CN1120235C

CN1120235C - 碱性蛋白酶缺陷型丝状真菌

Info

Publication number: CN1120235C
Application number: CN97193274A
Authority: CN
Inventors: J·莱姆比克
Original assignee: Novozymes AS
Current assignee: Novozymes AS
Priority date: 1996-03-27
Filing date: 1997-03-26
Publication date: 2003-09-03
Anticipated expiration: 2017-03-26
Also published as: ES2257774T3; EP0894126A1; DE69735199T2; DK0894126T3; JP2000507106A; DE69735199D1; US6291209B1; WO1997035956A1; ATE317005T1; EP0894126B1; JP4263241B2; AU2152897A; CN1214731A

Abstract

本发明涉及用于生产异源多肽的丝状真菌，通过重组DNA技术对该真菌进行了修饰，使碱性蛋白酶的表达被完全或部分灭活。本发明也包括利用本发明的真菌高产量生产目标蛋白质的方法。本发明还涉及生产用于这些方法中的这种真菌及DNA构建体的方法。

Description

碱性蛋白酶缺陷型丝状真菌

本发明涉及新型真菌宿主细胞以及生产蛋白质的方法。更具体的，本发明涉及一种用于异源蛋白质表达的宿主细胞，该细胞经过遗传性修饰以使表达碱性蛋白酶活性的水平明显降低。此外，本发明涉及一种利用本发明的真菌高产量生产目的蛋白质的方法，该方法包括在适宜的生长培养基中培养宿主细胞，随后回收预期的蛋白质。本发明也包含生产用于上述方法中的真菌和DNA构建体的方法。

真菌，尤其是丝状真菌，作为表达胞外分泌的蛋白质的宿主已被广泛地商业性应用。具体的，属于曲霉属(Aspergillus)的种类用于内源性生产已有很长的商业应用的历史且最近也用于异源蛋白质的生产。

用作宿主细胞的微生物经常遇到的一个不利之处是其固有的蛋白水解酶的高水平生产和分泌，因而可能因为蛋白质水解而导致目标蛋白的产量降低。

已考虑了种种克服此问题的方法。例如，可以删除或打断编码不同的内源性蛋白酶的基因。WO 90/00192(Genencor公司)描述了经处理的不能分泌有酶活性的天冬氨酸蛋白酶的突变丝状真菌宿主。经过这样的突变，显示异源性多肽(牛凝乳酶)的产量增加了。EP 574,347(CibaGeigy公司)描述了一种枯草蛋白酶类丝氨酸蛋白酶缺陷的曲霉宿主。

然而，众所周知，除去此处提及的两种蛋白酶之外，真菌产生大量的蛋白酶。因此，仍旧需要无源自其它蛋白酶的蛋白质水解活性或这种活性水平非常低的丝状真菌菌株。

本发明的一个目的是提供用于生产异源性多肽产物的丝状真菌宿主细胞，与亲代细胞相比该细胞经遗传修饰以使表达内源性碱性蛋白酶的水平明显降低。

本发明涉及这样的修饰过的真菌，其中至少一个编码一种碱性蛋白酶活性的基因的转录和/或翻译被完全地或部分地抑制。

根据本发明，这可以通过利用重组DNA技术来实现，其中，删除或突变所感兴趣的真菌中编码碱性蛋白酶活性的基因从而使蛋白酶的表达水平降低或使所表达蛋白酶的活性水平降低。

在一具体的实施方案中，碱性蛋白酶基因是SEQ ID NO 1中列出的alp基因，已由Murakami，K.等人，1991，农业生物化学(Agric.Biol.Chem.)55：2807-2811描述。

此外，本发明涉及生产这样的真菌的方法，其中，通过碱性蛋白酶基因中核苷酸的替换、删除或插入造成碱性蛋白酶基因的失活。

本发明也涉及利用本发明的真菌宿主细胞生产异源性多肽的方法。尤其考虑分泌性多肽，其中，用包含有至少一个编码多肽或目的基因产物之DNA序列的DNA构建体修饰和选择性地转化的真菌宿主细胞在适宜的培养条件下适当的培养基中培养，回收并纯化预期的基因产物。

通过此处描述的方法，发现由本发明的真菌分泌的多肽的产量大大提高。

此外，本发明涉及由上述方法生产的多肽产物。

最后，本发明涉及用于上述提及方法中的包含有米曲霉(Aspergillusoryzae)alp基因DNA序列的DNA构建体。

参考实施例和下列附图更详细的描述本发明，其中：

图1表示构建HowB101的步骤，

图2表示构建pJaL212的步骤，

图3表示构建米曲霉pJaL125(alp缺失)的步骤，

图4表示pSX320，和

图5表示在本发明的宿主菌株(米曲霉JaL125)中产生45KD内切葡聚糖酶，与相对应的alp基因未缺失的米曲霉菌株相比该菌株的alp基因已缺失。

本发明书中使用了下列定义：

alpΔ指alp基因缺失的菌株；

alp^-指不产生有功能的Alp多肽即无蛋白水解活性的Alp蛋白质的菌株。

“功能性类似物”一词用在有关SEQ ID NO 1列出的alp基因上是为了表明在如下面详述的一定的特异性条件下能与SEQ ID NO1列出的DNA序列杂交的且展示至少70％的同源性的编码碱性蛋白酶的DNA序列。

