CN1342204A - 用于在真菌细胞中生产多肽的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用于生产多肽的方法,包括(a)在适合于多肽生产的条件下培养亲本真菌细胞的突变体,其中突变细胞包含两种核酸序列,第一种核酸序列包含pacC pH信号转导途径的一种或多种基因或其同源物的修饰,第二种核酸序列编码多肽;和(b)由培养液分离多肽。

Description

用于在真菌细胞中生产多肽的方法

                  发明背景

发明领域

本发明涉及用于在蛋白酶缺陷的细胞中生产多肽的方法。

相关技术的描述

许多微生物能够在宽pH范围生长。这种能力需要保护细胞内过程免受极端pH影响的有效pH稳态机制和确保位于pH稳态界限之外的活性只发生于适当环境pH的方法。

pacC基因编码称为PacC的蛋白质，PacC是一种序列特异的DNA结合蛋白，激活优先在碱性pH合成的产物之基因的表达，并抑制适于在酸性生长条件下的基因产物的合成。Tilburn等人(1995，欧洲分子生物学杂志(EMBO Journal)14：779-790)提出，当存在由应答碱性环境pH的palA、B、C、F、H、和I基因产物介导的信号时，构巢曲霉(Aspergillus nidulans)中的PacC激活碱性表达基因的转录。已知palA、B、C、F、H、和I基因属于PacC pH信号转导途径。由此，当处于碱性环境pH时，碱性基因的表达升高，而酸性基因的表达降低。在酸性条件下，PacC处于非功能形式且其水平降低，导致酸表达基因产物的脱抑制和碱性表达基因(包括pacC自身)激活的缺乏。

pacC基因或Pac pH信号转导途径基因的一些突变能够模仿处于实际环境pH之外时的生长效果(Caddick等人，1986，分子普通遗传学(Molecular General Genetics)203：346-353；Shah等人，1991，FEMS微生物学通讯(FEMS Microbiological Letters)77：209-212；Espeso等人，1993，欧洲分子生物学杂志(EMBO Journal)12：3947-3956；Arst等人，1994，分子普通遗传学(Molecular GeneralGenetics)245：87-790)。6种基因palA、B、C、F、H、和I任一种中的一些突变模仿处于酸性pH的生长效果，并导致例如酸性磷酸(酯)酶水平升高和碱性磷酸(酯)酶水平降低。相反，pacC基因中的一些突变模仿处于碱性pH的生长效果，并导致例如碱性磷酸(酯)酶水平升高和酸性磷酸(酯)酶水平降低。模仿碱性条件生长的这些pacC基因突变除去了调节其活性的C端片段。当除去了酸性C端结构域之后，PacC是有活性的，能够激活碱性条件生长所需基因的表达并抑制酸性条件生长所需基因的表达。pacC基因的这些突变回避了对信号转导途径的需要，导致碱性表达基因的构成和酸性表达基因的超抑制。

已经由构巢曲霉(Tilburn等人，1995，见上文)、黑曲霉(Aspergillus niger)(Maccabe等人，1996，分子普通遗传学(MolecularGeneral Genetics)250：367-374)、寄生曲霉(Aspergillus parasiticus)(Pinero和Keller，1997，植物病理学(Phytopathology)87：S78)、和产毒青霉(Penicillium chrysogenum)(Suarez等人，1996，分子微生物学(Molecular Microbiology)20：529-540)克隆了pacC基因。

已经公开了PacC pH信号转导途径中的基因，包括构巢曲霉palA(Negrete-Urtasun等人，1997，细菌学杂志(Journal of Bacteriology)179：1832-1835)、构巢曲霉palB基因(Denison等人，1995，生物化学杂志(Journal of Biological Chemistry)270：28519-28522)；构巢曲霉palF基因(Maccheroni等人，1997，基因(Gene) 194：163-167；)、和构巢曲霉palI基因(Arst等人，1994，见上文)。

Caddick等人(1986，分子普通遗传学(Molecular GeneralGenetics)203：346-352)和Arst等人(1994，分子普通遗传学(Molecular General Genetics)245：787-790)已经描述了PacC pH信号转导突变体。

在不需要破坏或删除负责总蛋白水解活性的每一种基因的情况下，降低或消除对感兴趣蛋白质的生产有害的蛋白水解活性的能力(特别是在重组细胞中)，将提供本领域目前不可获得然而非常有吸引力的替代物。

本发明的一个目的是提供用于在真菌细胞中生产蛋白质的改进方法。

                    发明概述

本发明涉及用于生产多肽的方法，包括：(a)在适合于多肽生产的条件下培养亲本真菌细胞的突变体，其中突变细胞包含两种核酸序列，第一种核酸序列包含pacCpH信号转导途径的至少一种基因或其同源物的修饰，第二种核酸序列编码多肽；和(b)由培养液分离多肽。

                    附图简述

图1显示了米曲霉(Aspergillus orzae)palB基因的基因组核酸序列和推导的氨基酸序列(分别为SEQ ID NO：1和2)。

图2显示了pJaL400的限制性图谱。

图3显示了pMT1935的限制性图谱。

图4显示了pJaL394的限制性图谱。

图5显示了pMT1931的限制性图谱。

图6显示了pMT1936的限制性图谱。

图7显示了米曲霉palA基因的部分基因组核酸序列和推导的氨基酸序列(分别为SEQ ID NO：3和4)。

图8显示了pBM1a的限制性图谱。

图9显示了pBM7的限制性图谱。

图10显示了pBM8的限制性图谱。

                        发明详述

本发明涉及用于生产多肽的方法，包括：(a)在适合于多肽生产的条件下培养亲本真菌细胞的突变体，其中突变型真菌细胞通过修饰与亲本细胞有关，如pacC pH信号转导途径的一种或多种基因或其同源物的破坏或删除；和(b)由突变细胞培养液分离多肽。

术语“pacC pH信号转导途径”此处定义为感觉微生物生长环境的环境pH，并通过基因palA、palB、palC、palF、palH、和palI编码的一组细胞内蛋白质，促进PacC转变成有活性的转录因子的蛋白水解加工的途径。激活的PacC开启碱性条件生长所需基因的表达，并关闭酸性条件生长所需基因的表达。可以理解，本发明的方法包括palA、palB、palC、palF、palH、和palI基因的同源物。

在本发明的方法中，可以修饰参与pacC pH信号转导途径的任何真菌细胞基因，包括(但不限于)丝状真菌或相似同源酵母(如Rim9p；Denison等人，1998，分子微生物学(Molecular Microbiology)30：259-264)的palA、palB、palC、palF、palH、和/或palI基因。在优选的实施方案中，基因是palA基因。在另一个优选的实施方案中，基因是palB基因。在更优选的实施方案中，基因是具有核酸序列SEQ IDNO：1的米曲霉palA基因。在另一个更优选的实施方案中，基因是具有核酸序列SEQ ID NO：3的米曲霉palB基因。

如下文所示，真菌细胞pacC pH信号转导途径中的一种或多种基因的修饰降低了由细胞产生的蛋白水解活性的量。一种或多种蛋白酶可能负责蛋白水解活性。在碱性条件下由PacC引起的特定蛋白酶基因表达降低产生的缺陷，由于缺乏由palA、B、C、F、H、和I基因编码的基因产物组介导的信号，并不激活碱性表达基因的转录。

使用本领域众所周知的方法，通过降低或消除一种或多种上述基因的表达，可以构建pacC pH信号转导途径突变型细胞。例如，通过改变对活性必需的编码区或其一部分或者表达编码区所需调控功能，可以修饰或灭活基因。这种调控或控制序列的实例可以是启动子序列或其功能性部分，即足以影响核酸序列表达的一部分。可能修饰的其它控制序列包括(但不限于)前导序列、多聚腺苷酸化序列、前肽序列、信号肽序列、转录终止子、和转录激活子。

基因的修饰或灭活可以如下进行，对亲本细胞进行诱变，选择能够在亲本细胞标准生长pH之外生长的突变型细胞，随后测量突变型细胞对亲本细胞的蛋白水解活性。例如，可以通过使用合适的物理或化学诱变剂，或通过使用合适的寡核苷酸，或通过将DNA序列进行PCR诱变，来进行特异的或随机的诱变。此外，可以通过使用这些诱变剂的任意组合来进行诱变。

适合于本发明目的的物理或化学诱变剂的范例包括紫外线(UV)照射、羟胺、N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)、O-甲基羟胺、亚硝酸、甲基磺酸乙酯(EMS)、亚硫酸氢钠、甲酸、和核苷酸类似物。

使用这些试剂时，通常如下进行诱变，在合适条件下，在存在选定诱变剂时，温育待诱变的亲本细胞，并筛选展示pacCpH信号转导途径的基因表达降低的突变型细胞。

可以通过在基因或其转录或翻译所需调控元件中导入、替代、或除去一个或多个核苷酸，来实现pacC pH信号转导途径中的一种或多种基因的修饰或灭活。例如，可以插入或除去核苷酸，从而导入终止密码子、除去起始密码子、或改变开放读码框。可以根据本领域的已知方法，通过定点诱变或PCR诱变，实现这些修饰或灭活。虽然从理论上说，可以在体内(即直接在表达待修饰基因的细胞上)进行修饰，但是优选如下文例示的在体外进行修饰。

灭活pacC pH信号转导途径的方便方法的范例是基于基因替换、基因删除、或基因破坏的技术。在基因破坏的方法中，在体外对对应于感兴趣的内源基因或基因片段的核酸序列进行诱变以产生缺陷型核酸序列，然后用该序列转化亲本细胞以产生缺陷型基因。通过同源重组，缺陷型核酸序列取代了内源基因或基因片段。可能期望缺陷型基因或基因片段还编码可用于选择其中核酸序列已被修饰或破坏的转化体的标记。

或者，可以通过已建立的反义技术，使用与基因的核酸序列互补的核苷酸序列，进行pacC pH信号转导途径中的一种或多种基因的修饰或灭活。更具体的说，可以通过导入与基因的核酸序列互补、可以在细胞中转录、并能够与细胞中产生的mRNA杂交的核苷酸序列，来降低或消除基因的表达。在能使互补的反义核苷酸序列与mRNA杂交的条件下，翻译的蛋白质的量由此被降低或消除。

