PT1276874E - Clonagem e expressão de uma lipase extracelular resistente aos ácidos de yarrowia lipolytica - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO "Clonagem e expressão de uma lipase extracelular, resistente aos ácidos de Yarrowia Lipolytica" A presente invenção tem por objecto a produção, por engenharia genética, de lipases de leveduras utilizáveis para a obtenção de medicamentos.

Os alimentos ingeridos quotidianamente pelo homem são constituídos essencíalmente por lípidos, proteínas e açúcares. Todos estes constituintes sofrem, antes da sua absorção, uma hidrólise catalisada por enzimas do tracto digestivo. A falta de uma ou de outra destas enzimas pode assim causar distúrbios digestivos e dar origem a uma desnutrição importante. É por exemplo o caso de certas situações patológicas, como a mucoviscosidade ou a insuficiência pancreática exócrina, às quais está associado um déficit de lipase pancreática. Para corrigir este déficit, propõe-se classicamente administrar, por via oral, extractos pancreáticos. Contudo, a eficácia desta terapêutica está limitada pelo facto de as enzimas contidas nesses extractos (lipases, amilases e proteases) serem rapidamente inactivadas pela acidez do meio gástrico.

Tem sido então proposto utilizar preparações de lipase que resistem às condições gástricas, tal como, por exemplo, preparações de lipase gástrica de mamíferos produzidas por engenharia genética, como a descrita no pedido de patente de invenção francesa publicada com o número 2 699 179, ou preparações de lipases de microrganismos que têm uma actividade correcta em meio ácido [ZENTLER-MONRO et al., Pancreas, 7, 311-319 (1992)].

Entre as lipases de microrganismos activas em meio ácido, podem citar-se as lipases fúngicas, tal como as de Candida ernobii, [YOSHIDA et al., Biochim. Biophys. Acta,; 154, 586-588, (196811, de Trichosporon asteroide [DHARMSTHITI et al. , Biotechnol. Appl. Biochem. , 26, 111-116 (1997)], de Rhizapus javanicus [ (UYTTENBROECKet al. , Biol. Chem. Hoppe Seyler, 374, 245-254, (1993)), ou de Yarrowia lipolytica [HADEBALL, Acta Biotechnol., 2,159-167 (1991); NOVOTNY et al. , J. Basic Microbiol., 28, 221-227 (1988)] . Para além da sua actividade em pH ácido, estas lipases possuem características comuns como o facto de serem resistentes, na presença do seu substrato, à digestão pelas proteases (tripsina, quimotripsina e pepsina) e de serem resistentes à acção dos sais biliares (a sua actividade estará conservada na presença de taurocolato de sódio 10 mM.

Contudo, a produção natural de lipases por estes microrganismos não é geralmente suficiente para permitir prepara-las à escala industrial a um custo razoável.

Os requerentes decidiram isolar e clonar o gene de uma lipase fúngica activa a um pH ácido, para permitir a sua sobre-expressão nas células hospedeiras.

Foram assim levados a clonar o gene que codifica para uma lipase extracelular resistente a ácidos de Yarrowia lipolytica ( igualmente denominada a seguir por LIP2 ou LIP2w29a) , A expressão deste gene nas células hospedeiras permitiu obter esta enzima sob uma forma activa. 2 A presente invenção tem por objecto um fragmento de ácido nucleico isolado que compreende uma sequência que codifica para o precursor intracelular de uma lipase extracelular resistente a ácidos, de levedura, caracterí-zada pelo facto de o referido precursor intracelular da referida lipase presente, ao nível da sequência polípe-ptídica, ter pelo menos 30 % de identidade e pelo menos 39 % de semelhança com o precursor intracelular da lipase extracelular de Yarrowia lipolytica definida pela sequência SEQ ID NO: 2.

Por: "fragmento de ácido nucleico que codifica para uma lipase extracelular" entende-se qualquer fragmento de ácido nucleico que compreenda pelo menos uma sequência que codifica para a forma madura da referida lipase; pode compreender, além disso, toda ou parte das sequências que codificam para as porções "pré" e "pró" do seu precursor intracelular.

As moléculas de ácido nucleico, de acordo com a presente invenção, estão representadas, por exemplo, pela sequência nucleotídica SEQ ID NO: 1 da lista de sequências em anexo.

Na sequência SEQ ID NO: 1, os nucleótidos 3737 a 4741 correspondem à sequência que codifica para o precursor intracelular da lipase extracelular Y. lipolytica, e os nucleótidos 3836 a 4741 que codificam para a enzima madura segregada pelas células, 0 polipéptído da sequência SEQ ID NO: 2 compreende no total 335 aminoãcidos e a massa molecular teórica deduzida da sua sequência é de 36782 daltons. A proteína madura compreende 301 aminoãcidos. 3

De acordo cora um processo de realização vantajoso do fragmento de ácido nucleico, ele compreende pelo menos uma sequência que codifica para um polipéptido que compreende os aminoãcidos 34 a 334 do polipéptido definido para a sequência SEQ ID NO: 2. Neste caso, o referido fragmento compreende, com vantagem, a sequência que corresponde aos nucleótidos 3836-4738 da SEQ ID NO: 1.