决定核苷酸探针和同源的DNA或RNA序列之间杂交的合适的条件包括：将含有要杂交的DNA片段或RNA的滤膜在5×SSC(标准柠檬酸盐)中预浸10分钟，将滤膜在5×SSC溶液(Sambrook等人，1989)，5×Denhardt溶液(Sambrook等人，出处同前)，0.5％SDS和100μg/ml变性的超声处理过的鲑精DNA(Sambrook等人，出处同前)中预杂交，随后在含有随机引物产生的由³²P-dCTP标记的(比活性＞1×10⁹cpm/μg)探针的相同溶液中约45℃下杂交12小时(Feinberg，A.P.和Vogelstein，B.，1983，分析生物化学(Anal.Biochem.)132：6-13)。然后在优选不高于50℃条件下于2×SSC，0.5％SDS中洗涤2次30分钟，更优选不高于55℃，更优选不高于60℃，更优选不高于65℃，更为优选不高于70℃，尤其是不高于75℃的条件。

在这些条件下与寡核苷酸探针杂交的分子用X-射线胶片检测。

上面提到的DNA序列的同源性用两个序列之间显示第一个序列从第二个序列衍生关系的同一性程度来确定。同源性可通过本领域已知的计算机程序来适当的确定，如：由GCG程序包(Needleman，S.B.，和Wunsch，C.D.，1970，分子生物学杂志(Journal of MolecularBiology)48：443-453)提供的GAP。使用GAP按照下列设置进行DNA序列比较：GAP产生罚(Creation penalty)5.0，GAP延伸罚(Extensionpenalty)3.0，DNA序列的编码区与SEQ ID NO.1中所示DNA序列的酶编码部分显示优选至少70％，更优选至少80％，更优选至少90％，更优选至少95％，更优选的至少97％的同一性。

本发明第一方面涉及用于生产异源肽的已被重组DNA技术修饰的真菌，其中一种或多种内源性碱性蛋白酶活性已被完全或部分地灭活。遗传性修饰

本发明的真菌可以用本领域技术人员知晓的重组DNA技术的标准技术加以修饰。负责碱性蛋白酶生产的基因序列可被部分灭活或全部去除。

换言之，本发明的真菌以降低的水平表达碱性蛋白酶活性，或者不表达碱性蛋白酶活性，或者表达酶学上无活性的碱性蛋白酶。本发明的一个方面，在编码碱性蛋白酶基因产物的序列中通过核苷酸的删除、插入或替换的方式实现碱性蛋白酶活性的灭活或水平降低。

在一具体的实施方案中，所述灭活是通过修饰编码目标碱性蛋白酶的结构序列或调控序列(例如：通过干扰调控碱性蛋白酶基因表达的表达信号的调控)来实现。

已知的且有用的技术包括但不局限于：特异性或随机诱变，PCR产生的诱变，位点特异性DNA删除、插入和/或替换，基因破坏或基因置换技术，反义技术或上述技术的任何组合。

诱变可以利用合适的物理或化学诱变剂来完成。适于本发明的目的的物理或化学诱变剂的例子包括：紫外照射，羟胺，N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)，O-甲基羟胺，亚硝酸，甲磺酸乙酯(EMS)，亚硫酸氢钠，甲酸和核苷酸类似物。当使用这样的诱变剂时，典型的诱变是通过适于诱变发生的条件下将待诱变的细胞在所选的诱变剂存在下培养，且挑选产生的碱性蛋白酶水平明显降低的突变细胞来完成的。

导致灭活或碱性蛋白酶活性降低的修饰也可以通过在碱性蛋白酶中转录或翻译所需的编码序列或调控元件中导入、置换或移去一个或多个核苷酸来完成。例如可以插入或删除核苷酸从而导致导入了一个终止密码子，除去了起始密码子或开放阅读框架的改变。结构序列或调控元件的修饰或灭活可以通过与本领域已知方法一致的位点导向性诱变或PCR产生的诱变的方法来实现。虽然原则上可以在体内进行修饰，即：直接作用在携带有碱性蛋白酶基因的细胞上，目前优选在体外进行修饰。

灭活或降低所选的真菌宿主细胞的碱性蛋白酶产量的方便方法基于基因中断的原理。此方法包括编码待突变的内源基因或基因片段的DNA序列的使用。所述DNA序列在体外被突变后产生一个缺陷型基因，再将该基因转入真菌中。通过同源重组，缺陷型基因取代了内源性基因或基因片段。包含一个用于选择目的转化子的遗传性标记可能是有利的。

基因删除或破坏的方法在Miller等人，1985，分子细胞生物学(Mol.Cell.Biol.)5：1714-1721；WO 90/00192(Genencor)；May G.1992，《丝状真菌应用分子遗传学》(Applied Molecular Genetics ofFilamentous Fungi)1-25页，J.R.Kinghorn和G.Turner编，Blackie Academic和Professional 1994，《用于遗传操作的载体》(Vectorsfor genetic manipulation)，641-665页，S.D.Martinelli和J.R.Kinghorn编，Elsevier中有专门的描述。

此外，DNA序列的修饰和/或灭活方法可以通过使用常规的反义技术利用与碱性蛋白酶编码序列(如：由SEQ ID NO.1列出的alp基因核苷酸序列或功能性类似物)互补的核苷酸序列来完成。

反义技术及其应用在美国专利NO.5,190,931(纽约大学)中有详细描述。

经过前面提到的遗传性修饰使本发明的真菌表达的碱性蛋白酶活性明显降低。在一优选的实施方案中，碱性蛋白酶活性水平下降了约50％以上，优选85％以上，更优选的为90％以上，最优选的为95％以上。在一最优选的实施方案中，宿主细胞基本上没有可检测出的碱性蛋白酶活性。

本发明的真菌中可以由一种选择性标记，如pyrG基因，argB基因，sC基因或hph基因替换碱性蛋白酶基因。

在本发明的一个具体实施方案中，碱性蛋白酶基因包含有SEQ IDNO.1中列出的alp基因序列或其功能性类似物。

Alp是一种在中性到碱性pH范围内有最大酶活性的丝氨酸蛋白酶。如从核苷酸序列推断的成熟的Alp蛋白质是一个包含有282个氨基酸且在N-端附近有一个121个氨基酸的前原区域的枯草蛋白酶型丝氨酸蛋白酶。Alp与其他枯草蛋白酶型丝氨酸蛋白酶的氨基酸序列比较表明Alp中的三个残基(Asp41，His 72和Ser 228)构成催化位点。当用丙氨酸残基替换Ser 228时观察到蛋白水解活性的降低，表明该Ser 228是催化位点的一部分(Tatsumi等人，1991，农业生物化学，55：3099-3101)宿主真菌

