JP4263241B2 - アルカリプロテアーゼを欠失した糸状真菌 - Google Patents
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Description
発明の分野
本発明は、新規な真菌宿主細胞およびタンパク質製造の方法に関する。さらに詳しくは、本発明は、異種性タンパク質の発現のために有用である宿主細胞に関し、ここで、この宿主細胞は、アルカリプロテアーゼ活性の発現レベルを有意に低下させる様に、遺伝的に修飾されている。本発明はさらに、本発明の真菌を用いて高収量に、注目するタンパク質を製造する方法に関し、ここで、この方法は、適切な増殖培地での宿主細胞の培養、それに続く、所望するタンパク質の回収を含む。本発明はまた、これらの方法で用いられる真菌およびDNA構成体を作成する方法も含む。
発明の背景
真菌、および特に糸状真菌は、細胞外に分泌されるタンパク質の発現のために、宿主細胞として広く工業的に用いられている。特に、アスペルギラス（Aspergillus）属に属する種は、内在性タンパク質および、最近では異種性タンパク質製造のために、工業的に使用されてきた長い歴史をもつ。
宿主細胞として用いる微生物に、頻繁に見られる一つの問題は、タンパク質分解により、注目するタンパク質産物の収量低下を引き起こすタンパク質分解酵素の、固有な生産および高レベルな分泌である。
これを解決する多様な方法が考案されてきた。例えば、多種類の内在性プロテアーゼをコードする遺伝子を除去、または破壊できる。WO 90/00192（Genencor Inc.）は、酵素活性のあるアスパラギン酸プロテアーゼの分泌を不可能にした、糸状真菌宿主の変異株を記載している。この変異では、異種性ポリペプチドであるウシのキモシンの収量が増加したことが示された。EP 574 347（Ciba Geigy AG）は、サブチリシン型のセリンプロテアーゼを欠失したアスペルギラス属の宿主を記載している。
しかし、真菌は、ここで述べた２つに加え、多数のプロテアーゼを生産することが良く知られている。従って、その他のプロテアーゼに由来するタンパク質分解活性が存在しないか、または非常に低い、糸状真菌株が未だに必要とされている。
発明の概要
異種性ポリペプチド産物を製造するための糸状真菌宿主細胞を提供することが、本発明の目的であり、ここでは、この細胞は、親細胞に比べて、内在性アルカリプロテアーゼ活性の発現レベルを有意に低くするために、遺伝的に修飾されている。
本発明は、この様な修飾された真菌に関し、ここでは、アルカリプロテアーゼ活性をコードする少なくとも一つの遺伝子の転写および／または翻訳が、完全または部分的に阻害されている。
本発明によれば、組換えDNAテクノロジーを用いて、この目的を達成しうる。ここでは、問題の真菌アルカリプロテアーゼ活性をコードする遺伝子配列は欠失されるか、または変異され、その結果、プロテアーゼ発現レベルの低下か、または活性レベルが低いプロテアーゼの発現が起きている。
具体例では、アルカリプロテアーゼ遺伝子は、配列番号１に示され、且つ、Murakami,K.,et al.,1991,Agric.Biol.Chem.55:2807-2811に記載されているalp遺伝子である。
さらに本発明は、この様な真菌を作成する方法に関し、ここではアルカリプロテアーゼ遺伝子の失活は、アルカリプロテアーゼ遺伝子におけるヌクレオチド置換、欠失または挿入によって得られる。
本発明はまた、本発明の真菌宿主細胞を用いて、異種性ポリペプチドを製造する方法にも関する。特に、分泌性ポリペプチドが意図され、ここでは、真菌宿主細胞は、少なくとも、注目するポリペプチドまたは遺伝子産物をコードするDNA配列を含むDNA構成体を用いて修飾され、そして随意に形質転換されており、適切な増殖培地中で適当な条件下に培養され、そして所望の遺伝子産物が回収および精製される。
ここに記述した方法によって、本発明の真菌によって分泌されるポリペプチドの収量が大きく増加することがわかった。
さらに、本発明は前記方法によって製造されるポリペプチド産物に関する。
最後に、本発明は前記方法で使用しようとする、アスペルギラス・オリザイ（Aspergillus oryzae）のalp遺伝子配列を含むDNA構成体に関する。
図の簡単な説明
本明細書において、実施例及び次の図を参考にして本発明は詳述される。ここでは：
図１は、HowB101作成に係るステップを示し、
図２は、pJaL212作成に係るステップを示し、
図３は、A.オリザイ（A.oryzae）pJaL125（alp欠失）作成に係るステップを示し、
図４は、pSX320を示し、および
図５は、alpが欠失されていないA.オリザイ株に対して、alpが欠失された本発明の宿主株（A.オリザイpJaL125）における45kDエンドグルカナーゼの生産を示す。
定義
本明細書において、次の定義が用いられる。
alpΔは、alp遺伝子が欠失された株を意味する。
alp-は、機能的Alpポリペプチドを生産しない株、すなわちタンパク質分解活性がないAlpタンパク質を生産する株を意味する。
配列番号１に示したalp配列に関連して用いる、「機能的類似体」という用語は、以下で詳述するある特定の条件で配列番号１に示したDNA配列にハイブリダイズし、そして、少なくとも70%の相同性を示す、アルカリプロテアーゼをコードするDNA配列を意味する。
ヌクレオチドプローブと、相同DNAまたはRNA配列との間の、確定的ハイブリダイゼーションのための適切な条件を次に示す。DNA断片またはRNAを含むフィルターを5X SSC（標準塩化ナトリウムクエン酸液）中で、10分間前もって浸しておく。5Xデンハルト液（Sambrook et al.,ibid）、0.5% SDS、100ug/mlの変性分断化したサケ精子DNA（Sambrook et al.,ibid）を含む5X SSC（Sambrook et al.,1989）中で、プレハイブリダイゼーションする。続いて、ランダムプライムによる32P-dCTP標識プローブ（比活性＞1X109cpm/ug）を含む同上の溶液中で12時間、約45℃でハイブリダイゼーションする（Feinberg,A.P.,Vogelstein,B.1983 Anal.Biochem.132:6-13）。それから、このフィルターを2回、30分間、2X SSC、0.5% SDS中で洗うが、好ましくは50℃以下で、より好ましくは55℃以下、より好ましくは60℃以下、より好ましくは65℃以下、さらにより好ましくは70℃以下、特別には75℃以下で洗う。
本条件下でオリゴヌクレオチドプローブがハイブリダイズする分子は、Ｘ線フィルムで検出される。
前に参照したDNA配列の相同性は、最初の配列が２番目の配列から派生することを示す、２配列間の同一性の程度として決定される。相同性は、GCGプログラムに提供されているGAPなどの、当業界で既知のコンピュータプログラムをもちいて、適切に決定されうる（Needleman,S.B.,and Wunsch,C.D.1970,Journal of Molecular Biology 48:443-453）。DNA配列比較のために、GAPクリエーションペナルティー5.0、GAPエクステンションペナルティー0.3の設定でGAPを用いると、DNA配列のコーディング領域は、配列番号１で示したDNA配列の酵素コード領域に対して、一致の程度として、好ましくは少なくとも70%、より好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも90%、より好ましくは少なくとも95%、より好ましくは少なくとも97%を示す。
発明の詳細な説明
第一の観点として、本発明は、組換えDNAテクノロジーによって修飾され、一つまたは複数の内在性アルカリプロテアーゼ活性が完全または部分的に失活された、異種性ペプチドの製造に有用な、真菌に関する。
遺伝的修飾
当業者に既知の組換えDNAテクノロジーの標準技法を用いて、本発明の真菌は、修飾されうる。アルカリプロテアーゼ生産をになう遺伝子配列は、部分的に失活されるか、または完全に除去されうる。
言い換えれば、本発明の真菌は、アルカリプロテアーゼ活性を低いレベルに発現するか、またはアルカリプロテアーゼ活性を全く発現しないか、または酵素失活したアルカリプロテアーゼを発現する。本発明の一つの観点では、アルカリプロテアーゼ活性のこの様な失活またはレベル低下は、アルカリプロテアーゼ遺伝子産物をコードする配列におけるヌクレオチドの欠失、挿入または置換によって達成されうる。
具体例では、前記の失活は、問題のアルカリプロテアーゼをコードする構造配列または調節配列における修飾によって、例えば、アルカリプロテアーゼ遺伝子の発現を制御する発現シグナルの制御を妨害することによって、達成される。
既知の有用な技術は、特異的またはランダム突然変異、PCRによる突然変異、部位特異的DNA欠失、挿入および／また置換、遺伝子破壊または遺伝子置換、アンチセンス技法、またはこれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない。
突然変異は、適切な物理的または化学的突然変異原を用いて、実施されうる。本目的に適する物理的または化学的変異原の例は、紫外線照射、ヒドロキルアミン、N-メチル-N’-ニトロ-N-ニトロソグアニジン（MNNG）、O-メチルヒドロキシルアミン、亜硝酸、エチルメタンスルホン酸（EMS）、重亜硫酸ナトリウム、蟻酸、ヌクレオチド類似体を含む。これらの変異原が使われる際には、典型的には、選択した変異原の存在下に、突然変異が生じるための適切な条件で、変異させようとする細胞を培養すること、そしてアルカリプロテアーゼの生産レベルが有意に低下した変異細胞を選択することによって、突然変異は達成される。
アルカリプロテアーゼの失活または活性低下を導く修飾もまた、アルカリプロテアーゼのコード配列またはその転写もしくは翻訳に必要な調節エレメントにおいて、１つまたは複数のヌクレオチドの導入、置換または除去によって達成されうる。停止コドンの導入、開始コドンの除去、またはオープンリーディングフレイムの変化を起こすためには、例えば、ヌクレオチドが、挿入または除去されうる。当業界で既知の方法に従い、部位特異的突然変異またはPCRによる突然変異によって、構造配列または調節エレメントの修飾または失活が、達成されうる。原則として、修飾はインビボで、すなわちアルカリプロテアーゼ遺伝子を持つ細胞に対して直接に施されるが、ここでは、インビトロで修飾する方が好まれる。
選択した真菌宿主細胞のアルカリプロテアーゼの生産を喪失させるか、または低下させる便利な方法は、遺伝子中断の原理に基づいている。この方法では、突然変異させようとする標的の、内在性遺伝子または遺伝子断片をコードしているDNA配列を利用する。前記DNA配列が、インビトロで突然変異をうけ、その結果欠陥遺伝子になり、真菌細胞に形質導入される。相同組換えによって、欠陥遺伝子が、内在性遺伝子または遺伝子断片を置換する。注目の形質転換体の選択に用いる遺伝マーカーを含むのが望ましいであろう。
遺伝子欠失または破壊の方法は、特に次の文献に記載されている。Miller et al.,1985,Mol.Cell.Biol.5:1714-1721;WO 90/00192（Genencor）;May G.,1992,Applied Molecular Genetics of Filamentous Fungi pp.1-25,J.R.Kinghorn and G.Turner,Eds.,Blackie Academic and Professional;and,in G.Turner,1994,Vectors for genetic manipulation,pp.641-665,S.D.Martinelli and J.R.Kinghorn,Eds.,Elsevier.