与涉及真菌细胞中pacC pH信号转导途径的基因的核酸序列互补或同源的核酸序列可以由包含这些基因的微生物来源获得。具有与米曲霉核酸序列SEQ ID NO：1互补或同源的核酸序列的palA基因的优选来源是构巢曲霉。具有与米曲霉核酸序列SEQ ID NO：3互补或同源的核酸序列的palB基因的优选来源是构巢曲霉。

pacC pH信号转导途径其它基因(可能与所选真菌细胞相应基因的核酸序列互补或同源)的优选丝状真菌来源包括(但不限于)来自构巢曲霉的palF基因(Maccheroni等人，1997，见上文)和来自构巢曲霉的palI基因(Arst等人，1994，见上文)。此外，核酸序列对于真菌细胞可能是天然的。

pacC pH信号转导途径基因同源物(可能与所选真菌细胞相应基因的核酸序列互补或同源)的优选酵母来源包括(但不限于)酿酒酵母(Rim9p；Denison等人，1998，见上文)。

在优选的实施方案中，突变型真菌细胞还包含两个或多个拷贝的pacC基因。两个或多个拷贝的pacC基因预防了pal突变表型的基因外抑制。基因外抑制显示为导致PacC组成性活性的pacC的平截。

pacC对于真菌细胞可以是天然的或异源的。来自丝状真菌的pacC基因的优选来源包括(但不限于)构巢曲霉(Tilburn等人，1995，见上文)、黑曲霉(Maccabe等人，1996，见上文)、寄生曲霉(Pinero和Keller，1997，见上文)、和产毒青霉(Suarez等人，1996，见上文)。来自酵母的pacC基因同源物的优选来源包括(但不限于)Yarrowia lipolytica(Lambert等人，1997，分子和细胞生物学(Molecularand Cellular Biology)17：3966-3976)和酿酒酵母(Su和Mitchell，1993，核酸研究(Nucleic Acids Research)21：3789-3797)。

在本发明的方法中，PacC pH信号转导条件的修饰导致一种或多种蛋白酶的产量降低或消除。

术语“一种或多种蛋白酶”此处定义为一种或多种外肽酶和/或内肽酶。外肽酶切割接近底物氨基或羧基末端的肽键，而内肽酶切割远离底物末端的肽键(Rao，1998，微生物学和分子生物学回顾(Microbiology and Molecular Biology Reviews) 62：597-635)。外肽酶可以是氨肽酶或羧肽酶。外肽酶或内肽酶可以是丝氨酸蛋白酶、金属蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、或半胱氨酸蛋白酶(Rao等人，1998，见上文，North，1982，微生物学回顾(Microbiological Reviews)46：308-340；Otto如Schirmeister，1997，化学回顾(Chemical Reviews)97：133-171)。在优选的实施方案中，一种或多种蛋白酶是丝氨酸蛋白酶。在另一个优选的实施方案中，一种或多种蛋白酶是金属蛋白酶。在另一个优选的实施方案中，一种或多种蛋白酶是天冬氨酸蛋白酶。在另一个优选的实施方案中，一种或多种蛋白酶是半胱氨酸蛋白酶。在另一个优选的实施方案中，一种或多种蛋白酶是氨肽酶。在另一个优选的实施方案中，一种或多种蛋白酶是羧肽酶。在另一个优选的实施方案中，一种或多种蛋白酶是丝氨酸蛋白酶、金属蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、氨肽酶、和/或羧肽酶。

可以使用本领域众所周知的任何方法测定蛋白酶的活性。还可以使用本领域众所周知的、对丝氨酸蛋白酶、金属蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、或半胱氨酸蛋白酶特异的蛋白酶抑制剂鉴定蛋白水解活性的类型。参阅例如North，1982，见上文；Otto和Schirmeister，1997，见上文；和Rao等人，1998，见上文。

在本发明的方法中，在相同条件下培养时，与相应的亲本真菌细胞相比，优选突变型真菌细胞产生的一种或多种蛋白酶少至少大约25％，更优选至少大约50％，甚至更优选至少大约75％，最优选至少大约95％。在最优选的实施方案中，在相同条件下培养时，与相应的亲本真菌细胞相比，突变型真菌细胞不产生可检测的蛋白酶。在适合于生产感兴趣多肽的条件下，或者在适合于生产一种或多种蛋白酶的条件下，可以在一种或多种蛋白质的生产方面比较亲本和突变细胞。

在本发明的方法中，多肽可以是对于感兴趣的突变型真菌细胞是天然的或异源的任何多肽。

术语“多肽”此处并非指特定长度的编码产物，因此包括肽、寡肽、和蛋白质。术语“异源多肽”此处定义为对于真菌细胞不是天然的多肽、经修饰而改变了天然序列的天然多肽、或由于对真菌细胞进行了重组DNA技术的操作从而其表达在数量上发生了改变的天然多肽。例如，可以重组生产天然多肽，如通过将编码多肽的基因置于不同启动子的控制之下以增强多肽的表达，通过使用信号序列以促进感兴趣的天然天然外排到细胞外，并增加编码由细胞正常产生的多肽的基因的拷贝数。突变型真菌细胞可以包含一个或多个拷贝的编码多肽的核酸序列。

多肽优选激素或其变体、酶、受体或其一部分、抗体或其一部分、或报道基因。在更优选的实施方案中，多肽是氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂合酶、异构酶、或连接酶。在甚至更优选的实施方案中，多肽是氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、壳多糖酶、角质酶、环状糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、转化酶、漆酶、脂酶、甘露糖苷酶、齿斑葡聚糖酶(mutanase)、氧化酶、果胶分解酶、过氧化物酶、磷脂酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶、或木聚糖酶。

可以由任何原核、真核、或其它来源获得编码感兴趣的多肽、能够在真菌细胞中表达的核酸序列。为了本发明的目的，术语“由……获得”如此处与指定来源一起使用时，指多肽由该来源或插入了来自该来源的基因的细胞产生。

用于分离或克隆编码感兴趣多肽的核酸序列的技术在本领域是已知的，并包括由基因组DNA的分离方法、由cDNA的制备方法、或其组合。例如通过使用众所周知的聚合酶链式反应(PCR)，能够由这种基因组DNA克隆核酸序列。参阅Innis等人，1990，《PCR方法和应用指南》(PCR：A Guide to Method and Application)，AcademicPress，纽约。克隆步骤可能涉及切割并分离包含编码多肽的核酸序列的期望核酸片段，将片段插入载体分子，并将重组载体掺入将复制多个拷贝或克隆的核酸序列的突变型真菌细胞。核酸序列可以是基因组、cDNA、RNA、半合成、合成来源、或其任意组合。

在本发明的方法中，多肽还可以包括融合或杂合多肽，其中另一种多肽融合在多肽或其片段的N端或C端。通过将编码一种多肽的核酸序列(或其部分)与编码另一种多肽的核酸序列(或其部分)融合而产生融合多肽。用于产生融合多肽的技术在本领域是已知的，并包括连接编码各种多肽的编码序列，使得它们处于同一读码框，且融合多肽的表达受相同启动子和终止子的控制。杂合多肽可以包括至少两种不同多肽的部分或完整多肽序列的组合，其中一种或多种多肽对于突变型真菌细胞可能是异源的。

可以以多种方式操作编码感兴趣多肽的分离核酸序列，以提供多肽的表达。表达应理解为包括涉及多肽生产的任何步骤，包括(但不限于)转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰、和分泌。在插入载体前对核酸序列进行操作可能是希望的或必需的，这取决于表达载体。利用克隆方法用于修饰核酸序列的技术在本领域是众所周知的。

“核酸构建物”此处定义为由天然产生的基因分离的、或经修饰包含以自然界中不存在的方式组合和并列的核酸片段的单链或双链核酸分子。当核酸构建物包含本发明编码序列表达所需的所有控制序列时，术语“核酸构建物”与术语“表达盒”同义。术语“编码序列”此处定义为直接指示其蛋白质产物的氨基酸序列的核酸序列。基因组编码序列的边界通常由正好位于mRNA开放读码框5’末端上游的ATG起始密码子(真核生物)和正好位于mRNA开放读码框3’末端下游的转录终止子序列确定。编码序列可以包括(但不限于)DNA、cDNA、和重组核酸序列。

术语“控制序列”此处定义为包括对感兴趣多肽的表达必需或有利的所有成分。每一种控制序列对于编码多肽的核酸序列可以是天然的或外来的。这些控制序列包括(但不限于)前导序列、多聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列、和转录终止子。最低限度，控制序列包括启动子，和转录和翻译终止信号。为了导入有助于将控制序列与编码多肽的核酸序列编码区连接的特异限制性位点，可以与接头一起提供控制序列。术语“可操作连接”此处定义为其中控制序列被正确置于相对于DNA序列编码序列的位置使得控制序列指导多肽表达的这样一种构象。

控制序列可以是恰当的启动子序列，即由用于表达核酸序列的真菌细胞识别的核酸序列。启动子序列包含介导多肽表达的转录控制序列。启动子可以是在选定的真菌细胞中显示转录活性的任何核酸序列，包括突变的、截短的、和杂合的启动子，而且可以由编码对于真菌细胞是同源的或异源的胞外或胞内多肽的基因获得。

用于在丝状真菌细胞中指导核酸构建物转录的合适启动子的范例是由编码米曲霉的TAKA淀粉酶、米赫根毛霉(Rhizomucor miehei)的天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉的中性α-淀粉酶、黑曲霉的酸稳定α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉(Aspergillus awamori)的葡糖淀粉酶(glaA)、米赫根毛霉的脂酶、米曲霉的碱性蛋白酶、米曲霉的磷酸丙糖异构酶、构巢曲霉的乙酰胺酶、尖镰孢(Fusarium oxysporum)的胰蛋白酶样蛋白酶(WO 96/00787)获得的启动子，以及NA2-tpi启动子(黑曲霉的中性α-淀粉酶基因和米曲霉的磷酸丙糖异构酶基因启动子的杂合体)，及其突变的、截短的、和杂合的启动子。

在酵母宿主中，有用的启动子由酿酒酵母的烯醇化酶(ENO-1)基因、酿酒酵母的半乳糖激酶(GAL1)基因、酿酒酵母的醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH2/GAP)基因、和酿酒酵母的3-磷酸甘油酸激酶基因获得。Romanos等人(1992，酵母(Yeast)8：423-488)描述了用于酵母宿主细胞的其它有用的启动子。

控制序列还可以是合适的转录终止子序列，即由真菌细胞识别以终止转录的序列。终止子序列与编码多肽的核酸序列的3’端可操作连接。在选定的真菌细胞中发挥功能的任何终止子都可以用于本发明。

用于丝状真菌细胞的优选终止子由编码米曲霉的TAKA淀粉酶、黑曲霉的葡糖淀粉酶、构巢曲霉的邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉的α-糖苷酶、和尖镰孢的胰蛋白酶样蛋白酶的基因获得。