De acordo com uma disposição vantajosa deste modo de realização, o referido fragmento de ácido nucleico compreende, além disso, uma sequência que codifica para um polipéptido que permite a secreção da referida lipase. Neste caso, o referido fragmento compreende, com vantagem, uma sequência que codifica para os aminoácidos 1 a 33 do polipéptido definida pela sequência SEQ ID NO: 2,

Os resultados da comparação da sequência SEQ ID NO: 2 que corresponde ao precursor intracelular, com sequências do banco de dados SWISSPROT, utilizando o programa GCG-gap [versão 9.1-UNIX (set. 97).] e a matriz BLOSUM 62, (GENETICS COMPUTER GROUP, Universdade do Wisconsin) , estão ilustrados no quadro a seguir. QUADRO 1 N° SWISS-PROT ORGANISMO Y. lipolytica % de % de se- identidade melhança Yarrowía. lipolytica 100 100 Candida. ernobii 30,3 3 9,2 P47145 Saccharomyces cerevisíaeB 28,6 38,2 P25234 Pénicillium caaienbertii 26,8 33,6 P21811 Rhizopus delemar 31,5 38,6 P19515 Rhizomucor miehel 21,4 34,1 JX0343 Fusarium heterosporum 29 | 36 3: lipase hipotética 4 A presente invenção engloba igualmente cassetes de expressão de uma lipase extracelular, resistente a ácidos de levedura, que compreendem: - um fragmento de ácido nucleico de acordo com a presente invenção; - sequências que permitem regular a expressão da referida lipase de uma célula hospedeira. 0 fragmento de ADN de acordo com a presente invenção compreende a sequência que codifica para a forma madura da lipase resistente a ácidos, isolada ou associada a sequências que codificam para sinais de secreção. Estes sinais de secreção podem ser ou os associados à referida lipase, ou sinais heterólogos.

As sequências que permitem regular a expressão são em particular sequências do tipo promotor e terminador de transcrição, funcionais na célula hospedeira em que se pretende expressar a lipase.

Podem escolher-se sequências de regulação apropriadas em função da célula hospedeira, das condições (por exemplo, indutiva ou constitutiva) e do nível de expressão desejado.

Podem utilizar-se sequências de regulação natural-mente associadas à que codifica para a lipase e / ou sequências heterólogas. Podem utilizar-se sequências provenientes de diferentes genes, associadas em combinações diferentes.

Pode-se assim construir, por exemplo, uma cassete que expressa um precursor intracelular, na qual a forma madura 5 de uma lipase resistente a ácidos codificada por um fragmento de ácido nucleico de acordo com a presente invenção está associada aos seus próprios sinais de secreção ou a sinais de secreção de origem heteróloga; a sequência que codifica para este precursor pode ser colocada sob controlo transcricional dos seus próprios promotor e termínador ou então pode estar associada a um promotor heterólogo e/ou a um termínador heterólogo. É assim possível utilizar, no quadro de uma cassete de expressão de acordo com a presente invenção, o promotor e/ou o termínador de transcrição do gene da lipase extracelular da F. lipolytica, assim como a sequência que codifica para toda ou parte da região pré-pro da lipase extracelular da Y. lipolytica.

Por outro lado, a sequência que codifica para a forma madura da lipase codificada por um fragmento de ácido nucleico de acordo com a presente invenção pode estar associada a um promotor e/ou a um termínador dos sinais heterólogos de secreção. Por exemplo, para a expressão numa levedura da lipase extracelular da Y. lipolytica pode-se utilizar a sequência de sinal desta lipase e o promotor e/ou o termínador do gene LIP2 ou ainda outros promotores e/ou terminadores, tal como, por exemplo, o promotor AC02 de Y. lipolytica [LE CLAINCHE, Tese de doutoramento do Institut National Agronomique Paris Grignon, defendida em 2 de Julho de 1997] que, tal como o da lipase LIP2, ê indutível pelos triglicéridos e pelos ácidos gordos.

Para expressar uma lipase codificada por um fragmento de ácido nucleico de acordo com a presente invenção, noutras células hospedeiras, deve-se associar a sequência 6 que codifica para a proteína madura com sequências de controlo da transcrição e com sinais de secreção funcionais nesta célula hospedeira. A presente invenção engloba igualmente vectores re-combinantes susceptíveis de serem obtidos por inserção de pelo menos um fragmento de ácido nucleico de acordo com a presente invenção e, com vantagem, pelo menos uma cassete de expressão de acordo com a presente invenção, num vector hospedeiro.