別の方法では、DNA配列の修飾および／または失活は、アルカリプロテアーゼ、例えば配列番号１に示したalp遺伝子のヌクレオチド配列またはその機能的類似体、をコードする配列に相補的なヌクレオチド配列を用いるアンチセンス法によって達成されうる。
アンチセンステクノロジーとその利用は、米国特許5190931号（ニューヨーク大学）に詳述されている。
前記の遺伝的修飾の結果、本発明の真菌は、アルカリプロテアーゼ活性の発現レベルが有意に低下する。好ましい例では、アルカリプロテアーゼ活性レベルは、約50%より大きく、好ましくは約85%より大きく、より好ましくは約90%より大きく、もっとも好ましくは約95%より大きく、低下している。最良の例では、宿主細胞で、実質上アルカリプロテアーゼ活性が検出されない。
本発明の真菌は、pyrG遺伝子、argB遺伝子、sC遺伝子、またはhph遺伝子などの選択マーカーによって置換されたアルカリプロテアーゼ遺伝子を持ちうる。
本発明の具体例では、アルカリプロテアーゼ遺伝子は、配列番号１に示したalp遺伝子、またはその機能的類似体を含んで成る。
Alpは、中性からアルカリ性のpH範囲で最大酵素活性を示すセリンプロテアーゼである。塩基配列から推定すると、成熟型Alpタンパク質は、サブチリシン型のセリンプロテアーゼで、282アミノ酸、およびアミノ末端の近傍に存在する121アミノ酸のプレプロ領域から成る。Alpと、他のサブチリシン型セリンプロテアーゼ間のアミノ酸配列の比較から、Alp内の３アミノ酸残基（Asp41、His72、Ser228）が触媒部位を形成することが示唆される。Ser228がアラニンによって置換される際に見られる、タンパク質分解活性の喪失から、Ser228が触媒部位の一部であることが支持されている（Tatsumi et al.、1991,Agri.Biol.Chem.55:3099-3101）。
宿主真菌
本発明によれば、本真菌は、好ましくは、アスペルギラス（Aspergillus）、トリコデルマ（Trichoderma）、ヒュミコラ（Humicola）、カンジダ（Candida）、アクレモニウム（Acremonium）、フサリウム（Fusarium）およびペニシリウム（Penicillium）から成る群から選択した属に属する。
これらの属の内、A.オリザイ（A.oryzae）、A.ニガー（A.niger）、A.アワモリ（A.awamori）、A.フェニキス（A.phoenicis）、A.ジャポニカス（A.japonicus）、A.フィチダス（A.foetidus）、A.ニデュランス（A.nidulans）、T.リーセイ（T.reesei）、T.ハージアナム（T.harzianum）、H.インスレンス（H.insulens）、H.ラヌギノサ（H.lanuginosa）、F.グラミナルム（F.graminearum）、F.ソラニ（F.solani）、F.ベネナツム（F.venenatum）、P.クリソゲナム（P.chrysogenum）から成る群から選択した種が好ましい。本明細書で説明されるように、これらの各種において、アルカリプロテアーゼの相同遺伝子が失活されうるか、または別の具合に修飾されうる。
一般には、本発明の真菌は形質転換され、所望のタンパク質産物をその真菌は、生産できるようになる。
真菌を形質転換する方法は当業界では周知であり、例えば、EP 0 184 438 A2（Gist-Brocades N.V.）およびEP application no.87103806（Novo Nordisk A/S）を参照できる。
注目の遺伝子産物が宿主細胞に固有であれば、形質転換は必要ないが、しかし、生産を増加するためには、注目のタンパク質をコードする遺伝子の多重コピーを、本発明の真菌に組み込むことは有益であろう。
宿主真菌を作成する方法
本発明の別の観点は、本発明の第一の観点である真菌を作成する方法から成り、ここでは、アルカリプロテアーゼ遺伝子の前記失活は、次のステップによって達成される：
i）真菌宿主細胞からアルカリプロテアーゼ遺伝子の相同体をクローニングし、
ii）内部配列部分がヌクレオチド置換、欠失または挿入により修飾されたアルカリプロテアーゼ遺伝子を含む、DNA構成体を作成し
iii）この構成体を用いて、前記真菌を形質転換し、そして
iv）次のことを示す形質転換体を選択する：
１）検出できないアルカリプロテアーゼ活性、
２）レベルの低下したアルカリプロテアーゼ活性、または
３）酵素失活したアルカリプロテアーゼ。
アルカリプロテアーゼ活性の「低下」という用語は、活性レベルが、突然変異していない対応する株が示す活性より、低いことを意味する。
Alp活性を含むアルカリプロテアーゼの活性は、合成基質N-スクシニル-Ala-Ala-Pro-Phe−パラニトロアニリド（Sigma Chemical Co.）を用いて測定できる。活性は、1mMの基質を含む20mMトリス塩酸pH8.0の反応液1ml中で、25℃で測定される。パラニトロアニリンの遊離は410nmの吸光で測定される（Ramesh et al,1994,Infection and Immunity,Jan.79-85）。
前記ステップi）において問題としたアルカリプロテアーゼ遺伝子の相同体は、以前同定されたアルカリプロテアーゼ遺伝子を用いたクロスハイブリダイゼーションによるか、またはアルカリプロテアーゼ変異体の補完によって、クローン化できる。
測定されうるアルカリプロテアーゼの活性が見られないのは、アルカリプロテアーゼ遺伝子産物の合成に必要な配列における欠失に起因するかもしれない。
アルカリプロテアーゼの活性レベルの低下は、全てのアルカリプロテアーゼ遺伝子の不完全な失活か、または機能低下したアルカリプロテアーゼ遺伝子産物の発現に起因するかもしれない。
前記クローニングにおいては、DNA構成体は、アルカリプロテアーゼ遺伝子内に組み込まれる様に作成されうるか、または、そのアルカリプロテアーゼ遺伝子が除去され、そしてpyrG遺伝子、argB遺伝子、sC遺伝子、またはhph遺伝子など別な遺伝子によって置換されうる。
その遺伝子がalp遺伝子の場合、単離された形質転換体は、alp-またはalpΔであろう。
本発明のもう一つの観点は、真菌を作成する方法に関し、ここでは、アンチセンステクノロジーを用いることによって失活が得られ、この様な方法は、次のステップを含んで成る：
i）アルカリプロテアーゼ遺伝子から転写したmRNAに相補的なRNA分子の合成を導く発現プラスミドの作成、
ii）前記発現プラスミド、および別のプラスミドまたは同じプラスミド上に存在する適切なマーカーを用いた、宿主真菌細胞の形質転換、
iii）前記マーカーを使った、形質転換体の選択、そして
iv）アルカリプロテアーゼ遺伝子産物の合成が低下した形質転換体のスクリーニング。
さらに、本発明の観点は、前記方法で使用したDNA構成体を含む。
本発明のDNA構成体に関する方法について、前記DNA構成体は、alp遺伝子などのアルカリプロテアーゼ遺伝子を含んでよく、ここでは、その内部配外の一部は、ヌクレオチド置換、欠失、または挿入によって修飾されている。
DNA構成体はさらにまた、下記のような注目のポリペプチド産物をコードする配列を含みうる。
前記アンチセンス法に関し、DNA構成体は、機能的プロモーターに連結したアルカリプロテアーゼ遺伝子の逆方向DNA配列を含んでよく、ここでは、そのmRNAは、アルカリプロテアーゼ遺伝子からできるmRNAに少なくとも部分的に相補的である。
方法
さらに本発明の観点は、異種性ポリペプチド、好ましくは分泌性の遺伝子産物の製造方法に関し、ここでは、本発明の真菌は、適切な増殖培地で、適当な条件下に培養され、そこから所望の遺伝子産物が回収および精製される。
酵素などの異種性ポリペプチドを製造する際には、発酵pHの選択は、使用される宿主細胞、その細胞が要求する増殖培地、ポリペプチドの安定性などの因子に、しばしば左右される。従って、本発明の真菌は、いかなるpHで行われる、いかなる発酵にも用いられうるが、宿主が生産する内在性の酸性および／または中性プロテアーゼの活性が失活するか、または少なくとも有意に低下するpHにおいて発酵が実施されるのが有益である。よって、例えばpH5から11、例えば、pH6から10.5、pH7から10、pH8から9.5で発酵が実施されれば、酸性プロテアーゼ（アスパラギン酸およびセリンプロテアーゼなど）の活性レベルが低下するか、失活さえするかもしれない。7以上のpH範囲では、中性プロテアーゼも同様である。従って、WO 90/00192記載のように、アスパラギン酸プロテアーゼの除去は、製造収量に限られた影響だけを与えるであろう。