用于酵母细胞的优选终止子由编码酿酒酵母的烯醇化酶、酿酒酵母的细胞色素C(CYC1)、或酿酒酵母的甘油醛-3-磷酸脱氢酶的基因获得。Romanos等人(1992，见上文)描述了用于酵母细胞的其它有用的终止子。

控制序列还可以是合适的前导序列，即对于真菌细胞进行的翻译重要的mRNA非翻译区。前导序列与编码多肽的核酸序列的5’端可操作连接。在选定的真菌细胞中发挥功能的任何前导序列都可以用于本发明。

用于丝状真菌细胞的优选前导序列由编码米曲霉的TAKA淀粉酶和构巢曲霉的磷酸丙糖异构酶的基因获得。

用于酵母细胞的合适前导序列由编码酿酒酵母的烯醇化酶(ENO-1)、酿酒酵母的3-磷酸甘油酸激酶、酿酒酵母的α-因子、和酿酒酵母的醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH2/GAP)的基因获得。

控制序列还可以是多聚腺苷酸化序列，即与核酸序列的3’端可操作连接、当转录时由真菌细胞识别作为向转录的mRNA添加多聚腺苷酸残基的信号的序列。在选定的真菌细胞中发挥功能的任何多聚腺苷酸化序列都可以用于本发明。

用于丝状真菌细胞的优选多聚腺苷酸化序列由编码米曲霉的TAKA淀粉酶、黑曲霉的葡糖淀粉酶、构巢曲霉的邻氨基苯甲酸合酶、尖镰孢的胰蛋白酶样蛋白酶、和黑曲霉的α-糖苷酶的基因获得。

Guo和Sherman(1995，分子细胞生物学(Molecular CellularBiology)15：5983-5990)描述了用于酵母细胞的有用的多聚腺苷酸化序列。

控制序列还可以是编码与多肽的氨基末端连接并引导编码的多肽进入细胞分泌途径的氨基酸序列的信号肽编码区。核酸序列的编码序列的5’端可能固有的包含在翻译读码框中与编码分泌多肽的编码区天然连接的信号肽编码区。或者，编码序列的5’端可能包含对于编码序列是外源的信号肽编码区。当编码序列天然不含信号肽编码区时，可能需要外源信号肽编码区。或者，为了增强多肽的分泌，可以仅仅用外源信号肽编码区取代天然信号肽编码区。但是，引导表达的多肽进入选定真菌细胞的分泌途径的任何信号肽编码区都可以用于本发明。

用于丝状真菌细胞的有效信号肽编码区是由编码米曲霉的TAKA淀粉酶、黑曲霉的中性淀粉酶、黑曲霉的葡糖淀粉酶、米赫根毛霉的天冬氨酸蛋白酶、Humicola insolens的纤维素酶、和Humicolalanuginosa的脂酶的基因获得的信号肽编码区。

用于酵母细胞的有用信号肽由编码酿酒酵母的α-因子和酿酒酵母的转化酶的基因获得。Romanos等人(1992，见上文)描述了其它有用的信号肽编码区。

控制序列还可以是编码位于多肽氨基末端的氨基酸序列的前肽编码区。产生的多肽称为前酶或前多肽(或者在某些情况中称为酶原)。前多肽通常是无活性的，而且可以由前多肽通过前肽的催化或自催化切割转变成成熟的有活性多肽。前肽编码区可以由酿酒酵母的α-因子基因、米赫根毛霉的天冬氨酸蛋白酶基因、和嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)的漆酶基因(WO 95/33836)获得。

当信号肽和前肽区都存在于多肽的氨基末端时，前肽区紧靠多肽的氨基末端，而信号肽区紧靠前肽区的氨基末端。

可能还需要添加能够相对于真菌细胞的生长调控多肽表达的调控序列。调控系统的范例是应答化学或物理刺激(包括存在调控化合物)引起基因表达开启或关闭的调控系统。原核系统中的调控系统包括lac、tac、和trp操纵子系统。在酵母中，可以使用ADH2系统或GAL1系统。在丝状真菌中，可以使用TAKAα-淀粉酶启动子、黑曲霉的葡糖淀粉酶启动子、和米曲霉的葡糖淀粉酶启动子作为调控序列。调控序列的其它范例是能够用于扩增基因的调控序列。在真核系统中，包括当存在氨甲喋呤时扩增的二氢叶酸还原酶基因和当存在重金属时扩增的金属硫蛋白基因。在这些情况中，编码多肽的核酸序列将与调控序列可操作连接。

在本发明的方法中，可以使用用于改变编码感兴趣多肽的内源基因表达的核酸构建物。该构建物可以包含改变内源基因表达所需最小数目的成分。在一个实施方案中，该核酸构建物优选包含(a)靶向序列、(b)调控序列、(c)外显子、和(d)剪接供体位点。将核酸构建物导入细胞后，构建物通过同源重组插入细胞基因组中的内源基因位点。靶向序列指导元件(a)-(d)整合到内源基因中，使得元件(b)-(d)与内源基因可操作连接。在另一个实施方案中，核酸构建物包含(a)靶向序列、(b)调控序列、(c)外显子、(d)剪接供体位点、(e)内含子、和(f)剪接受体位点，其中靶向序列指导元件(a)-(f)的整合，使得元件(b)-(f)与内源基因可操作连接。但是，构建物可以包含其它成分，诸如选择标记。

在这两个实施方案中，这些成分的导入产生了内源基因表达改变了的新的转录单位。在本质上，新的转录单位是通过靶向构建物导入的序列和内源基因的融合产物。在内源基因改变了的一个实施方案中，基因被激活。在该实施方案中，使用同源重组，插入将引起基因以高于相应亲本细胞的水平表达的调控序列，从而替代、破坏、或灭活与亲本细胞内源基因正常相连的调控序列。使用本领域众所周知的方法(参阅美国专利号5,641,670)，通过在构建物中包含可扩增的选择标记，可以进一步扩增激活的基因。在内源基因改变了的另一个实施方案中，基因表达降低了。

靶向序列可以位于内源基因内、直接与基因相邻、位于上游基因内、或位于内源基因上游且相距一定距离。可以使用一种或多种靶向序列。例如，环状质粒或DNA片段优选采用单个靶向序列，而线性质粒或DNA片段优选采用两个靶向序列。

构建物的调控序列可以包含一种或多种启动子、增强子、支架附着区或基质结合位点、负调控元件、转录结合位点、或这些序列的组合。

构建物还包含内源基因的一个或多个外显子。外显子定义为拷贝成RNA、并存在于成熟mRNA分子中的DNA序列，因此外显子序列与内源基因的编码区处于同一读码框。外显子可以任选的包含编码一个或多个氨基酸和/或部分编码氨基酸的DNA。或者，外显子包含对应于5’非翻译区的DNA。当外源外显子或外显子编码一个或多个氨基酸和/或部分氨基酸时，核酸构建物被设计成在转录和剪接后，读码框与内源基因编码区处于同一读码框，因此由第二个外显子衍生的mRNA部分的正确读码框没有改变。

构建物的剪接供体位点指导一个外显子与另一个外显子的剪接。通常，第一个外显子位于第二个外显子的5’，而且位于第一个外显子3’侧翼且有交叠的剪接供体位点识别位于第二个外显子5’侧翼的剪接受体位点。剪接受体位点和剪接供体位点一样，是指导一个外显子与另一个外显子发生剪接的序列。剪接系统利用剪接受体位点与剪接供体位点联合作用以除去内含子。

在本发明的另一个方面，突变型真菌细胞还可以包含一种或多种编码可能有害于感兴趣多肽的生产、回收、和/或应用的蛋白质的第三种核酸序列的修饰。修饰降低或消除了一种或多种第三种核酸序列的表达，导致在相同条件下培养时，包含经修饰的第三种核酸序列的突变细胞可以比不含第三种核酸序列的修饰的突变细胞产生更多的多肽。第三种核酸序列可以编码任何蛋白质或酶。例如，酶可以是氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、壳多糖酶、角质酶、环状糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、转化酶、漆酶、脂酶、甘露糖苷酶、齿斑葡聚糖酶、氧化酶、果胶分解酶、过氧化物酶、磷脂酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶、或木聚糖酶。

可以将上述各种核酸和控制序列连接在一起，以产生重组表达载体，该载体可以包含一个或多个方便的限制性位点，使得能够在这些位点插入或取代编码多肽的核酸序列。或者可以通过将包含该核酸序列的序列或核酸构建物插入用于表达的适当载体来表达编码多肽的核酸序列。在构建表达载体的过程中，将编码序列置于载体中，使得编码序列与用于表达(和可能的分泌)的适当控制序列可操作连接。

重组表达载体可以是能够方便地进行重组DNA步骤并能够表达编码多肽的核酸序列的任何载体(如质粒或病毒)。载体的选择通常取决于载体与将要导入该载体的真菌细胞的相容性。载体可以是线性或闭环质粒。载体可以是自主复制的载体，即作为染色体外实体存在的载体，其复制不依赖于染色体的复制，如质粒、染色体外元件、微小染色体、或人工染色体。载体可以包含确保自我复制的任何手段。或者载体可以是当导入真菌细胞后整合到基因组中并与它所整合的染色体一起复制的载体。载体系统可以是单个载体或质粒或者两个或多个载体或质粒(它们共同包含将要导入真菌细胞基因组中的总DNA)或者转座子。

载体优选包含一种或多种能够容易选择经转化细胞的选择标记。选择标记是其产物提供杀生物剂或病毒抗性、重金属抗性、使营养缺陷型变成原养型、等等的基因。用于酵母细胞的合适标记是ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1、和URA3。用于丝状真菌细胞的选择标记包括(但不限于)amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨甲酰转移酶)、bar(膦丝菌素乙酰基转移酶)、hygB(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸还原酶)、pyrG(乳清苷-5’-磷酸脱羧酶)、sC(硫酸腺苷酰转移酶)、和trpC(邻氨基苯甲酸合酶)、及其等同物。优选用于丝状真菌细胞的是构巢曲霉或米曲霉的amdS和pyrG基因和吸水链霉素(Streptomyces hygroscopicus)的bar基因。

载体优选包含能够使载体稳定整合到细胞基因组中或能够使载体在细胞中不依赖于基因组而自主复制的元件。

“导入”指将包含编码感兴趣多肽的核酸序列的载体导入细胞，使得载体作为染色体整合载体或自我复制的染色体外载体获得维持。通常认为整合是有利的，因为这样核酸序列更有可能在细胞内稳定存在。载体整合到染色体中的过程通过同源重组、非同源重组、或转座发生。

