CN1283082A - 糖氧化酶及其在焙烤中的用途 - Google Patents

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Abstract

通过加入糖氧化酶可以改善面团或面包的性能,其中比起相应的单糖而言所述糖氧化酶可以更加有效地氧化寡糖的还原端,例如优先于葡萄糖而氧化麦芽糖糊精或纤维糊精。从Microdochium的菌株、特别是从M.nivale中可以得到一种具有比氧化葡萄糖更有效地氧化麦芽糖糊精和纤维糊精能力的新的糖氧化酶。这种新的糖氧化酶的氨基酸序列与已知的氨基酸序列之间具有非常低的同源性(<20%的同一性)。

Description

糖氧化酶及其在焙烤中的用途
发明背景
本发明涉及糖氧化酶在焙烤中的用途并且涉及一种新的糖氧化酶。相关现有技术的描述
在制作面包的过程中，已知向面包面团中加入改善面包的和/或改善面团的添加剂，其中所述添加剂的作用特别导致面包的结构、体积、风味和新鲜度的改善以及面团机械加工性能和稳定性的改善。
用于强化谷蛋白和改善面团流变学和加工性能的面团“调节剂”在工业中是众所周知的并且已被长期使用。如碘酸盐、过氧化物、抗坏血酸、溴酸钾和偶氮二酰胺这样的非特异性氧化剂具有谷蛋白强化作用。已经有人提出这些调节剂诱导了强化谷蛋白并从而强化面团的蛋白质之间键的形成。
同样已知使用葡萄糖氧化酶来强化谷蛋白并改善面团的流变学和加工性能。因此，US 2，783，150公开了葡萄糖氧化酶在面粉中的用途，以改善面团的强度以及焙烤的面包的结构和外观。EP 321 811和EP 338 452公开了与其它酶(硫氢基氧化酶、半纤维素酶、纤维素酶)结合的葡萄糖氧化酶在焙烤中的用途。但是，由于在制备焙烤制品中所用的谷物面粉中通常葡萄糖的含量低，因此葡萄糖氧化酶作为面团和/或面包改善添加剂的效力是有限的。
因此，已经对鉴定出作用于除葡萄糖以外的底物的氧化还原酶产生了兴趣。WO96/39851公开了己糖氧化酶的用途，该氧化酶能够将D-葡萄糖以及包括麦芽糖、乳糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖和纤维二糖在内的几种其它还原糖氧化成其各自的内酯，随后水解成各自的醛糖二糖酸。WO97/22257公开了吡喃糖氧化酶在焙烤中的用途。该酶催化几种单糖在C2位置上的氧化，其间伴随着过氧化氢的释放。尽管呈其吡喃糖形式的葡萄糖倾向于是优选的底物，但是该酶能够氧化其它的底物，例如如木糖这样的呋喃糖。
尽管催化葡萄糖和其它糖直接氧化成相应醛糖酸的酶似乎广泛分布在自然界中，但大多数已知的糖氧化酶对单糖具有特异性。Lin等人(1991，《Biochim.Biophys.Acta》1118：41-47)已经描述了从分离自土壤的Acremonium strictum菌株T1的麦麸培养物中分离和纯化的寡糖氧化酶。该酶具有氧化在还原端上带有葡萄糖残基的寡糖的能力。该酶显示出针对麦芽糖、乳糖、纤维二糖以及由多达7个葡萄糖单位组成的麦芽寡糖的反应性。JP-A5-84074公开了该酶作为分析试剂的用途。
发明概述
本发明人已经发现面团或面包的性能可以通过加入糖氧化酶来加以改善，其中比起相应的单糖而言所述糖氧化酶可以更有效地氧化寡糖的还原端，例如优先于葡萄糖而氧化麦芽糖糊精或纤维糊精。这可以导致面团的坚硬度、粘性、稳定性和强度的改善。针对混合时间、发酵时间和水含量的增加，它也可以增加面团的耐受性。
本发明人还发现了一种具有比氧化葡萄糖更有效地氧化麦芽糖糊精和纤维糊精能力的新的糖氧化酶。这种新的氧化酶可以从Microdochium、特别是从M.nivale中得到。本发明人已经分离并保藏了这样的一个菌株M.nivale CBS 100236。这种新的糖氧化酶的氨基酸序列与已知的氨基酸序列之间具有非常低的同源性(＜20％的同一性)。
因此，本发明提供了一种用于制备面团和/或由面团制得的焙烤制品的方法，该方法包括向所述面团中加入一种糖氧化酶，所述糖氧化酶对作为底物的聚合度为2或者更高的寡糖要比对相应的单糖具有更高的活性。本发明还提供了一种包括所述糖氧化酶的面包改善添加剂。该面包改善添加剂可以包括第二种酶(淀粉酶、纤维素酶、半纤维素酶、脂肪酶或磷脂酶)，并且它可以呈聚结的粉末或颗粒的形式。
本发明进一步提供了一种新的糖氧化酶。这种糖氧化酶可以是由Microdochium nivale CBS100236产生的或具有如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的多肽，或者该酶可以是其类似物。这种糖氧化酶也可以从Microdochium的菌株中衍生而来并且对麦芽四糖具有氧化活性，在底物浓度为0.83mM的情况下该氧化活性至少是对葡萄糖的氧化活性的两倍。
本发明还提供了一种通过培养Microdochium来生产所说的糖氧化酶的方法。本发明进一步提供了一种包括编码本发明糖氧化酶的核酸序列的核酸构建体，以及在本发明糖氧化酶的重组生产中有利地使用的重组表达载体和重组宿主细胞。在另一方面，本发明提供了用于生产本发明糖氧化酶的重组方法，该方法包括在有助于生产所述糖氧化酶的条件下培养宿主细胞以及从细胞和/或培养基中回收所述的糖氧化酶。
附图的简要描述
图1-3分别图解说明了质粒pBANe15、pEJG33和pEJG35。在实施例中描述了细节。
发明详述糖氧化酶在焙烤中的用途
本发明提供了向面团中加入糖氧化酶，该糖氧化酶对作为底物的聚合度为2或者更高的寡糖要比对相应的单糖具有更高的活性。可以以如下所述的面团和/或面包改善添加剂的形式加入所述的糖氧化酶。
该糖氧化酶通常是以这样的数量加入的，即对于在面团和/或焙烤制品的至少一个目标性能方面提供可测量的效果而言，该加入量是有效的。在面团中，通常在面团中以对应于0.01-5％的量、具体地讲以0.1-3％的量包含有面包改善和/或面团改善添加剂。通常以每千克面粉对应着0.01-100毫克酶蛋白的量加入所述的酶，其中优选0.1-25毫克/千克、更优选0.1-10毫克/千克、并且最优选0.5-5毫克/千克。
面团中寡糖的水平可以通过加入淀粉酶来提高，其中该淀粉酶水解淀粉以形成作为主要产物的寡糖，例如嗜热脂肪芽孢杆菌生麦芽糖α-淀粉酶(可以以Novamyl(R)购得)、米曲霉α-淀粉酶(可以以Fungamyl(R)购得)或β-淀粉酶。
寡糖氧化酶的使用可以导致焙烤制品体积的增加和面包屑结构与柔软性的改善，以及面团强度与稳定性的增加和粘性的下降，从而导致机械加工性能的改善。这一作用可能是下面所讨论的谷蛋白强化作用的结果或者是除此以外的结果。当使用劣质面粉时，这种对面团的作用可能特别有利。就将要在工业中加工的面团来说，这种改善的机械加工性能特别重要。
面团的稳定性是焙烤面团的最重要的特性之一，并且对大规模和小规模应用来说都是重要的。稳定的或硬的面团能够更大程度地耐受混合时间、醒发时间以及在面团运输过程中的机械振动，而软的或不太稳定的面团则不太能耐受这些处理。既然具有高的谷蛋白含量和良好的谷蛋白质量的面粉有助于形成硬的面团，含有低的蛋白含量或具有劣质的谷蛋白质量的面粉导致形成软的面团。因此，具有优良的流变学和加工性能的硬面团是由含有坚固的谷蛋白网络的面粉所产生的。
可以将寡糖氧化酶加入到面团物质的任何混合物中或面团中或者加入到面团中所含的任何物质中；即在合适的并且避免所述酶暴露于强烈的化学品或条件之中(在这种情况下，该酶可能会变得失活)的情况下，寡糖氧化酶可以在制备面团的任何步骤中加入或者可以分一步、两步或多个步骤加入。底物的特异性
在底物浓度为10mM或更低的情况下，所述的糖氧化酶优选对聚合度为2-6的寡糖(尤其是麦芽糖、麦芽三糖或麦芽四糖)要比对葡萄糖具有更高的活性。这一比较可以在1mM或者更低的底物浓度下进行，并且对麦芽四糖的活性优选是对葡萄糖的活性的两倍以上。糖氧化酶可能对麦芽糖糊精、纤维糊精或麦芽四糖具有氧化活性，其中在0.83mM的底物浓度下该活性至少是对葡萄糖氧化活性的两倍。
这样的底物浓度代表着根据普通焙烤实践制得的普通面团的浓度。因此，例如在由面团制得的提取物中，发现麦芽糖的浓度为4.1mM，这对应于如Poulsen，C.等人(1996.《谷物化学》75：51-57)所述的在40℃下以1∶10的比例提取1小时所得的41毫摩尔/千克的面团。进一步提到的是如果面粉中存在着足够的内源淀粉分解活性(例如β-淀粉酶)或者正如时常在实践中通常采用的那样，向面团或面粉中加入外源淀粉分解酶的话，那么可提取的麦芽糖的量可能会更高。WO96/39851类似地公开了麦芽糖在面团中是以1.4％(w/w)的水平存在着的。因此，可以利用的底物(例如麦芽糖)的量可能根据面粉的种类和质量、配方、混合和发酵方法以及其它添加剂的存在而有所不同。
在pH6和50mM下，来自M.nivale的优选糖氧化酶具有下列优先顺序(降序)：纤维二糖＞麦芽糖＞葡萄糖＞木糖＞乳糖。在Michaeli-Menten动力学的基础上，针对优选底物的表观Km值为：59mM(纤维二糖)，11mM(麦芽糖)，42mM(葡萄糖)；对葡萄糖和麦芽糖而言，Vmax是相似的。因此，所述氧化酶显示出优先选择麦芽糖而不是葡萄糖，特别是在低的底物浓度下(低于10mM)更是如此。
在底物浓度为0.83mM的情况下，来自M.nivale的优选糖氧化酶能够以比氧化相应的单糖更高的速率来氧化聚合度(DP)为DP2-DP5的寡糖。因此，该酶能够以比水解葡萄糖更高的速率水解麦芽糖糊精和纤维糊精两者，其中单糖的单元分别是通过α-1，4或β-1，4糖苷键连接的。糖氧化酶能够同样好地并且以比水解单糖葡萄糖高出大约10倍的水平来水解所有的具有DP2-DP5的纤维糊精。当以麦芽糖糊精作为底物时，所述糖氧化酶的活性在比起针对单糖高出11/2倍(对麦芽六糖来说)到几乎高出5倍(对麦芽四糖来说)的范围内变化。糖氧化酶的性质
所述的糖氧化酶在pH为5-7的范围内优选是有活性的并且是稳定的，例如在该范围内具有大于40％的活性，并且最优选在该范围内具有最佳的活性。优选来自M.nivale的糖氧化酶在pH大约为6时具有最佳的活性，并且在pH范围为5-7时显示出至少80％的活性(相对于最大的活性)。在40℃下，在pH范围为4-9时所述的酶是稳定的，但当pH为3时该酶是不稳定的。
所述的糖氧化酶在20-45℃时优选是有活性的并且是稳定的，例如在该范围内具有大于50％的活性，并且最优选在该范围内具有最佳的活性。来自M.nivale的优选糖氧化酶在大约40℃时具有最佳的活性，并且在30-60℃的范围内显示出至少70％的活性(相对于最大的活性)。在pH为6时，该酶在60℃以下是稳定的，但在70℃时该酶失活。它的变性温度为73℃。
所述糖氧化酶能够氧化在还原端带有葡萄糖残基的还原性寡糖。它氧化1-位上的葡萄糖残基以形成相应的酸。因此，它氧化麦芽糖以形成麦芽糖酸并氧化乳糖以形成乳糖酸。
可以分离出所述糖氧化酶的活性，例如基本上不含其它非糖氧化酶的多肽，比如正如由SDS-PAGE测定的以蛋白质为基础的纯度大于大约80％、并且更优选纯度大于大约90％。
来自M.nivale的优选糖氧化酶具有由SDS-PAGE测定的约为52kDa的分子量以及约为8.9的等电点。它表现为一种脱氢酶，它具有携带电子受体(诸如铁氰化钾、亚甲蓝、苯醌和2，6-二氯苯酚-靛酚(DCPIP))的附带的(side)活性。糖氧化酶的来源
所述的寡糖氧化酶可以从微生物的来源获得，诸如从真菌中获得，例如丝状真菌或酵母，具体地讲为Ascomycota的真菌，例如真子囊菌纲，尤其是核菌类。
所述糖氧化酶可以来源于例如产有丝分裂孢子的核菌类，诸如支顶孢属，具体地讲为A.strictum，比如ATCC34717或T1；A.fusidioides，比如IFO6813；或A.potronii，比如IFO31197。在一个优选的实施方案中，寡糖氧化酶是从由Lin等人(1991，《Biochim.Biophys.Acta》1118：41-47)以及在JP-A5-84074中公开的来源得到的。
所述糖氧化酶还可以从Xylariales的微生物中得到；尤其是产有丝分裂孢子的Xylariales，诸如Microdochium属，特别是M.nivale的种。公众在培养物保藏所中可以容易地获得这些菌株，诸如美国模式培养物保藏所(ATCC)、德意志微生物保藏中心(DSM)和真菌菌种保藏中心(CBS)。
在Microdochium Syd(Samuels与Hallett，1983，《TBMS》81：473)中描述了Microdochium属。在与Gerlachia、G.nivalis、G.oryzae、雪腐病镰孢或Rynchosporium oryzae同义的情况下已经描述了Microdochium的一些菌株。通过专著(Hyponectr)fide(Muller，1977，《Rev.mycol.》41：129)进一步描述了这些菌株。
优选的菌株为M.nivale，NN008551。该菌株是从在印度选取的天然来源分离出来的，并且将该菌株于1997年12月4日按照国际承认用于专利程序目的的微生物保藏布达佩斯条约以登记入册号CBS100236保藏在真菌菌种保藏中心。
本发明人已经分离出编码来自M.nivale CBS100236的糖氧化酶的基因并且已将其插入大肠杆菌中。在1998年6月12日按照国际承认用于专利程序目的的微生物保藏布达佩斯条约，将包含所述基因的大肠杆菌菌株保藏在位于IL州Peoria市1815大学北街的农业研究服务保藏所(NRRL)并且命名为NRRLB-30034。附加的酶
可以将所述的糖氧化酶作为唯一的酶加入面团中，或者该酶可以与一种或多种附加的酶结合起来使用。附加的酶可以是淀粉酶(如上所述)、环糊精葡聚糖转移酶、肽酶(具体地讲为外肽酶、转谷氨酰胺酶)、脂肪酶、磷脂酶、纤维素酶、半纤维素酶(具体地讲为戊聚糖酶，诸如木聚糖酶)、蛋白酶、蛋白质二硫化物异构酶(例如WO95/00636中公开的蛋白质二硫化物异构酶)、糖基转移酶以及氧化还原酶(例如过氧化物酶、漆酶、葡糖氧化酶、吡喃糖氧化酶、脂肪氧合酶、L-氨基酸氧化酶或附加的糖氧化酶)等等。
附加的酶可以是包括哺乳动物和植物在内的任何来源的，优选是微生物(细菌、酵母或真菌)来源的并且可以通过本领域通常采用的技术得到。
所述的淀粉酶可以来源于细菌或真菌，具体地讲可以来源于曲霉属的菌株(优选黑色曲霉或米曲霉的菌株)或来源于芽孢杆菌属的菌株。一些实例为α-淀粉酶(例如来自解淀粉芽孢杆菌)和淀粉葡糖苷酶(例如来自黑色曲霉)。商业产品包括BAN和AMG(丹麦Novo Novo Nordisk A/S公司的产品)、Grindamyl A1000或A5000(可以从丹麦Grindsted Products公司得到)以及淀粉酶H和淀粉酶P(荷兰Gist-Brocades公司的产品)。
所述的蛋白酶可以是Neutrase(可以从丹麦Novo Nordisk A/S公司得到)。
所述的脂肪酶可以来源于Thermomyces(腐质霉属)、Rhizomucor、假丝酵母属、曲霉属、根霉属或假单胞菌属的菌株，具体地讲可以来自T.lanuginosus(H.lanuginosa，EP 305，216)、Rhizomucor miehei(EP 238，023)、南极假丝酵母(例如WO88/02775中所述的脂肪酶A或脂肪酶B)、黑色曲霉、德列马根霉、无根根霉或葱头假单胞菌(EP214，761与WO89/01032)。面团
面团通常是包括小麦粉或小麦面粉和/或其它类型的粗粉、面粉或淀粉(诸如玉米粉、玉米淀粉、黑麦粗粉、黑麦粉、燕麦粉、燕麦粗粉、大豆粉、高粱粗粉、高粱粉、米淀粉、米粉、马铃薯粗粉、马铃薯粉或马铃薯淀粉)的面粉面团。
所述面团可以是新鲜的、冷冻的或是预先焙烤的(par-baked)。
所述面团通常是发酵的面团或者是将要进行发酵处理的面团。可以以多种方式使面团发酵，比如通过加入化学膨松剂(例如碳酸氢钠)或者通过加入发酵剂(发酵的面团)，但是优选通过加入合适的酵母培养物来使面团发酵，所述的培养物诸如啤酒糖酵母(面包酵母)的培养物，而所述啤酒糖酵母例如为市售的啤酒糖酵母的菌株。