根据本发明，真菌优选属于选自包含有曲霉属(Aspergillus)，木霉属(Trichoderma)，腐质霉属(Humicola)，假丝酵母属(Candida)，Acremonium，镰孢霉属(Fusarium)和青霉属(Penicillium)的组中的属。

在这些属中，选自米曲霉(A.oryzae)，黑曲霉(A.niger)，泡盛曲霉(A.awamori)，海枣曲霉(A.phoenicis)，日本曲霉(A.japonicus)，臭曲霉(A.foetidus)，构巢曲霉(A.nidulans)，T.reesei，T.harzianum，H.insulens，H.lanuginosa，禾本科镰孢(F.graminearum)，腐皮镰孢(F.solani)，F.venenatum和产黄青霉(P.chrysogenum)的种是优选的。对于这些种类中每一个种，同源的碱性蛋白酶基因可以被灭活或经过如此处所述的其他方式修饰。

通常将本发明的真菌转化到可产生期望的蛋白产物的真菌中。

转化真菌的方法为本领域所周知的，参见如：EP 0,184,438 A2(Gist-Brocades N.V.)和EP申请号NO.87103806(Novo Nordisk A/S)。

当目标基因产物为宿主细胞自身产物时不必进行转化，但为了增加产量，可以将编码目标蛋白的基因的多个拷贝整合到本发明的真菌中。生产宿主真菌的方法

本发明的另一方面包含生产本发明第一方面的真菌的方法，其中所述的碱性蛋白酶基因的灭活通过下述步骤：

i)从一种真菌宿主细胞中克隆碱性蛋白酶基因的同源基因，

ii)产生包含有部分内在序列由核苷酸替换、删除或插入等修饰过的碱性蛋白酶基因的DNA构建体，

iii)用该构建体转化该真菌，和

iv)挑选显示如下特点的转化子：

1)无可检测出的碱性蛋白酶活性，

2)碱性蛋白酶活性水平降低，

3)无酶活性的碱性蛋白酶。

“降低”的碱性蛋白酶活性一词是指活性水平比相应的非突变体表现出的水平要低。

可以用合成底物N-琥珀酰-Ala-Ala-Pro-Phe-对硝基苯胺(Sigma化学公司)鉴定包括Alp活性的碱性蛋白酶活性。在1ml反应体积中用1mM溶于20mM Tris-HCl，pH 8.0中的底物25℃下测定活性。410nm处测定释放出的对硝基苯胺(Ramesh等人，1994，感染和免疫(Infection and Immunity)，1月号，79-85)。

前面提及的步骤i)中的目标碱性蛋白酶基因的同源基因可以通过与先前确定为碱性蛋白酶基因的交叉杂交或者通过碱性蛋白酶突变型的互补的方法来克隆。

在合成碱性蛋白酶基因产物所必需的序列中的缺失可能导致可测得的碱性蛋白酶活性的缺失。

全部碱性蛋白酶基因的不完全灭活或功能降低的碱性蛋白酶基因产物的表达可能导致碱性蛋白酶活性水平的降低。

与前面提及的克隆相关，可以通过将DNA构建体整合到碱性蛋白酶基因中，或者，删除碱性蛋白酶基因以及用其它如pyrG基因、argB基因、sC基因或hph基因取代碱性蛋白酶基因的方法构建DNA构建体。

如果该基因是alp基因，分离的转化子可能是alp^-或alpΔ。

本发明的另一方面涉及生产真菌的方法，其中利用反义技术使碱性蛋白酶失活，这样的方法包含下列步骤：

i)构建一种用于合成与转录自碱性蛋白酶基因的mRNA互补的RNA分子的表达质粒，

ii)用在不同的质粒或同一质粒上的所述表达质粒和适宜的标记转化宿主真菌细胞，

iii)用该标记挑选转化子，和iv)筛选碱性蛋白酶基因产物合成降低了的转化子。

本发明的另一方面包括用于上述方法中的DNA构建体。

就与本发明的DNA构建体相关的方面而言，该DNA可以包含如alp基因的碱性蛋白酶基因，其中部分内在基因序列已被核苷酸替换、删除或插入等方法修饰。

该DNA构建体也可以进一步包含编码目标多肽产物(如那些下文中述及的)的DNA序列。

就上面提及的反义方法而言，DNA构建体可以包含与有功能的启动子相连的碱性蛋白酶基因的倒置DNA序列，其中的mRNA至少与产自碱性蛋白酶基因的mRNA部分互补。方法

本发明的另一方面涉及生产异源多肽的方法，优选为分泌性基因产物，其中将本发明的真菌在适当的培养条件下于合适的培养基中培养，并从中回收和纯化期望的基因产物。

当生产异源多肽(如：酶)时，发酵pH的选择依赖于如：所用的宿主细胞，宿主细胞所要求的生长培养基和该多肽的稳定性等因素。通常，虽然可以在任何pH下的任何发酵工艺中应用本发明的真菌，最好在使得由宿主细胞产生的内源性酸性和/或中性蛋白酶的活性失活或至少明显降低的pH下进行发酵。于是，当在如：pH 5到pH 11，如pH 6到10.5，7到10或8到9.5的条件下进行发酵，酸性蛋白酶(如：天冬氨酸和丝氨酸蛋白酶)以及在高于pH 7时中性蛋白酶的活性水平会降低甚至会失活。因此，天冬氨酸蛋白酶的去除(如WO 90/00192中所述)只会对产量有有限的影响。