Pode-se escolher, de preferência, como vectores hospedeiros que permitem a replicação em várias cópias de informação genéticas introduzidas na célula hospedeira e, com vantagem, a sua manutenção sob uma forma estável. Pode tratar-se de vectores extra-cromossómicos, tal como plasmidos estáveis de múltiplas cópias ou vectores epissomais; pode também tratar-se de vectores integradores. A título de exemplo de vectores hospedeiros que se podem utilizar para a clonagem e expressão de uma lipase extracelular resistente a ácidos, codificada por um fragmento de ácido nucleico de acordo com a presente invenção, podemos citar, por exemplo, os vectores descritos no pedido de patente de invenção PCT WO 00/12729 em nome do INRA.

Uma estirpe de E. coli que alberga um destes vectores denominada JMP 10, que compreende uma inserção correspondente à região 1715-4806 da sequência SEQ ID NO: 1, contendo o promotor, a porção codificante e o termi-nador de transcrição da lipase de Y. lipolytíca, foi depo-sitada na Collection Nationale de Cultures de Microorganismes 7 (CNCM), INSTITUT PASTEUR, 25, rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cédex 15, France, em 12de Maio de 1998, com o número 1-2013. A presente invenção tem igualmente por objecto células eucarióticas ou procariõticas transformadas por pelo menos um fragmento de ácido nucleico de acordo com a presente invenção.

As células transformadas de acordo com a presente invenção podem obter-se, por exemplo, a partir de células bacterianas, de células de levedura ou de fungos ou de células de animais (por exemplo células de mamíferos ou de insectos).

Os requerentes obtiveram, nomeadamente, a partir de células de células de Y. lipolytica transformadas por um fragmento de ácido nucleico de acordo com a presente invenção, uma estirpe super-produtora da referida lipase.

Um outro objecto da presente invenção consiste pois nesta estirpe de Y. lipolytica, que foi depositada em 24 de Agosto de 1999, de acordo com o tratado de Budapeste, na Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) , INSTITUT PASTEUR, 25 rue du Docteur Roux, 75724 PARIS CEDEX 15, FRANCE, com o número 1-2294. A presente invenção tem igualmente por objecto um processo de produção de lipase recombinante, processo esse que é caracterizado por compreender pelo menos uma etapa durante a qual se põe em cultura células transformadas de acordo com a presente invenção e uma etapa na qual se colhe a lipase recombinante produzida pelas referidas culturas.

De acordo com um modo de realização preferido, prefere-se um processo de acordo com a presente invenção, sendo as referidas células transformadas células da estirpe 1-2294.

Esta lipase recombinante pode ser obtida quer após a lise celular, quer, com vantagem, a partir do meio de cultura no qual ela é segregada pelas células, por técnicas clássicas, conhecidas por si próprias, por exemplo por precipitação fraccionada seguida de uma ou várias etapas de cromatografia. A presente invenção será melhor compreendida com a ajuda do complemento de descrição que se segue, que se refere a exemplos que descrevem a clonagem do gene que codifica para a lipase extracelular da Y. lipolytica e a obtenção de estirpes de levedura transformada que exprimem este gene. É de ter em atenção que estes exemplos são dados unicamente a título de ilustração do objecto da presente invenção e que não constituem, de nenhuma forma, uma limitação.

EXEMPLO 1: ISOLAMENTO E CARACTERIZAÇÃO DO GENE DA LIPASE DE YARROWIA LIPOLYTICA

Isolamento do ADNc:

Fez-se o rastreio de um banco de ADNc de Y. lipolytica com a ajuda de sondas de ácido nucleico derivadas da sequência que codifica para a lipase de Candida ernobii. 9 A partir dos clones positivos, amplifícou-se o gene da lipase Yarrowia Iipolytíca (LIP2W29a) por RCP com a ajuda do par de olígonucleótídos convergenets Lip ATG/Lip STOP :

Lip ATG: 5'

CCCGGGCCGCAGTGGCCACAATGAAGCTTTCCACCATCCTTTTCACAGCC 3'

Lip STOP: 5 ' GTTGGCGGCCGCGAATTCGGATCCTAAATAA.ACGATATTCATTTATTAAA GTAGATAGTTGAGG· 3' e foi clonado nos plasmidos pBLUESCRIPT KS+ (STRATAGENE, La Jolla) no sítio EcoRV, 0 plasmido recombinante obtido denomina-se pKS-LIP2W29a. Contém uma inserção de 1118 pb (coordenadas 3737 a 4806 da sequência SEQ ID NO: 1) contendo os sítios de restrição Smal et Sfil, seguidos de uma sequência de consenso do ambiente de ATG (CACAATG), da sequência do quadro de leitura da prolipase, da sequência terminadora, até ao sítio de poliadenilação e dos sítios de restrição BamHl, EcoRI e Notl,

Isolamento do ADN genómico:

Analisaram-se seis conjuntos de um banco de ADN genómico de Γ, lipolytica [XUAN et al, , C. Curr. Genet. , 14, 10 15-21, (1988) com a ajuda de um par de oligonucleótidos convergentes Ylip04 e YlipOB.