所述面团也可以包括其它常规的面团成分，例如：蛋白质，比如牛奶或奶粉、谷蛋白和大豆；鸡蛋(或是完整的鸡蛋、蛋黄或是蛋清)；起酥油，诸如颗粒状的脂肪或油；氧化剂，诸如抗坏血酸、溴酸钾、碘酸钾、偶氮二酰胺(ADA)或过硫酸铵；还原剂，诸如L-半胱氨酸；糖；盐，诸如氯化钠、醋酸钙、硫酸钠或硫酸钙。所述面团还可以包括乳化剂，诸如甘油单酯或甘油二酯、甘油单酯或甘油二酯的二乙酰酒石酸酯、脂肪酸的糖酯、脂肪酸的聚甘油酯、甘油单酯的乳酸酯、甘油单酯的醋酸酯、聚氧乙烯硬脂酸盐、磷脂、卵磷脂与溶血卵磷脂。
所述面团可以是面食制品的面团，其中该面团优选是由硬粒小麦粉或者具有相当质量的面粉制得的。当在制备面食制品和面条的过程中使用时，所述的糖氧化酶可以使得谷蛋白的结构得以增强，并从而使面团的粘性减小、面团的强度增加以及面团产品的结构得以改善。焙烤制品
本发明的方法可以用于由面团制备的任意种类的焙烤制品，所述制品或具有柔软的特性或具有松脆的特性，它或是白色的、浅色的或是深色的类型。实例为面包(具体地讲为白色的全麦面包或黑麦面包)，一般说来该面包呈枕形面包或小白面包的形状，还有法式baguette型面包、pita面包、未经发酵的玉米饼、蛋糕、薄烤饼、饼干、曲奇饼、脆皮松饼、大馅饼皮、瑞典黑麦面包干、馒头、比萨饼等。预混物
本发明进一步涉及面团和/或由面团制得的焙烤制品的预混物，例如呈面粉组合物形式的预混物，其中预混物包括所述糖氧化酶和如上具体描述的可选择的其它酶。可以通过将有关的酶与诸如面粉、淀粉、糖或盐之类的合适载体混合在一起来制备预混物。预混物可以含有其它的面团改善和/或面包改善添加剂，例如包括以上提及的酶在内的任何添加剂。
面团和/或面包改善添加剂
可以以颗粒或聚结的粉末的形式来提供作为面团和/或面包改善添加剂的所述糖氧化酶。面团和/或面包改善添加剂优选具有很窄的粒度分布，其中超过95％(重量)的颗粒在25至500μm的范围内。
颗粒和聚结的粉末可以通过常规的方法制备，例如通过在流化床制粒机中将淀粉酶喷洒到载体上来制备。所述载体可以由具有合适粒度的微粒核心组成。载体可以是可溶的或是不溶的，该载体例如有盐(比如氯化钠或硫酸钠)、糖(比如蔗糖或乳糖)、糖醇(比如山梨醇)、淀粉、大米、玉米糁或大豆。氨基酸序列
所述糖氧化酶可以是一种多肽，该多肽是由Mictodochium nivale CBS100236产生的，它具有如SEQIDNO：2所示的氨基酸序列，或者它是由存在于大肠杆菌NRRLB-30034中的基因编码的；或者它可以是其类似物。类似物可以具有至少50％的同一性，可以具有免疫交叉反应性，可以是等位基因变体或具有氧化酶活性的片段。糖氧化酶还可以是由在严格性差的条件下与SEQIDNO：1的核酸序列杂交的核酸序列编码的多肽、其互补链或其至少有100个核苷酸的亚序列。
SEQIDNO：2中所示的氨基酸序列与已知的序列之间具有小于20％的同一性。它与来自加利福尼亚罂粟的网硬蛋白氧化酶前体的氨基酸序列(GenPept登记入册号为2897944)有13.6％是相同的，与来自氧化节杆菌的6-羟基-D-烟碱氧化酶的氨基酸序列(GenPept登记入册号为122805)有17.8％是相同的。
采用用于获得肽以及测定肽序列的标准方法，例如由IRL出版社于1989年出版的Findlay与Geisow编辑的《蛋白质测序-实用方法》所述的方法，可以测定多肽的氨基酸序列。与现有技术氨基酸序列的比较已经表明SEQIDNO：2与任何现有技术的氨基酸序列之间仅仅具有极少的同源性(＜20％)。
所述多肽可以是具有相差不超过3个氨基酸的氨基酸序列的变体，其中优选相差不超过2个氨基酸、且更优选相差不超过1个氨基酸。
所述糖氧化酶可以包括至少一个部分序列，该部分序列为SEQIDNO：2的第1-24位所示的N-末端氨基酸序列或者为SEQIDNO：2的第229-266、249-271、303-322、336-347、383-404、405-414以及420-440位所示的内部序列。另一方面，糖氧化酶可以与所说部分序列的至少一个序列之间至少有50％是相同的，其中优选至少有60％、更优选至少有70％、甚至更优选至少有80％、甚至更优选至少有90％并且最优选至少有97％是相同的，这些序列都定性地保留着所述糖氧化酶的活性(在下文中称作“同源糖氧化酶”)及其等位基因形式和片段的活性，其中的片段保留着糖氧化酶的活性。
在一个优选的实施方案中，同源糖氧化酶包括一种氨基酸序列，该序列与所说部分氨基酸序列的至少一个序列之间相差5个氨基酸、优选相差4个氨基酸、更优选相差3个氨基酸、甚至更优选相差2个氨基酸、且最优选相差1个氨基酸。糖氧化酶可以包括其等位基因形式或片段，其中该片段保留着糖氧化酶的活性。
同源糖氧化酶的氨基酸序列可以通过插入或缺失一个或多个氨基酸残基和/或以不同的氨基酸残基取代一个或多个氨基酸残基来区别于任意的部分氨基酸序列。氨基酸的改变优选在本质上是不重要的，即并不显著地影响糖氧化酶的三级结构和/或活性的保守性氨基酸的取代。不重要的氨基酸的改变也可以包括小的缺失，一般说来为1至大约30个氨基酸的缺失；小的氨基-或羧基-末端的延伸，诸如氨基-末端甲硫氨酸残基的延伸；在大约20-25个残基以内的小接头肽；或者通过改变净电荷或另一种功能来促进纯化的小的延伸反应，诸如聚组氨酸序列、抗原表位或结合域的延伸。
保守性取代的例子有在碱性氨基酸(如精氨酸、赖氨酸和组氨酸)、酸性氨基酸(如谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(如谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸(如亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸)、芳族氨基酸(如苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)以及小分子氨基酸(如甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸和苏氨酸)小组内的取代。一般不改变特异性活性的氨基酸的取代在本领域中是公知的并且例如由纽约州的学术出版社于1979年出版的H.Neurath和R.L.Hill编著的《蛋白质》一书中有所描述。最常发生的置换为：Ala/Ser，Val/Ile，Asp/Glu，Thr/Ser，Ala/Gly，Ala/Thr，Ser/Asn，Ala/Val，Ser/Gly，Tyr/Phe，Ala/Pro，Lys/Arg，Asp/Asn，Leu/Ile，Leu/Val，Ala/Glu，Asp/Gly并且也可以反过来置换。
核酸序列
本发明提供了一种包括编码所述糖氧化酶的核酸序列的核酸序列。编码糖氧化酶的核酸序列可以包括：
a)克隆到存在于大肠杆菌NRRLB-30034中的质粒中的编码糖氧化酶的DNA序列的一部分，或
b)在SEQIDNO：1的第67-1550位中所示的DNA序列，或
c)a)或b)中所限定的DNA序列的类似物，该类似物
ⅰ)与所说的DNA序列之间具有至少50％的同一性，或
ⅱ)在严格性差的条件下与所说的DNA序列杂交的序列、其互补链或其亚序列。
同一性的程度可以至少为60％、优选大约70％、优选大约80％、更优选大约90％、甚至更优选大约95％、且最优选大约为97％。
等位基因变体指的是占据了同一染色体基因座的两种或多种可替换形式基因的任意一种。等位基因变异是通过突变自然发生的，并且可以在群体中造成多态性。基因的突变可以是沉默的(在编码的多肽中没有变化)或者可以编码具有改变了的氨基酸序列的多肽。多肽的等位基因变体是由基因的等位基因变体所编码的多肽。
杂交是指按照标准的Southern印迹方法，在严格性差、中等或严格性强的条件下类似的核酸序列与所述的寡核苷酸探针进行杂交(例如在42℃下在5XSSPE、0.3％SDS、200mg/ml剪切(sheared)并变性的鲑精DNA以及针对严格性强、中等和严格性差而言分别为50％、35％或25％的甲酰胺中进行预杂交和杂交)。在一个优选的实施方案中，该核酸序列能够在严格性强的条件下与糖氧化酶的编码区杂交，所述编码区位于编码包含于CBS100236之中的本发明糖氧化酶的核酸序列、其互补链或其亚序列上。
编码糖氧化酶的DNA序列可以从产生所述糖氧化酶的任何细胞或微生物中分离出来，其中采用本领域众所周知的各种方法以便将来自其天然位置的核酸序列重新确定到不同的位置上，而在该新的位置上将会复制所述的核酸序列。
根据本领域众所周知的方法，可以将包含于CBS100236之中的核酸序列或其亚序列的糖氧化酶编码区用于设计寡核苷酸探针，以便从不同属或种的其它菌株中分离出编码糖氧化酶的同源基因。因此，为了鉴定和分离出其中相应的基因，可以按照标准的Southern印迹方法针对与所述探针杂交的DNA来筛选由所述其它微生物制得的基因组或cDNA文库。该探针可以比整个序列短许多，但长度应当至少为15个核苷酸、优选至少为25个核苷酸、且更优选至少为40个核苷酸。也可以使用更长的探针，优选其长度不超过1200个核苷酸。既可以使用DNA探针，又可以使用RNA探针。通常将探针进行标记以用于检测相应的基因(例如用32P、3H、生物素或抗生物素蛋白标记)。根据本发明，可以在SEQIDNO：1的基础上构建优选的探针。
通过琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳或其它本领域公知的分离技术，可以分离出来自所述其它微生物的基因组或其它DNA。可以将来自文库或分离的DNA的DNA转移并固定在硝酸纤维素或其它合适的载体物质上。为了鉴定出与编码包含于CBS100236之中的本发明糖氧化酶的核酸序列同源的克隆或DNA，在Southern印迹中使用载体物质，其中最后优选在不高于40℃下每次都使用2XSSC、0.2％SDS洗涤载体物质，洗涤3次30分钟，所述温度更优选不高于45℃、更优选不高于50℃、更优选不高于55℃、甚至更优选不高于60℃、尤其是不高于65℃。采用X-光片检测在这些条件下与寡核苷酸探针杂交的分子。
能够与寡核苷酸探针杂交的本发明分离的核酸序列可以从任何属的微生物中、例如从细菌或真菌来源中得到，其中所述寡核苷酸探针与编码包含于CBS100236之中的本发明的糖氧化酶的核酸序列、其互补链或其亚序列杂交。
所述糖氧化酶可以从给定的微生物来源中获得(或是内部生成的)。因此，糖氧化酶可以由来源生物体或由细胞生产，其中在该细胞中已经插入了来自所述来源的基因。
此外，使用上面提到的探针，可以从包括由自然界(例如土壤、堆肥、水等)分离出的微生物在内的其它来源鉴定并得到同源基因。用于从自然栖息地中分离微生物的技术是本领域众所周知的。然后，通过类似地筛选另一种微生物的基因组或cDNA文库，可以得到核酸序列。
一旦用上述探针已经检测出核酸序列，于是通过采用那些本领域普通技术人员众所周知的技术(例如参见Sambrook等人，1989，出处同上)，可以分离或克隆所述的序列。用于分离或克隆核酸序列的公知技术包括从基因组DNA中分离、从cDNA中制备、或它们的结合。例如通过采用使用特异性引物的众所周知的聚合酶链式反应(PCR)，例如在US4，683，202或R.K.Saiki等人(1988，《科学》239：487-491)中所述的方法，可以实现由所述基因组DNA克隆出本发明的核酸序列。另外可以参见例如Innis等人，1990，《PCR方案：方法与应用指南》，学术出版社，纽约。从产生糖氧化酶的生物体或者另一种或有关的生物体中可以克隆出核酸序列，因此该核酸序列例如可以是核酸序列的糖氧化酶编码区的等位基因变体或物种变体。
另一方面，通过确定的标准方法，例如通过由S.L.Beaucage和M.H.Caruthers(1981，《四面体通讯》22：1859-1869)所述的phosphoamidite方法或者通过由Matthes等人(1984，《EMBO杂志》3：801-805)所述的方法，可以合成制备出编码所述酶的DNA序列。在前面提到的phosphoamidite方法中，例如在DNA自动合成仪中合成出寡核苷酸，将寡核苷酸纯化、退火、连接并且克隆到合适的载体中。
对于与所述糖氧化酶基本类似的糖氧化酶的合成而言，编码所述糖氧化酶的核酸序列的修饰可能是必须的。术语与所述糖氧化酶“基本类似”是指所述糖氧化酶的非天然存在的形式。这种糖氧化酶与从其天然来源分离出的糖氧化酶的区别可能在于一些人工改造的方式。例如，可能使人感兴趣的是合成出所述糖氧化酶的变体，其中所述变体在如使用位点诱变的特异活性、热稳定性、氧化稳定性、最佳pH或类似方面有所不同。在编码包含于CBS100236之中的本发明糖氧化酶的核酸序列或其亚序列的糖氧化酶编码区的基础上，和/或通过引入核苷酸的取代，其中该取代并不产生由所述核酸序列编码的糖氧化酶的另一种氨基酸序列但却对应着打算生产所述酶的宿主生物体的密码子使用，或者通过引入可能产生不同氨基酸序列的核苷酸的取代，便可以构建类似的序列。对于核苷酸取代的一般性描述，例如参见Ford等人，1991，《蛋白质的表达与纯化》2：95-107。
这种取代可以在对所述分子的功能至关重要的区域之外进行并且仍然生成了具有活性的糖氧化酶。根据本领域公知的方法，比如定点诱变或丙氨酸扫描诱变(例如参见Cunningham与Wells，1989，《科学》244：1081-1085)，可以鉴定出对由分离出的核酸序列编码的糖氧化酶的活性而言是必须的并因而优选不进行取代的氨基酸残基。在后一技术中，在所述分子中每个带正电的残基上引入突变，并且检测所得突变分子的蛋白酶活性以鉴定出对所述分子的活性至关重要的氨基酸残基。通过分析晶体结构也可以测定底物-酶相互作用的位点，其中晶体结构是通过诸如核磁共振分析、结晶学或光亲和标记(例如参见de Vos等人，1992，《科学》255：306-312；Smith等人，1992，《分子生物学杂志》224：899-904；Wlodaver等人，1992，《FEBS通讯》309：59-64)之类的技术测定的。
所述的糖氧化酶可以是一种融合多肽，其中将另一种多肽融合到所述多肽或其片段的N-末端或C-末端。融合多肽是通过将编码另一种多肽的核酸序列(或其部分)融合到本发明核酸序列(或其部分)中来产生的。用于生产融合多肽的技术是本领域公知的，并且包括将编码所述多肽的编码序列连接起来，从而使得它们位于框架中，并且融合多肽的表达处于同一启动子和终止子的控制之下。
还有另一种用于鉴定糖氧化酶编码克隆的方法涉及将基因组DNA的片段插入表达载体(比如质粒)中，用所得的基因组DNA文库转化糖氧化酶阴性细菌，然后将转化的细菌涂布到含有糖氧化酶底物的琼脂上，从而使得鉴定出表达糖氧化酶的克隆。
最后，所述的DNA序列可以是基因组与合成来源混合的，可以是合成与cDNA来源混合的或是基因组与cDNA来源混合的，所述序列是根据标准的技术在适宜的情况下通过将合成的、基因组的或cDNA来源的片段连接在一起制得的，其中所述片段对应于整个DNA序列的各个区域。氨基酸或核酸序列的同一性
本说明书与权利要求书中所指的多肽的同一性被确定为表明由第二个序列衍生出的第一个序列的该两个序列之间相同的程度。根据在Needleman，S.B.与Wunsch，C.D.(1970)《分子生物学杂志》48：443-45中所述的方法并按照用于多肽序列比较的如下设置：缺口(gap)产生罚分(penalty)为3.0且缺口延伸罚分为0.1，便可以适当地测定出同一性。通过公知的计算机程序，比如GCG程序包中提供的GAP(威斯康星软件包程序手册，第8版，1994年8月，遗传学计算机小组，575科学道，麦迪逊市，威斯康星州，美国53711)可以进行测定。
