CN1213403A - 具有齿斑葡聚糖酶活性的多肽及编码该多肽的核酸 - Google Patents

Abstract

本发明涉及有齿斑葡聚糖酶活性的多肽和分离的编码该多肽的核酸序列。本发明也涉及含有该核酸序列的核酸结构、载体和宿主细胞以及生产该多肽的方法。本发明还涉及口腔组合物和降解齿斑葡聚糖的方法。

Description

具有齿斑葡聚糖酶活性的多肽及编码该多肽的核酸

本发明涉及具有齿斑葡聚糖酶活性的多肽及分离的编码该多肽的核酸序列。本发明也涉及包含有该核酸序列的核酸结构、载体和宿主细胞以及生产该多肽的方法。本发明还涉及含有该多肽的组合物及其使用方法。

牙斑形成导致龋齿、牙龈炎、牙周疾病和最终牙齿脱落。牙斑是细菌、上皮细胞、白细胞、巨噬细胞和其他口腔渗出物的混合物。细菌从口腔中的蔗糖产生葡聚糖和果聚糖。这些葡聚糖、果聚糖和微生物形成牙斑持续增长的粘性基质。

变异链球菌(Streptococcus mutans)是与牙斑相关的常见细菌。口腔中由这种细菌产生的胞外可溶性多糖对细菌在牙齿表面的附着和增长起重要作用，因此在龋齿的病原学中是重要的因素。齿斑葡聚糖是变异链球菌产生的可溶性多糖的主要成分，由α-1,3-葡萄糖苷键的骨架和α-1,6-葡萄糖苷键支链组成。

齿斑葡聚糖酶是α-1,3-葡聚糖酶(也称为α-1,3-葡聚糖糖水解酶)，它可以降解齿斑葡聚糖中的α-1,3-葡萄糖苷键。已从两种木霉(Trichoderma)属的菌株(Hasegawa等人，1969，生物化学杂志(Journalof Biological Chemistry)244:5460-5470；Guggenheim和Haller,1972，牙齿研究杂志(Journal of Dental Research)51:394-402)和一株链霉属(Steptomyces)菌株(Takehara等人，1981，细菌学杂志(Journal ofBacteriology)145:729-735)中描述了齿斑葡聚糖酶。来源于Trichoderma harzianum的齿斑葡聚糖酶基因已被克隆和测序(日本专利4-58889/A)。

虽然齿斑葡聚糖酶有在牙齿应用和个人护理产品如：牙膏、口香糖或其他口腔和牙齿护理产品中用作抗斑剂的商业潜力，现有技术尚不能生产出足够量的可用于商业的齿斑葡聚糖酶。

本发明目的是提供能以商业用量生产的新型齿斑葡聚糖酶。

本发明涉及选自下组的有齿斑葡聚糖酶活性的分离的多肽：

(a)具有SEQ ID NO:3列出的氨基酸序列的多肽；

(b)由能在高度严格条件下与ⅰ)SEQ ID NO:2列出的核酸序列或ⅱ)其互补链杂交的核酸序列编码的多肽；

(c)与SEQ ID NO:3列出的氨基酸序列至少有60％同一性的氨基酸序列的多肽；

(d)(a)、(b)或(c)的等位形式；和

(e)(a)、(b)、(c)或(d)的片段

本发明也涉及编码多肽的分离的核酸序列和含有该核酸序列的核酸结构、载体及宿主细胞以及生产该多肽的方法。本发明还涉及口腔用组合物和降解齿斑葡聚糖的方法。

图1展示了产紫青霉(Penicillum purpurogenum)基因组DNA与Trichoderma harzianum cDNA探针的杂交分析。

图2展示了插入到克隆Pp6A中3.6Kb DNA的部分限制性酶切图谱。

图3展示了产紫青霉CBS 238.95齿斑葡聚糖酶的基因组DNA序列和推测的氨基酸序列(分别为SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3)。

图4展示了产紫青霉CBS 238.95和Trichoderma harzianum的齿斑葡聚糖酶的氨基酸序列对比。

图5展示了pBANe6的限制性酶切图谱。

图6展示了产紫青霉CBS 238.95齿斑葡聚糖酶的pH性质。

图7展示了产紫青霉CBS 238.95齿斑葡聚糖酶的温度性质。有齿斑葡聚糖酶活性的多肽

在第一个实施方案中，本发明涉及有齿斑葡聚糖酶活性的分离的多肽，它带有由SEQ ID No:3列出的氨基酸序列或者是其保留有齿斑葡聚糖酶活性的片段或亚序列。优选的，该片段至少含有400个氨基酸残基，更优选的为至少有475个氨基酸残基，更为优选以为至少550个氨基酸残基，最优选的为至少600个氨基酸残基。

本发明的多肽优选获自下列但不限于下列毒霉属的种类，包括：Penicillium allahabadense,Penicillium arenicola，糙落青霉(Penicilliumasperum),Penicillium aurantiogriseum,Penicillium bilaii，短密青霉(Penicillium brevicompactum)，沙门柏干酪青霉(Penicilliumcamembertii)，变灰青霉(Penicillium canescens)，产黄青霉(Penicilliumchrysogenum),Penicillium citreonigrum，黄绿青霉(Penicilliumcitreoviride)，桔青霉(Penicillium citrinum)，棒形青霉(Penicilliumclaviforme)，普通青霉(Penicillium commune),Penicilliumconcentricum，顶青霉(Penicillium corylophilum)，丛花青霉(Penicilliumcorymbiferum)，皮落青霉(Penicillium crustosum)，圆弧青霉(Penicilliumcyclopium)，斜卧青霉(Penicillium decumbens)，指状青霉(Penicilliumdigitatum)，异生青霉(Penicillium diversum)，杜克青霉(Penicilliumduclauxii),Penicillium echinulatum，扩展青霉(Penicilliumexpansum)，瘿青霉(Penicillium fellutanum)，常现青霉(Penicilliumfrequentans)，绳状青霉(Peniciilium funiculosum)，平滑青霉(Penicilliumglabrum),Penicillium glandicola，粒状青霉(Penicilliumgranulatum),Penicillium griseofulvum，多毛青霉(Penicilliumhirsutum),Penicillium hordei，纠缠青霉(Penicillium implicatum)，岛青霉(Penicillium islandicum)，意大利青霉(Penicillium italicum),Penicillium janczewskii，微紫青霉(Penicillium janthinellum)，铅色青霉(Penicillium lividum),Penicillium luteum，梅林青霉(Penicilliummelinii)，米舒青霉(Penicillium miczynskii),Penicillium minioluteum,Penicillium montanense，黑青霉(Penicillium nigricans),Penicilliumolivicolor，奥尔森(Penicillium olsonii)，草酸青霉(Penicilliumoxalicum)，桧状青霉(Penicillium piceum)，嗜松青霉(Penicilliumpinophilum)，软毛青霉(Penicillium puberulum)，产紫青霉(Penicilliumpurpurogenum)(同名与红色青霉(Penicillium rubrum))，细小青霉(Penicillium pusillum)，皱绒青霉(Penicillium raciborskii)，雷斯青霉(Penicillium raistrickii)，局限青霉(Penicillium restrictum)，娄地青霉(Penicillium roqueforti)，皱褶青霉(Penicillium rugulosum)，菌核青霉(Penicillium sclerotiorum)，简青霉(Penicillium simplicissimum)，尖孢青霉(Penicillium spiculisporum)，小刺青霉(Penicillium spinulosum)，密集青霉(Penicillium stipitatum)，条孢青霉(Penicillium striatum)，托尼青霉(Penicillium terlikowskii)，托姆青霉(Penicillium thomii)，变幻青霉(Penicillium variabile)，变异青霉(Penicillium varians)，蠕形青霉(Penicillium vermiculatum),Penicillium verrucosum，鲜绿青霉(Penicillium viridicatum),Penicillium vulpinum，荨麻青霉(Penicilliumurticae)，瓦克青霉(Penicillium waksmanii)，沃特曼青霉(Penicilliumwortmanni)。这些种类的菌株在一系列培养物保藏中心如：美国典型培养物保藏中心(ATCC)、德意志微生物保藏中心(DSM)、真菌菌种保藏中心(CBS)和农业农业研究机构保藏中心(NRRL)处可以为公众所获得。

在更优选的实施方案中，本发明的多肽获自产紫青霉，最优选的选自产紫青霉CBS238.95或者其突变株，如带有由SEQ ID No:3中列出的氨基酸序列的多肽。

本发明的多肽也可以获得自青霉属的有性型，如：正青霉属(Eupenicillim)和篮霉菌属(Talaromyces)，包括但不局限于：Eupenicillium alutaceum、Eupenicillium cinnamopurpureum、Eupenicillium crustaceum、Eupenicillium hirayamae、Eupenicilliumpinetorum、Eupenicillium javanicum、Eupenicillium lapidosum、Eupenicillium ludwigii、Eupenicillium ochrosalmoneum、Eupenicillium shearii、Talaromyces flavus、Talaromyces stipitatus、Talaromyces luteus、Talaromyces wortmanii、Talaromycestrachyspermus、Talaromyces thermophilus和Talaromyces striatus。

本发明的多肽也可从其他如Samson和Pitt在Samson和Pitt编，青霉属和曲霉属分类学进展(Advances in Penicillium and AspergillusSystematies),Plenum出版社，ASI系列，纽约，1985一书中定义的与青霉属同义的真菌中获得。青霉属是丝孢菌类属，其特征在于在瓶梗轮的链中产生通常为绿色的分生孢子。瓶梗可直接位于柄上或位于一个、两个或极少时为三个坚实的支持细胞(梗基和枝，有时两者之间有副枝)上。瓶梗带有短而直的颈和光滑的外壁，隔一定时间不是同时地特征性的产生在柄或梗基上。

本发明中与给定来源相关的词“获自”应当是指由该来源产生的或是由一个插入该来源的基因的细胞产生的多肽。

在第二个实施方案中，本发明涉及由能在高度严格条件下与一寡核苷酸探针杂交的核酸序列编码的多肽，此寡核苷酸探针在同样条件下可与SEQ ID No:2列出的核酸序列或其互补链杂交(J.Sambrook,E.F.Fritsch和T.Maniatus,1989，分子克隆：实验室手册(Molecular CIoning,ALaboratory Manual)第2版，冷泉港，纽约)。杂交表明：按照标准Southern杂交程序，在低或高的严格条件下如：42℃ 5×SSPE,0.3％SDS,200μg/ml剪断的变性的鲑精DNA及50,35或25％的甲酰胺分别对应高、中或低的严格条件，类似的核酸序列可与对应于SEQ ID No:2列出的核酸序列的多肽编码部分的寡核苷酸探针杂交。

SEQ ID No:2可用于按照本领域周知的方法从其他不同的种、属中鉴定并克隆编码带有齿斑葡聚糖活性的多肽的DNA。因此，可以从这些其他生物中制得的基因文库、cDNA文库或组合化学文库中筛选与SEQ IDNo:2杂交且编码齿斑葡聚糖酶的DNA。来源于这样的其他生物的基因组DNA或其他DNA可以用琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳或其他分离技术分离到。来源于文库的DNA或分离到的DNA可被转移并固定到硝酸纤维素膜或其他适宜的载体材料上。为了鉴定与SEQ ID No:2同源的克隆或DNA，用于Southern杂交的载体材料最终用2×SSC,0.2％SDS洗涤3次，每次30分钟，洗涤温度优选不高于50℃，更优选不高于55℃，又更为优选不高于60℃，再优选为不高于65℃。在这些条件下与寡核苷酸探针杂交的分子用X光胶片检测。

在第三个实施方案中，本发明涉及带有与SEQ ID No:3列出的氨基酸序列有一定的同一性的氨基酸序列并定量地保留多肽的齿斑葡聚糖酶活性(此处以后称“同源性多肽”)的多肽，此处的同一性至少约为60％，优选至少约为70％，更优选至少约为80％，更为优选至少约为90％，最优选至少约为95％和最优选至少约为97％。在优选的实施方案中，同源性多肽与SEQ ID No:3列出的氨基酸序列有5个氨基酸不同，优选为4个氨基酸不同，更优选为3个，更为优选为2个，最优选为1个氨基酸不同。两个或多个氨基酸序列的同一性可以用本领域已知的GCG程序包中的如：GAP的计算机软件来确定(Needleman和Wunsch,1970，分子生物学杂志(Journal of Molecular Biology)48:443-453)。本发明中用同一性表、罚区间为10、区间长度为10的Clustal方法(Higgins,1989,CABIOS 5:151-153)确定两个氨基酸序列之间的同一性。

同源性多肽的氨基酸序列由于插入或删除一个或多氨基酸残基和/或用不同的氨基酸残基取代一个或多个氨基酸残基，而与SEQ ID No:3列出的氨基酸序列不同。优选地，氨基酸变化是性质上变化微小的，即不显著影响蛋白质的折叠和/或活性的保守性氨基酸取代；小量删除，典型地为1到约30个氨基酸的删除；小量氨基或羧基末端延伸，如一个氨基端甲硫氨酸残基；小的多至20-25个残基的接头肽的加入；通过改变净电荷便于纯化或其它功能的小延伸如：聚组氨酸片段、抗原表位或结合区域。

保守性取代的例子在下组范围之内：碱性氨基酸(如：精氨酸、赖氨酸和组氨酸)、酸性氨基酸(如：谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(如谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸(如亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸)、芳香氨基酸(如：苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)和小氨基酸(如：甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸和甲硫氨酸)。一般不改变特异活性的氨基酸取代为本领域所周知且如H.Neurath和R.L.Hill,1979，蛋白质(The Proteins),Academic出版社，纽约一书中所述。最常见的取代是：Ala/Ser,Val/Ile,Asp/Glu,Thr/Ser,Ala/Gly,Ala/Thr,Ser/Asn,Ala/Val,Ser/Gly,Tyr/Phe,Ala/Pro,Lys/Arg,Asp/Asn,Leu/Ile,Leu/Val,Ala/Glu,Asp/Gly以及反过来的取代。

本发明也涉及与产紫青霉CBS 238.95的多肽有免疫化学同一性或部分免疫化学同一性的多肽。在此实施方案中，本发明的多肽用于生产与多肽表位有免疫活性或结合力的抗体。与产紫青霉BCS 238.95的多肽有免疫化学同一性的多肽是指含有抗产紫青霉CBS 238.95天然多肽的抗体的抗血清以相同方式与其他多肽反应，如：沉淀的完全融合、沉淀形态相同且/或采用专一性免疫化学技术时电泳迁移率相同。免疫化学同一性的更进一步的解释如Axelsen,Bock和Kroll在N.H.Axelsen,J.Kroll和B.Weeks编，定量免疫电泳手册(a Manual of QuantitativeImmunoelectrophoresis),Blackwell科学出版社，1973，第10章中所述。部分免疫化学同一性指含有抗产紫青霉CBS 238.95天然多肽的抗体的抗血清以部分相同的方式与其它多肽反应，如：沉淀的部分融合、沉淀形态的部分相同且/或用专一性免疫化学技术时电泳迁移率的部分相同。部分免疫化学同一性的进一步解释如Bock和Axelsen在N.H.Axelsen,J.Kroll和B.Weeks编，定量免疫电泳手册，Balckwell科学出版社，1973，第11章中所述。免疫化学性质用周知的正交双向免疫扩散法进行的免疫交叉反应同一性测试法来决定。特别地，抗本发明多肽的抗血清按Harboe和Ingild在N.H.Axelsen,J.Kroll和B.Weeks编，定量免疫电泳手册，Blackwell科学出版社，1973，第23章或是Johnstone和Thorpe，免疫化学实践(Immunochemistry in Practice),Blackwell科学出版社，1982(更确切地第27-31页)中所述的方法通过免疫兔(或其他啮齿类动物)获得。