Ylíp04 5' GGCACTAAGATCTTCAAGCCC 3'

YlipOB 5’ GAAGCCATTGTGGACAAGACAG 3'

Obteve-se uma amplificação para o conjunto 2. Analisaram-se as colónias bacterianas deste conjunto por hibridação com o gene LIP2W29a, obtido como se descreve em 1) anterior, como sonda. Este rastreio permite obter o plasmido pINA-LIP2, que contém um fragmento genõmico de cerca de 6,5 kb (figura 1-C) . Este fragmento foi digerido por diferentes enzimas de restrição. Os fragmentos EcoRV (El) , Pstl (Pl, P2, P3 et P4) e Bglll (Bl) assim obtidos foram clonados no plasmido pBLUESCRIPT KS+ nos sítios EcoRV, Pstl e BamH 1, respectivamente. A análise do plasmido pINA-LIP2 revelou que contém as regiões promotoras e uma parte de sequência que codifica para a lipase.

Para se obter o fim do gene da lipase e da região terminadora, realizou-se uma etapa de RCP inversa. A hibridação do ADN genõmico cortada pelas enzimas de restrição Hindi 11, Pstl e Sphl, com o gene LIP2W29a revelou fragmentos de 1,4 kb, 1,6 6 kb e 3,7 kb, respectivamente. Amplificou-se o fragmento HindIII de 1,4 kb de ADN genõmico: o ADN genõmico foi digerido por HindIII, ligado e amplificado por RCP com a ajuda de oligonucleótidos divergents Ylip03 e Ylip04. Ylip03: 5' TATCCAATGTTTGCGAGTCGGG 3' 0 fragmento obtido (figura 1-D) foi clonado no plasmido pBLUESCRIPT KS+ no sítio EcoRV. O plasmido recombinante, denominado pKS-PCR-H foi sequenciado.

II

As sequências de uma parte da inserção de pINA-LIP2, do plasmido pKS-LIP2W29a e do plasmido pKS-PCR-H, foram unidas para se obter um segmento EcoRV-HindiII de 5304 pb (figura 1-E) cuja sequência figura em anexo com o número SEQ ID N°. 1. A figura 1 esquematiza as diferentes etapas descritas antes, da clonagem do gene da lipase extraeelular de Yarrowia lipolytica (LIP2W29a).

Legenda da figura 1: A: Carta de restrição genómica parcial do lócus de LIP2w29a. Os símbolos representam EcoRV (EV) , PstI (P), BglII (Bg) e HindIII (H). A localização do ORF da LIP2W29a foi esquematizada por um bloco a negro, B: Localização da sequência do ADNc e representação esquemática dos oligonucleótidos Lip ATG e Lip STOP utilizados para amplificar o gene que codifica para a lipase. O plasmido recombinante é designado por pKLIP2W29a. Localização dos oligonucleótidos Ylip04 de Ylip05 utilizados para ensaiar o banco de Xuan (Xuan et al, 1988). C: Representação esquemática da inserção de 6,5 kb contida no plasmido pINA-LIP2 e localização dos subclones EcoRV (El) , PstI (Pl, P2, P3 e P4) e BglII (Bl) utilizados para sequenciar a região 5' do gene da LIP2W29a.

D: Sequenciação do fragmento de ADN genómico HindIII de 1,4 kb. O ADN genómico foi digerido por HindIII, 12 ligado e amplificado por RCP com o par de oligonucleõtidos divergentes Ylip03 e Ylíp04. O fragmento de RCP foi clonado e o plasmido recombinante contendo o dito fragmento foi denominado por pKS-PCR- H. E: Sequência do lócus YL-LIP2. As sequências do plasmido pKS-LIP2W29a (B), dos subclones PINA-LIP2 (C) e do plasmido pKS-PCR-H (D) foram juntas. A sequência final representa uma região EcoRV-HindIII de 5304 pb. A análise da sequência nucleofílica da região EcoRV-HindlII de 5304 pb permitiu por evidência a presença de uma fase de leitura aberta codificando para um polipéptido de 335 aminoãcidos. A sequência deste polipéptido está representada na lista de sequências em anexo com o número SEQ ID N°. 2.

Características da lipase

Sequência de sinal: A região pré-pró está situada entre as posições -33 e -1 da sequência peptídica. Compreende uma sequência sinal de 13 aminoãcidos situados entre as posições -33 e -19 da sequência peptídica, 4 dipéptidos X-Ala ou X-Pro, substratos da diaminopeptidase, uma região pró de 12 aminoãcidos situados entre as posições -12 e -1 da sequência peptídica e cujos últimos dois aminoãcidos formam um sítio KR (Lis-Arg) , substrato de uma endoprotease codificada pelo gene XPR6 (homólogo de Kex2 em S. cerevisiae). 13 Sítios potenciais de JJ-glicosilação:

Existem dois sítios potenciais de N-glicosilação (asparagina-X-Ser/Tre) que estão localizados ao nível dos aminoãcidos 113 e 134. Sítio catalítico:

Encontram-se os três aminoãcidos verdadeiramente implicados na composição do sítio catalítica da enzima nas seguintes posições respectivas: 162 para o resíduo de serina compreendido na sequência de consenso GxSxG comum para todas as lipases, 230 para o resíduo do ácido aspártico e em 289 para o resíduo de histidina. A análise por transferência de Southern mostra que este gene está presente numa única cópia no genoma de Yarrowia lipolytíca. EXEMPLO 2: CLONAGEM DO GENE DA LIPASE LIP2 DE YARROWIA LIPOLYTÍCA NOS VECTORES INTEGRADORES E EXPRESSÃO EM YARROWIA LIPOLYTÍCA:

Construção dos vectores que compreendem o gene que codifica para a lipase de Yarrowia lipolytica 0 gene que codifica para a lipase LIP2 de Yarrowia lipolytica foi clonado no vector integrador JMP3. Este vector hospedeiro está descrito no pedido de patente de invenção francesa em nome do INRA, intitulado: "PROCEDE DE TRANS FORMATION NON-HOMOLOGUE DE YARROWIA LIPOLYTICA" e depositada no mesmo dia que o presente pedido de patente de invenção. 14

Trata-se um vector de auto clonagem que se íntegra no genoma após corte pela enzima de restrição Notl. Esta restrição permite a eliminação da parte bacteriana (origem de replicação de E, coli e do mercador de resistência

KanR).

Derivam do vector pINA1067 (ígualmente denominado por pINA970) descrito por BARTH et GAILLARDIN [The dimorphic fungus Yarrowia lipolytica. In: Non conventional yeasts ín biotechnology (Wolf K. Ed.) . Springer-Verlag, Berlin pp 313-388, (1996)], no qual se introduziu um fragmento Notl que compreende uma origem de replicação por E. coli e um marcador de resistência à canamicina e donde se retirou um fragmento de HindiII-EcoRI (contendo sequências do plasmido pBR322, um marcador de resistência à tetraciclina e o promotor e o terminador XPR2), que foi substituído por um adaptador contendo os sítios de restrição HindIII, Ciai, MluI, Hpal, BamHI e EcoRI.

Construção dos vectores de amplificação JMP6 e JMP1Q

Os vectores de amplificação JMP6 e JMP10 foram construídos ligando três vias utilizando fragmentos purificados apôs electroforese em gel de agarose.

Construção de JMP6: 0 promotor do gene do acilo CoA oxidase, AC02, de Y. lipolytica foi amplificado por RCP com os oligonucleótidos Aco2Pl e Aco2P2 que contêm um sítio Ciai e HindIII, respectivamente. O fragmento de RCP de 2168 pb foi clonado no sítio EcoRV do vector de BLUESCRIPT KS+. 0 plasmido resultante é designado por KS-AC02prom. Este vector foi 15 digerido por Ciai e parcialmente por HindIII, para se obter um fragmento de 2155 pb contendo o promotor completo. 0 gene da lipase está contido num fragmento HindIII-EcoRI de 1134 pb isolado do plasmido KSLIP2W29a.

Os dois fragmentos foram purificados e inseridos nos sítios Clal-EcoRI du vector JMP3. O plasmido resultante foi designado por JMP6.

Este plasmido está representado na figura 2.

Construção de JMP10: O promotor do gene da lipase LIP2 de Y. lipolytica está contido num fragmento Ndel* - HindIII de 2030 pb do plasmido KS+-LIP2prom. Este plasmido foi digerido por Ndel, tratado com ADNpolimerase de T4, para se obter o sítio Ndel franco (Ndel*) . Após inactivação da enzima Ndel e da polimerase (20 minutos, 70 °C), cortou-se o ADN por HindIII. O fragmento Ndel*-HindIII de 2030 pb foi ligado com o fragmento HindIII-EcoRI de 1134 pb comportando o gene da lipase e o seu terminador e foi inserido nos sítios Hpal-EcoRI do vector JMP3. O plasmido resultante chamado JMP10 está representado

na figura 3. Este plasmido foi depositado na Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM), INSTITUT PASTEUR, 25, Rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15,

França, em 12 de Maio de 1998, com o número 1-2013.

Os plasmidos JMP6 e JMP10 foram introduzidos por transformação com acetato de lítio após linearização por Notl, E150 (compreendendo os sítios zeta) , quer na estirpe 16 POld (desprovida de transposões e de sítios zeta) . Estas duas estirpes de Y. lipolytica possuem uma eliminação do gene URA3.

Obtêm-se normalmente 20 a 50 transformantes/pg de ADN com estirpe POld e 100 a 200 transformantes/μα de ADN com a estirpe E150.

Os transformantes são designados a seguir de acordo com a seguinte nomenclatura: nome da estirpe - número do plasmido - número do transformante. Exemplo: POld-6-15 estirpe POld, plasmido JMP6, transformante número 15. A integração do gene da lipase no genoma dos transformantes verifica-se por transferência de SOUTHERN e hibrídação com sondas derivadas da sequência zeta, da sequência do promotor AC02 e da sequência da lipase.