另一方面，通过Clustal方法(Higgins，1989，《CABIOS》5：151-153)使用LASERGENETM MEGALIGNTM软件(DNASTAR公司，麦迪逊市，威斯康星州)可以测定同一性的程度，其中所述软件带有同一性的平台(table)并按照如下的多个对比(alignment)参数：缺口罚分为10、缺口长度罚分为0。成对的对比参数为Ktuple=1、缺口罚分=3、窗口=5、且对角线=5。
类似多肽的成熟区与上述糖氧化酶序列之间的同一性程度表现为优选至少60％、更优选至少70％、更优选至少80％、更优选至少90％、尤其是至少为95％。
对本发明来说，通过带有同一性平台、缺口罚分为10以及缺口长度罚分为10的Clustal方法(Higgins，1989，《CABIOS》5：151-153)来测定两个核酸序列之间同一性的程度。免疫化学特性
所述糖氧化酶与天然的M.nivale菌株或其表达糖氧化酶活性的有性型(teleomorph)的糖氧化酶之间具有免疫化学同一性或部分的免疫化学同一性。在这一实施方案中，将所说的糖氧化酶用于生产具有免疫反应性或结合到所述多肽表位上的抗体。
与天然M.nivale的多肽之间具有免疫化学同一性的多肽是指含有抗天然M.nivale多肽的抗体的抗血清是否以相同的方式与其它多肽发生反应，比如采用具体的免疫化学技术来观察沉淀是否完全融合、沉淀的形态是否相同和/或电泳迁移率是否相同。对免疫化学同一性的进一步解释由Axelsen、Bock与Kroll在Blackwell科学出版社于1973年出版的N.H.Axelsen、J.Kroll与B.Weeks编辑的《定量免疫电泳手册》第10章中进行了描述。
部分的免疫化学同一性是指含有抗天然M.nivale多肽的抗体的抗血清以部分相同的方式与其它的多肽反应，比如采用具体的免疫化学技术来观察沉淀是否部分融合、沉淀的形态是否部分相同和/或电泳迁移率是否部分相同。对部分免疫化学同一性的进一步解释由Bock与Axelsen在Blackwell科学出版社于1973年出版的N.H.Axelsen、J.Kroll与B.Weeks编辑的《定量免疫电泳手册》第11章中进行了描述。
免疫化学特性可以通过免疫交叉反应同一性试验来测定，比如众所周知的Ouchterlony免疫双扩散方法。具体地讲，根据下列文献所述的方法通过免疫接种兔子(或啮齿类动物)便产生了抗所述多肽的抗血清：Harboe与Ingild在Blackwell科学出版社于1973年出版的N.H.Axelsen、J.Kroll与B.Weeks编辑的《定量免疫电泳手册》第23章中，或者Johnstone与Thorpe在Blackwell科学出版社于1982年出版的《实用免疫化学》中(更具体地讲在第27-31页中)。
优选地，所述抗体为单克隆抗体。例如根据在纽约冷泉港的冷泉港出版社于1988年出版的E.Harlow与D.Lane编辑的《抗体-实验指南》中所述的方法，可以制备出单克隆抗体。例如通过硫酸铵沉淀、接下来通过透析和离子交换层析(例如DEAE-Sephadex)，可以从抗血清中获得纯化的免疫球蛋白。
糖氧化酶的生产
采用本领域公知的方法，通过在含有合适的碳源和氮源以及无机盐的营养培养基上发酵以上提到的微生物菌株，便可以生产出所述的糖氧化酶(例如Bennett，J.W与LaSure，L.编辑《真菌附加基因操作》学术出版社，CA，1991)。合适的培养基可以通过商业途径从供应商处得到或者可以根据出版的组成来制备(例如在美国模式培养物保藏所的目录中)。在20℃至30℃范围内的温度适合于糖氧化酶的生长和生产。
发酵可以是培养细胞以便使所说的糖氧化酶表达或分离的任何方法。因此，可以将发酵理解为包括在合适的培养基中并且在使得糖氧化酶表达或分离的条件下进行的摇瓶培养、在实验室或工业发酵罐中进行的小规模或大规模的发酵(包括连续、分批、补料分批或固态发酵)。
由上述方法生产得到的糖氧化酶可以通过常规的方法从发酵培养基中进行回收，其中包括、但却不限于：离心、过滤、喷雾干燥、蒸发或沉淀。然后可以将回收的蛋白质通过各种层析工艺进一步纯化，例如离子交换层析、凝胶过滤层析、亲和层析等。
所述的糖氧化酶可以通过下列方法生产，该方法包括(a)培养表达糖氧化酶的野生型生物体，以便生产出包括糖氧化酶的上清液；以及(b)回收糖氧化酶。
另一方面，所述糖氧化酶也可以通过需氧培养转化的宿主生物体来生产，其中所述生物体含有来自以上提到的菌株的合适的遗传信息。这种转化体可以通过如下所述的本领域公知的方法进行制备和培养。核酸构建体
本发明还涉及核酸构建体，它包括可操作地连接到一个或多个控制序列上的本发明的核酸序列，其中所述控制序列能够在与所述控制序列相适应的条件下在合适的宿主细胞中指导编码序列的表达。
核酸构建体可以是单链的或是双链的核酸分子，它是从天然存在的基因中分离出来的或是已经进行了修饰以便含有核酸的区段，所述核酸区段以在自然界中不以其它方式存在的一种方式进行结合与并置的。当核酸构建体含有为表达本发明编码序列所需的所有的控制序列时，所述的核酸构建体可以是表达盒。编码序列可以是这样的一种序列，其中当处于合适的控制序列的控制之下时，该序列被转录成mRNA并且被翻译成本发明的糖氧化酶。通常通过位于5’-端的翻译起始密码子ATG和位于3’-端的翻译终止密码子来确定编码序列的边界。编码序列可以包括、但却不限于DNA、cDNA和重组的核酸序列。
可以以多种方式操作本发明分离的核酸序列，以便提供糖氧化酶的表达。取决于表达载体，在核酸序列插入载体之前该序列的操作可能是人们希望的或是必须的。利用克隆方法用于修饰核酸序列的技术是本领域众所周知的。
控制序列可以包括对表达核酸序列的编码序列而言是必须的或是有利的所有的元件。每个控制序列对于编码糖氧化酶的核酸序列来说可以是天然的或是外源的。所述的控制序列包括、但却不限于前导序列、启动序列、信号序列以及转录终止子。控制序列至少包括启动子以及转录和翻译终止信号。为了引入有助于将控制序列与编码糖氧化酶的核酸序列的编码区连接在一起的特异性限制位点，可以使控制序列具备多个接头。
控制序列可以为合适的启动序列，即一种由用于表达所述核酸序列的宿主细胞识别的核酸序列。启动序列含有介导糖氧化酶表达的转录控制序列。所述启动子可以是在所选的宿主细胞中表现出转录活性的任何的核酸序列，并且可以从编码胞外的或胞内的糖氧化酶的基因中得到，其中所述基因对宿主细胞而言或是同源的或是异源的。
用于指导本发明核酸构建体转录的合适的启动子的例子(尤其是在细菌宿主中)为由下列来源得到的启动子：大肠杆菌的乳糖操纵子、天蓝色链霉菌的琼脂糖酶基因(dagA)、枯草芽孢杆菌的蔗糖6-果糖基转移酶基因(sacB)、地衣芽孢杆菌的α-淀粉酶基因(amyL)、嗜热脂肪芽孢杆菌的生麦芽糖淀粉酶基因(amyM)、解淀粉芽孢杆菌的α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢杆菌的青霉素酶基因(penP)、枯草芽孢杆菌的xylA与xylB基因和原核生物的β-内酰胺酶基因(Villa-Kamaroff等人，1978，《美国国家科学院学报》75：3727-3731)以及tac启动子(DeBoer等人，1983，《美国国家科学院学报》80：21-25)。其它的启动子在下列文献中进行了描述：《美国科学》中的“来自重组细菌的有用蛋白质”1980，242：74-94；以及Sambrook等人，1989，出处同上。
对于在真菌宿主中的转录来说，有用的启动子的例子包括那些可以由编码下列酶的基因衍生出来的启动子：米曲霉的TAKA淀粉酶、Rhizomucor miehei的天冬氨酸蛋白酶、黑色曲霉的中性α-淀粉酶、黑色曲霉的酸稳定性α-淀粉酶、黑色曲霉的葡糖淀粉酶、Rhizomucor miehei的脂肪酶、米曲霉的碱性蛋白酶、米曲霉的丙糖磷酸异构酶以及构巢曲霉的乙酰胺酶。
控制序列也可以为合适的转录终止序列，即一种由所选的宿主细胞识别的用于终止转录的序列。可以将终止序列可操作地连接到编码糖氧化酶的核酸序列的3’端。在本发明中可以使用任何在所选的宿主细胞中起作用的终止子。
控制序列也可以为合适的前导序列，即对宿主细胞的翻译来说很重要的mRNA的非翻译区。可以将前导序列可操作地连接到编码糖氧化酶的核酸序列的5’端。在本发明中可以使用任何在所选的宿主细胞中起作用的前导序列。
控制序列还可以为信号肽的编码区，该编码区编码与糖氧化酶的氨基末端相连的氨基酸序列，它可以指导所表达的糖氧化酶进入细胞的分泌途径。信号肽的编码区对糖氧化酶而言可以是天然的或者可以从外源来源中获得。核酸序列的编码序列的5’端本来就可以含有信号肽的编码区，其中在翻译读框中该编码区天然地与编码分泌性糖氧化酶的编码区的区段相连。另一方面，编码序列的5’端可以含有这样的信号肽编码区，该编码区对于编码分泌性糖氧化酶的编码序列的部分而言是外源的。在编码序列通常不含信号肽的编码区的情况下，可能需要外源的信号肽编码区。另一方面，相对于通常和编码序列相连的天然信号肽的编码区来说，为了获得糖氧化酶分泌的增强，外源信号肽的编码区可以简单地替换天然信号肽的编码区。在本发明中可以使用能够指导所表达的糖氧化酶进入所选宿主细胞分泌途径中的任何信号肽的编码区。
针对细菌宿主细胞、具体地讲为芽孢杆菌属的有效的信号肽编码区为由下列来源得到的信号肽的编码区：来自芽孢杆菌NCIB 11837的生麦芽糖淀粉酶基因、嗜热脂肪芽孢杆菌的α-淀粉酶基因、地衣芽孢杆菌的枯草蛋白酶基因、地衣芽孢杆菌的β-内酰胺酶基因、嗜热脂肪芽孢杆菌的中性蛋白酶基因(nprT，nprS，nprM)以及枯草芽孢杆菌的prsA基因。由Simonen与Palva(1993，《微生物学回顾》57：109-137)描述了其它的信号肽。表达载体
本发明还涉及重组表达载体，它包括本发明的核酸序列、启动子、以及转录和翻译的终止信号。可以将上述各种核酸序列与控制序列连接在一起以生产出重组表达载体，所述表达载体可以包括一个或多个方便的限制位点以便可以使得在所述位点插入或取代编码糖氧化酶的核酸序列。另一方面，通过将核酸序列或包括本发明核酸序列的核酸构建体插入到合适的表达载体中，便可以表达本发明的核酸序列。在创建表达载体的过程中，使编码序列位于载体中，以便将编码序列可操作地与合适的用于表达的并且有可能用于分泌的控制序列相连。
在真核生物中，所述表达载体还可以包括可操作地与编码糖氧化酶的DNA序列相连的聚腺苷酸化序列。终止序列和聚腺苷酸化序列可以适当地来源于与启动子相同的来源。
重组表达载体可以是能够方便地经历重组DNA的步骤并且能够进行所述核酸序列表达的任何载体。载体的选择通常取决于载体与该载体将被引入的宿主细胞之间的相容性。载体可以是线性的或闭环的质粒。载体可以为自主复制的载体，即该载体以染色体外的实体的形式存在并且其复制不依赖于染色体的复制，例如质粒、染色体外元件、微型染色体或人工染色体。载体可以含有任何用于确保自复制的元件。另一方面，所述载体可以是这样的一种载体，即当将其引入宿主细胞中时，该载体被整合到基因组中并且与已被整合到基因组中的所述染色体一起复制。载体系统可以是单一的载体或质粒或者是两个或多个载体或质粒，它们共同含有将被引入到宿主细胞的基因组中的总DNA或转座子。
本发明的载体优选含有一个或多个允许容易地选择转化细胞的选择标记。选择标记是一种基因，其产物提供了抗微生物剂的抗性、对重金属的抗性以及对营养缺陷体的原养型等。细菌选择标记的例子有来自枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌的dal基因，或者为赋予了抗生素抗性(比如氨苄青霉素、卡那霉素、红霉素、氯霉素或四环素的抗性)的标记。此外，通过例如在WO91/09129中所述的共转化也可以实现选择，其中选择标记位于单独的载体上。
本发明的载体含有这样的元件，所述元件允许将载体稳定地整合到宿主细胞的基因组中或者允许在细胞中不依赖于细胞基因组的载体的自主复制。
当将本发明的载体引入宿主细胞时，可以将该载体整合到宿主细胞的基因组中。对整合来说，载体可以依靠编码糖氧化酶的核酸序列或该载体的任何其它的元件，以便通过同源重组将载体稳定地整合到基因组中。另一方面，载体可以含有用于指导通过同源重组整合到宿主细胞基因组中的附加的核酸序列。附加的核酸序列可以使载体在染色体的精确位置上整合到宿主细胞的基因组中。为了提高在精确位置上整合的可能性，整合元件优选应当含有足够数量的核酸，比如100至1，500个碱基对、优选400至1，500个碱基对并且最优选800至1，500个碱基对，其中它们与相应的靶序列之间是高度同源的以便提高同源重组的可能性。整合元件可以是与宿主细胞基因组中的靶序列同源的任何序列。此外，整合元件可以是非编码的或编码的核酸序列。
对自主复制而言，载体可以进一步包括一个可以使该载体在目的宿主细胞中自主复制的复制起点。细菌复制起点的例子有允许在大肠杆菌中复制的质粒pBR322、pUC19、pACYC177和pACYC184的复制起点，以及允许在芽孢杆菌中复制的质粒pUB110、pE194、pTA1060和pAMβ1的复制起点。复制起点可以是一种具有突变以在芽孢杆菌细胞中发挥其对温度敏感功能的复制起点(例如参见Ehrlich，1978，《美国国家科学院学报》75：1433)。
可以将超过一个拷贝的编码本发明糖氧化酶的核酸序列插入宿主细胞中，以扩增该核酸序列的表达。通过采用本领域众所周知的方法将至少一个添加拷贝的核酸序列整合到宿主细胞基因组中并选择转化体，便可以实现所述核酸序列的稳定扩增。在WO94/14968中描述了用于实现基因组DNA序列扩增的方便方法。
适合于构建编码糖氧化酶并分别含有启动子、终止子和其它元件的载体的方法是本领域普通技术人员众所周知的(例如参见Sambrook等人，出处同上)。
此外，理想的是加入相对于宿主细胞的生长而言可以调节糖氧化酶表达的调节序列。调节系统的例子为那些随化学或物理刺激而导致基因的表达开始或停止的系统，其中包括存在着调节化合物。原核生物系统中的调节系统包括lac，tac和trp操纵系统。调节序列的其它例子为那些可以使得基因扩增的序列。在这些情况下，编码糖氧化酶的核酸序列将会被可操作地与调节序列相连。
虽然在一些情况下胞内的表达可能是有利的，例如当使用某些细菌作宿主细胞时，但通常优选的是，所表达的糖氧化酶是胞外分泌的。宿主细胞
本发明还涉及重组宿主细胞，所述宿主细胞或者包括如上所述的DNA构建体或者包括表达载体，它们可以有利地用于重组生产糖氧化酶的过程中。宿主细胞可以是亲代细胞的任何后代，由于复制过程中发生的突变，后代细胞与亲代细胞是不同的。
优选用包括核酸序列的载体转化细胞，接下来将该载体整合到宿主染色体中。“转化”是指将包括本发明核酸序列的载体引入宿主细胞中，以便将该载体保持为染色体的整合体或作为自复制的染色体外的载体。通常认为整合是有利的，这是因为在细胞中更有可能稳定地保持所述的核酸序列。通过如上所述的同源或非同源重组发生载体向宿主染色体中的整合。
宿主细胞的选择在很大程度上取决于编码糖氧化酶的基因及其来源。宿主细胞可以是高等生物体、比如哺乳动物或昆虫的细胞，但优选微生物的细胞、例如细菌或真菌(包括酵母)的细胞。
合适的细菌细胞的例子有革兰氏阳性细菌，其中包括、但却不限于芽孢杆菌属的细胞，例如嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、强固芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌以及苏云金芽孢杆菌；或链霉菌属的细胞，例如变青链霉菌或鼠灰链霉菌；或者为革兰氏阴性细菌，比如大肠杆菌以及假单胞菌种。在一个优选的实施方案中，细菌宿主细胞为迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌的细胞。