能与同SEQ ID No:2列出的核酸序列或其互补链或者亚片段杂交的寡核苷酸探针杂交的核酸序列编码的多肽、同源性多肽和具有免疫同一性或部分免疫同一性的多肽可以从任一种属的生物中获得，优选细菌或真菌来源。这样的多肽可来源于青霉属菌株和在公共保藏单位的相应种类。此外，这样的多肽可以用上述探针从包括自然界中(如：土壤、堆肥、水等)分离的微生物等其他来源中鉴定与获得。从自然生境中分离微生物的技术为本领域周年。核酸序列可以用相似地从另外的微生物cDNA文库中筛选而来，这些微生物具体地为真菌，如：曲霉属(Aspergillus sp.)的菌株，尤其是棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、臭曲霉(Aspergillus foetidus)、日本曲霉(Aspergillus japonicus)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黑曲霉(Aspergillus niger)或米曲霉(Aspergillusoryzae)，木霉属(Trichoderma sp.)的菌株，尤其是Trichodermaharzianum、康宁木霉(Trichoderma koningii)、Trichodermalongibrachiatum、Trichoderma reesei或绿色木霉(Trichodermaviride)，或是镰孢霉(Fusarium sp.)属菌株，尤其是Fusarium cerealis、Fusarim crookwellense、禾本科镰孢霉(Fusarium graminearum)、尖镰孢霉(Fusarium oxysporum)、接骨木镰孢霉(Fusarium sambucinum)或Fusarium sulphureum，或是腐质霉属(Humicola sp.)的菌株，或是出芽短梗霉属(Aureobasidium sp.)、隐球酵母属(Cryptococcus sp.)、Filibasidium sp.、Magnaporthe sp.、毁丝霉属(Myceliophthora sp.)、Neocallimastix sp.、拟青霉属(Paecilomyces sp.)、Piromyces sp.、篮霉属(Talaromyces sp.)、嗜热子囊菌属(Thermoascus sp.)、羧孢壳属(Thielaviasp.)或裂褶菌属(Schizophyllum sp.)的菌株。一旦用探针测得编码多肽的核酸序列，这些序列就可由本领域普通技术人员熟悉的技术分离或克隆(如：Sambrook等人，同前)。

此处所述“分离的”多肽是基本上不合其他非齿斑葡聚糖酶的多肽，如：用SDS-PAGE测定至少约20％的纯度，优选至少约40％的纯度，更优选约60％的纯度，更为优选约80％的纯度，最优选约90％的纯度，更最优选的95％的纯度。

本发明也涉及含有包括在SEQ ID No:3列出的氨基酸序列中的催化区域的杂合或融合多肽。在优选的实施方案中，这些多肽有齿斑葡聚糖酶活性。

本发明也涉及含有包括SEQ ID No:3列出的氨基酸序列中的接头的杂合或融合多肽。在优选的实施方案中，这些多肽有齿斑葡聚糖酶活性。

本发明也涉及含有包括在SEQ ID No:3列出的氨基酸序列中的齿斑葡聚糖结合区域的杂合或融合多肽。在优选的实施方案中，这些多肽有齿斑葡聚糖酶活性。核酸序列

本发明也涉及编码本发明的多肽的分离的核酸序列。在优选的实施方案中，核酸序列编码获自青霉属的产紫青霉的多肽；在更优选的实施方案中，核酸序列获自产紫青霉CBS 238.95，如：由SEQ ID No:2列出的核酸序列。在更为优选的实施方案中，核酸序列是在大肠杆菌NRRL B-21518中所含质粒pZL-Pp6A中的序列。本发明也包括编码由SEQ IDNo:3列出的氨基酸序列的多肽的核酸序列，它由于遗传密码的简并性而不同与SEQ ID No:2。本发明也涉及编码保留有齿斑葡聚糖酶活性的SEQ ID No:3片段的SEQ ID No:2的亚序列。优选编码保留有齿斑葡聚糖酶活性的SEQ ID No:3片段的SEQ ID No:2的亚序列至少含1400个核苷酸，更优选为至少1650个核苷酸，最优选为至少1800个核苷酸。

如上所述，核酸序列可以获自如Samson和Pitt,1985，(同前)所述的与青霉属义或为青霉属有性型的微生物。

用于分离或克隆编码多肽的核酸序列的技术已为本领域技术人员所知晓，其中包括：从基因组DNA中分离，从cDNA中制备或是上面技术的组合。从这些基因组DNA中克隆本发明的核酸序列可以用周知的聚合酶链式反应技术(PCR)或从表达文库中抗体筛选检出带有共同结构特征的克隆的DNA片段等方法来进行。参见如：Innis等人，1990，方法和应用指南(A Guide to Methods and Application),Academic出版社，纽约。其他核酸扩增方法如：连接酶链式反应(LCR)、连接的活化转录(LAT)和基于核酸序列的扩增(NASBA)也可以采用。核酸序列可以从生产该多肽的青霉中克隆，也可以从其他或相关例如可以是该核酸序列多肽编码区的等位序列或物种变种的生物中获得。

此处所用“分离的”核酸序列一词是指基本上不含有其他核酸序列的核酸序列，如用琼脂糖凝胶电泳检测至少约20％的纯度，优选至少约40％的纯度，更优选约60％的纯度，甚至更优选约80％的纯度，最优选约90％的纯度，甚至最优选约95％的纯度。例如：分离的核酸序列的获得可以通过基因工程中所用的标准克隆方法使之从天然的位点再定位到另外的位点上，并从中再产生该序列。克隆方法可以包括：切割和分离包含有编码该多肽的核酸序列的期望的核酸片段，将该片段插入到载体分子，且将该重组载体掺入到将复制该核酸序列的多拷贝或克隆的宿主细胞中。该核酸序列可以是基因组序列、cDNA、RNA、半合成或合成的或以上任一组合的来源。

本发明也涉及编码有活性的多肽的核酸序列，此核酸序列与SEQ IDNo:2所列出的核酸序列有一定程度的同一性，同一性至少约为60％，优选至少约为70％，更优选至少约为80％，更为优选至少约为90％，最优选约为95％。更最优选约为97％。两个核酸序列之间的同一性可以用本领域已知的计算机程序如GCG程序包中提供的GAP(Needleman和Wunsch,1970，分子生物学杂志48:443-453)来确定。为确定本发明中两个核酸序列之间的同一性程序，采用同一性表、罚区间为10、区间长度为10的Clustal方法(Higgins,1989，同前)

为了合成实质上相似于该多肽的多肽，编码该多肽的核酸序列的修饰也是需要的。“实质上相似于”该多肽是指非天然存在的该多肽的形式。这些多肽也许以一些故意设计的形式区别于分离自其天然来源的多肽。例如：可以用如定点突变的方法合成不同的多肽，这些多肽在比活性、热稳定性、最适pH条件或其它方面有所不同。类似序列可以在SEQ ID No:2的多肽编码部分核酸序列基础上构建，如：核酸序列的亚序列，和/或通过引入不引起核酸序列编码的多肽的氨基酸序列改变成其他氨基酸序列但相应于宿主生物的密码子使用以使之便于酶的生产的核苷酸取代，或是通过引入使之成为不同氨基酸序列的核苷酸取代等方法。对核苷酸取代的一般性描述参见Ford等人，1991，蛋白质表达和纯化(ProteinExpression and Purification)2:95-107。

对本领域技术人员而言显然可以在分子的关键功能区域之外进行这样的取代而仍可得到有活性的多肽。由本发明中分离的核酸序列编码的多肽活性所必需氨基酸残基和其优选不予取代的部分可以按照如定点突为或丙氨酸扫描突变(alanine-scanning mutagenesis)等本领域已知的方法来确定(见Cunningham和Wells,1989，科学(Science)244:1080-1085)。在后一技术中分子中每一残基均引入突变，测定所得的突变分子的齿斑葡聚糖酶活性从而确定对于分子活性关键的氨基酸残基。底物-酶反应的位点也可以通过分析由如核磁共振分析、结晶学或光亲和标记(photoaffinity labelling)等方法确定的三维结构来确定(见de Vos等人，1992，科学225:306-316；Smith等人，1992，分子生物学杂志224:899-904；Wlodaver等人，1992,FEBSLetters 309:59-64)。

本发明中的多肽也包括其中另一多肽融合在该多肽或该多肽片段的N-端或C-端上的融合多肽或可切割的融合多肽。融合多肽是将编码其他多肽的核酸序列(或其中一部分)融合到本发明的核酸序列(或其中一部分)上产生的。生产融合多肽的技术为本领域所周知，包括：连接编码多肽的编码序列以使它们处于同一读框且在同一启动子和终止子控制下表达融合多肽。

本发明也涉及能在高度严格条件下与寡核苷酸探针杂交的核酸序列，该寡核苷酸探针能在同一条件下与SEQ ID No:2列出的核酸序列或其互补链杂交(Sambrook等人，同前)。杂交表明在标准条件下类似的核酸序列能与相应于SEQ ID No:2列出的核酸序列的多肽编码部分的寡核苷酸杂交。

SEQ ID No:3列出的氨基酸序列或其部分氨基酸序列可用于设计一种寡核苷酸探针，编码本发明多肽的基因或其亚序列也可用作探针，这些探针可用来从任何种属中分离同源性基因。尤其是，为了检定和分离相关基因，这些探针可在标准的Southern杂交方法下用来和所感兴趣的种属的基因组或cDNA杂交。这样的探针可比完整序列短，但长度应当至少有15个核苷酸，优选至少为25个，更优选为40个核苷酸。较长的探针也可使用。DNA和RNA探针均可使用。为检测相关基因通常要标记探针(如：用³²P、³H、³⁵S、生物素或抗生物素蛋白)。用此处所述简并性探针和源于产紫青霉的基因组DNA或第一链cDNA进行的PCR反应也可以产生可用作克隆相应的基因组或cDNA的探针的产紫青霉齿斑葡聚糖酶特异性产物。核酸结构

本发明也涉及包含可操纵地连接到一个或多个控制序列上的本发明的核酸序列的核酸结构，该控制序列在适宜条件下在适当的宿主细胞内指导编码序列的表达。

此外，定义的“核酸结构”是单链或双链的核酸分子，该核酸结构可以从天然存在的基因中分离，或者从经修饰带有以自然界不存在的方式组合或排列的核酸片段中分离。当核酸结构中含有表达本发明的编码序列所必需的全部控制序列时，核酸结构一词也可与表达框架同义。此处“编码序列”一词定义为当置于上述控制序列控制之下时可被转录成mRNA且被翻译成本发明的多肽的序列。该编码序列的边界一般由5＇-端的翻译起始密码子ATG和3＇-端的终止密码子来决定。编码序列可包括但不局限于基因组DNA、cDNA和重组核酸序列。

编码本发明的多肽的分离的核酸序列可以不同的方式操纵以表达多肽。依据表达载体，也许需要在插入到该载体之前对编码该多肽的核酸序列加以操作。应用克隆方法对核酸序列的修饰技术为本领域周知。

此处“控制序列”定义为包括所有表达核酸序列的编码序列所必需或有助于表达的成分。每一控制序列可以是对编码多肽的核酸序列而言同源的或异源的。这样的控制序列包括但不局限于：先导序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号序列和转录终止子。至少，控制序列包括启动子和转录及翻译终止信号。控制序列也可提供用于引入特殊限制性位点的接头以便于将控制序列与编码多肽的核酸序列的编码区域连接。

控制序列可以是一个合适的启动子序列，即一个可由宿主细胞识别的用于表达核酸序列的核酸序列。启动子序列中含有调节多肽表达的转录控制序列。启动子可以是在所选宿主细胞中有转录活性的任何核酸序列，可以从编码与宿主细胞同源或异源的胞内或胞外多肽的基因中获得。

指导本发明的核酸结构转录的合适的启动子的例子，(尤其是在细菌宿主细胞中)是来源于大肠杆菌的乳糖(lac)操纵子、天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)琼脂糖酶基因(dag A)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)α-淀粉酶基因(amy L)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophillus)的产麦芽淀粉酶基因(amy M)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)α-淀粉酶基因(amy Q)、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(pen P)、枯草芽孢杆菌xyl A和xyl B基因，以及原核的β-内酰胺酶基因(Villa-Kamaroff等人，1978，美国国家科学院院报(Proceedings of the National Academy of Sciences USA)，75:3727-3731)的启动子和tac启动子(DeBoer等人，1983，美国国家科学院院报，80:21-25)。还有些启动子如“来源于重组细菌的有用蛋白质”(科学美国人(Scientific American)1980,242:74-94)和Sambrook等人(同前)中所述。

在丝状真菌宿主细胞中指导本发明的核酸结构转录的合适启动子的例子是来源于编码米曲霉(Aspergillus oryzae)TAKA淀粉酶、Rhizomucor miehei的天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉(Aspergillus niger)中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉(Aspergillusawamori)葡糖淀粉酶(gla A)、Rhizmucor miehei的脂肪酶、米曲霉的碱性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸异构酶、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)乙酰胺酶、尖镰孢(Fusarium oxysporum)胰蛋白酶样蛋白酶(如美国专利No.4,288,627中所述，此处引用作为参考。)的基因的启动子和其杂交合体。用于丝状真菌宿主细胞的特别优选的启动子是TAKA淀粉酶、NA2-tpi(编码黑曲霉中性α-淀粉酶和米曲霉丙糖磷酸异构酶基因的启动子杂合体)和gla A启动子。

在酵母宿主中，有用的启动子来源于酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)烯醇化酶(ENO-1)基因、酿酒酵母半乳糖激酶基因(GAL 1)、酿酒酵母乙醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因(ADH2/GAP)和酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶基因。其它有用的酵母宿主细胞的启动子如Romanos等人，1992，酵母8:423-488中所述。在哺乳动物宿主细胞中，有用的启动子包括如来源于猿病毒40(SV40)、劳斯肉瘤病毒(RSV)、腺病毒和牛乳头瘤病毒(BPV)的病毒启动子。

控制序列也可以是合适的转录终止序列，一段由宿主细胞识别的终止转录的序列。终止序列被可操纵地连接到编码多肽的核酸序列的3＇端。在所选宿主细胞中有作用的任何终止子均可用于本发明。

优选的用于丝状真菌宿主细胞的终止子来源于编码米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合成酶、黑曲霉α-葡萄糖苷酶和尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶的基因。