Produção de lipase no meio de cultura por meio de estirpes transformadas de Yarrowia lipolíticas Põe-se em cultura as diferentes estirpes a 28 °C com agitação (200 rpm) num erlenmeyer com alhetas, de 250 mL, contendo 4 0 mL de meio (extracto de levedura 10 g/L; bactopeptona 20g/L; tampão de fosfato de sódio 50 mM, a pH 6,8) com ou sem indutor (por exemplo, oleato a 0,5 %) . A sementeira inicial faz-se a uma densidade óptica de 0,1 unidade por mL a 600 nm.

Fazem-se diferentes colheitas durante este tempo e realizam-se os ensaios da actividade da lipase nos sobrenadantes por titulação, de acordo com o protocolo seguinte:

Faz-se a incubação das misturas reaccionais (5 mL de emulsão de azeite (SIGMA, França, ref. 800-1); 2 mL de tampão Na2HP04/KH2P04 50mM, a pH 6,8; enzima a diferentes concentrações), durante 20 minutos, a 37 °C, com agitação orbital (250 rpm) em tubos de plástico de 20 mL. Pãra-se a reacção por adição de 4 mL de solução de uma mistura 1/1 (v/v) de etanol/acetona, contendo 0,09 % de timolftalaína (p/v). em seguida faz-se a titulação do conteúdos dos tubos com soda 50 mM (soda 0, OSN (TITRISOL, MERCK)) até ao aparecimento da viragem da cor azul da timolftalaína. A actividade enzimãtica presente nos tubos é calculada como se segue:

Actividade (U/mL) = (V-Vo) x M x D (T x E)

Vo = volume de sonda posto na amostra testemunho para a dosagem (mL) V = volume de soda posto na amostra (mL) T = tempo da reacção (minutos) M = molaridade da soda utilizada para a dosagem (mM) D = diluição efectuada na amostra doseada E = volume da amostra utilizada para a dosagem (mL)

Uma unidade de lipase corresponde à quantidade de enzima capaz de 1 pmole de ácido gordo/minuto nas condições operatórias descritas antes.

Os resultados obtidos com a estirpe de referência el50 e as estirpes modificadas E150-6-2 e E150-10-4, estão ilustrados no quadro II que se segue:

QUADRO II

Actividade da lipase (unidades/ raL de sobrenadante) Meio sem indutor Meio com indutor Tempos de cultura (horas) E150 E150-6-2 E150-10-4 E150 E150-6-2 EI5 0-10-4 0 0 0 0 0 0 0 4 0 0 0 0 7,5 0 4 0 4 8 12 23 8 22 29 12 229 92 32 4 46 13 312 4 6 0 21 58 17 280 92 70 0 12 13 262

Os resultados obtidos com a estirpe de referência POld e o clone transformado P01d-6-17 estão ilustrados no quadro III a seguir:

QUADRO III

Actividade da lipase (U/mL) Meio com indutor Tempos de cultura (horas) POld POld-6-17 0 0 0 8 0 15 10 0 40 13 0 160 15 14 221 24 42 229 36 40 187 EXEMPLO 3: PRODUÇÃO DE LIPASE EXTRACELULAR PELO CLONE MS4

DE YARROWIA LIPOLYTICA A partir de culturas de células POld de Yarrowía lipolytíca transformadas como se descreve no exemplo 2, os requerentes conseguiram seleccionar um clone produzindo uma quantidade de lipase muito mais importante que os outros 19 clones transformados sem que esta sobre-produção altere as suas capacidades de crescimento.

Este clone, denominado a seguir como MS4, contém 10 cópias da cassete de expressão; foi depositado em 24 de Agosto de 1939 na Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM), INSTITUT PASTEUR, 25 rue du Docteur Roux, 75724 PARIS CEDEX 15, FRANÇA, com o número 1-2294. A produção de lipase por este clone foi determinada como se descreve a seguir. A/ Produção de lipase extracelular pelo clone MS4 num Erleruneyer

Condições experimentais

Realizam-se todas as culturas a 28 °C, com agitação (150 rpm) em frascos de gargalho estreito com alhetas tapados, de 250 mL (CML, França), contendo 50 mL de meio de cultura (água desionizada; extracto de levedura 10 g/L; bactotriptona NI 20 g/L (ORGANOTECHNIE); tampão Na2HP04/KH2P04 50 mM, a pH 6,8; glicose 10 g/L (SIGMA); azeite ou ácido oleico (MERCK), em diferentes concentrações).

As sementeiras iniciais das culturas são realizadas de modo a obter uma densidade óptica a 600 nm (DOgotmm) de 0,25 para 1 mL (ou seja, cerca de 2,5.1o7 células/mL).