细菌宿主细胞的转化例如可以通过下列方法来实现：原生质体转化(例如参见Chang与Cohen，1979，《普通分子遗传学》168：111-115)、使用感受态细胞(例如参见Young与Spizizin，1961，《细菌学杂志》81：823-829；或者Dubnau与Davidoff-Abelson，1971，《分子生物学杂志》56：209-221)；电穿孔(例如参见Shigekawa与Dower，1988，《生物技术》6：742-751)；或接合(例如参见Koehler与Thorne，1987，《细菌学杂志》169：5771-5278)。
宿主细胞也可以是真核生物，比如哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞或真菌细胞。有用的哺乳动物的细胞包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、海拉(HeLa)细胞、幼小仓鼠肾(BHK)细胞、COS细胞、或可以得到的任何编号的其它无限增殖化细胞系(例如可以从美国模式培养物保藏所得到)。
在一个优选的实施方案中，宿主细胞为真菌细胞。正如本文中所用的那样，“真菌”包括门(phyla)：Ascomycota、Basidomycota、Chytridiomycota和Zygomycota[如Hawksworth等人在《Ainsworth与Bisby氏真菌字典》第8版(1995，CAB国际，大学出版社，剑桥，英国)中所定义的]以及Oomycota(如在Hawksworth等人，1995，出处同上，第171页中引用的)和所有的产有丝分裂孢子的真菌(Hawksworth等人，1995，出处同上)。代表性的Ascomycota的小组例如包括链孢霉属、Eupenicillium(=青霉属)、Emericella(=曲霉属)、Eurotium(=曲霉属)以及以上所列举的真酵母。Basidiomycota的例子包括蘑菇、锈菌和黑粉菌。代表性的Chytridiomycota的小组例如包括Allomyces、小芽枝霉属、雕蚀菌属以及水生真菌。代表性的Oomycota的小组例如包括Seprolegniomycetous的水生真菌(水霉)、比如绵霉属。产有丝分裂孢子的真菌的例子包括曲霉属、青霉属、假丝酵母属以及链格孢属。代表性的Zygomycota的小组例如包括根霉属和毛霉属。
在一个优选的实施方案中，真菌宿主细胞为酵母细胞。本文中所用的“酵母”包括产子囊酵母(Endomycetales)、产担孢子酵母以及属于半知菌类(酵母菌)的酵母。产子囊酵母被划分为蚀精霉科和糖酵母科。后者由四个亚科组成，即裂殖糖酵母亚科(例如裂殖糖酵母属)、拿逊氏酵母亚科、油脂酵母亚科以及糖酵母亚科(例如毕赤氏酵母属、克鲁维氏酵母属和糖酵母属)。产担孢子酵母包括Leucosporidim属、红冬孢属、锁掷酵母属、Filobasidium属与线黑粉菌属。属于半知菌类的酵母被划分为掷孢酵母科(例如Sorobolomyces属和布氏弹孢酵母属)与隐球酵母科(例如假丝酵母属)这两科。酵母可以为比如在《酵母生物学与活性》(Skinner，F.A.，Passmore，S.M.与Davenport，R.R.编辑的应用细菌学协会的专题论文集系列9，1980)中描述的那样。酵母生物学和酵母遗传学操作是本领域众所周知的(例如参见《酵母生物化学与遗传学》Bacil，M.，Horecker，B.J.与Stopani，A.O.M.编辑，第2版，1987；《酵母》Rose，A.H.与Harrison，J.S.编辑，第2版，1987；以及《糖酵母的分子生物学》Strathem等人编辑，1981)。
在更为优选的实施方案中，酵母宿主细胞为假丝酵母属、克鲁维氏酵母属、糖酵母属、裂殖糖酵母属、毕赤氏酵母属或Yarrowia属的种的细胞。
在最优选的实施方案中，酵母宿主细胞为卡尔斯伯糖酵母、啤酒糖酵母、糖化糖酵母、道格拉斯氏糖酵母、克鲁维氏糖酵母、Saccharomycesnorbensis或卵形糖酵母的细胞。在另一个最优选的实施方案中，酵母宿主细胞为乳克鲁维氏酵母的细胞。在另一个最优选的实施方案中，酵母宿主细胞为Yarrowialipolytica的细胞。
在一个优选的实施方案中，真菌宿主细胞为丝状真菌细胞。“丝状真菌”包括Eumycota和Oomycota亚门(如Hawksworth等人，1995，出处同上所定义的)的所有的丝状体。丝状真菌的特征在于由壳多糖、纤维素、葡聚糖、脱乙酰壳多糖、甘露聚糖和其它复合多糖组成的营养菌丝壁。营养生长是通过菌丝的延伸，并且碳的分解代谢是专性需氧的。相比之下，比如啤酒糖酵母之类的酵母的营养生长是通过单细胞菌体的芽殖，并且碳的分解代谢可能是发酵型的。在一个更优选的实施方案中，丝状真菌宿主细胞为支顶孢属、曲霉属、镰孢属、腐质霉属、毛霉属、毁丝霉属、链孢霉属、青霉属、草根霉属、Tolypocladium和木霉属的种的细胞、但并不限于这些属的种的细胞。
在最优选的实施方案中，丝状真菌宿主细胞为泡盛曲霉、臭曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑色曲霉或米曲霉的细胞。在另一个最优选的实施方案中，丝状真菌宿主细胞为Fusarium cerealis、Fusarium crookwelense、禾谷镰孢、尖孢镰孢、接骨木镰孢、硫色镰孢或Fusarium venenatum的细胞。在另一个最优选的实施方案中，丝状真菌宿主细胞为Humicola insolens或Humicola lanuginosa的细胞。在另一个最优选的实施方案中，丝状真菌宿主细胞为米赫毛霉的细胞。在另一个最优选的实施方案中，丝状真菌宿主细胞为嗜热毁丝霉的细胞。在另一个最优选的实施方案中，丝状真菌宿主细胞为粗糙链孢霉的细胞。在另一个最优选的实施方案中，丝状真菌宿主细胞为产紫青霉的细胞。在另一个最优选的实施方案中，丝状真菌宿主细胞为Thielavia terrestris的细胞。在另一个最优选的实施方案中，木霉属的细胞为Trichoderma harzianum、康宁氏木霉、Trichoderma longibrachiatum、Trichoderma reesei或绿色木霉的细胞。
以本身公知的方式通过涉及原生质体形成、原生质体转化以及细胞壁再生的方法可以转化真菌细胞。在EP 238 023以及Yelton等人的论文(1984，《美国国家科学院学报》81：1470-1474)中描述了用于转化曲霉属宿主细胞的合适的方法。由Malardier等人(1989，《基因》78：147-156)或者在共同未决的系列号为08/269，449的美国专利申请中描述了转化镰孢属的种的合适方法。可以使用由下列文献所述的方法来转化酵母：Becker与Guarente在Abelson，J.N.与Simon，M.I.编辑的《酶学方法》(纽约学术出版社公司)第194卷第182-187页中的“酵母遗传学与分子生物学指南”；Ito等人，1983，《细菌学杂志》153：163；与Hinnen等人，1978，《美国国家科学院学报》75：1920。通过采用Graham与Van der Eb(1978，《病毒学》52：546)的磷酸钙沉淀方法进行直接的摄取可以转化哺乳动物的细胞。生产的重组方法
所述糖氧化酶可以通过重组的方法来生产，该方法包括在有助于生产所说糖氧化酶的条件下培养如上所述的宿主细胞以及从细胞和/或培养基中回收该糖氧化酶。
在这些方法中，采用本领域公知的方法在适合于糖氧化酶生产的营养培养基中培养细胞。例如，在合适的培养基中并且在使得糖氧化酶表达和／或分离的条件下对细胞进行摇瓶培养、在实验室或工业发酵罐中进行小规模或大规模的发酵(包括连续、分批、补料分批或固态发酵)。采用本领域公知的方法，在包括碳源和氮源以及无机盐的合适的营养培养基中进行培养(例如参见M.V.Arbige等人在Abraham L.Sonenshein，James A.Hoch与Richard Losick编辑的《枯草芽孢杆菌与其它革兰氏阳性细菌》美国微生物协会，华盛顿特区，1993，第871-895页中)。合适的培养基可以通过商业途径从供应商处得到或者可以根据出版的组成来制备(例如在美国模式培养物保藏所的目录中)。如果糖氧化酶是分泌到营养培养基中的话，那么可以直接从培养基中回收糖氧化酶。如果糖氧化酶是不分泌的，那么从细胞裂解物中回收糖氧化酶。
采用本领域公知的方法可以检测对所述多肽具有特异性的糖氧化酶。这些检测方法可以包括特异性抗体的使用、酶产物的生成或酶底物的消失。例如，可以将酶测定用于测定所述多肽的活性。
得到的糖氧化酶可以通过本领域公知的方法回收。例如，糖氧化酶可以通过常规的方法从营养培养基中回收，其中包括、但却不限于离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发或沉淀。
本发明的糖氧化酶可以通过本领域公知的各种方法来纯化，其中包括、但却不限于层析(例如离子交换层析、亲和层析、疏水层析、层析聚焦和大小排阻层析)、电泳方法(例如制备等电聚焦(IEF))、溶解度之差(例如硫酸铵沉淀)或提取(例如参见《蛋白质的纯化》J.C.Janson与Lars Ryden编辑，VCH出版社，纽约，1989)。工业应用
除了以上所讨论的在焙烤中的用途以外，例如还可以将所述的糖氧化酶以起到抗菌剂作用的有效量用于个人护理产品中，诸如牙膏(具体地讲在希望使牙齿变白的情况下的牙膏)、漱口剂、假牙清洁剂、液体皂、皮肤护理霜和护肤液、头发护理与身体护理制剂以及用于清洁隐形眼镜的溶液。所述糖氧化酶也可以为衣物洗涤剂组合物或餐具洗涤剂组合物的组分，并且可以用于产生过氧化氢。衣物洗涤剂组合物可以包括表面活性剂、所说的糖氧化酶以及该糖氧化酶的底物。餐具洗涤剂组合物可以包括所说的糖氧化酶和漂白剂前体或过氧酸以及糖氧化酶的底物。
所述的糖氧化酶可以用作分析试剂，例如用于测定给定样品中存在的还原糖的数量，或者可以将该酶固定化并插入到电极中以便提供对淀粉或纤维素水解的连续测量。
此外，可以将本发明的糖氧化酶用于把在还原端带有葡萄糖残基的寡糖氧化成相应的酸，例如用于由乳糖生产乳糖酸。
用于测定糖氧化酶活性的方法
DMAB/MBTH测定
预混物：
7.2mM3-二甲基氨基苯甲酸(DMAB)
0.33mM3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙(MBTH)
4mg/ml重组的Coprinus cinereus过氧化物酶(rCiP)
0.4M/0.4M磷酸盐/柠檬酸盐缓冲液(pH6)
培养混合物：
180μl500mM葡萄糖25mM柠檬酸盐25mM磷酸盐pH6.0
20μl样品
使培养混合物在30℃下培养20分钟。然后，将100ml的培养混合物与100ml的预混物混合在一起。30秒钟后，读取540(或490)nm下的吸光度。其中包括0.2mMH2O2的标准样品。
4AA-TOPS测定
测定是在96孔微量滴定板中进行的。将100μl 0.1M的磷酸盐/柠檬酸盐缓冲液(pH6)与50μl 0.24M的葡萄糖和50μl预混物(3 mM4-氨基安替比林(4AA)、7mM N-乙基-N-磺丙基-m-甲苯胺(TOPS)、40PODU/ml rCiP)混合，并且通过加入40μl经过了适当稀释的氧化酶溶液来启动反应。采用易于从分子设备公司得到的Vmax微量滴定板，在490nm下测量作为时间函数的吸收值，并且以吸收值线性增加的斜率作为活性。
实施例
实施例1：来自野生型M.nivale的糖氧化酶的生产
M.nivale的培养
采用下列完全培养基来发酵M.nivale CBS 100236的菌株：
摇瓶培养基：            BA
Rofec(Roquette)        10克
NH4NO3(Merck)       10克
KH2PO4(Merck)       10克
Solcafloc(Dicacel)     40克
MgSO4-7(H2O)        0.75克
Pluronic 100％(BASF)   0.1ml
加入自来水至最终体积为1000ml。
将pH调节到pH6.5，然后加入1片500mg的碳酸钙。将100ml的完全培养基加入每个体积为500ml的带有2个档板的摇瓶中。然后将摇瓶在121℃下高压灭菌40分钟。由孢子悬浮液制备接种物，其中孢子悬浮液是由在26℃下培养了7天、然后在20ml无菌水和Tween80(ICI)中进行了洗涤的5PDA斜面培养物制得的。以2ml的孢子悬浮液接种每个摇瓶，然后在26℃下并且在125rpm的恒定振荡下培养10天。在培养结束时，使细胞成为片状，并从上清液中纯化所述的酶。
纯化
从5升的发酵中，使用截止分子量为10kDa的过滤器(Filtron)通过超滤将4300ml经过离心的发酵肉汤过滤并浓缩至660ml。用介于200与400mg/ml之间的(NH4)2SO4沉淀该酶。在将沉淀溶解在25mMTris(pH7.5)之后，通过超滤洗涤样品，直至导电率与25mMTris(pH7.5)相同为止。使样品通过体积为300ml的用同一缓冲液平衡过的Q-SepharoseXL柱(Pharmacia)并收集流出物。在加入(NH4)2SO4至100mg/ml时，使样品通过用25mMTris(pH7.5)与100mg(NH4)2SO4/ml平衡过的HIC柱(Toyopearl-丁基650)(TosoHaas)。用25mM醋酸盐缓冲液(pH5.0)洗涤流出物，并将其加入用同一缓冲液平衡过的SP-Sepharose柱(Pharmacia)中。使用线性盐梯度来洗脱被结合的酶，使得超过10个柱的体积时达到溶于25mM醋酸盐缓冲液(pH5.0)的1MNaCl。汇集活性组分。通过在苯基-superose柱上的HIC层析来最终完善该制备过程，使用在超过20个柱的体积时线性梯度由2M(NH4)2SO4进行至0M的25mM醋酸盐缓冲液(pH5.0)的缓冲液。汇集活性级分并在25mM醋酸盐缓冲液(pH5.0)中透析24小时。
鉴定
由SDS-PAGE纯化的蛋白质的分析表明分子量约为52kDa，并且通过等电聚焦测定pl约为8.9。
纯化的M.nivale的氧化酶还呈现出明显的黄色，这表明存在着作为辅因子的FAD。对酶的吸光度的仔细研究揭示出385和440nm处的两个吸收的最大值，这是该酶中存在FAD的特征。在存在葡萄糖的情况下，440nm处的峰消失了，这表明FAD被还原了。
实施例2：来自M.nivale的糖氧化酶的氨基酸序列
还原并使M.nivale的高度纯化的制品进行烷基化。然后用赖氨酰基内肽酶(Wako)或TPCK-胰蛋白酶(Promega)降解该酶的样品。通过在Vydac218TP柱(Vydac)上的RP-HPLC以TFA(三氟乙酸)/异丙醇分离出肽，并且在Vydac218TP柱上以TFA/乙腈对肽重新纯化。通过Edman降解分析所选择的肽。通过测定在PVDF膜上电印迹的纯化酶的序列来测定N-末端序列。
所得到的部分序列为在SEQIDNO：2的第1-24位所示的N-末端序列，以及如在SEQINNO：2的第229-266、249-271、303-322、336-347、383-404、405-414、420-440位所示的内部序列。当在Swissprot与EMBL数据库中进行检索时，来自所述糖氧化酶的序列中没有一个序列显示出与任何相关的序列是同源的。
实施例3：Microdochium nivale的基因组DNA的提取
用10ml无菌的0.008％Tween20漂洗Microdochium nivale(NN008551，CBS100236)菌丝体的琼脂斜面培养物。将体积为2ml的菌丝体溶液接种到含有50mlMY50pH6.0培养基的250ml摇瓶中。MY50pH6.0培养基每升由下列物质组成：50克麦芽糖糊精、2克MgSO4·7H2O、10克KH2PO4、2克K2SO4、2克柠檬酸、10克酵母提取物、2克脲和0.5ml的AMG痕量元素原液。AMG痕量金属溶液每升由下列物质组成：14.3克ZnSO4·7H2O、2.5克CuSO4·5H2O、0.5克NiCl2·6H2O、13.8克FeSO4·7H2O、8.5克MnSO4·H2O和3克柠檬酸。在26℃、125rpm下培养摇瓶6天。