优选的用于酵母宿主细胞的终止子来源于编码酿酒酵母烯醇化酶、酿酒酵母细胞色素C(CYC1)或酿酒酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶的基因。其他用于酵母宿主细胞的有用的终止子如Romanos等人(1992，同前)的描述。

控制序列也可以是合适的先导序列，一种对由宿主细胞翻译重要的mRNA的非翻译区。先导序列被可操纵地连接到编码多肽的核酸序列的5＇端。在所选宿主细胞中有功能的任何先导序列均可用于本发明。

优选用于丝状真菌宿主细胞的先导序列来源于编码米曲霉TAKA淀粉酶和米曲霉丙糖磷酸异构酶的基因。

用于酵母宿主细胞的合适的先导序列来源于酿酒酵母烯醇化酶(ENO-1)基因、酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶基因、酿酒酵母α-因子和酿酒酵母乙醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因(ADH2/AGP)。

控制序列也可以是聚腺苷酸化序列，一个被可操纵地连接到核酸的3＇端和在转录时可由宿主细胞识别的作为在转录的mRNA上加上聚腺苷酸残基的信号的序列。在所选宿主细胞中有作用的任何聚腺苷酸序列均可用于本发明。

优选用于丝状真菌宿主细胞的聚腺苷酸化序列来源于编码米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合成酶和黑曲霉α-葡萄糖苷酶的基因。

用于酵母宿主细胞的有用的聚腺苷酸化序列如Guo和Sherman,1995，分子细胞生物学(Molecular Celluar Biology)15:5983-5990中所述。对哺乳动物细胞而言聚腺苷酸化序列为本领域所周知。

控制序列也可以是编码连接到多肽的氨基末端的氨基酸序列的信号肽编码区域，该氨基酸序列能引导表达的多肽进入细胞的分泌途径。该核酸5＇端的编码序列本身可含有与编码该分泌多肽的编码区域片段天然地连在翻译阅读框架中的信号肽编码区域。此外，编码序列的5＇端也可以含有与编码分泌多肽的编码区域部分异源的信号肽编码区域。当该编码区域正常不含有信号肽编码区域时可能需要异源的信号肽编码区域。此外，异源信号肽编码区域也可以简单替换天然的信号肽编码区域以获得与编码序列正常相关联的天然信号肽相比更高的齿斑葡聚糖酶的分泌。此信号肽编肽区域可以从来源于曲霉属的葡萄糖苷酶或淀粉酶基因、Rhizomucor属的脂酶或蛋白酶基因、酿酒酵母的α-因子的基因、芽孢杆菌属的淀粉酶或蛋白酶基因或是小牛前凝乳酶原基因中获得。然而，在所选宿主细胞中能够引导表达的齿斑葡聚糖酶进入分泌途径的任何信号肽编码区域均可用于本发明。

用于细菌宿主细胞的有效的信号肽编码区域是从芽孢杆菌NCIB11837、产麦芽淀粉酶基因，嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶基因、地衣芽孢杆菌枯草蛋白酶基因、地衣芽孢杆菌β-丙酰胺酶基因、嗜热脂肪芽孢杆菌中性蛋白酶基因(nprT、nprS、nprM)和枯草芽孢杆菌Prs A基因中获得的信号肽编码区域。其他信号肽如Simonen和Palva,1993，微生物综述(Microbiological Reviews)57:109-137中所述。

用于丝状真菌宿主细胞的有效的信号肽编码区域是从米曲霉TAKA淀粉酶基因、黑曲霉中性淀粉酶基因、Rhizomucor miehei天冬氨酰蛋白酶基因、柔毛腐质霉(Humicola lanuginosa)纤维素酶基因或Rhizomueormiehei脂酶基因中获得的信号肽编码区域。

用于酵母宿主细胞的有用的信号肽从酿酒酵母α-因子和酿酒酵母转化酶的基因中获得。其他有用的信号肽编码区域如Romanos等人，1992(同前)中所述。

控制序列也可以是前肽编码区域，它编码位于多肽氨基末端的氨基酸序列。所得多肽称为蛋白原或多肽原(有时是酶原)。多肽原通常无活性并能从多肽原通过前肽的催化性或自催化性切割转变为成熟的有活性的多肽。前肽编码区域可以从枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶基因(aprE)、枯草芽孢杆菌中性蛋白酶基因(npr T)、酿酒酵母α-因子基因或嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophilum)漆酶基因中获得(WO 95/33836)。

本发明的核酸结构也可以包含一个或多个核酸序列，它们编码有利于多肽表达的一个或多个因子，如：激活剂(例如反式作用因子)、分子伴侣和加工蛋白酶等。在宿主细胞中有作用的任何因子均可用于本发明。编码一个或多个这些因子的核酸序列不必与编码多肽的核酸序列串联。

激活剂是一种激活编码多肽的核酸序列的转录的蛋白质(Kudla，等人1990,EMBO Journal,9:1355-1364；Jarai和Buxton,1994，当代遗传学(Current Genetics)26:2238-244；Verdier,1990，酵母(Yeast)6:271-297)。编码激活剂的核酸序列可以从编码嗜热脂肪芽孢杆菌NprA(npr A)、酿酒酵母血红素激活剂蛋白1(hap1)、酿酒酵母半乳糖代谢蛋白4(gal4)和构巢曲霉氨调节蛋白(are A)的基因中获得。对其它例子见Verdier,1990(同前)和Mackenzie等人，1993，普通微生物学杂志(Journal of General Microbiology)139:2295-2307。

分子伴侣是帮助其它多肽正确折叠的蛋白质(Hartl等人，1994,TIBS 19:20-25；Bergeron等人，1994,TIBS 19:124-128；Demolder等人，1994，生物技术杂志(Journal of Biotechnology)32:179-189；Craig,1993，科学(Science)260:1902-1903；Gething和Sambrook,1992，自然(Nature)355:33-45；Puig和Gilbert,1994，生物化学杂志(Journal of Biological Chemistry)269:7764-7771；Wang和Tsou,1993,The FASEB Journal 7:1515-11157；Robinson等人，1994，生物技术(Bio/Technology)1:381-384)。编码分子伴侣的核酸可以从编码枯草芽孢杆菌GroE蛋白、米曲霉蛋白二硫键异构酶、酿酒酵母钙联接蛋白、酿酒酵母Bip/GRP78和酿酒酵母Hsp70的基因获得。对于其它的例子见Gething和Sambrook,1992(同前)和Hartl等人，1994(同前)。

加工蛋白酶是切割前肽以产生成熟的有生化活性的多肽的蛋白酶(Enderlin和Ogrydzialz,1994，酵母10:67-79；Fuller等人，1989，美国国家科学院院报86:1434-1438；Julius等人，1984，细胞(Cell)37:1075-1089；Julius等人，细胞32:839-852)。编码加工蛋白酶的核酸序列可以从编码酿酒酵母二肽氨肽酶、酿酒酵母Kex2和Yarrowia lipolytica二元加工内切蛋白酶(xpr6)的基因获得。

也可能希望加入能够调节与宿主细胞生长有关的多肽表达的调节序列。调节系统的例子是那些响应于包括存在调节化合物在内的化学或物理刺激能引起基因表达的打开或关闭的调节序列。原核体系中的调节系统包括：乳糖(lac)、tac和色氨酸(trp)操纵子系统。在酵母中，可以使用ADH2系统或GAL1系统。在丝状真菌中，可以用TAKAα-淀粉酶启动子、黑曲霉葡糖淀粉酶启动子和米曲霉葡糖淀粉酶启动子作为调节序列。其他调节序列的例子是允许基因扩增的调节序列。在真核体系中，包括有氨甲蝶呤存在时扩增的二氢叶酸还原酶基因和有重金属时扩增的金属硫蛋白基因。在这些情况下，编码多肽的基因应当放置在与调节序列串联的位置。表达载体

本发明也涉及含有本发明的核酸序列、启动子及转录和翻译终止信号的重组表达载体。上面所述不同的核酸和控制序列可以联结在一起构成重组表达载体，此重组表达载体中可以包括一个或多个方便的限制性位点以便于在这些位点中插入或替换编码多肽的核酸序列。此外，也可以通过将核酸序列或含有该序列的核酸结构插入到合适的表达载体中来表达本发明的核酸序列。构建表达载体时，编码序列应位于载体的适当位置上，使编码序列可操纵地连到合适的表达控制序列和可能的分泌控制序列上。

重组表达载体可以是便于重组DNA方法操作的能使核酸序列表达的任何载体(如：质粒或病毒)。载体的选择典型地依赖载体与载体将被引入的宿主细胞之间的相容性。载体可以是线性或闭合环状的质粒。载体可以是自主复制性载体，如：作为染色体外存在的载体；独立于染色体复制而复制的载体，如质粒；染色体外组件；微型染色体或人工染色体。载体可含有用于保证自我复制的任何工具。此外，载体可以是当被导入宿主细胞后整合到宿主基因组且与整合的染色体一起复制的载体。载体系统可以是单个载体或质粒或是多个载体或质粒，它们一起含有引入到宿主细胞基因组中的总DNA，或者是一个转座子。

本发明的载体优选含有允许方便地挑选转化细胞的一个或多个选择性标记。选择性标记是其产物提供杀生物剂或病毒抗性、重金属抗性、原养型到营养缺陷型转变及其他特性的基因。细胞的选择性标记的例子有源于枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌的dal基因或是使其获得如氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素或四环素抗性的基因。经常用的哺乳动物抗性标记为二氢叶酸还原酶基因。用于酵母宿主细胞的适宜的选择性标记是ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1和URA3。用于丝状真菌宿主细胞的选择性标记可以选自下组但不局限于下组中：amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨甲酰基转移酶)、bar(膦丝菌素乙酰转移酶)、hyg B(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸还原酶)、pyrG(乳清酸核苷-5＇-磷酸脱羧酶)、sC(硫酸腺苷酸转移酶)、trp C(邻氨基苯甲酸合成酶)和glufosinate抗性标记以及其他种属的等效物。在曲霉细胞中优选使用的是来源于构巢曲霉和米曲霉的amd S和pgr G标记以及来源于吸水链霉菌的bar标记。此外，可通过共转化完成选择，如WO 91/17243中所述，其中选择性标记位于不同的载体上。

本发明的载体优选含有使载体稳定地整合到宿主细胞基因组上或使载体在细胞中独立于细胞基因组自主复制的元件。

本发明的载体当被引入宿主细胞后可以整合到宿主细胞基因组中。对整合而言，载体可依赖编码多肽的核酸序列或载体的任何其它元件通过同源或非同源重组稳定地整合到基因组中。此外，载体可以含有附加核酸序列用于指导通过同源重组整合到宿主细胞基因组上。附加的核酸序列使载体能整合到宿主细胞基因组染色体上的精确位置。为了增加整合到精确位置上的机率，整合元件应优选含有与相应靶序列同源的足够数目的核酸，如100-1,500碱基对，优选400-1,500碱基对，最优选800-1,500碱基对，以增加同源重组的可能性。整合元件可以是与宿主细胞中的靶序列同源的任何序列。此外，整合元件可以是编码或非编码核酸序列。另一方面，载体也可以通过非同源重组的方式整合到宿主细胞的基因组上。这些核酸序列可以是与宿主细胞基因组靶序列同源的编码的或非编码的任何序列。

对于自主复制，载体可进一步包含有在所讨论的宿主细胞中使载体自主复制的复制起点。细菌的复制起点的例子有允许在大肠杆菌中复制的质粒pBR322、pUC19、pACYC177和pACYC184的复制起点以及允许在芽孢杆菌中复制的质粒pUB110、pE194、pTA1060和pAM β1的复制起点。用于酵母宿主细胞的复制起点的例子是2微米复制起点，CEN6和ARS4的组合及CEN3和ARS1的组合。复制起点可以是带有使其在宿主细胞内成为温度敏感型的突变的复制起点(见Ehrlich,1978，美国国家科学院院报(Proceedings of the National Academy of SciencesUSA)75:1433)。

可以将多个编码本发明的多肽的核酸序列的拷贝插入到宿主细胞中以增强该核酸序列的表达。可以通过本领域周知的方法将至少一个核酸序列的附加拷贝整合到宿主细胞基因组中并挑选转化子从而获得该核酸序列稳定的增强表达。

用于连接上述元件以构造本发明的重组表达载体的方法为本领域技术人员所周知(见Sambrook等人，1989，同前)。宿主细胞

本发明也涉及包含有利于多肽的重组生产的本发明核酸序列的重组宿主细胞。“宿主细胞”一词包括由于在复制过程中发生突变而与亲代细胞不一致的亲代细胞的任何子代。

优选用含有本发明核酸序列的载体转化宿主细胞随后该载体整合到宿主染色体上。“转化”是指将含有本发明核酸序列的载体导入宿主细胞以使载体以染色体整合体或以自复制的染色体外载体的形式保留在胞内。一般认为整合有利，因为核酸更易于稳定地保留在细胞内。载体整合到宿主染色体上可以通过如上述的同源或非同源性重组。

宿主细胞的选择很大程度上取决于编码多肽的基因和它的来源。宿主细胞可以是单细胞微生物，如：原核生物，或者是非单细胞微生物，如：真核生物。有用的单细胞是细菌细胞，如革兰氏阳性菌，包括但不局限于：芽孢杆菌细胞，例如：Bacillus alkalophilus，解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amylogiquefaciens),Bacillus brevis，环状芽孢杆菌(Bacilluscirculans)，凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)，灿烂芽孢杆菌(Bacilluslautus)，迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)，地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)，巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)，嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和苏云金芽孢杆菌(BAcillus thuringiensis)或是链霉菌细胞，例如：浅青紫链霉菌(Streptomyces lividans)或鼠灰链霉菌(Streptomyces murinus)，或者是革兰氏阴性菌如大肠杆菌和假单孢菌(Pseudomonas sp.)。在优选的实施方案中，细菌宿主细胞有：迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌。细菌宿主细胞的转化可以通过例如：原生质体转化(见如：Chang和Cohen,1979，分子普通遗传学(Molecular GeneralGenetics)168:111-115)、使用感受态细胞(见如：Young和Spizizin,1961，细菌学杂志(Journal of Bacteriology)81:823-829，或Dubnar和Davidoff-Abelson,1971，分子生物学杂志(Journal of Biology)56:209-211)、电穿孔法(见如：Shigekawa和Dower,1988，生物技术(Biotechniques)6:742-751)、或接合法(见如：Koehler和Thorne,1987，细菌学杂志169:5771-5278)等方法来实现。

宿主细胞可以是真核生物，如哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞或真菌细胞。有用的哺乳动物细胞包括：中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、Hela细胞、仔仓鼠肾(BHK)细胞、COS细胞或任何其他可得到的永生化细胞，如：来源于美国典型培养物保藏中心(ATCC)。