然而，在碱性pH范围中，在未修饰的宿主细胞中碱性蛋白酶可以有活性，且可以是降解目标多肽产物的主要原因。因此，在这样的情况中编码碱性蛋白酶活性的基因的灭活尤其有利。

由于酸性、中性和碱性蛋白酶的活性在不同种类的真菌中不同，例如：在米曲霉中的碱性蛋白酶的活性比在黑曲霉中高，本发明的碱性蛋白酶的灭活对特定宿主也十分有益。

能在上述碱性pH范围的发酵条件中生产的酶的例子包括：内切葡聚糖酶，肌醇六磷酸酶，蛋白酶，脂酶，角质酶，纤维素酶，凝乳酶，过氧化物酶和蛋白质二硫键异构酶。

期望的异源多肽可以用常规方法从培养基中回收，包括：通过离心或过滤从培养基中分离细胞，必要时要先破坏细胞，用盐如硫酸铵的方法沉淀上清或滤液中的蛋白质组分，再用各种层析方法如：离子交换层析，亲和层析或类似的方法中的任一方法纯化。异源多肽

在本发明中，期望的多肽是一种“异源多肽”，指不是本发明的真菌宿主细胞天然的多肽，或是经修饰改变了天然序列的天然多肽(即遗传变体)，或是如启动子、核糖体结合位点等表达该天然多肽所需的天然调控序列的遗传操作造成的或是由重组DNA技术对本发明的真菌进行其它修饰造成的表达数量改变了的天然多肽。

由本发明的真菌表达的异源多肽也可以是前体蛋白质，即酶原，杂合蛋白质，以原序列或前原序列或其它未成熟的形式获得的蛋白质。

在另一优选的实施方案中，产物是一种酶；具体地，一种糖苷酶，如：淀粉酶，具体的是α-淀粉酶或β-淀粉酶；一种纤维素酶，具体的是内切-1，4-β-葡聚糖酶(EC 3.2.1.4)或内切-1，3-β-葡聚糖苷酶(EC 3.2.1.6)；一种木聚糖酶，具体的是内切-1，4-β-木聚糖酶(EC 3.2.1.8)或木聚糖-内切-1，3-β-木糖苷酶(EC 3.2.1.32)；α-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.22)；多聚半乳糖醛酸酶(EC 3.2.1.15)；纤维素1，4-β-纤维二糖苷酶(EC 3.2.1.91)和一种内切葡聚糖酶，具体的是内切-1，6-β-葡聚糖酶(EC 3.2.1.75)，内切-1，2-β-葡聚糖酶(EC 3.2.1.71)，内切-1，3-β-葡聚糖酶(EC 3.2.1.39)或是内切-1，3-α-葡聚糖酶(E.C.3.2.1.59)。

在一优选的实施方案中，产物是一种真核多肽，如：胰岛素、生长激素、胰高血糖素、促生长素抑制素、干扰素、血小板衍生生长因子(PDGF)、第七因子、第八因子、尿激酶、促红细胞生成素、凝乳酶、组织型纤溶酶原激活剂、血清白蛋白或血小板生成素。

在另一优选的实施方案中，产物是真菌来源的蛋白质。在一优选的实施方案中，产物是真菌的酶，例如：淀粉分解酶，如：α-淀粉酶，β-淀粉酶，葡糖淀粉酶；β-半乳糖苷酶；肌醇六磷酸酶；细胞溶解酶，脂解酶；木聚糖降解酶(xylanolytic enzyme)；蛋白水解酶；氧化还原酶，如过氧化物酶或漆酶；果胶酶；角质酶和蛋白质二硫键异构酶。

在另一优选的实施方案中，产物是细菌性蛋白质。在一优选的实施方案中，产物是细菌的酶；具体的是淀粉分解酶，如：α-淀粉酶或β-淀粉酶；葡糖淀粉酶；β-半乳糖苷酶；细胞溶解酶；脂解酶和蛋白水解酶。

优选的杂合多肽是凝乳酶原和胰蛋白酶原样蛋白酶。

本发明用下列实施例进一步阐述。这不应认为限制了如附加的权利要求书所述的本发明的范围。材料和方法菌株米曲霉IFO 4177：可获自发酵研究所(Institute for Fermention)，大阪，17-25 Juso Hammachi-2-Chrom Yodogawa-Ku，大阪，日本。JaL 125：此菌株的构建如实施例所述。基因alp：编码碱性蛋白酶的基因，示于SEQ ID NO.1pyrG：编码乳清苷-5′-磷酸脱羧酶的基因，该酶参与了

尿苷的生物合成。质粒pSO2 按实施例1制备。pSO5 按实施例1从pSO2制备。pSRe403：按实施例1制备。pSX320：质粒构建如欧洲专利申请No.0,531,372B1所述。pToC90： p3SR2质粒的亚克隆，带有来源于构巢曲霉的2.7kb

XbaI片段(Corrick等人，1987，基因(Gene)53：

63-71)的amdS基因，在pUC19载体上

(Yannisch-Perron等人，1985，基因33：103

-119)，按WO 91/17243所述制备。Bluescript SK^- M.A.Alting-Mees和Short，J.M.，1989，核酸研究

(Nucleic Acids Res.)17：9494-9494.pUC18和pUC118 Viera和Messing，1987，酶学方法杂志(J.Meth.

enzymol.)153：3-11

实施例1米曲霉碱性蛋白酶的基因组删除

用一步基因置换法(G.May，《丝状真菌应用分子遗传学》(AppliedMolecular Genetics of Filamentous Fungi)，1992，1-25页，J.R.Kinghorn和G.Turner编；Blackwell Academic and Professional)删除alp基因。利用米曲霉pyrG基因为标记；所用的米曲霉菌株是pyrG-菌株。米曲霉pyrG基因的克隆