通过Miracloth(Calbiochem，La Jolla，CA)收集培养了6天的菌丝体，用大约50ml的10mMTis-1mMEDTApH8.0(TE)漂洗两次并挤压干。然后将菌丝体在液氮中冷冻并且在用干冰预冷的咖啡电研磨机中磨成细粉。将2克的粉末样品转移到无菌的一次性50ml锥形试管中，并缓慢地加入体积为20ml的裂解缓冲液(100mMEDTA，10mMTris，1％TritonX-100，500mM盐酸胍，200mMNaCl，pH8.0)，之后再加入20μg/ml不含DNA酶的RNA酶A。在37℃下培养该混合物30分钟。然后以0.8mg/ml的浓度加入蛋白酶K，并且在50℃下再培养该混合物2小时。在12-15，000×g下离心裂解的混合物20分钟，以便使不溶的碎片沉淀下来。
将裂解物上清液转移到用10mlQBT缓冲液(Qiagen，Santa Clarita，CA)预先平衡过的Qiagen-tip 500 Maxi柱(Qiagen，Santa Clarita，CA)中，并用30ml的QC缓冲液(Qiagen，Santa Clarita，CA)洗涤该柱。用15ml的QF缓冲液(Qiagen，Santa Clarita，CA)洗脱DNA，并将7倍体积的经过滤器灭菌的异丙醇加入洗脱的DNA溶液中。轻轻地混合该溶液，然后在15，000×g下离心20分钟以便使DNA沉淀。用5ml冰冷的70％乙醇洗涤成沉淀的DNA，将DNA进行空气干燥并重新悬浮在500μl的TE中。
实施例4：Microdochium nivale糖氧化酶基因的PCR扩增
将来自实施例2中所述的纯化Microdochium nivale糖氧化酶N-末端和内部片段的一级氨基酸序列的数据用于创建下列简并的PCR引物，以便由实施例3中制备的Microdochium nivale基因组DNA扩增所述糖氧化酶的基因：
正向引物(N-末端肽序列)：GCIGCIGGIGTICCIATHGAYAT(SEQ IDNO：3)
反向引物(内部肽序列)：IGGRTCIGCRTARTTDATRTACAT(SEQ IDNO：4)。
根据制造商的说明，使用Hot Wax OptistartTM试剂盒(Invitrogen，SanDiego，CA)完成扩增。安排了6个反应，其彼此不同之处在于如下表所示的pH和Mg2+的浓度：
1.5mMMgCl2  2.5mMMgCl2  3.5mMMgCl2
    pH8.5     反应1     反应2     反应3
    pH9     反应4
    pH9.5     反应5
    pH10     反应6
扩增反应液(50μl)含有1.62μg作为模板的Microdochium nivale基因组DNA、50皮摩尔的各种引物、1×PCR缓冲液、5μ110mMdNTP混合物以及含有适当数量Mg2+的HotWaxTMMg2+珠。将反应液在如下设置的Perkin Elmer 480循环变温加热器中循环：循环1为在94℃下2.5分钟并在72℃下2分钟；循环2-37各为在94℃下45秒钟、在50℃下45秒钟并在72℃下2分钟；并且循环38为在94℃下45秒钟、在50℃下45秒钟并在72℃下10分钟。循环39为4℃下的保温(soak)循环。
将体积为9μl的各种反应液在1％琼脂糖凝胶上使用50mMTris-50mM硼酸-1mMEDTA(TBE)缓冲液进行电泳。反应液4、5和6显示出位于1335bp处的主要带。汇集反应液4、5和6，并将它们在如上所述的1％琼脂糖凝胶上电泳。从凝胶中切下1335bp的带，并使用QiaexⅡ凝胶提取试剂盒(Qiagen，Santa Clarita，CA)纯化。然后根据制造商的说明，将纯化的1335 bp的PCR产物克隆到pCR2.1-TOPO(Invitrogen，San Diego，CA)中，并且转化到大肠杆菌TOP10细胞(Invitrogen，Carlsbad，CA)中。使用WizardMaxi制备试剂盒(Promega，麦迪逊市，威斯康星州)，从转化体中分离出质粒DNA。根据制造商说明，使用应用生物系统公司的Prism 377 DNA测序仪以及377XL采集与分析软件(Perkin Elmer，应用生物系统公司，Foster市，CA)测定分离的质粒DNA的序列。序列的数据证实了1335bp的片段编码Microdochium nivale糖氧化酶基因的一部分。
实施例5：Microdochium nivale基因组DNA的Southern印迹
通过Southem杂交分析实施例3中制得的基因组DNA的样品(Maniatis等人，1982，《分子克隆：实验手册》，冷泉港出版社，冷泉港，纽约)。用EcoRⅠ、KpnⅠ、NotⅠ、SacⅠ、SphⅠ或XbaⅠ(Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN)消化大约3μg的基因组DNA，并在0.6％琼脂糖凝胶上使用TBE缓冲液通过大小来进行分级分离。在波长短的紫外光下给凝胶拍照，并将其在0.5MNaOH-1.5MNaCl中浸泡30分钟，接下来在1MTris-HClpH8-1.5MNaCl中浸泡15分钟。采用Turbo印迹方法(Schleicher与Schuell，Keene，NewHampshire)通过在20XSSPE(3M氯化钠-0.2M磷酸二氢钠-0.02MEDTA二钠)中的毛细管印迹，将凝胶中的DNA转移到HybondN杂交膜(AmershamLife Science，Arlington Height，IL)上。使膜与UV(UV Stratalinker 2400，Stratagene，La Jolla，CA)交联，然后在45℃下将其在温和的搅拌下在下列杂交缓冲液中浸泡2小时：5XSSPE、50％甲酰胺(v/v)、0.3％SDS与200μg/ml变性并剪切的鲑睾丸DNA。
通过随机引发(Prime it Ⅱ，Stratagene，La Jolla，CA)用α[32p]dCTP(Amersham，Arlington Heights，IL)对实施例4中所述的含有Microdochium nivale糖氧化酶的部分编码序列的1335bp片段进行放射性标记。将α[32p]dCTP-标记的片段以每毫升缓冲液约为1×106cpm的活性加入到杂交缓冲液中。在振荡的水浴中，在45℃下将混合物与膜培养过夜。在培养后，在45℃下洗涤该膜3次共15分钟，其中每次都是在含有0.2％SDS的2XSSC(0.3MNaCl，30mM柠檬酸钠，pH7.0)中进行的。将膜在纸巾上干燥15分钟，然后包裹在塑料包装物中，并且在-70℃下借助增感屏(柯达公司，Rochester，NY)将该膜在X-光片下曝光3小时。
Southern印迹表明在含有SacⅠ消化物的泳道中存在着3kb的带。由于SacⅠ消化物产生了大小小到足以扩增并且大到足以含有全长基因的带，因此将其用于通过反向PCR来分离完全序列。
实施例6：Microdochium nivale糖氧化酶基因的编码序列的反向PCR
采用反向PCR来得到1335bp片段的5’与3’侧翼DNA，以便分离出Microdochium nivale糖氧化酶基因的整个编码序列。将6μg的Microdochiumnivale基因组DNA(实施例3)的样品用SacⅠ消化完全，然后根据制造商的说明使用QIAquick核苷酸去除试剂盒(Qiagen，Santa Clarita，CA)进行纯化。在14-16℃下，借助溶于最终体积为500μl的10个单位的T4连接酶(Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN)与1X连接酶的缓冲液，使1μg纯化的消化DNA样品进行自身连接过夜。然后通过在65℃下培养反应液15分钟来加热灭活所述的连接酶。使用Microcon30(Millipore，Bedford，MA)浓缩反应液。使用QIAquick核苷酸去除试剂盒来纯化反应产物。然后将自身连接的产物用作反向PCR的模板。
将下列引物以与常规的聚合酶链式反应相反的方向创建到糖氧化酶基因的5’和3’端，以便由1335bp的PCR产物的已知区域进行扩增：
靠上的1199bp：TCCAGTTCTACGACCGCTACG(SEQIDNO：5)
靠下的158bp：CAGACTTGGCAGAGACCTTGA(SEQIDNO：6)。
扩增反应液(100μl)含有100皮摩尔的各种引物、1μg SacⅠ消化的并自身连接的基因组DNA、10μl的10mMdNTP混合物、1xTaq聚合酶缓冲液(Perkin Elrmer，Foster市，CA)和5个单位的Taq聚合酶(Perkin Elmer，Foster市，CA)。将无菌的矿物油平铺在反应液的顶部，并放入如下设置的PerkinElmer480型循环变温加热器中：循环1为在94℃下2.5分钟并在72℃下2分钟；循环2-11各为在94℃下30秒钟、在55℃下45秒钟并在72℃下2分钟；循环12-28各为在94℃下30秒钟、在55℃下45秒钟并在72℃下2分钟，其中每个循环都延长20秒钟；并且循环29为在72℃下10分钟。循环30为4℃下的保温循环。
将反应液在1％琼脂糖凝胶上使用TBE缓冲液进行电泳，其间显现出3kb的带。将3kb的带从凝胶中切下，并使用QiaexⅡ凝胶提取试剂盒进行纯化。然后将纯化的3kb的PCR产物克隆到pCR2.1-TOPO中并转化到大肠杆菌TOP10细胞中，以生成大肠杆菌pEJG40/TOP10。按照国际承认用于专利程序目的的微生物保藏布达佩斯条约，将大肠杆菌pEJG40/TOP10的转化体于1998年6月12日保藏在位于IL州Peoria市1815大学北街的农业研究服务保藏所(NRRL)并且命名为NRRLB-30034。
使用WizardMaxi制备试剂盒从该转化体中分离出质粒DNA。根据借助染料-终止子化学(Giesecke等人，1992，《病毒学方法杂志》38：47-60)的引物步行技术，使用应用生物系统公司的Prism 377DNA测序仪以及377XL采集与分析软件，对分离的质粒DNA进行测序。除了lac-正向和lac-反向引物以外，可以使用下列寡核苷酸测序引物进行测序：
1335bp片段的测序引物：
IACRTCRAARTARTARTCIACRAARTT(SEQIDNO：7)
RTTIACCCAICCRTC(SEQIDNO：8)
IGGRTCIGCRTARTTDATRTACAT(SEQ ID NO：9)
DATRAARTCIACRTGRTCRAARTT(SEQ ID NO：10)
CCAYTGYTCIGGIGTICCRTARTA(SEQ ID NO：11)
CTCGCCACTTTCCCTGCTCCC(SEQ ID NO：12)
CTCGGTCACCAAGGCTCTCCC(SEQ ID NO：13)
GACCGCTACGACAACAACCAG(SEQ ID NO：14)
反向PCR产物的测序引物：
TCGGAGAAATGAGAGCAACCA(SEQ ID NO：15)
AGCCGACGTCCAGCATAGCAG(SEQ ID NO：16)
ACCCTACCATACGAGTTCACG(SEQ ID NO：17)
GGTCGAATCGTCACAAAGTAT(SEQ ID NO：18)
CACTGGACTGCCGACTGGATG(SEQ ID NO：19)
CAACAACCAGACCTACCC(SEQ ID NO：20)
CTCAGCAGCACTTCTTTTCAT(SEQ ID NO：21)
测序表明核酸序列具有一个1448bp(SEQ ID NO：1)的开放读框(ORF)，其中含有一个65bp的内含子。该ORF的G+C的含量为58.33％。翻译起点的-3位为腺嘌呤，这符合其中的-3位总为腺嘌呤的Kozak氏规则。推定的TATA基元也存在于-122，TATAAA处。
推定的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)表明具有495个氨基酸的蛋白质的计算分子量为54，678道尔顿。在van Heijne规则(van Heijne，1984，《分子生物学杂志》173：243-251)的基础上，头18个氨基酸可能包括分泌型信号肽，它指导新生肽进入内质网中。采用van Heijne程序计算得到30.395的得分，以便预测出信号肽。除了由于N-末端氨基酸序列没有紧跟在信号肽之后而可能有4个氨基酸前肽不同之外，来源于纯化Microdochium nivale糖氧化酶片段(实施例2)的部分肽的氨基酸序列与那些在推定的氨基酸序列中发现的是一致的。
实施例7：Microdochium nivale糖氧化酶表达载体的构建
合成出如下所示的两个合成的寡核苷酸引物，以便通过PCR扩增用于在镰孢属和曲霉属宿主细胞中亚克隆与表达的来自Microdochium nivale基因组DNA的糖氧化酶基因。为了促进基因片段亚克隆到表达载体pDM181和pBANE15中，分别在羧肽酶基因的5’和3’端引入SwaⅠ和PacⅠ限制酶位点。
正向引物：5’-GATTTAAATATGCGTTCTGCATTTATCTTG-3’(SEQ ID NO：22)
反向引物：5’-GTTAATTAATTATTTGACAGGGCGGACAGC-3’(SEQ ID NO：23)。
黑体字(每个都在第10-30位)表示编码序列。
除了循环参数变化如下以外，PCR、纯化和亚克隆都在如实施例4所述的条件下进行：循环1为在94℃下2分钟、在60℃下4秒钟以及在72℃下45秒钟；循环2-37各为在94℃下45秒钟、在60℃下45秒钟以及在72℃下2分钟；以及循环38为在94℃下45秒钟、在60℃下45秒钟以及在72℃下6分钟。循环39为4℃下的保温循环。
载体pDM181含有尖孢镰孢的类似胰蛋白酶的蛋白酶启动子和终止子作为调节序列并含有吸水链霉菌的bar基因作为用于真菌转化的选择标记(WO98/20136；de Block等人，1987，《EMBO杂志》6：2513-2518)。载体pBANE15(图1)含有TAKA启动子和AMG终止子并含有构巢曲霉的amdS基因作为用于真菌转化的选择标记。这两个载体也含有用于在大肠杆菌中进行选择的amp基因。
用SwaⅠ和PacⅠ消化以上获得的糖氧化酶的克隆，并使用TBE缓冲液通过0.8％琼脂糖凝胶电泳和QiaexⅡ凝胶提取试剂盒进行纯化。将消化的片段克隆到事先用SwaⅠ和PacⅠ消化的pDM181和pBANE15中，于是分别生成了表达质粒pEJG35和pEJG33(图2和图3)。
将所述表达质粒转化到大肠杆菌XL10Gold细胞(Stratagene，La Jolla，CA)中。分离出含有正确质粒的转化体，并使用Wizard Maxi制备试剂盒制备质粒DNA。
实施例8：在米曲霉中表达Microdochium nivale糖氧化酶的基因
采用原生质体转化(Yelton等人，1984，《美国国家科学院学报》81：1470-1474)，将pEJG33转化到蛋白酶缺陷型米曲霉的宿主菌株JaL142(Christensen等人，1988，《生物/技术》6：1419-1422)和JaL228(WO98/12300)中。将100μl的原生质体(2×106)放入装有大约5μgpEJG33的14mlFalcon试管中并温和地混合。加入体积为250μl的溶于10mMTris-HCl pH 7.5-10mM CaCl2的60％PEG4000，并通过轻柔的翻滚以进行混合。然后将试管在37℃下培养30分钟。加入3ml的STC(1.2 M山梨醇，10mM Tris pH7.5，10mMCaCl2)并通过倒置进行混合。然后将溶液直接涂布到Cove平板上，所述Cove平板每升由342.3克蔗糖、10ml的1.5MCsCl、10ml的1M乙酰胺、20ml的1XCove盐溶液和1％的琼脂组成。50XCove盐溶液由每升26克KCl、26克MgSO4·7H2O、76克KH2PO4和50ml的Cove痕量金属原液组成。每升Cove痕量金属溶液由0.04克NaB4O7·10H2O、0.4克CuSO4·5H2O、1.2克FeSO4·7H2O、0.7克MnSO4·H2O、0.8克Na2MoO2·2H2O和10克ZnSO4·7H2O组成。在37℃下将平板培养5天。将转化体转移到培养基相同的平板中并在37℃下培养5天。在相同的条件下使用相同的平板通过将孢子划线并挑取分离的菌落来纯化转化体。总共回收了12个米曲霉JaL142转化体和22个米曲霉JaL228转化体。