在优选的实施方案中，宿主细胞是真菌细胞。此处所用“真菌”一词包括子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、壶菌门(Chytridiomycota)、接合菌门(Zygomycota)(如Hawksworth等人，Ainsworth和Bisby＇s真菌词典(Ainsworth and Bisby＇s Dictionary ofThe Fungi)第8版，1995,CAB International,University Press，剑桥，英国)和卵菌门(Oomycota)(如Hawksworth等人，1995，同前，171页)以及所有有丝分裂孢子的真菌(Hawksworth等人，1995，同前)。子囊菌门代表性的组包括：如：脉孢菌属(Neurospora)、正青霉属(Eupenicillium(=青霉属))、Emericella(=曲霉属)，散囊菌属(Eurotium即(=曲霉属))和上面列出的真性酵母。担子菌门的例子包括：蘑菇、锈菌(rust)和黑粉菌(smut)。壶菌门代表性的组包括：异水霉属(Allomyces)、小芽枝霉属(Blastocladiella)、雕蚀菌属(Coelomomyces)和水生真菌。卵菌门代表性的组包括：水霉属(Saprolegniomycetous)水生真菌(水霉菌)如绵霉属(Achlya)。有丝分裂孢子真菌的例子包括：曲霉属、青霉属、假丝酵母(Candida)和链格孢属(Alternaria)。接合菌门代表性的组包括：根霉属(Rhizopus)和毛霉属(Mucor)。

在优选的实施方案中，真菌宿主细胞是酵母细胞。此处所用“酵母”包括：产子囊酵母(ascosporogenous yeast)(内孢霉目(Endomycetales))，产担子孢子囊酵母(basidiosporogenous yeast)和属于半知菌(芽酵母)(Fungi Imperfecti(Blastomycetes))的酵母。产子囊酵母分成蚀精霉科(Spermophthoraceae)和酵母科(Saccharomycetaceae)两个科。后者包含四个亚科，裂殖酵母亚科(Schizosaccharomycoideae)(如：裂殖酵母属(Schizosaccharomyces))，拿逊酵母亚科(Nadsonioideae)，油脂酵母亚科(Lipomycoideae)，酵母亚科Saccharomycoideae(如：毕赤酵母属(Pichia)，克鲁维酵母属(Kluyveromyces)和酵母属(Saccharomyces))。产担子孢子囊酵母包括：白冬孢酵母属(Leucosporidim)、红冬孢酵母属(Rhodosporidium)、锁掷酵母属(Sporidiobolus),Filobasidium和Filobasidiella。属于半知菌的酵母分成掷孢酵母科(Sporobolomycetaceae)(如：掷孢酵母属(Sorobolomyces)和布勒弹孢酵母属(Bullera))和隐球酵母科(Cryptococcaceae)(如：假丝酵母属(Candida))。由于酵母分类在将来可能改变，为了本发明的目的，酵母应当按照《酵母的生物学和活性》(Biology and Activities of Yeast)(Skinner,F.A.,Passmore,S.M.，和Davenport,R.R编，Soc.App.Bacteriol,Symposium Series No.9,1980)所述进行定义。酵母的生物学和酵母的遗传操作为本领域周知(见如：酵母的生物化学和遗传学(Biochemistry andGenetics of Yeast),Bacil,M.,Horecker,B.J.和Stopani,A.O.M编，第2版，1987；酵母(The Yeasts),Rose,A.H.和Harrison,J.S.编，第2版，1987，酵母属酵母的分子生物学(The Molecular Biology of the YeastSaccharomyces),Strathern等人编，1981)。

在更优选的实施方案中，酵母宿主细胞是假丝酵母属、克鲁维酵母属、酵母属、裂殖酵母属、毕赤酵母属或Yarrowia的种类。

在最优选的实施方案中，酵母宿主细胞是卡尔酵母(Saccharomycescarlsbergensis)，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，糖化酵母(Saccharomyces diastaticus),Saccharomyces douglasii，克鲁弗酵母(Saccharomyces kluyveri)，诺地酵母(Saccharomyces norbensis)或Saccharomyces oviformis的细胞。在其他最优选的实施方案中，酵母宿主细胞是乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)细胞。在其他最优选的实施方案中，酵母宿主细胞是Yarrowia Lipolytica细胞。

在一优选的实施方案中，真菌宿主细胞是丝状真菌细胞。“丝状真菌”包括所有真菌门(Eumycota)和卵菌亚门的丝状形式(如Hawksworth等人，1995，(同前)所述)。丝状真菌用组成营养菌丝的几丁质、纤维素、葡聚糖、脱乙酰壳聚糖、甘露聚糖和其它的复杂多糖来表征。通过菌丝的延长进行营养性生长且碳源代谢为专性需氧的。相反，如酿酒酵母的酵母营养性生长是通过单细胞菌体的芽殖且碳源代谢可以是发酵的。在更优选的实施方案中，丝状真菌宿主细胞是但不局限于：Acremonium，曲霉属(Aspergillus)，镰孢霉属(Fusarium)，腐质霉属(Humicola)，毛霉属(Mucor)，毁丝霉属(Myceliophthora)，脉孢霉属(Neurospora)，青霉属(Penicillium)，梭孢壳属(Thielavia),Tolypocladium和木霉属(Trichoderma)的细胞。

在更优选的实施方案中，丝状真菌宿主细胞是曲霉细胞。在另一更优选的实施方案中，丝状真菌宿主细胞是Acremonium细胞。在另一更优选的方案中，丝状真菌宿主细胞是镰孢霉属细胞。在另一更优选的实施方案中，丝状真菌宿主细胞是腐质霉属细胞。在另一更优选的方案中，丝状真菌宿主细胞是毛霉属细胞。在另一更优选的实施方案中，丝状真菌宿主细胞是毁丝霉属细胞。在另一更优选的实施方案中，丝状真菌宿主细胞是脉孢霉属细胞。在另一更优选的实施方案中，丝状真菌宿主细胞是青霉属细胞。在另一更优选的实施方案中，丝状真菌宿主细胞是梭孢壳属。在另一更优选的实施方案中，丝状真菌宿主细胞是Tolypocladium细胞。在另一更优选的实施方案中，丝状真菌宿主细胞是木霉属细胞。

在最优选的实施方案中，丝状真菌宿主细胞是泡盛曲霉、臭曲霉、日本曲霉、黑曲霉或曲霉细胞。在另一最优选的实施方案中，丝状真菌宿主细胞是Fusarium cerealis、Fusarium crookwellense、禾本科镰孢霉、尖镰孢霉、接骨木镰孢霉或Fusarium sulphureum细胞。在另一最优选的实施方案中，丝状真菌宿主细胞是Humicola insolens和Humicolalanuginosa细胞。在另一最优选的实施方案中，丝状真菌宿主细胞是米黑毛霉(Mucor miehei)细胞。在另一最优选的实施方案中，丝状真菌宿主细胞是Myceliophthora thermophilum细胞。在另一最优选的实施方案中，丝状真菌宿主是粗糙脉孢霉细胞。在另一最优选的实施方案中，丝状真菌宿主细胞是产紫青霉细胞。在另一最优选的实施方案中，丝状真菌宿主细胞是Thielavia terrestris细胞。在另一最优选的实施方案中，木霉属细胞是Trichoderma harzianum、Trichoderma koningii、Trichodermalongibrachiatum、Trichoderma reesei或Trichoderma viride细胞。

真菌细胞的转化方法包括按本身已知的方式进行的原生质体形成，原生质体转化和细胞壁再生。合适的转化曲霉属宿主细胞的方法如欧洲专利238,023和Yelton等人，1984，美国国家科学院院报81:1470-1474中所述。合适的转化镰孢霉属的种类的方法如Malardier等人，1989，基因(Gene)78:147-156或在共同未决美国中请08/269,449中所述。酵母可以用如Becker和Guarente在Abelson,J.N和Simon,M.I编的《酵母遗传学和分子生物学导论》(Guide to Yeast Genetics and MolecularBiology)，酶学方法(Methods in Enzymology),194卷，182-187页，Academic出版公司，纽约；Ito等人，1983，细菌学杂志(Journal ofBacteriology)153:163和Hinnen等人，1978，美国国家科学院院报75:1920中所述方法进行转化。哺乳动物细胞可以用磷酸钙沉淀法(Graham和Van der Eb 1978，病毒学(Virology)52:546)通过直接吞入进行转化。生产方法

本发明也涉及生产本发明的多肽的方法，其中包括：(a)培养青霉属菌株以生产含有该多肽的上清；和(b)回收该多肽。

本发明也涉及生产本发明的多肽的方法，其中包括：(a)在可引起该多肽表达的条件下培养宿主细胞；和(b)回收该多肽。

在上面两种方法中，用本领域已知的方法在适于生产多肽的营养性培养基中培养细胞。例如：在合适的培养基中和多肽能被表达和/或分离的条件下于实验室或工业发酵罐中进行的摇瓶培养、小规模或大规模发酵(包括连续式、分批式、补料分批式或固相发酵)来培养细胞。用本领域已知方法(参见例：细菌和酵母菌的参考文献；Bennett,J.W.和LaSure,L.，编《真菌中的基因操作》(More Gene Manipulations in Fungi),Academic出版社，CA,1991)在含有碳源和氮源和无机盐的合适的营养培养基中进行培养。可以从商业性供应者得到或按照公开的组成(例如：美国典型培养物保藏中心(ATCC)目录)制备合适的培养基。如果该多肽可被分泌到营养性培养基中，则可直接从培养基中回收多肽。如果该多肽不被分泌，则从细胞菌丝体中回收。

用本领域已知的特异于该多肽的技术检测该多肽。检测方法包括：特异性抗体的使用、酶产物的形成或是酶底物的消失。例如，可以用酶检定作为检测该多肽活性的方法。测定齿斑葡聚糖酶活性的方法为本领域已知，包括：如齿斑葡聚糖酶消化的齿斑葡聚糖的高效排阻层析。

所得多肽可以用本领域已知的方法回收。例如：该多肽可以从营养性培养基中用传统的方法包括但不局限于：离心、过滤、萃取、喷雾干燥、蒸发或沉淀等方法回收。回收的该多肽可以用不同的层析方法进一步纯化，如：离子交换层析、凝胶过滤层析、亲和层析等。

本发明的多肽也可用本领域已知的不同方法包括但不局限于：层析(如：离子交换、亲和、疏水、层析聚焦和排阻)、电泳方法(如：制备型等电聚焦(IEF)，差示溶解(如：硫酸铵沉淀)和萃取(见如：蛋白质纯化(ProteinPurification)J.-C Janson和Lars Ryden编，VCH publishers，纽约，1989)进行纯化。多肽组合物

更进一步，本发明涉及其中富集本发明多肽的多肽组合肽。本文中，“富集”一词是指该多肽组合物的齿斑葡聚糖酶活性由于加入了本发明的多肽而增强了，例如：富集系数为1.1。

该多肽组合物可以是一个含有以本发明的肽为主要酶成分的组合物，如：单组分多肽组合物。此外，组合物可以包含多重酶活性，如：氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、几丁质酶、角质酶、脱氧核糖核酸酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、盐过氧化物酶(haloperoxidase)、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、齿斑葡聚糖酶、氧化物酶、果胶降解酶、过氧化物酶、肌醇六磷酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶或木聚糖酶。附加的酶可通过属于曲霉的优选棘孢曲霉、泡盛曲霉、黑曲霉或米曲霉、或者属于Trichoderma、Humicola、优选Humicolainsolens或者属于Fusarium，优选Fusarinm graminearum的微生物制造。

多肽组合物可按本领域已知方法制成液体或干组合物形式。例如：该多肽组合物可以是颗粒或微粒的形式。组合物中包括的多肽可以按本领域已知的方法稳定。

下面列出本发明的多肽组合物的优选的用途实例。本发明多肽组合物的剂量和组合物应用的其他条件可以用基于本领域已知的方法确定。用途

本发明的齿斑葡聚糖酶可用作降解由口腔中的变异链球菌产生的齿斑葡聚糖的抗斑剂。(Guggenheim,1970,Helv.Odont.Acta 14:89-108)。齿斑葡聚糖对细菌在牙齿表面上的附着和增长起重要作用，因此在龋齿的病原学中很重要(Kelstrup,1978，丹麦牙科杂志(Danish DentalJournal)82:431-437)。

本发明还涉及口腔组合物尤其是牙粉，其中包含有效量的齿斑葡聚糖酶和在牙科应用及个人护理产品中用作抗斑剂的合适的口腔载体。“有效量”此处定义为能减少牙斑的足够量的齿斑葡聚糖酶。“合适的口腔载体”此处定义为能以安全有效的方式在口腔中应用本发明组合物的合适载体。本发明的组合物可用口腔产品领域普通方法制造。牙粉是与牙刷联合使用以从牙齿上除去污垢使口腔在刷后感到清洁和清凉的产品。牙粉也经常用作带有特殊治疗和美容功能的输送剂。个人护理产品的例子包括但不局限于牙膏、牙胶、漱口水、口香糖和托牙清洁剂。

产品的组成成分依具体产品而不同(Kirk-Othmer,John Wiley &Sons,New York)。组成成分的例子包括但不局限于：磨擦剂、致湿物、表面活性剂、乳化剂、胶体、鳌合剂、粘附剂、一种或多种用于粘附和结构的树胶或树脂、一种或多种香料、色素、防腐剂和用于特殊效果的活性剂(如：氟化物和增白剂)。漱口水可以输送因为与牙膏成分之间的化学不相容性而无法通过牙膏供给的活性剂。例如：氟化钠、含钙磨擦剂、十二烷基硫酸钠和洗必泰是不相容的。

本发明还涉及包含在口腔中应用足够量的本发明产品的降解口腔中齿斑葡聚糖的方法。本发明的组合物可以以干的、膏、胶或液体形式应用。组合物可以是在应用前需用合适量的水或其它稀释剂稀释的浓缩物。组合物中每个组分的浓度依应用的用途和方法而不同。齿斑葡聚糖酶的浓度依具体的组合物的本质而不同，尤其是组合物是浓缩物还是可直接使用的。应用后，应允许组合物与口腔中的组织保持接触从15秒到约12小时范围内的一定时间直至洗掉或刷掉。此外，组合物也可不受限制地留在口腔直至产品被如：饮用液体或咀嚼食物的机械方式去除。

本发明用下列实施例进一步描述，但不应该认为限定了本发明的范围。实施例1：由产紫青霉CBS 238.95生产齿斑葡聚糖酶

产紫青霉CBS 238.95获自Centraalbureau voor Schimmelcultures,Oosterstraat 1,3742 SK Baarn，荷兰。菌株在pH6.0,30℃ 300转/分搅拌培养，每升培养基中含有30g葡萄糖、0.5g酵母提取物、2g柠檬酸、11g MgSO₄-7H₂O、6g K₃PO₄-3H₂O、12g(NH₄)₂PO₄和6.5g乳酸。生长10天，全部培养液离心，回收上清。实施例2：齿斑葡聚糖酶平皿检定

