenz enthielt.
Um das Ende des Gens für die Lipase und die Terminatorregion zu erhalten, wurde ein Schritt mittels inverser PCR durchgeführt. Die Hybridisierung der mit den Restriktionsenzymen HindiII, PstI und SphI geschnittenen genomischen DNA mit dem LIP2W29a-Gen lieferte Fragmente mit 1,4 kb, 1,66 kb bzw. 3,7 kb. Das genomische HindIII-DNA-Fragment mit 1,4 kb wurde amplifiziert: Die genomische DNA wurde mit HindIII verdaut, ligiert und durch PCR mit den divergierenden Oligonukleotiden Ylip03 und Ylip04 amplifiziert.
Das erhaltene Fragment (1-D) wurde an der EcoRV-Stelle in das Plasmid pBLUESCRIPT KS+ kloniert. Das rekombinante Plasmid, das als pKS-PCR-H bezeichnet wurde, wurde sequenziert.
Die Sequenzen eines Teils der Insertion von pINA-LIP2, des Plasmids pKS-LIP2W29a und des Plasmids pKS-PCR-H wurden zusammengebaut, so dass ein EcoRV-HindIII-Segment mit 5304 bp erhalten wurde (1-E), dessen Sequenz im Anhang unter der Nummer SEQ ID NO: 1 dargestellt ist.
1 stellt die verschiedenen oben beschriebenen Schritte der Klonierung des Gens für die extrazelluläre Lipase von Yarrowia lipolytica (LIP2W29a) schematisch dar.
Legende zu 1:

A: Partielle genomische Restriktionskarte des LIP2W29a-Locus. Die Symbole bezeichnen EcoRV (EV), PstI (P), BgIII (Bg) und HindIII (H).

Die Lokalisation des ORF von LIP2W29a ist schematisch durch einen schwarzen Block dargestellt.

B: Lokalisation der cDNA-Sequenz und schematische Darstellung der Oligonukleotide Lip ATG und Lip STOP, die zur Amplifikation des für die Lipase codierenden Gens verwendet wurden. Das rekombinante Plasmid ist als pKS-LIP2W29a bezeichnet. Lokalisation der Oligonukleotide Ylip04 und Ylip05, die zum Testen der Bank von Xuan verwendet wurden (Xuan et al, 1988).
C: Schematische Darstellung der in Plasmid pINA-LIP2 enthaltenen 6,5 kb-Insertion und Lokalisation der Subklone EcoRV (E1), PstI (P1, P2, P3 und P4) und BgIII (B1), die zur Sequenzierung der 5'-Region des Gens für LIP2W29a verwendet wurden.
D: Sequenzierung des genomischen 1,4 kb-HindIII-DNA-Fragments. Die genomische DNA wurde mit HindIII verdaut, ligiert und durch PCR mit dem Paar divergierender Oligonukleotide Ylip03 und Ylip04 amplifiziert. Das PCR-Fragment wurde kloniert und das rekombinante Plasmid, das das Fragment enthält, wurde als pKS-PCR-H bezeichnet.
E: Sequenz des YL-LIP2-Locus. Die Sequenzen des Plasmids pKS-LIP2W29a (B), der pINA-LIP2-Subklone (C) und des Plasmids pKS-PCR-H (D) wurden zusammengebaut. Die endgültige Sequenz ist eine EcoRV-HindIII-Region mit 5304 bp.