在如上所述的单独的COVE平板上培养转化体，然后使用WiHeveen等人(1990，《应用微生物生物技术》33：683)所述的指示平板测试其糖氧化酶的活性。将未转化的宿主用作对照。总共鉴定出11个阳性转化体。用无菌的去离子水制备每个阳性转化体的孢子原种。将体积为500μl的包括未转化宿主的每种孢子原种接种到含有25mlMY50培养基的125ml的摇瓶中。在37℃、200rpm下培养摇瓶7天。由于Microdochium nivale的糖氧化酶含有作为辅因子的FAD，因此一组烧瓶还含有52μM的核黄素-5’-磷酸(Sigma化学药品公司，St.Louis，MO)。
在第3、5和第7天时从每个烧瓶中取出500μl的样品并测定其糖氧化酶的活性。糖氧化酶的活性是在96孔板中测量的，其中含有10μl上清液，接下来加入1μl的邻-茴香胺、69μl的Britton与Robinson缓冲液(pH6.0)、10μl的1MD-葡萄糖以及10μl如WO92/16634所述得到的Coprinus cinereus过氧化物酸(3.76PODU/ml)在405nm下，以mOD/分钟为单位测量活性10分钟。所有的转化体都产生了可以检测到的糖氧化酶的活性。向摇瓶中加入核黄素5’-磷酸对活性的增加具有次要的作用。将来自糖氧化酶最高产者的20μl的样品在验证糖氧化酶生产的8-16％Tris-甘氨酸凝胶(Novex，San Diego，CA)上操作。
通过将分离的菌落连续两次贴补(patching)到新的COVE平板上，将具有最高活性的转化体进行孢子的纯化，然后将其在摇瓶中重新生长并如上所述重新测试糖氧化酶的活性以验证糖氧化酶的生产。
在34℃、pH7与1000-1200rpm下，在2升的实验室发酵罐中使含有pEJG33的米曲霉JaL228发酵8天，其中发酵罐中含有由Nutriose、酵母提取物、(NH4)2HPO4、MgSO4·7H2O、柠檬酸、K2SO4、CaCl2·H2O和痕量金属溶液组成的培养基。痕量金属溶液(1000X)每升由22克的ZnSO4·7H2O、11克的H3BO3、5克的MnCl2·4H2O、5克的FeSO4·7H2O、1.6克的CoCl2·5H2O、1.6克的(NH4)6Mo7O24与50克的Na4EDTA组成。一次发酵中补充2×10-4MFMN/升(GOX003.8)，而另一发酵却不进行补充(GOX002.8)。
如上所述测定8天的样品。结果表明在两种发酵中都存在着糖氧化酶的活性，但在两种发酵肉汤之间检测不到糖氧化酶活性的差别。
实施例9：在Fusarium venenatum中表达Microdochium nivale糖氧化酶的基因
采用Royer等人(1995，《生物/技术》13：1479-1483)的方法借助BASTATM(膦丝菌素抗性选擀，将pEJG35引入Fusarium venenatum菌株CC1-3(WO97/26330)中。除草剂BASTATM中的活性成分为膦丝菌素。BASTATM是从AgrEvo(Hoechst Schering，Rodovre，丹麦)得到的，并且在使用前用苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)提取2次、再用氯仿∶异戊醇(24∶1)提取1次。在存在BASTATM下进行生长的基础上，回收14个转化体，然后将其在室温下在单独的琼脂平板上培养，所述琼脂平板由补充有5mg/mlBASTATM的20ml的50XVogels培养基(Royer等人，1995，出处同上)、25克蔗糖、25克纯净琼脂以及25mMNaNO3组成。然后使用WiHeveen等人(1990，出处同上)所述的指示平板来测试转化体中糖氧化酶的生产。测试的5个转化体呈阳性。将来自每个阳性转化体的填料(plug)接种到单独的125ml摇瓶中，其中包括以未转化的Fusarium venenatum CC1-3作为对照，摇瓶中含有补充了0.5g/l CaCl2的30mlM400Da培养基，然后在30℃下在150rpm的搅拌下培养7天。M400Da培养基每升由50克的麦芽糖糊精、2克MgSO4、2克KH2PO4、4克柠檬酸、2克脲、0.5gCaCl2和1ml的Cove痕量金属溶液组成。一组烧瓶还含有52μM的核黄素5’-磷酸。
在第3、5和第7天时，从每个烧瓶中取出500微升培养肉汤并进行离心。如实施例8所述，测定上清液的糖氧化酶的活性。所有的转化体都产生了可以检测到的糖氧化酶的活性。向摇瓶中加入核黄素5’-磷酸已经对活性的增加基本上没有影响。将来自糖氧化酶最高产者的20μl的样品在8-16％Tris-甘氨酸凝胶(Novex，San Diego，CA)上操作，这证实了糖氧化酶的生产。将最高产者在Vogels/BASTATM平板上进行孢子纯化。
在30℃下，在2升发酵罐中将含有pEJG35的Fusarium venenatum菌株CC1-3发酵8天，其中发酵罐中含有每升由下列物质组成的培养基：20克蔗糖、2.0克MgSO4·7H2O、2.0克KH2PO4、2.0克柠檬酸·H2O、2.0克CaCl2·H2O、0.5ml的AMG痕量金属溶液(在灭菌前将pH调节到4.5)以及每升由2.5克脲和30ml大豆维生素混合物组成的经过滤器灭菌的混合物，其中在培养基灭菌并冷却后再加入所述的灭菌混合物。进料物流为由蔗糖和脲组成的经分批高压灭菌的混合物。
如实施例8所述测定8天的样品。结果表明存在着糖氧化酶的活性。
实施例10：重组Microdochium nivale糖氧化酶的纯化
将如实施例8所述制得的两种米曲霉JAL228发酵的JaL228肉汤GOX002.8(1.2升)和GOX003.8(1.4升)结合起来。使用Whatman#2滤纸过滤结合的肉汤，然后进行洗涤并使用配备有S1Y10膜的Amicon螺旋形浓缩器通过超滤将其浓缩至512ml。如实施例8所述对糖氧化酶活性的测量表明基本上百分之百地回收了所述的酶。
然后将浓缩液装入用10mMTris-HCl(pH8)预先平衡的Q-Sepharose柱(189ml；Pharmacia生物技术公司，Piscataway，NJ)中。用溶于10mMTris-HCl(pH8)的2MNaCl洗脱糖氧化酶。如上所述对糖氧化酶活性的测量表明大部分的酶没有结合到柱子上。
将来自Q-Sepharose柱的流通的级分(flow-through fractions)(760ml)调节到pH5.5，并将其装入用10mMMES(pH5.5)预先平衡的SP-Sepharose柱(176ml；Pharmacia生物技术公司，Piscataway，NJ)中。用溶于10mMMES(pH5.5)的1MNaCl洗脱糖氧化酶，于是产生了根据SDS-PAGE具有表现电泳纯度的糖氧化酶制剂。下表总结了重组糖氧化酶的纯化。基于下列氧电极的测定，总共实现了14倍的纯化、回收率为31％。采用Hansatech氧电极、通过由0.26ml的10mMMES(pH5.5)、30μl的1.0MD-葡萄糖以及3μl的糖氧化酶组成的测试溶液来测量糖氧化酶。
重组糖氧化酶的纯化
        体积    A280  A280xV  A450   A450xV A280/ 活性   回收率
                                              A450
肉汤    2580    51.3     100    1.9     100    27    8.2     100
超滤    512     44.2     17     2.35    25     19    45      107
 Q-     768     20.7     12     1       16     21    24      87
Sepharose
 SP-    144     52.6     5.7    3.7     11     19    45      31
Sepharose
单位：体积，ml；AxV与回收率(活性x体积)，％；活性(过氧化物酶/邻-茴香胺测定)，IU/ml。
实施例11：重组糖氧化酶的分子特性
采用Novex 8-16％Tris-甘氨酸SDS-PAGE凝胶的SDS-PAGE表明如实施例8和9所述得到的重组糖氧化酶具有约为55kDa的分子量，这与野生型糖氧化酶的类似。
在应用生物系统公司的476A蛋白质测序仪(Perkin Elmer/应用生物系统公司分公司，Foster市，CA)中，通过联机的HPLC和液相三氟乙酸(TFA)传递(delivery)进行重组糖氧化酶的N-末端序列的测定。将重组糖氧化酶制剂在还原条件下使用Novex Nupage MOPS缓冲液进行SDS-PAGE，其中使用了Novex10％Bis-Tris-SDS-PAGE凝胶。在25伏下、在10mMCAPS缓冲液(pH11.0)中，将凝胶电转移印迹到PVDF膜(Novex，San Diego，CA)上2小时。在溶于40％甲醇/1％醋酸的0.1％考马斯蓝R250中对PVDF膜进行染色，并切下观察到的带。采用测序试剂(Perkin Elmer/应用生物系统公司分公司，Foster市，CA)从印迹软片中测定切下带的序列。乙内酰苯硫脲-氨基酸的检测是通过联机的HPLC使用缓冲液A和缓冲液B来完成的，其中缓冲液A含有3.5％的四氢呋喃水溶液以及18ml含有醋酸、醋酸钠和己磺酸钠的预混浓缩物(Perkin Elmer/应用生物系统公司分公司，Foster市，CA)、而缓冲液B含有乙腈。采集数据，并使用应用生物系统公司的610数据分析软件在MacintoshIIsi中进行分析。
两种切下的带的N-末端测序都得到了SEQ ID NO：2的第1-21位所示的序列，其中第6位是不能确定的，但基于推定的氨基酸序列为半胱氨酸。N-末端的结果与推定的氨基酸序列相吻合，这表明由米曲霉和Fusarium venenatum宿主进行了正确的处理。
正如在用1厘米石英杯在Shimadzu UV160U分光光度计中记录的那样，在10mMMES-NaCl(pH5.5)中，重组的糖氧化酶具有黄素蛋白特有的紫外可见的光谱。在280和450nm下的相对吸光度为19，这略微大于野生型酶得到的数值12。通过氨基酸分析测量280nm下的消光系数为1.9g/(lxcm)，而预测值为2.1(包括FAD分子的贡献)。因此，看起来每种重组的糖氧化酶都含有一个黄素分子(可能为FAD)。
假定每个D-葡萄糖分子的氧化都与一分子O2还原为H2O2有关，那么使用如实施例10所述的Hansatech氧电极测量重组糖氧化酶的活性。在pH5.5和20℃下，重组的糖氧化酶以4.0IU/A280的比活或以116转换/分钟氧化D-葡萄糖(0.1M)。正如由实施例8所述的Coprinus cinereus过氧化物酶/茴香胺方法测定的那样，重组的糖氧化酶具有与野生型酶相同的比活。
实施例12：底物特异性
在60mM底物浓度下底物的特异性
在室温下在微滴板中通过以下列顺序混合来测定来自M.nivale的糖氧化酶的底物特异性：
50μl 0.4/0.4M磷酸盐/柠檬酸盐缓冲液(pH6)
50μl 底物(360mM)
50μl 21.6mM3-二甲基氨基苯甲酸(DMAB)
50μl 1mM3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙(MBTH)
50μl 75μg/ml，rec.Coprinus cinereus过氧化物酶(rCiP)
50μl糖氧化酶
跟踪记录595nm下的吸光度至少3分钟。计算出每分钟吸光度的增加并将该值用作相对活性的测量值。
本发明糖氧化酶对各种单糖和二糖底物的氧化活性的结果总结在下表中，并且该结果表明所述糖氧化酶能够氧化大部分的还原糖而且对麦芽糖和纤维二糖要比对相应的单糖葡萄糖表现出更高的活性。该酶对诸如果糖、蔗糖、海藻糖和甲基-b-D-吡喃葡糖苷之类的非还原糖没有活性。将结果表示为相对于D-纤维二糖的最佳活性的M.nivale酶的底物特异性。
    底物     活性％
    D-葡萄糖     69
 2-脱氧-D-葡萄糖     4.2
    D-半乳糖     31.3
    D-甘露糖     3.2
    D-木糖     55.6
    D-麦芽糖     83.5
    D-纤维二糖     “100”
    乳糖     52.5
0.83mM下的底物特异性
对底物特异性进一步的分析表明来自M.nivale的糖氧化酶能够氧化所测试的所有聚合度(DP)、即DP2-DP5的寡糖，其中除了将底物浓度改变为0.83mM之外使用的测定条件与上述相同。而且，该酶能够水解其中的单糖单元分别由α-1，4或β-1，4糖苷键连接的麦芽糖糊精和纤维糊精两者。糖氧化酶同样好地并且以比水解单糖高出大约10倍的水平来水解所有测试的纤维糊精。当以麦芽糖糊精为底物时，所述糖氧化酶的活性在比起针对单糖高出11/2倍(对麦芽六糖来说)到几乎高出5倍(对麦芽四糖来说)的范围内变化。结果总结在下表中，该结果表明相对于DP 1(D-葡萄糖)而言的聚合度与1，4键的类型对糖氧化酶活性的影响。
             活性％
DP  α-1，4         β-1，4
1           “100”
2    211             949
3    348             1147
4    477             1111
5    161             1014
在1％底物浓度下的底物特异性
当采用1％的底物浓度在上述测定条件下进行测定时，即使在通过透析除去小分子的寡糖和单糖之后，对来自M.nivale的糖氧化酶对多糖氧化活性的分析表明该酶能够显对羧甲基纤维素(CMC)有显著的活性。结果总结在下表中，该结果显示出相对于D-纤维二糖的糖氧化酶对羧甲基纤维素的活性。
    底物       活性％
D-纤维二糖    “100”
CMC            17.7
CMC，透析过的  8.8
在10mM底物浓度下的底物特异性
在pH7.8(50mMTris-HCl缓冲液)、10mM底物下，测量来自M.nivale的糖氧化酶对各种底物的氧化活性。其中包括来自支顶孢属的糖氧化酶的类似数据以便用于比较(如BBA(1991)1118：41-47中所述)。
麦芽糖麦芽三糖麦芽四糖麦芽五糖麦芽六糖麦芽七糖乳糖葡萄糖纤维二糖 Microdochium76.184.9100.058.641.232.567.039.665.7 支顶孢属1009474466656596447
实施例13：麦芽糖的氧化
为了证明来自M.nivale的糖氧化酶氧化1-位上的还原基团，通过层析的方法在下列条件下跟踪记录麦芽糖的氧化：在加入50μl纯化的M．nivale糖氧化酶之前，将125μl的0.2M柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液(pH6)加入到250μl的10mM麦芽糖和75μl的水中。在40℃下在恒定的振荡下培养样品不超过30分钟。通过将100μl的样品加入到900μl95℃的水中来终止反应。然后采用下列条件在Dionex DX-500系统中通过阴离子交换层析(CarboPac PA1柱，Dionex)、接下来通过脉冲电流检测(Dionex)来分析50μl的反应混合物：
流速： 1ml/分钟
A-缓冲液： 0.1MNaOH(在氦气中脱气)