齿斑葡聚糖酶的活性通过实施例1的上清样本在齿斑葡聚糖琼脂平皿上形成透明区带的能力来测定。如齿斑葡聚糖经过葡聚糖酶处理，平皿检定的灵敏度则会增加。

葡聚糖酶处理过的齿斑葡聚糖由在pH6.5,37℃(保持恒定)下通气率为75转/分的培养基中培养变异链球菌CBS 350.71制得，每升培养基中含有6.5g NZ-Case,6g酵母提取物，20g(NH₄)₂SO₄,3gK₃PO₄,50g葡萄糖，和0.1％Pluronic PE6100。

35小时后，加入蔗糖至终浓度为60克/升以诱导产生葡萄糖基转移酶。总发酵时间为75小时。来自发酵的上清液经过离心和过滤(无菌)。蔗糖加入到上清液中至终浓度5％(pH用乙酸调到7.0)，搅拌溶液37℃下过夜。过滤溶液，不溶的齿斑葡聚糖收集在propex上用含有0.1％苯甲酸钠，pH5(用乙酸调)的去离子水充分洗涤。最后，不溶的齿斑葡聚糖被冷冻干燥并研磨。

10克纯化过的变异链球菌齿斑葡聚糖悬浮在200ml 0.1M,pH6.0的乙酸钠溶液中并且在30℃下与50μl葡聚糖酶50L(Dextranase ^TM)(NovoNordisk A/S,Bagsvard，丹麦)培养20小时。培养后离心上清液，用去离子水洗涤沉淀。重复此步骤两次。洗涤过的沉淀在65℃下干燥并用咖啡磨研磨成粉末。1克葡聚糖酶处理过的齿斑葡聚糖悬浮在15ml 0.1MpH6.0的乙酸钠溶液中用Ultra Turrax匀浆机(Janke和Kunkel,IKA-Labortechnik)混合25分钟。混合过的悬浮液用蒸汽高压灭菌20分钟，加入到450ml 2％的融化的琼脂中倒入培养皿，含有齿斑葡聚糖的琼脂冷却后在琼脂上打孔，10μl酶样品加入到各孔中。37℃下培养平皿20小时，齿斑葡聚糖酶活性可通过在乳白色背景上的透明区域观察到。

10μl按实施例1所述制得的产紫青霉CBS 238.95的全培养液上清样品在含有葡聚糖酶处理过的齿斑葡聚糖的琼脂平皿上产生了透明区域。实施例3：高效排阻层析检定

葡聚糖酶处理过的齿斑葡聚糖到可溶性多糖产物的齿斑葡聚糖酶的降解可用高效排阻层析来测定。

0.5％w/v葡聚糖酶处理过的齿斑葡聚糖(如实施例2)所述制备)在0.1M pH6.0的乙酸钠中的悬浮液在Ultra Turrax匀浆机中混合25分钟。在Eppendorf管中，将1ml混匀的悬浮液加入酶样品中并在Eppendorf热混合仪中30℃下培养20小时，然后在95℃下处理20分钟使齿斑葡聚糖酶热失活。对于每个齿斑葡聚糖酶样品，同时带有一个先将齿斑葡聚糖酶热失活的对照。齿斑葡聚糖悬浮液离心后，上清取25μl注射到3个串联的TSK柱(PW G4000,PW G3000,PWG2500(Toso Haas,7.8mm内径×30cm))进行分析。糖类用0.4M pH3.0的乙酸钠室温下洗脱，流速为每分钟0.8ml。洗脱的糖用Shimadzu折光系数检测仪测定折光系数来测定，收集的数据用Dionex软件(AI-450,Dionex公司，Sunnyvale,CA)来处理。葡聚糖和葡萄糖用作分子量标准。齿斑葡聚糖酶活性导致葡萄糖的产生。

25μl按实施例1制得的产紫青霉CBS 238.95的全培养液上清样品从葡聚糖酶处理过的齿斑葡聚糖中产生了葡萄糖。实施例4：产紫青霉CBS 238.95齿斑葡聚糖酶的纯化

从如实施例1所述制备的全培养液上清中纯化产紫青霉CBS 238.95齿斑葡聚糖酶使用四步骤纯化方法。

首先，上清液用0.2μm滤膜过滤。100ml过滤过的上清用带有截留分子量为10,000KDa的膜的Amicon超滤器进行超滤使之浓缩且用25mM pH8.0的Tris-HCl平衡。

其次，50ml浓缩液以每分钟1.5ml的流速加入到用25mM pH8.0的Tris-HCl预平衡过的XK 16/20 Fast Flow Q琼脂糖凝胶阴离子交换柱上。用2倍体积的25mM pH8.0的Tris-HCl洗柱，再用3倍体积的25mM pH8.0的Tris-HCl中0到1M NaCl的线性梯度洗脱结合的蛋白质。各收集部分齿斑葡聚糖酶的活性用如实施例2的齿斑葡聚糖酶平皿法检定。齿斑葡聚糖酶活性用如实施例3中所述的高效排阻层析法确认。合并含有齿斑葡聚糖酶活性的收集部分。齿斑葡聚糖酶约在0.75M NaCl处被洗脱。

第三，将合并收集部分的缓冲液用截留分子量为10,000的Amicon超滤器超滤，通过平衡更换成0.25M pH5.5的醋酸铵缓冲液。收集的部分被加到Hiload 26/60 Superdex 75(Pharmacia Biotech,Uppsala，瑞典)凝胶过滤柱上，用0.25M pH5.5的醋酸铵缓冲液以每分钟1ml的速度洗脱齿斑葡聚糖酶蛋白。用如实施例3所述的高效排阻层析法检测齿斑葡聚糖酶活性。合并收集含有齿斑葡聚糖酶的部分。

第四，将合并收集部分的缓冲液通过用截留分子量为10,000的Amicon超滤器超滤更换成20mM pH8.0的Tris-HCl。合并收集部分以每分钟1ml的速度加入到用20mM pH8.0的Tris-HCl预平衡过的Mono Q HR10/10(Pharmacia Biotech,Uppsala，瑞典)柱上。用2倍体积的20mM ph8.0 Tris-HCl缓冲液洗柱，再用100ml 20mM pH8.0 Tris-HCl中0到0.75MNaCl线性梯度洗脱结合的蛋白质。用实施例3所述的高效排阻层析法检定齿斑葡聚糖酶活性。齿斑葡聚糖酶约在0.4M NaCl处被洗脱。实施例5：产紫青霉CBS 238.95齿斑葡聚糖酶的N-端序列测定

获自产紫青霉CBS 238.95的齿斑葡聚糖酶在按标准方法SDS-PAGE和电印迹后，按照制造商指示进行操作，用带有固定盒的AppliedBiosystem 473A蛋白质测序仪测定其N-端氨基酸序列。测得的N端序列如下：Xaa-Thr-Ser-Asx-Arg-Leu-Val-Phe-Ala-(His)-Phe-(Met)-Val-Gly-Ile-Val-1               5                    10                     15

                             (SEQ ID NO:1)其中，10位和12位的氨基酸残基不确定，但认为分别是His和Met,1位的Xaa代表未测出的氨基酸残基，4位的Asx代表天冬氨酸或天冬酰胺的氨基酸残基。此序列与下面列出的日本专利No.4-58889/A所公开的Trichoderma harzianum齿斑葡聚糖酶的N-端序列明显不同：Ser-Ser-Ala-Asp-Arg-Leu-Val-Phe-Cys-His-Phe-Met-Ile-Gly-Ile-Val-1               5               10                  15

                         (SEQ ID NO:4)实施例6：产紫青霉CBS 238.95 DNA提取

产紫青霉238.95在25ml 0.5％酵母提取物-2％葡萄糖(YEG)培养基中32℃和250转/分条件下培养24小时。利用Miracloth(Calbiochem,LaJolla,CA)过滤收集菌丝体，用25ml 10mM Tris-1mM EDTA(TE)缓冲液洗涤一次。沥去多余缓冲液并将菌丝体用液氮冷冻。在电动咖啡磨中将冷冻的菌丝体研磨成细粉末，将粉末加入含有20ml TE缓冲液和5ml 20％W/V十二烷基硫酸钠(SDS)的一次性塑料离心管中。颠倒混合数次使混匀，用等体积酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1,v/v/v)抽提两次。加入乙酸钠(3M溶液)使终浓度为0.3M，再用2.5倍体积的冰冷乙醇沉淀核酸。15,000×g离心30分钟后将沉淀风干30分钟，再用0.5ml TE缓冲液重新悬浮。加入无DNA酶的核糖核酸酶A至每浓度100μg/ml，混合物在37℃培养30分钟。混合物中再加入蛋白酶K(200μg/ml),37℃继续培养1小时。最后，混合物用酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1,v/v/v)抽提两次，再按标准方法用乙酸钠和乙醇沉淀DNA。DNA沉淀真空干燥后用TE缓冲液重新悬浮，4℃贮存。实施例7：基因组DNA的杂交分析

如实施例6所述制备的总细胞DNA样品用Southern杂交(Maniatis等人，1982，分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning,a LaboratoryManual)、冷泉港出版社，冷泉港，纽约)进行分析。约5μg DNA样品用BamHⅠ,EcoRⅠ或HindⅢ消化后用1％琼脂糖凝胶按大小分离。用短波UV灯对凝胶照像，将凝胶在0.5M NaOH-1.5M NaCl溶液中浸泡15分钟，再浸泡于1M Tris-HCl(pH8)-1.5M NaCl溶液中15分钟。按照Davis等人(1980，高等细菌遗传学：遗传工程手册(Advanced BacterialGenetics,A Manual for Genetic Engineering)冷泉港出版社，冷泉港，纽约)所述方法通过20×SSPE(3M NaCl-0.2M Na₂HPO₄-0.02MEDTA-Na₂)以毛细管作用将凝胶中的DNA转移到Nytran^TM杂交膜上(Schleicher和Schuell,Keene,NH)。真空中80℃烘烤膜2小时后45℃下浸泡于杂交缓冲液中轻摇2小时，杂交缓冲液由：5×SSPE,35％甲酰胺(V/V),0.3％SDS和200μg/ml变性和剪切的鲑鱼测试DNA组成。含有Tricho derma harzianum齿斑葡聚糖酶cDNA的编码序列(见日本专利NO.4-58889/A)的齿斑葡聚糖酶专一性探针(约1.8Kb)用α-[³²P]dCTP(Amersham,Arlington Heights,IL)通过缺口翻译(Maniatis等人，同前)进行放射性标记后，以约1×10⁶cpm每毫升缓冲液的活性加入到杂交缓冲液中。混合物和膜一起45℃下水浴摇床中培养过夜。培养后，45℃下用含有0.1％SDS的0.2×SSPE洗膜一次，再用不含SDS的0.2×SSPE同样温度下洗膜两次。膜在纸巾上干燥15分钟后用Saran-Wrap^TM包裹，-70℃下在增感屏上对X-光胶片曝光过夜(Kodak,Rochester，纽约)。

Southern杂交显示在中等严格条件下Trichoderma harzianumcDNA可用作探针检定和克隆如图1所示的来源于产紫青霉CBS 238.95的齿斑葡聚糖酶基因。实施例8:DNA文库和齿斑葡聚糖酶克隆的检定

基因组cDNA文库用细菌噬菌体克隆载体λZipLox(LifeTechnologies,Gaithersburg,MD)构建，大肠杆菌Y1090ZL细胞(LifeTechnologies,Gaithersburg,MD)用作平板接种和重组噬菌体纯化的宿主，大肠杆菌DH10BZip(Life Technologies,Gaithersburg,MD)用于单个pZL1-齿斑葡聚糖酶克隆的剪切。总细胞DNA用Tsp509I部分消化并在1％的琼脂糖凝胶上按大小分级分离。切下迁移到3～7kb范围的DNA片段，用Prep-a-Gene试剂(BioRad Laboratories,Hercules,CA)从胶中洗脱。洗脱得到的DNA与用EcoRⅠ切割且去磷酸化的λZipLox载体手臂(Life Technologies,Gaithersburg,MD)连接，连接混合物用商业化包装抽提物(Stratagene,La Jolla,CA)包装。包装的DNA文库在大肠杆菌Y1090ZL细胞(Life Technologies,Gaithersburg,MD)中平板接种和扩增。未扩增的基因组文库含有4.1×10⁶pfu/ml(不含有基因组DNA插入的对照连接产生2.0×10⁴pfu/ml)。用按实施例7的放射性标记的Trichoderma harzianum齿斑葡聚糖酶探针通过噬菌斑杂交法从文库中筛选了约45,000个噬菌斑。探选出与探针强烈杂交的18个阳性克隆，其中10个在大肠杆菌Y1090ZL细胞中纯化两次。随后齿斑葡聚糖酶克隆以pZL1-齿斑葡聚糖酶克隆从λZipLox载体中切出(D＇Alessio等人，1992,Focus^14:76)。实施例9：产紫青霉CBS 238.95齿斑葡聚糖酶基因的DNA序列分析

用标准方法(Maniatis等人，同前)获得实施例8中所述pZL1-齿斑葡聚糖酶克隆的限制性图谱。联合用鸟枪DNA测序法(Messing等人，1981，核酸研究(Nucleic Acids Research)9:309-321)和利用染料终止子化学的引物步移法(Giesecke等人，1992，病毒学方法杂志，(Journal ofVirol.Methods)38:47-60)通过Applied Biosysterms 373A型自动DNA测序仪(Applied Biosysterms公司，Foster City,CA)测定实施例8中所述齿斑葡聚糖酶克隆的DNA序列。除乳糖正向和乳糖反向引物外，按照制造商指示在Applied Biosysterms 394型DNA/RNA合成仪上合成了特异性寡核苷酸测序引物。实施例10：产紫青霉CBS 238.95齿斑葡聚糖酶基因的性质

命名为Pp6A(大肠杆菌INVα1F-pZL-Pp6A)的一个pZL1-齿斑葡聚糖酶克隆的限制性图谱表明：在中等严格条件下与Trichodermaharzianum齿斑葡聚糖酶cDNA杂交的区域位于靠近图2所示插入的3.6Kb基因组DNA的一端。

该片段部分DNA序列测定表明有一个与Trichoderma harzianum齿斑葡聚糖cDNA同源的开放阅读框架(SEQ ID No:2)，图3所示为产紫青霉齿斑葡聚糖酶的推测的氨基酸序列(SEQ ID No:3)。

产紫青霉CBS 238.95齿斑葡聚糖酶基因中内含子和外显子的位置基于推测的氨基酸序列与相应的Trichoderma harzianum齿斑葡聚糖酶基因产物的序列比较而确定。基于这个比较，产紫青霉CBS 238.95齿斑葡聚糖酶基因含有5个由4个小内含子(63,81,58和78bp)分隔的外显子(126,532,226,461和548bp)。内含子的大小和组成与其它真菌的基因相一致(Gurr等人，1987,Kinghorn,J.R(编)，真核微生物的基因结构(GeneStructure in Eukaryotic Microbes)93-139页，IRL出版社，牛津)：两者均含有保守的剪接供体和受体序列以及在每个间隔序列3＇端附近的套索序列(PuCTPuAC)共有区。