Die Analyse der Nukleotidsequenz der EcoRV-HindIII-Region mit 5304 bp ermöglichte die Feststellung eines offenen Leserasters, der für ein Polypeptid mit 335 Aminosäuren codiert. Die Sequenz dieses Polypeptids ist in dem anliegenden Sequenzprotokoll unter der Nummer SEQ ID NO: 2 dargestellt.
Eigenschaften der Lipase
Signalsequenz:
Die Prä-Pro-Region befindet sich zwischen den Positionen -33 und -1 der Peptidsequenz. Sie umfasst eine Signalsequenz mit 13 Aminosäuren, die sich zwischen den Positionen -33 und -19 der Peptidsequenz befindet, 4 X-Ala oder X-Pro-Dipeptide, Substrate der Diaminopeptidase, eine Pro-Region mit 12 Aminosäuren, die sich zwischen den Positionen -12 und -1 der Peptidsequenz befindet und deren zwei letzte Aminosäuren eine KR (Lys-Arg)-Stelle bilden, das Substrat für eine von dem XPR6-Gen codierte Endoprotease (homolog zu Kex2 bei S. cerevisiae).
Potenzielle N-Glykosylierungsstellen:
Es gibt zwei potenzielle N-Glykosylierungsstellen (Asparagin-X-Ser/Thr), die bei den Aminosäuren 113 und 134 lokalisiert sind.
Katalytisches Zentrum:
Die drei Aminosäuren, die wahrscheinlich an der Bildung des katalytischen Zentrums des Enzyms beteiligt sind, finden sich jeweils an den folgenden Positionen: 162 für den Serinrest, der in der Konsensussequenz G×S×G enthalten ist, die allen Lipasen gemein ist, 230 für den Asparaginsäurerest und 289 für den Histidinrest.
Die Southern-Blot-Analyse zeigt, dass dieses Gen im Genom von Yarrowia lipolytica in nur einer Kopie vorliegt.
BEISPIEL 2: KLONIERUNG DES GENS DER LIP2-LIPASE VON YARROWIA LIPOLYTICA IN INTEGRATIONSVEKTOREN UND EXPRESSION IN YARROWIA LIPOLYTICA:
Konstruktion von Vektoren, die das Gen enthalten, das für die Lipase von Yarrowia lipolytica codiert.
Das für die LIP2-Lipase von Yarrowia lipolytica codierende Gen wurde in den Integrationsvektor JMP3 kloniert. Dieser Wirtsvektor wird in der französischen Anmeldung im Namen von INRA mit dem Titel: „PROCEDE DE TRANSFORMATION NON-HOMOLOGUE DE YARROWIA LIPOLYTICA" beschrieben und am selben Tag wie die vorliegende Anmeldung hinterlegt.
Es handelt sich um einen Vektor zur Selbstklonierung, der nach Schneiden mit dem Restriktionsenzym NotI in das Genom integriert. Diese Restriktion ermöglicht die Eliminierung des bakteriellen Teils (Replikationsursprung von E. coli und des Resistenzmarkers KanR).
Sie leiten sich von dem Vektor pINA1067 ab (auch als pINA970 bezeichnet), beschrieben von BARTH und GAILLARDIN [The dimorphic fungus Yarrowia lipolytica. In: Non conventional yeasts in biotechnology (Wolf K. Hrsg.). Springer-Verlag, Berlin, S. 313–388 (1996)], in den ein NotI-Fragment eingebaut wurde, das einen Replikationsursprung für E. coli und einen Kanamycinresistenzmarker umfasst, und aus dem ein HindIII-EcoRI-Fragment ausgeschnitten wurde (enthaltend Sequenzen des Plasmids pBR322, einen Tetracyclinresistenzmarker und den XPR2-Promoter und -Terminator), das durch einen Adapter ersetzt wurde, der die Restritkionsstellen HindIII, ClaI, MluI, HpaI, BamHI und EcoRI enthält.
Konstruktion der Vektoren JMP6 und JMP10 zur Amplifikation.
Die Vektoren JMP6 und JMP10 zur Amplifikation wurden durch dreigleisige Ligation konstruiert, wobei durch Agarosegelelektrophorese gereinigte Fragmente verwendet wurden.
Konstruktion von JMP6:
Der Promoter des Gens für die Acyl-CoA-Oxidase ACO2 von Y. lipolytica wurde durch PCR mit den Oligonukleotiden Aco2P1 und Aco2P2 amplifiziert, die eine ClaI- bzw. eine HindIII-Stelle enthalten. Das 2168 bp-PCR-Fragment wurde in die EcoRV-Stelle des Vektors BLUESCRIPT KS+ kloniert. Das resultierende Plasmid wird als KS-ACO2prom bezeichnet. Dieser Vektor wurde mit ClaI und partiell mit HindIII verdaut, wobeiein 2155 bp-Fragment erhalten wurde, das den vollständigen Promoter enthält.