B-缓冲液： 0.1MNaOH，0.6mM醋酸钠(在氦气中脱气)
梯度： 0-3分钟，5％的B-缓冲液
3-19分钟，5-30％的B-缓冲液
19-21分钟，30-100％的B-缓冲液
21-23分钟，100％的B-缓冲液
23-24分钟，100-5％的B-缓冲液
从Sigma化学药品公司购买标准的麦芽糖糊精(DP1-7)。根据Fitting&Putman(1952)《生物化学杂志》199：573所述制备麦芽糖酸。
使用以上的方法，检测出麦芽糖为保留时间约为8.0分钟的峰，同时检测出麦芽糖酸为保留时间约为13.3分钟的峰。在上述条件下，在存在M.nivale糖氧化酶的情况下，由麦芽糖生成了麦芽糖酸，这是因为在大约13.3分钟时展开了一个峰。因此，糖氧化酶氧化麦芽糖中游离的还原端基。下面以反应混合物中麦芽糖酸的μM浓度给出了所产生的麦芽糖酸的量：
培养时间(分钟)    麦芽糖酸(μM)
    0                  0
    5                 150
    10                370
    30                880
实施例14：结合常数Km
通过改变糖底物的浓度并由4AA-TOPS测定方法测定糖氧化酶的活性来进行稳态动力学的研究。尽管该反应不是简单的一底物-一产物的机理(E+SES→E+P)，但仍将其假设为简单的Michaelis-Menten动力学反应。
使用一些优选的底物来研究针对M.nivale的糖氧化酶的稳态动力学。由Lineweaver-Burke作图法得到动力学常数，其中假设为简单的Michaelis-Menten动力学反应(尽管这是一种相当不好的假设)以便得到各种底物的表观值“Km”和“Vm”。“Km”的结果为：
葡萄糖：    42mM
麦芽糖：    11mM
纤维二糖：  59mM。
所述的糖氧化酶对纤维二糖表现出最高的活性。但是，纤维二糖的“Km”要比麦芽糖的几乎高出6倍。同样地，葡萄糖的“Km”明显高于麦芽糖的，而这两种底物的“Vm”却大体相同。因此，以前所显示的在低的底物浓度下对麦芽糖的优选可以由麦芽糖较低的“Km”值加以解释。
实施例15：pH与温度的活性分布
在室温下采用以上实施例12中所述的方法、但是要用调节到待测pH值的缓冲液并在反应混合物中测量实际的pH，在微滴板中测定在某一pH范围内来自M.nivale糖氧化酶的活性。下面的结果(相对于pH6.32时的最佳值的活性)表明所述糖氧化酶在pH5-7时具有最佳的活性，并且该酶具有相当宽pH的活性分布。
pH      活性％
3.38    5.58
4.28    27.69
5.31    88.97
6.32    100.00
7.15    96.20
8.05    57.25
通过在玻璃试管中混合缓冲液与底物并且在不同的温度下(30-80℃)预培养至少5分钟来测定糖氧化酶的温度活性分布：
150ml    0.4/0.4M磷酸盐/柠檬酸盐(pH6)
150ml    180mM麦芽糖
150ml    氧化酶稀释液
通过加入氧化酶来启动反应，并且在恒温浴槽中在设置的合适的温度下培养样品。5分钟后将样品放在冰上，通过加入450μl的DMAB：MBTH：rCiP(1∶1∶1)在如实施例12所述的各种浓度下测定过氧化氢的产生，并且在HP 8452A二极管阵列分光光度计(惠普公司)上处理10秒钟后测量590nm下吸光度的增加。其中包括没有进行培养的盲试。下面所示的结果(相对于50℃下的最佳值)表明该酶在至少60℃以下是有活性的，其中在50℃下具有最佳的活性。
℃    活性％
30    86.28
40    90.98
50    100.00
60    79.95
70    2.27
实施例16：由DSC测定的热稳定性
使用来自Pharmacia公司的NAP-5柱，将来自M.nivale的糖氧化酶样品脱盐入0.1MMES(pH6)中。将样品(含有6.5mg/ml的氧化酶)装入VP-DSC装置(MicroCal)中，并以90°/小时的扫描速度进行由20℃至90℃的线性扫描。
发现变性温度为73℃。
实施例17：温度和pH的稳定性
温度稳定性：
在通过4AA-TOPS检测测量残留活性之前，在pH6下在不同的温度下预培养来自M.nivale的糖氧化酶10分钟：
温度℃：    残留活性％：
40             81
50             78
60             100
70             19
80             2
结果表明该酶在60℃以下是稳定的，但在70℃及70℃以上是不稳定的。这与由DSC实验得到的结果是一致的。
pH-稳定性：
在通过4AA-TOPS检测测量残留活性之前，在40℃下在不同的pH下培养来自M.nivale的糖氧化酶2小时：
pH：    残留活性％：
3          2
4         100
5         95
6         93
7         99
8         97
9         93
结果表明该酶在pH4-9的范围内是稳定的，但当pH为3时是不稳定的。
实施例18：糖氧化酶对谷蛋白流变学特性的影响
面包面团的配方
小麦面粉  100％(=10克)
水        58％(包括酶溶液)
盐        1.5％
糖        1.5％
小麦面粉为Meneba型面粉。该面粉不含抗坏血酸。
将面团在10g Micro Mixer(NSI-33R型，来自国家生产公司)中混合2∶30分钟。在混合前加入来自M.nivale的糖氧化酶。在混合后，使面团在32℃和85％的相对湿度下静置90分钟。用2％的NaCl溶液从面团中洗出谷蛋白(在Perten仪器公司的Glutomatic2200中处理7分钟)，然后在谷蛋白指标离心机2015(Perten仪器公司)中离心1分钟。
为了评价在振动下面团的强度，在Bohlin VOR流变仪系统(Bohlin仪器公司)中分析谷蛋白的流变学特性，其中以恒定的频率(1Hz)进行着发生应力形变的摆动(sweep)。在该方法中，将面团的粘弹特性划分为两个部分、即动力剪切储能模量G’和动力剪切损耗模量G”。损耗模量与储能模量之比在数值上等于粘弹性相角d的正切值。储能模量G’的增加以及相角d的减小表明面团更硬并更有弹性。
糖氧化酶         G’             G”                 d
无(参考)       349.5      166.4      25.46
 50U/kg面粉    397.9      176.3      23.89*
100U/kg面粉   456.3*    193.7*    23.02*
200U/kg面粉   523.0*    207.4*    21.77*
500U/kg面粉   554.7*    207.3*    20.49*
1000U/kg面粉  708.5*    249.4*    19.40*
结果表明G’储能模量以与加入到面团中的糖氧化酶的用量成正比地增加。就相角d而言，所有经糖氧化酶处理的面团都与参考物的不同，并且相角随加入酶的量成比例地减小。因此，糖氧化酶提高了弹性模量，从而以依赖于用量的方式提高了面团的弹性。图表为三次独立测量的平均值。通过在5％的显著水平上进行ANOVA分析，用星号表示的数据在统计上是显著的。
实施例19：糖氧化酶对面团坚度的影响
焙烤步骤
基本配方：
面粉(Meneba)    12g(°100％)
水              60％(包括酶溶液)
酵母            4％
糖              1.5％
NaCl            1.5％
面粉不含抗坏血酸。
步骤：将面团在10g Micro Mixer(NSI-33R型，来自国家生产公司)中混合21/2分钟。在混合前加入来自M.nivale的糖氧化酶。混合后面团的最终温度约为27℃。在混合后立即对面团进行评价。
对面团的评价
根据经验按照下列标度测量面团的粘性和坚硬度：
评分系统     1     2     3     4     5     6
坚硬度： 非常软 太软 软/良好 正常     硬 太硬
粘性： 几乎为液体 太粘     粘 良好     干 太干
在2天的时间里进行评价，其中每天针对每个用量采用3次重复实验。下表中总结的数据代表6种评价的平均值。结果表明面团的坚硬度和粘性都表现出相同的所述糖氧化酶产生具有极佳面团坚度的面团的能力随用量而增加的趋势。在200和300单位/千克下，熟练的面包师评价该面团具有极佳的坚硬度和柔软性并具有非常通风的坚度。
糖氧化酶     坚硬度  粘性
无(参考)      3.0    2.3
10U/kg面粉    3.0    3.0
50U/kg面粉    3.5    3.4
100U/kg面粉   4.0    4.0
200U/kg面粉   4.0    3.8
300U/kg面粉   4.1    4.1
500U/kg面粉   4.8    4.8
溴酸盐        4.0    3.5
实施例20
为了测试Microdochium niVale的糖氧化酶(MCO)对不同加工参数中变化的耐受性，已经在“欧洲直接面团法”这种标准尺度焙烤试验(2千克面粉)中测试了MCO。与标准的焙烤步骤(ABF-SP.1217.01/01)相比，通过增加水含量、通过增加混合时间和/或通过增加发酵时间来使面团变形。试验的目的在于澄清MCO是否能使面团对这些变化具有更强的抗性。为了模拟实际的焙烤工艺，结合芬加密尔Super MA(木聚糖酶与淀粉酶)来测试MCO。方案是以不完全的统计设计为基础的。与不合MCO的对照相比，MCO的加入导致面团/面包的强度更好。比如当评价状态(=“底部(foot)”的面积)时，例如可以断定在MCO的用量(0-200U)与水加入量增加了1.5％和混合时间增加了+2分钟之间没有观察到明显的相互作用。
    序列表<110>Novo Nordisk A/S<120>糖氧化酶及共用途<130>5421-WO，SLK<140><141><160>23<170>Patentln 2.0版<210>1<211>1553<212>DNA<213>Microdochium nivale<220><221>内含子<222>(1012)..(1076)<220><221>CDS<222>(1)..(1011)<220><221>CDS<222>(1077)..(1553)<220><221>mat-肽<222>(67)..(1550)<400&#621atg cgt tct gca ttt atc ttg gcc ctc ggc ctt atc acc gcc agc gct    48Met Arg Ser Ala Phe Ile Leu Ala Leu Gly Leu Ile Thr Ala Ser Ala-20                 -15                     -10gac gct tta gtc act cgc ggt gcc atc gag gcc tgc ctg tct gct gct    96Asp Ala Leu Val Thr Arg Gly Ala Ile Glu Ala Cys Leu Ser Ala Ala-5              -1   1               5              10ggc gtc ccg atc gat att cct ggc act gcc gac tat gag cgc gat gtc    144Gly Val Pro Ile Asp Ile Pro Gly Thr Ala Asp Tyr Glu Arg Asp Val15                  20                  25gag ccc ttc aac atc cgc ctg cca tac att ccc acc gcc att gct cag    192Glu Pro Phe Asn Ile Arg Leu Pro Tyr Ile Pro Thr Ala Ile Ala Gln30                  35                  40acg cag act act gct cac atc cag tcg gca gtc cag tgc gcc aag aag    240Thr Gln Thr Thr Ala His Ile Gln Ser Ala Val Gln Cys Ala Lys Lys45                  50                  55ctc aac ctc aag gtc tct gcc aag tct ggt ggt cac agc tac gcc tcg    288Leu Asn Leu Lys Val Ser Ala Lys Ser Gly Gly His Ser Tyr Ala Ser60                  65                  70ttc ggc ttt ggt ggc gag aac ggt cac ctc atg gtc cag ctc gac cgc   336Phe Gly Phe Gly Gly Glu Asn Gly His Leu Met Val Gln Leu Asp Arg75                  80                  85                  90atg att gat gtc atc tcg tac aat gac aag act ggc att gcc cat gtt   384Met Ile Asp Val Ile Ser Tyr Asn Asp Lys Thr Gly Ile Ala His Val95                 100                 105gag ccc ggt gcc cgc ctc gga cat ctc gcc acc gtc ctc aac gac aag   432Glu Pro Gly Ala Arg Leu Gly His Leu Ala Thr Val Leu Asn Asp Lys110                 115                 120tac ggc cgt gcc atc tcc cac ggt aca tgc cct ggt gtc ggc atc tcc   480Tyr Gly Arg Ala Ile Ser His Gly Thr Cys Pro Gly Val Gly Ile Ser125                 130                 135ggc cac ttt gcc cac ggc ggc ttc ggc ttc agc tcg cac atg cac ggt   528Gly His Phe Ala His Gly Gly Phe Gly Phe Ser Ser His Met His Gly140                 145                 150ctg gct gtc gac tcg gtc gtc ggt gtc act gtt gtt ctt gct gat gga   576Leu Ala Val Asp Ser Val Val Gly Val Thr Val Val Leu Ala Asp Gly155                 160                 165                 170cgc atc gtt gag gct tct gcc act gag aat gct gac ctc ttc tgg ggt   624Arg Ile Val Glu Ala Ser Ala Thr Glu