しかし、アルカリのpH範囲では、修飾されていない宿主細胞のアルカリプロテアーゼが活性を持ち、注目のポリペプチド産物の分解の主要因になるかもしれない。従って、この様な場合、アルカリプロテアーゼ活性をコードする遺伝子の失活は、特に有益である。
様々な真菌間で、酸性、中性およびアルカリ性プロテアーゼの活性は多様であるので、本発明のアルカリプロテアーゼ遺伝子の失活はまた、ある種の宿主に特に有効である。例えば、アスペルギラス・オリザイのアルカリプロテアーゼ活性はアスペルギラス・ニガーのものより高い。
前記のアルカリのpH範囲で発酵条件下に製造できる酵素例は、エンドグルカナーゼ、フィターゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、クチナーゼ、セルラーゼ、キモシン、ペルオキシダーゼ、およびタンパク質ジスルフィドイソメラーゼを含む。
所望の異種性ポリペプチドは、下記を含む常法により培地から回収されうる。必要なら細胞破壊後、遠心または濾過を用いて培地から細胞を分離する。硫酸アンモニウムなどの塩を用いて、上清または濾過液のタンパク質成分を沈殿させる。その後、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどの様々なクロマトグラフィー法を用いて精製する。
異種性ポリペプチド
本発明の状況において、所望のポリペプチドは、「異種性ポリペプチド」であり、それは、本発明の真菌宿主細胞に固有ではないポリペプチド、固有であるが、その固有な配列を変化させる様に修飾されたポリペプチド（すなわち、遺伝子多型）、または、組換えDNAテクノロジーによる、プロモーター、リボソーム結合部位など固有ポリペプチドの発現に必要な固有な調節配列への操作か、または本発明の真菌へのその他の操作の結果、発現が量的に変化した固有なポリペプチド、を意味する。
本発明の真菌が発現する異種性ポリペプチドはまた、前駆体タンパク質、すなわち酵素前駆体、融合タンパク質、プロ配列もしくはプレプロ配列としてか、またはその他未成熟な状態で得られるタンパク質でもよい。
好ましい別の具体例では、産物は、酵素である；特に、グリコシダーゼ、例えば、アミラーゼ、特にα-アミラーゼまたはβ-アミラーゼ；セルラーゼ、特にエンド-1,4-β-グルカナーゼ（EC 3.2.1.4）またはエンド-1,3-β-グルカナーゼ（EC 3.2.1.6）；キシラナーゼ、特にエンド-1,4-β-キシラナーゼ（EC 3.2.1.8）またはキシラン-エンド-1,3-β-キシロシダーゼ（EC 3.2.1.32）；α-ガラクトシダーゼ（EC 3.2.1.22）；ポリガラクツロナーゼ（EC 3.2.1.15）；セルロース1,4-β-セロビオシダーゼ（EC 3.2.1.91）；およびエンドグルカナーゼ、特にエンド-1,6-β-グルカナーゼ（EC 3.2.1.75）、エンド-1,2-β-グルカナーゼ（EC 3.2.1.71）、エンド-1,3-β-グルカナーゼ（EC 3.2.1.39）またはエンド-1,3-α-グルカナーゼ（EC 3.2.1.59）。
好ましい具体例では、産物は、真核生物のポリペプチドである。例えば、インスリン、成長ホルモン、グルカゴン、ソマトスタチン、インターフェロン、PDGF、第VII因子、第VIII因子、ウロキナーゼ、エリスロポエチン、キモシン、組織プラスミノーゲンアクチベーター、血清アルブミン、トロンボポエチン。
好ましい別の具体例では、産物は、真菌由来のタンパク質である。好ましい具体例では、産物は、真菌の酵素である。例えば、でんぷん分解酵素、例えばα-アミラーゼ、β-アミラーゼ、グルコアミラーゼ、β-ガラクトシダーゼ、フィターゼ、セルロース分解酵素、脂質分解酵素、キシラン分解酵素、タンパク質分解酵素、酸化還元酵素、例えばペルオキシダーゼまたはラッカーゼ、ペクチナーゼ、クチナーゼ、およびタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ。
好ましいさらに別の具体例では、産物は、細菌のタンパク質である。好ましい具体例では、産物は、細菌の酵素である。特に、でんぷん分解酵素、例えばα-アミラーゼまたはβ-アミラーゼ；グルコアミラーゼ；β-ガラクトシダーゼ；セルロース分解酵素；脂質分解酵素；およびタンパク質分解酵素。
好ましい融合ポリペプチドは、プロキモシンおよびプロトリプシン様プロテアーゼである。
本発明は、以下に示す実施例において、より詳述される。しかし、これらは、添付した請求項に規定された本発明の範囲を限定するように、解釈されるべきでは決してない。
実施例
材料と方法
細胞株
アスペルギラス・オリザイ IFO 4177：発酵研究所、大阪から入手可能、日本大阪市淀川区十三本町２丁目17-25。
JaL125：この株の構造は例中に記述する。
遺伝子
alp：この遺伝子は配列番号１に示すアルカリプロテアーゼをコードする。
pyrG：この遺伝子は、ウリジンの生合成に関係する酵素、オロチジン-5’-リン酸デカルボキシラーゼをコードする。
プラスミド
pSO2：例１に従い調製される。
pSO5：例１に従いpSO2から調製される。
pSRe403：例１に従い調製される。
pSX320：このプラスミドの構造はEP 0 531 372B1に記述されている。
pToC90：p3SR2のサブクローンで、アスペルギラス・ニデュランスのamdS遺伝子を2.7kbのXbaI断片（Corrick et al.,1987,Gene 53:63-71）としてpUC19ベクター（Yannisch-Perron et al,,1985,Gene 33:103-119）に連結し、WO 91/17243に記述どおり調製される。
Bluescript SK-:M.A.Alting-Mees and Short,J.M.,1989,Nucleic Acids Res.17:9494-9494
pUC18及びpUC118:Viera and Messing,1987,J.Meth.Enzymol.153:3-11
例１
アスペルギラス・オリザイのアルカリプロテアーゼのゲノム欠失
alp遺伝子を一段階置換法によって欠失させた。（G.May,Applied Molecular Genetics of Filamentous Fungi,1992,pp.1-25.J.R.Kinghorn and G.Turner,Eds.;Blackie Academic and Professional）。使用したマーカーはA.オリザイのpyrG遺伝子で；使用したA.オリザイ株はpyrG-株であった。
アスペルギラス・オリザイのpyrG遺伝子のクローニング
A.オリザイのpyrG遺伝子を、A.ニガーのpyrG遺伝子とのクロスハイブリダイゼーションによって単離した（W.van Hartingsveldt et al.,1987,Mol.Gen.Genet.206:71-75）。SauIIIAで部分分解したA.オリザイIFO 4177のDNAからなるラムダライブラリーを、低いストリンジェンシーで、A.ニガーのpyrG遺伝子の1kb DNA断片をプローブに用いて、探索した。一つの陽性クローンから得たDNAを、pUC118ベクターにサブクローニングした。得られたプラスミド、pSO2は、A.ニガーのpyrG遺伝子変異株を用いた補完から、pyrG遺伝子を含んでいることが示された。
アスペルギラス・オリザイのpyrGマイナス株の作成
両端に約1kbのpyrGのフランキング配列を含んだ、pyrG欠失プラスミドpSO5を、プラスミドpSO2から作成した。A.オリザイIFO 4177を、この構成体を用いて形質転換し、そして、その形質転換体を、pyrG変異体に特徴的な表現型である5-フルオロ-オロト酸に対する耐性によって選択した。サザン分析から、一つの形質転換体HowB101が、pyrGの遺伝子座に期待した欠失をもつことが示された。pyrG変異体であるから、HowB101は増殖にウリジンを要求する。ウリジン非存在下に増殖する能力を選択することで、HowB101株を、野生型pyrG遺伝子によって形質転換することができる。