表达载体整合到真菌细胞中可能涉及由以本质上已知形式的原生质体的形成、原生质体的转化、和细胞壁的再生组成的过程。用于整合曲霉属细胞的合适步骤描述于EP 238 023和Yelton等人，1984，美国国家科学院进展(Proceedings ofNational Academy of Sciences USA)81：1470-1474。用于转化镰孢属物种的合适方法描述于Malardier等人，1989，基因(Gene)78：147-156和WO 96/00787。可以使用Becker和Guarente(J.N.Abelson和M.I.Simon编，酵母遗传学和分子生物学指南(Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology)，酶学方法(Methods in Enzymology)，第194卷，第182-187页，Academic Press公司，纽约；Ito等人，1983，细菌学杂志(Journal ofBacteriology)153：163；和Hinnen等人，1978，美国国家科学院进展(Proceedings of the National Academy of Sciences USA) 75：1920)描述的步骤转化酵母。

为了整合到细胞基因组中，载体可以依赖编码多肽的核酸序列或用于通过同源或非同源重组将载体稳定整合到基因组中的任何其它元件。或者载体可以包含用于通过同源重组指导整合到细胞基因组中的其它核酸序列。上述其它核酸序列使得载体能够在染色体中的精确位点整合到基因组中。为了提高在精确位点整合的可能性，整合元件应当优选包含足够数目的核酸，诸如100-1,500个碱基对，优选400-1,500个碱基对，最优选800-1,500个碱基对，这些核酸序列与相应的靶序列高度同源以增强同源重组的几率。整合元件可以是与细胞基因组中的靶序列同源的任何序列。此外，整合元件可以是非编码或编码的核酸序列。另一方面，载体可以通过非同源重组整合到细胞基因组中。

为了自主复制，载体还可以包含使得载体能够在所述细胞中自主复制的复制起点。用于在酵母细胞中使用的复制起点的范例是2μ复制起点、ARS1、ARS4、ARS1和CEN3的组合、以及ARS4和CEN6的组合。复制起点可以是具有使其在真菌细胞中的功能为温度敏感型的突变的复制起点(参阅Ehrlich，1978，美国国家科学院进展(Proceedings of the National Academy of Sciences USA)75：1433)。

可以理解，本发明的方法不限于用于获得突变型真菌细胞的特定目。可以在构建用于生产多肽的细胞的过程中的任何步骤，将涉及pacC pH信号转导途径的基因的修饰导入细胞。优选的是，在导入编码多肽的基因之前，真菌突变型细胞的pacC pH信号转导途径中的基因已经通过本发明的方法进行了修饰。

用于连接上述元件以构建重组表达载体的步骤对于本领域技术人员是众所周知的(参阅J.Sambrook，E.F.Fritsch，和T.Maniatus，1989，分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning，A LaboratoryManual)，第2版，冷泉港，纽约)。

在本发明的方法中，真菌细胞可以是野生型细胞或突变型细胞。

“真菌”，如此处所用，包括子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、壶菌门(Chytridiomycota)、和接合菌门(Zygomycota)(由Kawksworth等人在《Ainsworth和Bisby氏真菌字典》(Ainsworth and Bisby’s Dictionary of The Fungi)中定义的，第8版，1995，CAB International，University Press，剑桥，英国)，以及卵菌门(Oomycota)(如Hawksworth等人记录的，1995，见上文，第171页)和所有有丝分裂孢子真菌(Hawksworth等人，1995，见上文)。

在优选的实施方案中，真菌细胞是酵母细胞。“酵母”，如此处所用，包括产子囊孢子酵母(内孢霉目(Endomycetales))、产担子酵母、和属于半知菌纲的酵母(芽孢纲(Blastomycete))。由于酵母的分类将来可能改变，为了本发明的目的，应当如《酵母的生物学和活性》(Biology and Activities of Yeast)(F.A.Skinner、S.M.Passmore、和R.R.Davenport编，应用细菌学学会第9次座谈会(Soc.App.Bacteriol.Symposium Series NO.9)，1980)所述定义酵母。

在更优选的实施方案中，酵母细胞是假丝酵母属(Candida)、汉逊酵母属(Hansenula)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属(Pichia)、酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、或Yarrowia属的细胞。

在最优选的实施方案中，酵母细胞是卡尔酵母(Saccharomycescarlsbergensis)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、糖化酵母(Saccharomyces diastaticus)、道格拉斯酵母(Saccharomycesdouglasii)、克鲁弗酵母(Saccharomyces kluyveri)、诺地酵母(Saccharomyces norbensis)、或卵形酵母(Saccharomyces oviformis)细胞。在另一个最优选的实施方案中，酵母细胞是乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)细胞。在另一个最优选的实施方案中，酵母细胞是Yarrowia lipolytica细胞。

在另一个优选的实施方案中，真菌细胞是丝状真菌细胞。“丝状真菌”包括真菌门(Eumycota)和卵菌门(Oomycota)(如Hawksworth等人定义的，1995，见上文)的亚门的所有丝状形态。丝状真菌的特点通常在于由壳多糖、纤维素、葡聚糖、壳聚糖、甘露聚糖、和其它复杂多糖组成的菌丝壁。通过菌丝的延长进行营养生长，碳代谢是专性需氧的。相反，酵母(诸如酿酒酵母)的营养生长是通过单细胞菌体的出芽进行的，碳代谢可以是发酵性的。

在更优选的实施方案中，丝状真菌细胞是顶孢霉属(Acremonium)、曲霉属(Aspergillus)、短梗霉属(Aureobasidium)、隐球酵母属(Cryptococcus)、线黑粉菌属(Filibasidium)、镰孢属(Fusarium)、赤霉属(Gibberella)、腐质霉属(Humicola)、Magnaporthe属、毛霉属(Mucor)、毁丝霉属(Myceliophthora)、漆斑菌属(Myrathecium)、Neocallimastix属、脉孢霉属(Neurospora)、拟青霉属(Paecilomyces)、青霉属(Penicillium)、Piromyces属、裂褶菌属(Schizophyllum)、踝节菌属(Talaromyces)、热子囊菌属(Thermoascus)、梭孢壳属(Thielavia)、Tolypocladium属、或木霉属(Trichoderma)的细胞。

在最优选的实施方案中，丝状真菌细胞是棘孢曲霉(Aspergillusaculeatus)、泡盛曲霉、臭曲霉(Aspergillus foetidus)、日本曲霉(Aspergillus japonicus)、构巢曲霉、黑曲霉、或米曲霉细胞。

在另一个最优选的实施方案中，丝状真菌细胞是杆孢状镰孢、Fusarium crookwellense(Fusarium cerealis的同义词)、黄色镰孢、禾谷镰孢、禾赤镰孢、异孢镰孢、合欢木镰孢、尖镰孢、多枝镰孢、粉红镰孢、接骨木镰孢、肤色镰孢、茄病镰孢、侧孢样镰孢、硫色镰孢、Fusarium torulosum、Fusarium trichothecioides、或Fusariumvenenatum细胞。

Fusarium venenatum细胞最优选Fusarium venenatum A3/5，最初作为禾谷镰孢ATCC 20334保藏、最近由Yoder和Christianson(1998，真菌遗传学和生物学(Fungal Genetics and Biology)23：62-80)以及O’Donnell等人(1998，真菌遗传学和生物学(Fungal Genetics andBiology)23：57-67)重新分类为Fusarium venenatum；以及Fusariumvenenatum的分类学同等物，不论这些物种现在的名称如何。在另一个优选的实施方案中，Fusarium venenatum细胞是Fusariumvenenatum A3/5或Fusarium venenatum ATCC 20334的形态学突变体，公开于WO 97/26330。

在另一个最优选的实施方案中，丝状真菌细胞是虱状赤霉(Gibberella pulicaris)、玉蜀黍赤霉(Gibberella zeae)、Humicolainsolens、Humicola lanuginosa、米赫毛霉(Mucor miehei)、嗜热毁丝霉、露湿漆斑菌(Myrothecium roridin)、粗糙脉孢菌(Neurosporacrassa)、或产紫青霉(Penicillium purpurogenum)的细胞。

在另一个最优选的实施方案中，丝状真菌细胞是Trichodermaharzianum、康宁木霉(Trichoderma koningii)、Trichodermalongibrachiatum、Trichoderma reesei、或绿色木霉(Trichoderma viride)的细胞。

在本发明的方法中，使用本领域已知的方法，在适合于生产感兴趣多肽的培养基中培养突变型真菌细胞。例如，可以通过摇瓶培养和在实验室或工业发酵罐中进行的小量或大量发酵(包括连续、成批、补料分批、或固态发酵)，在合适的培养基中和在能够表达和/或分离多肽的条件下，培养细胞。在包含碳源、氮源、和无机盐的合适培养基中，使用本领域已知步骤进行培养。合适的培养基可以由供应商处购买，或者可以根据发表的组成成分配制(如美国典型培养物收藏中心的目录)。可以由培养基直接回收分泌型多肽。

可以使用对多肽特异的本领域已知方法检测多肽。这些检测方法可以包括特异性抗体的使用、酶产物的形成、酶底物的消失、或SDS-PAGE。例如，酶实验可以用于测定多肽活性。用于测定许多酶的酶活性的步骤在本领域是已知的。

可以通过本领域的已知方法分离产生的多肽。例如，可以通过传统步骤由培养液分离多肽，包括(但不限于)离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发、或沉淀。然后可以通过本领域的多种已知步骤纯化分离的多肽，包括(但不限于)层析(如离子交换、亲和、疏水、层析聚焦、和大小排阻)、电泳步骤(如制备性等电聚焦)、差异溶解(如硫酸铵沉淀)、或抽提(参阅《蛋白质纯化》(Protein Purification)，J.-C.Janson和Lars Ryden编，VCH Publishers，纽约，1989)。

本发明由下列实施例进一步描述，这些实施例不应当理解为本发明范围的限制。

                     实施例材料

作为缓冲液和底物使用的化学药品是至少试剂级的商品。材料和溶液

PDA平板含有39g/L马铃薯右旋糖琼脂(Difco)，并添加10mM尿苷用于pyrG营养缺陷型。

MY25培养基(pH6.5)每升含有25g麦芽糖、2.0g MgSO₄·7H₂O、10g KH₂PO₄、2.0g柠檬酸、10g酵母提取物、2.0g K₂SO₄、2.0g尿素、和0.Sml微量金属溶液。将MY25摇瓶培养基用玻璃蒸馏水1∶100或1∶1000稀释以用于微量滴定培养实验(MY25/100或MY25/1000)。将培养物于34℃培养。