Asn Ala Asp Leu Phe Trp Gly                175                 180                 185atc aag ggc gct ggc tcc aac ttc ggc atc gtt gct gtc tgg aag ctc    672Ile Lys Gly Ala Gly Ser Asn Phe Gly Ile Val Ala Val Trp Lys Leu190                 195                 200gcc act ttc cct gct ccc aag gtt ctc acc cgc ttt ggc gtc acc ctc    720Ala Thr Phe Pro Ala Pro Lys Val Leu Thr Arg Phe Gly Val Thr Leu205                 210                 215aac tgg aag aac aag acc tct gcc ctc aag ggc atc gag gct gtt gag    768Asn Trp Lys Asn Lys Thr Ser Ala Leu Lys Gly Ile Glu Ala Val Glu220                 225                 230gac tac gcc cgc tgg gtc gcc ccc cgc gag gtc aac ttc cgc att gga    816Asp Tyr Ala Arg Trp Val Ala Pro Arg Glu Val Asn Phe Arg Ile Gly235                 240                 245                 250gac tac ggc gct ggt aac ccg ggt atc gag ggt ctc tac tac ggc act    864Asp Tyr Gly Ala Gly Asn Pro Gly Ile Glu Gly Leu Tyr Tyr Gly Thr255                 260                 265ccc gag caa tgg cgt gcg gct ttc caa cct ctg ctc gac act ctg cct    912Pro Glu Gln Trp Arg Ala Ala Phe Gln Pro Leu Leu Asp Thr Leu Pro270                 275                 280gct gga tac gtt gtc aac ccg acc acc tcc ttg aac tgg atc gag tcg    960Ala Gly Tyr Val Val Asn Pro Thr Thr Ser Leu Asn Trp Ile Glu Ser285                 290                 295gtg ctc agc tac tcc aac ttt gac cat gtc gac ttc att act cct cag     1008Val Leu Ser Tyr Ser Asn Phe Asp His Val Asp Phe Ile Thr Pro Gln300                 305                 310cct gtaagtgttc accgactttg cgctgggaga atgttttatg tcggctttac          1061Pro315tgactccctc tacag gtc gag aac ttc tat gcc aag agc ttg acg ctc aag    1112Val Glu Asn Phe Tyr Ala Lys Ser Leu Thr Leu Lys320                 325agt atc aag ggc gac gcc gtc aag aac ttt gtc gac tac tac ttt gac     1160Sar Ile Lys Gly Asp Ala Val Lys Asn Phe Val Asp Tyr Tyr Phe Asp330                 335                 340gtg tcc aac aag gtt aag gac cgc ttc tgg ttc tac cag ctc gac gtg     1208Val Ser Asn Lye Val Lys Asp Arg Phe Trp Phe Tyr Gln Leu Asp Val345                 350                 355cac ggc ggc aag aac tcg caa gtc acc aag gtc acc aac gcc gag aca     1256His Gly Gly Lys Asn Ser Gln Val Thr Lys Val Thr Asn Ala Glu Thr360                 365                 370                 375gcc tac cct cac cgc gac aag ctc tgg ctg atc cag ttc tac gac cgc     1304Ala Tyr Pro His Arg Asp Lys Leu Trp Leu Ile Gln Phe Tyr Asp Arg380                 385                 390t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                 21<210>7<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<220><221>修饰的碱基<222>(1)<223>i<220><221>修饰的碱基<222>(19)<223>i<400>7nacrtcraartartartcna craartt             27<210>8<211>15<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<220><221>修饰的碱基<222>(4)<223>i<220><221>修饰的碱基<222>(10)<223>i<400>8rttnacccanccrtc                           15<210>9<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>9nggrtcngcrtarttdatrtacat                  24<210>10<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>10datraartcnacrtgrtcraartt                  24<210>11<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>11ccaytgytcnggngtnccrtarta24<210>12<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>12ctcgccactttccctgctccc                  21<210>13<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>13ctcggtcaccaaggctctccc                  21<210>14<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>14gaccgctacgacaacaaccag                 21<210>15<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>15tcggagaaatgagagcaacca                21<210>16<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>16agccgacgtccagcatagcag                21<210>17<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>17accctaccatacgagttcacg                 21<210>18<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>18ggtcgaatcgtcacaaagtat                 21<210>19<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>19cactggactgccgactggatg                 21<210>20<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>20caacaaccagacctaccc                      18<210>21<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>21ctcagcagcacttcttttcat                   21<210>22<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>22gatttaaatatgcgttctgcatttatcttg          30<210>23<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>23gttaattaattatttgacagggcggacagc        30

Claims (28)

1．一种用于制备面团和/或由面团制得的焙烤制品的方法，该方法包括向所述面团中加入糖氧化酶，所述的糖氧化酶对作为底物的聚合度为2或更高的寡糖比对相应的单糖具有更高的活性。
2．权利要求1的方法，其中在10mM或者更低的底物浓度下，所述糖氧化酶对具有聚合度为2-6的寡糖，特别是麦芽糖、麦芽三糖或麦芽四糖比对葡萄糖具有更高的活性。
3．权利要求1或2的方法，其中所述的糖氧化酶可以由Microdochium或支顶孢属的菌株、优选M.nivale的菌株、更优选CBS 100236得到。
4．一种包括糖氧化酶的面粉、面团或焙烤制品，所述的糖氧化酶对作为底物的聚合度为2或更高的寡糖比对相应的单糖具有更高的活性。
5．一种面团和/或面包改善添加剂，所述添加剂包括：
a)一种糖氧化酶，所述的糖氧化酶对作为底物的聚合度为2或更高的寡糖比对相应的单糖具有更高的活性；和
b)第二种酶，所述的第二种酶选自由淀粉酶、纤维素酶、半纤维素酶、脂肪酶和磷脂酶组成的组中。
6．权利要求5的组合物，其中所述的第二种酶为水解淀粉以生成作为主要产物的寡糖的淀粉酶。
7．权利要求6的组合物，其中所述的淀粉酶为嗜热脂肪芽孢杆菌的生麦芽糖α-淀粉酶、米曲霉的α-淀粉酶或β-淀粉酶。
8．一种呈颗粒或聚结粉末形式的面团和/或面包改善添加剂，所述添加剂包括一种糖氧化酶的活性，所述糖氧化酶对作为底物的具有聚合度为2或更高的寡糖比对相应的单糖具有更高的活性。
9．权利要求8的添加剂，其中超过95％重量的添加剂具有介于25与500μm之间的粒度。
10．一种糖氧化酶，所述的糖氧化酶为：
a)由Microdochium nivale CBS 100236生产的多肽，或
b)由DNA序列的糖氧化酶编码部分所编码的多肽，其中所述的DNA序列是被克隆到存在于大肠杆菌NRRLB-30034中的质粒中的，或
c)具有如SEQ ID NO：2中所示氨基酸序列的多肽，或
d)(a)、(b)或(c)中限定的多肽的类似物，所述类似物：
ⅰ)与所说的多肽之间具有至少50％的同一性，
ⅱ)与抵御纯化形式的所说多肽而产生的抗体之间具有免疫反应性，
ⅲ)为所说多肽的等位基因变体，或
ⅳ)为具有糖氧化酶活性的所说多肽的片段，或
e)由在严格性差的条件下与下列序列杂交的核酸序列所编码的多肽：
ⅰ)SEQ ID NO：1的第67-1550位中所示的核酸序列，或
ⅱ)其互补链；或其至少有100个核苷酸的亚序列。
11．权利要求10的糖氧化酶，所述糖氧化酶可以从Microdochium的菌株、优选M.nivale得到。
12．一种糖氧化酶，所述的糖氧化酶可以从Microdochium的菌株中得到并且对麦芽四糖具有氧化活性，其中在0.83mM的底物浓度下，所述糖氧化酶对麦芽四糖的氧化活性至少是对葡萄糖氧化活性的2倍。
13．权利要求12的糖氧化酶，所述糖氧化酶可以从M.nivale的菌株、优选菌株M.nivale CBS 100236得到。
14．一种用于生产糖氧化酶的方法，该方法包括在合适的营养培养基中培养产糖氧化酶的Microdochium菌株，接下来回收所述的糖氧化酶。
15．权利要求14的方法，其中所说的菌株为M.nivale的菌株，优选CBS100236。
16．一种核酸序列，所述的核酸序列包括编码权利要求10-13之任一的糖氧化酶的核酸序列。
17．一种编码糖氧化酶的核酸序列，所述的核酸序列包括：
a)DNA序列的糖氧化酶编码部分，所述DNA序列是克隆到存在于大肠杆菌NRRLB-30034的质粒中的，或
b)SEQID NO：1的第67-1550位中所示的DNA序列，或
c)a)或b)中限定的DNA序列的类似物，所述类似物：
ⅰ)与所说的DNA序列之间具有至少50％的同一性，或
ⅱ)在严格性差的条件下与所说的DNA序列、其互补链或其亚序列进行杂交。
18．一种核酸构建体，所述核酸构建体包括可操作地连接到一个或多个控制序列的权利要求16或17的核酸序列，所述的控制序列能够指导所述糖氧化酶在合适的表达宿主中进行表达。
19．一种重组表达载体，所述的表达载体包括权利要求18的核酸构建体、启动子以及转录和翻译的终止信号。
20．一种重组宿主细胞，所述的宿主细胞包括权利要求18的核酸构建体。
21．一种用于生产糖氧化酶的方法，该方法包括在有助于表达所述糖氧化酶的条件下培养权利要求20的宿主细胞以及回收所述的糖氧化酶。
22．一种用于生产糖氧化酶的方法，该方法包括：
a)从产糖氧化酶的Microdochium菌株中分离出编码所述糖氧化酶的DNA序列，
b)在合适的载体中将所述DNA片段与合适的表达信号结合，
c)用所述载体转化合适的异源宿主生物体，
d)在导致所述脂解酶表达的条件下培养所述转化的宿主生物体，以及
e)从所述培养基中回收所述的糖氧化酶。
23．一种Microdochium属的菌株，所述的菌株能够表达权利要求10-13之任一的糖氧化酶。
24．前述权利要求的菌株，所述的菌株为M.nivale，优选菌株CBS100236。
25．权利要求10-13之任一的糖氧化酶用于个人护理产品的用途。
26．权利要求10-13之任一的糖氧化酶作为测定还原糖数量的分析试剂的用途。
27．根据权利要求10-13之任一的固定化糖氧化酶作为提供连续测量淀粉或纤维素水解的电极中的分析试剂的用途。
28．根据权利要求10-13之任一的糖氧化酶用于由乳糖生产乳糖酸的用途。
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