Das Gen für die Lipase ist in einem 1134 bp-HindIII-EcoRI-Fragment enthalten, das aus Plasmid KS+-LIP2w29a erhalten wurde.
Die beiden Fragmente wurden gereinigt und in die ClaI-EcoRI-Stellen des Vektors JMP3 eingebaut. Das resultierende Plasmid wird als JMP6 bezeichnet.
Dieses Plasmid ist in 2 dargestellt.
Konstruktion von JMP10:
Der Promoter des Gens für die LIP2-Lipase von Y. lipolytica wird von einem 2030 bp-Ndel*-HindIII-Fragment des Plasmids KS+-LIP2prom getragen. Dieses Plasmid wurde mit NdeI verdaut und mit T4-DNA-Polymerase behandelt, um die NdeI-Stelle stumpf zu machen (NdeI*). Nach Inaktivierung des NdeI-Enzyms und der Polymerase (20 min, 70°C) wurde die DNA mit HindIII geschnitten. Das 2030 bp-NdeI*-HindIII-Fragment wurde mit dem 1134 bp-HindIII-EcoRI-Fragment legiert, das das Gen für die Lipase und ihren Terminator trägt, und in die HpaI-EcoRI-Stellen des Vektors JMP3 eingebaut.
Das resultierende, JMP10 genannte Plasmid ist in 3 dargestellt. Dieses Plasmid wurde am 12. Mai 1998 unter der Nummer I-2013 bei der Collection Nationale de Cultures des Microorganismes (CNCM), INSTITUT PASTEUR, 25, Rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cédex 15, Frankreich, hinterlegt.
Die Plasmide JMP6 und JMP10 wurden nach Linearisierung mit NotI durch Transformation mit Lithiumacetat) entweder in den Stamm E150 (umfassend Zeta- Stellen oder in den Stamm PO1d (ohne Transposons und Zeta-Stellen) eingeschleust. Diese beiden Y. lipolytica-Stämme besitzen eine Deletion des URA3-Gens.
Mit dem Stamm PO1d erhält man typischerweise 20 bis 50 Transformanten/μg DNA und mit dem Stamm E150 100 bis 200 Transformanten/μg DNA.
Die Transformanten werden nachfolgend entsprechend der folgenden Nomenklatur bezeichnet: Name des Stamms – Nummer des Plasmids – Nummer der Transformante. Beispiel: PO1d-6-15, Stamm PO1d, Plasmid JMP6, Transformante Nummer 15.
Die Integration des Gens für die Lipase in das Genom der Transformanten wird durch Southern-Blot und Hybridisierung mit Sonden, die sich von Zeta-Sequenzen, der Sequenz des ACO2-Promoters und der Sequenz der Lipase ableiten, verifiziert.
Lipaseproduktion in Kulturmedium durch transformierte Yarrowia lipolytica-Stämme
Die verschiedenen Stämme wurden bei 28°C unter Schütteln (200 Upm) in einem 250 ml-Erlenmeyer-Kolben mit Schikanen, der 40 ml Medium (Hefeextrakt 10 g/l; Bactopepton 20 g/l; 50 mM Natriumphosphatpuffer, pH 6,8) mit oder ohne Induktor (beispielsweise 0,5% Oleat) kultiviert. Animpfen erfolgte mit einer optischen Dichte von 0,1 Einheiten pro ml bei 600 nm.
Im Laufe der Zeit werden verschiedene Proben entnommen, und die Tests der Lipaseaktivität erfolgen titrimetrisch mit den Überständen nach folgendem Protokoll:
Die Reaktionsmischungen (5 ml Olivenölemulsion (SIGMA, Frankreich, Ref. 800-1); 2 ml 50 mM Na₂HPO₄/KH₂PO₄-Puffer; pH 6,8; Enzym in verschiedenen Konzentrationen) werden bei 37°C 20 Minuten in 20 ml-Kunststoffröhrchen auf einem Rundschüttler (250 Upm) inkubiert. Die Reaktion wird durch Zugabe von 4 ml Lösung einer 1:1-Mischung (V/V) von Ethanol/Aceton mit 0,09% Thymolphtalein (W/V) gestoppt. Der Inhalt der Röhrchen wird anschließend mit 50 mM Soda (0,05 N Soda (TITRISOL, MERCK)) bis zum Auftreten des blauen Farbumschlags von Thymolphtalein titriert. Die Enzymaktivität in den Röhrchen wird wie folgt berechnet:

V₀: = Volumen Soda, das für die Bestimmung in die Kontrollprobe gegeben wurde (ml)
V: = Volumen Soda, das in die Probe gegeben wurde (ml)
T: = Reaktionszeit (min.)
M: = Molarität des für die Bestimmung verwendeten Sodas (mM)
D: = effektive Verdünnung der analysierten Probe
E: = Volumen der für die Bestimmung verwendeten Probe (ml)

Eine Lipaseeinheit entspricht der Menge Enzym, die in der Lage ist, die Bildung von 1 μmol Fettsäure/min. und den oben beschriebenen Arbeitsbedingungen zu katalysieren.

Die mit dem Referenzstamm E150 und den modifizierten Stämmen E150-6-2 und E150-10-4 erhaltenen Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle II dargestellt: TABELLE II

	Lipaseaktivität (Einheiten/ml Überstand)
	Medium ohne Induktor			Medium mit Induktor
Dauer der Kultur (Stunden)	E150	E150-6-2	E150-10-4	E150	E150-6-2	E150-10-4
0	0	0	0	0	0	0
4	0	0		0	0
7,5	0	4	0	4	8	12
23	8	22	29	12	229	92
32	4	46		13	312
46	0	21	58	17	280	92
70	0	12		13	262

Die mit dem Referenzstamm PO1d und dem transformierten Klon PO1d-6-17 erhaltenen Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle III dargestellt: TABELLE III

Lipaseaktivität (U/ml)

Medium mit Induktor

Dauer der Kultur (Stunden) PO1d PO1d-6-17

0 0 0

8 0 15

10 0 40

13 0 160

15 14 221

24 42 229

36 40 187
BEISPIEL 3: PRODUKTION VON EXTRAZELLULÄRER LIPASE DURCH DEN KLON MS4 VON YARROWIA LIPOLYTICA
Ausgehend von Kulturen von PO1d-Zellen von Yarrowia lipolytica, die wie in Beispiel 2 beschrieben transformiert worden waren, gelang es den Erfindern, einen Klon zu selektionieren, der eine weitaus größere Menge Lipase produziert als die anderen transformierten Klone, ohne dass diese Überproduktion seinen Wachstumsfähigkeiten schadet.
Dieser Klon, der nachfolgend als MS4 bezeichnet wird, enthält 10 Kopien der Expressionskassette; er wurde am 24. August 1999 unter der Nummer I-2294 bei der Collection Nationale de Culture der Microorganismes (CNCM), INSTITUT PASTEUR, 25, Rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cédex 15, Frankreich, hinterlegt.
Die Lipaseproduktion durch diesen Klon wird wie nachfolgend beschrieben bestimmt.
A) Produktion von extrazellulärer Lipase durch den Klon MS4 im Erlenmeyer
Versuchsbedingungen
Alle Kulturen werden bei 28°C unter Schütteln (150 Upm) in mit Stopfen versehenen 250 ml-Kolben mit Schikanen (CML, Frankreich) durchgeführt, die 50 ml Kulturmedium enthalten (deionisiertes Wasser; Hefeextrakt 10 g/l; Bactotrypton N1 20 g/l (ORGANOTECHNIE); 50 mM Na₂HPO₄/KH₂PO₄-Puffer, pH 6,8; Glucose 10 g/l (SIGMA); Olivenöl oder Ölsäure (MERCK) in verschiedenen Konzentrationen).
Das Animpfen der Kulturen erfolgte so, dass man eine optische Dichte bei 600 nm (OD_600nm) von 0,25 pro 1 ml erhält (oder etwa 2,5 × 10⁷ Zellen/ml).
Während der Umsetzung werden mehrere Proben entnommen. Bei jeder entnommenen Probe werden Biomasse und Überstand durch Zentrifugation voneinander getrennt und es wird die OD_600nm pro 1 ml gemessen. Die Lipaseaktivität im Überstand wird wie oben in Beispiel 2 angegeben titrimetrisch bestimmt, während das Zellwachstum aus der Biomasse bestimmt wird.
Ergebnisse
In 4 sind dargestellt:

– Zellwachstum des Klons MS4 (O), bestimmt durch Messsung der Extinktion bei 600 nm, A_600nm, als Funktion der Zeit.
– Lipaseaktivität (•) als Funktion der Zeit.