通过与黑曲霉pyrG基因的交叉杂交克隆米曲霉基因(W.vanHartingsveldt等人，1987，分子普通遗传学杂志(Mol.Gen.Genet)206：71-75)。用来源于黑曲霉pyrG基因的1Kb DNA片段在低严格条件下探寻用Sau IIIA部分消化的米曲霉IFO 4177 DNA的λ文库。来源于一个阳性克隆的DNA被亚克隆到pUC118载体。通过与黑曲霉pyrG突变型的互补表明所得质粒pSO2含有该pyrG基因。米曲霉pyrG菌株的构建

含有约1kb pyrG两侧序列的pyrG缺失质粒pSO5从质粒pSO2构建而来。用此构建体转化米曲霉IFO 4177，用pyrG突变型的表型特征(5-氟-乳清酸抗性)挑选转化子。通过Southern杂交分析表明一个转化子HowB101中在pyrG位置上有预期的缺失。作为pyrG突变型，How B101的生长需要尿苷。可以通过挑选能在无尿苷下生长的转化子的方法用野生型pyrG基因转化How B101。

构建HowB101的步骤如图1所示。米曲霉alp^-菌株的构建

用alp缺失的质粒pJaL212转化米曲霉HowB101构建米曲霉alp^-菌株。碱性蛋白酶破坏的质粒pJaL212的构建

通过Sau 3A部分消化基因组DNA构建米曲霉IFO 4177基因组文库。片段连接到BamHI消化的pUC 19中。用碱性蛋白酶基因产物的已知蛋白质序列片段的简并性寡核苷酸筛选文库。用此法分离到含有3.9kb的Sau 3A片段的一个质粒。该质粒命名为pSRe403。

用Sac II消化pSRe403，分离516kb片段且再连接形成pSRe403_Sac II。此质粒用Hind III部分消化，末端用Klenow聚合酶补平且再连接以消除pUC 19中的Hind III位点、所得质粒名为pJaL173。用Hind III部分消化pJaL173，将带有pSO2的pyrG基因的3.8kb的Hind III片段插入到消化的pJaL 173中形成pJaL212。pJal212的构建见图2。一种米曲霉alp^-菌株的分离

用标准方法将pJaL 212的6.8kb SacI-SphI双酶切片段转化米曲霉HowB101。此片段由1.5kb的alp启动子、pyrG基因和alp基因3′端的1.5kb片段组成。用缺乏尿苷时的生成能力挑选转化子。再次分离后从12个转化子中制备染色体DNA，用PstI切割并用来自pJaL173含有部分alp基因的599bp PstI/Sac II片段作为放射性标记探针进行Southern杂交分析。带有alp基因缺失的转化子可以通过1.0kb位置野生型PstI条带移动到1.9kb位置的条带而方便地识别。

4个转化子中1.0kb Pst I条带移动到1,9kb条带的位置。其中一个转化子命名为JaL125。

构建JaL125的步骤如图3所示。

实施例2米曲霉菌株JaL 125中45KD内切葡聚糖酶的生产

通过与pToC90共转化，用表达来源于Humicola insolens的45KD内切葡聚糖酶的真菌表达质粒pSX320转化米曲霉菌株IFO 4177和JaL125。质粒pSX320的构建已于EP 0,531,372中描述。

在含有10mM乙酰胺的基本培养基上生长挑选转化子，按生产Carezyme^的能力筛选pSX320的存在。

挑选各个菌株的一个转化子，在含有100ml麦芽糖糊精，大豆粉和蛋白胨的摇瓶中30℃生长5天。每日取发酵液样品并用SDS-PAGE分析。通过凝胶扫描系统BioImage(BioImage System，UK)从考马斯蓝染色的蛋白条带中定量测定45KD内切葡聚糖酶的产量。结果如图5所示。结果表明，在删除了alp基因的菌株的发酵液中产生的45KD内切葡聚糖酶比带有alp基因的野生型菌株多。这表明通过删除alp基因增强了内切葡聚糖酶的稳定性。