2X MY盐溶液(pH6.5)每升含有4g MgSO₄·7H₂O、4g K₂SO₄、20g KH₂PO₄、4g柠檬酸、1ml微量金属溶液、和2ml CaCl₂·2H₂O(100g/L原液)。

基本培养基转化平板(pH6.5)每升含有6g NaNO₃、0.52g KCl、1.52g KH₂PO₄、1ml微量金属溶液、1g葡萄糖、500mg MgSO₄·7H₂O、342.3g蔗糖、和20g Noble琼脂。基本培养基转移平板(pH6.5)每升含有6g NaNO₃、0.52g KCl、1.52g KH₂PO₄、1ml微量元素、10g葡萄糖、500mg MgSO₄·7H₂O、和20g Noble琼脂。

微量金属溶液(1000X)每升含有22g ZnSO₄·7H₂O、11g H₃BO₃、5g MnCl₂·4H₂O、5g FeSO₄·7H₂O、1.6g CoCl₂·5H₂O、1.6g(NH₄)₆Mo₇O₂₄、和50g Na₄EDTA。

COVE平板每升含有343.3g蔗糖、20ml COVE盐溶液、10ml1M乙酰胺、10ml 3M CsCl、和25g Nobel琼脂。COVE盐溶液(50X)每升含有26g KCl、26g MgSO₄·7H₂O、76g KH₂PO₄、和50ml COVE微量金属溶液。COVE微量金属溶液每升含有0.04g NaB₄O₇·10H₂O、0.040g CuSO₄·5H₂O、0.70g FeSO₄·H₂O、0.80g Na₂MoO₂·2H₂O、和10g ZnSO₄。

NZY平板每升含有5g NaCl、2g MgSO₄·7H₂O、5g酵母提取物、10g NZ胺、和15g Bacto琼脂。

YEG培养基每升含有5g酵母提取物和20g右旋糖。

STC含有1.2M山梨醇/10mM CaCl₂/10mM Tris(pH7.5)。

SM缓冲液每升含有5.8g NaCl、2g MgSO₄·7H₂O、50ml 1MTris-HCl(pH7.5)、和5ml 2％明胶。实施例1：用pDSY82转化米曲霉HowB430

如WO 98/11203所述构建米曲霉HowB430。

按照下面的方案制备米曲霉HowB430的原生质体。将米曲霉HowB430在100ml培养基(1％酵母提取物/2％胨/1％葡萄糖)中于32℃以150rpm振摇培养16-18小时。通过0.45mm滤器过滤回收菌丝体直至滤器上剩下大约10ml，用25ml 1.0-1.2M MgSO₄/10mM磷酸钠(pH6.5)清洗，如前过滤，再次如前清洗直至剩下10ml，然后重悬于装在125ml Ehrlenmeyer烧瓶中的10ml 5mg/ml NOVOZYM234^TM(Novo Nordisk A/S，Bagsvrd，丹麦)(溶于1.2M MgSO₄/10mM磷酸钠(pH6.5)，0.45mm过滤)。将悬浮液以50rpm温和振摇于37℃温育1小时以产生原生质体。将10ml原生质体/菌丝体制备物加到30ml Corex离心管中，用5ml 0.6M山梨醇/10mM Tris-HCl(pH7.5)封盖，并在旋转桶状转头中以3600xg离心15分钟以回收原生质体。使用巴斯德移液管由缓冲液界面回收原生质体。然后将原生质体用5倍体积的STC清洗，离心，如前清洗并离心。将原生质体重悬于STC至终浓度2x10⁷原生质体/ml。

在14ml Falcon聚丙烯管中加入0.1ml浓度为2x10⁷原生质体/ml的原生质体、5-15μl用15U BamHI线性化的pDSY82(WO98/11203)、和250μl 60％PEG4000/10mM CaCl₂/10mM Tris-HCl(pH7)，温和混匀，并于37℃温育30分钟。将悬浮液与12ml熔化的上层琼脂(1X COVE盐/1％NZ胺/0.8％蔗糖/0.6％Nobel琼脂)或3ml STC混合，并将悬浮液倒在基本培养基平板上。将平板于37℃温育3-5天。

BamHI REMI pDSY82转化的转化率的范围为大约80-100转化体/μg DNA。获得了米曲霉HowB430的BamHI REMI文库，含大约27,000个DNA标签转化体。

米曲霉HowB430标签突变库集合称为“b”，因为pDSY82经BamHI消化，且随后转化时存在BamHI，将文库合并成大约1000个转化体的组并在10％甘油中保存于-80℃。实施例2：脂酶表达筛选

对实施例1中所述HowB430标签突变库“b”集合测验脂酶表达。

对于96孔板筛选，使用等体积无菌水和2X MY盐溶液(pH6.5)制成的稀释液将MY25培养液稀释1000倍。对于24孔板筛选，使用等体积无菌水和2X MY盐溶液(pH6.5)制成的稀释液将MY25培养液稀释100倍。

最初的96孔板筛选包括用MY25//1000稀释来自不同汇合体的孢子，使得将50ml培养液分装到孔中时每个孔平均接种1个孢子。接种后，将96孔板于34℃静止培养7天。然后如下文所述测验培养物的脂酶活性。直接在装有MY25/100的24孔板中接种感兴趣的突变体，并于34℃培养7天。然后如下文所述测验培养物的脂酶活性。然后将感兴趣的突变体涂布在COVE平板上以产生孢子，传布到PDA平板上以产生单菌落，然后使用上述24孔板方法测试每种分离菌的4个单菌落。

临使用前将对-硝基苯丁酸底物原液(21ml对-硝基苯丁酸/mlDMSO)用MC缓冲液(4mM CaCl₂/100mM MOPS(pH7.5))1：50稀释，由此配制脂酶测验底物。将标准脂酶(LIPOLASE^TM，NovoNordisk A/S，Bagsvrd，丹麦)用含0.02％ α-烯烃磺酸酯(AOS)去污剂的MC缓冲液配制成40LU/ml。将标准液保存于4℃直至使用。临使用前将标准脂酶用MC缓冲液1/40稀释。将培养液样品用含0.02％AOS去污剂的缓冲液稀释，并将20μl分装至96孔板的孔中，随后加入200μl经稀释底物。使用平板读数仪记录405nm吸光值的2个读数，间隔大约1分钟。相对于脂酶标准计算脂酶单位/ml(LU/ml)。

96孔板筛选及随后24孔板筛选的结果鉴定了命名为DEBY10.3的DNA标签突变体以用于进一步的评价，该菌株产生的脂酶水平比对照菌株米曲霉HowB430高。实施例3：米曲霉DEBY10.3的摇瓶评价

将实施例2中所述米曲霉DEBY10.3涂布在COVE平板上以产生用于摇瓶评价的孢子。

摇瓶评价如下进行，用300-500ml孢子悬浮液(0.02％吐温80和来自COVE平板的孢子)接种装在125ml摇瓶中的25ml MY25培养基(pH6.5)。将摇瓶于34℃以200rpm温育3天。在第2天和第3天取样，并如实施例2中所述测量脂酶活性。

所得结果显示于下文表1，其中将作为对照的米曲霉HowB430的脂酶产量标准化为1.0。表1.DNA标签突变体的脂酶表达菌株描述        构建      集合   #96孔板筛选   24孔板结果   摇瓶结果

                               (LU/ml)       (LU/ml)HowB430    HowB425+pBANe8  NA        NA            1.0        1.0DEBY10.3   pDSY81+BamHI    b1        808           1.7        2.2

如表1中所示，在摇瓶中培养时米曲霉DEBY10.3产生的脂酶比对照菌株米曲霉HowB430多大约2.2倍。实施例4：由米曲霉DEBY10.3拯救质粒DNA和侧翼DNA

由米曲霉DEBY10.3分离pDSY82 DNA和基因组侧翼基因座。

按照下面的步骤由米曲霉DEBY10.3分离基因组DNA。用每种突变体的孢子原种接种150ml YEG培养基，并于37℃以250rpm培养过夜。使用Miracloth(Calbiochem，La Jolla，CA)通过过滤由每种培养物收获菌丝体，并用10mM Tris/0.1mM EDTA(pH8)(TE)漂洗2次。然后将菌丝体制备物在液氮中快速冻结，并用研钵和杵磨成细分。将每种粉状菌丝体制备物转移到50ml管中，并加入20ml裂解缓冲液。向每种制备物中加入RNA酶至终浓度20μg/ml，并将制备物于37℃温育30分钟。然后向每种制备物中加入蛋白酶K至终浓度0.1mg/ml，并将制备物于50℃温育1小时。然后将制备物以15,000xg离心20分钟以沉淀不溶性物质。将每种上清液加到用制造商提供的QBT平衡的Qiagen MAXI柱(Qiagen，Chatsworth，CA)上。然后用30ml制造商提供的QC清洗柱子。用15ml制造商提供的QF由柱子洗脱DNA，然后通过加入0.7倍体积的异丙醇沉淀并以15,000xg离心20分钟来回收。最后将沉淀用5ml 70％乙醇清洗，空气干燥，并溶于200μl TE。

取2μg米曲霉DEBY10.3基因组DNA制备物，分别用BalI、HpaI、NarI、NdeI、SphI、和StuI消化。限制性内切酶不切割pDSY82，使得能够分离整合的质粒和侧翼基因组DNA。然后将经消化的基因组DNA在20μl反应体系中用T₄ DNA连接酶进行连接。

用每种经连接的DNA制备物转化E.coli HB101。然后如下筛选转化体，由转化体提取质粒DNA，限制性消化插入片段以确认它们衍生自pDSY82，并使用Applied Biosystems公司373A型自动测序仪(Applied Biosystems Model 373A Automated DNA Sequencer)(Applied Biosystems公司，Foster City，CA)，使用引物行走技术和染料终止物化学法(Giesecke等人，1992，病毒学方法杂志(Journalof Virol.Methods)38：47-60)，使用M13反向引物(-48)和M13正向引物(-20)(New England Biolabs，Beverly，MA)，使用对pDSY82特异的引物，在两条链上对插入片段进行测序。

转化体大肠杆菌HB101-pDSY109包含由米曲霉DEBY10.3 SphI回收的基因座。实施例5：米曲霉DEBY10.3拯救基因座pDSY109的定性鉴定

使用Applied Biosystems公司373A型自动测序仪，使用引物行走技术和染料终止物化学法，使用M13反向引物(-48)和M13正向引物(-20)，使用对待测序DNA特异的引物，在两条链上对米曲霉DEBY10.3回收基因座pDSY109整合事件两侧的3.4和2.2kb区域进行测序。核酸序列说明整合事件发生于palB基因的开放读码框内。palB基因编码涉及pacC pH信号转导途径的半胱氨酸蛋白酶，pacC pH信号转导途径传递环境pH信号。