HowB101の作成に係るステップを図１に示す。
アスペルギラス・オリザイのalpマイナス株の作成
アスペルギラス・オリザイのalp-株は、A.オリザイ株HowB101を、alp欠失プラスミドpJaL212によって形質転換して作成した。
アルカリプロテアーゼ破壊プラスミドpJaL212の作成
Sau3Aで部分分解したゲノムDNAから、A.オリザイIFO 4177ゲノムライブラリーを作成した。断片を、BamHIで切断したpUC19に連結した。アルカリプロテアーゼ遺伝子産物の既知のタンパク質配列断片に対応する、縮重したオリゴヌクレオチドを用いて、ライブラリーをスクリーニングした。この様にして、3.9kbのSau3A断片を含むプラスミドを単離した。このプラスミドをpSRe403と名付けた。
pSRe403をSacIIで切断し、そしてその5.6kb断片を単離および再結合し、pSRe403_SacIIを作成した。pUC19中のHindIII部位を除くために、このプラスミドをHindIIIで部分切断し、末端をクレノーポリメラーゼによって埋め、そして再結合した。できたプラスミドをpJaL173と名付けた。pJaL173をHindIIIで切断し、pSO2のpyrG遺伝子を含む3.8kbのHindIII断片を、pJaL173に挿入し、pJaL212を作成した。pJaL212の作成を図２で概説する。
A.オリザイのalpマイナス株の単離
常法に従い、pJaL212の6.8kbのSacI-SphI断片によって、A.オリザイHowB101株を形質転換した。この断片は、1.5kbのalpプロモーター、pyrG遺伝子、および1.5kbのalp遺伝子の３’末端から成る。ウリジン非存在下に増殖する能力により、形質転換体を選択した。再単離後、12の形質転換体から染色体DNAを調製し、そのDNAをPstIで切断し、そして、放射性標識プローブとして、alp遺伝子部分を含むpJaL173のPstI/SacIIの599bp断片を用いて、サザン分析した。alp遺伝子の欠失を持つ形質転換体は、1.0kbの野生型のPstIバンドの1.9kbへのシフトによって容易に認識される。
４つの形質転換体において、1.0kbのPstIバンドが1.9kbへシフトした。それらの形質転換体の一つをJaL125と名付けた。
JaL125の作成に係るステップを図３に示す。
例２
A.オリザイ株JaL125における45kDエンドグルカナーゼの生産
ヒュミコラ・インソレンス（Humicola insolens）の45kDエンドグルカナーゼの真菌用発現プラスミドであるプラスミドpSX320（図４）を用いて、pToC90との同時形質転換により、A.オリザイIFO 4177およびJaL125を形質転換した。プラスミドpSX320の作成は、EP 0 531 372に以前より記載されていた。
形質転換体は、10mMアセトアミドを含んだ最小培地上での増殖により選択し、そしてCarezyme▲Ｒ▼を生産する能力によって、pSX320の存在についてスクリーニングした。
各株から一つの形質転換体を選択し、マルトデキストリン、ダイズミール、およびペプトン100mlを含んだ振とうフラスコで、30℃で５日間培養した。発酵ブロスのサンプルを毎日採取し、そしてSDS-PAGEで分析した。45kDエンドグルカナーゼの収量は、ゲルスキャニングシステムバイオイメージ（BioImage System,UK）を使用して、クマシーブルー染色したタンパク質バンドから定量した。結果を図５に示す。その結果から、alp遺伝子を含む野生型株に比べると、alp遺伝子が欠失された株の発酵ブロス中に、より多くの45kDエンドグルカナーゼが存在することが示唆される。これより、alp遺伝子を欠失することで、エンドグルカナーゼの安定性が増加することが示唆される。
配列表
（１）一般情報：
（ii）発明の名称：新規な微生物
（iii）配列の数：１
（２）配列番号１の情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ：3922塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）ストランド：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（ii）遺伝子型：cDNA
（vi）起源：
（Ｂ）株：アスペルギラス・オリザイA01560
（ix）特徴：
（Ａ）名称／キー：エクソン
（Ｂ）位置：2310..2634
（ix）特徴：
（Ａ）名称／キー：エクソン
（Ｂ）位置：2684..3129
（ix）特徴：
（Ａ）名称／キー：エクソン
（Ｂ）位置：3188..3276
（ix）特徴：
（Ａ）名称／キー：エクソン
（Ｂ）位置：3333..3686
（xi）配列記載：配列番号１：
本発明は、新規な真菌宿主細胞およびタンパク質製造の方法に関する。さらに詳しくは、本発明は、異種性タンパク質の発現のために有用である宿主細胞に関し、ここで、この宿主細胞は、アルカリプロテアーゼ活性の発現レベルを有意に低下させる様に、遺伝的に修飾されている。本発明はさらに、本発明の真菌を用いて高収量に、注目するタンパク質を製造する方法に関し、ここで、この方法は、適切な増殖培地での宿主細胞の培養、それに続く、所望するタンパク質の回収を含む。本発明はまた、これらの方法で用いられる真菌およびDNA構成体を作成する方法も含む。
発明の背景
真菌、および特に糸状真菌は、細胞外に分泌されるタンパク質の発現のために、宿主細胞として広く工業的に用いられている。特に、アスペルギラス（Aspergillus）属に属する種は、内在性タンパク質および、最近では異種性タンパク質製造のために、工業的に使用されてきた長い歴史をもつ。
宿主細胞として用いる微生物に、頻繁に見られる一つの問題は、タンパク質分解により、注目するタンパク質産物の収量低下を引き起こすタンパク質分解酵素の、固有な生産および高レベルな分泌である。
これを解決する多様な方法が考案されてきた。例えば、多種類の内在性プロテアーゼをコードする遺伝子を除去、または破壊できる。WO 90/00192（Genencor Inc.）は、酵素活性のあるアスパラギン酸プロテアーゼの分泌を不可能にした、糸状真菌宿主の変異株を記載している。この変異では、異種性ポリペプチドであるウシのキモシンの収量が増加したことが示された。EP 574 347（Ciba Geigy AG）は、サブチリシン型のセリンプロテアーゼを欠失したアスペルギラス属の宿主を記載している。
しかし、真菌は、ここで述べた２つに加え、多数のプロテアーゼを生産することが良く知られている。従って、その他のプロテアーゼに由来するタンパク質分解活性が存在しないか、または非常に低い、糸状真菌株が未だに必要とされている。
発明の概要
異種性ポリペプチド産物を製造するための糸状真菌宿主細胞を提供することが、本発明の目的であり、ここでは、この細胞は、親細胞に比べて、内在性アルカリプロテアーゼ活性の発現レベルを有意に低くするために、遺伝的に修飾されている。
本発明は、この様な修飾された真菌に関し、ここでは、アルカリプロテアーゼ活性をコードする少なくとも一つの遺伝子の転写および／または翻訳が、完全または部分的に阻害されている。
本発明によれば、組換えDNAテクノロジーを用いて、この目的を達成しうる。ここでは、問題の真菌アルカリプロテアーゼ活性をコードする遺伝子配列は欠失されるか、または変異され、その結果、プロテアーゼ発現レベルの低下か、または活性レベルが低いプロテアーゼの発現が起きている。
具体例では、アルカリプロテアーゼ遺伝子は、配列番号１に示され、且つ、Murakami,K.,et al.,1991,Agric.Biol.Chem.55:2807-2811に記載されているalp遺伝子である。
さらに本発明は、この様な真菌を作成する方法に関し、ここではアルカリプロテアーゼ遺伝子の失活は、アルカリプロテアーゼ遺伝子におけるヌクレオチド置換、欠失または挿入によって得られる。