实施例5中所述N-端氨基酸序列与由图3(SEQ ID No:3)列出的推测的产紫青霉CBS 238.95齿斑葡聚糖酶基因产物的N-端氨基酸序列相比较表明：在成熟的酶中不存在氨基末端的30个氨基酸。基于von Heijne规则(von Heijne,1984，分子生物学杂志(Journal of MolecularBiology)173:243-251)，前20个氨基酸可能含有指导初生多肽进入内质网中的分泌信号肽。其余10个氨基酸可能代表了在二元Arg-Arg序列后蛋白酶解切割随后去除的前肽序列。成熟的齿斑葡聚糖酶是由600个氨基酸(MW=63,443)组成的酸性蛋白质(计算等电点为3.8)。由于在SDS-PAGE观察到的分子量(约96,000)显然大于由图3(SEQ ID No:3)列出的推测的氨基酸序列的预期值，可能是由于齿斑葡聚糖酶含有相当量的可能多达重量的34％的糖类。产紫青霉齿斑葡聚糖酶的信号肽和前肽部分与图4所示(SEQ ID No:5)Trichoderma harzianum齿斑葡聚糖酶没有相似性。

成熟的产紫青霉CBS 238.95齿斑葡聚糖酶的推测的氨基酸序列与来源于如图4所示(SEQ ID No:5)的Trichoderma harzianum的齿斑葡聚糖酶(日本专利No.4-58889/A)有约52.8％的同源性。最大同源性的区域位于这两个蛋白质的氨基末端半区以及含有各自C-末端的最后70个氨基酸残基。成熟的产紫青霉齿斑葡聚糖酶似乎含有三个独特的区域：(1)氨基末端的催化区域，(2)富含Ser-Thr的连接区域和(3)C-末端多糖(如齿斑葡聚糖)结合区域(548-630残基)。富含Ser-Thr区域(475-547残基)62％由Ser和Thr组成，基本上以477位和547位的Cys残基为边界。这个区域可以与黑曲霉葡糖淀粉酶中的富含Ser-Thr的连接区域相类似的方法被高度糖基化(氧连接)(Coutinho和Reilly,1994，蛋白质工程(Protgein Engineering)7:393:400)。实施例11：产紫青霉CBS 238.95齿斑葡聚糖酶在米曲霉中的表达

下面所示两个合成的寡核苷酸引物设计用于从质粒pZL-Pp6A中扩增产紫青霉CBS 238.95齿斑葡聚糖酶基因。5’-cccatttaaatATGAAAGTCTCCAGTGCCTTC-3’(SEQ ID NO:6)5’-cccttaattaaTTAGCTCTCTACTTGACAAGC-3’(SEQ ID NO:7)

(大写字母对应于在齿斑葡聚糖酶基因中存在的序列)

含有52ng质粒DNA,1×Pwo缓冲(Boehringer Mannheim,Indinapolis,IN),dATP、dTTP、dGTP和dCTP各1mM以及2.5单位PwoI(Boehringer Mannheim,Indinapolis,IN)的PCR反应中用上述两种引物各100pM。PCR反应条件为：第一次循环在95℃ 3分钟，后25个循环中每次95℃ 1分钟，60℃ 1分钟和72℃ 1.5分钟，最后一次循环72℃ 5分钟。扩增的2.2Kb DNA片段用凝胶电泳纯化且用限制性内切酶SWaⅠ和PacⅠ(用制造商确定的条件)切割。切下的片段克隆到用SwaⅠ和PacⅠ预先切割过的质粒pBANe6(图5)中得到表达质粒pJeRS35。

质粒pJeRS35用标准原生质体转化法(Christensen，等人，1988，生物技术(Bio/Technology)1419-1422)导入碱性蛋白酶缺陷型米曲霉宿主JaL 142-6。转化在原生质体为约2×10⁷个原生质体/毫升的浓度下进行。每100μl原生质体和约5μg DNA一起置于冰上30分钟。加入1毫升SPTC(40％PEG 4000,0.8M山梨糖醇，0.05M pH8.0的Tris，0.05M CaCl₂)，原生质体在室温下培养20分钟。在COVE转化平皿(每升中：0.52g KCl,0.52g MgSO₄-7H₂O,1.52g KH₂PO₄,1ml下述微量金属溶液，342.3g蔗糖，25g Noble琼脂，10ml 1M的乙酰胺，10ml 3M的CsCl)上平板接种之前转化液中加入7ml Cove琼脂上层(每升中：0.52g KCl,0.52g MgSO₄-7H₂O,1.52g KH₂PO₄,1ml下述微量金属溶液，0.8M蔗糖和1％的低熔点琼脂)。微量金属溶液(1000x)每升由22g ZnSO₄-7H₂O,11g H₃BO₃,5g MnCl₂-4H₂O,5gFeSO₄-7H_2O,1.6g CoCl₂-5H₂O,1.6g(NH₄)₆MO₇O₂₄和50g Na₄EDTA组成。平皿34℃下培养5-7天。转化子转移到同样培养基的平皿上37℃培养3-5天。转化子通过孢子划线和挑选分离的菌落在同样平皿同样条件下培养进行纯化。总共得到40个能在COVE培养基上利用乙酰胺作为唯一氮源的转化子。

转化子在34℃有搅拌的条件下在含有20ml MY50N培养基的摇瓶中生长3天，MY50N培养基每升中含有62g Nutriose,2.0gMgSO₄-7H₂O,2.0gKH₂PO₄,4.0g柠檬酸，8.0g酵母提取物，2.0g尿素，0.1g CaCl₂和0.5ml微量金属溶液，调至pH6.0。微量金属溶液为每100ml去离子水中含有2.2g ZnSO₄·7H₂O,1.1g H₃BO₃,0.5gMgCl₂-4H₂O,0.5g FeSO₄-7H₂O,0.16g CoCl₂-5H₂O,0.16g(NH₄)₆Mo₇O₂₄和5g Na₄EDTA。

4℃下混合1％(V/W)齿斑葡聚糖的悬浮液和溶于pH5.5 0.1M的乙酸钠缓冲液的1％的琼脂糖20分钟制得齿斑葡聚糖酶检定平皿。加热熔化琼脂糖倒入150mm平皿。凝固后在平板上打孔(约40μl同等体积)。40个生长的转化子培养基的离心液分别取35μl加入到孔中，37℃下培养平板。经过夜培养，其中14个转化子孔显示有暗的透明区域(对照没有透明区域)。

按照制造商的指示，用8-16％聚丙烯酰胺Novex胶(Novex,SanDiego,CA)通过SDS-PAGE分析阳性转化子的培养液。转化子在约96KDa处有明显条带而对照的培养液中没有这样大小的条带。一个转化子培养液中的96KDa条带用SDS-PAGE再次分离，再用溶于10％甲醇，pH11.0的10mM CAPS(3-[环己氨基]-1-丙磺酸)将条带转移到PVDF膜上2小时。PVDF膜用溶于40％甲醇/1％乙酸中0.1％考马斯蓝R-250染色20秒。将染色的条带切下并按照制造商指示用固定盒及液相三氟乙酸输送通过Applied Biosystems公司的476A型蛋白测序仪(Applied Biosysterms,Foster City,CA)测定N-端序列。结果显示出基于DNA序列的预期的齿斑葡聚糖酶N-端。N-端加工在Kex-2切割位点之后。N-端序列测定为STSDRLVFAHFMVGIVSDRTSA(SEQ ID NO:1)实施例12：重组产紫青霉齿斑葡聚糖酶的纯化和鉴定

如实施例11中所述的米曲霉JeRS323的一个转化子在30℃,200转/分的1升的摇瓶中生长4天，摇瓶中250ml的培养基含有每升10g酵母提取物，20g蛋白胨并加入2％麦芽糖。全部培养液用Miracloth过滤。

如实施例2所述方法制得的齿斑葡聚糖用0.1M pH5.5的乙酸钠缓冲液洗涤，并以15.6g每780ml 0.45μm过滤过的摇瓶培养基的量悬浮制成2％的溶液。悬浮液调至pH5.5再于4℃下混合1小时。悬浮液再用烧结玻璃过滤漏斗过滤，用0.1M pH5.5的乙酸钠缓冲液(总体积1110ml)洗涤4次，最后用去离子水(总体积1250ml)洗涤6次。每次洗涤步骤后，悬浮液均过滤并收集滤液。通过测定从齿斑葡聚糖释放出的可溶性还原糖的产生确定齿斑葡聚糖酶的洗脱。具体地，0.1ml溶于50mM pH5.5的乙酸钠缓冲液中的5％齿斑葡聚糖(至少允许溶胀1小时)加入到圆底Eppendorf管(保证充分搅拌)内0.3ml的每一部分滤液(用去离子水稀释)中，40℃下剧烈振荡培养15分钟。加入0.1ml 0.4M NaOH终止反应。样品离心后用0.45μm滤器(Millipore,Bedford,MA)过滤，收集滤出液。750μl Eppendorf管中的氰铁酸盐试剂(0.4g/l K₃Fe(CN)₆,20g/lNa₂CO₃)中加入每一份滤液各100μl并在85℃培养15分钟。待样品冷却后，测量420nm处吸收值的下降。使用一系列葡萄糖稀释液作为标准。底物和酶的空白作为对照。样品均以双份测定。1齿斑葡聚糖酶单位(MU)定义为pH5.5和40℃下从齿斑葡聚糖中每分钟产生1微摩尔还原糖(以葡萄糖当量计)的酶的量。

重组齿斑葡聚糖酶在用水洗的过程中被洗脱。合并滤液，用0.7μm膜过滤(Whatman,Fairfield,NJ)，用装备有截留分子量为10KDa膜的Microsep^TM微浓缩仪浓缩，进一步用装备有YM10膜的Amicon滤器(Amicon,Beverly,MA)浓缩到25ml。纯化结果得到129倍纯化且产率约为20％(表1)。齿斑葡聚糖上不完全的吸附以及洗脱步骤中齿斑葡聚糖酶的部分漏失可能是相对较低的产率的原因。通过SDS-PAGE评价齿斑葡聚糖酶的纯度大于95％，等电聚焦(IEF)测得分子量约为90KDa，等电点(pI)约为pH3(理论值pI=3.95)。N-端氨基酸序列确认为Ser-Thr-Ser-Asp-Arg-(SEQ ID No:1)。

表1：重组产紫青霉齿斑葡聚糖酶的纯化

样品	体积(ml)	A280 A260	活性(MU/ml)	总活性(MU)	产率(％)
						培养液	780	19.8 27.3	2.2	1716	100
纯化后	25	0.90 0.65	12.8	320	19

在不同温度下用上述步骤培养检定混合物(50mM pH5.5的乙酸钠缓冲液或50mM pH7.0的磷酸钠缓冲液)获得温度曲线。悬浮齿斑葡聚糖于50mM不同pH的(pH3-3.5的甘氨酸-HCl,pH4-5.5的乙酸钠和pH6-7.5的磷酸钠)缓冲液中获得pH曲线。

纯化的重组产紫青霉齿斑葡聚糖酶的pH和温度曲线如图6和图7所示。该酶在pH3.5到5的范围有相当宽的最适pH值，pH7时最适温度为40-45℃,pH5.5时最适温度为50-55℃。

在0.1M pH7磷酸钠缓冲液含有0.2％齿斑葡聚糖的悬浮液中4℃搅拌状况下培育不同浓度的纯化的重组产紫青霉齿斑葡聚糖酶1小时获得结合等温线。样品15,000xg离心10分钟，上清液中剩余酶的量由荧光光谱法测量，测量使用Perkin Elmer LS50荧光分光光度计，280nm激发，345nm发射。用纯化的齿斑葡聚糖酶构建荧光标准曲线。

观察到的纯化的重组产紫青霉齿斑葡聚糖酶结合到齿斑葡聚糖的结合等温线可以用简单的用于固体表面吸附的Langmur模型来拟合。产紫青霉齿斑葡聚糖酶显示相似的强齿斑葡聚糖亲和力，沉降常数(K_d)约为0.111±0.016μM，最大结合容量(A_max)为0.244±0.012μmol酶/克齿斑葡聚糖。

用MicroCal MC-2仪按制造商指示完成纯化的重组产紫青霉齿斑葡聚糖酶的差示扫描量热分析。扫描从5℃到95℃以每小时90C的恒定扫描速率完成。观察到产紫青霉齿斑葡聚糖酶的中点变性温度在pH7时约为46℃。

         生物材料的保藏

下列菌株按照布达佩斯条约已在农业研究机构保藏中心(NRRL)(1815 University Street,Peoria,Illinois，美国)保藏。

菌株                保藏号           保藏日期E.col:INVα1F(pZL-Pp6A) NRRL B-21518    1996.1.18.

本菌株以确保在此申请未决期间能为由专利和商标委员会(Comissioner of Patents and Trademarks)按照37 C.F.R.1.14和35U.S.C.122决定的公众所能获得的条件被保藏。保藏物基本上为每个保藏菌株的纯培养物。保藏物可按同等主题的相应申请或其分案所递交的国家的专利法要求为公众所获得。然而，应当知晓保藏物的可得性并不等于授权实施本发明，从而减损由政府法令授予的专利权。

本发明在此公开的具体的实施方案并不限制此处叙述和要求的本发明的范围，因为这些实施方案只用于阐明本发明的不同方面。任何等同的实施方案均认为落在本发明的范围内。事实上，按前述描述对除去此处展示和描述以外的本发明的不同的修饰对本领域技术人员而言是显而易见的。这样的修饰也认为落入附加的权利要求的范围内。

此处引用不同的参考文献均以全文公开内容作为参考。

序列表(1)一般信息

(ⅰ)申请人：

(A)姓名：Novo Nordisk Biotech,Inc.

(B)街道：1445 Drew Avenue

(C)城市：Davis，加利福尼亚

(D)国家：美国

(E)邮政编码：95616-4880

(F)电话：(916)757-8100

(G)传真：(916)758-0317

(ⅰ)申请人：

(A)姓名：Novo Nordisk A/S

(B)街道：Novo Alle

(C)城市：Bagsvard

(D)国家：丹麦

(E)邮政编码：DK-2880

(F)电话：+45 4444 8888

(G)传真：+45 4449 3256

(ⅱ)发明题目：产紫青霉齿斑葡聚糖酶

(ⅲ)序列数目：7

(ⅵ)通讯地址：

(A)地址：Novo Nordisk of North America,Inc.

(B)街道：405 Lexington Avenue,64th层

(C)城市：纽约

(D)州：纽约

(E)国家：美国

(F)邮政编码：10174-6401

(ⅴ)计算机可读形式：

(A)介质类型：软盘

(B)计算机：IBM PC兼容机

(C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS

(D)软件：Patent IN Release#1.0，版本#1.30(ⅵ)当前申请数据：

(A)申请号：待分配

(B)申请日期：待分配

(C)分类号：(ⅷ)律师/代理人信息：

(A)姓名：Lambiris,Elias J.