Efectuam-se várias colheitas durante a reacção. Para cada colheita, separam-se a biomassa e o sobrenadante por centrifugação e mede-se a sua DOS00nm para 1 mL. Dosei a-se a actividade da lipase no sobrenadante por titulação, 20 conforme indicado no exemplo 2 anterior, enquanto que o crescimento celular é medido a partir da biomassa.

Resultados

Na figura 4 estão representados: 0 crescimento celular do clone MS4 (o) avaliado pela medição da absorvência a 600 nm A60onm em função do tempo. A actividade da lipase (·) em função do tempo.

Estes resultados mostram que nas condições de cultura, a actividade da lipase aumenta no sobrenadante para atingir um máximo às 96 horas, o clone MS4 permite a produção de 0,5 g/L de lipase, ou seja 1200 U/mL (figura 4) no sobrenadante, após 100 horas de cultura. Isto representa 200 vezes mais de lipase do que a estirpe POld inicial. A análise em gel SDS-PAGE da cinética da produção da lipase num sobrenadante de cultura, mostra uma acumulação constante da lipase sem degradação aparente.

Os requerentes, além disso, ensaiaram a influência das condições da cultura e da composição do meio na produção de lipase.

Constatou-se assim que a utilização bactotriptona favorecia fortemente a actividade da lipase. Com efeito, quando este constituinte é substituído por uma bactope-ptona, a actividade observada é cerca de 3 vezes menor. 21

Observou-se ígualmente que a presença de um ácido gordo ou de um triglicérido era indispensável para a indução da produção da lipase. A presença de azeite a 5 % na cultura, permite ter títulos máximos de lipase, a adição de azeite a 10 % não aumenta sígnificativamente os títulos. 0 ácido oleico é igualmente um excelente indutor quando é utilizado a 10 %. B/ Produção de lipase extracelular num fermentador - Condições experimentais - Preparação das ampolas da sementeira O clone MS4 é espalhado com uma forte densidade num meio de agar mínimo (YNB ww DIFCO 1,7 g/L; glutamato 0,5 g/L; glicose 10 g/L; PASTAGAR B 12 g/L) e é posto em incubação durante 48 horas, a 28 °C. Recuperam-se as células com 5 mL de YPD e utilizam-se para semear 200 mL de meio YPD. Em seguida faz-se a cultura até uma A600nm de 10 (ou seja 108 células/mL) . Retomam-se as leveduras após centrifugação em 50 mL YEA glicerol (extracto de levedura 5 g/L; glicose 10 g/L; glicerol a 20 %) , arrefece-se e conserva-se em ampolas de 1 mL a -80 °C. - Pré-cultura

Realizam-se duas pré-culturas durante 16 horas, a 28 °C, com agitação orbital (150 rpm), em frascos com gargalo estreito com alhetas de 11, contendo 200 mL de meio YPD (extracto de levedura (LIFE TECHNOLOGIES, França) 10 g/L; bactopeptona (DIFCO, França) 10 g/L; glicose anidra (SIGMA, França) 10 g/L). 22

Cada pré-cultura é semeada com uma ampola de 1 mL do clone MS4 (ou seja, 4.108 células). - Fermentação • Meio de fermentação em lotes Água desionizada, extracto de levedura (ORGANOTECHNIE, França) 10 g/L; bactotriptona (ORGANOTECHNIE, França) 20 g/L; tampão Na2HP04/KH2P04 50 mM, a pH 6,8; azeite a 5 % (azeite ROUX, França); 3,5 mL de anti-espuma (RHODORSIL 426 R, PROLABO), adicionados de uma só vez desde o princípio da fermentação. O tampão de fosfato e o azeite são posto na autoclave separadamente. • Meio de fermentação em contínuo

Extracto de levedura (ORGANOTECHNIE, França) 5 g/L; bactotriptona (ORGANOTECHNIE, França) 10 g/L; tampão Na2HP04/KH2P04 50 mM, a pH 6,8.

Condições da fermentação:

Efectua-se a sementeira inicial do fermentador a uma DOsoonm de 1 para 1 mL.

Realiza-se a fermentação a 27 °C e a pH 6 (regulada pela soda 2,5 M) num fermentador de 5 L, contendo 3,5 L de meio (ver acima) como uma aeração 1 vvm, um p02 fixado no valor mínimo de 5 %, com uma velocidade inicial de agitação de 300 rpm, podendo subir até 1000 rpm pelo incremento de 5 rpm para conservar a p02 mínima. 23 A fermentação dura 24 horas em meio de fermentação em lotes e até 3 dias em meio de fermentação em contínuo.

Resultados • Fermentação em lotes

Uma produção máxima da actividade da lipase obtém-se após 24 horas (4000 U/mL). A actividade mantém-se em seguida num^ plataforma durante algumas horas antes de começar a decrescer. Este decrescimento parece estar ligado ao desaparecimento do azeite, substrato da lipase no meio. •Fermentação em contínuo

Uma produção de lipase em dois dias, com débito de 200 mL/hora, pode ser obtida com uma taxa de produção de enzima à volta de 80 U/mL/hora.