本発明はまた、本発明の真菌宿主細胞を用いて、異種性ポリペプチドを製造する方法にも関する。特に、分泌性ポリペプチドが意図され、ここでは、真菌宿主細胞は、少なくとも、注目するポリペプチドまたは遺伝子産物をコードするDNA配列を含むDNA構成体を用いて修飾され、そして随意に形質転換されており、適切な増殖培地中で適当な条件下に培養され、そして所望の遺伝子産物が回収および精製される。
ここに記述した方法によって、本発明の真菌によって分泌されるポリペプチドの収量が大きく増加することがわかった。
さらに、本発明は前記方法によって製造されるポリペプチド産物に関する。
最後に、本発明は前記方法で使用しようとする、アスペルギラス・オリザイ（Aspergillus oryzae）のalp遺伝子配列を含むDNA構成体に関する。
図の簡単な説明
本明細書において、実施例及び次の図を参考にして本発明は詳述される。ここでは：
図１は、HowB101作成に係るステップを示し、
図２は、pJaL212作成に係るステップを示し、
図３は、A.オリザイ（A.oryzae）pJaL125（alp欠失）作成に係るステップを示し、
図４は、pSX320を示し、および
図５は、alpが欠失されていないA.オリザイ株に対して、alpが欠失された本発明の宿主株（A.オリザイpJaL125）における45kDエンドグルカナーゼの生産を示す。
定義
本明細書において、次の定義が用いられる。
alpΔは、alp遺伝子が欠失された株を意味する。
alp-は、機能的Alpポリペプチドを生産しない株、すなわちタンパク質分解活性がないAlpタンパク質を生産する株を意味する。
配列番号１に示したalp配列に関連して用いる、「機能的類似体」という用語は、以下で詳述するある特定の条件で配列番号１に示したDNA配列にハイブリダイズし、そして、少なくとも70%の相同性を示す、アルカリプロテアーゼをコードするDNA配列を意味する。
ヌクレオチドプローブと、相同DNAまたはRNA配列との間の、確定的ハイブリダイゼーションのための適切な条件を次に示す。DNA断片またはRNAを含むフィルターを5X SSC（標準塩化ナトリウムクエン酸液）中で、10分間前もって浸しておく。5Xデンハルト液（Sambrook et al.,ibid）、0.5% SDS、100ug/mlの変性分断化したサケ精子DNA（Sambrook et al.,ibid）を含む5X SSC（Sambrook et al.,1989）中で、プレハイブリダイゼーションする。続いて、ランダムプライムによる32P-dCTP標識プローブ（比活性＞1X109cpm/ug）を含む同上の溶液中で12時間、約45℃でハイブリダイゼーションする（Feinberg,A.P.,Vogelstein,B.1983 Anal.Biochem.132:6-13）。それから、このフィルターを2回、30分間、2X SSC、0.5% SDS中で洗うが、好ましくは50℃以下で、より好ましくは55℃以下、より好ましくは60℃以下、より好ましくは65℃以下、さらにより好ましくは70℃以下、特別には75℃以下で洗う。
本条件下でオリゴヌクレオチドプローブがハイブリダイズする分子は、Ｘ線フィルムで検出される。
前に参照したDNA配列の相同性は、最初の配列が２番目の配列から派生することを示す、２配列間の同一性の程度として決定される。相同性は、GCGプログラムに提供されているGAPなどの、当業界で既知のコンピュータプログラムをもちいて、適切に決定されうる（Needleman,S.B.,and Wunsch,C.D.1970,Journal of Molecular Biology 48:443-453）。DNA配列比較のために、GAPクリエーションペナルティー5.0、GAPエクステンションペナルティー0.3の設定でGAPを用いると、DNA配列のコーディング領域は、配列番号１で示したDNA配列の酵素コード領域に対して、一致の程度として、好ましくは少なくとも70%、より好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも90%、より好ましくは少なくとも95%、より好ましくは少なくとも97%を示す。
発明の詳細な説明
第一の観点として、本発明は、組換えDNAテクノロジーによって修飾され、一つまたは複数の内在性アルカリプロテアーゼ活性が完全または部分的に失活された、異種性ペプチドの製造に有用な、真菌に関する。
遺伝的修飾
当業者に既知の組換えDNAテクノロジーの標準技法を用いて、本発明の真菌は、修飾されうる。アルカリプロテアーゼ生産をになう遺伝子配列は、部分的に失活されるか、または完全に除去されうる。
言い換えれば、本発明の真菌は、アルカリプロテアーゼ活性を低いレベルに発現するか、またはアルカリプロテアーゼ活性を全く発現しないか、または酵素失活したアルカリプロテアーゼを発現する。本発明の一つの観点では、アルカリプロテアーゼ活性のこの様な失活またはレベル低下は、アルカリプロテアーゼ遺伝子産物をコードする配列におけるヌクレオチドの欠失、挿入または置換によって達成されうる。
具体例では、前記の失活は、問題のアルカリプロテアーゼをコードする構造配列または調節配列における修飾によって、例えば、アルカリプロテアーゼ遺伝子の発現を制御する発現シグナルの制御を妨害することによって、達成される。
既知の有用な技術は、特異的またはランダム突然変異、PCRによる突然変異、部位特異的DNA欠失、挿入および／また置換、遺伝子破壊または遺伝子置換、アンチセンス技法、またはこれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない。
突然変異は、適切な物理的または化学的突然変異原を用いて、実施されうる。本目的に適する物理的または化学的変異原の例は、紫外線照射、ヒドロキルアミン、N-メチル-N’-ニトロ-N-ニトロソグアニジン（MNNG）、O-メチルヒドロキシルアミン、亜硝酸、エチルメタンスルホン酸（EMS）、重亜硫酸ナトリウム、蟻酸、ヌクレオチド類似体を含む。これらの変異原が使われる際には、典型的には、選択した変異原の存在下に、突然変異が生じるための適切な条件で、変異させようとする細胞を培養すること、そしてアルカリプロテアーゼの生産レベルが有意に低下した変異細胞を選択することによって、突然変異は達成される。
アルカリプロテアーゼの失活または活性低下を導く修飾もまた、アルカリプロテアーゼのコード配列またはその転写もしくは翻訳に必要な調節エレメントにおいて、１つまたは複数のヌクレオチドの導入、置換または除去によって達成されうる。停止コドンの導入、開始コドンの除去、またはオープンリーディングフレイムの変化を起こすためには、例えば、ヌクレオチドが、挿入または除去されうる。当業界で既知の方法に従い、部位特異的突然変異またはPCRによる突然変異によって、構造配列または調節エレメントの修飾または失活が、達成されうる。原則として、修飾はインビボで、すなわちアルカリプロテアーゼ遺伝子を持つ細胞に対して直接に施されるが、ここでは、インビトロで修飾する方が好まれる。
選択した真菌宿主細胞のアルカリプロテアーゼの生産を喪失させるか、または低下させる便利な方法は、遺伝子中断の原理に基づいている。この方法では、突然変異させようとする標的の、内在性遺伝子または遺伝子断片をコードしているDNA配列を利用する。前記DNA配列が、インビトロで突然変異をうけ、その結果欠陥遺伝子になり、真菌細胞に形質導入される。相同組換えによって、欠陥遺伝子が、内在性遺伝子または遺伝子断片を置換する。注目の形質転換体の選択に用いる遺伝マーカーを含むのが望ましいであろう。
遺伝子欠失または破壊の方法は、特に次の文献に記載されている。Miller et al.,1985,Mol.Cell.Biol.5:1714-1721;WO 90/00192（Genencor）;May G.,1992,Applied Molecular Genetics of Filamentous Fungi pp.1-25,J.R.Kinghorn and G.Turner,Eds.,Blackie Academic and Professional;and,in G.Turner,1994,Vectors for genetic manipulation,pp.641-665,S.D.Martinelli and J.R.Kinghorn,Eds.,Elsevier.