序列表(1)一般信息

(i)申请人：

(A)姓名：Novo Nordisk A/S

(B)街道：Novo Alle

(C)城市：Bagsvaerd

(D)国家：丹麦

(E)邮政编码：DK-2880

(F)电话：+45 4444 8888

(G)传真：+45 4449 3256

(ii)发明题目：新型微生物

(iii)序列数目：1

(iv)计算机可读形式

(A)介质类型：软盘

(B)计算机：IBM PC兼容机

(C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS

(D)软件：PatentIn Release#1.0，版本#1.30B(EPO)(2)SEQ ID NO 1信息

(i)序列特征

(A)长度：3922碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑构建体：线性

(ii)分子类型：cDNA

(vi)初始来源：

(B)菌株：米曲霉A01560

(ix)特征：

(A)名称/关键词：外显子

(B)位置：2310..2634

(ix)特征：

(A)名称/关键词：外显子

(B)位置：2684..3129

(ix)特征：

(A)名称/关键词：外显子

(B)位置：3188..3276

(ix)特征：

(A)名称/关键词：外显子

(B)位置：3333..3686

(xi)SEQ ID NO.1描述：GGATCCATAA TGAGCACACT TGAACCTCGC ATGAGTGCTC CATATCTTAG ATCCATTTGA 60GTCACGAGCG TCGAAGCCAA GGCTAAAAGA AAAGGGACCA AGACCGCCGC ATATCGGGGT 120GGCTGAACAA TCGCTGCTAG TGTGTACACA GGATACATAA ATTAATCAAG AGCCAATGAC 180GTTATCGAAG ACATGATATT ACTTACTTGA TTTGTTGCGG TGCTCCGACT CAACTGGATT 240CAGATGGAAG GGAAGGGATT CTTGATCAGG CTCGTCCCGG GATGACCATT GCTCCTCTCG 300AATCGAGACA ATGTTGAATG CCCAGGATGA CGATTGAGAG CGAGATATTA AAAAAGAGAT 360TAAGGGTTGA CGATTGCCAA CGGAAGCCCG ATGGAAGAAG AAATGCCAAG AATTTGGCTG 420CCTGGATGTT AGTGCCGTTT AGCCTCAGGC CCCAGCTGAA TCCCTGCCAA TCACGAGGCA 480GGGCTCACCA CCTCCAACCC TTACACAAGA CTCGCCCTCG CTCTTTCCTG CAGGTCCTCT 540GCTTACTTTC CCCTCTTTTC CCTCCTGAAA TGCCCCGAGA ATGCCGTCCG GAGCTTAGGA 600AAGCTACGAC GGCTTAATGT TCTAATTTCC CCCACCGACC TGCCCTGGCC AGTTAGACCG 660CCGGACCCAT CGAATGCAAC ATCACCAACA CTAATTTACC TGCATCTCTG TCAGCCCACT 720GGGTTTAACT AGATATGCCA AGGACTTGCT TGGCTGGTTT ATGCATGAAG AGAGATGGGC 780ACTAGTGCGT GCGGGACCAC AAACCTCACC TGCAGAGGGC TCATGCACCT GAAAGACTGC 840CAATGATCAT TTGACTGGTT AGGTCAAGGG GTTAGGCTTA GAGCCCTTTG CTAATGCCGA 900TGCCGCCTCT TTGACTGCCA CATTTCTTGG CTTCCCCTCT TGGCCCCTCC CGTCCCTTGA 960TGCCAAGGGC CTTGGTGGCT CGGACTCCCG GCGGTAGGCT GGCCACCTAC TCATGGCGTG 1020CGGAGATGGG CCATTCAGGT TGTGCCTAAT GACATACTCT GATGCCGACG GGAAGGCCGG 1080CTGCTTGCTG GTGTCATTGG CTTCTCGAAT GACTCGGAGG ATTGTCGTCT TGCAGGACTT 1140TTGTGTAACA ACAGGGGCCG ACAGTTGGCG TGGCTGCCGT GGATATGCTT TTGCTGCGAG 1200CCATGGTTAT TCTGCGGAAC GAAACCACCC TCCCACCCAA ACAGGGCTAA TGTGCCCAGG 1260TCCTGATACC ATCAGAAGAC CTCCAGGAGC ACATGCCTGT TCGCATAACC GTGGTGTAGC 1320ACCAGGAATT GCTTAGCTTA GCTTCTTCGA CTGGGGGGCC AGAAAGTGCT TATCGCAAAG 1380ATCCCACTTC TTTGTGTGAT AGCCCCTCCC GCGGCCCTTG ATCAAGCCGT TCTCGCTCGC 1440CCATACCGAA ACCGCGATAT TATAGGTGCA GATGGTTATT ATTCTTTTTC TTTTTCTTTT 1500TCTTTGCTTC TCATGCAGCC CCATACGTTG CCGAATTTGG CTACACCTTG GGGCTCATTC 1560TTCGAACTTT AGATTCCGAC AAGACCTCAG CACCCAATCA AAACCCTTGA TTCCTGATAA 1620AAGACGTGGA AAAAAGCGGA TATCGCGTGA GGATGCCAAG CAAAGGGAAT GGGTCACATT 1680GATCTCTGTC GCGCTGTTAG GATGATCTTC ACTCCTAAAG GCATCGCCGC GGCATTAGGC 1740CCTTCCCTGT CCAAGATATC GGTTACTCCT CTCATTATGG CGAGCTACTT TGTGAATTAA 1800TTGACTGAGG GATATACCAC CTTCCCTTTG AAGGTACCGA GCCACTACCT TGAGCGTTAG 1860TTACTTTTTC GAGGAAAGCA TCCTATGCTA GTCTCTGCCA ATCACTGCAG CGTCGACAAC 1920TTGCCATAGC CTTGTGTTCT TCACGGTCTA TCGGAACACC CGTTCATGAC TGAAAGGGGT 1980CAGCGTCCGT GGTGGTCAAC ATCATTCTCA TCTTTCATCA TGCCCGCTGA TTGATAGAGT 2040AATTTCCGGT GGAGCACAAC GCCGTCCTCT GAGATGCAAT GTCACCCTGT AAGTTTCAAC 2100TACAATCTGT AGTACAGAGC ATCCTTGTAC TTGCATGCTG TGCAAGTGAT CCAAATCCGT 2160AGAACTTGCT CGAGAACAGG GAAATATAGA ACTCCTGAAG GTTATAAATA CCACATGCAT 2220CCCTCGTCCA TCCTCACTTC CATCATCAAG CCAGCGGTTT CTATCCTCCG ACTTGAGTTG 2280TTCTTGCGCA TCTTTACAAT CTTCTCATCA TGCAGTCCAT CAAGCGTACC TTGCTCCTCC 2340TCGGAGCTAT CCTTCCCGCG GTCCTCGGTG CCCCTGTGCA GGAAACCCGC CGGGCCGCTG 2400AGAAGCTTCC TGGAAAGTAC ATTGTCACAT TCAAGCCCGG CATTGACGAG GCAAAGATTC 2460AGGAGCATAC CACCTGGGCT ACCAACATTC ACCAGCGCAG TCTGGAGCGT CGTGGCGCCA 2520CTGGCGGTGA TCTTCCTGTC GGTATTGAGC GCAACTACAA GATCAACAAG TTCGCCGCCT 2580ATGCAGGCTC TTTCGACGAT GCTACCATTG AGGAGATTCG CAAGAACGAA GATGTTTGTG 2640GTCATCCGCT CGCATTTTTG AATGACAGCT AACTCGCGCC CAGGTTGCCT ACGTCGAGGA 2700GGACCAGATC TACTACCTCG ATGGCCTGAC TACCCAGAAG AGTGCCCCCT GGGGTCTGGG 2760CAGCATTTCC CACAAGGGCC AGCAGAGCAC CGACTACATC TACGACACTA GTGCCGGCGA 2820GGGCACCTAT GCCTACGTGG TGGATAGCGG TGTCAATGTC GACCATGAGG AGTTCGAGGG 2880CCGCGCCAGC AAGGCCTACA ACGCTGCCGG TGGTCAGCAT GTGGACAGCA TTGGCCATGG 2940CACCCACGTT TCCGGCACCA TTGCTGGCAA GACTTATGGT ATCGCCAAGA AGGCCAGCAT 3000CCTTTCGGTC AAAGTTTTCC AGGGTGAATC GAGCAGCACT TCCGTCATTC TTGACGGCTT 3060CAACTGGGCT GCCAACGACA TTGTTAGCAA GAAGCGTACC AGCAAGGCTG CAATCAACAT 3120GAGCTTGGGT GAGTTTACAT TGTTCTTCTC TACTTGGAAC GCGCGAGCGC TAATTTCAAA 3180AACACAGGCG GTGGCTACTC TAAGGCTTTC AACGATGCGG TCGAGAACGC ATTCGAGCAG 3240GGTGTTCTCT CGGTTGTCGC TGCCGGTAAC GAGAACGTAC GTCTCCCCTC CATCGCGCAA 3300AGACGAATTC GTAACTGACT TGATTTTCTT AGTCTGATGC CGGCCAAACC AGCCCTGCCT 3360CTGCCCCTGA TGCCATCACT GTTGCCGCTA TCCAGAAGAG CAACAACCGC GCCAGTTTCT 3420CCAACTTTGG CAAGGTCGTT GACGTCTTCG CTCCCGGTCA AGATATCCTT TCTGCCTGGA 3480TTGGCTCTTC CTCTGCCACC AACACCATCT CTGGTACCTC CATGGCTACT CCCCACATTG 3540TCGGCCTGTC CCTCTACCTC GCTGCCCTTG AGAACCTCGA TGGCCCCGCT GCCGTGACCA 3600AGCGCATCAA GGAGTTGGCC ACCAAGGACG TCGTCAAGGA TGTTAAGGGC AGCCCTAACC 3660TGCTTGCCTA CAACGGTAAC GCTTAAGTAC CAGGAGTACG TCGCAGGATT CTACCATTGT 3720TACTGGAATA CAATGATGAT TAGAAAACGA AGAGCGTTAT GATTCGGACG GATATATGCA 3780TGGCACCCAT ACAGCGTGAT ACATAGGCTG TTTGCTCAAG AATTAGGATT TTATCTGAAT 3840CCATGTACAG AGTATACTTA TGTTAGTAGT CAATAAAATC TTGGCTTTCT AATTTTGTCC 3900CATCTACAAG GGGTCGTCGA TC 3922