(B)登记号：33,728

(C)参考/卷号：4593.200-WO

(ⅸ)电讯信息

(A)电话：212-867-0123

(B)传真：212-878-9655(2)SEQ ID No:1信息

(ⅰ)序列特征：

(A)长度：22氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：肽

(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID No:1：Ser Thr Ser Asp Arg Leu Val Phe Ala His Phe Met Val Gly Ile Val1               5                   10                  15Ser Asp Arg Thr Ser Ala

        20(2)SEQ ID No:2信息

(ⅰ)序列特征：

    (A)长度：2523碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)

(ⅸ)特征：

    (A)名称/关键词：CDS

    (B)位置：联合(41..1666,230..760,842..1069,1128..1586,1665..2210)

(ⅹⅰ)特征：

    (A)名称／关键词：信号肽

    (B)位置：41..130

(ⅸ)特征：

    (A)名称/关键词：成熟多肽

    (B)位置：联合(131..166,230..760,842..1069,1128..1586,1665..2210)

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID No:2：AATTGTGCCC TAAACCTCCT CCTGGAGGAA CACACTCAAG ATG AAA GTC TCC AGT        55

                                        Met Lys Val Ser Ser

                                        -30GCC TTC GCG GCG ACG CTG TCC GCA ATT ATA GCT GCG TGC TCA GCT CTT       103Ala Phe Ala Ala Thr Leu Ser Ala Ile Ile Ala Ala Cys Ser Ala Leu-25                 -20                 -15                 -10CCT TCT GAC TCA ATG GTT TCG AGG CGA AGC ACA TCG GAC CGT CTC GTG       151Pro Ser Asp Ser Met Val Ser Arg Arg Ser Thr Ser Asp Arg Leu Val

             -5                   1               5TTC GCG CAT TTC ATG GTAAACATCC ATCTCGAATA TGAGGCACAT AGTCAGTGAC       206Phe Ala His Phe Met

     10GATAGATTGG CTGACTTCAT CAG GTT GGT ATC GTC AGT GAC CGG ACC AGT         256

                      Val Gly Ile Val Ser Asp Arg Thr Ser

                               15                  20GCT AGC GAT TAT GAC GCC GAC ATG CAG GGT GCT AAA GCT TAT GGA ATT       304Ala Ser Asp Tyr Asp Ala Asp Met Gln Gly Ala Lys Ala Tyr Gly Ile

         25                  30                  35GAC GCC TTT GCA TTG AAT ATC GGT ACC GAT ACC TTC AGC GAC CAG CAA       352Asp Ala Phe Ala Leu Asn Ile Gly Thr Asp Thr Phe Ser Asp Gln Gln

     40                  45                  50CTG GGG TAT GCC TAC GAG TCT GCG GCA AAC AAT GAC ATG AAA GTG TTC       400Leu Gly Tyr Ala Tyr Glu Ser Ala Ala Asn Asn Asp Met Lys Val Phe

 55                  60                  65ATT TCA TTC GAT TTC AAC TGG TGG TCC ACC AGC CAG GCC ACC GAA ATT       448Ile Ser Phe Asp Phe Asn Trp Trp Ser Thr Ser Gln Ala Thr Glu Ile70                  75                  80                  85GGC CAA AAG ATT GCC CAG TAC GGT AGC CrA CCA GGC CAG CTC ATG TAT       496Gly Gln Lys Ile Ala Gln Tyr Gly Ser Leu Pro G1y Gln Leu Met Tyr

             90                  95                 100GAT GAC AAG ATT TTC GTC TCG TCG TTT GCT GGC GAC GGT GTA GAC GTG       544Asp Asp Lys Ile Phe Val Ser Ser Phe Ala Gly Asp Gly Val Asp Val

        105                 110                 115GCA GCA TTG AAG TCA GCT GCT GGC GGC AAT GTG TTC TTC GCT CCA AAC       592Ala Ala Leu Lys Ser Ala Ala Gly Gly Asn Val Phe Phe Ala Pro Asn

    120                 125                 130TTC CAT CCA TCG TAT GGT ACA GAC CTG TCG GAT GTC GAT GGT CTT CTC       640Phe His Pro Ser Tyr Gly Thr Asp Leu Ser Asp Val Asp Gly Leu Leu

135                 140                 145AAC TGG ATG GGC TGG CCT AGC AAT GGT AAT AAC AAG GCT CCA ACT GCC       688Asn Trp Met Gly Trp Pro Ser Asn Gly Asn Asn Lys Ala Pro Thr Ala150                 155                 160                 165GGT GCC AAC GTT ACC GTT GAG GAA GGG GAC GAG GAA TAT ATA ACT GCT       736Gly Ala Asn Val Thr Val Glu Glu Gly Asp Glu Glu Tyr Ile Thr Ala

            170                 175                 180TTG GAT GGC AAG CCC TAC ATT GCT GTCAGTCGCC TAACCCTACC TCCTAGCCTT      790Leu Asp Gly Lys Pro Tyr Ile Ala

        185GGAGCAAAAC GATTCAGTTT GGCTGACCTT TTCTTTTTTC TTCTTCACTA G CCG GCC      847

                                                    Pro Ala

                                                    190TCA CCA TGG TTC TCT ACG CAT TTT GGG CCA GAG GTG ACA TAC AGC AAG       895Ser Pro Trp Phe Ser Thr His Phe Gly Pro Glu Val Thr Tyr Ser Lys

        195                 200                 205AAC TCG GTT TTC CCA TCT GAT TTG CTT TTC TAC CAG CGT TGG AAT GAT       943Asn Trp Val Phe Pro Ser Asp Leu Leu Phe Tyr Gln Arg Trp Asn Asp

    210                 215                 220CTA TTG AAT TTG GGC CCT CAA TTC ATT GAA GTG GTC ACC TGG AAT GAC       991Leu Leu Asn Leu Gly Pro Gln Phe Ile Glu Val Val Thr Trp Ash Asp

225                 230                 235TAT GGT GAA TCG CAA TAT GTC GGA CCT CTG AAC TCT CCT CAT ACA GAC      1039Tyr Gly Glu Ser Gln Tyr Val Gly Pro Leu Asn Ser Pro His Thr Asp240                 245                 250                 255GAT GGC TCC TCT CGA TGG GCG AAT GAC ATG GTAAGCCATC TTGTGTAGGT        1089Asp Gly Ser Ser Arg Trp Ala Asn Asp Met

            260                 265ATCGGTGTTT TGTTTCTATG CTAACATCAA GAAACTAG CCT CAC GAT GGC TGG        1142

                                      Pro His Asp Gly Trp

                                                      270CTG GAT CTG GCA AAG CCC TAC ATC GCG GCA TTC CAC GAC GGG GCC ACT      1190Leu Asp Leu Ala Lys Pro Tyr Ile Ala Ala Phe His Asp Gly Ala Thr

            275                 280                 285TCG CTA TCA TCA TCC TAC ATC ACC GAA GAC CAG CTC ATC TAC TGG TAT      1238Ser Leu Ser Ser Ser Tyr Ile Thr Glu Asp Gln Leu Ile Tyr Trp Tyr

        290                 295                 300CGG CCT CAA CCA CGA CTC ATG GAC TGC GAC GCA ACT GAT ACC TGC ATG      1286Arg Pro Gln Pro Arg Leu Met Asp Cys Asp Ala Thr Asp Thr Cys Met

    305                 310                 315GTT GCT GCC AAC AAT GAC ACG GGC AAC TAT TTC GAG GGC AGA CCC AAT      1334Val Ala Ala Asn Asn Asp Thr Gly Asn Tyr Phe Glu Gly Arg Pro Asn

320                 325                 330GGG TGG GAA AGC ATG GAG GAC GCT GTC TTC GTG GTT GCT TTG CTC CAG      1382Gly Trp Glu Ser Met Glu Asp Ala Val Phe Val Val Ala Leu Leu Gln335                 340                 345                 350TCT GCT GGA ACG GTT CAG GTC ACT TCA GGC CCT AAT ACC GAG ACA TTT      1430Ser Ala Gly Thr Val Gln Val Thr Ser Gly Pro Asn Thr Glu Thr Phe

            355                 360                 365GAT GCT CCT GCT GGT GCA AGC GCC TTC CAG GTT CCC ATG GGC TTC GGC      1478Asp Ala Pro Ala Gly Ala Ser Ala Phe Gln Val Pro Met Gly Phe Gly

        370                 375                 380CCC CAG AGC TTC TCC CTG TCG CGG GAT GGC GAG ACA GTA TTG TCT GGA      1526Pro Gln Ser Phe Ser Leu Ser Arg Asp Gly Glu Thr Val Leu Ser Gly

    385                 390                 395ACA AGC TTG AAG GAT ATC ATT GAT GGA TGC TTG TGC GGA ATC TAC AAC      1574Thr Ser Leu Lys Asp Ile Ile Asp Gly Cys Leu Cys Gly Ile Tyr Asn

400                 405                 410TTC AAC GCC TAT GTAAGAACTG CCGTGTCTTT TGTATATCTG AATATGTTTC          1626Phe Asn Ala Tyr415CAAGGTTATT GACATGGGAA AAAAAAAAAA AAATTCAG GTG GGC TCT CTG CCA        1679

                                      Val Gly Ser Leu Pro

                                          420GCA ACT TTC TCC GAT CCA CTC GAG CCA CCT TCT CTC AAC GCC TTC AGC      1727Ala Thr Phe Ser Asp Pro Leu Glu Pro Pro Ser Leu Asn Ala Phe Ser

425                 430                 435GAA GGC TTG AAG GTT TCG ACA TGC AGC GCG ACA CCA TCT TTG GGA TTG      1775Glu Gly Leu Lys Val Ser Thr Cys Ser Ala Thr Pro Ser Leu Gly Leu440                 445                 450                 455ACA TCG ACC ACT CCA CCA GAG ACC ATT CCT ACA GGC ACG ATT ACT CCA      1823Thr Ser Thr Thr Pro Pro Glu Thr Ile Pro Thr Gly Thr Ile Thr Pro

            460                 465                 470GGA TCA GCT ATT ACA GGT GCT GCA ACA ACT ACC TCT ACC ATC TCG ACC      1871Gly Ser Ala Ile Thr Gly Ala Ala Thr Thr Thr Ser Thr Ile Ser Thr

        475                 480                 485ACC TCC ACG ATT TCC ACG ACC TCA ACT TTT ATC TCA ACT ACC ACC ACC      1919Thr Ser Thr Ile Ser Thr Thr Ser Thr Phe Ile Ser Thr Thr Thr Thr

    490                 495                 500ACC ACG TCC AGT GCT GCT ACC TCC ACC ACC ACC GGA ACT TGC ATC GCC      1967Thr Thr Ser Ser Ala Ala Thr Ser Thr Thr Thr Gly Thr Cys Ile Ala

505                 510                 515GGC ACT GGC CCT GAC AAC TAT TCT GGC CTG TGT TCC TTC TGC TGT AAC      2015Gly Thr Gly Pro Asp Asn Tyr Ser Gly Leu Cys Ser Phe Cys Cys Asn520                 525                 530                 535TAC GGC TAC TGT CCG GGC TCC GAT GGT TCG GCC GGC CCG TGT ACA TGC      2063Tyr Gly Tyr Cys Pro Gly Ser Asp Gly Ser Ala Gly Pro Cys Thr Cys

            540                 545                 550ACG GCC TAT GGA GAT CCA GTT CCT ACG CCT CCA GTA ACA GGA ACA GTT      2111Thr Ala Tyr Gly Asp Pro Val Pro Thr Pro Pro Val Thr Gly Thr Val

        555                 560                 565GGC GTT CCG CTT GAT GGC GAG GGT GAC AGT TAC TTG GGT CTG TGT AGT      2159Gly Val Pro Leu Asp Gly Glu Gly Asp Ser Tyr Leu Gly Leu Cys Ser

    570                 575                 580TTT GCC TGC AAC CAC GGC TAT TGC CCG TCT ACT GCT TGT CAA GTA GAG      2207Phe Ala Cys Asn His Gly Tyr Cys Pro Ser Thr Ala Cys Gln Val Glu

585                 590                 595AGC TGAGAGGTGC CACTATCTAG GTAATACCAT GTTAAAGTAA TACCTAGGTA           2260Ser600CTCTGTGTCT AGCTTGAGAG ATGGCAGGGT ATCTAGTTCT ATCTTAAATA TAAGATTTCT    2320CCAACTTACA TGATTTTGAT GCACATGGAT AGGTAGACCT GGACAGTGAA GGGCAATACT    2380TAAATAATGC AAACAGACAC TGGATCTATA TCGTTCAACT CAGTTGGCCA AAGACTAGTC    2440GTGAAAAAAA CACCCTTTCG AACAAAAACC TTCTTCGCTG CATCAACGCA GTCCAAAATA    2500AGTCCAATCC CCTCCACCAT GAA                                            2523(2)SEQ ID No:3信息

(ⅰ)序列特征：

    (A)长度：630氨基酸

    (B)类型：氨基酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：蛋白质

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID No:3Met Lys Val Ser Ser Ala Phe Ala Ala Thr Leu Ser Ala Ile Ile Ala-30                 -25                 -20                 -15Ala Cys Ser Ala Leu Pro Ser Asp Ser Met Val Ser Arg Arg Ser Thr

            -10                  -5                   1Ser Asp Arg Leu Val Phe Ala His Phe Met Val Gly Ile Val Ser Asp

      5                  10                  15Arg Thr Ser Ala Ser Asp Tyr Asp Ala Asp Met Gln Gly Ala Lys Ala

 20                  25                  30Tyr Gly Ile Asp Ala Phe Ala Leu Asn Ile Gly Thr Asp Thr Phe Ser35                  40                  45                  50Asp Gln Gln Leu Gly Tyr Ala Tyr Glu Ser Ala Ala Asn Asn Asp Met

             55                  60                  65Lys Val Phe Ile Ser Phe Asp Phe Asn Trp Trp Ser Thr Ser Gln Ala

         70                  75                  80Thr Glu Ile Gly Gln Lys Ile Ala Gln Tyr Gly Ser Leu Pro Gly Gln

     85                  90                  95Leu Met Tyr Asp Asp Lys Ile Phe Val Ser Ser Phe Ala Gly Asp Gly

100                 105                 110Val Asp Val Ala Ala Leu Lys Ser Ala Ala Gly Gly Asn Val Phe Phe115                 120                 125                 130Ala Pro Asn Phe His Pro Ser Tyr Gly Thr Asp Leu Ser Asp Val Asp

            135                 140                 145Gly Leu Leu Asn Trp Met Gly Trp Pro Ser Asn Gly Asn Asn Lys Ala

        150                 155                 160Pro Thr Ala Gly Ala Asn Val Thr Val Glu Glu Gly Asp Glu Glu Tyr

    165                 170                 175Ile Thr Ala Leu Asp Gly Lys Pro Tyr Ile Ala Pro Ala Ser Pro Trp

180                 185                 190Phe Ser Thr His Phe Gly Pro Glu Val Thr Tyr Ser Lys Asn Trp Val195                 200                 205                 210Phe Pro Ser Asp Leu Leu Phe Tyr Gln Arg Trp Asn Asp Leu Leu Asn