別の方法では、DNA配列の修飾および／または失活は、アルカリプロテアーゼ、例えば配列番号１に示したalp遺伝子のヌクレオチド配列またはその機能的類似体、をコードする配列に相補的なヌクレオチド配列を用いるアンチセンス法によって達成されうる。
アンチセンステクノロジーとその利用は、米国特許5190931号（ニューヨーク大学）に詳述されている。
前記の遺伝的修飾の結果、本発明の真菌は、アルカリプロテアーゼ活性の発現レベルが有意に低下する。好ましい例では、アルカリプロテアーゼ活性レベルは、約50%より大きく、好ましくは約85%より大きく、より好ましくは約90%より大きく、もっとも好ましくは約95%より大きく、低下している。最良の例では、宿主細胞で、実質上アルカリプロテアーゼ活性が検出されない。
本発明の真菌は、pyrG遺伝子、argB遺伝子、sC遺伝子、またはhph遺伝子などの選択マーカーによって置換されたアルカリプロテアーゼ遺伝子を持ちうる。
本発明の具体例では、アルカリプロテアーゼ遺伝子は、配列番号１に示したalp遺伝子、またはその機能的類似体を含んで成る。
Alpは、中性からアルカリ性のpH範囲で最大酵素活性を示すセリンプロテアーゼである。塩基配列から推定すると、成熟型Alpタンパク質は、サブチリシン型のセリンプロテアーゼで、282アミノ酸、およびアミノ末端の近傍に存在する121アミノ酸のプレプロ領域から成る。Alpと、他のサブチリシン型セリンプロテアーゼ間のアミノ酸配列の比較から、Alp内の３アミノ酸残基（Asp41、His72、Ser228）が触媒部位を形成することが示唆される。Ser228がアラニンによって置換される際に見られる、タンパク質分解活性の喪失から、Ser228が触媒部位の一部であることが支持されている（Tatsumi et al.、1991,Agri.Biol.Chem.55:3099-3101）。
宿主真菌
本発明によれば、本真菌は、好ましくは、アスペルギラス（Aspergillus）、トリコデルマ（Trichoderma）、ヒュミコラ（Humicola）、カンジダ（Candida）、アクレモニウム（Acremonium）、フサリウム（Fusarium）およびペニシリウム（Penicillium）から成る群から選択した属に属する。
これらの属の内、A.オリザイ（A.oryzae）、A.ニガー（A.niger）、A.アワモリ（A.awamori）、A.フェニキス（A.phoenicis）、A.ジャポニカス（A.japonicus）、A.フィチダス（A.foetidus）、A.ニデュランス（A.nidulans）、T.リーセイ（T.reesei）、T.ハージアナム（T.harzianum）、H.インスレンス（H.insulens）、H.ラヌギノサ（H.lanuginosa）、F.グラミナルム（F.graminearum）、F.ソラニ（F.solani）、F.ベネナツム（F.venenatum）、P.クリソゲナム（P.chrysogenum）から成る群から選択した種が好ましい。本明細書で説明されるように、これらの各種において、アルカリプロテアーゼの相同遺伝子が失活されうるか、または別の具合に修飾されうる。
一般には、本発明の真菌は形質転換され、所望のタンパク質産物をその真菌は、生産できるようになる。
真菌を形質転換する方法は当業界では周知であり、例えば、EP 0 184 438 A2（Gist-Brocades N.V.）およびEP application no.87103806（Novo Nordisk A/S）を参照できる。
注目の遺伝子産物が宿主細胞に固有であれば、形質転換は必要ないが、しかし、生産を増加するためには、注目のタンパク質をコードする遺伝子の多重コピーを、本発明の真菌に組み込むことは有益であろう。
宿主真菌を作成する方法
本発明の別の観点は、本発明の第一の観点である真菌を作成する方法から成り、ここでは、アルカリプロテアーゼ遺伝子の前記失活は、次のステップによって達成される：
i）真菌宿主細胞からアルカリプロテアーゼ遺伝子の相同体をクローニングし、
ii）内部配列部分がヌクレオチド置換、欠失または挿入により修飾されたアルカリプロテアーゼ遺伝子を含む、DNA構成体を作成し
iii）この構成体を用いて、前記真菌を形質転換し、そして
iv）次のことを示す形質転換体を選択する：
１）検出できないアルカリプロテアーゼ活性、
２）レベルの低下したアルカリプロテアーゼ活性、または
３）酵素失活したアルカリプロテアーゼ。
アルカリプロテアーゼ活性の「低下」という用語は、活性レベルが、突然変異していない対応する株が示す活性より、低いことを意味する。
Alp活性を含むアルカリプロテアーゼの活性は、合成基質N-スクシニル-Ala-Ala-Pro-Phe−パラニトロアニリド（Sigma Chemical Co.）を用いて測定できる。活性は、1mMの基質を含む20mMトリス塩酸pH8.0の反応液1ml中で、25℃で測定される。パラニトロアニリンの遊離は410nmの吸光で測定される（Ramesh et al,1994,Infection and Immunity,Jan.79-85）。
前記ステップi）において問題としたアルカリプロテアーゼ遺伝子の相同体は、以前同定されたアルカリプロテアーゼ遺伝子を用いたクロスハイブリダイゼーションによるか、またはアルカリプロテアーゼ変異体の補完によって、クローン化できる。
測定されうるアルカリプロテアーゼの活性が見られないのは、アルカリプロテアーゼ遺伝子産物の合成に必要な配列における欠失に起因するかもしれない。
アルカリプロテアーゼの活性レベルの低下は、全てのアルカリプロテアーゼ遺伝子の不完全な失活か、または機能低下したアルカリプロテアーゼ遺伝子産物の発現に起因するかもしれない。
前記クローニングにおいては、DNA構成体は、アルカリプロテアーゼ遺伝子内に組み込まれる様に作成されうるか、または、そのアルカリプロテアーゼ遺伝子が除去され、そしてpyrG遺伝子、argB遺伝子、sC遺伝子、またはhph遺伝子など別な遺伝子によって置換されうる。
その遺伝子がalp遺伝子の場合、単離された形質転換体は、alp-またはalpΔであろう。
本発明のもう一つの観点は、真菌を作成する方法に関し、ここでは、アンチセンステクノロジーを用いることによって失活が得られ、この様な方法は、次のステップを含んで成る：
i）アルカリプロテアーゼ遺伝子から転写したmRNAに相補的なRNA分子の合成を導く発現プラスミドの作成、
ii）前記発現プラスミド、および別のプラスミドまたは同じプラスミド上に存在する適切なマーカーを用いた、宿主真菌細胞の形質転換、
iii）前記マーカーを使った、形質転換体の選択、そして
iv）アルカリプロテアーゼ遺伝子産物の合成が低下した形質転換体のスクリーニング。
さらに、本発明の観点は、前記方法で使用したDNA構成体を含む。
本発明のDNA構成体に関する方法について、前記DNA構成体は、alp遺伝子などのアルカリプロテアーゼ遺伝子を含んでよく、ここでは、その内部配外の一部は、ヌクレオチド置換、欠失、または挿入によって修飾されている。
DNA構成体はさらにまた、下記のような注目のポリペプチド産物をコードする配列を含みうる。
前記アンチセンス法に関し、DNA構成体は、機能的プロモーターに連結したアルカリプロテアーゼ遺伝子の逆方向DNA配列を含んでよく、ここでは、そのmRNAは、アルカリプロテアーゼ遺伝子からできるmRNAに少なくとも部分的に相補的である。
方法
さらに本発明の観点は、異種性ポリペプチド、好ましくは分泌性の遺伝子産物の製造方法に関し、ここでは、本発明の真菌は、適切な増殖培地で、適当な条件下に培養され、そこから所望の遺伝子産物が回収および精製される。
酵素などの異種性ポリペプチドを製造する際には、発酵pHの選択は、使用される宿主細胞、その細胞が要求する増殖培地、ポリペプチドの安定性などの因子に、しばしば左右される。従って、本発明の真菌は、いかなるpHで行われる、いかなる発酵にも用いられうるが、宿主が生産する内在性の酸性および／または中性プロテアーゼの活性が失活するか、または少なくとも有意に低下するpHにおいて発酵が実施されるのが有益である。よって、例えばpH5から11、例えば、pH6から10.5、pH7から10、pH8から9.5で発酵が実施されれば、酸性プロテアーゼ（アスパラギン酸およびセリンプロテアーゼなど）の活性レベルが低下するか、失活さえするかもしれない。7以上のpH範囲では、中性プロテアーゼも同様である。従って、WO 90/00192記載のように、アスパラギン酸プロテアーゼの除去は、製造収量に限られた影響だけを与えるであろう。
しかし、アルカリのpH範囲では、修飾されていない宿主細胞のアルカリプロテアーゼが活性を持ち、注目のポリペプチド産物の分解の主要因になるかもしれない。従って、この様な場合、アルカリプロテアーゼ活性をコードする遺伝子の失活は、特に有益である。