Diese Ergebnisse zeigen, dass die Lipaseaktivität unter diesen Kulturbedingungen im Überstand ansteigt und bei 96 Stunden ein Maximum erreicht; der Klon MS4 erlaubt die Produktion von etwa 0,5 g/l Lipase, d. h. 12000 U/ml (4), im Überstand nach 100 Stunden Kultivierung. Dies ist 200-mal mehr Lipase als der Ausgangsstamm PO1d.
Eine Gelanalyse der Kinetik der Lipaseproduktion im Kulturüberstand mittels SDS-PAGE zeigt eine konstante Akkumulation der Lipase ohne sichtbaren Abbau.
Die Erfinder haben außerdem den Einfluss der Kulturbedingungen und der Medienzusammensetzung auf die Lipaseproduktion getestet.
Sie haben auf diese Weise festgestellt, dass die Verwendung von Bactotrypton die Lipaseaktivität stark begünstigte. Wenn dieser Bestandteil durch ein Bactopepton ersetzt wird, ist die beobachtete Aktivität tatsächlich etwa 3-mal geringer.
Es wurde auch beobachtet, dass die Gegenwart einer Fettsäure oder eines Triglycerids für die Induktion der Produktion der Lipase unverzichtbar war. Die Gegenwart von 5% Olivenöl in der Kultur erlaubte es, maximale Lipasetiter zu erhalten, während die Zugabe von 10% Olivenöl die Titer nicht signifikant erhöhte. Ölsäure ist auch ein ausgezeichneter Induktor, wenn sie mit 10% verwendet wird.
B) Produktion von extrazellulärer Lipase im Fermenter
– Versuchsbedingungen
– Vorbereitung der Inokulationsampullen
Der Klon MS4 wird bei hoher Dichte auf Minimalagar ausgestrichen (YNB ww DIFCO 1,7 g/l; Glutamat 0,5 g/l; Glucose 10 g/l; PASTAGAR B 12 g/l) und 48 Stunden bei 28°C inkubiert. Die Zellen werden mit 5 ml YPD geerntet und zum Animpfen von 200 ml YPD-Medium verwendet. Dann werden sie bis zu einer A_600nm von 10 (d. h. 10⁸ Zellen/ml) gezüchtet. Die Hefen werden nach Zentrifugation in 50 ml kaltem YEA-Glycerin (Hefeextrakt 5 g/l; Glucose 10 g/l; Glycerin 20%) aufgenommen und bei –80°C in 1 ml-Ampullen aufbewahrt.
– Vorkultur
Zwei Vorkulturen werden 16 Stunden bei 28°C mit einem Rundschüttler (150 Upm) in 1 l-Kolben mit Schikanen vorgenommen, die 200 ml YPD-Medium enthalten (Hefeextrakt (LIFE TECHNOLOGIES Frankreich) 10 g/l; Bactopepton (DIFCO, Frankreich) 10 g/l; wasserfreie Glucose (SIGMA Frankreich) 10 g/l.
Jede Vorkultur wird mit einer 1 ml-Ampulle des Klons MS4 angeimpft (d. h. 4 × 10⁸ Zellen).
– Fermentation
Medium zur Batch-Fermentation:
Deionisiertes Wasser, Hefeextrakt (ORGANOTECHNIE, Frankreich) 10 g/l; Bactotrypton (ORGANOTECHNIE, Frankreich) 20 g/l; 50 mM Na₂HPO₄/KH₂PO₄-Puffer, pH 6,8; 5% Olivenöl (Olivenöl ROUX, Frankreich); 3,5 ml Antischaummittel (RHODORSIL 426 R, PROLABO), zugegeben auf einmal zu Beginn der Fermenation.
Der Phosphatpuffer und das Olivenöl werden getrennt autoklaviert.
Medium zur kontinuierlichen Fermentation:

Hefeextrakt (ORGANOTECHNIE, Frankreich) 5 g/l; Bactotrypton (ORGANOTECHNIE, Frankreich) 10 g/l; 50 mM Na₂HPO₄/KH₂PO₄-Puffer, pH 6,8.