            215                 220                 225Leu Gly Pro Gln Phe Ile Glu Val Val Thr Trp Asn Asp Tyr Gly Glu

        230                 235                 240Ser Gln Tyr Val Gly Pro Leu Asn Ser Pro His Thr Asp Asp Gly Ser

    245                 250                 255Set Arg Trp Ala Asn Asp Met Pro His Asp Gly Trp Leu Asp Leu Ala

260                 265                 270Lys Pro Tyr Ile Ala Ala Phe His Asp Gly Ala Thr Ser Leu Ser Ser275                 280                 285                 290Ser Tyr Ile Thr Glu Asp Gln Leu Ile Tyr Trp Tyr Arg Pro Gln Pro

            295                 300                 305Arg Leu Met Asp Cys Asp Ala Thr Asp Thr Cys Met Val Ala Ala Asn

        310                 315                 320Asn Asp Thr Gly Asn Tyr Phe Glu Gly Arg Pro Asn Gly Trp Glu Ser

    325                 330                 335Met Glu Asp Ala Val Phe Val Val Ala Leu Leu Gln Ser Ala Gly Thr

340                 345                 350Val Gln Val Thr Ser Gly Pro Asn Thr Glu Thr Phe Asp Ala Pro Ala355                 360                 365                 370Gly Ala Ser Ala Phe Gln Val Pro Met Gly Phe Gly Pro Gln Ser Phe

            375                 380                 385Ser Leu Ser Arg Asp Gly Glu Thr Val Leu Ser Gly Thr Ser Leu Lys

        390                 395                 400Asp Ile Ile Asp Gly Cys Leu Cys Gly Ile Tyr Asn Phe Asn Ala Tyr

    405                 410                 415Val Gly Set Leu Pro Ala Thr Phe Ser Asp Pro Leu Glu Pro Pro Ser

420                 425                 430Leu Asn Ala Phe Ser Glu Gly Leu Lys Val Ser Thr Cys Ser Ala Thr435                 440                 445                 450Pro Ser Leu Gly Leu Thr Ser Thr Thr Pro Pro Glu Thr Ile Pro Thr

            455                 460                 465Gly Thr Ile Thr Pro Gly Ser Ala Ile Thr Gly Ala Ala Thr Thr Thr

        470                 475                 480Ser Thr Ile Ser Thr Thr Ser Thr Ile Ser Thr Thr Ser Thr Phe Ile

    485                 490                 495Ser Thr Thr Thr Thr Thr Thr Ser Ser Ala Ala Thr Ser Thr Thr Thr

500                 505                 510Gly Thr Cys Ile Ala Gly Thr Gly Pro Asp Asn Tyr Ser Gly Leu Cys515                 520                 525                 530Ser Phe Cys Cys Asn Tyr Gly Tyr Cys Pro Gly Ser Asp Gly Ser Ala

            535                 540                 545Gly Pro Cys Thr Cys Thr Ala Tyr Gly Asp Pro Val Pro Thr Pro Pro

        550                 555                 560Val Thr Gly Thr Val Gly Val Pro Leu Asp Gly Glu Gly Asp Ser Tyr

    565                 570                 575Leu Gly Leu Cys Ser Phe Ala Cys Asn His Gly Tyr Cys Pro Ser Thr

580                 585                 590Ala Cys Gln Val Glu Ser595                 600(2)SEQ ID No:4信息(ⅰ)序列特征：

(A)长度：16个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性(ⅱ)分子类型：肽(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID No:4Ser Ser Ala Asp Arg Leu Val Phe Cys His Phe Met Ile Gly Ile Val1               5                   10                  15(2)SEQ ID No:5信息

(ⅰ)序列特征：

    (A)长度：635个氨基酸

    (B)类型：氨基酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：蛋白质

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID No:5Met Leu Gly Val Phe Arg Arg Leu Arg Leu Gly Ala Leu Ala Ala Ala1               5                   10                  15Ala Leu Ser Ser Leu Gly Ser Ala Ala Pro Ala Asn Val Ala Ile Arg

        20                  25                  30Ser Leu Glu Glu Arg Ala Ser Sar Ala Asp Arg Leu Val Phe Cys His

    35                  40                  45Phe Met Ile Gly Ile Val Gly Asp Arg Gly Ser Ser Ala Asp Tyr Asp

50                  55                  60Asp Asp Met Gln Arg Ala Lys Ala Ala Gly Ile Asp Ala Phe Ala Leu65                  70                  75                  80Asn Ile Gly Val Asp Gly Tyr Thr Asp Gln Gln Leu Gly Tyr Ala Tyr

            85                  90                  95Asp Ser Ala Asp Arg Asn Gly Met Lys Val Phe Ile Ser Phe Asp Phe

        100                 105                 110Asn Trp Trp Ser Pro Gly Asn Ala Val Gly Val Gly Gln Lys Ile Ala

    115                 120                 125Gln Tyr Ala Asn Arg Pro Ala Gln Leu Tyr Val Asp Asn Arg Pro Phe

130                 135                 140Ala Ser Ser Phe Ala Gly Asp Gly Leu Asp Val Asn Ala Leu Arg Ser145                 150                 155                 160Ala Ala Gly Ser Asn Val Tyr Phe Val Pro Asn Phe His Pro Gly Gln

            165                 170                 175Ser Ser Pro Ser Asn Ile Asp Gly Ala Leu Asn Trp Met Ala Trp Asp

        180                 185                 190Asn Asp Gly Asn Asn Lys Ala Pro Lys Pro Gly Gln Thr Val Thr Val

    195                 200                 205Ala Asp Gly Asp Asn Ala Tyr Lys Asn Trp Leu Gly Gly Lys Pro Tyr

210                 215                 220Leu Ala Pro Val Ser Pro Trp Phe Phe Thr His Phe Gly Pro Glu Val225                 230                 235                 240Sar Tyr Ser Lys Asn Trp Val Phe Pro Gly Gly Pro Leu Ile Tyr Asn

            245                 250                 255Arg Trp Gln Gln Val Leu Gln Gln Gly Phe Pro Met Val Glu Ile Val

        260                 265                 270Thr Trp Asn Asp Tyr Gly Glu Ser His Tyr Val Gly Pro Leu Lys Ser

    275                 280                 285Leu His Phe Asp Asp Gly Asn Ser Lys Trp Val Asn Asp Met Pro His

290                 295                 300Asp Gly Phe Leu Asp Leu Ser Lys Pro Phe Ile Ala Ala Tyr Lys Asn305                 310                 315                 320Arg Asp Thr Asp Ile Ser Lys Tyr Val Gln Asn Glu Gln Leu Val Tyr

            325                 330                 335Trp Tyr Arg Arg Asn Leu Lys Ala Leu Asp Cys Asp Ala Thr Asp Thr

        340                 345                 350Thr Ser Asn Arg Pro Ala Asn Asn Gly Ser Gly Asn Tyr Phe Glu Gly

    355                 360                 365Arg Pro Asp Gly Trp Gln Thr Met Asp Asp Ala Val Tyr Val Ala Ala

370                 375                 380Leu Lau Lys Thr Ala Gly Ser Val Thr Ile Thr Ser Gly Gly Thr Thr385                 390                 395                 400Gln Thr Phe Gln Ala Asn Ala Gly Ala Asn Leu Phe Gln Ile Pro Ala

            405                 410                 415Ser Ile Gly Gln Gln Lys Phe Ala Leu Thr Arg Asn Gly Gln Thr Ile

        420                 425                 430Phe Ser Gly Thr Ser Leu Met Asp Ile Thr Asn Val Cys Ser Cys Gly

    435                 440                 445Ile Tyr Asn Phe Asn Pro Tyr Val Gly Thr Ile Pro Ala Gly Phe Asp

450                 455                 460Asp Pro Leu Gln Ala Asp Gly Leu Phe Ser Leu Thr Ile Gly Leu His465                 470                 475                 480Val Thr Thr Cys Gln Ala Lys Pro Ser Leu Gly Thr Asn Pro Pro Val

            485                 490                 495Thr Ser Gly Pro Val Ser Ser Leu Pro Ala Ser Ser Thr Thr Arg Ala

        500                 505                 510Ser Ser Pro Pro pro Val Ser Ser Thr Arg Val Ser Ser Pro Pro Val

    515                 520                 525Ser Ser Pro Pro Val Ser Arg Thr Ser Ser Pro Pro Pro Pro Pro Ala

530                 535                 540Ser Ser Thr Pro Pro Ser Gly Gln Val Cys Val Ala Gly Thr Val Ala545                 550                 555                 560Asp Gly Glu Ser Gly Asn Tyr Ile Gly Leu Cys Gln Phe Ser Cys Asn

            565                 570                 575Tyr Gly Tyr Cys Pro Pro Gly Pro Cys Lys Cys Thr Ala Phe Gly Ala

        580                 585                 590Pro Ile Ser Pro Pro Ala Ser Asn Gly Arg Asn Gly Cys Pro Leu Pro

    595                 600                 605Gly Glu Gly Asp Gly Tyr Leu Gly Leu Cys Ser Phe Ser Cys Asn His

610                 615                 620Asn Tyr Cys Pro Pro Thr Ala Cys Gln Tyr Cys625                 630                 635(2)SEQ ID No:6信息

(ⅰ)序列特征：

    (A)长度：32碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：cDNA

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID No:6

CCCATTTAAA TATGAAAGTC TCCAGTGCCT TC(2)SEQ ID No:7

(ⅰ)序列特征：

    (A)长度：32碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性(ⅱ)分子类型：cDNA(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID No:7CCCTTAATTA ATTAGCTCTC TACTTGACAA GC

Claims (40)

1．分离的有齿斑葡聚糖酶活性的多肽，其选自下组中：

(a)带有SEQ ID No:3列出的氨基酸序列的多肽；

(b)由能在高度严格的条件下与(ⅰ)SEQ ID No:2列出的核酸序列或(ⅱ)其互补链杂交的核酸序列编码的多肽；

(c)与SEQ ID No:3列出的氨基酸序列至少有60％同源性的氨基酸序列的多肽；

(d)(a)、(b)或(c)的等位形式；和

(e)(a)、(b)、(c)或(d)的片段。

2．权利要求1的多肽，其含有与SEQ ID No:3列出的氨基酸序列或其片段至少有60％的同源性的氨基酸序列。

3．权利要求2的多肽，其含有与SEQ ID No:3列出的氨基酸序列或其片段至少有70％同源性的氨基酸序列。

4．权利要求3的多肽，其含有与SEQ ID No:3列出的氨基酸序列或其片段至少有80％同源性的氨基酸序列。

5．权利要求4的多肽，其含有与SEQ ID No:3列出的氨基酸序列或其片段至少有90％同源性的氨基酸序列。

6．权利要求5的多肽，其含有与SEQ ID No:3列出的氨基酸或其片段至少有95％同源性的氨基酸序列。

7．权利要求6的多肽，其含有由SEQ ID No:3列出的氨基酸序列或其片段。

8．权利要求7的多肽，其含有由SEQ ID No:3列出的氨基酸序列。

9．权利要求7的多肽，其含有SEQ ID No:3中31-630残基的氨基酸序列。

10．权利要求2的多肽，其获自青霉属或其同义属或有性型的菌株。

11．权利要求1的多肽，其是由在高度严格条件下能与(ⅰ)由SEQ IDNo:2列出的核酸序列或(ⅱ)其互补链杂交的核酸序列或其片段所编码的。

12．权利要求11的多肽，其是由在高度严格条件下能与(ⅰ)由SEQ IDNo:2列出的核酸序列或(ⅱ)其互补链杂交的核酸序列编码的。

13．权利要求10的多肽，其获自青霉属或其同义属或有性型的菌株。

14．权利要求13的多肽，其获自产紫青霉或其同义种或有性型的菌株。

15．权利要求1的多肽，其是由在大肠杆菌NRRL B-21518中所含的质粒pZL-Pp6A中含有的核酸序列编码的。

16．一种分离的核酸序列，其含有编码权利要求1的多肽的核酸序列。

17．按照权利要求16的核酸序列，其中的核酸序列编码一个获自青霉属菌株的多肽。

18．按照权利要求17的核酸序列，其中的核酸序列编码一个获自产紫青霉或其同义种或有性型的多肽。

19．按照权利要求18的核酸序列，其中的核酸序列编码一个获自产紫青霉CBS 238.95或突变菌株的多肽。

20．按照权利要求16的核酸序列，其编码一个含有与SEQ ID No:3列出的氨基酸序列至少有60％同源性的氨基酸序列的多肽。

21．按照权利要求16的核酸序列，其在高度严格的条件下能与(a)SEQ ID No:2列出的核酸序列或(b)其互补链或一个等位形式或是一个片段杂交。

22．按照权利要求16的核酸序列，其中的核酸序列包含在大肠杆菌NRRL B-21518中所含的质粒pZL-Pp6A中。

23．按照权利要求16的核酸序列，其中的核酸序列由SEQ ID No:2列出。

24．一种核酸结构，其包含权利要求16的核酸序列，后者可操纵地连接到一个或多个在合适的表达宿主中能指导多肽表达的控制序列上。

25．一种重组表达载体，其含有权利要求24的核酸结构、启动子和转录及翻译终止信号。

26．按照权利要求25的载体，其进一步包含一个选择性标记。

27．一种含有权利要求24的核酸结构的重组宿主细胞。

28．按照权利要求27的细胞，其中的宿主细胞是细菌或真菌细胞。

29．按照权利要求28的细胞，其中细菌细胞是芽孢杆菌、假单孢菌或链霉菌细胞。

30．按照权利要求28的细胞，其中真菌细胞是丝状真菌或酵母细胞。

31．按照权利要求30的细胞，其中丝状真菌细胞是Acremonium，曲霉属，镰孢霉属，腐质霉属，毛霉属，毁丝霉属，脉孢霉属，青霉属，梭孢壳属，Tolypocladium或木霉属的细胞。

32．按照权利要求30的细胞，其中酵母细胞是假丝酵母属，克鲁维酵母属，毕赤酵母属，酵母属，裂殖酵母属或Yarrowia的细胞。

33．生产权利要求1的多肽的方法，包括(a)培养青霉属菌株以生产含有该多肽的上清；和(b)回收该多肽。

34．生产权利要求1的多肽的方法，包括(a)在诱导该多肽表达的条件下培养含有核酸结构的宿主细胞，该核酸结构含有编码该多肽的核酸序列；和(b)回收该多肽。

35．一种口腔组合物，其含有(a)权利要求1的多肽和(b)口腔可接受的载体。

36．一种降解齿斑葡聚糖的方法，包括对齿斑葡聚糖应用权利要求1的多肽。

37．按照权利要求36的方法，其中齿斑葡聚糖由口腔中的变异链球菌产生。

38．一种杂合多肽，其含有包括在SEQ ID No:3列出的氨基酸序列中的催化区域。

39．一种杂合多肽，其含有包括在SEQ ID No:3列出的氨基酸序列中的接头。

40．一种杂合多肽，其含有包括在SEQ ID No:3中列出的氨基酸序列中的齿斑葡聚糖结合区域。

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