様々な真菌間で、酸性、中性およびアルカリ性プロテアーゼの活性は多様であるので、本発明のアルカリプロテアーゼ遺伝子の失活はまた、ある種の宿主に特に有効である。例えば、アスペルギラス・オリザイのアルカリプロテアーゼ活性はアスペルギラス・ニガーのものより高い。
前記のアルカリのpH範囲で発酵条件下に製造できる酵素例は、エンドグルカナーゼ、フィターゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、クチナーゼ、セルラーゼ、キモシン、ペルオキシダーゼ、およびタンパク質ジスルフィドイソメラーゼを含む。
所望の異種性ポリペプチドは、下記を含む常法により培地から回収されうる。必要なら細胞破壊後、遠心または濾過を用いて培地から細胞を分離する。硫酸アンモニウムなどの塩を用いて、上清または濾過液のタンパク質成分を沈殿させる。その後、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどの様々なクロマトグラフィー法を用いて精製する。
異種性ポリペプチド
本発明の状況において、所望のポリペプチドは、「異種性ポリペプチド」であり、それは、本発明の真菌宿主細胞に固有ではないポリペプチド、固有であるが、その固有な配列を変化させる様に修飾されたポリペプチド（すなわち、遺伝子多型）、または、組換えDNAテクノロジーによる、プロモーター、リボソーム結合部位など固有ポリペプチドの発現に必要な固有な調節配列への操作か、または本発明の真菌へのその他の操作の結果、発現が量的に変化した固有なポリペプチド、を意味する。
本発明の真菌が発現する異種性ポリペプチドはまた、前駆体タンパク質、すなわち酵素前駆体、融合タンパク質、プロ配列もしくはプレプロ配列としてか、またはその他未成熟な状態で得られるタンパク質でもよい。
好ましい別の具体例では、産物は、酵素である；特に、グリコシダーゼ、例えば、アミラーゼ、特にα-アミラーゼまたはβ-アミラーゼ；セルラーゼ、特にエンド-1,4-β-グルカナーゼ（EC 3.2.1.4）またはエンド-1,3-β-グルカナーゼ（EC 3.2.1.6）；キシラナーゼ、特にエンド-1,4-β-キシラナーゼ（EC 3.2.1.8）またはキシラン-エンド-1,3-β-キシロシダーゼ（EC 3.2.1.32）；α-ガラクトシダーゼ（EC 3.2.1.22）；ポリガラクツロナーゼ（EC 3.2.1.15）；セルロース1,4-β-セロビオシダーゼ（EC 3.2.1.91）；およびエンドグルカナーゼ、特にエンド-1,6-β-グルカナーゼ（EC 3.2.1.75）、エンド-1,2-β-グルカナーゼ（EC 3.2.1.71）、エンド-1,3-β-グルカナーゼ（EC 3.2.1.39）またはエンド-1,3-α-グルカナーゼ（EC 3.2.1.59）。
好ましい具体例では、産物は、真核生物のポリペプチドである。例えば、インスリン、成長ホルモン、グルカゴン、ソマトスタチン、インターフェロン、PDGF、第VII因子、第VIII因子、ウロキナーゼ、エリスロポエチン、キモシン、組織プラスミノーゲンアクチベーター、血清アルブミン、トロンボポエチン。
好ましい別の具体例では、産物は、真菌由来のタンパク質である。好ましい具体例では、産物は、真菌の酵素である。例えば、でんぷん分解酵素、例えばα-アミラーゼ、β-アミラーゼ、グルコアミラーゼ、β-ガラクトシダーゼ、フィターゼ、セルロース分解酵素、脂質分解酵素、キシラン分解酵素、タンパク質分解酵素、酸化還元酵素、例えばペルオキシダーゼまたはラッカーゼ、ペクチナーゼ、クチナーゼ、およびタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ。
好ましいさらに別の具体例では、産物は、細菌のタンパク質である。好ましい具体例では、産物は、細菌の酵素である。特に、でんぷん分解酵素、例えばα-アミラーゼまたはβ-アミラーゼ；グルコアミラーゼ；β-ガラクトシダーゼ；セルロース分解酵素；脂質分解酵素；およびタンパク質分解酵素。
好ましい融合ポリペプチドは、プロキモシンおよびプロトリプシン様プロテアーゼである。
本発明は、以下に示す実施例において、より詳述される。しかし、これらは、添付した請求項に規定された本発明の範囲を限定するように、解釈されるべきでは決してない。
実施例
材料と方法
細胞株
アスペルギラス・オリザイ IFO 4177：発酵研究所、大阪から入手可能、日本大阪市淀川区十三本町２丁目17-25。
JaL125：この株の構造は例中に記述する。
遺伝子
alp：この遺伝子は配列番号１に示すアルカリプロテアーゼをコードする。
pyrG：この遺伝子は、ウリジンの生合成に関係する酵素、オロチジン-5’-リン酸デカルボキシラーゼをコードする。
プラスミド
pSO2：例１に従い調製される。
pSO5：例１に従いpSO2から調製される。
pSRe403：例１に従い調製される。
pSX320：このプラスミドの構造はEP 0 531 372B1に記述されている。
pToC90：p3SR2のサブクローンで、アスペルギラス・ニデュランスのamdS遺伝子を2.7kbのXbaI断片（Corrick et al.,1987,Gene 53:63-71）としてpUC19ベクター（Yannisch-Perron et al,,1985,Gene 33:103-119）に連結し、WO 91/17243に記述どおり調製される。
Bluescript SK-:M.A.Alting-Mees and Short,J.M.,1989,Nucleic Acids Res.17:9494-9494
pUC18及びpUC118:Viera and Messing,1987,J.Meth.Enzymol.153:3-11
例１
アスペルギラス・オリザイのアルカリプロテアーゼのゲノム欠失
alp遺伝子を一段階置換法によって欠失させた。（G.May,Applied Molecular Genetics of Filamentous Fungi,1992,pp.1-25.J.R.Kinghorn and G.Turner,Eds.;Blackie Academic and Professional）。使用したマーカーはA.オリザイのpyrG遺伝子で；使用したA.オリザイ株はpyrG-株であった。
アスペルギラス・オリザイのpyrG遺伝子のクローニング
A.オリザイのpyrG遺伝子を、A.ニガーのpyrG遺伝子とのクロスハイブリダイゼーションによって単離した（W.van Hartingsveldt et al.,1987,Mol.Gen.Genet.206:71-75）。SauIIIAで部分分解したA.オリザイIFO 4177のDNAからなるラムダライブラリーを、低いストリンジェンシーで、A.ニガーのpyrG遺伝子の1kb DNA断片をプローブに用いて、探索した。一つの陽性クローンから得たDNAを、pUC118ベクターにサブクローニングした。得られたプラスミド、pSO2は、A.ニガーのpyrG遺伝子変異株を用いた補完から、pyrG遺伝子を含んでいることが示された。
アスペルギラス・オリザイのpyrGマイナス株の作成
両端に約1kbのpyrGのフランキング配列を含んだ、pyrG欠失プラスミドpSO5を、プラスミドpSO2から作成した。A.オリザイIFO 4177を、この構成体を用いて形質転換し、そして、その形質転換体を、pyrG変異体に特徴的な表現型である5-フルオロ-オロト酸に対する耐性によって選択した。サザン分析から、一つの形質転換体HowB101が、pyrGの遺伝子座に期待した欠失をもつことが示された。pyrG変異体であるから、HowB101は増殖にウリジンを要求する。ウリジン非存在下に増殖する能力を選択することで、HowB101株を、野生型pyrG遺伝子によって形質転換することができる。
HowB101の作成に係るステップを図１に示す。
アスペルギラス・オリザイのalpマイナス株の作成
アスペルギラス・オリザイのalp-株は、A.オリザイ株HowB101を、alp欠失プラスミドpJaL212によって形質転換して作成した。
アルカリプロテアーゼ破壊プラスミドpJaL212の作成
Sau3Aで部分分解したゲノムDNAから、A.オリザイIFO 4177ゲノムライブラリーを作成した。断片を、BamHIで切断したpUC19に連結した。アルカリプロテアーゼ遺伝子産物の既知のタンパク質配列断片に対応する、縮重したオリゴヌクレオチドを用いて、ライブラリーをスクリーニングした。この様にして、3.9kbのSau3A断片を含むプラスミドを単離した。このプラスミドをpSRe403と名付けた。
pSRe403をSacIIで切断し、そしてその5.6kb断片を単離および再結合し、pSRe403_SacIIを作成した。pUC19中のHindIII部位を除くために、このプラスミドをHindIIIで部分切断し、末端をクレノーポリメラーゼによって埋め、そして再結合した。できたプラスミドをpJaL173と名付けた。pJaL173をHindIIIで切断し、pSO2のpyrG遺伝子を含む3.8kbのHindIII断片を、pJaL173に挿入し、pJaL212を作成した。pJaL212の作成を図２で概説する。