使用实施例4中所述方案，分离米曲霉HowB430的基因组DNA。通过首先用Tsp509I部分消化米曲霉HowB430基因组DNA来构建米曲霉HowB430基因组文库。使用制造商推荐的条件，使用4个单位的Tsp509来消化3.5μg米曲霉HowB430基因组DNA。反应于65℃进行，由0-50分钟间隔5分钟取样。将反应液置于冰上，并通过加入EDTA至10mM来终止。然后将这些消化物在含溴化乙锭的1％琼脂糖凝胶上电泳，并切下含3-9kb DNA的凝胶区域。然后使用β-琼脂糖酶I，使用制造商(New England Biolabs，Beverly，MA)提供的方案，由凝胶块纯化DNA。然后按照制造商(Life Technologies公司，Gaithersburg，MO)的指示，于16℃过夜将根据大小选择的DNA连接到λZipLox EcoRI臂中。使用Gigapack GoldIII包装试剂盒(Gigapack GoldIII Packaging Kit)(Stratagene，La Jolla，CA)，按照制造商的指示，包装并滴定连接产物。总计，获得了8x10⁶个重组噬菌斑，并使用制造商提供的方案扩增文库。

筛选基因组文库以获得palB基因组克隆。如随λZipLox臂提供的方案中所述，将基因组文库适当稀释以获得7000噬菌斑/150mm平板。使用标准方案(Sambrook等人，1989，见上文)将噬菌斑点到Hybond N⁺滤膜(Amersham，Cleveland，OH)上。使用UV交联固定滤膜，并在DIG Easy Hyb中于42℃预杂交。将滤膜与DIG标记的0.25kb palB探针杂交。使用下列引物经PCR扩增探针，这些引物使用Applied Biosystems公司394型DNA/RNA合成仪(AppliedBiosystems Model 394 DNA/RNA Synthesizer)按照制造商的指示合成，并使用Genius试剂盒(Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN)用薯蓣皂苷元(dioxygenin)标记：5’-CTGCCGTCGAAGGTGTCCAAG-3’(SEQ ID NO：5)5’-ATTGTGGCCCCTATGTGGATT-3’(SEQ ID NO：6)

使用大约0.2μg pDSY109作为模板来制备100μl扩增反应体系。每个反应体系包含下列成份：0.2μg质粒DNA，48.4pmol正向引物和48.4pmol反向引物，1mM dATP、dCTP、dGTP、和dTTP，1X Taq聚合酶缓冲液，和2.5U Taq聚合酶(Perkin-Elmer公司，Branchburg，NJ)。将反应体系在Ericomp Twin Block System Easy Cycler中温育，编程如下：95℃5min，1个循环；95℃1min，55℃1min，72℃2min，30个循环。

清洗滤膜，并使用随Genius试剂盒提供的方案进行后杂交。鉴定了几个阳性噬菌斑，并使用标准方案(Sambrook等人，1989，见上文)纯化至均一。

按照实施例1中所述方法测定了一个palB克隆的核苷酸序列。图1显示了核苷酸序列(SEQ ID NO：1)和推导的氨基酸序列(SEQ IDNO：2)。palB基因编码4700bp的开放读码框，该读码框编码854个氨基酸的多肽。开放读码框由3个内含子中断。

使用Clustal法(Higgins，1989，CABIOS5：151-153)，使用LASERGENE^TM MEGALIGN^TM软件(DNASTAR公司，Madison，WI)，以同一性表和下列多重比对参数，进行了palB氨基酸序列的比较性比对：缺口罚分10，缺口长度罚分10。成对比对参数为Ktuple＝1，缺口罚分＝3，框＝5，对角线＝5。

比较性比对显示米曲霉PalB蛋白(SEQ ID NO：2)与构巢曲霉PalB蛋白(Denison等人，1995，见上文)具有66.4％的同一性。

如上所述制备了经BalII消化的米曲霉DEBY10.3和米曲霉HowB101基因组DNA的Southern印迹。用DIG标记的0.25kb palB探针探查印迹以确认回收的侧翼DNA是米曲霉DEBY10.3中分裂的基因。

来自米曲霉HowB101的大约7.5kb BalII条带与探针杂交，同时来自米曲霉DEBY10.3的12kb条带也与探针杂交。大小差异符合整合一个质粒拷贝的预期大小，从而确认了回收基因座在米曲霉DEBY10.3中分裂。

由于预测米曲霉DEBY10.3中的整合事件将导致PalB蛋白失去功能，因此测试在pH8.0和pH6.5培养米曲霉DEBY10.3。构巢曲霉palB^-菌株不能在pH8.0生长，但是能够在pH6.5生长。在添加10mM尿苷的基本培养基中，在pH8.0和pH6.5培养米曲霉HowB430和米曲霉DEBY10.3。正如预测的，米曲霉DEBY10.3不能在pH8.0生长。实施例6：pMT1936的构建

使用在Applied Biosystems公司394型DNA/RNA合成仪上按照制造商的指示合成的下列引物，构建了包含palB分裂盒的pTM1936：100752                                                  ：5’-GGTTGCATGCTCTAGACTTCGTCACCTTATTAGCCC-3’(SEO ID NO：7)100753                                     ：5’-TTCGCGCGCATCAGTCTCGAGATCGTGTGTCGCGAGTACG-3’(SEQ ID NO：8)100754                                     ：5’-GATCTCGAGACTAGTGCGCGCGAACAGACATCACAGGAACC-3’(SEQ ID NO：9)100755                                     ：5’-CAACATATGCGGCCGCGAATTCACTTCATTCCCACTGCGTGG-3’(SEQ ID NO：10)

由按照实施例4中所述方案制备的米曲霉A1560(Christensen等人，1988，生物技术(Bio/Technology)6：1419-1422)的基因组DNA经PCR扩增米曲霉palB 5’侧翼序列和编码palB产物N端部分的序列。使用了大约0.5μg基因组DNA和两种引物100754和100755各5pmol。使用聚合酶Pwo，如制造商(Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN)所述进行扩增。扩增进行了40个循环。将部分反应产物进行酚抽，乙醇沉淀，EcoRI和XhoI消化，并通过琼脂糖凝胶电泳分离了大约1.05kb的片段。

如上所述该用引物100752和100753获得了米曲霉palB 3’侧翼序列和编码palB基因产物C端部分的序列，并用XhoI和XbaI消化PCR产物，然后进行凝胶电泳回收了大约1.5kb的片段。

将上述两种经消化和纯化的PCR片段与来自载体pJaL400(图2)的经纯化2.7kb EcoRI-XbaI片段一起进行三片段连接，产生pMT1935(图3)。pMT1935的palB 5’和3’侧翼由经PCR引物100754和100753导入的BssHII、SpeI、和XhoI位点分开。

将在PyrG侧翼含重复片段的pJaL394(图4)的3.5kb HindIII片段克隆到将HindIII切割、去磷酸化、并纯化的pBluescriptII SK(-)中。获得了包含两种取向的插入片段质粒。选择了一种质粒pMT1931(图5)，其中pBluescript多接头的SpeI位点位于pyrG基因的下游，XhoI位点位于pyrG基因的上游。以3.5kb SpeI-XhoI片段分离PyrG基因，并插入经SpeI和XhoI消化并纯化的pMT1935，产生分裂质粒pMT1936(图6)。

可以由pMT1936以6.2kb NotI片段(切割多接头中的NotI)或5.5kb AseI-PvuI片段(切割实际的palB 5’和3’侧翼序列内的AseI和PvuI)分离pyrG可选择palB分裂盒。实施例7：用来自pMT1936的AseI/PvuI palB分裂盒转化米曲霉

使用实施例1中所述相同转化方案，用由pMT1936获得的5.5kbAseI-PvuI片段转化米曲霉HowB430。通过用AseI和PvuI消化pMT1936并使用Qia快速凝胶提取试剂盒(Qiagen，Chatsworth，CA)按照制造商的指示在1％琼脂糖凝胶上分离片段，由此分离用于转化的线性片段。然后测试转化体在pH6.5或pH8.0的基本培养基平板上的生长。

结果显示测试的128个转化体中13个拥有palB^-表型，表现为不能在pH8.0生长。将13种palB^-菌株和13种能够在pH8.0生长的转化体进行孢子纯化。

对来自米曲霉palB^-突变体、米曲霉palB⁺菌株、和米曲霉HowB430的基因组DNA进行Southern印迹，以确认AsnI-PvuI转化DNA片段作为清除取代而整合到palB基因座中。按照实施例4中所述步骤制备基因组DNA，用PvuI消化，并在0.8％琼脂糖凝胶上电泳。使用0.4NNaOH和毛细管作用将DNA转移到Hybond N⁺滤膜上。将印迹UV交联，然后于65℃在Rapid Hyb中预杂交。然后用含来自pMT1936的0.9kb AsnI-SpeI片段的探针探查印迹。在1％琼脂糖凝胶上电泳后，使用Qia快速旋转柱(QiaQuick spin column)分离0.9kb片段。使用随机引发标记试剂盒Vistra ECF Random Prime Labeling Kit标记片段。将印迹预杂交，并于65℃在Rapid Hyb(Amersham，Cleverland，OH)中杂交，然后在2X SSC/0.1％SDS中于65℃5min清洗2次，在0.2X SSC/0.1％SDS中于65℃ 10min清洗2次。清洗后，使用信号放大试剂盒Vistra ECF Signal Amplification Kit(Amersham，Cleveland，OH)和成像系统STORM860 Imaging System(MolecularDynamics，Sunnyvale，CA)检测印迹。

Southern印迹结果证明了探针与来自米曲霉HowB430的6kb条带杂交。预计清楚的分裂(片段)将与大约8kb PvuI条带杂交。Southern印迹结果还显示了一些palB^-菌株具有清楚分裂(片段)，而其它菌株则没有。实施例8：米曲霉ΔpalB菌株的细胞外蛋白酶生成

将实施例7中所述3种米曲霉palB^-和3种米曲霉palB⁺菌株，在装有培养基(Nutriose、酵母提取物、(NH₄)₂HPO₄、MgSO₄·7H₂O、柠檬酸、K₂SO₄、CaCl₂·H₂O、和微量金属溶液)的2升发酵罐中于34℃、pH7、1000-2000rpm培养8天。每天对细胞外培养液取样，并在第6天使用下文所述FTC-酪蛋白测验法对样品测验总细胞外蛋白酶活性。