LISTA DE SEQUÊNCIAS <110> LABORATÓRIOS MAYOLY SPINDLER SEMAN, Michel PIGNEDE, Georges FUDALEJ, Franck NICAUD, Jean-Marc GAILLARDIN, Claude

<120> CLONAGEM E EXPRESSÃO DE UMA LIPASE EXTRACELULAR, DE LEVEDURA, RESISTENTE A ÁCIDOS <13 0 > MJPcb269/24 <14 0 > 24 <141> <160 > 2 <170> Patentln Ver. 2.1

<21G> 1 <211> 5304 <212> ADN <213> Yarrowia lipolytica <220>

<221> CDS <222> (3737) . . (4741) <22 0 > <221> mat_péptido <222 > (3836) (4741) <400> 1 gatatcggta gcaaacagac acgaagaaga ggccttggag aatttggaaa caacatccat 60 tcgtgctcct tgtttctgct ttccatgcaa atgca-acagg gggataccgg gctgcagagt 120 tcggaaggtc tcgtagacgt atcgcacctg ttttgatgaa ctgaagaaaa cgatgatctt 180 gaacttggtg tgtgttctca ggaaacccca cagtgtgtcc agcttgtctt gcagctccac 240 gcagacatag ttctgttcga ggttcttggg tgtgctggaa gtggtgtccg ggttggcgga 300 gatgtacttg gggtcggcga gtgacaaacg ggccagatca ctgacgctct tggtctgtgt 360 tgcgctgaaa agcagagtct gtctgtccac aggcaggttt tccaaaatgg catccatggt 420 cttcttgaaa cccatatcga ggattcgatc ggcctcgtcc agcaccagca tcttcacgtt 480 agaaagatca aacccgctag tttggtccat gtgttgtaac agtcgtccgg gtgtacaaat 540 gagaatgttc agcttggcca gtcggtcagc ctccatggca acgtcctttc ctccaataac 600 caaaccagca gagaagctgt gacaacggcc gatttttcgc agaacctgga aaatctggac 660 cgccagttct cgagtcggac taataaccag ggctcctaaa ccatccacat cactccactt 720 gtttcgaaac aggcactcca acacaggcac cagaaacgcc agagtcttac cacttccggt 780 acgcgctgct ccaagcagat 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Lisboa, 28 de Dezembro de 2007 29

Claims (12)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Fragmento de ácido nucleico isolado que compreende uma sequência que codifica para o precursor intracelular de uma lipase extracelular levedura, resistente aos ácidos, caracterizado pelo facto de o referido precursor intracelular da referida lipase apresentar, ao nível da sequência polipeptídica, uma identidade pelo menos igual a 30% e uma semelhança pelo menos igual a 39% com o precursor intracelular da lipase extracelular de Yarrowia lipolytica.
2. 2. Fragmento de ácido nucleico isolado, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de possuir pelo menos uma sequência nucleotídica que codifica um polipéptido que possui os aminoácidos desde 34 a 334 do polipéptido definido pela SEQ ID NO: 2.
3. 3. Fragmento de ácido nucleico isolado, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo facto de compreender a sequência correspondente aos nucleótidos 3836 a 4738, da SEQ ID NO: 1.
4. 4. Fragmento de ácido nucleico isolado, de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo facto de compreender ainda uma sequência que codifica para um polipéptido que permite a secreção da referida lipase.
5. 5. Fragmento de ácido nucleico isolado, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo facto de compreender uma sequência que codifica para os aminoácidos 1 a 33 do polipéptido definido pela SEQ ID NO: 2 . 1
6. 6. Fragmento de ácido nucleico isolado, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo facto de compreender a sequência correspondente aos nucleótidos 3737 a 3835, da SEQ ID NO: 1.
7. 7. Cassete de expressão de uma lipase extracelular de levedura, resistente aos ácidos, caracterizado pelo facto de possuir: - um fragmento de ácido nucleico de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 6, - sequências que permitem regular a expressão da referida lipase numa célula hospedeira.
8. 8. Vector recombinante que possui pelo menos um fragmento de ácido nucleico de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 6.
9. 9. Vector recombinante de acordo com a reivindicação 8, o qual possui pelo menos uma cassete de expressão de acordo com a reivindicação 7.
10. 10. Célula eucariótica ou procariótica transformada pelo menos com um fragmento de ácido nucleico de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 6.
11. 11. Estirpe de células transformadas de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pelo facto de se tratar de um clone de Yarrowia lipolytíca designado por MS4, depositado na Collection Nationale de Culture de Microorganismes (C.N.C.M.) com o número 1-2294.
12. 12. Processo para a produção de uma lipase resistente aos ácidos, caracterizado pelo facto de compreender pelo menos uma etapa durante o qual são produzidas em cultura células transformadas de acordo com uma 2 e uma etapa recombinante qualquer das reivindicações 10 ou 11 durante a qual se recolhe a lipase produzida pelas referidas células. Lisboa, 28 de Dezembro de 2007