Claims

1.一种用于异源多肽生产的丝状真菌，通过重组DNA技术对该真菌进行了修饰，使得具有SEQ ID NO 1所示序列或与其至少有80％同源的DNA序列的alp基因编码的内源性碱性蛋白酶活性被完全或部分灭活。

2.根据权利要求1的真菌，其中所述灭活通过编码一种碱性蛋白酶基因产物的序列的核苷酸删除、插入或替换的方法来实现。

3.根据权利要求1的真菌，其中所述灭活通过干扰调节碱性蛋白酶基因表达的表达信号的调控来实现。

4.根据权利要求1的真菌，其中所述灭活是利用反义技术实现的。

5.根据权利要求1到4项中任一项的真菌，它是丝状真菌。

6.根据权利要求5的真菌，它属于选自下面组中的属：曲霉属，木霉属，腐质霉属，假丝酵母属，Acremonium，镰孢霉属和青霉属。

7.权利要求6的真菌，其属于选自下组中的种：米曲霉，黑曲霉，泡盛曲霉、海枣曲霉，日本曲霉，臭曲霉，构巢曲霉，T.reesei，T.harzianum，H.insulens，H.lanuginosa，禾本科镰孢，腐皮镰孢，F.venenatum和产黄青霉。

8.一种产生权利要求1的丝状真菌的方法，其中碱性蛋白酶基因的灭活是通过下列步骤完成的：i)从目标真菌中克隆目标碱性蛋白酶基因；ii)产生含有碱性蛋白酶基因的DNA构建体，其中该基因一部分已被替换或删除，或是在该基因中插入了额外DNA；iii)用该DNA构建体转化所述真菌，且iv)根据下列特征分离转化子：

1)没有可检测到的碱性蛋白酶活性；

2)能检测到碱性蛋白酶活性水平的降低；或者

3)可获得失去功能的碱性蛋白酶。

9.根据权利要求8的方法，其中所述灭活通过编码碱性蛋白酶基因产物的序列的核苷酸删除、插入或替换的方法来实现。

10.根据权利要求8的方法，其中所述灭活通过干扰调节碱性蛋白酶基因表达的表达信号的调控来实现。

11.根据权利要求8的方法，其中所述灭活是利用反义技术实现的。

12.根据权利要求8的方法，其中所述真菌是丝状真菌。

13.根据权利要求12的方法，其中所述真菌属于选自下面组中的属：曲霉属，木霉属，腐质霉属，假丝酵母属，Acremonium，镰孢霉属和青霉属。

14.根据权利要求13的方法，其中所述真菌属于选自下组中的种：米曲霉，黑曲霉，泡盛曲霉、海枣曲霉，日本曲霉，臭曲霉，构巢曲霉，T.reesei，T.harzianum，H.insulens，H.lanuginosa，禾本科镰孢，腐皮镰孢，F.venenatum和产黄青霉。