A.オリザイのalpマイナス株の単離
常法に従い、pJaL212の6.8kbのSacI-SphI断片によって、A.オリザイHowB101株を形質転換した。この断片は、1.5kbのalpプロモーター、pyrG遺伝子、および1.5kbのalp遺伝子の３’末端から成る。ウリジン非存在下に増殖する能力により、形質転換体を選択した。再単離後、12の形質転換体から染色体DNAを調製し、そのDNAをPstIで切断し、そして、放射性標識プローブとして、alp遺伝子部分を含むpJaL173のPstI/SacIIの599bp断片を用いて、サザン分析した。alp遺伝子の欠失を持つ形質転換体は、1.0kbの野生型のPstIバンドの1.9kbへのシフトによって容易に認識される。
４つの形質転換体において、1.0kbのPstIバンドが1.9kbへシフトした。それらの形質転換体の一つをJaL125と名付けた。
JaL125の作成に係るステップを図３に示す。
例２
A.オリザイ株JaL125における45kDエンドグルカナーゼの生産
ヒュミコラ・インソレンス（Humicola insolens）の45kDエンドグルカナーゼの真菌用発現プラスミドであるプラスミドpSX320（図４）を用いて、pToC90との同時形質転換により、A.オリザイIFO 4177およびJaL125を形質転換した。プラスミドpSX320の作成は、EP 0 531 372に以前より記載されていた。
形質転換体は、10mMアセトアミドを含んだ最小培地上での増殖により選択し、そしてCarezyme▲Ｒ▼を生産する能力によって、pSX320の存在についてスクリーニングした。
各株から一つの形質転換体を選択し、マルトデキストリン、ダイズミール、およびペプトン100mlを含んだ振とうフラスコで、30℃で５日間培養した。発酵ブロスのサンプルを毎日採取し、そしてSDS-PAGEで分析した。45kDエンドグルカナーゼの収量は、ゲルスキャニングシステムバイオイメージ（BioImage System,UK）を使用して、クマシーブルー染色したタンパク質バンドから定量した。結果を図５に示す。その結果から、alp遺伝子を含む野生型株に比べると、alp遺伝子が欠失された株の発酵ブロス中に、より多くの45kDエンドグルカナーゼが存在することが示唆される。これより、alp遺伝子を欠失することで、エンドグルカナーゼの安定性が増加することが示唆される。
配列表
（１）一般情報：
（ii）発明の名称：新規な微生物
（iii）配列の数：１
（２）配列番号１の情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ：3922塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）ストランド：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（ii）遺伝子型：cDNA
（vi）起源：
（Ｂ）株：アスペルギラス・オリザイA01560
（ix）特徴：
（Ａ）名称／キー：エクソン
（Ｂ）位置：2310..2634
（ix）特徴：
（Ａ）名称／キー：エクソン
（Ｂ）位置：2684..3129
（ix）特徴：
（Ａ）名称／キー：エクソン
（Ｂ）位置：3188..3276
（ix）特徴：
（Ａ）名称／キー：エクソン
（Ｂ）位置：3333..3686
（xi）配列記載：配列番号１：
Claims (18)
- 配列番号１に示された配列をもつalp遺伝子又は当該遺伝子プロモーターにおける欠失又は点突然変異により内在性アルカリプロテアーゼ活性が、完全又は部分的に失活された、異種性ポリペプチドの製造に使用されるＡ．オリザイ（A．oryzae）株。
- アルカリプロテアーゼ遺伝子産物をコードする配列におけるヌクレオチドの欠失、挿入又は置換によって前記失活が得られた、請求項１に記載のＡ．オリザイ株。
- 前記アルカリプロテアーゼ遺伝子の発現を制御する発現シグナルの制御を妨害することによって前記失活が得られた、請求項１に記載のＡ．オリザイ株。
- アンチセンス法によって前記失活が得られた、請求項１に記載のＡ．オリザイ株。
- 配列番号１に示されたA.オリザイのalp遺伝子をコードするDNA配列の修飾を含むDNA構成体であって、前記修飾が、前記遺伝子の内部分を含む一部分が置換もしくは欠失された修飾か、又は外来DNAが遺伝子内に挿入された修飾である、上記ＤＮＡ構成体。
- 前記アルカリプロテアーゼ遺伝子の失活が、以下のステップ：
i）Ａ．オリザイ株から、アルカリプロテアーゼ遺伝子をクローニングし；
ii）前記遺伝子の内部分を含む一部分が置換もしくは欠失されるか、又は前記遺伝子内に外来DNAが挿入されたアルカリプロテアーゼ遺伝子を含むDNA構成体を作成し；
iii）前記DNA構成体を用いて、前記Ａ．オリザイ株を形質転換し；そして
iv）以下の条件を達成する形質転換体を単離する：
１）アルカリプロテアーゼ活性が検出され得ない；
２）アルカリプロテアーゼ活性の低下レベルが測定され得る；又は、
３）機能を喪失したアルカリプロテアーゼが得られる、
により得られた、請求項１から４のいずれか１項に記載のＡ．オリザイ株を作成する方法。 - 前記アルカリプロテアーゼ遺伝子の失活がアンチセンステクノロジーの使用によって得られる、請求項１から４のいずれか１項に記載のＡ．オリザイ株を作成する方法であって、以下のステップ：
i）前記アルカリプロテアーゼ遺伝子から転写されたmRNAに相補的なRNA分子の合成をもたらす発現プラスミドを構築し；
ii）前記発現プラスミドと適切なマーカーを用いて宿主Ａ．オリザイ株細胞を形質転換し；
iii）前記マーカーを使用して形質転換体を選択し；そして
iv）前記アルカリプロテアーゼ産物の合成が低下している選択された形質転換体をスクリーニングする、
を含む、前記方法。 - 前記アルカリプロテアーゼ遺伝子が、配列番号１に示された配列を含むalp遺伝子である、請求項６又は７に記載の方法。
- 所望の遺伝子産物をコードするDNA配列によって形質転換された、請求項１から４のいずれか１項に記載のＡ．オリザイ株宿主細胞を培養することを含む、異種性ポリペプチドを製造する方法。
- 前記ポリペプチドが、前記Ａ．オリザイ株宿主細胞により細胞外の培地へ分泌される、請求項９に記載の方法。
- 前記ポリペプチドが、前記培地から回収および精製される、請求項１０に記載の方法。
- pH5から11で、好ましくはpH6から10.5で、例えばpH7から10で、特にはpH8から9.5で発酵を行う、請求項９から１１のいずれか１項に記載の方法。
- 前記の所望の遺伝子産物が、グリコシダーゼ、例えば、アミラーゼ、特にα-アミラーゼまたはβ-アミラーゼ；セルラーゼ、特にエンド-1,4-β-グルカナーゼまたはエンド-1,3-β-グルカナーゼ；キシラナーゼ、特にエンド-1,4-β-キシラナーゼまたはキシラン-エンド-1,3-β-キシロシダーゼ；α-ガラクトシダーゼ；ポリガラクツロナーゼ；セルロース1,4-β-セロビオシダーゼ；およびエンドグルカナーゼ、特にエンド-1,6-β-グルカナーゼ、エンド-1,2-β-グルカナーゼ、エンド-1,3-β-グルカナーゼまたはエンド-1,3-α-グルカナーゼから成る群から選択した酵素である、請求項９から１２のいずれか１項に記載の方法。
- 前記の所望の遺伝子産物が、インスリン、成長ホルモン、グルカゴン、ソマトスタチン、インターフェロン、PDGF、第VII因子、第VIII因子、ウロキナーゼ、tPA、EPO、およびTPOから成る群から選択した真核生物のポリペプチドである、請求項９から１２のいずれか１項に記載の方法。
- 前記の異種性ポリペプチドが、Ａ．オリザイ株起源のタンパク質である、請求項９から１２のいずれか１項に記載の方法。
- 前記産物が、でんぷん分解酵素、例えばα-アミラーゼ、β-アミラーゼ、グルコアミラーゼ、β-ガラクトシダーゼ、フィターゼ、セルロース分解酵素、脂質分解酵素、キシラン分解酵素、タンパク質分解酵素、酸化還元酵素、例えばペルオキシダーゼまたはラッカーゼ、ペクチナーゼ、クチナーゼ、およびタンパク質ジスルフィドイソメラーゼから成る群から選択したＡ．オリザイ株の酵素である、請求項１５に記載の方法。
- 前記の異種性ポリペプチドが細菌由来のタンパク質である、請求項９から１２のいずれか１項に記載の方法。
- 前記細菌のタンパク質が、でんぷん分解酵素、グルコアミラーゼ、β-ガラクトシダーゼ、セルロース分解酵素、脂質分解酵素、およびタンパク質分解酵素から成る群から選択した酵素である、請求項１７に記載の方法。
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