FTC-酪蛋白测验法如下进行。向10μl用0.1M MOPS缓冲液(pH7.0)适当稀释的酶溶液中加入40μl与0.1M MOPS缓冲液(pH7.0)1∶1混和的FTC-酪蛋白(Twining，1984，分析生化(AnalyticalBiochemistry)143：30-34)启始反应。将反应体系于37℃温育2小时，随后用150μl 5％三氯乙酸猝灭反应。猝灭反应在5℃下置2小时然后离心10分钟。将20ul上清液转移到装有2ml 0.5M硼酸盐缓冲液(pH9.0)的试管中并混和。然后将该溶液的200μl样品转移到黑色U形底96孔板(Dynatech公司，Chantiily，VA)中，将硼酸盐缓冲液用作空白将仪器标零。使用Fluorolite 1000仪器(Dynatech公司，Chantiily，VA)使用参照设置1176的频道3和4.1V灯泡电压，测量荧光。仪器的动态范围处于0-4000荧光单位之间，最佳“孔与孔”重复性处于400-3500单位之间。

表2中显示的结果指出米曲霉palB^-菌株产生的细胞外蛋白酶比米曲霉palB⁺菌株平均低10倍。还在存在丝氨酸蛋白酶抑制剂PMSF或金属蛋白酶抑制剂1，10-邻二氮杂菲时进行测验。表2中显示了由所示抑制剂抑制的总蛋白酶活性百分比。米曲霉palB⁺和palB^-样品的抑制模式相似，说明palB删除影响丝氨酸蛋白酶和金属蛋白酶的生成。表2.palB^-和野生型菌株中的细胞外蛋白酶水平菌株           蛋白酶荧光单位+  ％PMSF抑制^** ％1，10-邻二氮杂菲抑制^**DEBY10.3palB^-    1120             73            4DEBY10.3palB^-    1370             77            15DEBY10.3palB^-    810              69            3DEBY10.3palB⁺    11100            87            37DEBY10.3palB⁺    9785             83            34DEBY10.3palB⁺    13050            84            37+于37℃和pH7温育2小时。^**抑制剂浓度为1mM。

如上所述还将其它3种米曲霉palB^-和其它3种米曲霉palB⁺菌株在2升发酵罐中培养8天，并每天进行细胞外取样。在第6天使用上述FTC-酪蛋白测验法在存在或不存在抑制剂时测验样品。

表3中显示的结果指出米曲霉palB^-菌株产生的总蛋白酶活性比米曲霉palB⁺菌株平均低10倍。表3.米曲霉palB^-和野生型菌株中的细胞外蛋白酶水平菌株               蛋白酶荧光单位+  ％PMSF抑制^**   ％1，10-邻二氮杂菲抑制^**DEBY10.3palB^-     485              77              35DEBY10.3palB^-     345              48              0DEBY10.3palB^-     540              52              0DEBY10.3palB⁺     4580             92              23HowB430palB⁺      5025             86              39HowB430palB⁺      3765             77              37+于37℃和pH7温育1小时。^**抑制剂浓度为1mM。

如上所述还将2种米曲霉palB^-菌株和1种米曲霉palB⁺菌株在2升发酵罐中培养8天。米曲霉palB^-菌株是palB基因的清楚分裂。8天每天进行细胞外取样。在第6天使用上述FTC-酪蛋白测验法在存在或不存在抑制剂时测验样品。结果显示于下文表4。米曲霉palB^-菌株产生的细胞外蛋白酶活性比米曲霉palB⁺菌株平均低20倍。表4.米曲霉palB^-和野生型菌株中的细胞外蛋白酶水平菌株                   蛋白酶荧光单位+   ％PMSF抑制^**   ％1，10-邻二氮杂菲抑制^**DEBY10.3palB^-         1095              35              0HowB430ΔpalB76-11-1   715               44              3.5HowB430ΔpalB76-11-1   16360             91              36pLRF2-10(palB⁺)+于37℃和pH7温育2小时。^**抑制剂浓度为1mM。实施例9：构巢曲霉palA基因的PCR扩增

由如实施例4中所述制备的基因组DNA，使用PCR和下列引物，扩增来自构巢曲霉的palA基因。palA2540R：5’-TCGCGCAGTCGTGATTCAAAG-3’(SEQ ID NO：11)pal172：5’-CCGCACTGGAGTAAATAACAT-3’(SEQ ID NO：11)

反应体系包含50ng构巢曲霉基因组DNA、palA2540R和palA172各50pmol、Perkin Elmer PCR缓冲液、1mM dNTP、和0.5U Taq DNA聚合酶。将反应体系在Ericomp Twin Block System Easy Cycler中循环，编程如下：95℃3min，1个循环；95℃1min，50℃1min，72℃1min，30个循环；72℃5min，1个循环。取一部分反应液在琼脂糖凝胶上电泳，并获得了大约2.5kb的预期产物。将一半反应液在制备性凝胶上电泳，切下含想要的产物的凝胶块，并使用Qia快速凝胶提取试剂盒由凝胶分离DNA。

使用引发试剂盒Prime-It Kit(Stratagene，La J0lla，CA)按照制造商的指示，用³²P-dCTP标记1/10的凝胶分离PCR产物。在TEMidi G-50柱(5’至3’，Boulder，CO)上进行标记反应后，纯化palA探针。实施例10：用构巢曲霉palA探针进行米曲霉基因组DNA的Southern分析

将如实施例4中所述制备的米曲霉HowB430的基因组DNA用BamHI、EcoRI、或HindIII消化，并在琼脂糖凝胶上电泳。如实施例7中所述，在碱性条件下，将DNA转移到Hybond N⁺滤膜上。将相同3个印迹在低度、中度、和高度严谨度杂交缓冲液中于42℃杂交1小时(预杂交和杂交在5X SSPE/0.3％SDS/200μg/ml剪断并变性鲑鱼精DNA中进行，低度、中度、和高度及很高严谨度分别含25、35、或50％甲酰胺)。加入实施例10中所述³²P-dCTP标记的palA探针，并将印迹于4℃杂交过夜。将印迹于42℃在2X SSC/0.1％SDS中5min清洗2次，在0.2X SSC/0.1％SDS中10min清洗2次。在中度和低度严谨度缓冲液中杂交的印迹上观察到特异性条带。实施例11：palA米曲霉基因组克隆的分离

按照制造商的指示在λZipLox中构建米曲霉HowB425的基因组文库。文库含有630,000个噬菌斑形成单位，其中73％含有插入片段。平均插入片段大小为3.5kb。将大约7000个重组噬菌体与大肠杆菌Y1090(Life Technologies，Gaithersburg，MD)一起涂布在NZY大平板上。使用标准方案将噬菌斑点到Hybond N⁺滤膜上。将滤膜UV交联，并如实施例10中所述于42℃在中等严谨度杂交缓冲液中预杂交1小时。加入³²P标记的构巢曲霉palA探针，并将滤膜于42℃杂交过夜。如上所述清洗滤膜并使X-射线胶片暴光。

获得了2个阳性克隆。挑取阳性噬菌斑并在1ml SM缓冲液中洗脱。将洗脱液稀释10⁴，并取50或100μl与大肠杆菌Y1090细胞一起涂布在NZY大平板上。如前点取噬菌斑并处理滤膜。由每个平板分离一个纯化阳性噬菌斑。通过依照提供的方案(Life Technologies公司，Gaithersburg，MD)与大肠杆菌DH10B细胞一起涂布，由阳性克隆切下质粒DNA。实施例12：palA米曲霉基因组克隆的分析

使用Qia快速制备试剂盒Qiaquick Prep8 Kit(Qiagen，Chatsworth，CA)由实施例11中所述2个阳性克隆(palA5A和palA6A)分离质粒DNA。用PstI消化质粒DNA以确认它们包含插入片段。使用应用生物系统377 XL型自动DNA测序仪(APPliedBiosystems Model 377 XL Automated DNA Sequencer)，使用M13正向和反向引物，进行基因组克隆的部分核苷酸测序。部分测序确认了克隆包含米曲霉palA同源物。测定了最大克隆palA5A的核苷酸序列。使用应用生物系统377XL型自动DNA测序仪，使用染料终止物化学法，进行DNA测序。使用转座子插入策略(引物岛转座试剂盒Primer Island Transposition Kit，Perkin-Elmer/Applied Biosystems公司，Foster City，CA)产生了重叠群序列。经测序，palA5A的2.9kb插入片段的平均度为5.3。

palA5A克隆的核苷酸序列(SEQ ID NO：3)证明分离了palA的部分克隆，根据与构巢曲霉palB基因(Negrete-Urtasun等人，1997，见上文)的同源性，缺失编码palA最后大约245个氨基酸的DNA。部分核苷酸序列(SEQ ID NO：3)和推导的氨基酸序列(SEQ ID NO：4)显示于图7。palA基因编码2855bp的开放读码框，该读码框编码549个氨基酸的多肽。开放读码框由4个内含子中断，它们的定位在构巢曲霉和米曲霉克隆之间是严格保守的。

使用Clustal法(Higgins，1989，CABIOS5：151-153)，使用LASERGENE^TM MEGALIGN^TM软件(DNASTAR公司，Madison，WI)，以同一性表和下列多重比对参数，进行了部分米曲霉PalA推导氨基酸序列与其它PalA氨基酸序列的比较性比对：缺口罚分10，缺口长度罚分10。成对比对参数为Ktuple＝1，缺口罚分＝3，框＝5，对角线＝5。

比较性比对显示部分米曲霉PalA蛋白(SEQ ID NO：2)与构巢曲霉PalA蛋白(Negrete-Urtasun等人，1997，见上文)具有88％的同一性。实施例13：米曲霉菌株中palA的删除

构建用pyrG基因取代600bp palA开放读码框的质粒pBM8。

使用应用生物系统394型DNA/RNA合成仪(Applied BiosystermsModel 394 DNA/RNA Synthesizer)，按照制造商的指示，合成了设计用于PCR扩增两种分开的palA片段的下列合成寡核苷酸引物。第一组包括设计用于加入XhoI位点的5’引物和用于加入HindIII位点的3’引物。第一组：引物980163：5’-AGTAGCCGTCTATCTCTCCAGCAGTAGTGT-3’(SEQ ID NO：13)引物980164：5’-AAGCTTACTCGCAATTAGCCTTCTCGGTGAATCG-3’(SEQ ID NO：14)第二组包括设计用于加入HindIII位点的5’引物和用于加入NotI位点的3’引物。第二组：引物980165：5’-AAGCTTTACGATGTCATGCTGGGCAACGGTCAAG-3’(SEQ ID NO：15)引物980166：5’-GCGGCCGCCTCTGCGTGATACTCTAGGGTCTGG-3’(SEQ ID NO：16)粗体字母表示编码序列。