15.根据权利要求8的方法，其中所述基因部分是基因内在部分。

16.根据权利要求8的方法，其中所述碱性蛋白酶基因是含有SEQID No 1所示序列或与其至少80％同一性的DNA序列的alp基因。

17.一种产生权利要求1的真菌的方法，其中利用反义技术获得碱性蛋白酶基因的灭活，该方法包括：

i)构建能合成与转录自碱性蛋白酶基因的mRNA互补的一种RNA分子的一种表达质粒；

ii)用该表达质粒和合适的标记转化宿主真菌细胞；

iii)用该标记选择转化子；和

iv)从所选择的转化子中筛选目标碱性蛋白酶产物合成降低的转化子。

18.根据权利要求17的方法，其中所述真菌是丝状真菌。

19.根据权利要求18的方法，其中所述真菌属于选自下面组中的属：曲霉属，木霉属，腐质霉属，假丝酵母属，Acremonium，镰孢霉属和青霉属。

20.根据权利要求19的方法，其中所述真菌属于选自下组中的种：米曲霉，黑曲霉，泡盛曲霉、海枣曲霉，日本曲霉，臭曲霉，构巢曲霉，T.reesei，T.harzianum，H.insulens，H.lanuginosa，禾本科镰孢，腐皮镰孢，F.venenatum和产黄青霉。

21.根据权利要求17的方法，其中所述碱性蛋白酶基因是含有SEQ ID No 1所示序列或与其至少80％同一性的DNA序列的alp基因。

22.一种产生权利要求1的真菌的方法，其中所述真菌经修饰后生产碱性蛋白酶的水平比野生型菌株低，修饰方法包括利用当整合到该真菌基因组后能引起功能性碱性蛋白酶产量降低的DNA构建体转化该真菌的亲本细胞。

23.根据权利要求22的方法，其中所述碱性蛋白酶基因是含有SEQ ID No 1所示序列或与其至少80％同一性的DNA序列的alp基因。

24.一种生产异源多肽的方法，其包括培养一种已用编码期望的基因产物的DNA序列转化的根据权利要求1的真菌宿主细胞。

25.根据权利要求24的方法，其中所述灭活通过编码一种碱性蛋白酶基因产物的序列的核苷酸删除、插入或替换的方法来实现。

26.根据权利要求24的方法，其中所述灭活通过干扰调节碱性蛋白酶基因表达的表达信号的调控来实现。

27.根据权利要求24的方法，其中所述灭活是利用反义技术实现的。

28.根据权利要求24的方法，其中所述真菌是丝状真菌。

29.根据权利要求28的方法，其中所述真菌属于选自下面组中的属：曲霉属，木霉属，腐质霉属，假丝酵母属，Acremonium，镰孢霉属和青霉属。

30.权利要求29的方法，其中所述真菌属于选自下组中的种：米曲霉，黑曲霉，泡盛曲霉、海枣曲霉，日本曲霉，臭曲霉，构巢曲霉，T.reesei，T.harzianum，H.insulens，H.lanuginosa，禾本科镰孢，腐皮镰孢，F.venenatum和产黄青霉。

31.根据权利要求24的方法，其中所述多肽由所述真菌宿主细胞分泌到胞外培养基中。

32.根据权利要求31的方法，其中所述多肽从所述培养基中回收并纯化。

33.根据权利要求24的方法，其中发酵在pH5到11的条件下进行。

34.根据权利要求32的方法，其中发酵在pH6到10.5的条件下进行。

35.根据权利要求32的方法，其中发酵在pH7到10的条件下进行。

36.根据权利要求32的方法，其中发酵在pH8到9.5的条件下进行。

37.根据权利要求24的方法，其中所述期望的基因产物是一种选自下组中的酶：一种糖苷酶；一种纤维素酶；一种木聚糖酶；α-半乳糖苷酶；多聚半乳糖醛酸酶；纤维素1，4-β-纤维二糖苷酶和一种内切葡聚糖酶。

38.根据权利要求37的方法，其中所述期望的基因产物是选自下组的酶：淀粉酶；内切-1，4-β-葡聚糖酶或内切-1，3-β-葡聚糖酶；内切-1，4-β-木聚糖酶或木聚糖-内切-1，3-β-木糖苷酶；内切-1，6-β-葡聚糖酶，内切-1，2-β-葡聚糖酶，内切-1，3-β-葡聚糖酶或内切-1，3-α-葡聚糖酶。

39.根据权利要求37的方法，其中所述期望的基因产物是α-淀粉酶或β-淀粉酶。

40.根据权利要求24的方法，其中所述期望的基因产物是一种选自下组中的真核多肽：胰岛素，生长激素，胰高血糖素，促生长素抑制素，干扰素，血小板衍生生长因子，第七因子，第八因子，尿激酶，组织型纤溶酶原激活剂，促红细胞生成素和血小板生成素。

41.根据权利要求24的方法，其中所述的异源多肽是真菌来源的蛋白质。

42.根据权利要求41的方法，其中的产物是选自下组中的真菌的酶：淀粉分解酶，葡糖淀粉酶，β-半乳糖苷酶，肌醇六磷酸酶，细胞溶解酶，脂解酶，木聚糖降解酶，蛋白水解酶，氧化还原酶，果胶酶，角质酶和蛋白质二硫键异构酶。

43.根据权利要求41的方法，其中的产物是选自下组中的真菌酶：α-淀粉酶，β-淀粉酶，过氧化物酶或漆酶。

44.根据权利要求24的方法，其中所述异源多肽是细菌来源的。

45.权利要求44的方法，其中细菌蛋白质是一种选自下组中的酶：淀粉分解酶，葡糖淀粉酶，β-半乳糖苷酶，细胞溶解酶，脂解酶和蛋白水解酶。