Fermentationsbedingungen:
Das Animpfen des Fermenters erfolgt bei einer OD_600nm von 1 pro 1 ml.
Die Fermentation wird bei 27°C und pH 6 (pH eingestellt durch 2,5 M Soda) in einem 5 l-Fermenter mit 3,5 l Medium (siehe oben) bei einer Belüftungsrate von 1 vvm, einem auf einen Minimalwert von 5% eingestellten pO₂ und mit einer anfänglichen Schüttelgeschwindigkeit von 300 Upm durchgeführt, die in Schritten von 5 Upm auf bis zu 1000 Upm ansteigen kann (um den minimalen pO₂ beizubehalten).
Die Fermentation im Medium zur Batch-Fermentation dauert 24 Stunden und im Medium zur kontinuierlichen Fermentation bis zu 3 Tage.
Ergebnisse:
Batch-Fermentation
Eine maximale Lipaseaktivität wird nach 24 Stunden erhalten (4000 U/ml). Die Aktivität hält sich dann über einige Stunden auf einem Plateau, bevor sie abzunehmen beginnt. Diese Abnahme scheint mit dem Verschwinden des Olivenöls, dem Substrat für die Lipase, im Medium zusammenzuhängen.
Kontinuierliche Fermentation
Bei einem Durchsatz von 200 ml/Stunde konnte eine Lipaseproduktion über 2 Tage erreicht werden, und es wurde eine Enzymproduktionsrate von etwa 80 U/ml/Stunde der erhalten. SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Isoliertes Nukleinsäurefragment, umfassend eine Sequenz, die für den intrazellulären Vorläufer einer säureresistenten extrazellulären Lipase aus Hefe codiert, dadurch gekennzeichnet, dass der intrazelluläre Vorläufer der Lipase auf Ebene der Polypeptidsequenz wenigstens 30% Identität und wenigstens 39% Ähnlichkeit mit dem durch die Sequenz SEQ ID NO: 2 definierten intrazellulären Vorläufer der extrazellulären Lipase von Yarrowia lipolytica aufweist.
Isoliertes Nukleinsäurefragment nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es wenigstens eine Nukleotidsequenz umfasst, die für ein Polypeptid codiert, das die Aminosäuren 34 bis 334 des durch die Sequenz SEQ ID NO: 2 definierten Polypeptids umfasst.
Isoliertes Nukleinsäurefragment nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Sequenz den Nukleotiden 3836 bis 4738 der Sequenz SEQ ID NO: 1 entspricht.
Isoliertes Nukleinsäurefragment nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass es ferner eine Sequenz umfasst, die für ein Polypeptid codiert, das die Sekretion der Lipase ermöglicht.
Isoliertes Nukleinsäurefragment nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass es eine Sequenz umfasst, die für die Aminosäuren 1 bis 33 des durch die Sequenz SEQ ID NO: 2 definierten Polypeptids codiert.
Isoliertes Nukleinsäurefragment nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass es die Sequenz umfasst, die den Nukleotiden 3737 bis 3835 der Sequenz SEQ ID NO: 1 entspricht.
Expressionskassette für eine säureresistente extrazelluläre Lipase aus Hefe, dadurch gekennzeichnet, dass sie umfasst: – ein Nukleinsäurefragment nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 6; – Sequenzen, die es ermöglichen, die Expression der Lipase in einer Wirtszelle zu regulieren.
Rekombinanter Vektor, umfassend wenigstens ein Nukleinsäurefragment nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 6.
Rekombinanter Vektor nach Anspruch 8, umfassend wenigstens eine Expressionskassette nach Anspruch 7.
Eukaryontische oder prokaryontische Zelle, transformiert mit wenigstens einem Nukleinsäurefragment nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 6.
Transformierter Zellstamm nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um den Yarrowia lipolytica-Klon mit der Bezeichnung MS4 handelt, hinterlegt am 24. August 1999 bei der Collection Nationale de Culture de Microorganismes (C.N.C.M.) unter der Nummer I-2294.
Verfahren zur Herstellung einer säureresistenten Lipase, dadurch gekennzeichnet, dass es wenigstens einen Schritt umfasst, bei dem man transformierte Zellen nach irgendeinem der Ansprüche 10 oder 11 kultiviert, und einen Schritt, bei dem man die von diesen Zellen produzierte rekombinante Lipase erntet.