建立100μl的PCR反应体系，包括50ng palA5A DNA模板、各种引物各50pmol、1X PCR缓冲液含2mM MgSO₄(BoehringerMannheim)、1mM dNTP、和2.5单位Taq DNA聚合酶(BoehringerMannheim)。将反应体系在Ericomp Twin Block System Easy Cycler中循环，编程如下：95℃5min，1个循环；95℃1min，55℃1min，72℃1.5min，30个循环；95℃1min，55℃1min，72℃3min，1个循环。

取10μl PCR反应体系在1.0％琼脂糖凝胶上于100伏电泳1小时。由凝胶切下第一组引物大约1100bp的主要产物和第二组引物大约730bp的主要产物，并使用Qia快速凝胶提取试剂盒(Qiaquick GelExtraction Kit)纯化。随后按照制造商的指示，将经纯化的PCR产物克隆到质粒pCR2.1-TOPO(Invitrogen，San Diego，CA)中，并转化TOP10细胞(Invitrogen，San Diego，CA)。

获得了2个克隆，1100bp插入片段的命名为大肠杆菌pPalA1，730bp插入片段的命名为大肠杆菌pPalA2。使用Perkin-Elmer应用生物系统377XL型测序仪(Perkin-Elmer APPlied Biosystems Model 377Sequencer XL)，使用染料终止物化学法，使用lac正向测序引物和lac反向测序引物，通过测序来分析这两个克隆。

用HindIII消化pBluescript KS-，并用Klenow片段处理产生平末端。将DNA在制备性凝胶上电泳，并切下含经切割质粒DNA的条带。使用Qia快速凝胶提取试剂盒由凝胶分离DNA。然后将质粒连接，转化大肠杆菌DH5α，并由几个菌落分离质粒DNA。通过HindIII限制性消化对克隆筛选HindIII位点的缺失。将缺失HindIII位点的一个克隆命名为pBM1a(图8)。使用Qiaquick Prep8方案(Qiagen，Chatsworth，CA)由pBM1a制备质粒DNA。用0.5μl XhoI和NotI(每种10U/μl)消化pBM1a。用0.5μl XhoI和HindIII(每种10U/μl)消化pPalA1。用0.5μl NotI和HindIII(每种10U/μl)消化pPalA2。将经消化DNA在1％琼脂糖凝胶上于100伏电泳1小时。由凝胶切下pPalA1的1100bp片段、pPalA2的730bp片段、和pBM1a的2.9kb片段，并重悬于200μl 10mM Tris(pH7.5)。随后将三种DNA片段连接在一起，并转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。产生的质粒命名为pBM7(图9)。

用1μl HindIII(10U/μl)消化来自pJal394的DNA。将经消化DNA在0.7％琼脂糖凝胶上于100伏电泳1小时，产生3539bp条带。由凝胶切下3539bp片段，并重悬于200μl 10mM Tris(pH7.5)。

用1μl HindIII(10U/μl)消化来自pBM7的DNA。将HindIII于65℃热灭活10分钟，随后使用虾碱性磷酸酶(Boehringer Mannheim，Indinopolis，IN)按照制造商的指示去磷酸化。将经消化DNA在0.7％琼脂糖凝胶上于100伏电泳1小时，产生3630bp条带。由凝胶切下3630bp片段，并重悬于300μl 10mM Tris(pH7.5)。将两种DNA片段连接在一起，并转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。产生的克隆命名为pBM8(图10)。

为了分离pBM8的删除片段，用NotI和XhoI消化质粒，并将消化物在制备性凝胶上电泳。使用Qia快速凝胶提取试剂盒由凝胶分离5.3kb删除片段。用片段转化如实施例1中所述制备米曲霉HowB430原生质体，并在基本培养基平板上选择。总计获得了93个转化体。在pH8.0的基本培养基平板上测试转化体的pal^-表型。93个中的3个不能在pH8.0生长。Southern分析确认了3个菌株为清楚分裂。实施例14：米曲霉ΔpalA菌株中的细胞外蛋白酶生成

将实施例13中所述2株米曲霉palA⁺和2株米曲霉palA^-菌株如实施例8中所述在2升发酵罐中于34℃培养8天。使用实施例8中所述FTC-酪蛋白测验法测定第6天样品的总细胞外蛋白酶活性。

下文表5中所示结果证明米曲霉palA^-菌株产生的细胞外蛋白酶水平是米曲霉palA⁺菌株的大约1/10。表5.HowB430 ΔpalA菌株和细胞外蛋白酶菌株                            蛋白酶荧光单位DEBY599.3(wt)                   7450ΔpalA1-3                       710palA6-1(wt)                     5150ΔpalA7-1                       565

                          生物材料的保藏

下列生物学材料已经根据布达佩斯条约保藏于农业研究机构保藏中心(Agricultural Research Service Patent Culture Collection)，北方地区研究中心(Northern Regional Research Center)，Peoria，伊利诺斯州(Illinois)，保藏号如下：保藏物                     编号           保藏日期大肠杆菌HB101 pDSY109      NRRL B-21623   1996年9月5日大肠杆菌XL-1Blue pDSY174   NRRL B-30089   1999年1月28日

这些菌株已经进行了保藏，在该专利申请的待审期内，保证根据37 C.F.R.§1.14和35 U.S.C.§122授权的专利和商标委员会所确定的人能够获得该培养物。该保藏物代表了保藏菌株的基本上纯的培养物。在提交了该申请的副本或其后续申请的国家中，可以按照该国专利法的要求提供该保藏物。但是，应当明白保藏物的可获得性并不构成对以侵犯由政府行为授予的专利权来实施本发明的许可。

由于此处公开的特殊实施方案意欲作为此处描述和要求的发明的多个方面的例示，所以本发明并非限制在这些实施方案的范围之内。任何相当的实施方案均属于本发明的范围之内。甚至于本领域技术人员根据上述描述显然能够理解本发明除了此处所示和所述之外的各种变化。这些变化也属于所附权利要求的范围之内。当发生冲突时，以本说明书包括定义为准。

此处引用的多处参考文献完整引入作为参考。

Claims (29)

1.一种用于生产多肽的方法，包括：

a)培养亲本真菌细胞的突变体，其中突变细胞包含两种核酸序列，第一种核酸序列包含pacC pH信号转导途径的一种或多种基因的修饰，第二种核酸序列编码多肽；和

b)由培养液分离多肽。

2.权利要求1的方法，其中pacC pH信号转导途径的一种或多种基因选自palA、palB、palC、palF、PalH、和palI；及其同源物。

3.权利要求1的方法，其中基因是palA基因。

4.权利要求1的方法，其中基因是palB基因。

5.权利要求1的方法，其中基因是palC基因。

6.权利要求1的方法，其中基因是palF基因。

7.权利要求1的方法，其中基因是palI基因。

8.权利要求1的方法，其中多肽对于真菌细胞是天然的或异源的。

9.权利要求1的方法，其中真菌细胞是丝状真菌细胞或酵母细胞。

10.权利要求1的方法，其中丝状真菌细胞是顶孢霉属、曲霉属、短梗霉属、隐球酵母属、线黑粉菌属、镰孢属、赤霉属、腐质霉属、Magnaporthe、毛霉属、毁丝霉属、漆斑菌属、Neocallimastix、脉孢霉属、拟青霉属、青霉属、Piromyces、裂褶菌属、踝节菌属、热子囊菌属、梭孢壳属、Tolypocladium、或木霉属的细胞。

11.权利要求1的方法，其中酵母细胞是假丝酵母属、汉逊酵母属、克鲁维酵母属、毕赤酵母属、酵母属、裂殖酵母属、或Yarrowia属的细胞。

12.权利要求1的方法，其中在相同条件下培养时突变体产生的一种或多种蛋白酶的量比亲本真菌细胞少。

13.权利要求12的方法，其中一种或多种蛋白酶是一种外肽酶或一种内肽酶。

14.权利要求12的方法，其中一种或多种蛋白酶是一种外肽酶和一种内肽酶。

15.权利要求13或14的方法，其中外肽酶或内肽酶是丝氨酸蛋白酶、金属蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、或半胱氨酸蛋白酶。

16.权利要求12-15任一项的方法，其中当在相同条件下培养时突变细胞产生的一种或多种蛋白酶比亲本真菌细胞至少少大约25％。

17.权利要求12-16任一项的方法，其中突变真菌细胞不产生蛋白酶。

18.权利要求1-17任一项的方法，其中突变真菌细胞包含至少两个拷贝的第二种核酸序列。

19.权利要求1-18任一项的方法，其中多肽是激素、激素变体、酶、受体或其一部分、抗体或其一部分、或报道基因。

20.权利要求19的方法，其中酶是氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂合酶、异构酶、或连接酶。

21.权利要求20的方法，其中酶是氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、壳多糖酶、角质酶、环状糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、转化酶、漆酶、脂酶、甘露糖苷酶、齿斑葡聚糖酶、氧化酶、果胶分解酶、过氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶、或木聚糖酶。

22.权利要求1-21任一项的方法，其中突变细胞还包含一种或多种pacC基因的两个或多个拷贝。

23.权利要求1-22任一项的方法，其中突变细胞还包含一种或多种第三种核酸序列的一种或多种修饰，其中修饰降低或消除了一种或多种第三种核酸序列的表达。

24.权利要求23的方法，其中第三种核酸序列编码的酶选自氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、壳多糖酶、角质酶、环状糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、转化酶、漆酶、脂酶、甘露糖苷酶、齿斑葡聚糖酶、氧化酶、果胶分解酶、过氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶、或木聚糖酶。

25.由权利要求1-24任一项的方法生产的多肽。

26.一种真菌细胞的蛋白酶缺陷型突变体，包含两种核酸序列，第一种核酸序列包含pacC pH信号转导途径的一种或多种基因的修饰，第二种核酸序列编码多肽，其中在相同条件下培养时突变细胞产生的一种或多种蛋白酶的量比亲本真菌细胞少。

27.权利要求26的突变细胞，其中多肽相对于突变细胞是天然的或异源的。

28.一种包含核酸序列SEQ ID NO.3的分离的核酸序列。

29.权利要求28的核酸序列，该核酸序列包含于大肠杆菌NRRL B-30089所含质粒pDSY174中。

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